JP4921978B2 - 細胞培養装置、画像処理装置及び細胞検出システム - Google Patents

Description

この発明は、細胞培養中に取得した複数枚の画像データから細胞部分を抽出することのできる細胞培養装置、画像処理装置及び細胞検出システムに関する。

従来から、細胞培養を行う過程において、微細な細胞の培養状態を画像観察することは行われているが、それは主に大学や研究所等の実験室においてであり、研究者が高温槽から培養中のシャーレを取り出し、細胞を顕微鏡で観察する方法が採られている。
また、培養中に取得した画像データから細胞を抽出するには、画素値の分布をもとに閾値を算出し、その閾値以上あるいは閾値以下の画素を細胞として抽出していた。しかしながら、上記閾値処理による方法では、細胞に照射された光の強さによっては画像が白っぽくなり、実際の細胞量以上に細胞が存在するように検出されることがあった。すなわち、培地の色変化、光源の光量の変化、画像中心部と周辺部の明暗差、画像に含まれるノイズなどの影響を受けずに安定して細胞を抽出するためには、細胞抽出処理の前にノイズ除去、平滑化フィルタ、輪郭強調などのフィルタ処理が必須であった。

特許文献1には、画像データ内で明るさの変化をモニタし、特定の閾値でトリガ信号を発生して、所定の遅延時間後に繰り返しカメラで撮像してその加算平均を求めるようにしたものが記載されている。
特開2000-275539号公報

また、培養装置内に、培養器を間に挟んで光源とCCDカメラを対向して配置し、CCDカメラによって培養器内の培養初期段階における細胞を撮影し、細胞の運動状態を観測することができるようにした技術が非特許文献１に記載されている。
Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.94,no.4,351-356.2002"Characterization of Cellular Motion Through Direct Observation of Individual Cells at Early Stage in Anchorage-Dependent Culture"

従来のように、培養中の細胞を恒温槽から取り出して顕微鏡で観察する方法では、細胞が実験室中の雰囲気に触れるために、培養目的ではない菌が混入することが危惧され、顕微鏡観察終了後、再び培養を継続することが困難になるという問題を有していた。
この問題を解決するために、顕微鏡を培養装置内へ組み込むことも考えられ得るが、この場合には、培養装置が大型化して、コストも上昇してしまうという問題が新たに生ずる。
また、従来のように、フィルタ処理を行なうものは、細胞抽出処理前のフィルタ処理が細胞抽出精度に大きな影響を与えていた。このフィルタ処理によって、画像中心部と周辺部の明暗差、画像に含まれるノイズなどをある程度除去することができ、また、特許文献1に記載されたものも画像に含まれるノイズなどをある程度除去することができる。ところが、画像データによってはその効果が少なかったり、細胞の輪郭が不明瞭になったりする場合などがあった。
また、上記非特許文献1に記載された技術は、培養器内の細胞を単純に撮影するものであるので、培養の初期段階では個々の細胞を分離識別可能であるが、培養過程が進行してくると、ここの細胞を分離識別しにくくなると考えられるものであった。

この発明は、上述の点に鑑みなされたものであり、細胞培養の進み具合を装置外へ細胞を取り出すことなく観測することができる細胞培養装置を提供することを目的としてなされたものである。
また、本発明は、培地の色変化、光量の変化、画像の中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響を受けずに細胞を画像で抽出することができる細胞培養装置、画像処理装置及び細胞検出システムを提供することにある。

本発明に係る細胞培養装置は、細胞を培養中の培養器手段と、前記培養器手段から前記細胞の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段及び前記培養器手段のいずれか一方を移動させて前記画像取得手段の焦点を前記培養器手段の培養中の細胞の前後に位置するように調整する焦点位置調整手段と、前記焦点位置調整手段によって設定された前記培養器手段の培養中の細胞の前に位置する焦点位置で前記画像取得手段によって取得された画像データの一部領域と、前記焦点位置調整手段によって設定された前記培養器手段の培養中の細胞の後に位置する焦点位置で前記画像取得手段によって取得された画像データの一部領域との間で差分を取る差分処理を施すことにより細胞部分のみを抽出する抽出手段と、前記差分処理の対象となる前記画像データ毎の一部領域同士において、一方の一部領域を、他方の一部領域に対して所定ピクセルずらすことで、前記一部領域同士間の位置を補正する位置補正手段と、を備えたことを特徴としている。
これは、画像取得手段であるカメラあるいは培養器を相対的に移動可能な構造とし、任意の焦点での画像取得を可能とする。そしてカメラの焦点位置を変化させて撮影した複数枚の画像は培地、ノイズ成分はほぼ同様な画素値を持つ。従って、この発明のように異なる焦点で撮影した複数枚の画像データを差分処理することにより、培地の色変化、光量の変化、画像の中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響は消失し、細胞部分のみが抽出される。
また、位置補正手段によって、焦点を変化させる際に生じる画像のＸ，Ｙ方向と回転方向の位置ずれを画像処理により補正することで、複数枚の画像の位置ずれに起因する細胞抽出精度の低下を防止することができる。また、培地の色変化、光量の変化、画像中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響を受けずに細胞部分のみを抽出することができる。

さらに、本発明に係る細胞培養装置は、前記細胞培養装置において、前記抽出手段による細胞部分のみを抽出するための最適な画像を取得するために前記画像取得手段の焦点位置を算出する焦点位置算出手段を備えたことにある。
これは、取得した画像に対してプロファイル、フーリエ変換、微分などを用いて細胞の輪郭が明瞭となる焦点位置または画像取得手段の位置を算出する。算出された焦点位置で取得された画像は、細胞抽出処理に適した画像となる。そして、算出された焦点位置へ次回の計測時に画像取得手段の位置決めを行うことにより、常に同じ精度で焦点を合わせることができる。

本発明に係る細胞培養装置において、前記抽出手段は、前記一部領域を２５６ピクセル×２５６ピクセルで設定し、抽出した細胞の画像が縦方向に大きく傾斜している場合、細胞数が最小であるか否かを判定し、抽出した細胞の画像が横方向に大きく傾斜している場合、細胞の長さの合計が最小であるか否かを判定する、ことを特徴とする。

本発明によれば、培養過程にある細胞を装置外へ取り出すことなく観察することができるので、培養対象外の菌が混入することはなくなる。
また、本発明によれば、培地の色変化、光量の変化、画像の中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響を受けずに細胞部分のみを抽出することができる。

この実施の形態に係る細胞培養装置、画像処理装置及び細胞検出システムの構成を示すブロック図である。 培養装置内の各構成手段の配置の概略を示す図である。 図1の画像処理ユニットの詳細を示す図である。 画像処理ユニットの実行する細胞抽出処理の一例を示すフローチャート図である。 カメラの移動距離と隣り合う画素値の差の総和との関係を示す図である。 対物レンズの焦点位置が培養器の底面に位置する場合の画像の一例を示す図である。 対物レンズの焦点位置が培養器の底面よりも前側(カメラ側)にある場合の画像の一例を示す図である。 対物レンズの焦点位置が培養器の底面よりも後側(光源側)にある場合の画像の一例を示す図である。 図7及び図8の画像に対して差分・位置合わせ処理及び二値化処理を施した場合の画像を示す図である。

符号の説明

11 細胞培養装置、12 培養器、13 CCDカメラ、14 画像処理ユニット、15 コンバータ、16 カメラ・培養器駆動装置、17 モータコントローラ、18 光源、21 移動用ガイド、22 対物レンズ、31 データバス、32 CPU、33 主メモリ、34 外部記憶装置、35 通信ポート、36 モニタ、37 キーボード

以下、本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。図1は、この実施の形態に係る細胞培養装置、画像処理装置及び細胞検出システムの構成を示すブロック図である。図に示すように細胞培養装置11はその内部が外部空間と遮断される箱型構造を有し、その内部に、細胞を培養する培養器12と、この培養器12内の細胞を撮影するためのCCDカメラ13と、このCCDカメラ13から得られる画像データを画像処理ユニット14に転送するためのコンバータ15と、CCDカメラ13又は培養器12を移動するためのカメラ・培養器駆動装置16と、カメラ・培養器駆動装置16を任意の位置に移動するためのモータコントローラ17と、CCDカメラ13の上部に設置した光源18から構成されている。培養器12は、底面が透明となっており、CCDカメラ13は、光源18から照射された光であって、培養器12の底面を透過した透過光を撮影するように構成されている。なお、上記構成において、CCDカメラ13は40万画素程度のCCDデバイスを備えていることが望ましく、また光源18は平行光ではなく拡散光を発するLEDや豆電球が望ましい。

図2は、培養装置11内の各構成手段の配置の概略を示す図であり、培養装置11の中でCCDカメラ13を移動する場合の培養器12、カメラ・培養器駆動ユニット16、移動用ガイド21、対物レンズ22の配置をそれぞれ示す図である。図から明らかなように、培養装置11内の上面部に光源18が取り付けられている。この光源18の下側に培養器12が配置され、さらにこの培養器12の中央付近下側に対物レンズ22を備えたCCDカメラ13が配置されている。CCDカメラ13はCPU32から出力される指令によって動作させられるカメラ・培養器駆動装置16の駆動制御によって、移動用ガイド21に沿って上下に移動し、焦点位置を上下方向に変更して培養器12内の細胞の画像を撮影する。なお、CCDカメラ13と対物レンズ22とを組み合わせた撮像装置は、培養器12の中心付近に位置する底面近傍の微小面積、例えば1.5mm(縦)×2.0mm(横)程度の微小領域を撮影可能なように構成することが望ましい。

図3は、図1の画像処理ユニット14の詳細を示す図である。画像処理ユニット14は、データバス31を介して演算処理を行うCPU32と、このCPU32が一時的に記憶領域として使用する主メモリ33と、画像データや位置情報を格納する外部記憶装置34と、モータコントローラ17と通信するための通信ポート35と、細胞抽出後の画像を表示するモニタ36と、ユーザの入力を受け付けるキーボード37とから構成される。この画像処理ユニット14は、CCDカメラ13からの画像をコンバータ15を介して取り込み、種々の画像処理を行なう。

図4は、画像処理ユニットにより実行される細胞抽出処理の一例を示すフローチャート図である。以下、図4に示す細胞抽出処理ステップを説明する。

図4に記載された一連のステップは、予めインストールされたソフトウェアによって、細胞培養過程における所定時間間隔で、例えば1回／日の頻度で繰り返して、CPU32から出力される指令によって図1乃至図3に記載されたユニットが順次駆動制御されて実行されるものである。なお、図4に記載された一連のステップを所定時間間隔で繰返し実行するための計時はCPU32に備えられたクロック発生器の出力を用いることができる。

［ステップS41］
このステップS41では、CPU32がモータコントローラ17に命令を出してCCDカメラ13を上下方向に移動させながら、所定ピッチ間隔で、例えば27μm間隔で画像を撮影する画像取得動作が実行される。この画像取得動作によって取得された複数の画像データは、コンバータ15を経由して外部記憶装置34に保存される。

［ステップS42］
このステップS42では、全ての画像を取り終えた後、画像選択処理が実行される。この画像選択処理では、外部記憶装置34に記憶された複数画像から、細胞の辺縁が明瞭な画像が少なくとも2枚以上選択される。細胞の辺縁が明瞭な画像では不明瞭な画像におけるものに比べて画素値の変化が大きくなる。そこで隣り合う画素値の差の絶対値を算出し、それらの総和を求め主メモリ33に保持する。図5は、カメラの移動距離と隣り合う画素値の差の総和との関係を示す図である。図5では、2箇所のピークがあり、このピーク値を示す画像が細胞の辺縁が明瞭な画像となる。図6乃至図8は図5における代表的なカメラの焦点位置における画像を示している。ここに、図6は、対物レンズ22の焦点位置が培養器12の底面に位置する場合の画像の一例を示す図であり、図7は、対物レンズ22の焦点位置が培養器12の底面よりも前側(カメラ側)にある場合の画像の一例を示す図であり、図8は、対物レンズ22の焦点位置が培養器12の底面よりも後側(光源側)にある場合の画像の一例を示す図である。これらの画像はいずれも焦点距離をごくわずかしか違わない位置に設定して取得された画像であるために、それらの画像の濃度差はほぼ同じものとなっている。これらの図から明らかなように、対物レンズ２２の焦点位置が培養器12の底面に対し前後いずれかにずれている方が細胞の辺縁が明瞭な画像を取得することができることが発明者の実験によって明らかになった。

［ステップS43］
このステップS43では、前述の2箇所のピークに相当する2枚以上の画像を選択することができたか否か、すなわち図7及び図8に示す細胞の辺縁が明瞭な画像が取得されたか否か(その位置がCPU32によって算出されたか否か)の判定が行われ、yesの場合は次のステップS44に進み、noの場合はステップS42にリターンする。この画像選択ステップにおいて、前記外部記憶装置34に記憶された画像に対し、プロファイル処理、フーリエ変換、微分などを用いて画像処理を行い、細胞画像の輪郭抽出を行う。そして、細胞画像の輪郭が明瞭な画像を取得したCCDカメラ13の位置を求めることが含まれている。この細胞画像が明瞭に得られたCCDカメラ13の位置は前記主メモリ33等へ記憶され、次回の細胞抽出処理時に用いられるようにする。

［ステップS44］
このステップS44では、ステップS42〜S43で選択された2枚の画像に対し、画像の中心部へ256ピクセル×256ピクセルの小画像領域を設定すると共に、一方の画像の小画像領域を他方の画像の小画像領域に対してX(横)方向，Y方向に1ピクセルずつずらし差分を取り、両画像中の細胞の位置を合わせるための差分・位置合わせ処理が行なわれる。ここで、両画像の位置合わせステップを実施形態へ含めてある理由は、CCDカメラ13が培養器12の方向へ移動すると、装置の組立精度の良し悪しにもよるが、各撮影位置において画像上で若干の位置ずれが生ずることが考えられるからである。したがって、CCDカメラ13を移動しても撮影される画像の位置ずれが生じない装置では、位置合わせのステップを省略することができる。

［ステップS45］
前のステップS44の差分・位置合わせ処理の結果に基づいて次の判定が行われる。すなわち、前記小画像領域中に描出された細胞の画像が縦方向に大きく傾斜している場合には、細胞数が最小であるか否かを判定する。この理由は、細胞が大きく傾斜している場合には、位置合わせが正確でないと差分により細胞が2重となり、あたかも細胞が数多く存在するように観えるからである。また、前記小画像領域中に描出された細胞の画像が横方向に大きく傾斜している場合には、その細胞の長さの合計が最小であるか否かの判定が行われる。この理由は、細胞が横向きに並んでいる場合には、位置合わせが正確でないと。差分により細胞が実際よりも横長に観えるからである。判定の結果、yesの場合は、その位置で2枚の画像の差分・位置合わせ処理が終了し、ステップS46に進み、noの場合は、ステップS44にリターンする。このステップS45の判定がyesとなるまで差分・位置合わせ処理が行なわれる。ここで、差分・位置合わせ処理によって2つの画像の位置合わせが完了すると、その時の差分画像には、細胞が描出される。ころ理由は定かではないが、LEDランプのような点光源から照射された光が細胞に当たってもたらされた焦点位置が異なる2つの画像は、細胞の表面における光の散乱状態が異なった情報を有しているからであると発明者は推定している。また、ステップS42で説明したように、差分処理に供される画像同士は、図5に示すように濃度差が約19％あるが、差分を採ることによって、培地の色変化、光量の変化、画像の中心部と周辺部の明暗差、ノイズなどの影響はほとんど消失させることが可能となる。

［ステップS46］
このステップS46では、細胞の長さ、個数、形状などの解析を容易にするために画像の二値化処理を行なう。図9は、図7及び図8の画像に対する差分・位置合わせ処理の結果、細胞数が最小で、かつ、その細胞の長さの合計が最小となった差分画像について、二値化処理を施した結果の画像を示す図である。このように、細胞数が最小で、かつ、その細胞の長さの合計が最小となった差分画像を二値化することにより、個々の細胞が白色部分として明瞭に描出される。なお、このステップS46における二値化処理は、この後のデータのコンピュータによる取り扱い、例えば後述の細胞数のカウント、細胞同士の間隔測定、細胞の大きさ測定等を容易にするもので、それらを行わないのであれば、本ステップS46を省略しても良い。

図9の画像に基づいて、細胞の長さ、個数、形状などの解析を容易に行なうことが可能となる。すなわち、図9の二値化画像中の白色部分は細胞を示しているので、その画素数をカウントすることで細胞の増殖率が推定でき、また、細胞の間隔すなわち黒色の幅を測定することでも細胞の増殖率が推定できる。さらには、細胞の長さを測定することで、細胞の成長度合いを推定することができる。

以上説明したように、本発明によれば、その内部が外部空間と遮断される箱型構造を有し、その内部に、細胞を培養する培養器12と、この培養器12内の細胞を撮影するためのCCDカメラ13と、このCCDカメラ13から得られる画像データを画像処理ユニット14に転送するためのコンバータ15と、CCDカメラ13又は培養器12を移動するためのカメラ・培養器駆動装置16と、カメラ・培養器駆動装置16を任意の位置に移動するためのモータコントローラ17と、CCDカメラ13の上部に設置した光源18を含んで細胞培養装置が構成されているので、培養過程にある細胞を装置外へ取り出すことなく、細胞の増殖程度を観測することができる。また、予めインストールされたソフトウェアにより、細胞の画像解析が定期的に自動で行われるので、細胞培養の省力化が計れる。

本発明は、本発明の要旨を変更しない限りにおいて種々の変形が可能である。例えば、図1の構成において、画像ユニット14へモニタ用ディスプレイ、例えば液晶ディスプレイを接続し、モニタ用ディスプレイへ画像情報を供給することで、カメラによって撮影された細胞の画像や、差分処理を行った画像を表示することが可能となる。さらには、CPU32によって画像上で細胞の大きさ(長さや径)や培養器内における細胞の分布密度を計測し、その計測結果をモニタ用ディスプレイへ表示するようにすることも可能である。

Claims (6)

1. 細胞を培養中の培養器手段と、
   前記培養器手段から前記細胞の画像を取得する画像取得手段と、
   前記画像取得手段及び前記培養器手段のいずれか一方を移動させて前記画像取得手段の焦点を前記培養器手段の培養中の細胞の前後に位置するように調整する焦点位置調整手段と、
   前記焦点位置調整手段によって設定された前記培養器手段の培養中の細胞の前に位置する焦点位置で前記画像取得手段によって取得された画像データの一部領域と、前記焦点位置調整手段によって設定された前記培養器手段の培養中の細胞の後に位置する焦点位置で前記画像取得手段によって取得された画像データの一部領域との間で差分を取る差分処理を施すことにより細胞部分のみを抽出する抽出手段と、
   前記差分処理の対象となる前記画像データ毎の一部領域同士において、一方の一部領域を、他方の一部領域に対して所定ピクセルずらすことで、前記一部領域同士間の位置を補正する位置補正手段と、
   を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
2. 前記抽出手段による細胞部分のみを抽出するための最適な画像を取得するために前記画像取得手段の焦点位置を算出する焦点位置算出手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載された細胞培養装置。
3. 前記抽出手段は、
   前記一部領域を２５６ピクセル×２５６ピクセルで設定し、
   抽出した細胞の画像が縦方向に大きく傾斜している場合、細胞数が最小であるか否かを判定し、
   抽出した細胞の画像が横方向に大きく傾斜している場合、細胞の長さの合計が最小であるか否かを判定する、
   ことを特徴とする請求項１または２に記載された細胞培養装置。
4. 前記画像データ生成手段は、さらに差分処理された画像データを二値化処理する手段を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養装置。
5. 前記画像取得、画像解析並びに細胞の培養度合いの判定用データの生成を、所定期間を持って自動的に繰返し行う手段を備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養装置。
6. 前記画像取得手段によって取得された画像に基づく画像データを表示するディスプレイユニットを備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養装置。

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