JPWO2014084255A1 - 細胞観察装置、細胞観察方法及びそのプログラム - Google Patents

Abstract

この細胞観察装置は、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出部と、撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出部と、エッジ画像と色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、画素の輝度値の分散により検出し、撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成部とを備える。

Description

本発明は、細胞の顕微鏡画像を用いてこの細胞の状態を観察する細胞観察装置、細胞観察方法及びそのプログラムに関する。
本願は、２０１２年１１月２８日に、日本に出願された特願２０１２−２５９８８０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、細胞の状態を検出する際、細胞を生きたままの状態で長期間にわたって顕微鏡により観察できる実験装置が実用化されてきている。こうした実験装置を使用することにより、細胞の成長や細胞の分裂といった過程をリアルタイムで観察することができる。そして、こうした細胞の変化の過程を撮影して得られる細胞の画像データを時系列的に解析することで、細胞に生じる変化を詳細に分析することが可能となる。

例えば、単細胞の酵母を用いて発酵を行い、ビール、焼酎等の様々な酒類を製造することができる。酒類の品質保持のためには、このような発酵に使用する酵母の生理状態を発酵前に判定して、その後の発酵への影響を予測することが行われている（例えば、特許文献２参照）。すなわち、酵母を用いた発酵、醸造や物質生産等において、生産にこれから用いようとする酵母細胞の生理状態を予め把握しておくことは、発酵の成否を予見し、高品質で安定した製品を得るために必要である。

微細藻類は、主として単細胞の光合成生物を指している。この微細藻類は、光合成により、光エネルギーを化学エネルギーに変換し、変換したエネルギーを自己の生存及び増殖のために用いている。
また、微細藻類は、種類によって、有用成分として炭化水素や必須不飽和脂肪酸（例えばＤＨＡ（Ｄｏｃｏｓａ Ｈｅｘａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＰＡ（Ｅｉｃｏｓａ Ｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）など）、デンプン、色素などを生合成するものがあり、これらの生合成の機能の工業的利用が期待されている。

微細藻類を用いた上記有用成分の高効率な生産を行おうとする場合、微細藻類の細胞の生理状態を適切に把握することが重要である。すなわち、微細藻類の細胞の生理状態は、培地組成、二酸化炭素濃度、光強度、培養温度、細胞密度などの周辺環境の生育条件によって大きく変化する。そして、微細藻類の細胞は、生理状態に応じて有用成分の産生及び蓄積量も変化するからである。

したがって、微細藻類の細胞による有用成分の高効率な生産のため、細胞の生育条件の最適化の過程においても、また細胞による有用成分の生産の過程においても、培養中の微細藻類の細胞の生理状態を把握し、有用成分の生産量を把握することが必要である。
また、細胞を培養している培地中への他種生物の混入が微細藻類の細胞の生理状態に影響を及ぼす場合がある。この他種生物の混入による生理状態への影響が、細胞による有用成分の生産過程において問題となることも少なくない。
したがって、上述した培養中の培地へ混入した他種生物の検出も、微細藻類の細胞を用いた有用成分の高効率な生産のためには重要となる。

微細藻類の細胞の一例として、微細藻類の一種であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓを挙げる。このＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、健康食品としても用いられる赤色の抗酸化剤アスタキサンチンを生合成することで工業的にも有用性が高い。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、細胞の生理状態を反映して様々な細胞形態を示す。またアスタキサンチンの蓄積量も、培養中の条件に応じて異なる（例えば、非特許文献１参照）。

Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓによるアスタキサンチン生産の高効率化には、高生産株の利用や培養条件の最適化が行われてきた（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、現状ではその生産性は高いとはいえず、更なる生産性の向上が期待されている。さらに、近年、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに寄生する他種生物の一例として真菌Ｐａｒａｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ ｓｅｄｅｂｏｋｅｒｅｎｓｉｓが発見された。Ｐａｒａｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ ｓｅｄｏｂｏｋｅｒｅｎｓｉｓに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、細胞色が緑から茶褐色に変化し、死に至る（例えば、非特許文献２参照）。

Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓと同定されている培養株の複数種類を、世界中から複数種類取り寄せ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ以外の生物の混入を調べた。この結果、驚くべきことに、工業的に利用されている株を含む全ての培養株において混入が確認された。したがって、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの細胞の生理状態、有用成分アスタキサンチンの蓄積量、他種生物の混入率を把握することは、工業利用において重要な課題である。

細胞の生理状態を把握する方法として、微生物である出芽酵母に対しては、メチレンブルー法による死滅判別技術等の評価方法（例えば、非特許文献３参照）が知られている。
しかしながら、この非特許文献３による方法では、細胞の生理状態を多面的に判定できない。
また、特許文献２には、細胞形態定量値を用いる酵母の生理状態の評価方法が示されている。詳しくは、目的とする酵母の細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格の蛍光染色画像を画像解析して、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量解析値を求め、その値を予め用意したデータベースと比較することによって、目的とする酵母の生理状態を評価する方法である。

しかしながら、この方法では細胞の固定・染色処理と蛍光顕微鏡による観察を必要としており、野外および生産現場等におけるリアルタイムの生理状態の把握には適さない。また微細藻類の細胞への適用には何ら検討も示唆もされていない。
また、有用成分の蓄積量を把握する方法として、特許文献１では、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのアスタキサンチン量を、ジメチルスルフォキシドによって細胞から色素体を抽出し、４９２ｎｍおよび７５０ｎｍの吸光度を測定することで定量する方法が示されている。
しかし、測定には多数の微細藻類の細胞からの色素体の抽出を必要とし、色素体の抽出に時間を要する。

また、他種生物の検出については、微細藻類である珪藻の細胞に寄生している真菌であるツボカビ類を、ツボカビ類の細胞壁の成分であるキチンに結合するｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ ｗｈｉｔｅで特異的に染色する方法が示されている（非特許文献４）。
また、別の先行研究では、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに寄生するＰａｒａｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ ｓｅｄｅｂｏｋｅｒｅｎｓｉｓの遊走子嚢をＦＩＴＣ−ＷＧＡで染色している（非特許文献５）。

しかし、これらはいずれも、細胞の染色処理を必要としており、培養液中の細胞を直接判別するものではない。また、特許文献２及び非特許文献５などの方法では、蛍光顕微鏡を必要とするため、野外および生産現場等における判別には適さない。
以上に述べたとおり、微細藻類の細胞の生育状況、また微細藻類の細胞の培地に混入する他種生物（例えば寄生菌）などの混入状況、微細藻類の細胞による有用物質の生産量の各々をリアルタイムにモニターする簡便な方法はない。

特開２００７−９７５８４号公報 特開２０１１−３０４９４号公報

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，３０巻 （１９９４年），８２９−８３３ページ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１２巻 （２００８年） ７０−８１ページ Ｅ．Ｂ．Ｃ． Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ．， Ｊ． Ｉｎｓｔ． Ｂｒｅｗ． ８３巻 （１９７７年）， １０９−１１８ページ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７５巻 （２００９年），２５４５−２５５３ページ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１５巻（２０１１年），８０３−８１１ページ

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、微細藻類などの細胞による有用物質の生産量向上のため、培養条件の開発や有用物質高生産株の育種を行う際、この細胞の培地に混入する他種生物などの混入状況、微細藻類の細胞による有用物質の生産量の各々をリアルタイムにモニターする細胞観察装置、細胞観察方法及びそのプログラムを提供することを目的とする。

本発明の細胞観察装置は、一層の細胞（平面上に細胞が重ならずに一層のみで配置されている状態）を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出部と、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出部と、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成部とを備えることを特徴とする。

本発明の細胞観察装置は、前記合成画像において色素体の存在する細胞の画像領域を対象細胞画像とし、色素体の存在しない細胞の画像領域を非対象細胞画像として検出し、前記合成画像における全細胞の画像における当該非対象細胞画像の比率を求める細胞形態検出部をさらに備えることを特徴とする。

本発明の細胞観察装置は、前記細胞の画像領域における色素体の輝度値から前記色素体の量である色素体量を算出する色素値抽出部をさらに備えることを特徴とする。

本発明の細胞観察装置は、前記細胞の画像領域から色素体の平均輝度値を求めておき、前記撮像画像を撮像した当該細胞から色素体を抽出して色素体量を求め、平均輝度値と細胞当たりの色素体量との回帰式を予め求めて記憶部に記憶させておき、前記色素値抽出部が前記細胞画像における平均輝度値を求め、前記回帰式から細胞当たりの色素体量を求めることを特徴とする。

本発明の細胞観察方法は、輪郭抽出部が、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出過程と、色素体領域抽出部が、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出過程と、画像合成部が、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成過程と を含むことを特徴とする。

本発明のプログラムは、細胞の形状を観察する細胞観察装置の動作をコンピュータに実行させるプログラムであり、コンピュータを、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出手段、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出手段、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成手段として機能させるためのプログラムである。

この発明によれば、微細藻類などの顕微鏡写真である撮像画像から抽出したエッジ画像と色素体画像とを重ね合わせるため、撮像画像内の細胞の画像を従来に比較して精度良く抽出でき、細胞の全体的な形状及び細胞内における色素体領域（例えば、生成される産生物質の領域）の割合も容易に検出することができる。
これにより、本発明によれば、細胞の生理状態の指標、他種生物の混入状況、有色色素体の蓄積状況が定量値として得られ、細胞の生理状態の把握や、有用成分の生産状況の把握が容易になる。

この発明の一実施形態による細胞観察装置１の構成例を示す概略ブロック図である。 撮像装置１００が撮像した撮像画像（明視野画像）に解析結果を重ね合わせて表示した画像を示している。 テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される個々の細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。 テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される複数の撮像画像における細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。 観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。 観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＧ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。 本実施形態による細胞観察装置１における細胞観察の処理の動作例を示すフローチャートである。 エッジ画像と色素体画像とを重ね合わせた、細胞画像の最外縁部を示す図である。 新鮮培地に対してヘマトコッカスを接種後、細胞観察装置１により測定したアスタキサンチンとクロロフィルとの蓄積量の変化を示すグラフと、代表的な細胞の画像である。 細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報（ＯｕｔｅｒＡｒｅａ、ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ））と、目視による細胞の分類（遊走子細胞、移行細胞、パルメラ細胞）との対応を示す図である。 実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの細胞当たりの色素量を培養液１ｍｌあたりに換算した色素量（μｇ／ｍｌ）と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定した色素量との相関を示すグラフである。 実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの細胞当たりの色素量を培養液１ｍｌあたりに換算した色素量（μｇ／ｍｌ）と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定した色素量との相関を示すグラフである。 実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの細胞当たりの色素量を培養液１ｍｌあたりに換算した色素量（μｇ／ｍｌ）と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定したアスタキサンチンの色素量との相関を示すグラフである。 実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの細胞当たりの色素量を培養液１ｍｌあたりに換算した色素量（μｇ／ｍｌ）と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定したアスタキサンチンの色素量との相関を示すグラフである。 クロロフィル量及びカロテノイド量の各々を推定するために用いる重回帰分析の式を説明する図である。 遊走子とパルメロイドとの各々を撮像した撮像画像を示す図である。 ランダムフォレスト法によって、トレーニングデータの培養細胞の２個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、トレーニングデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。 ランダムフォレスト法によって、トレーニングデータの培養細胞の２個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、テストデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。 ランダムフォレスト法の機械学習によって、トレーニングデータの培養細胞の２５個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、トレーニングデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。 ランダムフォレスト法の機械学習によって、トレーニングデータの培養細胞の２５個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、テストデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像における周囲の長さを示すＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の重心の座標から細胞画像の外周までの距離の最大値を示すＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の面積を示すＯｕｔｅｒＡｒｅａ（単位：μｍ^２）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の最小の幅（短軸）部分の寸法ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の赤チャンネル（Ｒ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の色素体の領域における面積であるＩｎｎｅｒＡｒｅａ（単位：μｍ^２）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における赤チャンネル（Ｒ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の緑チャンネル（Ｇ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における青チャンネル（Ｂ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の中心点から重心までの距離を示す数値であるＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＣｅｌｌＣｅｎｔｅｒＴｏＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の青チャンネル（Ｂ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における緑チャンネル（Ｇ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の緑チャンネル（Ｇ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の重心から長軸の最も遠い座標点までのなす角度を示すＡｎｇｌｅＦｒｏｍＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓＴｏＦａｒＥｎｄＯｆＬｏｎｇＡｘｉｓ（単位：degree of angle）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の細胞内の色素体の周囲の長さを示すＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の細胞内の色素体の面積と細胞の面積との比を示すＡｒｅａＲａｔｉｏ（単位：μｍ^２／μｍ^２）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内における色素体の青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像におけるＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ距離（すでに説明したパラメータ）を示す数値であるＯｕｔｅｒＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍＤｉｓｔａｎｃｅ（単位：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の長軸と短軸との比を示す数値であるＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）（単位：μｍ／μｍ）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の赤チャンネル（Ｒ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と細胞画像の外周の円への適合度を示す数値であるＯｕｔｅｒＲｏｕｎｄＦｉｔｎｅｓｓ（単位：μｍ^２／μｍ^２）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の色素体の赤チャンネル（Ｒ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の色素体の緑チャンネル（Ｇ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。 培養した時間と培養細胞の細胞画像の最大の幅（長軸）部分の寸法ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。 第１主成分ＰＣ１と培養を始めてからの経過時間との対応を示す図である。 第１主成分ＰＣ１と相関のある（すなわち、形態の時間経過と相関のある）８個のパラメータを説明する図である。 鞭毛の発生及び消失と、培養を開始してからの経過時間との対応を示す図である。 自動細胞数計測装置により検出した野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ６及び変異株ＰｋＥ８の各々の粒子径毎の出現した頻度を示す図である。 本実施形態による細胞観察装置１が求めた、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ６及び変異株ＰｋＥ８の各々の粒子径毎の出現した頻度を示す図である。 図２１から図４５までに示したパラメータの有意差検定の結果を示すテーブルの図である。 判別分析の結果得られた判別関数ＬＤ１と判別関数ＬＤ２とによる野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の判別結果を示す図である。 判別関数ＬＤ１及び判別関数ＬＤ２の各々と図２１から図４５までに示したパラメータとの相関係数を示すテーブルの図である。 判別関数ＬＤ１と相関の高い各色のチャネルの細胞のピクセルの平均輝度値（ＯｕｔｅｒＭｅａｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ）と、細胞の出現率との対応を示す図である。 判別関数ＬＤ２と相関の高い細胞の大きさに関連するパラメータと、細胞の出現率との対応を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。図１は、この発明の一実施形態による細胞観察装置１の構成例を示す概略ブロック図である。本実施形態においては、単細胞生物の細胞を顕微鏡に付加したカラーカメラにより撮像し、この撮像したＲＧＢ（Ｒｅｄ、Ｇｒｅｅｎ、Ｂｌｕｅ）の各画素からなるピクセルで構成されたカラーの明視野画像である撮像画像から発育過程の細胞の生理状態、及びこの細胞を培養する培地に混入する混入他種生物を解析するものである。

図１において、本実施形態の細胞観察装置１は、制御部１１、色合い調節部１２、輪郭抽出部１３、色素体領域抽出部１４、画像分割部１５、画像合成部１６、細胞領域抽出部１７、細胞構造抽出部１８、細胞形態検出部１９、色素値抽出部２０、画像記憶部２１、記憶部２２、テーブル記憶部２３及び表示部２４を備えている。以下の実施形態は、生理状態を観察する対象の観察対象細胞を微細藻類の単細胞生物である「Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（以下、ヘマトコッカス）」の細胞を例とし、観察対象細胞以外の生物である混入他種生物の画像をツボカビとして説明する。ヘマトコッカスは、生理状態として初期はクロロフィルが色素体（緑色の色素）として蓄積されるが、生育が進むとアスタキサンチンという有用物質の色素体（赤色の色素）を蓄積するようになる。

撮像装置１００は、顕微鏡にＣＣＤカメラが設けられており、所定の倍率にて培養容器２００内の培地３００にて培養されているヘマトコッカスの細胞を撮像し、撮像画像を細胞観察装置１に対して出力する。このとき、観察者は、撮像画像を撮像する撮像領域として、細胞が他の細胞と接触せずに一層で配列した領域を選択して、撮像装置１００により培地３００におけるヘマトコッカスの細胞を撮像する。

図２は、撮像装置１００が撮像した撮像画像（明視野画像）に解析結果を重ね合わせて表示した画像を示している。細胞画像は、外周と色素体領域とから構成されている。この図２の画像は、表示部２４に表示される画像である。この図２と同様に、各部の処理の結果は表示部２４に観察者が任意に表示できる。撮像画像の各処理後の画像は、記憶部２２にそれぞれの処理を行った各部により書き込まれて記憶される。
また、詳細は後に説明するが、ピクセル値で示された細胞の面積と、細胞画像の最外縁における最大幅（ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ）を最小幅（ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ）で除算した長軸短軸比（ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈとＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈとの比Ｌ／Ｓ）とがそれぞれの細胞画像に記述されている。この図２においては、細胞画像の中央には各細胞画像を識別する識別番号（ＩＤ）が記載されている。
また、細胞の発育の形態として、ヘマトコッカスの発育状態の初期である遊走子と、パルメラ細胞との顕微鏡により観察者が判定した結果が示されている。

図１に戻り、制御部１１は、撮像装置１００から得られる培養容器２００における培地３００の細胞を撮像した撮像画像（明視野画像）のデータを、画像記憶部２１に対して書き込んで記憶させる。
色合い調節部１２は画像記憶部から撮像画像を読み出し、当該撮像画像の各画素のＲＧＢの輝度値（階調度）を調整し、読みだした撮像画像内の輝度の分布に基づいて背景をグレーに調節する。
輪郭抽出部１３は、色合いが調節された撮像画像内の画像のエッジの抽出をＣａｎｎｙ法により行いエッジ画像の生成を行う。ここで、Ｃａｎｎｙ法に関しては、「Ｃａｎｎｙ、Ｊ．，Ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｄｇｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｇｅｎｃｅ、８：６７９−７１４，１９８６」に記載されている。

色素体領域抽出部１４は、撮像画像内において、読み出した撮像画像内の画像の類似した輝度値の画素領域（後述する観察対象の細胞内の色素体領域）を、Ｏｔｓｕ法による二値化処理により抽出する。ここで、Ｏｔｓｕ法に関しては、「Ｏｔｓｕ Ｎ、Ａ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｇｒａｙ−ｌｅｖｅｌ
ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ ａｎｄ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，９（１）：６２−６６，１９７９」に記載されている。

そして、画像分割部１５は、輪郭抽出部１３の抽出したエッジ画像に重ね合わせて、画素領域と重なったエッジを削除し、新たなエッジ画像とする。そして、画像分割部１５は、抽出する対象物である撮像画像における細胞の画像の領域を抽出するため、エッジ画像のエッジ情報を用い、撮像画像のセグメンテーション（領域分割）の処理を、ｗａｔｅｒ−ｓｈｅｄ法により行う。ここで、ｗａｔｅｒ−ｓｈｅｄ法に関しては、「Ｂｅｕｃｈｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｉｃｔｕｒｅ
ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ，Ｓｐｅｅｃｈ，ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ
Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＩＣＡＳＳＰ’８２．，７：１９２８−１９３１，１９８２」に記載されている。

画像合成部１６は、分割されたセグメントを、輝度値の分散が所定の閾値に対して大きい細胞セグメントと、輝度値の分散が所定の閾値に対して小さな背景セグメントに分け、分散撮像画像内の細胞の撮像された領域に対応する細胞セグメントとして選択する。
また、画像合成部１６は、細胞セグメント及び背景セグメントの各々を合成し、それぞれ細胞画像と背景画像とを生成して合成画像とする。

細胞領域抽出部１７は、細胞画像とした領域と円状のモデル画像との類似度を、Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍの手法により求め、所定の類似度以上の領域を丸い領域とし、一方類似度未満の領域とする。また、細胞領域抽出部１７は、丸くない領域を統合する。このＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍの手法を用いた円状のモデル画像との類似度の計算は、「Ｔｏｓｈｅｖ、Ａ．，Ｔａｓｋａｒ，Ｂ．，Ｄａｎｉｉｌｉｄｉｓ，Ｋ．，Ｏｂｊｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，９５０−９５７，２０１０」に記載されている。

細胞構造抽出部１８は、撮像画像における細胞画像の細胞外形及び細胞画像内の細胞構成部（色素体領域及び非色素体領域）に基づき、個々の細胞及び複数の細胞に対する数値情報（後述）を求め、細胞画像毎及びこの細胞画像を抽出した撮像画像毎に、この求めた数値情報をテーブル記憶部２３に対して書き込み記憶させる。

細胞形態検出部１９は、求められた細胞構成部の色素体領域の有無により、観察対象の細胞であるか否かの判定を行う。すなわち、細胞形態検出部１９は、細胞画像の示す細胞が観察対象細胞のヘマトコッカスであるか、あるいは混入他種生物のツボカビであるかの判定を、色素体領域の有無により判定する。このとき、細胞形態検出部１９は、色素体領域がある細胞画像を観察対象細胞のヘマトコッカスと判定し、一方、色素体領域のない細胞画像を非観察対象細胞のツボカビと判定する。
また、細胞形態検出部１９は、細胞の細胞外形（後述する細胞画像の長径と短径との比など）から細胞の成長過程を推定する。

色素値抽出部２０は、細胞画像毎に、細胞画像内におけるＲＧＢの各々の画素の輝度値の平均値を求め、この平均値を用いて予め求められ記憶部２２に格納されている回帰式により、色素体領域における色素の蓄積量の推定を行う。本実施形態においては、微細藻類であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの細胞を観察対象としているため、アスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）量及びクロロフィル（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）量の推定を行う。

＜細胞構造抽出部１８の出力する数値情報＞
図３は、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される個々の細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。
この数値情報の各種類のデータは、Ｎａｍｅ、ＩＤ、Ｔｙｐｅ、ＯｕｔｅｒＡｒｅａ、ＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＸ、ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＹ、ＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓ、ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）、Ｒｏｕｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓ、Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ ｄｉｓｔａｎｃｅ、ＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＩｎｎｅｒＡｒｅａ、ＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ、ＩｎｎｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＩｎｎｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＩｎｎｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙを含んでいる。以下、図３における数値情報の各々について説明する。

Ｎａｍｅは、細胞画像の画像データのファイル名を示す。ＩＤは、細胞と認識された細胞画像の領域を示す識別番号であり、撮像画像における位置情報（座標値）を含んでいても良い。Ｔｙｐｅは、ＩＤの付された細胞画像が示す細胞の種別を示す。例えば、図２に示すように、目的とする観察対象の微細藻類の観察対象細胞（例えば、図２のＩＤが８及び１０等の細胞画像）、撮像画像における観察対象細胞以外の生物である混入多種生物画像、細胞であるが撮像画像の縁に懸かって不完全な形状の画像となっている不完全形状細胞画像（例えば、図２のＩＤが１及び２等の細胞画像）を含んでいる。

ＯｕｔｅｒＡｒｅａは、細胞画像の面積を示しており、ピクセル数で面積が設定されている。ＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈは、細胞画像の外周の長さであり、細胞画像の外周に配列されたピクセル数で示した数値である。ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＸは、撮像画像のｘｙ座標系における細胞画像の重心のｘ座標（ピクセル値、すなわち撮像画像の左端からのピクセル数）を示した数値である。ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＹは、撮像画像のｘｙ座標系における細胞画像の重心のｙ座標（ピクセル値、すなわち撮像画像の上端からのピクセル数）を示した数値である。

ＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓは、重心の座標から撮像画像の外周までの距離の最大値（最大幅）をピクセル数で示した数値である。ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（Ｌ）は、細胞画像の最大の幅部分の寸法、すなわち長軸の長さをピクセル数で示した数値である。ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（Ｓ）は、細胞画像の最小の幅部分の寸法、すなわち短軸の長さをピクセル数で示した数値である。ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）は、ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈとＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈとの比Ｌ／Ｓを示す数値である。Ｒｏｕｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓは、細胞画像の形状の円への適合度を示す数値である。また、Ｒｏｕｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓは、「４π×面積÷周囲の長さの２乗」の式から算出される。

Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ ｄｉｓｔａｎｃｅは、本実施形態において、円のモデル画像と、対象画像とのＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍによる比較結果の類似度を示す数値であり、円状に近いモデル画像に類似している度合いを示す類似度を求める。ＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、細胞内の赤チャンネル（Ｒ画素）の輝度値の平均値を示す数値である。ＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、細胞内の緑チャンネル（Ｇ画素）の輝度値の平均値を示す数値である。ＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、細胞内の青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値の平均値を示す数値である。ＩｎｎｅｒＡｒｅａは、色素体の領域における面積を、当該領域内におけるピクセル数で示す数値である。ＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈは、色素体の領域の外周をピクセル数で示す数値である。ＩｎｎｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、色素体の領域内における赤チャンネル（Ｒ画素）の平均輝度値である。ＩｎｎｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、色素体の領域内における緑チャンネルの平均輝度値である。ＩｎｎｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、色素体の領域内における青チャンネルの平均輝度値である。

＜細胞構造抽出部１８の数値情報算出＞
以下に、細胞構造抽出部１８の行う数値情報の算出処理について説明する。
細胞構造抽出部１８は、細胞画像内のピクセル数を計数して、このピクセル数を図３における数値情報の細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像の外周に配列したピクセルの数を計数して、この外周のピクセル数を図３に示す細胞の周囲の長さＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像の面積から重心を求め、撮像画像における重心のｘ座標及びｙ座標を求め、それぞれＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＸ、ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＹとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。このｘ座標は撮像画像の左端からのピクセル数であり、ｙ座標は撮像画像の上端からのピクセル数である。

また、細胞構造抽出部１８は、重心の座標（ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＸ，ＯｕｔｅｒＣｅｎｔｅｒＹ）から細胞画像の外周までの最大幅となるピクセル値を計数して、図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像の長軸（長径）の長さのピクセル数を計数して、このピクセル数を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（Ｌ）として、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像の短軸（短径）の長さのピクセル数を計数して、このピクセル数を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（Ｓ）として、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈをＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈにより除算し、除算結果を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）として、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。

また、細胞構造抽出部１８は、「（４π×ＯｕｔｅｒＡｒｅａ）／（ＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ）^２」を算出し、円への適合度を算出し、この適合度を図３の数値情報におけるＲｏｕｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、円状のモデル画像と細胞画像とにおいて、任意の２点間の距離と角度とこの２点の外周に対する垂線の角度を算出し、これらのヒストグラム（Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ）の差を求めて、この差分をモデル画像との類似度とし、図３の数値情報におけるＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ ｄｉｓｔａｎｃｅとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。

また、細胞構造抽出部１８は、細胞画像内のＲ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像内のＧ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、細胞画像内のＢ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。

また、細胞構造抽出部１８は、色素体領域抽出部１４の抽出した色素体領域の面積を、この色素体領域に含まれるピクセル数を計数した計数値として求め、この計数値を図３の数値情報におけるＩｎｎｅｒＡｒｅａとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、色素体領域の外周に配列したピクセルの数を計数して、この外周のピクセル数を図３に示す色素体領域の周囲の長さＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、色素体領域内におけるＲ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＩｎｎｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、色素体領域内におけるＧ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＩｎｎｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。細胞構造抽出部１８は、色素体領域内におけるＢ画素の輝度値の平均値を算出し、この平均値を図３の数値情報におけるＩｎｎｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとして、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。

次に、図４は、テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される複数の撮像画像における細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。
この数値情報の各種類のデータは、Ｎａｍｅ、Ｔｏｕｃｈ、Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ、Ａｌｇａｅ、Ｏｔｈｅｒｓ、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ、Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌを含んでいる。以下、図４における数値情報の各々について説明する。

Ｎａｍｅは、細胞画像の画像ファイルの複数から構成される撮像画像の画像データのフォルダ名を示す。Ｔｏｕｃｈは、撮像画像の縁に接触している細胞の画像の個数を示す数値である。Ａｌｇａｅは、撮像画像における観察対象である対象細胞（本実施形態では微細藻類の単細胞）の数を示す数値である。この目的とする対象細胞は、円状のモデル画像との類似度が０．５未満であり、かつ色素体の領域がある細胞を示している。Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔは、撮像画像における観察対象でない非対象細胞（本実施形態では例えばツボカビの単細胞）の数を示す数値である。この目的としない非対象細胞は、円状のモデル画像との類似度が０．５未満であり、かつ色素体の領域が無い細胞を示している。Ｏｔｈｅｒｓは、対象細胞及び非対象細胞のいずれでもない非細胞の画像を示している。この非細胞は、モデル画像との類似度が０．５以上の判定不能な細胞を示している。対象細胞、非対象細胞及び非細胞を判定する類似度は、Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍの手法により求めたものである。Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔは、撮像画像において検出された細胞の総数、すなわち撮像画像の縁に接触している細胞数、対象細胞数及び非対象細胞数の合計値を示している。本実施形態においては、撮像画像の縁に接触している細胞数と微細藻類の細胞数とツボカビの細胞数と非細胞数とを加算した数値である。

Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒは、アスタキサンチン量測定に使用した数値（本実施形態においてはＲ画素の輝度値の平均値をＢ画素の輝度値の平均値により除算した数値）である。このＲ画素の輝度値の平均値及びＢ画素の輝度値の平均値は、撮像画像に含まれる対象細胞内における平均値を、撮像画像に含まれる全ての対象細胞において平均した平均値である。この対象細胞内の平均値は、対象細胞内に含まれる全てのピクセルにおける画素の輝度値の平均である。Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎは、Ｒ画素の輝度値の平均値であるＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを用い、ピクセル当たりの後述する回帰曲線から求めたアスタキサンチン量（回帰式：１３７．９×ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ−１７４．３）を示している。

Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒは、クロロフィル量測定に使用した数値（本実施形態においてはＧ画素の輝度値の平均値をＢ画素の輝度値の平均値により除算した数値）である。このＧ画素の輝度値の平均値及びＢ画素の輝度値の平均値は、撮像画像に含まれる対象細胞内における平均値を、撮像画像に含まれる全ての対象細胞において平均した平均値である。この対象細胞内の平均値は、対象細胞内に含まれる全てのピクセルにおける画素の輝度値の平均である。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌは、Ｇ画素の輝度値の平均値であるＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを用い、ピクセル当たりの後述する回帰曲線から求めたクロロフィル量（回帰式：２８４．７×ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ−３６９．１）を示している。
ここで、Ｔｏｕｃｈ、Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ、Ａｌｇａｅ、Ｏｔｈｅｒｓについては、細胞構造抽出部１８がテーブル記憶部２３における細胞画像のＴｙｐｅを読み込んで、それぞれの細胞数を計数して求め、求めた計数値をテーブル記憶部２３の図４に示す数値情報として書き込んで記憶させる。また、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔについてはそれぞれの細胞数の和を求め、求めた計算値をテーブル記憶部２３の図４に示す数値情報として書き込んで記憶させる。

次に、図５は、観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。図５のグラフは、縦軸が細胞当たりのアスタキサンチンの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）を示し、横軸が細胞画像内のピクセルのＲ画素の輝度値の平均値をＢ画素の平均値で除算した輝度値比を示している。

例えば、このアスタキサンチン算出用の回帰式は、以下のように予め求めて、記憶部２２に予め書き込んで記憶させておく。
撮像画像のすでに述べた画像解析を行い、上述した撮像画像内の数値情報を求め（色素の蓄積量以外）、細胞画像のＲ画素の輝度値の平均値と、Ｂ画素の輝度値の平均値との輝度比を求める。

そして、以下の様に撮像画像を撮像した細胞から色素を抽出して色素量の測定を行った。すなわち、撮像画像を撮像した細胞の培地である細胞培養液（例えば、１ｍｌ（ミリリットル））をミクロ遠心管に分取した後、室温にて８０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、ミクロ遠心管の底部に細胞を沈殿させて集菌を行った。遠心処理後、このミクロ遠心管における上清を除去し、沈殿した細胞に対して１０％のＫＯＨ（水酸化カリウム）溶液を１ｍｌ加え、７０℃で５分間の加熱を行った。

次に、室温において、８０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、ミクロ遠心管の底部に細胞を沈殿させて集菌を行った。遠心処理後、このミクロ遠心管における上清を除去し、細胞ペレットをミクロ遠心管ごと液体窒素に浸し、細胞ペレットをミキサーにより３０秒間にわたって粉砕処理を行った。粉砕処理を行った後に、ミクロ遠心管にＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）を１ｍｌ加え、ボルテックスにより１５分振動させて色素であるアスタキサンチンを抽出した。

その後、室温において、８０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、新たなミクロ遠心管に上清（色素抽出液）を移して色素であるアスタキサンチンを回収した。
そして、分光光度計によって、このアスタキサンチンの色素抽出液の４９２ｎｍ及び７５０ｎｍにおける光の吸収を吸光度として測定した。この吸光度の測定結果において、アスタキサンチンの色素濃度は、以下の式により求めた。
アスタキサンチン量（μｇ／ｍｌ）＝４．５（Ａ_４９２−Ａ_７５０）
この式において、４．５は比例定数であり、Ａ_４９２は４９２ｎｍにおける吸光度であり、Ａ_７５０は７５０ｎｍにおける吸光度である。このとき得られたアスタキサンチン量を、アスタキサンチンの抽出に用いた細胞数で除算して細胞当たりのアスタキサンチン量を算出した。

上述したように、異なる撮像画像における輝度比の異なる複数の撮像画像を撮像した試料から、アスタキサンチンの色素濃度を求めた。
そして、細胞画像内のＲ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を求め、この平均値の比である輝度比とアスタキサンチンの抽出量との対応を示す回帰式を、すなわちアスタキサンチンの量を推定する回帰式を図５の相関を求める回帰分析により求めた。

次に、図６は、観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＧ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。図６のグラフは、縦軸が細胞当たりのクロロフィルの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）を示し、横軸が細胞画像内のピクセルのＧ画素の輝度値の平均値をＢ画素の平均値で除算した輝度値比を示している。

例えば、このクロロフィル算出用の回帰式は、以下のように予め求めて、記憶部２２に予め書き込んで記憶させておく。
撮像画像のすでに述べた画像解析を行い、上述した撮像画像内の数値情報を求め（色素の蓄積量以外）、細胞画像のＧ画素の輝度値の平均値と、Ｂ画素の輝度値の平均値との輝度比を求める。

そして、以下の様に撮像画像を撮像した細胞から色素を抽出して色素量の測定を行った。すなわち、撮像画像を撮像した細胞の培地である細胞培養液（例えば、１ｍｌ（ミリリットル））をミクロ遠心管に分取した後、室温にて８０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、ミクロ遠心管の底部に細胞を沈殿させて集菌を行った。遠心処理後、このミクロ遠心管における上清を除去し、細胞ペレットをミクロ遠心管ごと液体窒素に浸し、細胞ペレットをミキサーにより３０秒間にわたって粉砕処理を行った。粉砕処理を行った後に、ミクロ遠心管にＤＭＳＯを１ｍｌ加え、ボルテックスにより１５分振動させて色素であるクロロフィルを抽出した。

その後、室温において、８０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、新たなミクロ遠心管に上清（色素抽出液）を移して色素であるクロロフィルを回収した。そして、細胞ペレットが白色となるまで、ミクロ遠心管にＤＭＳＯを１ｍｌ加え、ボルテックスにより１５分振動させて、遠心分離を行うクロロフィルの抽出処理を繰り返して行った。
そして、分光光度計によって、このクロロフィルの色素抽出液の６４９ｎｍ、６６５ｎｍ及び７５０ｎｍにおける光の吸収を吸光度として測定した。この吸光度の測定結果において、クロロフィルの色素濃度は、以下の式により求めた。
クロロフィル量（μｇ／ｍｌ）＝
１４．８５（Ａ_６６５−Ａ_７５０）−５．１４（Ａ_６４９−Ａ_７５０）
この式において、１４．８５及び５．１４は比例定数であり、Ａ_６６５は６６５ｎｍにおける吸光度であり、Ａ_６４９は６４９ｎｍにおける吸光度であり、Ａ_７５０は７５０ｎｍにおける吸光度である。このとき得られたクロロフィル量を、クロロフィルの抽出に用いた細胞数で除算して細胞当たりのクロロフィル量を算出した。

上述したように、異なる撮像画像における輝度比の異なる複数の撮像画像を撮像した試料から、クロロフィルの色素濃度を求めた。
そして、細胞画像内のＧ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を求め、この平均値の比である輝度比とクロロフィルの抽出量との対応を示す回帰式を、すなわちクロロフィルの量を推定する回帰式を図６の相関を求める回帰分析により求めた。

＜顕微鏡における撮像画像の撮像処理＞
ヘマトコッカスの新鮮培地への接種後の細胞形態の経時変化を観察するため、以下のようにヘマトコッカスの細胞培養を行った。すなわち、ヘマトコッカスの撮像画像の顕微鏡撮影及び回帰式を求めるためのアスタキサンチン量の定量のための試料は以下のように調製した。なお、培地におけるヘマトコッカスの細胞培養は、連続光の下で３ヶ月間にわたって行った。
そして、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ Ｋ００８４株の培養液１０ｍｌを、３００ｍｌ容量のフラスコに挿入した９０ｍｌの培地に対して接種した。また、周囲温度２５℃において４５μＥ（アインシュタイン）ｍ^−２ｓ^−１の光量子束密度の白色光の下で静置することで培養を行った。
そして、培養開始直後、７日目、１４日目に３０μｌを、フラスコから分取して、顕微鏡観察及び撮像画像の撮像を行った。

本実施形態におけるヘマトコッカスの培養を行う培地は、４．０５５ｍＭのＫＮＯ_３、０．３４７ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１８９ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、０．３０４ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．１７５ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、２．９７μＭのＥＤＴＡ（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_８）、３１．２μＭのＣｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ（クエン酸）、１．６８μＭのＣｏ（ＮＯ_３）_２、３８．１７μＭのＦｅ（III）ＮＨ_３ｃｉｔｒａｔｅ（クエン酸塩）、４．７μＭのＨ_３ＢＯ_３、０．９１μＭのＭｎＣｌ_２、０．０７μＭのＺｎＳＯ_４、０．１７μＭのＮａ_２ＭｏＯ_４、０．０３μＭのＣｕＳＯ_４の各々を含む溶液である。

また、培地におけるヘマトコッカスの顕微鏡観察は、以下のように行った。
１ｍｍ厚スライドグラスの表面に対し、ネイルエナメルにより各辺が１ｃｍの正四角形の枠を形成し、この枠内に対してヘマトコッカスの培養液の３０μｌを滴下した。そして、０．１７ｍｍ厚カバーグラスを用い、ネイルエナメルの枠を、ネイルエナメルにより封じてプレパラートを調製した。また、顕微鏡観察は、４０倍対物レンズを装着した正立型顕微鏡を用い、顕微鏡画像の撮影にはカラーＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）カメラにおいて解像度２０４０×１５３６ピクセル（画素数約３００万画素）を用いた。そして、撮像した撮像画像は、ＲＧＢ形式（Ｒ画素、Ｇ画素及びＢ画素）からなるＪＰＥＧ（Ｊｏｉｎｔ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｅｘｐｅｒｔｓ Ｇｒｏｕｐ）画像として、画像記憶部２１に対し、制御部１１を介して保存した。

＜細胞観察装置の動作説明＞
次に、本実施形態による細胞観察装置１の細胞観察の動作を図７及び図８を用いて説明する。図７は、本実施形態による細胞観察装置１における細胞観察の処理の動作例を示すフローチャートである。図８は、エッジ画像と色素体画像とを重ね合わせた、細胞画像の最外縁部を示す図である。図８の（ａ）は撮像装置１００が撮像した明視野画像である撮像画像を示している。本実施形態においては、細胞に対して蛍光染色などの前処理は一切行っていない。図８の（ｂ）は、色素体領域抽出部１４の生成する色素体画像を示している。
図８の（ｃ）は、輪郭抽出部１７の抽出した細胞領域画像を示している。図８の（ｄ）は、色素体画像と細胞領域画像とを重ね合わせた画像であり、細胞画像の最外縁部を示している。

すでに述べたように、以下の画像解析処理が行われる前に、観察者は、培地のプレパラートを調製し、このプレパラートにおけるヘマトコッカスの細胞の撮像画像をＣＣＤカメラにより撮像する。この撮像画像の撮像を行う際、観察者はヘマトコッカスの細胞同士が鉛直方向に重なっておらず、かつ他の細胞と接していない視野の領域を検索する。すなわち、ヘマトコッカスの細胞がプレパラート面において、他の細胞と接触せずに一層で配列した領域を検索する。

また、明らかに異常な細胞や異物があると判定される領域、かつスライドガラス及び壁−グラスに汚れがあり細胞周囲の背景に色のむらがある領域を避けて、ヘマトコッカスの撮像を行う。また、これらの視野を複数抽出し、同一細胞を複数回撮像しないように一定方向に顕微鏡のステージを移動させつつ、撮像画像の撮像を行う（０．５秒／枚）。例えば、２００個の細胞数の情報が得られる枚数の撮像画層を撮像する。

ステップＳ１：
観察者は、画像記憶部２１に記憶された撮像画像における細胞画像の色合い調整の処理を、図示されていない入力手段（例えば、キーボード）から制御信号を入力することにより、細胞観察装置１に対して実行させる。
制御部１１は、解析処理の制御信号が入力手段から供給されると、画像記憶部２１から撮像画像のデータ（図８の（ａ））を読み出し、読み出した撮像画像を色合い調節部１２に対して供給する。
色合い調節部１２は、撮像画像のＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値のヒストグラムをそれぞれ集計し、最頻値の輝度を背景の輝度値として選択する。

これにより、色合い調節部１２は、撮像画像のＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値を、細胞の画像である細胞画像以外の背景領域がグレーとなるように、Ｒ画素、Ｇ画素及びＢ画素各々の輝度値を調整する。
そして、制御部１１は、Ｒ画素、Ｇ画素及びＢ画素が調整された撮像画像を画像表示部２４及び輪郭抽出部１３に対して供給し、画像記憶部２１に対して書き込む。以下のステップＳ２からの画像処理は、背景領域がグレーに調整された後の撮像画像を用いて行う。

ステップＳ２：
輪郭抽出部１３は、撮像画像の１ピクセルを構成するＲＧＢの各画素のデータから、Ｒ画素のデータを抽出する。
そして、輪郭抽出部１３は、抽出したＲ画素のデータに対して輝度の最小値と最大値が０と２５５となるように輝度値を調節する。

そして、輪郭抽出部１３は、調節したＲ画素のデータを用いて、Ｃａｎｎｙ法により撮像画像内の画像の形状のエッジ（輪郭）のピクセルの抽出を行う。ここで、Ｒ画素を用いるのは、例えば微細藻類であるヘマトコッカスの細胞膜が赤色であるため、撮像画像における細胞の画像のエッジを抽出するのに都合が良いからである。
また、輪郭抽出部１３は、抽出したエッジの画像を画像分割部１５に対して出力する。

ステップＳ３：
輪郭抽出部１３におけるエッジ抽出が終了すると、制御部１１は、輪郭抽出部１３に対して供給した撮像画像を、色素体領域抽出部１４に対して供給する。
色素体領域抽出部１４は、撮像画像の１ピクセルを構成するＲＧＢの各画素のデータから、Ｂ画素のデータを抽出する。
そして、色素体領域抽出部１４は、撮像画像内において、各Ｂ画素の輝度値をＯｔｓｕ法により二値化して、細胞内の色素体（アスタキサンチン及びクロロフィルの色素体）の領域である色素体領域のピクセルを抽出する。また、色素体領域抽出部１４は、二値化により黒となった色素体の領域を色素体画像（図８の（ｂ））として、画像分割部１５に対して出力する。

ステップＳ４：
画像分割部１５は、輪郭抽出部１３から供給されたエッジ画像と、色素体領域抽出部１４から供給された色素体画像とを重ね合わせて、エッジ画像における余分なエッジ部分の削除と、エッジ画像に不足する細胞の形状の補足を行い、新たなエッジ画像を生成する。
次に、画像分割部１５は、抽出する対象物である撮像画像における細胞の画像の領域を抽出するため、抽出されたエッジ画像の情報を用いて、ｗａｔｅｒ−ｓｈｅｄ法により撮像画像のセグメンテーション（領域分割）を行う。
また、画像分割部１５は、セグメンテーションした領域の境界線を細線化、すなわち撮像画像におけるセグメントの境界線（ピクセル１個分の幅の境界線）を生成する。

ステップＳ５：
画像合成部１６は、撮像画像における１ピクセルを構成するＲＧＢの画素、すなわちＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の二値化を、上述したＯｔｓｕ法により行う。
そして、画像合成部１６は、二値化されて１ピクセルを構成するＲＧＢの画素のうち少なくとも一つの輝度値が閾値以下の画素の領域である画素集合領域を抽出する。実際には、この画素集合領域が撮像画像内における細胞の画像の領域内に含まれている。

ステップＳ６：
画像合成部１６は、撮像画像における画素集合領域の画像に対して、セグメントの境界線を重ね合わせて、セグメント毎の上述した画素集合領域の割合を求める。そして、画像合成部１６は、セグメント内における画素集合領域の割合が予め設定した割合を超えるセグメントを、撮像画像内の細胞の画像の領域である細胞セグメントとして選択する。この時点では、まだ実際の細胞の領域ではない背景領域が含まれている可能性がある。

ステップＳ７：
このため、画像合成部１６は、選択された細胞セグメント毎に、細胞セグメント内のＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素各々の画素値の平均値及び分散を算出する。
そして、画像合成部１６は、Ｒ画素、Ｇ画素及びＢ画素の少なくともいずれか一つの種類の画素の輝度値の分散の大きい細胞セグメントを、撮像画像内の細胞の撮像された領域に対応する細胞セグメントとして選択する。

また、画像合成部１６は、細胞セグメントとして選択された以外のセグメントを背景セグメントとする。
セグメントの選択処理が終了すると、画像合成部１６は、細胞セグメント及び背景セグメントを合成し、細胞画像と背景画像とを形成して合成画像とする。
上述した細胞セグメントと背景セグメントとの分類処理は、背景セグメントに比較して細胞セグメントにおける輝度値の分散が大きい事実を利用して行っている。

ステップＳ８：
次に、細胞領域抽出部１７は、合成画像における細胞画像とされる画像領域を選択するため、すでに説明したｗａｔｅｒ−ｓｈｅｄ法により、合成画像から細胞画像とされる画像領域をセグメント領域として分割する。

ステップＳ９：
そして、細胞領域抽出部１７は、分割されたセグメント各々のうち撮像画像の縁に接しているセグメントをＴｏｕｃｈとして振り分ける。さらに、残りのセグメントを、Ｃｈｏｒｄｉｏｇｒａｍを用いて、円状のモデル画像に近い円状セグメントと、円状のモデル画像とは異なる非円状セグメントとに振り分ける。この円に近い円状セグメントが、微細藻類の細胞、すなわちヘマトコッカスとして認識する。
また、細胞領域抽出部１７は、円状セグメント以外の非円状セグメントを統合し、最終的な細胞領域画像（図８の（ｄ））として、細胞構造抽出部に対して出力する。

ステップＳ１０：
細胞構造抽出部１８は、すでに説明した撮像画像内における細胞画像における図３に示す数値情報を算出して、細胞画像毎にテーブル記憶部２３に書き込んで記憶させる。
また、このとき、細胞形態検出部１９は、細胞画像において、色素体領域抽出部１４が色素体領域として検出した領域におけるＲ画素及びＧ画素の輝度値の抽出を行う。そして、細胞形態検出部１９は、双方の輝度値がともに予め設定された閾値未満の場合、この細胞をツボカビと判定し、この細胞の図３の数値情報におけるＴｙｐｅに対して「混入他種生物」を記入する。

ステップＳ１１：
制御部１１は、画像記憶部２１内の全ての撮像画像に対して、画像解析処理が終了したか否かの判定を行う。
このとき、制御部１１は、画像記憶部２１内の全ての撮像画像の画像解析処理が終了した場合、処理をステップＳ１２に対して進める。
一方、制御部１１は、画像記憶部２１内の全ての撮像画像の画像解析処理が終了していない場合、処理をステップＳ１に戻し、新たな撮像画像を画像記憶部２１から読み出し、画像解析処理を継続する。

ステップＳ１２：
細胞構造抽出部１８は、テーブル記憶部２３に記憶されている図３に示す数値テーブルから数値情報を読み出し、図４に示す数値情報Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ、Ａｌｇａｅ、Ｏｔｈｅｒ、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔの数値情報を算出し、観察対象の細胞のフォルダ毎に書き込んで記憶させる。このフォルダには、例えば、所定の日時において、アスタキサンチン及びクロロフィルの色素量の算出に用いた複数の撮像画像における細胞画像から求めた数値情報が記憶される。

上述したように、本実施形態によれば、微細藻類など細胞の顕微鏡写真である撮像画像から抽出したエッジ画像と色素体画像とを重ね合わせ、色素体画像によりエッジ画像にて不足する細胞の画像領域の外形を補足するため、撮像画像内の細胞画像の外形を従来に比較して精度良く抽出でき、細胞の全体的な形状及び細胞内における色素体領域（例えば、生成される産生物質の領域）の割合も容易に検出することができる。

＜細胞内に蓄積された色素量の推定処理＞
制御部１１は、撮像画像の画像解析処理が終了した後、色素値抽出部２０に対して、色素量の抽出処理を行わせる。

色素値抽出部２０は、テーブル記憶部２３からＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞画像内におけるＲ画素の輝度値の平均値）と、ＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞画像内におけるＢ画素の輝度値の平均値）とをフォルダ内にある全ての目的藻類の細胞画像の数値情報から読み出す。
次に、色素値抽出部２０は、全細胞画像のＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙを加算してＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値を求め、同様に全細胞画像のＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙを加算してＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値を求める。

そして、色素値抽出部２０は、ＯｕｔｅｒＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値をＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値により除算し、Ｒ画素及びＢ画素の輝度比であるＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを算出する。色素値抽出部２０は、算出したＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを、テーブル記憶部２３の図４の数値情報として書き込んで記憶させる。
次に、色素値抽出部２０は、記憶部２２からアスタキサンチン算出用の回帰式を読み出し、求めたＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒをこの回帰式に代入し、細胞当たりのアスタキサンチンの蓄積量を求め、Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎとして、テーブル記憶部２３の図４の数値情報として書き込んで記憶させる。

次に、色素値抽出部２０は、テーブル記憶部２３からＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞画像内におけるＧ画素の輝度値の平均値）と、ＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞画像内におけるＢ画素の輝度値の平均値）とをフォルダ内にある全ての目的藻類の細胞画像の数値情報から読み出す。
次に、色素値抽出部２０は、全細胞画像のＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙを加算してＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値を求め、同様に全細胞画像のＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙを加算してＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値を求める。

そして、色素値抽出部２０は、ＯｕｔｅｒＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値をＯｕｔｅｒＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ加算値により除算し、Ｒ画素及びＢ画素の輝度比であるＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを算出する。色素抽出部１９は、算出したＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒを、テーブル記憶部２３の図４の数値情報として書き込んで記憶させる。
次に、色素値抽出部２０は、記憶部２２からクロロフィル算出用の回帰式を読み出し、求めたＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒをこの回帰式に代入し、細胞当たりのアスタキサンチンの蓄積量を求め、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌとして、テーブル記憶部２３の図４の数値情報として書き込んで記憶させる。

図９は、新鮮培地に対してヘマトコッカスを接種後、細胞観察装置１により測定したアスタキサンチンとクロロフィルとの蓄積量の変化を示すグラフである。この図９において、縦軸が細胞当たりの色素量（蓄積量）を示し、横軸が培養期間（週）を示している。
図９から判るように、培地に対するヘマトコッカスの接種後に、接種直後（０週）、１週、２週後において、アスタキサンチン及びクロロフィルの蓄積量が増加している。
この結果は、実際のヘマトコッカスの細胞において、アスタキサンチンの蓄積量は１週間後にプラトーに達し、クロロフィルの蓄積量は時間経過により増加するとの知見と一致している。したがって、本実施形態による細胞観察装置１は実際に細胞を破壊して色素体の蓄積量を測定せずとも、培養している状態のまま色素の蓄積量を正確に推定することが可能である。

＜ヘマトコッカスの成長の推定処理＞
図１０は、細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報（ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）、ＯｕｔｅｒＡｒｅａ）と、目視による細胞の分類との対応を示す図である。図１０において、縦軸は細胞画像の長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）を示し、横軸は細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを示している。
また、「＋」マークは目視により遊走子として判定された細胞であり、「〇」マークが目視により遊走子からパルメラ細胞へ移行途中の移行細胞として判定された細胞であり、「×」マークが目視によりパルメラ細胞（アスタキサンチンを色素として産生するヘマトコッカスの細胞）として判定された細胞である。

すなわち、新鮮培地に接種すると、ヘマトコッカスの細胞は、内生胞子を形成し、胞子は出芽すると、鞭毛を持ち運動性のある遊走子になる。そして、遊走子はしばらくすると、鞭毛が消失し、運動性を失ったパルメラ細胞になる。図１０はこの生理状態の異なる遊走子とパルメラ細胞との判別を行うための条件を見出すための図である。
新鮮培地に移した後のヘマトコッカスの細胞に対して、２０枚の撮像画像においてヘマトコッカスの細胞を目視で遊走子とパルメラ細胞と判別できない移行状態の細胞との３種類に分類した。
そして、撮像画像を本実施形態の細胞観察装置１により解析し、ヘマトコッカスの細胞と判定した計１３８種類の細胞についての定量値を利用し、遊走子とパルメラ細胞との判別を行った。細胞のサイズ（面積）と細胞の長軸短軸比について、上述したように遊走子を「＋」で表し、パルメラ細胞を「×」で表し、移行状態の細胞を「○」で表してプロットされている。この図１０のグラフにおいて、細胞の面積が３０００ピクセル未満の領域に遊走子の８７％が、細胞の面積が３０００ピクセル以上の領域にパルメラ細胞の９６％が含まれることが判明した。

したがって、この細胞の面積が３０００ピクセル以上をパルメラ細胞と判別し、細胞の面積が３０００未満のピクセルを遊走子と判別することができる。また、長軸短軸比にも特徴があるため、ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）＞１．０５であり、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａが３０００ピクセル未満の細胞画像は遊走子と判定し、一方、ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）≦１．０５であり、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａが３０００ピクセル以上の細胞画像はパルメラ細胞と判定することにより、遊走子とパルメラ細胞とを区分することが可能である。この判定は、細胞形態検出部１９が行っている。

また、図２に示されているように、観察者の知見において、細胞の面積が３０００ピクセル未満であり、長短短軸比（Ｌ／Ｓ）が１．０５以上の細胞は遊走子であり、一方、細胞の面積が３０００ピクセル以上であり、長短短軸比（Ｌ／Ｓ）が１．０５未満の細胞がパルメラ細胞とされている。この結果からも、観察者の知見に対して、本実施形態による細胞観察装置１の判別とは同様となることが判る。

また、本実施形態においては、観察対象の細胞としてヘマトコッカスを例として説明したが、このヘマトコッカスに限らず、単細胞であれば観察対象としてはいずれの細胞に対しても適用可能である。例えば、ヘマトコッカス以外の微細藻類としては、クロレラ、ナノクロロプシス、ドナリエラ、ボトリオコッカスなどの他の細胞において特徴的な形態を定量化することができる。

＜重回帰分析によるヘマトコッカスの細胞内の色素量の推定＞
次に、細胞画像内のピクセルにおける赤チャンネル（Ｒ画素）、緑チャンネル（Ｇ画素）及び青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値を用いたアスタキサンチン（カロテノイド）量及びクロロフィル量の各々の推定について説明する。アスタキサンチンは、カロテノイドの一種である。
すでに、図５においては、細胞画像内におけるＲ画素とＢ画素との輝度値の平均値を用いた回帰式により、アスタキサンチン量の推定の説明をしている。また、図６においては、細胞画像内におけるＧ画素とＢ画素との各々の輝度値を用いた回帰式により、クロロフィル量の推定の説明をしている。
しかしながら、本実施形態においては上述したように、細胞画像内におけるＲ画素及びＢ画素の輝度値の平均値に対して、細胞画像内におけるＧ画素の輝度値の平均値を加え、細胞画像内におけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の各々の輝度値の平均値から、細胞の産生する色素量を求める重回帰式を用いて、アスタキサンチン量及びクロロフィル量の各々を求めている。アスタキサンチン量を求める重回帰式とクロロフィル量を求める重回帰式とは、各々異なる重回帰式（後述）であり、予め記憶部２２に書き込まれて記憶されている。

また、この重回帰式を用いた色素量の推定は、すでに説明した色素値抽出部２０が行う。色素値抽出部２０は、記憶部２２からアスタキサンチン算出用の重回帰式を読み出し、細胞画像内のＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の各々の輝度値の平均値を、アスタキサンチン及びクロロフィルの各々の重回帰式に代入し、細胞当たりのアスタキサンチンあるいはクロロフィルの蓄積量（アスタキサンチン量、クロロフィル量）を求め、ＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎあるいはＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌとして、テーブル記憶部２３の図４の数値情報として書き込んで記憶させる。

図１１は、実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの培養液１ｍｌあたりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定した色素量との相関を示すグラフである。図１１のグラフは、縦軸が重回帰式により推定した細胞当たりのクロロフィルの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）から換算した培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量（μｇ／ｍｌ）を示し、横軸が実測した培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量（μｇ／ｍｌ）を示している。図１１における相関の決定係数Ｒ^２は、０．９９９である。このクロロフィル量推定用の重回帰式は、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の各々の輝度値と、実測した細胞あたりのクロロフィル量との対応との相関をとる重回帰分析により生成した。

図１１においては、トレーニングデータとして用いた観察対象細胞（ＬＬ条件で培養した培養細胞）のクロロフィル量の実測値と、このトレーニングデータとして用いた観察対象細胞の細胞画像から求めたＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値から重回帰式を用いて求めたクロロフィルの推定量との相関を示している。また、培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量の測定については、図６の説明にある処理と同様のクロロフィルを抽出する処理を行い、細胞からクロロフィルを抽出して、培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量を求めた。ＬＬ条件とは、細胞を培養する際、所定の照度で常に明るい状態の環境に置くという培養条件である。

図１２は、実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの培養液１ｍｌあたりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定した色素量との相関を示すグラフである。図１２のグラフは、図１１のグラフと同様に、縦軸が重回帰式により推定した細胞当たりのクロロフィルの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）から換算した培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量（μｇ／ｍｌ）を示し、横軸が実測した培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量（μｇ／ｍｌ）を示している。図１２における相関の決定係数Ｒ^２は、０．９６３である。このクロロフィル量推定用の重回帰式は、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の各々の輝度値と、実測した細胞あたりのクロロフィル量との対応との相関をとる重回帰分析により生成した。

図１２においては、テストデータとして用いた観察対象細胞（ＬＤ条件で培養した培養細胞）のクロロフィル量の実測値と、このテストデータとして用いた観察対象細胞の細胞画像から求めたＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値から重回帰式を用いて求めたクロロフィルの推定量との相関を示している。また、培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量の測定については、図６の説明にある処理と同様のクロロフィルを抽出する処理を行い、細胞からクロロフィルを抽出して、培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量を求めた。ＬＤ条件とは、細胞を培養する際、所定の照度の明るい状態と、所定の照度の暗い状態とを、予め設定した周期で繰り返す環境に置くという培養条件である。

また、図１２は、上述したように、図１１で説明したＬＬ条件で培養した細胞をトレーニングデータとして生成した重回帰式を用い、ＬＤ条件で培養した細胞をテストデータとして培養液１ｍｌあたりのクロロフィル量を測定している。ＬＬ条件とＬＤ条件との各々は、培養条件が異なり、培養細胞の統計的な母集団として全く異なる集団である。しかしながら、図１２における実測値と推定値との相関における決定係数Ｒ^２は、０．９６３であり、異なる集団（ＬＬ条件で培養した細胞の集団）で作成した重回帰式であっても、ＬＤ条件で培養した細胞におけるクロロフィル量の実測値と、ＬＬ条件で培養した細胞を用いて生成した重回帰式で推定したクロロフィル量の推定値とが高い相関を有している。これにより、本実施形態におけるクロロフィル量を推定する重回帰式が、精度の高いクロロフィル量の推定処理を行うことが可能であることが解る。

図１３は、実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの培養液１ｍｌあたりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定したアスタキサンチンの色素量との相関を示すグラフである。図１３のグラフは、縦軸が推定した細胞当たりのアスタキサンチンの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）から換算した培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量（μｇ／ｍｌ）を示し、横軸が実測した培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量（μｇ／ｍｌ）を示している。図１３における相関の決定係数Ｒ^２は、０．９６３である。

図１３においては、トレーニングデータとして用いた観察対象細胞（ＬＬ条件で培養した培養細胞）のアスタキサンチン量の実測値と、このトレーニングデータとして用いた観察対象細胞の細胞画像から求めたＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値から重回帰式を用いて求めた推定量との相関を示している。また、培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量の測定については、図５の説明にある処理と同様のアスタキサンチンを抽出する処理を行い、細胞からアスタキサンチンを抽出して、培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量を求めた。ＬＬ条件とは、細胞を培養する際、所定の照度で常に明るい状態の環境に置くという培養条件である。

図１４は、実測した観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの培養液１ｍｌあたりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値の平均値を用いた重回帰式から推定したアスタキサンチンの色素量との相関を示すグラフである。図１４のグラフは、図１３のグラフと同様に、縦軸が推定した細胞当たりのアスタキサンチンの蓄積量（ｐｇ：ピコグラム）から換算した培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量（μｇ／ｍｌ）を示し、横軸が実測した培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量（μｇ／ｍｌ）を示している。図１４における相関の決定係数Ｒ^２は、０．９７５である。

図１４においては、テストデータとして用いた観察対象細胞（ＬＤ条件で培養した培養細胞）のアスタキサンチン量の実測値と、このテストデータとして用いた観察対象細胞の細胞画像から求めたＲ画素、Ｇ画素及びＢ画素の輝度値から重回帰式を用いて求めた推定量との相関を示している。また、培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量の測定については、図５の説明にある処理と同様のアスタキサンチンを抽出する処理を行い、細胞からアスタキサンチンを抽出して、培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量を求めた。ＬＤ条件とは、細胞を培養する際、所定の照度の明るい状態と、所定の照度の暗い状態とを、予め設定した周期で繰り返す環境に置くという培養条件である。

また、図１４は、上述したように、図１３で説明したＬＬ条件で培養した細胞をトレーニングデータとして生成した重回帰式を用い、ＬＤ条件で培養した細胞をテストデータとして培養液１ｍｌあたりのアスタキサンチン量を測定している。ＬＬ条件とＬＤ条件との各々は、培養条件が異なり、培養細胞の統計的な母集団として全く異なる集団である。しかしながら、図１４における実測値と推定値との相関における決定係数Ｒ^２は、０．９７５であり、異なる集団（ＬＬ条件で培養した細胞の集団）で作成した重回帰式であっても、ＬＤ条件で培養した細胞におけるアスタキサンチン量の実測値と、ＬＬ条件で培養した細胞を用いて生成した重回帰式で推定したアスタキサンチン量の推定値とが高い相関を有している。これにより、本実施形態におけるアスタキサンチン量を推定する重回帰式が、精度の高いアスタキサンチン量の推定処理を行うことが可能であることが解る。

図１５は、クロロフィル量及びカロテノイド量の各々を推定するために用いる重回帰分析の式を説明する図である。図１５のグラフは、縦軸が培養液１ｍｌあたりに換算した色素量（μｇ／ｍｌ）を示し、横軸が培養を開始してから経過した時間（日数）を示している。図１５において、黒丸が実際に測定したクロロフィル量の測定値であり、白丸が重回帰式で推定したクロロフィル量である。また、黒三角が実際に測定したカロテノイド量の測定値であり、白三角が重回帰式で推定したカロテノイド量である。

また、以下に示すクロロフィル濃度（ｐｇ／ｃｅｌｌ）の重回帰式（図１５にも提示）は、１個の細胞あたりに含まれるクロロフィル量を推定する式である。
Ｙ_ｃｈｌ＝−０．４６×Ｉ_Ｒ＋０．５６×Ｉ_Ｇ−０．８３×Ｉ_Ｂ−７２．０１
また、以下に示すカロテノイド濃度（ｐｇ／ｃｅｌｌ）の重回帰式（図１５にも提示）は、１個の細胞あたりに含まれるカロテノイド量を推定する式である。
Ｙ_ｃａｒ＝０．７５×Ｉ_Ｒ−０．２２×Ｉ_Ｇ−０．２７×Ｉ_Ｂ−６１．８３

また、これらの重回帰式において、Ｙ_ｃｈｌがクロロフィル濃度を示し、Ｙ_ｃａｒがカロテノイド濃度を示している。Ｉ_Ｒは、細胞画像内の色素体における赤チャンネルの輝度値の平均値である。Ｉ_Ｇは、細胞画像内の色素体における緑チャンネルの輝度値の平均値である。Ｉ_Ｂは、細胞画像内の色素体における青チャンネルの輝度値の平均値である。
上述した重回帰式は、以下の基本式における係数ａ、ｂ、ｃ、ｄの各々の値を重回帰分析で求めて生成した。
Ｙ＝ａＩ_Ｒ＋ｂＩ_Ｇ＋ｃＩ_Ｂ＋ｄ
上記式において、係数ａは、色素体のピクセルの赤チャンネルの輝度値の平均値に乗算する係数である。係数ｂは、色素体のピクセルの緑チャンネルの輝度値の平均値に乗算する係数である。係数ｃは、色素体のピクセルの青チャンネルの輝度値の平均値に乗算する係数である。係数ｄは、重回帰式における定数である。

＜ランダムフォレスト法によりヘマトコッカスの遊走子とパルメロイドとの判別＞
次に、ランダムフォレスト（Random forests）法によって、観察対象の培養細胞が遊走子とパルメロイドとのいずれかであるかの判別を行う判別処理について説明する。本項において、基本的には、ランダムフォレスト法による機械学習を用いて、撮像画像に含まれる細胞画像が示す細胞各々を、遊走子とパルメロイドとにそれぞれ分離するクラスタリング処理用の樹木モデルを生成する。そして、生成された樹木モデルを記憶部２２に予め書き込んで記憶させておく。本実施形態においては、パルメロイドはパルメラ細胞とも言う。

そして、細胞形態検出部１９は、記憶部２２から樹木モデルを読み出し、樹木モデルによる撮像画像に含まれる細胞画像のクラスタリングを行う。また、細胞形態検出部１９は、クラスタリング結果を、クラスタリング画像（例えば、後述する図２０の画像）で表示部２４に対して表示させ、その時点における遊走子とパルメロイドとの比率などをビジュアル的に表現させる。このクラスタリング画像を見ることにより、その時点の遊走子とパルメロイドとの比率を容易に視覚的に推定することができる。
また、細胞形態検出部１９は、クラスタリング結果の正解を入力されることにより、ランダムフォレスト法による機械学習を繰り返し、樹木モデルを更新していくように構成しても良い。

図１６は、遊走子とパルメロイドとの各々を撮像した撮像画像を示す図である。この図１６において、黒三角印で指し示している細胞がパルメロイドであり、矢印で指し示している細胞が遊走子である。すなわち、細胞Ｃ＿１、Ｃ＿２、Ｃ＿３、Ｃ＿４、Ｃ＿７の各々が遊走子であり、細胞Ｃ＿５、Ｃ＿６がパルメロイドである。
観察者が顕微鏡で観察した場合、パルメロイドと遊走子との区別は遊走子に鞭毛などがあって容易につくが、一方、培養している大量の細胞の全てを人間が判別し、パルメロイドと遊走子との数の比などを検出することは困難である。
上述した点を改善するため、樹木モデルによる培養細胞各々の数値的なクラスタリングのみでなく、クラスタリングの結果を表示装置にビジュアル的に表示することにより、遊走子とパルメロイドとの比率を明確に通知することができる。

図１７は、ランダムフォレスト法によって、トレーニングデータの培養細胞の２個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、トレーニングデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。２個のパラメータは、細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報である長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）と、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａとの各々である。また、図１７において、縦軸は細胞画像の長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）を示し、横軸は細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを示している。図１７において、トレーニングデータの細胞により生成した樹木モデルによるトレーニングデータの細胞の判別率は１００％である。判別率は、判別結果が遊走子を遊走子と判別し、パルメロイドをパルメロイドと判別する、判別の正答率を示すものである。この図１７を含め、後述する図１８、図１９及び図２０の各々において、白丸がパルメロイドの細胞を示し、白の菱形が遊走子の細胞を示している。

図１８は、ランダムフォレスト法によって、トレーニングデータの培養細胞の２個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、テストデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。２個のパラメータは、図１６の場合と同様に、細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報である長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）と、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａとの各々である。また、図１８において、図１７と同様に、縦軸は細胞画像の長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）を示し、横軸は細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを示している。図１８において、トレーニングデータの細胞により生成した樹木モデルによるテストデータの細胞の判別率は７９％である。
また、トレーニングデータ及びテストデータの各々の細胞は、新鮮培地に移した２日目あるいは３日目のヘマトコッカスの細胞を母集団として、この母集団からから抽出した６８２個の細胞を３４１個ずつに分けて、一方をトレーニングデータの細胞、他方をテストデータの細胞としたものである。

図１９は、ランダムフォレスト法の機械学習によって、トレーニングデータの培養細胞の２５個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、トレーニングデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。２５個のパラメータは、細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報である長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）と、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａとの各々に加え、図３及び図４に記載されている細胞観察装置１が画像解析から求めたパラメータの各々である。また、図１９において、縦軸は細胞画像の長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）を示し、横軸は細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを示している。図１９において、トレーニングデータの細胞により生成した樹木モデルによるトレーニングデータの細胞の判別率は１００％である。

図２０は、ランダムフォレスト法の機械学習によって、トレーニングデータの培養細胞の２５個のパラメータを用いて生成した樹木モデルにより、テストデータの培養細胞をクラスタリングした結果を示す図である。２５個のパラメータは、図１９の場合と同様に、細胞観察装置１が画像解析から求めた細胞画像の数値情報である長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）と、細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａとの各々に加え、図３及び図４に記載されている細胞観察装置１が画像解析から求めたパラメータの各々である。また、図２０において、図１９と同様に、縦軸は細胞画像の長径及び短径の比ＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）を示し、横軸は細胞画像の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを示している。図２０において、トレーニングデータの細胞により生成した樹木モデルによるテストデータの細胞の判別率は８９％である。

上述したように、２個のパラメータの場合、テストデータの細胞に対するパルメロイドと遊走子との判別率は７９％であったが、２５個のパラメータの場合、８９％と１０％ほど精度が良くなっていることが解る。
また、図１７から図２０の各々は、細胞培養を開始してから２日目あるいは３日目の培養後に判別を行っている。したがって、細胞培養を初めてから、時系列に上述した樹木モデルにより判別を行った場合、クラスタリング結果により、遊走子とパルメロイドとの比率の変化などが図１７から図２０に示すように、ビジュアル的に確認することができる。
さらに、トレーニングデータを異なる細胞培養の株を用いて増やし、樹木モデルを更新することにより、より遊走子とパルメロイドとのクラスタリングの精度を向上させることができ、細胞の培養の経過観察が撮像した細胞画像により容易にできるようになる。

以下に、本実施形態におけるランダムフォレスト法における機械学習に用いた２５個のパラメータの各々を説明する。また、以下の図２１から図４５までの全てにおいて、白丸がＬＬ条件で培養された細胞の細胞画像から抽出されたパラメータの各々を示し、黒丸がＬＤ条件で培養された細胞の細胞画像から抽出されたパラメータの各々を示している。以下の各図において、細胞構造抽出部１８は、パラメータを抽出する際、パラメータが長さの単位である場合、細胞画像の測定したい線分におけるピクセル数をカウントし、このカウント数から実際の長さの寸法を判定、すなわちピクセル数からμｍ単位の長さの数値に変換する。また、パラメータが面積である場合、細胞画像の測定したい領域におけるピクセル数をカウントし、このカウント数から実際の面積の寸法を判定、すなわちピクセル数からμｍ^２単位の長さの数値に変換する。また、図２１から図４５までの各数値は、複数の細胞画像の測定値を平均した平均値である。

図２１は、培養した時間と培養細胞の細胞画像における周囲の長さを示すＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図２１において、縦軸がＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数（Ｄａｙ、以下の図２２から図４５の各々も同様）を示している。

図２２は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の重心の座標から細胞画像の外周までの距離の最大値を示すＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図２２において、縦軸がＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図２３は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の面積を示すＯｕｔｅｒＡｒｅａ（単位：μｍ^２）との対応関係を示す図である。図２３において、縦軸がＯｕｔｅｒＡｒｅａの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図２４は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の最小の幅（短軸）部分の寸法ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図２４において、縦軸がＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図２５は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の赤チャンネル（Ｒ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図２５において、縦軸がＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の全てのピクセルにおけるＲ画素の輝度値を加算し、加算結果をＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図２６は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の色素体の領域における面積であるＩｎｎｅｒＡｒｅａ（単位：μｍ^２）との対応関係を示す図である。図２６において、縦軸がＩｎｎｅｒＡｒｅａの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図２７は、培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における赤チャンネル（Ｒ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図２７において、縦軸がＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体内の全てのピクセルにおけるＲ画素の輝度値を加算し、加算結果をＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図２８は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の緑チャンネル（Ｇ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図２８において、縦軸がＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の全てのピクセルにおけるＧ画素の輝度値を加算し、加算結果をＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図２９は、培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における青チャンネル（Ｂ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図２９において、縦軸がＩｎｎｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体内における全てのピクセルにおけるＢ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＩｎｎｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３０は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の中心点から重心までの距離を示す数値であるＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＣｅｌｌＣｅｎｔｅｒＴｏＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図３０において、縦軸がＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＣｅｌｌＣｅｎｔｅｒＴｏＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像のピクセル値から、細胞画像の中心座標値と、細胞画像の重心の重心座標値を求め、中心座標値と重心座標値との差分を求め、この差分をＤｉｓｔａｎｃｅＦｒｏｍＣｅｌｌＣｅｎｔｅｒＴｏＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓとする。

図３１は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の青チャンネル（Ｂ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図３１において、縦軸がＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内における全てのピクセルにおけるＢ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３２は、培養した時間と細胞画像の色素体の領域内における緑チャンネル（Ｇ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図３２において、縦軸がＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体内における全てのピクセルにおけるＧ画素の輝度値を加算し、加算結果をＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３３は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の緑チャンネル（Ｇ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図３３において、縦軸がＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内における全てのピクセルにおけるＧ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３４は、培養した時間と細胞画像の重心から長軸の最も遠い座標点までのなす角度を示すＡｎｇｌｅＦｒｏｍＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓＴｏＦａｒＥｎｄＯｆＬｏｎｇＡｘｉｓ（単位：degree of angle）との対応関係を示す図である。図３４において、縦軸がＡｎｇｌｅＦｒｏｍＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓＴｏＦａｒＥｎｄＯｆＬｏｎｇＡｘｉｓの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像のピクセル値から、細胞画像の重心の重心座標値を求め、細胞画像の長軸の受信座標から最も遠い座標値とを抽出し、この重心座標と座標値の結ぶ直線と、細胞画像の長軸とのなす角度を検出し、この角度をＡｎｇｌｅＦｒｏｍＩｎｎｅｒＣｅｎｔｅｒＯｆＭａｓｓＴｏＦａｒＥｎｄＯｆＬｏｎｇＡｘｉｓとする。

図３５は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内全体の青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図３５において、縦軸がＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の全てのピクセルにおけるＢ画素の輝度値を加算し、加算結果をＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３６は、培養した時間と細胞画像の細胞内の色素体の周囲の長さを示すＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図３６において、縦軸がＩｎｎｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図３７は、培養した時間と細胞画像の細胞内の色素体の面積と細胞の面積との比を示すＡｒｅａＲａｔｉｏ（単位：μｍ^２／μｍ^２）との対応関係を示す図である。図３７において、縦軸がＡｒｅａＲａｔｉｏの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像のピクセル値から、細胞画像全体の面積により、色素体の面積を除算することにより、細胞画像全体の面積に対する色素体の面積の比を求め、この比をＡｒｅａＲａｔｉｏとする。

図３８は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内における色素体の青チャンネル（Ｂ画素）の輝度値の加算値を示す数値であるＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図３８において、縦軸がＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体の領域全てのピクセルにおけるＢ画素の輝度値を加算し、加算結果をＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図３９は、培養した時間と細胞画像におけるＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍ距離（すでに説明したパラメータ）を示す数値であるＯｕｔｅｒＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍＤｉｓｔａｎｃｅ（単位：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）との対応関係を示す図である。図３９において、縦軸がＯｕｔｅｒＣｈｏｒｄｉｏｇｒａｍＤｉｓｔａｎｃｅの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図４０は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の長軸と短軸との比を示す数値であるＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）（単位：μｍ／μｍ）との対応関係を示す図である。図４０において、縦軸がＯｕｔｅｒＡｘｉｓＲａｔｉｏ（Ｌ／Ｓ）の測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図４１は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の赤チャンネル（Ｒ画素）の平均輝度値を示す数値であるＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図４１において、縦軸がＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内における全てのピクセルにおけるＲ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図４２は、培養した時間と細胞画像の外周の円への適合度を示す数値であるＯｕｔｅｒＲｏｕｎｄｆｉｔｎｅｓｓ（単位：μｍ^２／μｍ^２）との対応関係を示す図である。図４２において、縦軸がＯｕｔｅｒＲｏｕｎｄｆｉｔｎｅｓｓの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。

図４３は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の色素体の赤チャンネル（Ｒ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図４３において、縦軸がＩｎｎｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体における全てのピクセルにおけるＲ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＩｎｎｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図４４は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の細胞内の色素体の緑チャンネル（Ｇ画素）の平均輝度値を示す数値であるＩｎｎｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（単位：color unit）との対応関係を示す図である。図４４において、縦軸がＩｎｎｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。ここで、すでに説明した細胞構造抽出部１８は、細胞画像内の色素体における全てのピクセルにおけるＧ画素の輝度値の平均値を計算し、計算結果をＩｎｎｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。

図４５は、培養した時間と培養細胞の細胞画像の最大の幅（長軸）部分の寸法ＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（単位：μｍ）との対応関係を示す図である。図２４において、縦軸がＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの測定値を示し、横軸が細胞を培養した日数を示している。
上述したランダムフォレスト法における樹木モデルの生成に、図２１から図４５までに示した２５個のパラメータが用いられている。

＜観察対象細胞（ヘマトコッカス）の成長の経時変化におけるダイナミズムの評価＞
次に、図２１から図４５までの２５個を含む細胞形態検出部１９が抽出するパラメータから、ヘマトコッカスの遊走子からパルメロイドへの成長過程における細胞形態の経時変化及び条件依存を検出する評価用のパラメータを主成分分析により抽出した。
この主成分分析において、第１主成分ＰＣ１の寄与率は５１％であった。第１主成分ＰＣ１は、上述した図２１から図４５までの２５個を含む細胞構造抽出部１８が抽出するパラメータの内、長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ、細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを含む８個のパラメータ（後述）と高い相関があることが解った。
この８個のパラメータとしては、例えば、図２１に示す細胞の周囲の長さＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ及び図２２に示す細胞画像の重心から外周までの最大幅ＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓなどは、時間変化に対して線形的な変化を有し、第１主成分ＰＣ１と高い相関を有している。

次に、図４６は、第１主成分ＰＣ１と培養を始めてからの経過時間との対応を示す図である。図４６において、縦軸が第１主成分ＰＣ１の得点数（score of ＰＣ１）を示し、横軸は培養を開始してからの経過時間（Ｄａｙ）を示している。
この図４６から解るように第１主成分の値は時間と共に減少しているが、ＬＬ条件とＬＤ条件とは変化の状態が異なる。しかしながら、ＬＬ条件及びＬＤ条件の各々により培養した細胞ともに、第１主成分ＰＣ１との相関があり、当然に時間変化に対しても相関がある。このため、ＬＬ条件及びＬＤ条件の双方に対して、第１主成分ＰＣ１と相関のあるパラメータは、観察対象細胞の時間経過における成長過程での形態変化を検出するパラメータとして用いることができることが解る。

次に、図４７は、第１主成分ＰＣ１と相関のある（すなわち、形態変化における時間経過と相関のある）８個のパラメータを説明する図である。８個のパラメータは、長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（図４５）、細胞の周囲の長さＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ（図２１）、重心から外周までの最大幅ＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓ（図２２）、細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａ（図２３）、短軸の長さＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（図２４）、細胞画像全体の赤チャンネルの輝度値の加算値ＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（図２５）、細胞内の色素部分（色素体）の面積ＩｎｎｅｒＡｒｅａ（図２６）、色素部分の赤チャンネルの輝度値の加算値ＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（図２７）の各々である。

したがって、細胞の経時変化における成長過程の形態を観察する際、上述したＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＯｕｔｌｉｎｅＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＭａｘＲａｄｉｕｓ、ＯｕｔｅｒＡｒｅａ、ＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ、ＯｕｔｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＩｎｎｅｒＡｒｅａ、ＩｎｎｅｒＴｏｔａｌＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの８個の各々を、時間経過に従いモニターすることにより、細胞の形態変化を細胞画像により検出することができる。したがって、細胞を培養する際、上述した８個のパラメータを観察することにより、統計的に、時間経過毎にどの程度の成長過程（どの程度の第１主成分ＰＣ１の数値）になければならないかの判定ができ、培養の環境の適あるいは不適を判定することができる。

次に、図４８は、鞭毛の発生及び消失と、培養を開始してからの経過時間との対応を示す図である。図４８において、縦軸が鞭毛の生じている細胞の出現の頻度である出現率（Fraction of flagellated cells）を示し、横軸は培養を開始してからの経過時間（Ｄａｙ）を示している。この図４８から細胞における鞭毛の発生のピークが、ＬＬ条件の培養の環境下の細胞の場合に１日目にあり、ＬＤ条件の培養の環境下の細胞の場合に２日目にあることが解った。出現率は細胞を培養している培地の測定領域における全細胞により、鞭毛を有する細胞の数を除算したものである。
また、それ以降の時間経過における鞭毛の消失の時間的変化に対し、ＬＬ条件及びＬＤ条件の各々の培養の環境下の細胞間に差はないことが解る。このパラメータから、培養を開始してから鞭毛を発生させるまでの成長の速度は、ＬＬ条件下での環境による培養の方が、ＬＤ条件下での環境による培養より速いことが解る。しかしながら、鞭毛が発生した後、遊走子からパルメロイドに成長するまでの過程は、ＬＬ条件及びＬＤ条件の各々の環境下による培養の差がないことも解る。

例えば、図３３に示す細胞内における緑チャンネルの輝度の平均値ＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、細胞培養を開始してから１０日目以降の変化が異なっている。すなわち、ＬＬ条件の環境下の培養においては、細胞を撮像した細胞画像におけるＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値が変化しない。
一方、ＬＤ条件の環境下の培養においては、細胞を撮像した細胞画像におけるＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値が大きく低下している。これは、ＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙが、ＬＤ条件の環境下において培養した細胞と、ＬＬ条件下で培養した細胞とを分離することができるパラメータであることが解る。

第１主成分ＰＣ１と相関が少ないパラメータは、細胞の成長における時間的変化と異なる要素、すなわち培養の条件及び環境により、成長過程の細胞形態が時間的に異なることが推定される。
したがって、第１主成分ＰＣ１と相関が少ないパラメータから、培養の条件及び環境に依存するパラメータを抽出することにより、上述したように、ＬＬ条件下とＬＤ条件下との各々において成長した細胞のクラスタリングを可能とする。
上述したように、本実施形態による細胞観察装置が抽出したパラメータから、観察対象細胞の経時的変化と条件及び環境依存的変化との各々の特徴を有するパラメータを主成分分析で抽出できた。
また、主成分分析で抽出したパラメータにより、観察対象細胞の成長における経時変化のダイナミズムを評価することができる。

＜クロレラの細胞の異なる株の判別分析＞
次に、判別分析により、クロレラ細胞の異なる株の判別分析を行った。例えば、本実施形態においては、クロレラの野生（ＷＴ）株と、この野生株から派生した変異（ミュータント）株ＰｋＥ６と、変異株ＰｋＥ８との判別分析を行った。判別分析は、事前に与えられているデータの各々が異なるグループに分離されることが明らかな場合、新しいデータが得られた際に、いずれのグループに入るかを判別する（クラスタリングを行う）ための基準（判別関数）を得るための手法である。以下の処理は、細胞形態検出部１９が図２１から図４５に示すパラメータのデータを用いて行う。

図４９は、粒子径と粒子数を同時に計測できる自動細胞数計測装置により検出した野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ６及び変異株ＰｋＥ８の各々の粒子径毎の出現した頻度である出現頻度を示す図である。図４９において、縦軸が出現頻度を示し、横軸が細胞の粒子径を示している。この粒子径は、本実施形態におけるパラメータＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈに対応している。図４９から解るように、粒子径については、変異株ＰｋＥ６が大きいことが、自動細胞数計測装置による測定により確認できた。ここで、ＷＴは、ｗｉｌｄｔｙｐｅの略である。

次に、図５０は、本実施形態による細胞観察装置１における細胞形態検出部１９が求めた、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ６及び変異株ＰｋＥ８の各々の粒子径毎の出現した頻度を示す図である。この図５０において、縦軸が出現した頻度を示し、横軸が細胞画像から抽出したパラメータＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈ（粒子径）を示している。また、図５０において、野生（ＷＴ）株は実線、変異株ＰｋＥ８は破線、変異株ＰｋＥ６は一点鎖線で示している。また、出現頻度は、細胞を培養している培地の測定領域における全細胞により、各粒子径においてそれぞれの粒子径を有する確率密度の総和を除算したものである。ここで、得られた各細胞の粒子径がそれぞれ正規分布によって分布すると仮定したカーネル密度推定法により、細胞が各粒子径を持つ確率密度を推定した。
この図５０から解るように、粒子径については、変異株ＰｋＥ６が大きいことが、本実施形態である細胞観察装置１による撮像画像における細胞画像の各々に対する画像解析でも確認できた。

ここで、細胞形態検出部１９は、撮像画像における所定の領域の細胞画像の粒子径を検出し、粒子径毎にこの粒子径を有する細胞の出現頻度を求めた。それをグラフ化したものが図５０である。
その結果、変異株ＰｋＥ６が最も大きく、次に変異株ＰｋＥ８が大きく、野生株（ＷＴ）が最も小さいことが解る。また、図５０から変異株ＰｋＥ８にも変異株ＰｋＥ６と同等の大きさの細胞の集団が存在していることが解る。

図５１は、図２１から図４５までに示したパラメータの有意差検定の結果を示すテーブルの図である。図５１のテーブルにおいて、ＩＤはパラメータ名を示し、ｋｗはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の検定結果を示し、ｅ６／ｗｔは変異株ＰｋＥ６と野生株（ＷＴ）とのＵ検定の対比較の結果を示し、ｅ８／ｗｔは変異株ＰｋＥ８と野生株（ＷＴ）とのＵ検定の対比較の結果を示し、ｅ６／ｅ８は変異株ＰｋＥ６と変異株ＰｋＥ８とのＵ検定の対比較の結果を示している。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の検定結果においては、２５個のパラメータ中において２０個のパラメータに有意差が検出された（Ｐ＜０．０５、Ｐ値の判定）。Ｕ検定においては、７５組の対のうちで３２組の対に有意差が検出された（Ｐ＜０．０５、Ｐ値の判定）。
上述した結果から、図５１に示すパラメータを用いて判別分析を行うことにより、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々を判別することが可能であることが予想される。

図５２は、判別分析の結果得られた判別関数ＬＤ１と判別関数ＬＤ２とによる野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の判別結果を示す図である。この図５２において、縦軸は判別関数ＬＤ２の得点を示し、横軸が判別関数ＬＤ１の得点を示している。また、図５２において、白丸が変異株ＰｋＥ６であり、黒丸が変異株ＰｋＥ８であり、白四角が野生（ＷＴ）株である。ここで、判別関数ＬＤ１の得点が＋側に大きくなるほど細胞における色素の色が薄くなり、一方、得点が−側に絶対値で大きくなるほど細胞における色素の色が濃くなる傾向である。また、判別関数ＬＤ２の得点が＋側に大きくなるほど細胞の大きさが小さくなり、一方、得点が−側に絶対値で大きくなるほど細胞の大きさが大きくなる傾向である。
上述したように、判別関数ＬＤ１は、細胞画像の細胞内あるいは色素体内におけるピクセルにおける各々の色のチャンネルの輝度を示すパラメータと相関が高い。一方、判別関数ＬＤ２は、判別関数ＬＤ２は、細胞画像の細胞の大きさを示すパラメータと相関が高い。
このように、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々がそれぞれのグループとして分離（クラスタリング）されていることが図５２から解る。

次に、図５３は、判別関数ＬＤ１及び判別関数ＬＤ２の各々と図２１から図４５までに示したパラメータとの相関係数を示すテーブルの図である。図５３のテーブルにおいて、ＩＤはパラメータ名を示し、ＬＤ１の項は判別関数ＬＤ１との相関係数を示し、ＬＤ２の項は判別関数ＬＤ２との相関係数を示している。この図５３のテーブルから、判別関数ＬＤ１は、細胞画像の細胞内あるいは色素体内におけるピクセルにおける各々の色のチャンネルの輝度を示すパラメータと相関が高いことが解る。一方、判別関数ＬＤ２は、判別関数ＬＤ２は、細胞画像の細胞の大きさを示すパラメータと相関が高いことが解る。

図５４は、判別関数ＬＤ１と相関の高い各色のチャネルの細胞のピクセルの平均輝度値（ＯｕｔｅｒＭｅａｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ）と、細胞の出現率との対応を示す図である。
図５４の（ａ）は、細胞のピクセルの赤チャンネルの輝度値の平均値と、その平均値を有する細胞の出現率との対応を示している。図５４の（ａ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸がパラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値を示している。ＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙについては、変異株ＰｋＥ８の輝度値の平均値は、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ６と比較して最も高い。変異株ＰｋＥ６の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８と同様に高い集団と、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８より低い集団との２つのピークが見られる。野生（ＷＴ）株の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８より低く、変異株ＰｋＥ６の輝度値の低い集団より高い。

図５４の（ｂ）は、細胞のピクセルの緑チャンネルの輝度値の平均値と、その平均値を有する細胞の出現率との対応を示している。図５４の（ｂ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸がパラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値を示している。ＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙについては、ＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙと同様に、変異株ＰｋＥ８の輝度値の平均値は、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ６と比較して最も高い。変異株ＰｋＥ６の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８と同様に高い集団と、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８より低い集団との２つのピークが見られる。野生（ＷＴ）株の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８より低く、変異株ＰｋＥ６の輝度値の低い集団より高い。

図５４の（ｃ）は、細胞のピクセルの青チャンネルの輝度値の平均値と、その平均値を有する細胞の出現率との対応を示している。図５４の（ｃ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸がパラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値を示している。ＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙについては、ＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙと同様に、変異株ＰｋＥ８の輝度値の平均値は、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ６と比較して最も高い。変異株ＰｋＥ６の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８及び野生（ＷＴ）株と比較して最も低い。野生（ＷＴ）株の輝度値の平均値は、変異株ＰｋＥ８より低く、変異株ＰｋＥ６より高い。

上述の処理において、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＲｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。同様に、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＧｒｅｅｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。また、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＭｅａｎＢｌｕｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。ここで、細胞が各粒子径を持つ確率密度の推定はカーネル密度推定法により行った。

図５５は、判別関数ＬＤ２と相関の高い細胞の大きさに関連するパラメータと、細胞の出現率との対応を示す図である。図５５の（ａ）は、長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈと、その長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈを有する細胞の出現率との対応を示している。図５５の（ａ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸が長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの数値を示している。長軸の長さＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈについては、変異株ＰｋＥ６のピークが野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も高い。野生（ＷＴ）株のピークは、変異株ＰｋＥ６及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も小さい。変異株ＰｋＥ８のピークは、野生（ＷＴ）株と変異株ＰｋＥ８との間にある。

図５５の（ｂ）は、短軸の長さＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈと、その短軸の長さＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈを有する細胞の出現率との対応を示している。図５５の（ｂ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸が短軸の長さＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの数値を示している。短軸の長さＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈについては、変異株ＰｋＥ６のピークが野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も高い。変異株ＰｋＥ８のピークは、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も小さい。野生（ＷＴ）株のピークは、変異株ＰｋＥ６と変異株ＰｋＥ８との間にある。

図５５の（ｃ）は、細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａと、その細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａを有する細胞の出現率との対応を示している。図５５の（ｃ）において、縦軸が細胞の出現率を示し、横軸が細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａの数値を示している。細胞の面積ＯｕｔｅｒＡｒｅａについては、変異株ＰｋＥ６のピークが野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も高い。変異株ＰｋＥ８のピークは、野生（ＷＴ）株及び変異株ＰｋＥ８と比較して最も小さい。野生（ＷＴ）株のピークは、変異株ＰｋＥ６と変異株ＰｋＥ８との間にある。

上述の処理において、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＬｏｎｇＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。同様に、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＳｈｏｒｔＡｘｉｓＬｅｎｇｔｈの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。また、細胞形態検出部１９は、野生（ＷＴ）株、変異株ＰｋＥ８、変異株ＰｋＥ６の各々の株単位に、パラメータＯｕｔｅｒＡｒｅａの数値毎に各細胞が出現する確率密度を推定し、推定した確率密度の総和を株全体の細胞数で除算して、出現率を算出する。ここで、細胞が各粒子径を持つ確率密度の推定はカーネル密度推定法により行った。

上述したように、本実施形態によれば、細胞内の輝度値に関するパラメータと相関のある判別関数ＬＤ１と、細胞の大きさに関するパラメータと相関のある判別関数ＬＤ２とを用いることにより、野生（ＷＴ）株と、変異株ＰｋＥ６と、変異株ＰｋＥ８との細胞を、それぞれの株のグループに分離することができる。

また、図１における細胞観察装置１の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより細胞の生理状態を検出し培養の管理を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。

また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。

以上、この発明の実施形態を図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

細胞による有用物質の生産量向上のため、培養条件の開発や有用物質高生産株の育種を行う際、細胞の培地に混入する他種生物などの混入状況、微細藻類の細胞による有用物質の生産量の各々をリアルタイムにモニターする細胞観察装置を提供することができる。

１…細胞観察装置 １１…制御部 １２…色合い調節部 １３…輪郭抽出部 １４…色素体領域抽出部 １５…画像分割部 １６…画像合成部 １７…細胞領域抽出部 １８…細胞構造抽出部 １９…細胞形態検出部 ２０…色素値抽出部 ２１…画像記憶部 ２２…記憶部 ２３…テーブル記憶部 ２４…表示部

【０００５】
非特許文献２：Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１２巻 （２００８年） ７０−８１ページ
非特許文献３：Ｅ．Ｂ．Ｃ． Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ．， Ｊ． Ｉｎｓｔ． Ｂｒｅｗ． ８３巻 （１９７７年）， １０９−１１８ページ
非特許文献４：Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７５巻 （２００９年），２５４５−２５５３ページ
非特許文献５：Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１５巻（２０１１年），８０３−８１１ページ
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［００１６］
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、微細藻類などの細胞による有用物質の生産量向上のため、培養条件の開発や有用物質高生産株の育種を行う際、この細胞の培地に混入する他種生物などの混入状況、微細藻類の細胞による有用物質の生産量の各々をリアルタイムにモニターする細胞観察装置、細胞観察方法及びそのプログラムを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［００１７］
本発明の細胞観察装置は、一層の細胞（平面上に細胞が重ならずに一層のみで配置されている状態）を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出部と、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出部と、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて、前記エッジ画像における余分なエッジ部分の削除と、前記エッジ画像に不足する細胞の形状の補足を行い、新たなエッジ画像を生成し、当該新たに生成されたエッジ画像に基づいて前記撮像画像のセグメンテーションを行う画像分割部と、前記セグメンテーションの結果に基づいて、前記撮像画像のセグメント毎における画素の輝度値の分散を求め、当該分散を用いて前記撮像画像における細胞の画像領域と背

【０００６】
景の画像領域とを検出する検出部とを備えることを特徴とする。
［００１８］
本発明の細胞観察装置は、色素体の存在する前記細胞の画像領域を対象細胞画像とし、色素体の存在しない前記細胞の画像領域を非対象細胞画像として検出し、全細胞の画像における当該非対象細胞画像の比率を求める細胞形態検出部をさらに備えることを特徴とする。
［００１９］
本発明の細胞観察装置は、前記細胞の画像領域における色素体の輝度値から前記色素体の量である色素体量を算出する色素値抽出部をさらに備えることを特徴とする。
［００２０］
本発明の細胞観察装置は、前記細胞の画像領域から色素体の平均輝度値を求めておき、前記撮像画像を撮像した当該細胞から色素体を抽出して色素体量を求め、平均輝度値と細胞当たりの色素体量との回帰式を予め求めて記憶部に記憶させておき、前記色素値抽出部が前記細胞画像における平均輝度値を求め、前記回帰式から細胞当たりの色素体量を求めることを特徴とする。
［００２１］
本発明の細胞観察方法は、輪郭抽出部が、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出過程と、色素体領域抽出部が、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出過程と、画像分割部が、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて、前記エッジ画像における余分なエッジ部分の削除と、前記エッジ画像に不足する細胞の形状の補足を行い、新たなエッジ画像を生成し、当該新たに生成されたエッジ画像に基づいて前記撮像画像のセグメンテーションを行う画像分割過程と、検出部が、前記セグメンテーションの結果に基づいて、前記撮像画像のセグメント毎における画素の輝度値の分散を求め、当該分散を用いて前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを検出する検出過程とを含むことを特徴とする。
［００２２］
本発明のプログラムは、細胞の形状を観察する細胞観察装置の動作をコンピュータに実行させるプログラムであり、コンピュータを、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出

【０００７】
したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出手段、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出手段、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて、前記エッジ画像における余分なエッジ部分の削除と、前記エッジ画像に不足する細胞の形状の補足を行い、新たなエッジ画像を生成し、当該新たに生成されたエッジ画像に基づいて前記撮像画像のセグメンテーションを行う画像分割手段、及び、前記セグメンテーションの結果に基づいて、前記撮像画像のセグメント毎における画素の輝度値の分散を求め、当該分散を用いて前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを検出する検出手段として機能させるためのプログラムである。
発明の効果
［００２３］
この発明によれば、微細藻類などの顕微鏡写真である撮像画像から抽出したエッジ画像と色素体画像とを重ね合わせるため、撮像画像内の細胞の画像を従来に比較して精度良く抽出でき、細胞の全体的な形状及び細胞内における色素体領域（例えば、生成される産生物質の領域）の割合も容易に検出することができる。
これにより、本発明によれば、細胞の生理状態の指標、他種生物の混入状況、有色色素体の蓄積状況が定量値として得られ、細胞の生理状態の把握や、有用成分の生産状況の把握が容易になる。
図面の簡単な説明
［００２４］
［図１］この発明の一実施形態による細胞観察装置１の構成例を示す概略ブロック図である。
［図２］撮像装置１００が撮像した撮像画像（明視野画像）に解析結果を重ね合わせて表示した画像を示している。
［図３］テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される個々の細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。
［図４］テーブル記憶部２３に書き込んで記憶される複数の撮像画像における細胞に関わる数値情報の種類を示す図である。
［図５］観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているアスタキサンチンの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＲ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。
［図６］観察対象細胞（ヘマトコッカス）に蓄積されているクロロフィルの細胞当たりの色素量と、細胞画像内のピクセルにおけるＧ画素及びＢ画素の輝度値の平均値の比である輝度比との対応を示す回帰式を示すグラフである。

Claims (6)

1. 一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出部と、
   前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出部と、
   前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成部と
   を備えることを特徴とする細胞観察装置。
2. 前記合成画像において色素体の存在する細胞の画像領域を対象細胞画像とし、色素体の存在しない細胞の画像領域を非対象細胞画像として検出し、前記合成画像における全細胞の画像における当該非対象細胞画像の比率を求める細胞形態検出部
   をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 前記細胞の画像領域における色素体の輝度値から前記色素体の量である色素体量を算出する色素値抽出部
   をさらに備えることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞観察装置。
4. 前記細胞の画像領域から色素体の平均輝度値を求めておき、前記撮像画像を撮像した当該細胞から色素体を抽出して色素体量を求め、平均輝度値と細胞当たりの色素体量との回帰式を予め求めて記憶部に記憶させておき、
   前記色素値抽出部が前記細胞画像における平均輝度値を求め、前記回帰式から細胞当たりの色素体量を求めることを特徴とする請求項３に記載の細胞観察装置。
5. 輪郭抽出部が、一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出過程と、
   色素体領域抽出部が、前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出過程と、
   画像合成部が、前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成過程と
   を含むことを特徴とする細胞観察方法。
6. 細胞の形状を観察する細胞観察装置の動作をコンピュータに実行させるプログラムであり、
   コンピュータを、
   一層の細胞を撮像した撮像画像から、当該撮像画像内の細胞の画像のエッジの画素を抽出し、抽出したエッジの画素からなるエッジ画像を生成する輪郭抽出手段、
   前記撮像画像における細胞の画像の色素体の画素を抽出し、この抽出した色素体の画素からなる色素体画像を生成する色素体領域抽出手段、
   前記エッジ画像と前記色素体画像とを重ね合わせて合成された合成画像において、前記撮像画像における細胞の画像領域と背景の画像領域とを、前記画素の輝度値の分散により検出し、前記撮像画像における細胞の画像領域を検出する画像合成手段
   として機能させるためのプログラム。