JP2003531567A

JP2003531567A - チモーゲン活性化系

Info

Publication number: JP2003531567A
Application number: JP2000615734A
Authority: JP
Inventors: ダロウ，アンドリユー; キ，ジエンセン; アンドレイド−ゴードン，パトリシア
Original assignee: オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2003-10-28
Also published as: EP1173590A4; WO2000066709A2; CA2372907A1; AR023818A1; AU4239600A; WO2000066709A3; EP1173590A2; WO2000066709A9

Abstract

(57)【要約】限定されたタンパク質分解により、高度に制御されかつ再現可能な様式で（Ｓ１）セリンプロテアーゼの発現されたチモーゲン前駆体の活性化を可能にすることができる発現ベクター系をコードするＤＮＡ配列を記述する。プロセシングされた発現されたタンパク質は、活性化されれば、触媒活性の測定に敏感に反応する形態にされる。活性化された形態のこの触媒活性は、しばしば、プロセシングされないチモーゲン前駆体に関して、成熟したＳ１プロテアーゼ遺伝子産物のより正確な表示である。従って、この一連のチモーゲン活性化構築物は、セリンプロテアーゼ遺伝子産物の分析および特徴づけのための重要な系を表す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

トリプシン／キモトリプシン様（Ｓ１）セリンプロテアーゼファミリーのメン
バーは、不活性なチモーゲン前駆体のタンパク質分解性の活性化により、消化過
程および調節増幅カスケードを包含する複数の多彩な生理学的過程において中枢
的な役割を担うことができる。多くの例で、これらのカスケード内のプロテアー
ゼの基質は、「下流の」セリンプロテアーゼの不活性な形態もしくはチモーゲン
それら自身である。セリンプロテアーゼに媒介される調節の公知の例は、血液凝
固（Ｄａｖｉｅら、（１９９１）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０３６
３−７０）、キニン形成（ＰｒｏｕｄとＫａｐｌａｎ（１９８８）。ＡｎｎＲ
ｅｖＩｍｍｕｎｏｌ６：４９−８３）および補体系（ＲｅｉｄとＰｏｒｔｅ
ｒ（１９８１）。ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５０：４３３−
４６４）を包含する。これらのタンパク質分解経路はしばらくの間既知であるが
、新規セリンプロテアーゼの遺伝子およびそれらの産物の発見は、これらの現存
するカスケード内の調節のわれわれの理解を高めかつ全く新規のプロテアーゼネ
ットワークの解明につながることができるようである。

【０００２】タンパク質分解性の切断による活性の形態へのセリンプロテアーゼチモーゲン
の成熟は、チモーゲン性（ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）と称される、高められた
触媒効率のプロテアーゼへの変換をもたらす（ＴａｃｈｉａｓとＭａｄｉｓｏｎ
（１９９６）。ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７１：２８７４９−２８７５２）。
チモーゲン性、すなわち高められた触媒効率の程度は、セリンプロテアーゼファ
ミリーの個々のメンバーの間で広範に変動する。保存されたアミノ末端のチモー
ゲン活性化配列のタンパク質分解性の切断は、脂肪族アミノ酸（最も頻繁にはイ
ソロイシン（Ｉｌｅ−１６、キモトリプシンの番号付け））をもたらし、プロト
ン供与されたようになりそして従って正に荷電する。チモーゲン活性化と同時に
起こる事象は、脂肪族アミノ酸と高度に保存された残基、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ−１９４、キモトリプシンの番号付け）との間の塩架橋により生成される固定
した基質特異性ポケットの創製であり、一方のアミノ酸は活性部位のセリン（Ｓ
ｅｒ−１９５、キモトリプシンの番号付け）から上流に、触媒ドメイン内にある
（ＨｕｂｅｒとＢｏｄｅ（１９７８）。ＡｃｃＣｈｅｍＲｅｓ１１：１１
４−２２）。

【０００３】生化学的および酵素学的分析のための完全長のセリンプロテアーゼのｃＤＮＡ
の発現における主要な一欠点は、不活性なチモーゲンの産生についての抗しがた
い潜在性であった。これらのチモーゲン前駆体は、しばしば、タンパク質分解活
性をほとんどもしくは全く有さず、そして従って現在利用可能な２方法のいずれ
かの一方により活性化されなければならない。一方法は自己活性化（Ｌｉｔｔｌ
ｅら（１９９７）。ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２：２５１３５−２５１４２
）に頼り、これは均質な精製されたプロテアーゼ調製物中で起こることができ、
しばしば高いタンパク質濃度を必要とし（Ｊ．Ｑ．、未発表の観察結果）、そし
て研究者により厳密に評価されなければならない。第二の方法は、トリプシンの
ような代理プロテアーゼを使用して、所望のセリンプロテアーゼを切断する。そ
の後、代理プロテアーゼは不活性化される（Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７）。
ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２：２１５８２−２１５８８）か、もしくは所望
の活性化されたプロテアーゼから物理的に除去される（Ｈａｎｓｓｏｎら（１９
９４）。ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６９：１９４２０−６）かのいずれかでな
ければならない。双方の方法において、正確な条件を経験的に確立しかつ活性化
反応を慎重にモニターしなければならない。なぜなら、不十分な活性化もしくは
過剰消化は、活性のおよび不活性のチモーゲンタンパク質の不均質な集団をもた
らすとみられるからである。Ｓ１セリンプロテアーゼファミリーの特定のメンバ
ーを研究している若干の研究者は、細菌細胞（Ｗａｎｇら（１９９５）。Ｂｉｏ
ｌＣｈｅｍ３７６：６８１−４）もしくは哺乳動物細胞（Ｙａｍａｓｈｉｒ
ｏら（１９９７）。ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１３５０：１
１−１４）のいずれかで発現されるチモーゲンの活性化への制限プロテイナーゼ
の使用を探究した。組換えチモーゲンを包括的に活性化するこの方法は、系統的
な発現を可能にすることおよび数種のセリンプロテアーゼの活性化という付加さ
れた価値をはっきりと有する。

【０００４】（発明の要約）本発明は、その後に生成されかつタンパク質分解性にプロセシングされて活性
の酵素産物を生成することができる、異種の不活性のチモーゲンプロテアーゼの
系統的発現を見込む一連のＤＮＡベクターを提供する。本発明は、数種のＳ１プ
ロテアーゼファミリーのメンバーの迅速な分析を可能にする同時の発現および活
性化に敏感に反応する系を提供する。ベクター中で発現される目的のセリンプロ
テアーゼのｃＤＮＡを、多数の応用のいずれか１つに使用することができる。抗
血清の生成、もしくは、三次元結晶学的構造を決定するための結晶の成長に十分
な精製されたプロテアーゼの産生は、こうした多数の用途の２例にすぎない。こ
の特定のチモーゲン活性化系内で生成されるセリンプロテアーゼｃＤＮＡのタン
パク質産物は、タンパク質分解的に活性化することができ、それにより、精製さ
れた組換えタンパク質は、天然のもしくは内在性の供給源から精製された、その
成熟した活性化された遺伝子産物の対照物に類似の程度まで活性化されたように
なることができる。従って、発現されたプロテアーゼのｃＤＮＡの触媒活性およ
び基質特異性を評価することができる。

【０００５】

【発明の詳細な記述】

定義：本明細書で用いられる場合、「タンパク質ドメイン」という用語は、タンパク
質の残りの部分に無関係に安定した３−次元構造に折りたたまれ得るタンパク質
の領域を指す。この構造は、酵素活性、他の分子に関する認識モチーフの形成を
含む、タンパク質内のドメインの機能に伴う特定の機能を保持することができる
か、あるいはタンパク質が特定の環境中で存在するために必要な構造成分を与え
ることができる。タンパク質ドメインは通常、１つのタンパク質スーパーファミ
リー内及び類似の機能を果たす他のタンパク質スーパーファミリー内の両方にお
いて、進化的に保存されるタンパク質の領域である。

【０００６】本明細書で用いられる場合、「タンパク質スーパーファミリー」という用語は
、受け入れられている系統発生的標準によりその進化的関係が完全には確立され
得ないか、又は遠いかも知れないが、類似の３次元構造を示すか、又は決定的ア
ミノ酸の独特の共通性を示すタンパク質を指す。

【０００７】本明細書で用いられる場合、「融合タンパク質」という用語は、ドメイン又は
リンカー領域の組み合わされた機能の機能を得る目的で複数のタンパク質ドメイ
ン又はリンカー領域を組み合わせた結果である新しいタンパク質構築物を指す。
これは最も多くの場合、ヌクレオチド配列を分子クローニングし、所望のタンパ
ク質をコードする新しいポリヌクレオチド配列の形成を生ずることにより成され
る。あるいは又、２つのタンパク質を化学的に結合させることにより融合タンパ
ク質の形成を行うことができる。

【０００８】本明細書で用いられる場合、「リンカー領域」又は「リンカードメイン」とい
う用語あるいは類似のそのような記述用語は、クローニングベクター又は融合タ
ンパク質の構築において用いられるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の範
囲（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）を指す。リンカー領域の機能はヌクレオチド配列中へ
のクローニング部位の導入、２つのタンパク質ドメインの間への可変成分（ｆｌ
ｅｘｉｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）又はスペース−形成領域の導入あるいは特
定の分子相互作用のための親和性タグの形成を含むことができる。リンカー領域
は特定の目的なく、しかしクローニングの間に成される選択から生ずる妥協とし
て融合タンパク質中に導入され得る。

【０００９】本明細書で用いられる場合、「プレ−配列」という用語は、分泌シグナルアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なそのような分泌シグナル
配列が当該技術分野における熟練者に既知であり、本発明において用いるために
適している。適したプレ−配列の例にはプロラクチンＦＬＡＧ（ｐｒｏｌａｃｔ
ｉｎＦＬＡＧ）、トリプシノーゲン及びキモＦＬＡＧ（ｃｈｙｍｏＦＬＡＧ）が
含まれるが、これらに限られるわけではない。

【００１０】本明細書で用いられる場合、「プロ−配列」という用語は、制限プロテアーゼ
のための切断部位をコードするヌクレオチド配列を指す。制限プロテアーゼのた
めの多様な切断部位が当該技術分野における熟練者に既知であり、本発明におい
て用いるために適している。適したプロ−配列の例にはＥＫ、Ｆｘａ及びトロン
ビンが含まれるが、これらに限られるわけではない。

【００１１】本明細書で用いられる場合、「クローニング部位」又は「ポリクローニング部
位」という用語は、１つもしくはそれより多い利用可能な制限エンドヌクレアー
ゼ共通配列を有する、クローニングベクター内に含有される、又は融合タンパク
質内に操作導入された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヌクレオチド配列の領域を指す
。正しく選ばれる制限エンドヌクレアーゼの使用は、開始コドンに相対的に読み
枠内配列（ｉｎ−ｆｒａｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードする所望のヌクレオ
チド配列を単離することができるようにし、それは転写及び翻訳の後に望ましい
タンパク質産物を与える。次いでこれらのヌクレオチド配列を、新しい融合タン
パク質の形成に用いられる、あるいは部位特異的突然変異（ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を導入するために用いられ
る他のクローニングベクター中に導入することができる。サイレント突然変異、
保存突然変異又は所望の制限酵素共通配列を含有するリンカー領域の導入により
、クローニング部位を所望の位置に操作導入できることが当該技術分野における
者に周知である。クローニングされているタンパク質又はそれらのフラグメント
の所望の機能が保持される限り、クローニング部位の正確な位置が可変であるこ
とも当該技術分野における者に周知である。

【００１２】本明細書で用いられる場合、「標識」という用語は、タグを含有する融合タン
パク質の単離、精製又は検出を容易にするアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を指す。多様なそのようなタグが当該技術分野における熟練者に既知であ
り、本発明において用いるために適している。適したタグにはＨＡ−タグ、Ｈｉ
ｓ−タグ、ビオチン、アビジン及び抗体結合部位が含まれるが、これらに限られ
るわけではない。

【００１３】本明細書で用いられる場合、「発現ベクター」は、適した宿主におけるクロー
ニングされた遺伝子のコピーの転写及びそれらのｍＲＮＡｓの翻訳に必要なＤＮ
Ａ配列として本明細書で定義される。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むバクテ
リア、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む菌細胞及び動物細胞のよう
な多様な宿主中で真核遺伝子を発現させるためにそのようなベクターを用いるこ
とができる。

【００１４】本明細書で用いられる場合、「触媒ドメインカセット」という用語は、少なく
とも問題のセリンプロテアーゼの触媒ドメインをコードするアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を指す。多様なプロテアーゼ触媒ドメインを本発明の発
現ベクター中に挿入することができ、それには現在当該技術分野における熟練者
に既知のもの、ならびにそれをコードする単離されたヌクレオチド配列をまだ有
していないものもヌクレオチド配列が単離されたら含まれる。

【００１５】本明細書で用いられる場合、チモーゲン活性化ベクターの「機能性誘導体」は
、本明細書に記載する性質に実質的に類似の生物学的活性（機能的又は構造的）
を有する構築物である。「機能性誘導体」という用語は、存在する構築物の「フ
ラグメント」、「変異体」、「縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｖａｒｉａ
ｎｔｓ）、「類似体」及び「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）」を含むことが意
図されている。「フラグメント」という用語は、発現されるチモーゲン前駆体の
活性化に用いられるプレ及びプロ配列として記述されるモジュールのいずれの核
酸又はポリペプチドサブセットをも指すものとする。「変異体」という用語は、
チモーゲン活性化構築分子全体又はそれらのフラグメントに構造及び機能におい
て実質的に類似の構築物又はコード配列モジュールを指すものとする。ある構築
物及びチモーゲン活性化構築物から発現される両分子が類似の構造的特性を有す
るか、あるいは両分子が類似の生物学的性質を有する、すなわち発現される組換
えチモーゲンがタンパク質分解的切断の後に増強された触媒活性を生ずるように
操作され得る場合、ある構築物はチモーゲン活性化構築物に「実質的に類似」で
ある。従って２つの分子が実質的に類似の活性を有する場合、分子の１つの構造
が他において見い出されなくても、あるいは２つのアミノ酸配列が同じでなくて
も、それらは変異体であると考えられる。「類似体」という用語は、チモーゲン
活性化構築分子全体又はそれらのフラグメントに機能において実質的に類似の分
子を指す。

【００１６】本発明は図１に図式化する発現ベクター系をコードするＤＮＡに関し、それは
制限されたタンパク質分解を介して翻訳後修飾を可能にし、高度に調節され、且
つ再現的なやり方で不活性なチモーゲン前駆体タンパク質を活性化するであろう
。発現され、プロセシングされたタンパク質は、多くの場合、精製された本来の
組織試料からしばしば得られるものより正確に成熟プロテアーゼ遺伝子産物を表
すその触媒活性の測定を受け易い活性化された形態に変えられる。

【００１７】この系を用い、組換えＤＮＡを分子的に操作して特定のセリンプロテアーゼの
研究を可能にするために、当該技術分野において既知の多様な方法のいずれを用
いることもできる。これらの方法には、この系列のベクター中へのセリンプロテ
アーゼｃＤＮＡの挿入及び続くそれからの発現に従うセリンプロテアーゼｃＤＮ
Ａの直接機能的発現が含まれるが、これに限られるわけではない。そのようなセ
リンプロテアーゼｃＤＮＡ分子を得るための方法は、バクテリオファージ又はプ
ラスミドシャトルベクター内に構築されたｃＤＮＡライブラリを、アミノ酸配列
から設計されたタグオリゴヌクレオチドプローブ又は部分的もしくは関連ｃＤＮ
Ａの制限フラグメントを用いてスクリーニングすることである。この部分的ｃＤ
ＮＡは、ｃＤＮＡの配列又はタンパク質のアミノ酸配列からのマッチングもしく
は縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介するｃＤＮＡフラグメントの特
異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得られる。この目的のために発
現された配列タグ（ＥＳＴｓ）も利用できる。あるいは又、公開されている配列
の全−長ｃＤＮＡを、コード配列全体にフランキングするマッチングオリゴヌク
レオチドプライマーの設計を介する特異的ＰＣＲ増幅により得ることができる。
本明細書に記載するチモーゲン活性化構築物中への挿入には、特定のセリンプロ
テアーゼｃＤＮＡの触媒ドメイン（触媒カセット）のみの、ＰＣＲ増幅を介する
単離だけが必要である。次いで触媒ドメインを正しい翻訳位置合わせ（ｒｅｇｉ
ｓｔｅｒ）及び配向でチモーゲン活性化構築物中にサブクローニングし、組換え
融合タンパク質を形成することができる。

【００１８】上記で記載した方法を介して得られるセリンプロテアーゼ触媒カセットを、適
したプロモーター及び他の適した転写調節要素を含有する発現ベクター中に分子
クローニングすることにより組換え的に発現させ、原核もしくは真核宿主細胞中
に転移させ、セリンプロテアーゼ触媒ドメインの組換えチモーゲンを発現させる
ことができる。そのような操作のための技術は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ
．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ，２ｎｄｅｄ．，（１９８９）．１−１６２６）に十分に記載されており
、当該技術分野における者に周知である。

【００１９】特別に設計されたベクターは、バクテリア−酵母又はバクテリア−動物細胞又
はバクテリア−菌細胞又はバクテリア−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡ
のシャトリングを許す。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自
律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高
いコピー数のための可能性及び活性プロモーターを含有していなければならない
。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始する
ように向けるＤＮＡ配列として定義される。強力プロモーターは、ｍＲＮＡｓを
高い頻度で初期化させる（ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）ものである。発現ベクターはク
ローニングベクター、改変クローニングベクター（ｍｏｄｉｆｉｅｄｃｌｏｎ
ｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓ）、特別に設計されたプラスミド又はウィルスを含こと
ができるが、これらに限られるわけではない。

【００２０】哺乳類細胞において組換えセリンプロテアーゼ触媒ドメインをチモーゲン配置
で発現させるために多様な哺乳類発現ベクターを用いることができる。組換えタ
ンパク質発現に適してい得る商業的に入手可能な哺乳類発現ベクターにはｐＣＩ
Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）、
ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ
３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪ
ｏｌｌａ，ＣＡ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰ
Ｖ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４
２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９
）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴ
ＣＣ３７５６５）が含まれるが、これらに限られるわけではない。

【００２１】バクテリア細胞においてチモーゲン形態で組換えセリンプロテアーゼ触媒ドメ
インを発現させるために、多様なバクテリア発現ベクターを用いることができる
。組換えタンパク質発現に適してい得る商業的に入手可能なバクテリア発現ベク
ターにはｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）
及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）ｐＧＥＸ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が
含まれるが、これらに限られるわけではない。多くの哺乳類ｃＤＮＡｓの場合に
見られる通り、一般にバクテリアセリンプロテアーゼｃＤＮＡ発現は不溶性の組
換えタンパク質を生じ得、それは活性なコンフォーメーションでタンパク質を再
折りたたみするために再生されねばならない（Ｔａｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．
（１９９７），ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２：２１５８２−２１５８８）。
かくして我々は、真核細胞を特徴とする発現系に我々の努力を集中させてきた。

【００２２】多様な真菌細胞発現ベクターを、酵母のような真菌細胞においてチモーゲン配
置で組換えセリンプロテアーゼ触媒ドメインを発現させるために用いることがで
きる。組換えタンパク質発現に適してい得る商業的に入手可能な真菌細胞発現ベ
クターにはｐＹＥＳ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）
及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ
，ＣＡ）が含まれるが、これらに限られるわけではない。

【００２３】多様な昆虫細胞発現系を、昆虫細胞においてチモーゲン形態で組換えセリンプ
ロテアーゼ触媒ドメインを発現させるために用いることができる。Ｓｆ９細胞に
おける組換えタンパク質発現のための組換えバキュロウィルスの形成に適してい
得る商業的に入手可能なバキュロウィルス転移ベクターにはｐＦａｓｔＢａｃ１
（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）ｐ
ＡｃＳＧ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）ｐＢｌｕｅＢ
ａｃＩＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれるが
、これらに限られるわけではない。さらに、ドロソフィラ・シュナイダー（Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒ）系２（Ｓ２）細胞における組換えタン
パク質の発現を可能にするある種類の昆虫細胞ベクターも入手可能である（Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。

【００２４】チモーゲン活性化構築物をコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞における発現
のための発現ベクター中にサブクローニングすることができる。組換え宿主細胞
は原核性もしくは真核性であることができ、Ｅ．コリのようなバクテリア、酵母
のような菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系を含むがこれ
らに限られない哺乳類細胞ならびにドロソフィラＳ２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１
９６３）及びカイコＳｆ９（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１１）に由来する細胞系
を含むがこれらに限られない昆虫細胞を含むが、これらに限られるわけではない
。適していることができ、且つ商業的に入手可能な哺乳類の種に由来する細胞系
にはＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ
（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、
ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）、Ｌ−細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１５７３）が含まれるが、これらに限られるわけではない。

【００２５】発現ベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、プロト
プラスト融合法、リポフェクション、及びエレクトロポレーションを含むがこれ
に限定されない、多くの技術のうちいずれによっても宿主細胞に導入することが
できる。形質転換された細胞のプールは培養され、組換えタンパク質の発現につ
いて分析することができる。これに代えて、発現ベクター含有細胞は、クローン
として増殖され、各々について分析されてそれらが組換えタンパク質を産生して
いるか否かが決定される。チモーゲンの配置中に組換えセリンプロテアーゼ触媒
ドメインを発現している宿主細胞クローンの同定は、セリンプロテアーゼ触媒ド
メインのアミノ酸配列に対して向けられた抗体（入手できれば）との免疫反応性
を含むがこれに限定されない、いくつかの手段によって行うことができる。

【００２６】本明細書に記述されるチモーゲン活性化ベクターは、容易に入手できる（Ｂａ
ｂｃｏ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）、抗ＦＬＡＧ及び/又は抗ＨＡモノクローナ
ル抗体のエピトープタグをコードするモジュールを含有する。それゆえ、発現さ
れたチモーゲンタンパク質のレベルは、免疫アフィニティー及び/又はリガンド
アフィニティー技術によって定量することができる。これらは、トランスフェク
トされた真核細胞や形質転換された細菌溶解生成物から調整された培地のウェス
タンブロッティング、ＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡアッセイのような、チモーゲン
形態にある分泌された組換えセリンプロテアーゼ触媒ドメインの産生を検出する
ための、多くの手段のうちいずれによって行うこともできる。ＦＬＡＧエピトー
プがプレ及びプロ配列の間に位置し、且つエンテロキナーゼ（ＥＫ）やＸａ因子
（ＦＸａ）のいずれによるタンパク質分解活性化によっても除去されることから
、このタグの消失が定量的な消化の有効な尺度となる（図７、８、９及び１０参
照）。

【００２７】Ｓ１セリンプロテアーゼファミリーのいくつかのメンバーは明らかに膜結合性
である。それらは、ヘプシン（Ｌｅｙｔｕｓら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２７：１０６７−７４）及びＥＫ（Ｋｉｔａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：７５８８−９２）の場
合のようにＮ末端によって、あるいは、プロスタシン（Ｙｕら（１９９５）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３４８３−９）で実証されているようにＣ末端
において固定されている、II型内在性膜タンパク質であるかもしれない。これら
の場合において、この系で生成されるセリンプロテアーゼの生化学的特徴付けは
、触媒部位のみが発現し、これらの膜貫通ドメインが排除されているという点で
、容易になっている。それゆえ、発現したチモーゲンは可溶性であり、これが精
製、活性化及び続く生化学的分析を非常に容易にする。膜貫通ドメインは長く伸
びた非触媒ＮＨ₂末端中にあるので、触媒カセットモジュールの生成による触媒
ドメインの発現は、II型膜結合セリンプロテアーゼで直面する困難を排除する。
Ｃ末端がつながれたセリンプロテアーゼの可溶性触媒モジュールの設計には、然
しながら、予測された膜貫通セグメントの上流にある触媒ドメインをいかにして
切り取るかを決定するための膜貫通予測が要求される。特有のポリペプチド中に
おける推定上の膜貫通全領域の同定は、しばしば測定される範囲内におけるアミ
ノ酸ハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）の測定を伴う。特定領域のハイド
ロパシーを決定することができ（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３２）、一定のプロテアーゼ配列中にお
ける潜在的な膜貫通固定化Ｃ末端テールの予測を可能とする、一般的な配列分析
アルゴリズムがある。

【００２８】我々は、２つの制限プロテアーゼＥＫとＦＸａのいずれによる活性化も、精製
されたセリンプロテアーゼチモーゲンがＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズに結合し
ている時に、効果的に起こることを見出した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ結
合組換えプロテアーゼのタンパク質分解活性は、一度切断されて活性化されると
、妨げられない。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ結合プロテアーゼ（プロテアー
ゼビーズ）は明らかに安定であり、その活性は逐次的な発色（ｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｃ）アッセイによって測定でき、断続的な洗浄によって中断され、多段階の
アッセイの間中活性である。しかしながら、プロテアーゼビーズの安定性は測定
される特定のプロテアーゼの性質によって決定され、可能性としてはこれらのプ
ロテアーゼビーズは該プロテアーゼの固定化が必要とされる場合にも適用され得
る。例としては、タンパク質分解活性のビボ分析であることができる。プロテア
ーゼビーズ調製物は、皮下あるいは筋肉内への送達後に評価することができ、そ
して、アガロースビーズ結合プロテアーゼは拡散しそうにないことから、同様に
して送達した可溶性の調製物というよりは寧ろインビボにおけるプロテアーゼの
局在化した蓄積に近い。

【００２９】チモーゲン活性化構築物によって生成される組換えタンパク質を発現する他の
方法は、インビトロ転写/翻訳系である（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）。イヌ膵臓ミクロゾーム膜の添加によって、インビトロ転写/翻訳による、
発現されたチモーゲン触媒ドメインの膜移動とコアグリコシル化（ｃｏｒｅｇ
ｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ）が可能となる。しかしながら、これらの系は一般に
少量の翻訳産物を生成し、インビトロで翻訳された高い特異的活性を持つセリン
プロテアーゼのチモーゲン触媒ドメインは、続くタンパク質分解活性化によって
検出することができる。インビトロにおけるチモーゲン活性化構築物から転写さ
れたＲＮＡもまた、続くＸｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓの卵母細胞へのマイクロ
インジェクションによって効果的に翻訳される。

【００３０】特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにかなりの量の重複性があることが
知られている。それゆえ、本願発明は、最終的に同一のアミノ酸の翻訳物をコー
ドする代替のコドンを含むＤＮＡ配列にもまた向けられている。この明細書の目
的に沿って、１以上の置換されたコドンを持つ配列を縮重変異と定義する。また
、ＤＮＡ配列や発現タンパク質の根本的な物理的特性を実質的に変えないような
翻訳タンパク質の変異もまた本願発明の範囲に含まれる。そのような変化の例は
、脂肪族から他の脂肪族への、芳香族から他の芳香族への、酸性から他の酸性へ
の、及び塩基性から他の塩基性へのアミノ酸の置換は、ポリペプチドの機能の変
化を引き起こさないであろう、ということを含んでいる。また、より明白には、
残基の機能が電荷逆転を含むポリペプチドの溶解性を維持するのであれば、ラジ
カル置換が行われても良い。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に生じる
ペプチドとは異なる性質を持つペプチドをコードするように変えることができる
ことが知られている。ＤＮＡ配列を変える方法は、限定されるものではないが、
部位特異的突然変異誘発を含む。

【００３１】Ｓ１系列のセリンプロテアーゼは最大系列のペプチダーゼである「Ｒａｗｌｉ
ｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ（１９９４）、「ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ
」２４４：１９−６１］。この上に記述したように、このような多様な系列の員
は多様な機能（食物消化、食物凝固および繊維素溶解を包含）、補則的活性化ば
かりでなく他の免疫または炎症応答を果たす。正常な生理状態および病気になっ
た状態の両方で果たすそのような機能（いろいろな実験室で現在調査下にある）
が近い将来にはより良好に理解されるようになる可能性がある。活性プロテアー
ゼを多量に発現させることができる（後で生物化学的分析を受けさせることがで
きるように）ようになれば、疑い無く、そのような機能の手助けになるであろう
。加うるに、新規なＳ１セリンプロテアーゼｃＤＮＡを見いだすことができれば
、そのような酵素が調節する複雑な経路の理解が向上するであろう。本明細書に
記述するチモーゲン活性化構築物（ｚｙｍｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ）はそのような新規な遺伝子に関して将来行われるであろう生
物化学的特徴付けに役立つであろう。

【００３２】本発明は、また、チモーゲン活性化構築物から発現して来るタンパク質の活性
を調節する化合物を選別する方法にも向けたものである。そのような活性を調節
する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド類、タンパク質、またはタンパク質でな
い有機分子であり得る。チモーゲン活性化構築物から発現して来る蛋白質の機能
を調節する化合物を多様なアッセイで検出することができる。そのようなアッセ
イは、触媒活性もしくは酵素活性が変化したか否かを測定する簡単な「はい／い
いえ」アッセイであり得る。試験サンプルの発現または機能を標準サンプルの発
現または機能のレベルと比較することで、そのようなアッセイを定量アッセイに
することも可能である。本方法で識別したモジュレーターを治療剤として用いる
ことができる。

【００３３】そのような構築物は一般に幅広く多様な異種セリンプロテアーゼの発現、活性
化およびそれらの活性の特徴付けで用いるに有用であることから、チモーゲン活
性化ベクターＤＮＡを含有させたキット（ｋｉｔｓ）を調製することも可能であ
る。そのようなキットは、例えば、新規なセリンプロテアーゼが示すタンパク質
分解特異性を測定する目的でそれらを発現させる遺伝子を見つけだそうとする試
験者にとって特に有益であろう。そのようなキットは、少なくとも１つの容器を
密に封じ込めた状態で保持するに適するように区分化された担体を含んで成るで
あろう。前記担体は、更に、発現したタンパク質の検出で用いるに適した反応体
、例えば組換え型タンパク質または抗体なども含んで成るであろう。前記担体に
、また、検出手段、例えばタブを付けた抗原または酵素基質などを含有させるこ
とも可能である。加うるに、本明細書に記述する方法論を用いると生物化学的反
応で潜在的有用性を示すか或は治療用タンパク質として有用性を示す活性化を受
けたセリンプロテアーゼを多量に生じさせることができることから、前記方法論
の使用は商業的価値を有する。

【００３４】以下に示す実施例で本発明の説明を行うが、しかしながら、本発明をそれに限
定するものでない。実施例１プラスミドの操作：全ての分子生物学的方法を以前に記述された方法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
」、第２版（１９８９）、１−１６２６］に従わせた。特に明記しない限り、オ
リゴヌクレオチドをＲａｎｓｏｍＨｉｌｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒａｎ
ｓｏｍＨｉｌｌ、ＣＡ）から購入し（表１）そして全ての制限エンドヌクレア
ーゼおよび他のＤＮＡ修飾用酵素をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（
Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。最初にｐＣＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｐＣｌｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａ
ｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ベクターを用いて構築物を構築した後、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ発現ベクターｐＲＭ６３およびｐＦＬＥＸ６４の中に転移させた（以下に記述
するように）。用いたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクターは市販ベクターに類似
している（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）。全ての構築物
操作の立証を、ＡｌｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３蛍光配列決定装置
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いた染料テ
ーミネーターサイクル配列決定（ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で行った。プレシーケンス発生（ＰｒｅＳｅｑｕｅｎｃｅＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ）チモーゲン活性化構築物で用いたいろいろなモジュールのスキームを図１に示
す。以前に記述された様式［Ｉｓｈｉｉ他、（１９９３）、「ＪＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ」、２６８：９７８０−６］に類似した様式で、ウシのプロラクチンプレ
シーケンスシグナル配列（ｂｏｖｉｎｅｐｒｏｌａｃｔｉｎｐｒｅｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＦＬＡＧエピトープの上流に
融合させた。粘着性オーバーハング（ｃｏｈｅｓｉｖｅｏｖｅｒｈａｎｇｓ）
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド（５種類が１組）を設計することを通して、
前記シーケンスモジュール（ｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｄｕｌｅ）を生じさせた。
前記オリゴヌクレオチドをキナーゼで処理し（ｋｉｎａｓｅｄ）、５００ｍＭの
ＮａＣｌ中で対（ＰＦ−＃１ＵとＰＦ−＃１０Ｌ、ＰＦ−＃２ＵとＰＦ−＃９Ｌ
、ＰＦ−＃３ＵとＰＦ−＃８Ｌ、ＰＦ−＃４ＵとＰＦ−＃７Ｌ、ＰＦ−＃５Ｕと
ＰＦ−＃６Ｌ；表１）にした後、それに個別の５反応でアニーリングを受けさせ
た（ａｎｎｅａｌｅｄ）。このアニーリングを受けさせたオリゴヌクレオチドを
一定分量で一緒にして結合させた後、その生成物にプライマーＰＦ−＃１Ｕおよ
びＰＦ−＃６Ｌを用いたＰＣＲを受けさせた。このような予備反応を、Ａｍｐｌ
ｉｔａｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用い
、この製造業者が供給している緩衝液中で、９３℃で４５秒／６０℃で４５秒／
７２℃で４５秒の１０サイクルに続いて７２℃で５分間実施した。その生成物に
ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによる消化を受けさせた後、ＥｃｏＲＩおよび
ＮｏｔＩで開裂させておいたｐＣＤＮＡ３ベクターに結合させ、次にそれに子
ウシのアルカリ性ホスファターゼを用いた脱ホスホリル化（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｉｏｎ）を受けさせた。プロラクチンＦＬＡＧｐＣＤＮＡ３（ＰＦｐ
ＣＤＮＡ３）と表示する所望配列を含有する単離品を次の操作で用いた。追加的
プレシーケンス、例えばヒトのトリプシノーゲンＩおよびキモトリプシノーゲン
ＦＬＡＧ（ＣｈｙｍｏＦＬＡＧまたはＣＦ）など（図１）も、相当するオリゴヌ
クレオチド（表１）を用いた直接的な二本鎖オリゴヌクレオチド挿入で生じさせ
た。このような２つのプレシーケンスはプロラクチンのそれよりも短いことから
、アニーリングを受けさせた二重らせんが５’−ＥｃｏＲＩおよび３’−Ｎｏ
ｔＩ粘着性末端を含むように設計した、従ってそれらはｐＣＤＮＡ３の相当す
る部位に直接入り込み得る。

【００３５】Ｓ１プロテアーゼ系列の大部分の員は保存領域内のプロシーケンス（ｐｒｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の開裂部位の直ぐ上流にシステイン残基を含む。このシステ
イン残基（キモトリプシンの番号付けでＣｙｓ−１）は触媒作用ドメイン内の別
の保存システイン（Ｃｙｓ−１２２）にジスルフィド結合している［Ｍａｔｔｈ
ｅｗｓ他、（１９６７）「Ｎａｔｕｒｅ」（ロンドン）２１４：６５２−６］。
我々はこの種類のＳ１セリンプロテアーゼをタイプＩＩと呼ぶものとする。この
ような触媒作用を示すシステイン残基１２２がジスルフィド結合した状態で存在
することが特異的活性および／または基質特異性にとって重要である可能性があ
る。従って、この種類のセリンプロテアーゼを供給する目的で、我々は、チモー
ゲン開裂部位の直ぐ上流にシステイン残基を含む組換え型プロテアーゼをもたら
すであろうＣＦプレシーケンスの合成を行った。

【００３６】本発明では、組換え型タンパク質を真核細胞の分泌路の中にトラフィックする
（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）ためのプレシーケンスとして用いるに他のプレシー
ケンスも適する。それらには、これらに限定するものでないが、しばしば、翻訳
開始メチオニン残基に続いて存在する脂肪族アミノ酸で出来ている伸長部（ｓｔ
ｒｅｔｃｈ）が含まれる。新しく合成されたタンパク質はエクスポートシグナル
配列（ｅｘｐｏｒｔｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）によって真核細胞の
小胞体および細菌の形質膜に向かう。シグナル配列は疎水性の中心領域を含むが
、それらは全体長およびアミノ酸配列の両方の点で多大な多様性を示す。最近、
そのような多様性によってシグナル配列は多様な様式の標的（ｔａｒｇｅｔｉｎ
ｇ）および膜挿入を特定することが明らかになってきた。大多数のケースで、シ
グナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによる開裂の後に分泌されるタンパク
質の機能による障害を受けない［ＭａｒｔｏｇｌｉｏおよびＤｏｂｂｅｒｓｔｅ
ｉｎ（１９９８）、「ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ」、８：４１０−４１
５］。発現したタンパク質の分泌で一般的に用いるに適した多様なシグナル配列
モジュールを現在では商業的に入手することができ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、それらは本発明でプレシーケンスとして用いるに適
する。プロシーケンス発生ＰＣＲを２種類のプライマーＥＫ１−ＵおよびＥＫ１−Ｌと一緒に用いて、ヒ
トのトリプシノーゲンＩのＥＫ開裂部位を生じさせた（表１）。鋳型は、Ｄｂ
ＥＳＴのＦＡＳＴＡ研究［ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）、「
ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．」８５：２４４４−８］
で識別されたＥＳＴ（Ｗ４０５１１）であり、これをＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会
からＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を通
して入手した。Ｗ４０５１１の精製したプラスミドＤＮＡを予備ＰＣＲ反応で鋳
型として用い、これを製造業者の推奨に従ってＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）と一緒に用い、これを９３℃で
４５秒／５３℃で４５秒／７２℃で４５秒の１５サイクルに続いて７２℃で５分
間実施した。ＰＣＲ産物にＴ／ＡベクターｐＣＲ２．１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ
、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたサブクローン化を受けさせ（ｓｕｂｃｌ
ｏｎｅｄ）た後、所望配列を有するクローンを選択した。ＮｏｔＩおよびＸｂ
ａＩを用いた消化で前記産物を予備的に単離した後、ＰＦｐＣＤＮＡ３のＮｏ
ｔＩ部位とＸｂａＩ部位の間に位置するＰＦプレシーケンスの下流にサブク
ローン化することでＰＦＥＫｐＣＤＮＡ３を生じさせた。追加的プロシーケンス
、例えばＦＸａ開裂部位、およびＥＫ部位の変形（ＥＫ２およびＥＫ３）などを
、相当するオリゴヌクレオチドを用いた直接的な二本鎖オリゴヌクレオチド挿入
で生じさせた。アニーリング後にＰＦｐＣＤＮＡ３またはＣＦｐＣＤＮＡ３の中
に挿入し得るように５’−ＮｏｔＩおよび３’−ＸｂａＩ部位を持つオリゴ
ヌクレオチドを設計することで、一組のプレ−プロシーケンスモジュール、例え
ばＰＦＦＸａｐＣＤＮＡ３およびＣＦＥＫ２ｐｃＤＮＡ３（これらはそれぞれプ
ロラクチンＦＬＡＧおよびキモトリプシノーゲンＦＬＡＧのプレシーケンスを含
有する）などを生じさせた。

【００３７】他の種類のＳ１セリンプロテアーゼは、一般に、トリプシンのようなより小型
の数種のセリンプロテアーゼ、前立腺特異的抗原および角質層キモトリプシン型
（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ）酵素で定義可能である。我々は、そのような種類
をタイプＩと呼び、これはシステイン残基を開裂部位の直ぐ上流には含まないが
チモーゲン活性化プロシーケンスの直ぐ下流にシステインを含む。このようなト
リプシン様のＳ１セリンプロテアーゼの場合、そのようなシステイン（キモトリ
プシノーゲンの番号付けでＣｙｓ−２２）は、触媒作用ドメインに存在するシス
テイン（Ｃｙｓ−１５７）と一緒にジスルフィド結合の形成に参与しており［Ｓ
ｔｒｏｕｄ他（１９７４）、「ＪＭｏｌＢｉｏｌ」、８３：１８５−２０８
、Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ他（１９７７）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１６
：６５４−６４］、触媒活性およびまたは基質特異性に対して重要な影響を示し
得る。このような他の種類のセリンプロテアーゼを供給する目的で、チモーゲン
活性化構築物のためのＥＫ開裂モジュール（ｃｌｅａｖａｇｅｍｏｄｕｌｅｓ
）を更に２種類生じさせた（図２）。

【００３８】このように、特定のセリンプロテアーゼｃＤＮＡが示す活性を分析する時に、
その特定のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列に相当するプレ−プロシーケンス
の適切な組み合わせを用いることができる。例えば、トリプシン様タイプＩのセ
リンプロテアーゼをＰＦＥＫ３プレ−プロシーケンスから発現させることができ
る一方、ＣＦＥＫ２プレ−プロシーケンスモジュールはキモトリプシン様タイプ
ＩＩのプロテアーゼをより良好に発現させ得る。

【００３９】本発明では、そのような系が産出する不活性なチモーゲンを活性にする目的で
制限プロテアーゼで開裂させる時のプロシーケンスとして用いるに他のプロシー
ケンスおよびそれらの変形も適切である。それらには、これらに限定するもので
ないが、制限プロテアーゼであるトロンビンおよびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商
標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．、Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の開裂部位が含まれる。Ｃ−末端アフィニティー／エピトープタグキナーゼ操作してアニールした５’−ＸｂａＩおよび３’−ＮｏｔＩ付着
末端を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、終止コドン、６ヒスチジンコドンおよ
びＣ−末端終止コドン（６ＸＨＩＳＴＡＧ）、またはＣ−末端終止コドンを有す
る赤血球凝集素エピトープタグ（ＨＡＴＡＧ）のいずれかに従って設計した（図
１および表１）。これらのオリゴヌクレオチドを個別にプラスミドベクターｐＣ
ＩＮｅｏ（Promega, Madison, WI) 中のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の間
に結合した。同様に、オリゴヌクレオチドを赤血球凝集素エピトープタグに従い
、しかしＣ−末端終止コドンを欠失して設計した（ＨＡ−Ｎｏｎｓｔｏｐ）。こ
のＸｂａＩ付着末端を含むキナーゼ操作してアニールした二本鎖オリゴヌクレ
オチドを、ＨＡＴＡＧの上流側に再反復的に挿入して３ＸＨＡＴＡＧエピトープ
タグを作製した。さらに、ＨＡ−Ｎｏｎｓｔｏｐオリゴヌクレオチドを６ＸＨＩ
ＳＴＡＧの上流側に挿入して赤血球凝集素エピトープ／６ＸＨＩＳアフィニティ
ータグを作製した（ＨＡ６ＸＨＩＳＴＡＧ）。酵素前駆体活性化ベクター作製上記の一連のプレ−プロ配列（例えばＰＦＦＸａまたはＣＦＥＫ２など）をＥ
ｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてｐＣＤＮＡ３ベクターから分取的に切除し
た。ＦＸａ配列、特に表１記載のものはＸｂａＩ部位を含み、これは重複Ｄａ
ｍメチル化によりブロックされるようになる。この現象を防ぐために、これらの
ＦＸａ組換え体のプラスミドＤＮＡは、ＸｂａＩ制限酵素を用いてこの部位を
切断するために、Ｄａｍメチル化を欠失する株（例えばＳＣＳ１１０、Stratage
ne, La Jolla, CA）内に形質転換しそして精製しなければならなかった。プレ−
プロ配列を種々のＣ−末端エピトープまたは５’−ＥｃｏＲＩと３’−Ｘｂａ
Ｉの間のアフィニティタグしたｐＣＩｎｅｏ構築物内に結合した。従って、こ
れらの構築物はすべて、制限プロテアーゼＥＫ（部位ＥＫ１ＥＫ２ＥＫ３）
により認識されるプロ配列を有するインフレーム分泌を指令するためのプレ配列
（プロラクチンＦＬＡＧ、ＰＦ；キモトリプシノーゲンＦＬＡＧ、ＣＦ；または
トリプシノーゲン、Ｔ）、または酵素前駆体活性化のための転写後切断を可能と
するための因子Ｘａ（部位ＦＸａ）を特徴とする。エピトープ／アフィニティー
タグの直接上流にある上記の唯一のＸｂａＩ制限酵素部位は、これらのプレ−
プロの組合わせを分離する（図２）。設計の性質のために、ＸｂａＩ部位はこ
れらのベクターに重要であり、そして下記のように幾つかの基準に基づいて選択
された。これらは、「６−カッター」（特定の切断部位内の６ヌクレオチド塩基
を認識する制限酵素）制限酵素ＸｂａＩ部位が、一般的な使用のためのｃＤＮ
Ａ発現構築物の作製において手数がかかるクローニング段階を大幅に簡単にする
ｃＤＮＡ内にほとんど見いだされないという観察を含む。さらに、１個またはそ
れ以上のＸｂａＩ部位が特定のｃＤＮＡ内に存在しない場合にこのベクター内
に挿入しようと望む場合には、２種の他の制限酵素（ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ）も、ＸｂａＩ許容性付着末端を生成させる稀な６−カッターである。この
一連の酵素先駆体活性化構築物内で、プレ−プロ配列の翻訳レジスターは、エピ
トープ／アフィニティータグのものとは異なることに注意すべきである。得られ
た組換え体は、ｐＣＩｎｅｏ背景中の一連の哺乳類酵素前駆体活性化構築物を含
んでなる。発現の高いレベルのために、これらのプレ−プロ−エピトープモジュ
ールは、キイロショウジョウバエＳ２細胞内の発現が可能なベクター内に個別に
シャトルされる。これは、哺乳類ｐＣＩＮｅｏ酵素前駆体構築物を５’−Ｅｃ
ｏＲＩおよび３’−ＨｉｎｃＩＩを用いて消化して個別のプレ−プロ−Ｘｂ
ａＩ−エピトープ／アフィニティータグモジュールを分取的に単離してなされ
る。次いでこれらのモジュールを、金属結合性タンパク質プロモーターを含む誘
導性キイロショウジョウバエベクターｐＲＭ６３、またはアクチン５ｃプロモー
ターを含む構成性キイロショウジョウバエベクターｐＦＬＥＸ６４のいずれかの
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃＩＩ部位内に挿入する。実施例２セリンプロテアーゼｃＤＮＡの入手セリンプロテアーゼプロスタシンに相当する全長ｃＤＮＡの入手プロスタシンの全長ｃＤＮＡ(Yu et al (1995), J. Biol Chem 270:13483-9)
をＤｂＥＳＴ（ジーンバンクアクセッション番号AA205604）のＦＡＳＴＡサー
チを通じて同定し、そしてGenome Systems, Inc.(St Louis, Mo)を通じてＪ．Ｍ
．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムから入手した。クローンを確認のために配列決定
した。新規のプロテアーゼＯに相当する全長ｃＤＮＡの入手プロテアーゼＯと呼ばれる新規のセリンプロテアーゼ(Yoshida, et al.(1998)
, Biochim. Biophpys. Acta, 1399:225-228)の全長クローンをクローニングし、
そして当該技術分野の熟練者には公知の標準技術を用いて確認のために配列決定
した。プロテアーゼニューロプシンのヒトオーソログ(orthologue)に相当する全長ｃＤＮＡの入手ネズミニューロプシンに相同の部分クローン(Chen et al. (1995), J. Neuros
ci. 15:5088-97) も同定した(Yoshida et al., (1998), Gene, 213:9-16)。ヒト
ニューロプシンの全長ｃＤＮＡは、Ｕｎｉ−ＺＡＰケラチノサイトライブラリー
をスクリーニングし、次いで生体内切除および陽性の精製プラークの配列分析に
より得た。一般的プラスミド操作これらのセリンプロテアーゼｃＤＮＡの精製したプラスミドＤＮＡを、製造者
の推奨に従うAmplitaq(Perkin Elmer, Foster City, CA) 、またはＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる１００ｕｌ分取ＰＣＲ反応に
おける鋳型として使用した。代表的には、反応は、９３℃で３０秒間／５３〜６
５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間の１８サイクル、次いで５分間７２℃で、Ｐ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて操作した。使用したアニーリング温度は、Prim
erSelect 3.11 プログラム(DNASTAR Inc., Madison, WI) により特定の構築物に
ついて決定した。ＸｂａＩ切断可能末端を含むそれぞれのセリンプロテアーゼ
のプライマー（表１）は、これら３種のプロテアーゼの触媒ドメインに近接しそ
してＸｂａＩ触媒カセットを産生するように設計した（図１）。プロテアーゼ
タンパク質は、最初Ｃ−末端膜結合と考えられ、次いで分泌の後にタンパク質分
解により可溶性を与えられるので(Yu et al (1995), J. Biol CHem 270:13483-9
) 、プロスタシンの可溶性形を作製した。これは、膜テザー(tether)を表すと考
えられるアミノ酸の疎水性部分から直接上流の位置にＣ−末端ＸｂａＩプライ
マー（プロスタシン（ＳＯＬ）Ｘｂａ−Ｌ、表１）を設計してプロスタシン触媒
カセット内にＣ−末端２９アミノ酸を除外して達成された。

【００４０】分取ＰＣＲ産物をフェノール／ＣＨＣｌ₃（１：１）で抽出１回、ＣＨＣｌ₃抽
出、次いでグリコーゲン(Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN) キャ
リヤーを用いてＥｔＯＨ沈降した。沈降したペレットを７０％ＥｔＯＨを用いて
洗浄、減圧下で乾燥、および８０ｕｌＨ₂Ｏ、１０ｕｌ１０制限緩衝液第２番
および１ｕｌ１００ｘＢＳＡ(New England Biolabs, Beverly, MA)内に再懸濁
した。産物を少なくとも３時間、３７℃で２００単位ＸｂａＩ制限酵素(New E
ngland Biolabs, Beverly, MA)を用いて消化した。ＸｂａＩ消化した産物をフ
ェノール／ＣＨＣｌ₃（１：１）で抽出１回、ＣＨＣｌ₃抽出、ＥｔＯＨ沈降、７
０％ＥｔＯＨ洗浄および減圧下で乾燥した。汚染している鋳型プラスミドＤＮＡ
から精製するために、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭＴＲＩＳ−酢酸、１ｍＭＥＤ
ＴＡｐＨ８．３）内で１．０％低融解温度アガロース(Life Technologies, Ga
ithersberg, MD) を通して産物を電気泳動し、次いでゲルから切除した。切除し
た試料を慣用のように、適当なＸｂａＩ消化、脱リン酸化およびゲル精製した
酵素前駆体活性化ベクターを用いてゲル内結合した。これらのカセットを、ＮＨ
−末端プレ−プロ配列およびＣ−末端／エピトープアフィニティータグを用いる
適当な翻訳レジスター内にこれらを配置して正しい方向で一回挿入した。上記の
よにして直接クローニングしたＰＣＲ産物を確認のために配列決定した。希望す
る場合に一連の追加のベクター内へ引き続いてのサブクローニングのためのＸｂ
ａＩ触媒カセットを単離するために、確認した配列を有するクローンのみを選
択した。実施例３キイロショウジョウバエＳ２細胞内の組換えセリンプロテアーゼの発現キイロショウジョウバエＳ２細胞(ATCC, CRL-1963)(1x10⁷細胞）をＤＥＳｎｅ
ｏプラスミドの１ｕｇおよび組換え酵素前駆体活性化構築物精製ＤＮＡ(Qiagen,
Valencia, CA)の１９ｕｇを用いて、リン酸カルシウム沈降法(Wigler et al. (
1977), Cell 11:223-32)を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェ
クションされた細胞を２２〜２４℃で２４時間インキュベーションした。リン酸
カルシウム溶液を取り去りそして細胞を完全培地を用いて２回洗浄した。細胞を
選別しないで４８時間生育させた。Ｇ４１８を最終濃度４００ｕｇ／ｍｌまで加
えた。細胞をほぼ５〜８日毎に分割した。安定なＧ４１８耐性細胞の集団が４〜
５週間で得られた。安定にトランスフェクションされたＳ２細胞（血漿を含まな
い培地内で２ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌ）の二次カルチャーを、最終濃度１．０ｍＭま
でＣｕＳＯ₄を加えて４０時間で、組換えセリンプロテアーゼを発現するように
誘導した。実施例４組換えセリンプロテアーゼの精製および活性化安定なＳ２細胞からの血漿を含まない培地を分泌された組換えセリンプロテア
ーゼを精製するために使用した。適当なセントリプレプ(Centriprep)濃縮機を用
い、タンパク質の計算された分子量に対して、培地を4 〜5 倍濃縮した(Amicon
Inc., Beverly, MA)。５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー(Qiagen, Valencia, CA)の１
５０ｕｌを濃縮した培地５〜１０ｍｌに加えそして４℃で６０分間振とうして混
合した。酵素前駆体−結合樹脂を洗浄緩衝液（１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、３００ｍＭＮａＣｌ、および１５ｍＭイミダゾール）の１．５ｍ
ｌを用いて３回洗浄し、次いで蒸留Ｈ₂Ｏ１．５ｍｌで洗浄した。エンテロキナ
ーゼ切断は、室温で一晩、軽く振とうしながら、２０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．４）、５０ｍＭＮａＣｌ、および２．５ｍＭＣａＣｌ₂を含む緩衝
液中で、体積１５０ｕｌで酵素前駆体−結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズに、エンテロキ
ナーゼ(Novagen, Inc., Madison, WI; またはSigma, St, Louis , MO)を加えて
行った。次いで樹脂を洗浄緩衝液１．５ｍｌ洗浄２回で洗浄した。活性化したセ
リンプロテアーゼを溶出緩衝液（２０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、
２５０ｍＭＮａＣｌ、および２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出した。溶
出したタンパク質濃縮物を、Micro BCA Kit(Pierce, Rockford, IL) を用い、標
準として牛血清アルブミンを用いて測定した。活性化セリンプロテアーゼのアミ
ド分解活性は、表２に記載した合成基質からのパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）
の放出により測定した。これらの研究に使用した発色基質は、すべて市場で入手
した(Bachem California Inc., Torrance, PA; American Diagnostica Inc., Gr
eewich, CT; Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH)。アッセイ混合物は、
５００ｕＭ中の発色基質および１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２
５ｍＭＮａＣｌ、および２５ｍＭイミダゾールを含んでいた。ｐＮＡの放出は
、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA) で４０５ｎ
ｍ吸収フィルターを用いて、１２０分間、３７℃で測定した。最初の反応速度(V
max 、mOD/分) は、ソフトマックス(Softmax, Molecular Devices, Menlo Park,
CA)を用いて吸収に対する時間のプロットから決定した。種々の基質に対する活
性化プロテアーゼの比活性（産生ｐＮＡナノモル／分／ｕｇタンパク質）を表２
に示す。測定可能な発色アミド分解活性は、精製した未活性化酵素前駆体からは
検出されなかった。実施例５組換えセリンプロテアーゼの電気泳動およびウエスタンブロッティング検出還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在または不在において変性した精製
酵素前駆体または活性化したプロテアーゼの試料を、クーマシーブリリアントブ
ルーで染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Bio Rad, Hercules CA)により分析した。ウエ
スタンブロッティングのために、一過性または安定Ｓ２細胞から発現したＦｌａ
ｇタグしたセリンプロテアーゼを抗−ＦｌａｇＭ２抗体(Babco, Richmond, CA)
を用いて検出した。二次抗体はヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ−連結Ｆ（ａｂ’）２断片(Boehringer Mannheim Cor
p. Indianapolice, IN) であり、ＥＣＬキット(Amersham, Arlington Heights,
IL) により検出された。図７は、処理および活性化したプロテアーゼを産生する
発現および精製された酵素前駆体の定量的切断を証明するこにより、ＰＦＥＫ２
−プロスタシン−６ＸＨＩＳ機能を証明する。ＦＬＡＧエピトームはＥＫプロ配
列の直接上流に位置するので、ＥＫを用いる切断は、ポリアクリルアミドゲル中
に保持されるには小さすぎ、そのため＋ＥＫレーン内には検出されないＦＬＡＧ
−含有ポリペプチドを産生する。パネルＢにも示すように、未処理またはＥＫ消
化ＰＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳが、電気泳動の前にジスルフィド結合
を保持するためにＤＴＴの不在で変性される（レーン３および４）。試料の当量
がＢのウエスタンブロット内のゲルのそれぞれのレーンに負荷されたけれども、
抗−ＦＬＡＧＭｏＡｂＭ２は、ＤＴＴで前処理されるとタンパク質をさらに
良く検出するように見える（レーンＢ１とＢ３の比較）。図８は、処理および活
性化されたプロテアーゼを産生して、発現および精製された酵素前駆体の定量的
切断を証明することにより、ＣＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳ機能を証明
する。ＦＬＡＧエピトープはＥＫ２プロ配列の直接上流に位置するので、ＥＫを
用いる切断は、ポリアクリルアミドゲル中に保持されるには小さすぎ、そのため
＋ＥＫレーン内には検出されないＦＬＡＧ−含有ポリペプチドを産生する。パネ
ルＢでも示すように、未処理またはＥＫ消化ＣＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨ
ＩＳが、電気泳動の前にジスルフィド結合を保持するためにＤＴＴの不在で変性
される（レーン３および４）。レーン４で重要なことは、ＣＦプレ配列内のシス
テインと、Ｃｙｓ−１２２と推定されるプロスタシンの触媒ドメイン内のシステ
インとの間のジスルフィド結合の形成を示すＦＬＡＧエピトープの保持である（
キモトリプシンナンバリング(chymotrypsin numbering)）。ＥＫ切断およびＤＴ
Ｔを用いない変性の後のＦＬＡＧエピトープの保持は、システイン残基を含まな
いプロラクチンプレ配列を用いては観察されない（図７のレーン４と図８のレー
ン４との比較）。ＣＦプレ配列が、この系内で発現された場合に組換えセリンプ
ロテアーゼの重触媒鎖にジスルフィド結合される軽鎖形成が可能ことをこれが証
明する。還元剤ＤＴＴが存在しないと、ＥＫ切断されたポリペプチドは、ゲル内
で再現可能に低下した移動性を有するように見え（レーンＢ３とＢ４の比較）、
この理由はまだ不明である。図９は、処理および活性化されたプロテアーゼを産
生して発現および精製された酵素前駆体の定量的切断を証明することにより、Ｐ
ＦＥＫ１−ニューロプシン−６ＸＨＩＳの機能を証明する。図１０は、処理およ
び活性化されたプロテアーゼを産生して発現および精製された酵素前駆体の定量
的切断を証明することにより、ＰＦＥＫ１−プロテアーゼＯ−６ＸＨＩＳの機能
を証明する。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】

【表５】

【００４６】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】発明にかかる、多様なパターンのセグメントにより表されかつ表に要約される
一連の互換性のモジュールを特徴とする本チモーゲン活性化ベクターを図解で示
す。プロ配列の上の矢印は、この領域内の配列を制限プロテアーゼで切断するこ
とができることを示す。ＨＤＳは、セリンプロテアーゼ触媒ドメインカセット中
の触媒三つ組残基のアミノ酸を表す。分泌性のプレ配列にわれわれが使用した多
様な配列モジュール、われわれが設計しかつ成功裏に使用したチモーゲン活性化
プロ配列、および多様なＣ末端親和性／エピトープ標識付け（ｔａｇｇｉｎｇ）
の組み合わせを下に列挙する。これらの構築物は、保存された触媒ドメインのみ
をコードする特定のｃＤＮＡフラグメントの同じ読み枠での挿入により多様なセ
リンプロテアーゼを発現させるのに一般に使用することができる。包括的な活性
化は、適切な制限プロテアーゼＥＫもしくはＦＸａを使用する精製されたチモー
ゲンの消化により達成する。

【図２】発明にかかる、多様な活性化構築物の配列（配列番号１ないし配列番号６）を
提示する。それぞれについて、二本鎖ヌクレオチド配列を示し、そのセグメント
の下に、各それぞれのモジュールによりコードされる直接関係のあるアミノ酸配
列を示すよう翻訳する。関連する制限エンドヌクレアーゼ部位もまた、ＳＶ４０
後期ポリアデニル酸化配列由来の配列と一緒に包含する。配列番号１：構築物：ＰＦＥＫ２−終止配列番号２：構築物：ＴＥＫ３−１ＸＨＡ−ＴＡＧ配列番号３：構築物：ＰＦＦＸａ−３ＸＨＡ−ＴＡＧ配列番号４：構築物：ＰＦＥＫ１−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ配列番号５：構築物：ＣＦＥＫ２−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ配列番号６：構築物：ＣＦＥＫ２−ＨＡ６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ

【図３】発明にかかる、ＰＦＥＫ２−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ活性化構築物に挿入されたプ
ロテアーゼプロスタシンからの触媒ドメインの配列（配列番号７）。

【図４】発明にかかる、ＣＦＥＫ２−６ＸＨＩＡ−ＴＡＧ活性化構築物に挿入されたプ
ロテアーゼプロスタシンからの触媒ドメインの配列（配列番号８）。

【図５】発明にかかる、ＰＦＥＫ１−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ活性化構築物に挿入されたプ
ロテアーゼニューロプシンからの触媒ドメインの配列（配列番号９）。

【図６】発明にかかる、ＰＦＥＫ１−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ活性化構築物に挿入されたプ
ロテアーゼＯからの触媒ドメインの配列（配列番号１０）。

【図７】発明にかかる、配列番号７の活性化構築物（図３）から発現、精製かつ活性化
された、組換えプロテアーゼＰＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳのポリアク
リルアミドゲルおよびウェスタンブロット分析。クマシーブリリアントブルーで
染色されたセリンプロテアーゼＰＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳのサンプ
ルを含有するポリアクリルアミドゲルを示す（Ａ）。相対的分子量はタンパク質
標準品の位置により示す（Ｍ）。示されたレーンにおいて、精製されたチモーゲ
ンは、処理されないか（−）、もしくはＥＫで消化された（＋）（チモーゲンを
その活性の形態に切断かつ活性化するのにこれを使用した）かのいずれかであっ
た。抗ＦＬＡＧＭｏＡｂＭ２でプロービングされたＡのゲルのウェスタンブ
ロットもまた示す（Ｂレーン１および２）。これは、プロセシングかつ活性化
されたプロテアーゼを生成させる、発現かつ精製されたチモーゲンの定量的切断
を立証する。ＦＬＡＧエピトープはＥＫプロ配列のすぐ上流に配置されるため、
ＥＫでの切断は、ポリアクリルアミドゲル中に保持されるには小さすぎそして従
って＋ＥＫレーン中で検出されない、ＦＬＡＧ含有ポリペプチドを生成させる。
また、図Ｂに示されるが、電気泳動前にジスルフィド結合を保持するために、処
理されないもしくはＥＫで消化されたＰＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳを
ＤＴＴの非存在下で変性させた（レーン３および４）。Ｂのウェスタンブロット
におけるゲルの各レーンに同等量のサンプルを負荷したが、抗ＦＬＡＧＭｏＡ
ｂＭ２はＤＴＴで前処理された場合にタンパク質をより良好に検出するようで
ある（レーンＢ１をＢ３と比較されたい）。

【図８】発明にかかる、配列番号８の活性化構築物（図４）から発現、精製かつ活性化
された、組換えプロテアーゼＣＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳのポリアク
リルアミドゲルおよびウェスタンブロット分析。クマシーブリリアントブルーで
染色されたセリンプロテアーゼＣＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳのサンプ
ルを含有するポリアクリルアミドゲルを示す（Ａ）。相対的分子量はタンパク質
標準品の位置により示す（Ｍ）。示されたレーンにおいて、精製されたチモーゲ
ンは、処理されないか（−）、もしくはＥＫで消化された（＋）（チモーゲンを
その活性の形態に切断かつ活性化するのにこれを使用した）かのいずれかであっ
た。抗ＦＬＡＧＭｏＡｂＭ２でプロービングされたＡのゲルのウェスタンブ
ロットもまた示す（Ｂレーン１および２）。これは、プロセシングかつ活性化
されたプロテアーゼを生成させる、発現かつ精製されたチモーゲンの定量的切断
を立証する。ＦＬＡＧエピトープはＥＫ２プロ配列のすぐ上流に配置されるため
、ＥＫでの切断は、ポリアクリルアミドゲル中に保持されるには小さすぎそして
従って＋ＥＫレーン中で検出されない、ＦＬＡＧ含有ポリペプチドを生成させる
。また、図Ｂに示されるが、電気泳動前にジスルフィド結合を保持するために、
処理されないもしくはＥＫで消化されたＣＦＥＫ２−プロスタシン−６ＸＨＩＳ
をＤＴＴの非存在下で変性させた（レーン３および４）。レーン４においては、
おそらくＣｙｓ−１２２（キモトリプシンの番号付け）であるプロスタシンの触
媒ドメイン中のシステインとのＣＦプレ配列中のシステインの間のジスルフィド
結合の形成を示す、ＦＬＡＧエピトープの保持が有意である。ＥＫ切断およびＤ
ＴＴを用いない変性の後のＦＬＡＧエピトープの保持は、システイン残基を欠く
プロラクチンプレ配列を使用して観察されない（図７のレーン４を図８のレーン
４と比較されたい）。これは、ＣＦプレ配列が、この系で発現される場合に、組
換えセリンプロテアーゼの重触媒鎖にジスルフィド結合される軽鎖を形成するこ
とが可能であることを報告する。還元剤ＤＴＴの非存在下では、ＥＫ切断された
ポリペプチドはゲル中で再現可能に減少された移動度を有するようである（レー
ンＢ３をＢ４と比較されたい）。

【図９】発明にかかる、配列番号９の活性化構築物（図５）から発現、精製かつ活性化
された組換えプロテアーゼＰＦＥＫ１−ニューロプシン−６ＸＨＩＳのポリアク
リルアミドゲルおよびウェスタンブロット分析。クマシーブリリアントブルーで
染色されたセリンプロテアーゼＰＦＥＫ１−ニューロプシン−６ＸＨＩＳのサン
プルを含有するポリアクリルアミドゲルを示す（Ａ）。相対的分子量はタンパク
質標準品の位置により示す（Ｍ）。示されたレーンにおいて、精製されたチモー
ゲンは、処理されないか（−）、もしくはＥＫで消化された（＋）（チモーゲン
をその活性の形態に切断かつ活性化するのにこれを使用した）かのいずれかであ
った。抗ＦＬＡＧＭｏＡｂＭ２でプロービングされたＡのゲルのウェスタン
ブロットもまた示す。これは、プロセシングかつ活性化されたプロテアーゼを生
成させる、発現かつ精製されたチモーゲンの定量的切断を立証する。ＦＬＡＧエ
ピトープはＥＫ１プロ配列のすぐ上流に配置されるため、ＥＫ１での切断は、ポ
リアクリルアミドゲル中に保持されるには小さすぎそして従って＋ＥＫレーン中
で検出されない、ＦＬＡＧ含有ポリペプチドを生成させる。

【図１０】発明にかかる、配列番号１０の活性化構築物（図６）から発現、精製かつ活性
化された組換えプロテアーゼＰＦＥＫ１−プロテアーゼＯ−６ＸＨＩＳのポリア
クリルアミドゲルおよびウェスタンブロット分析。クマシーブリリアントブルー
で染色された新規セリンプロテアーゼＰＦＥＫ１−プロテアーゼＯ−６ＸＨＩＳ
のサンプルを含有するポリアクリルアミドゲルを示す（Ａ）。相対的分子量はタ
ンパク質標準品の位置により示す（Ｍ）。示されたレーンにおいて、精製された
チモーゲンは、処理されないか（−）、もしくはＥＫで消化された（＋）（チモ
ーゲンをその活性の形態に切断かつ活性化するのにこれを使用した）かのいずれ
かであった。抗ＦＬＡＧＭｏＡｂＭ２でプロービングされたＡのゲルのウェ
スタンブロットもまた示す。これは、プロセシングかつ活性化されたプロテアー
ゼを生成させる、発現かつ精製されたチモーゲンの定量的切断を立証する。ＦＬ
ＡＧエピトープはＥＫプロ配列のすぐ上流に配置されるため、ＥＫでの切断は、
ポリアクリルアミドゲル中に保持されるには小さすぎそして従って＋ＥＫレーン
中で検出されないＦＬＡＧ含有ポリペプチドを生成させる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/64 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/547 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アンドレイド−ゴードン，パトリシアアメリカ合衆国ペンシルベニア州18901ドイルスタウン・ウインデイラン301 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 BA14 CA01 FA10 GA11 HA06 4B050 CC03 EE10 FF12C HH01 KK18 LL01 LL05 LL10 4B063 QA05 QA20 QQ61 QQ95 QR16 QR90 QS05 QS22 QX10 4B065 AB01 AC14 BA02 BA24 CA33 CA44 CA46 CA60 4C076 CC50 DD29 EE38 FF02 4C084 AA01 AA03 BA01 BA08 BA22 CA53 DC03 MA05 NA03 ZC192

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】読み枠内でかつ順序どおりに、プレ配列、プロ配列、および
触媒ドメインカセットの同じ読み枠の挿入のためのクローニング部位を含んで成
る発現ベクター。
【請求項２】クローニング部位と読み枠内のタグ配列をさらに含んで成る
、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】前記ベクターが：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
列番号４、配列番号５および配列番号６より成る群から選択されるＤＮＡ配列を
含んで成る、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】前記ベクターが、クローニング部位に読み枠内で挿入された
触媒ドメインカセットを含有する、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】請求項１の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞。
【請求項６】（ａ）請求項４の発現ベクターを適する宿主細胞に移入する
こと；および（ｂ）発現ベクターからのチモーゲン触媒ドメインタンパク質の発現を可能にす
る条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること、を含んで成る、触媒ドメインカセットの発現方法。
【請求項７】前記発現ベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３
、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９
および配列番号１０より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、
請求項６記載の方法。
【請求項８】前記タンパク質が翻訳後タンパク質分解によりプレ配列で切
断される場合に、セリンプロテアーゼとして機能する、請求項４記載の発現ベク
ターを含有する組換え宿主細胞から産生されるセリンプロテアーゼ触媒ドメイン
。
【請求項９】前記プロテアーゼがＮｉ−ＮＴＡシリカもしくはＮｉ−ＮＴ
Ａアガロースビーズに結合される、請求項８記載のプロテアーゼ。
【請求項１０】（ａ）プロテアーゼの組換え触媒ドメインのモジュレータ
ーを組み合わせること；および（ｂ）タンパク質に対するモジュレーターの影響を測定すること、を含んで成る、本明細書に記述されるチモーゲン活性化構築物から発現かつ活性
化されるプロテアーゼの活性を調節する化合物の同定方法。【請求項１０】プロテアーゼに対するモジュレーターの影響が、その酵素
活性を阻害するがもしくは高めることである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】プロテアーゼに対するモジュレーターの影響が、発現され
た触媒ドメインにより媒介されるタンパク質分解の刺激もしくは阻害である、請
求項９記載の方法。
【請求項１２】化合物が、発現された触媒ドメインのモジュレーターであ
る、請求項９記載の方法において活性の前記化合物。
【請求項１３】請求項１２記載の化合物を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項１４】請求項１記載の発現ベクターを含んで成るキット。