JP2011030494A - 細胞形態定量値を用いる酵母の生理状態の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明による酵母の生理状態の評価方法は、目的とする酵母の細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格を蛍光染色した染色画像を画像解析して、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量解析値を求め、該解析値を、既知の生理状態の酵母細胞について予め取得しておいた細胞形態定量値からなるデータベースと比較することによって、目的の酵母の生理状態を判定することを含んでなる。
【選択図】なし
Description
すなわち、予め、既知の生理状態の酵母細胞について細胞形態定量値を取得しておき、データベースを作成しておく。データベースに加えられる細胞形態定量値のデータは、それが対応する既知の生理状態の酵母細胞と関連づけておくことが必要である。すなわち、解析値とデータベース上の値を比較し、目的とする酵母の解析値と、データベース上のある酵母の細胞形態定量値が類似する場合には、この目的とする酵母は、このデータベース上の酵母と同等の生理状態にあると判定することができる。予め取得しておく既知の生理状態の酵母細胞の種類は、多いほど、評価の精度を高めることができる。
発酵中の酵母細胞形態の経時変化を定量的に解析するために、下記の実験を行った。
下面発酵酵母KBY011を用いて、200ml YPD10培地(1%酵母エキス、2%ペプトン、および10%グルコース)にて、20℃の温度条件下、嫌気攪拌培養を行った。
培養開始から24時間毎に酵母サンプルを採取し、得られた各サンプルについて、細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格のそれぞれに特異的な蛍光試薬(フルオレセインイソシアナート−コンカナバリンA(fluorescein isothiocyanate-Con A)、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、4',6-diamidino-2-phenylindole)、ローダミンファロイジン(rhodamine phalloidin))を用いて三重染色を行って、細胞の染色画像を、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。
なお、形態パラメータの内容は、前述の文献(Proc Natl Acad Sci U S A. ;102:19015-20 (2005))に記載された501の形態パラメータに従った。
結果は表2に示される通りであった。
保存中の酵母の細胞形態の経時変化を定量的に解析するために、下面発酵酵母KBY011を用いて、保存温度0℃および9℃の条件にて10日間の保存試験を行った。
具体的には、発酵終了後の酵母を水洗いして、0℃または9℃の温度条件下にて、保存3日後および10日後に、それぞれ酵母サンプルを採取した。これらサンプルについて、実施例1と同様にして、酵母の細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格を、蛍光試薬を用いて三重染色した後、CalMoprh解析を行ない、細胞形態定量解析値を得た。
また結果をさらに詳しく検討すると、形態パラメータとして変化の大きかったもののパラメータ種類とその増減からみて、保存劣化が進むにつれて、娘細胞が大きい細胞の割合が増加していた。このことから、保存中にも酵母細胞が増殖し、芽が出た細胞が大きくなっていることが観察された。
下面発酵酵母KBY011(YeastA)以外の醸造酵母として、上面発酵酵母(YeastB)、清酒酵母(YeastC)、焼酎酵母(YeastD)、ワイン酵母(YeastE)、およびウイスキー酵母(YeastF)を用いて、200ml YPD10培地にて、20℃の温度条件下、嫌気攪拌培養を行った。
培養開始から24時間後に酵母サンプルをそれぞれ採取し、得られた各サンプルについて、実施例1と同様にして、酵母の細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格を蛍光試薬を用いて三重染色した後、CalMoprh解析を行ない、細胞形態定量解析値を得た。
結果は表4に示される通りであった。
下面発酵酵母の発酵中の経時変化、保存中の経時変化、および下面発酵酵母以外の醸造酵母株等の様々な条件下の酵母サンプルを用意した。具体的には、実施例1〜3で使用したサンプルに加えて、発酵温度、通気条件、酵母添加率等ついて異なる発酵条件にて、実際の生産規模レベルで発酵させ、発酵の終了した後のサンプル(Condition A〜D)も用意した。
Claims (7)
- 目的とする酵母の細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格を蛍光染色した染色画像を画像解析して、酵母細胞の形態学的な特徴に基づいて予め設定された形態パラメータについて、細胞形態定量解析値を求め、該解析値を、既知の生理状態の酵母細胞について予め取得しておいた細胞形態定量値からなるデータベースと比較することによって、目的の酵母の生理状態を判定することを含んでなる、酵母の生理状態の評価方法。
- 目的とする酵母細胞の蛍光染色を、細胞の外郭、核、およびアクチン細胞骨格をそれぞれ特異的に検出可能な蛍光試薬を用いて三重染色することにより行い、蛍光顕微鏡を用いることによって染色画像を得ることを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 画像解析して、形態学的な特徴に基づいて予め設定された501種の形態パラメータ、またはそれらから選択される複数の形態パラメータについてそれぞれ解析値を求めることを含んでなる、請求項1または2に記載の方法。
- 得られた解析値とデータベースとの比較を、クラスター解析により行って、解析値と類似した細胞形態定量値を有する、既知の生理状態の酵母細胞をデータベースより抽出し、それに基づいて、目的の酵母の生理状態を判別することを含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 酵母がビール酵母である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 生理状態を評価する酵母が、培養中、発酵中または醸造後の保存中のいずれかの酵母である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 培養中、発酵中または醸造後の保存中の酵母を、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法に付して、得られた酵母の生理状態の評価に基づいて、目的に適合した良好な状態の酵母を選別することを含んでなる、状態の良い酵母の選別方法。
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