JPH07502162A - 減システインｉｌ−６突然変異タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５６、突然変異タンパク質の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１ に対応する位置における他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項５４ 記載の宿主細胞。

５７、突然変異タンパク質の２２のＮ−末端アミノ酸が欠如している、請求項５ ４記載の宿主細胞。

５８、突然変異タンパク質のＮ−末端のアラニン残基が欠如している、請求項５ ４記載の宿主細胞。

５９、ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシスティン残基に対するコドンがセリン残基に対する１つのコ ドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシスティン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ 酸に対するコドンが欠如している宿主細胞。

６０．１Ｌ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシスティン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコ ドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシスティン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ 酸に対するコドンが欠如している宿主細胞。

６１、ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位［４５と５１に対応 する位置におけるシスティン残基に対するコドンがそれぞれセリン残基に対する 複数のコドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に 対応する位置におけるシスティン残基に対するコドンは保持され：Ｎ−末端アラ ニン残基に対するコドンが欠如している宿主細胞。

６２、ｌ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であっ て、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシスティン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコド ンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位 置におけるシスティン残基に対するコドンは保持され；Ｎ−末端アラニン残基に 対するコドンが欠如している宿主細胞。

明　細　書 減システィンＩＬ−６突然変異タンパク質発明の技術分野 本発明はＩＬ−６突然変異タンパク質に関する。特に本発明は、天然のＩＬ−６ のアミノ酸位置４５と５１に対応するシスティン残基が他のアミノ酸によって置 き換えられ、一方、アミノ酸位置７４と８４に対応するシスティン残基が保存さ れている、完全長トランケート（切形）ＩＬ−６突然変異タンパク質に関する。

発明の背景 インターロイキン−６（ＩＬ−６）はタンパク質の一つであり、文献では多くの 異名を与えられている。例えばインターロイキンーベー９２　（ＩＦＮ−Ｂ２） 、Ｂ細胞刺激因子−２（ＢＳＦ−２）　、Ｂ細胞ハイブリドーマ／プラズマ細胞 腫成長因子（ＨＰＧＦあるいはＨＧＦ）　、２６ｋＤａタンパク質及び肝細胞刺 激因子（Ｈ３Ｐ）などであり、以下の文献に記載されている：インターフェロン ーベーター２　（Ｚｉｌｂａｒｓｔｅｉｎら、ＥＭＢＯＪ、　５．２５１９（１ ９８６））　；２６ｋＤａタンパク質（Ｈａｅｇｅｍａｎら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５９．６２５　（１９８６））；Ｂ細胞刺激因子−２（Ｈ４ ｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．７３　（１９８６））；Ｂ細胞ハイブリド ーマ／プラズマ細胞腫成長因子（Ｖａｎ　５ｎｉｃｋら、Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３．９６７９　（１９８６））；Ｂ１１１ｉａ ｕ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ８．８４　（１９８７））　：Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６８．５４３　（１９８７））　；Ｔｏｓ ａｎｏら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．５０２　（１９８８）；及び肝細胞刺激因 子（Ｇａｕｌｄｉｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、’　８４．７ ２５１（１９８７））。

ハイブリドーマ成長因子の配列、即ちＩＬ−６の配列は。

Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆらによってＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ１３９．４１１５−４１２１　（１９８７）に記載されている：第４１１９ペ ージのｒｇＪ２Ａ参照。そのアミノ酸配列はシグナル・ペプチドを含み、このシ グナル・ペプチドはマチニアで完全長のＨＧＦタンパク質に続いている。

シグナル・ペプチドがどこで終わり、マチニアなタンパク質がどこで始まるのか については議論がある。シグナル・ペプチドは２７番目のアミノ酸（プロリン） か２８番目のアミノ酸（アラニン）で終わると記載されている。マチニアで完全 長のタンパク質は、アラニンで始まる１８５のアミノ酸残基かプロリンで始まる １８４のアミノ酸残基を有する。ソースが異なれば、ＩＬ−６の完全長とトラン ケートの異なったものの混合体となり、完全長のＩＬ−６、最初の二つのアミノ 酸即ちＡｌａＰｒｏを欠＜ＩＬ−６、最初のアミノ酸即ちＡｌａを欠＜ＩＬ−６ を含む。これについては、インターロイキン−６、’Ｓｅｈｇｅｌら編、（Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　八ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、第５５７巻）、ペー ジ１０４−１０（１、”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｕ＋ｎａｎ　ｆｌＰＧＦ／ＩＬ−６”のペ ーW １０７　（１９８９年）を参照されたい。

Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆらの論文の図２０には、ＨＧＦ、ＩＦＮ−ベーター２． ２６ｋｄタンパク質及びＢＳＦ−２をコードするヌクレオチド配列間の差異が記 載されている。これらの差異は２６　ｋ’ｄタンパク質のヌクレオチド４６にお けるＴと、残る三つの配列においてこの位置に対応するＣ；及びＩＦＮベーター ２における４２９番目の位置のＣと、他の三つの配列においてこの位置にある、 これに対応するＧである。Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ　’ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３９．４１１６−４１２１　（１９８７）のページ４ １１８、カラム１、第二バラグラフ参照。これら二つの差異はＢｒａｋｅｎｈｏ 　ｆ　ｆらによってサイレント・ポイント変異と記載されている。

よッテアミノ酸配列ＨＧＦ、ＩＦＮ−べ　９−２．２６ｋｄ及びＢ　Ｓ　Ｆ　− ２ハ同じタンパク質に対する異名であると考えられる。本発明の記述の目的のた めに、マチニアで天然由来かつ完全長のＩＬ−６のアミノ酸配列はＨＧＦ、■Ｆ Ｎ−ベーター２．２６ｋｄタンパク質及びＢＳＦ−２のアミノ酸配列と同一であ ると考える。

ＩＬ−６は多くの顕著な生物学的活性を有する重要なサイドキンであると報告さ れている。ＩＬ−６の活性は、他のインターロイキンやＴＮＦなど、他の成長因 子と結びついて発現することがしばしばある。よって、ｒＬ−６は感染や外傷に 対する炎症及び免疫応答の調整に重要な役割を果たしていると信じられている。

例えば、ＩＬ−６はＢ細胞、Ｔ細胞及び多能造血始原細胞の増殖と分化に関与し ている事が明らかにされている。

加えて、ＩＬ−６は炎症における応答に関与していること、及び肝細胞中の種々 の急性期タンパク質を誘導することが知られている。炎症応答におけるＩＬ−６ の関与の付加的証拠として、重度の火傷、腎移植、中枢神経系の急性感染、慢性 関節リウマチ及び敗血症性ショックの患者の体液中に高濃度のＩ’Ｌ−６が存在 することが挙げられる。

ＩＬ−６は巨核球形成と血小板産生を刺激することも示されている。これについ てはＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｂｌｏｏｄ　７？、７３５−７４０　（１９９１）及 びＨｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ　７？、４２−４８　（ｔ９９１）を参照されたい。

ＩＬ−６の生物学的活性は、重要な免疫療法的、抗炎症的組成物を示唆している 。ＩＬ−６と他のインターロイキンを含有する免疫療法的組成物は、例えば、Ｋ ｉｓｈｉｍｏｔｏら（味の素ｔ１８）によってヨーＤツバ出願番号第２５７４０ ６号に提起されている。

少量のヒ）ＩＬ−６は、ＩＬ−６を分泌する細胞のような天然物から単離できる かも知れない、；ｒＬ−６を分泌する細胞は、単核細胞、Ｔ細胞、繊維芽細胞、 ケラチノサイト及び内皮細胞など、多数存在する。

組換えＤＮＡ技法の出現以来、Ｅ、ｃｏｌｉ、注入キセノパス卵母細胞、無細胞 網状赤血球溶解物、昆虫細胞及び哺乳類細胞のような好適な宿主細胞における発 現によって、純粋なＩ　Ｌ−６を多量に得ることが可能であることが判った。例 えば、キセノパス卵母細胞や無細胞網状赤血球溶解産物における発現はＲｅｖｅ ｌらによって英国特許出願第２０６３８８２号に記載されている。

Ｆ：、ｃｏｌｉにおける発現はＳｎｏｕｗａｅｒｔによってＪｏｕｒｎａ　１ｏ ｆ１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４６．５８３−５９１　（１９９１）：Ｂｒａｋｅ ｎｈｏ　ｆ　ｆらによってＪｏｕｒｎａｌ　ｔｏｆ　Ｉｍｒｒｉｕｎｏｌｏｇｙ 。

１４５．５６１−５６８　（１’９９０）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩＴＩｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　’　１４３．１’１７５＝１１８２　（１９８９）及びＪｏｕ？ｎ ａｌ　Ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３９．４１１６−”４１２１（１９８７） に開示され；ＡｓａｇｏｅによってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６、ＬＯ６−８ ０９（１９８８）；及びＹａｓｕｅｄａによってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８ ．１０３６−１０４０　（１９９０）に開示されている。

商業的には、Ｅ、ｃｏｌｉでタンパクを産生ずることが出来ることが望ましい。

しかしながら、Ｅ、ｃｏｌｉにおける多量のＩＬ−６の発現には克服しなければ ならない問題があることが報告されている。例えば、Ａｓａｇｏｅらは、Ｘａ因 子−特異的開裂配列を用いてＨＧＦ融合タンパク質を調製するまでは、Ｅ、ｃａ ｌ目こおいてＩＬ−６を発現することができなかった；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　６．８０６−８０９　（１９８８）参照。同様にＹａｓｕｅｄａらは、高 い発現のレベルを達成するために、コード領域の前に二重Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅ１ｇ ａｒｎｏ配列を導入しなければならず、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅ１ｇａｒｎｏ領域と開 始コドンの間、及びタンパク質のＮ−末端領域のコドンにおいてＡ−Ｔに富んだ 配列を用いた：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ、ｇｙ　８゜１０３６−１０４０　（１ ９９０）。

分子生物学者たちは、組み換えＤＮＡ技法によって多量の純粋なタンパク質を調 製することができる他に、天然に存在するタンパク質を改良することができる。

例えば、天然のタンパク質に存在するアミノ酸のいくつかを欠いたタンパク質を 調製することができる。このようにしてＢｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆらはｌ−６の生 物学的活性は、マチニアでかつ天然のＩＬ−６からアミノ酸残基を２８個まで除 去しても影響されないことを報告している；ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ　１ｔ３．１１７５−１１８２　（１９８９）参照。　−天然 のタンパク質は、アミノ酸をあるタンパク質中に自然に存在する一つ以上のアミ ノ酸で置き換えることによっても改質することができる。そのような置換物は、 所望のアミノ酸を表すコドンを有するように改変されたヌクレオチド配列を有す る組換えＤＮＡを発現することによって、タンパク質中に導入する千とができる 。ＤＮＡは定方向突然変異の技法を用いて容易に改変することができる。

そのように改変されたＤＮＡによって発現されたタンパク質は突然変異タンパク 質と呼ばれる。定方向突然変異技法はり、ａ、ｔ　ｈ、ｅ　ｒら、Ｇｅｎｅｔｉ ｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ％Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、３１−５０ページ （１９８３）及びＳｍ１ｔｈとＧｉ　ｌ　ｌ　ａｍ、Ｇｅｎｅ　ｔｉ　ｃＥｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

Ｐｌｅｎｕｍ　ＰｒｅｓｓＶｏｌ、１−３２ページ（１９８１＞において検討さ れている。

例えば、天然インターフェロン・ベータのシスティン残基を他のアミノ酸で置き 換えることが推奨されてきた；Ｍａｒｋら、米国特許第４８５３３３号参照。

報告によると、インターフェロン・ベータのシスティン残基は分子間及び分子内 に望ましくない結合を形成し、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現を妨げ活 性に影響を与える。Ｍａｒｋらは、この方法は「好ましくないジスルフィド結合 を形成しやすくする機能的に非必須のシスティン残基を含む、任意の他の生物学 的に活性なタンパク質」に好適に適用できると推測している。

もちろん、Ｍａｒｋらは生物学的活性を保持したままで常にシスティン残基が置 換され得るとは限らないという点は認識している。もしシスティン残基がタンパ ク質の三次構造に必須のジスルフィド結合を形成すれば、システィンの置換物は 少なくとも幾らかの生物学的活性の損失をもたらすであろう。Ｍａｒｋらによる と文献から「生物学的に活性なタンパク質のシスティン量及び、活性と三次構造 に関してシスティン残基が果たしている役割についての情報」を知ることができ る。

ＩＬ−６のシスティン残基の一以上を置換することが推奨されている；Ｃ１ｅａ ｒｋら、ＰＣＴ出１ｊｉＷＯ８８１００２０６参照。しかしながら、浅っがの証 拠によるとそのような置換を行うことは好ましくない。

例えば、システィン残基が他のアミノ酸によって置換されやすいのはどのタンパ ク質かについて予想するためにＭａｒｋらが米国特許第４８５３３３２号におい て提案しているガイドラインによると、そのようなタンパク質は通常奇数のシス ティン残基を有する。ＩＬ−６には四つのシスティン残基がある。よってＩＬ− ６はＭａｒｋらによって提案されているガイドラインとは両立しない。

加えて、ＳｎｏｕｗａｅｒｔらはＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ（ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　 １４５．５８５−５９１　（１９９１）において、ＩＬ−これは、彼らがＩＬ− ６とＧ−Ｃ３Ｆは非常に相同性が高く、ヒトＩＬ−６とヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆのジスル フィド構造は類似しているということを知っていたからである；これについては Ｃｌｏｇｓｔｏら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ 　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　２７２．１４４−１５１　（１９８９）を参照。ヒ） Ｇ−Ｃ３Ｆの四つの保存されたシスティン残基のどのひとつを置換しても生物学 的活性の喪失がもたらされることも知られているので、Ｓｎｏｕｗａｅｒｔらは システィン・フリーｎ−６における活性の喪失は予想されていたと論断している 。

ＳｎｏｕｗａｅｒｔらはＩＬ−６分子のどの領域が活性に必要なのかを決定する ために実験を行った。彼らは、天然ＩＬ−６の全長にわたってそれぞれ２０個物 はどれも活性を失った。Ｓｎｏｕｗａｅｒｔらはジスルフィド結合がヒ）ＩＬ− ６の生物学的に活性な配座を保持するのに重要であると結論している。

■Ｌ−６の活性に対するシスティン残基の重要性を示す付加的な証拠はＢｒａｋ ｅｎｈｏ　ｆ　ｆらによる論文、即ちＪｏｕｒａｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ　１４５．５６１−５６８　（１９９０）において見いだされる。Ｂｒａｋ ｅｎｈｏｆ　ｆらはＩＬ−６の活性部位を調べるために特異的モノクローナル抗 体のエピトープ・マツピングを用いた。彼らはＩＬ−６分子には、活性に必要で あることを示唆している。Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆらは、場所は確かではないが 第二の活性部位がＩＬ−６にあるという意見を述べている。

ＩＬ−６の突然変異タンパク質とトランケート物を得ることが望まれる。特に望 まれることは、そしてそれが本発明の第一の目的であるが、天然のＩＬ−６の活 性に少なくとも比肩しうる減システィン変異タンパク質を、そのような変異タン パク質は存在しないという証拠にもかかわらず調製することである。

発明の概要 これらの、そしてその他の目的は、当業者にはやがて明らかになるものであるが 、天然のＴＬ−６の位置４５と５１のシスティン残基がそれぞれ他のアミノ酸に よって置換され、位置７４と８４のシスティン残基は置換されずに保持されてい るようなＩＬ−６の変異タンパク質を提供することによって達成される。

図面の簡単な説明 図１は、アラニン（ＩＬ−６５ＳＣＣ）　（シーケンスＩＤＮｏ：１　及びシー ケンスＩＤ　Ｎｏ：２）で始まる、ヒトＩＬ−６の完全長変異タンパク質のアミ ノ酸配列を示す。天然ＩＬ−６の、位置４５と５１のシスティン残基はセリン残 基によって置換されている。天然ＩＬ−６の、位置７４と８４のシスティン残基 は置換されずに保持されている。ＩＬ−６変異タンパク質を発現するヌクレオチ ド配列も合わせて示す。

図２は、実施例２において配列へとして記載した０、　５８０　ｋｂ　Ｂｃｏ　 Ｒ［Ｉ／Ｈｉｎｄ［ＩＩルー６　断片を示す。

図３は、実施例１においてｐＢｅｔａ　ｇａｌ／ＢＫ／ｃｆｆ［Ｌ−６（シーケ ンスＩＤＮｏニア　及びシーケンスＩＤ　Ｎｏ　：　８）として記載したプラス ミドを示す。

図４は、実施例２においてρにに２３３−２ｃｆ　ＩＬ−６として記載したプラ スミドの構築を示す。

図５は、実施例３においてｐＫＫ−２２ａａ　ｃｆｌＬ−６として記載したプラ スミドを示す。

図６は、Ｉ）ＫにＩＬ−６ＳＳＣＣ（シーケンスＩＤ　Ｎｏ：５　及びシーケン スＩＤＮｏ　：　６）のＮｃｏ１／ｆｌｉｎｄｌｌｌ断片を示す。実施例５参照 。

図７は、フェニル−セファロース疎水相互反応カラムからの溶出に続＜　−２２ ａａＩＬ−６５ＳＣＣ断片の溶出クロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの断片の 吸光度と時間（分）及び伝導度の勾配プロフィルを比較している；実施例１０ａ 参照。

図８は、Ｑ−セファロースカラムからの一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの溶出ク ロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの断片の吸光度と時間（分）及び伝導度の勾 配プロフィルを比較している；実施例１０ｂ参照。

図９は、ＣＭ−セファロース・イオン交換カラムからの一２２ａａ　ＩＬ−６５ ＳＣＣの溶出クロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの断片の吸光度と時間（分） 及び伝導度の勾配プロフィルを比較している；実施例１０ｃ参照。

図９Ａは、−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの精製の流れを示す。

図１０は、実施例１２において記載したＢ９増殖試験の結果を示す。

図１１は、実施例１２において記載した５ＫＷ６．４ヒ）ＩｇＭ産生試験を示す 。

図１２は、Ｈｉｎｄｌｒｌ／Ｋｐｎｌ　ＩＬ−６を含有するｐＴｒｐＢ／εに／ ｃｆｌＬ−６断片を示す；実施例１３参照。

図１３は、リコンビナント１！ｋＰｃＲによってＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ −６５ＳＣＣと−ＣＣ３Ｓを調製するだめの、実施例１４Ｂに記載の方略を示す 。

図１４は、ＩＬ−６変異体の変種の生物学的活性を示す；実施例１５参照。

本発明は、天然のＩＬ−６の活性に少なくとも比肩しうる生物学的活性を有する 、ＩＬ−６の突然変異タンパク質に関する。本明細書においては、ＩＬ−６とは ヒ）ＩＬ−６を指し、Ｉ　Ｌ−６と同じ名前で文献に記載されているタンパク質 を含む。そのようなタンパク質はインターフェロン・ベーター２（ＩＦＮ−８２ ））、Ｂ細胞刺激因子−２（ＢＳＦ−２）　、Ｂ細胞ハイブリドーマ／プラズマ 細胞腫成長因子（ＨＰＧＦあるいはＨＧＦ）　、２６ｋＤａタンパク質及び肝細 胞刺激因子（Ｈ３Ｐ）を含む。

ＩＬ−６のアミノ酸配列は文献に記載されている；例えば、Ｂｒａｋｅｎｈｏ　 ｆ　ｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３９．４１１６−４ １２１　（１９８７）の図２Ａ、Ｃ１ａｒｋら、ＰＣＴ出願ＷＯ３８１００２０ ６の図１を参照。これらの文献には、天然のＩＬ−６ｍＲＮＡに対応するｃＤＮ Ａ配列も記載されている。

天然のＩＬ−６は四つのシスティン残基を含み、これらはマチニアな完全長配列 の４５．５１７４及び８４番の各位置にある。これらの位置は、マチニアで天然 の完全長ＩＬ−６はアラニンを残基１として始まる１８５個のアミノ酸を含有す るという本明細書の定義に基づくものである。本明細書において、「了ミノ酸」 という語は、２０の天然界に存在するアルファー−アミノ酸を意味する。本発明 の突然変異タンパク質において、天然のＩＬ−６の位置４５と５１に対応するシ スティン残基は、それぞれ任意の他のアミノ酸で置換されている。一方、ＬＬ− ６の位置７４と８４に対応するシスティン残基は、本発明の突然変異タンパク質 において置換されずに保持されている。

発明者らは、予期しえない発見をするに至った。ＩＬ−６の活性は最初の二つの システィン残基を他のアミノ酸で置き換えることによって最も影響されると予想 されたであろう。これらのシスティン残基は、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆらによっ て活性部位の近くにジスルフィド結合を形成すると予想されていたことく上述） を記憶に留めるべきである。

そこで、まず発明者らは三番目と四番目の残基を他の残基で置き換えようと企て た。最初に試みた残基はセリンであった。

三番目と四番目のシスティン残基をセリン残基で置き換えても、得られた突然変 異タンパク質は比較的小さい活性しか有しなかった。Ｂｒａｋｅｎｈｏ　ｆ　ｆ らは、マチニアで天然の完全長（Ｌ−６の位置７４と８４にある、三番目と四番 目のシスティン残基は、最初の二つのシスティン残基より活性部位から遠いと予 想していた。

発明者らは、驚くべきことに、最初の二つのシスティン残基がセリン残基で置換 されたとき、得られる突然変異タンパク質は優れた活性、即ち、天然のＩＬ−６ の活性に少なくとも比肩しつる活性を有することを見いだした。最初の二つのシ スティン残基をセリン以外の残基で置換しても、優れた活性を有するＩＬ−６突 然変異タンパク質が得られる。

図１は、本発明の減システィンＩＬ−６突然変異タンパク質の一例にｋけるアミ ノ酸配列を示す。この配列は、位、［ｉ！４５と５１にふける天然システィン残 基をセリン残基で置き換えた他は天然のＩＬ−６の配列と同一である。突然変異 タンパク質を発現するヌクレオチド配列も図１に示す。

本明細書においては、システィン残基を位置７４と８４に有するが位置４５と５ １には有しないＩＬ−６突然変異タンパク質はＩＬ−６ＸＸＣＣと呼ばれる。

ここで、Ｘは任意の天然に存在するアルファアミノ酸若しくはアミノ酸類似体で ある。好ましくは、Ｘは天然のアミノ酸である。好ましい天然のアミノ酸として はアラニン、セリン、スレオニン、プロリン及びグリシンが挙げられる。システ ィン残基と置換される好ましいアミノ酸はセリンとアラニンである。

天然のマチニアなＩＬ−６（ＸＸ）の位置４５と５１に対応する位置でシスティ ン残基と置換される二つのアミノ酸は同一でも異なっていてもよい。ＸＸの例と してはＳＳ、ＡＡ、ＧＧ、ＤＲ，ＲＤ、ＳＡ、ＡＳなどが挙げられる。

そこで、図１に示すアミノ酸配列をＩＬ、−６５ＳＣＣと呼ぶ。どのシスティン 残基が置換されたか、また、どのアミノ酸が置換したかの表記がない場合には、 ＩＬ−６５ＳＣＣにおけるように、第一と第二のシスティン残基がセリン残基に よって置換されたものとみなされる。

本発明の突然変異タンパク質は、図１に示すように、完全長天然ＩＬ−６に対応 する、全１８５のアミノ酸残基を含有する。あるいは、１から２８ＯＮ−末端　 。

アミノ酸残基が除去されていてもよい。本発明における、除去された形の突然変 異タンパク質は、−ｎａａ　ＩＬ−６ｃｙｓ　ＸＸＣＣと表記される。ここで、 Ｘは上述のとおりであり、ｎは欠落しているアミノ酸残基の数をあられす。よっ てＮ−末端の２２個のアミノ酸を欠くトランケートの突然変異タンパク質は一２ ２ａａ　ｊＬ−６，ｃｙｓ　Ｘ、ＸＣＣと表記される。

マチニアで完全長のＩＬ−６における、位置１のアラニンと位置１と２のＴラニ ンープロリンはしばしば、タンパク質を処理しているあいだに開裂する。そこで 、本発明の突然変異タンパク質はしばしば、純粋のルー６　ｃｙｓ　ＸＸＣＣ， 純粋の−ｌａａ比−６ｃｙｓ　ＸＸＣＣ、純粋の一２ａａ　ＩＬ−６ｃｙｓ　Ｘ ＸＣＣ，または、比−６ｃｙｓ　ＸＸＣＣ，、−Ｉａａルー６　ｃｙｓ　ＸＸＣ Ｃ及び−２ａａ　ＩＬ−６ｃｙｓ　ＸＸＣＣのうちのニないし三の混合物を含有 する。

トランケート突然変異タンパク質の配列におけるアミノ酸の位置は、あたかもそ の突然変異タンパク質が完全長であるかのように、天然のＩＬ−６におけるアミ ノ酸の位置に対応して定義される。例えば、もしセリン残基が完全長Ｉ　Ｌ−６ の位置４５でシスティン残基と置き変わり、Ｎ−末端の２２個のアミノ酸が除か れるなら、トランケート型の第一のアミノ酸、セリンは完全長１−６の２３番目 のアミノ酸残基に対応する。トランケート突然変異タンパク質の２３番目のアミ ノ酸は、完全長ＩＬ−６の位［４５で置きかわるシスティン残基に対応する。

本発明は、本発明の完全長及びトランケート突然変異タンパク質をコードする核 酸分子をも包含する。核酸分子はＲＮＡかＤＮＡである。ＤＮＡは天然由来であ ることができ、例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮΔから得ることができる。

ＤＮＡはまた個々のヌクレオチドから合成することもできる。

核酸分子の配列は対応する突然変異タンパク質をコードする任意の配列であって よい。核酸分子は、例えば天然ＩＬ−６遺伝子の配列を有する。核酸分子は、Ｉ Ｌ−６突然変異タンパク質を発現するために用いた特定の宿主において、その発 現を最大にする配列を有することが好ましい。

本発明は上記の様な突然変異タンパク質と等価な変種、及びそのような変種をコ ードする核酸分子をも包含する。等価な変種とは、本発明の突然変異タンパク質 におけるアミノ酸、ヌクレオチド配列及び対応する核酸分子の中の置換や付加を 含む。変種は、得られた突然変異タンパク質と核酸分子が上記の機能的な基準を 満たすかぎり、即ち、天然ＩＬ−６の活性に少なくとも較べうる活性を保持する かぎり、本発明に含まれる。実質的に他の配列と同一であるが一以上の置換や付 加によって他の配列と異なるようなアミノ酸やヌクレオチドの配列は等価な配列 であると見なされる。天然のマチニアなＩＬ−６の位置４５と５１に対応するシ スティン残基の置換物を別として、等価な配列における置換や付加の割合は、本 発明の突然変異タンパク質のアミノ酸若しくはヌクレオチドの総数の、好ましく は２５％より少なく、より好ましくは１０％より少なく、最も好ましくは５％よ り少ない。

例えば、ある配列中のアミノ酸をこれと等価なアミノ酸で置換することは公知で ある。通常等価と考えられているアミノ酸グループは次のようなものである二（ ａ）　Ａｌａ（Ａ）　５ｅｒ（Ｓ）　Ｔｈｒ（Ｔ）　Ｐｒｏ（Ｐ）　Ｇｌｙ（Ｇ ）；（ｂ）　Ａｓｎ（Ｎ）　Ａｓｐ（Ｄ）　Ｇｌｕ（Ｂ）　Ｇｌｎ（Ｑ）；（ｃ ）　Ｈｉｓ（）Ｉ）　Ａｒｇ（Ｒ）　Ｌｙｓ（Ｋ）；（ｄ）　Ｍｅｔ（Ｍ）　Ｌ ｅｕ化）、　１ｉｅ（１）　Ｖａｌ（Ｖ）及び（ｅ）　Ｐｈｅ（Ｆ）　Ｔｙｒ（ Ｙ）　Ｔｒｐ（Ｗ）。

完全長でトランケートのＩＬ−６突然変異タンパク質への付加は、Ｃ−末端また はＮ−末端の終点において、対応するコドンを核酸配列の５゛または３°末端に 付加し、核酸分子を発現することによって行われる。核酸分子への内面的付加の 例としては、ゲノムＤＮＡに存在する介在配列が挙げられる。介在配列は、適当 な真核性宿主細胞の中では発現しない。

突然変異タンパク質の調製 本発明の突然変異タンパク質を得るには、対応する核酸分子を調製、増幅し、突 然変異タンパク質を適当な宿主細胞の中で発現するのが好ましい。好適な宿主細 胞の例としては、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類の細胞が挙げられる。中でも細菌 細胞が好ましい。Ｅ、ｃｏｌｉが特に好ましい。

本発明のＩＬ−６突然変異タンパク質をコードするＤＮＡは、四つの個々のヌク レオチドからの合成によるか、または天然の工Ｌ−６配列若しくは天然のＩＬ− ６配列の変種の変異誘発によって調製される。天然のＩＬ−６Ｄ、、ＮＡはヒト ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから単離される。天然の、またはトラ ンケートの工Ｌ−６ＤＮＡは、ＩＬ−６配列若しくはＩ’　Ｌ　−６の変種の配 列を含むリコンビナント・ベクターから単離することもできる。これらの方法に ついて以下に述べる。

四つのヌクレオチドからのＤＮＡの化学合成は、全体的にも部分的にも公知の方 法で行うことが出来る。そのような方法の例としてＣａｒｕｔｈｅｒｓによる、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．２８１−２８５　（１９８５）に記載されているもの が挙げられる。ＤＮＡはまた二重鎖のオリゴヌクレオチドを重ね合わせ、隙間を 埋め、両端を連結することによっても合成することができる。そのような方法に よって個々のヌクレオチドから、ＩＬ−６をコードするＤＮＡ分子を合成するこ とについてはＹａｓｕｅｄａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ’ｏｇｙ　８’、１０３ ６−１０’４０’（１９９０）に記載されている。

ＩＬ−６遺伝子やその断片のコード領域もまた、公知のＤＮＡ配列を用いて一以 上の適当なオリゴヌクレオチド・プローブを合成することによって、ヒトめ細製 される。この後、ヒトｃＤＮＡやゲノムＤＮＡのライブラリーまたはｍＲＮＡの ソースを、標識化した一個または複数のプローブを用いてスクリーニングする。

本発明の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡへと変換させるための出発物質 として好適なりＮＡを得るためには、手に入るりコンビナンド・プラスミドから 、天然ＩＬ−６、または天然ＩＬ−６の変種をコードするＤＮＡを単離すること が好ましい。四つのシスティン残基を含有する天然の完全長及びトランケートの ｒＬ−６をコードするりコンビナンド・プラスミドが知られている；例えばＣ１ ａｒｋら、ＰＣＴ出ＩＪｉＷＯ８８１００２０６；Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆら、 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４３．１１７５−１１８２　 （１９８９）；Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ　１３９．４１１６−４１２１　（１９８７）；Ｈｉｒａｎｏら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．２２８−２３１　（１９８ ７）参照。天然のＩＬ−６の位置４５と５１に対応する位置におけるシスティン 残基に対するコドンは、他のアミノ酸に対するコドン、好ましくは他の中性アミ ノ酸に対するコドン、より好ましくはセリンまたはアラニン残基に対するコドン によって置換される。システィンの置換は、部位特異的突然変異誘発によって行 うことが出来る。

あるいは、四つのシスティン残基がすべてセリン残基によって置換された、天然 ＩＬ−６の変種をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｐ ＣＴ出１１１ＪｉＵｓ８９１０５４２１の記載に従って得ることが出来る。天然 ＩＬ−６の位置７４と８４に対応する位置におけるセリン残基に対するコドンは 、部位特異的突然変異誘発などによってシスティン残基で置換される。位置４５ と５１に対応する位置におけるセリン残基に対するコドンは、そのまま保持され るかまたは他のアミノ酸残基、例えばアラニン等、によって同様に置換される（ 下記参照）。部位特異的突然変異誘発は公知の方法で行われる。例えば、Ｚｏｌ ｌｅｒとＳｍｉ　ｔｈ、Ｎｕｃ　１．Δｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１０，６４８７−６ ５００（１９８２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏ’ｌｏｇｙ　ｌＱＱ 、４６８−５００　（１９８３）；ＤＮＡ　３．４７９−４８８　（１９８４） 参照。

四つのシスティン残基すべてをふくむ［Ｌ−６と、四つのシスティン残基すべて が他のアミノ酸残基で置換されているＩ　Ｌ、　−６変種をコードするＤＮＡは 公知（Ｓｎｏｕｗａ　ｅ　ｒ　ｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ１４６．５８５−５９１　（１９９１））なので、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８．１７８−１８３　（１９９０）に記載のりコンビナン ド環複製連鎖反応（ＰＣＲ）の改変法によっても二つのシスティン残基の置換を 行うことができる。

図１３にその方法を用いた例を示す。二つのプラスミドを使用した例である。

ひとつのプラスミドはシスティン残基が他の残基で置換された、システィン−フ リーのＩＬ−６変種をコードするＤＮＡを含有している。他方のプラスミドはシ スティンを含むＩＬ−６をコードする対応ＤＮＡを含有している。

各プラスミドは二つの別々のＰＣＲプライマー・セットによって増幅される。

第一のプライマー・セット　−これをａと表記する−　は天然ＩＬ−６の配列の コドン４５−５１に対応するヌクレオチドをコードする領域を除いて、各プラス ミドの全長にわたり増幅を行うために用いる。このタイプの反応によって得られ る生成物を、反応で用いる鋳型によって”ａ−（ｃｙｓ）”あるいは”ａ　−（ ｃｙｓ−ｆｒｅｅ）”と呼ぶことにする。同様にして、同じプラスミドを鋳型と し、プライマー・セットｂを用いる、第二のタイプの反応によってｂ−（Ｃｙｓ ）”あるいはｂ−（ｃｙｓ−ｆ　ｒｅｅ）″が得られる。これらの得られた生成 物は、天然ＩＬ−６の配列におけるコドン７４−８４に対応するヌクレオチドを コードする領域を除いて、各プラスミドの全配列を含んでいる。

ゲル精製の後、精製物”ａ　−（ａｙｓ−ｆ　ｒｅｅ）”と”ｂ−（ｃｙｓ）” とを結合し、変性、アニーリングを行い、二つの一本鎖間隙を有するリコンビナ ント環を得る。第一の間隙を横切る一本鎖ＤＮＡは、位置４５と５１でシスティ ン残基以外のアミノ酸をコードし、一方、第二の間隙を横切る一本鎖ＤＮＡは、 位置７４と８４でシスティン残基をコードする。Ｅ、ｃｏｌｉへの形質転換の後 、これらの間隙を有する環は修復され、位置４５と５１のシスティンが他のアミ ノ酸で置換されたＩＬ−６突然変異タンパク質をコードする遺伝子を運ぶプラス ミドが得られる。実験の更なる詳細を実施例１４Ｂに記す。

本発明の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡは公知の方法によって増幅され る。好適な方法の例としては、５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７ 　（１９８８）、Ｍｕ＋１ｉｓら、米国特許第４６８３１９５、及びＳａｍｂｒ ｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓｍ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ″、第二版、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）が 挙げられる。クローンは、アンブリマーとしてラムダ−ｇｔｌｌ−特異オリゴマ ーを用い、ラムダ−ｇｔｌｌベクターにおいて増殖するのが便利である。

ＩＬ−６突然変異タンパク質をコードするＤＮＡの発現本発明の突然変異タンパ ク質をコードするＤＮＡは、複製され、種々の宿主に挿入されて、種々のクロー ニング・ベクター及び発現ベクターにおいてリコンビナント突然変異タンパク質 を発現するために用いられる。

突然変異タンパク質ＩＬ−６のコード領域をコードするＤＮＡがスプライシング されてなるベクターは、染色体、非染色体及び合成りＮＡ配列の断片を含む。

好ましい原核クローニング・ベクターとしては、ｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ，ｐＫＳＭ及びＲＰ４等のＦ：、ｃｏｌｉから得られ るプラスミドが挙げられる。原核ベクターは、Ｍ１３等のファージＤＮＡや他の 糸状−水制ＤＮＡファージの誘導体も含む。

本発明の突然変異タンパク質を細菌、特にＥ、ｃｏｌｉにおいて発現するベクタ ーもまた公知である。そのようなベクターとしては、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ及びＴ ｚａｇｏ　ｌ　ｏ　ｆ　ｆによってＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０．１５１３ −１５２０　（１９８５）に発表されているＰＡＴＨベクターが挙げられる。こ れらのベクターは、カルボキシ終末においてポリリンカーに続く、アントラニル 酸シンターゼ（ＴｒｐＥ）をコードするＤＮＡ配列を含む。他の発現ベクター系 はベーターガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）、ラムダＰｌ　；マルトース結合タンパ ク質（ｐＭＡＬ）；グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づく ものである一Ｇｅｎｅ　６７．３１　（１９８Ｂ）及びＰｅｐｔｉｄ６Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ　３．１６７　（１９９０）。

酵母で有用なベクターが入手可能である。好ましい例としては２ｕプラスミドが 挙げられる。

哺乳類の細胞において好適に使用できるベクターも公知である。そのようなベク ターとしては、良く知られた５Ｖ−４０の誘導体、アデノウィルス、レトロウィ ルス由来のＤＮＡ配列、及びプラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来す るベクターが挙げられる。

更に真核性の発現ベクターもこの技術分野において公知である（例えばＰ、Ｊ。

５ｏｕｔｈｅｒｎとＰ、Ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、ｌ、３ ２７−３４１　（１９８２）；Ｓ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏ　１．Ｃｅ　１ １゜Ｂｉｏｌ、１．８５４−８６４　（１９８１）：Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎｎ とＰ。

Ａ、　Ｓ　ｈ　ａ　ｒ　ｐ　”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　Ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｃｏｔｒａｎｓ■■モ狽■■ ｗｉｔｈ　Ａ　Ｍｏｄｕｌａｒ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａ ｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　Ｇｅｎｅ”Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、１５９．６０１−６２１　（１９８２）；Ｒ，Ｊ。

Ｋａｕｆｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ａ、５ｈａｒｐ、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ 。

１５９．６０１−６６４　（１９８２）；Ｓ、ｒ、５ｃａｈｉｌｌら、”Ｂｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　 Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｏｆ＾Ｈｕｍａｎ　ＩｍｍｕｎｅＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ＤＮ Ａ　Ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｌ（ａｍｓｔｅｒ　０ｖａｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ″、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．４６５４−４６５９　（１９８３）；ｃ。

Ｕｒｌａｕｂとり、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡ７７．４２１６−４２２０　（１９８０）参照）。

本発明において有用な発現ベクターは、発現されるべきＤＮＡ配列または断片に 対して機能的に連結される、少なくとも一つの発現コントロール配列を含む。

このコントロール配列は、クローン化したＤＮＡ配列の発現をコントロールし、 調整するためにベクターに挿入される。有用な発現コントロール配列の例として は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主オペレータ ー及びプロモーター領域、ｆｄコート・プロティンのコントロール領域、３−ホ スホグリセレート・キナーゼに対するプロモーター等の酵母の解糖プロモーター 、Ｐｂｏ２等の酵母酸ホスファターゼ、酵母アルファー接合型因子のプロモータ ー、及びポリオ−７、アデノウィルス、レトロウィルス又はシミアンウィルスに 由来するプロモーター、例えばＳＶ４０の早期及び後期プロモーター、その他、 真核または原核細胞、それらのウィルスまたはその組み合わせにふいて遺伝子の 発現をコントールすることが知られている配列が挙げられる。

有用な発現宿主としては、よく知られた原核及び真核細胞が挙げられる。好まし い原核細胞宿主の例としては、Ｅ、ｃｏｌｉ　５Ｇ−９３６、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ ＩＯＩ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｘ２２Ｂ２、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＴ、Ｅ、ｅｏｌｉ　ＭＲＣＩ等（７ ）Ｅ。

ｃｏｌｉ、シュードモナス、バチルス・サブチリス及びストレプトマイセスが挙 げられる。好ましい真核細胞宿主の例としては、酵母やその他の菌類、昆虫、Ｃ Ｏ３細胞やＣＨＯ細胞のような動物細胞、ヒト細胞及び組織培養した植物細胞が 挙げられる。

融合タンパク質 本発明の突然変異タンパク質は、適切な融合パートナ−と共に融合タンパク質の 形で発現される。融合パートナ−は精製と同定を容易にするものが好ましい。

融合パートナ−が宿主において自然に発現されるときに高い収率が得られる。有 用な融合パートナ−としては、ベーターガラクトシダーゼ（Ｇ　ｒ　ａ　ｙら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．６５９８　（１９８２ ））；ｔｒｐＥ　（Ｉｔａｋｕｒａら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．１０５６（１ ９７７））；プロティンＡ　（ＴＪｈｌｅｎら、Ｇｅｎｅ　２３．３６９（１９ ８３）；グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（Ｊｏｈｎｓｏｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３８．５８５　（１９８９））；Ｖａｎ　Ｅｔｔｅｎら、Ｃｅ １１５８．６６９　（１９８９））；マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎら、 Ｇｅｎｅ　６７．２１−３０　（１９８７）　；Ｍａｉｎａら、Ｇｅｎｅ　７４ ．３６−３７３　（１９８８）；Ｒｉｇｇｓ、Ｐ、著、Ａｕ５ｅｂｅｌ、Ｆ、　 Ｍ、ら（編）’Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒＢｉｏｌｏｇｙ’　ＧｒｅｎｎｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ／ＷｉｌｅｙＩｎｔｅ ｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９９０））が挙げられる。

上記のような融合タンパク質は、融合パートナ−に結合する試薬を用いたアフィ ニティー・クロマトグラフィーによって精製される。試薬は融合パートナ−の特 異的リガンド、または抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。例えば、ベ ーターガラクトシダーゼを含有する融合タンパク質は抗ベータ・ガラクトシダー ゼ抗体カラムを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製するこ とができる（Ｕｌ　１ｍａｎＳＧｅｎｅ　２９．２７−３１　（１９８４））、 同様にして、マルトース結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、架橋アミ ロースを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製することがで きる；Ｇｕａｎ、ヨー０７バ特許出１ｊＩ２８６２３９参照。

随意に、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、その融合タンパク質がＩＬ７− ６突然変異タンパク質と融合パートナ−との間に開裂可能な部位を含むように制 作することができる。化学的に開裂可能な部位及び酵素的に開裂可能な部位の双 方とも本技術分野で公知である。ＩＬ−６突然変異タンパク質は開裂部位のアミ ノ−末端またはカルボキシ末端部に生成する。

酵素的に開裂可能な部位の好適な例は、コラゲナーゼ（Ｋｅｉｌら、ＦＥＢＳＬ ｅｔｔｅｒｓ　５６．２９２−２９６　（１９７５））；エンテロキナーゼ（Ｈ ｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．１２０４−１２１０（１９８Ｂ） ）；ファクターＸａ（Ｎａｇａｉら、Ｍ　ｅｔ　ｈ　ｏ　ｄ　ｓＥｎｚｙｍｏｌ 、１５３．４６１−４８１　（１９８７））；及びトロンビン（Ｅａｔｏｎら、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ、、ｇｙ　２５．５０５　（１９８６））によって特異 的に認識され、開裂される部位である。コラゲナーゼはプｐｌＪンとＰ　ｒ　ｏ −ｘ　−Ｇ　１　ｙ　−Ｐ　ｒ　ｏのＸの間で開裂させる。ここでＸは中性アミ ノ酸である。エンテロキナーゼは、配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙ ｓにおいてリジンの後で開裂させる。ファクターＸａは配列１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇにおいてアルギニンの後で開裂させる。トロンビンは配列Ａｒｇ− Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｒｏにおいてアルギニンとグリシンの間で開裂させる。

特定の化学開裂試薬もまた公知である。例えば、シアノーゲンブロマイドはタン パク質においてメチオニン残基の所で開裂させる。

突然変異タンパク質の精製 リコンビナントタンパク質は、本技術分野において公知の方法によって精製され る。そのような方法の例として特異抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラ フィーが挙げられる。あるいは、リコンビナントタンパク質は、本技術分野で公 知の方法によって、イオン−交換、サイズ−除去法、及び疎水相互作用クロマト グラフィーの組み合わせによって精製することもできる。これらの、およびその 他の適切な方法は、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ編、第三巻、ＩＲＬブレス社、英国、 １９８７の’　ＤＮＡ　Ｃ１ａｎ　ｉｎｇ”中の、Ｍａｒｓｔｏｎによる”Ｔｈ ｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｐｒｏｔａｉｎｓ 　［１ｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎε、ｃｏｌ白こ記載されているB 適切なひだ形成 正しい、即ち活性のある、Ｈ，−６突然変異タンパク質構造を得るためには、突 然変異タンパク質は適切に折り畳まれなければならない。適切なひだ形成には、 システィン残基間における正しい分子内ジスルフィド結合（即ち、酸化）が必要 である。分子間システィン残基における好ましくない酸化は、最小限に抑えるべ きである。

変性タンパク質を酸化し、再生して活性状態にする方法は公知である。好ましく は、下記の方法におけるタンパク質濃度が、再生時若しくは復元時に５００マイ クログラム／ｍｌを越えない。

通常の一方法においては、タンパク質を塩酸グアニジンのようなカオトロープの ６モル溶液に溶解し、この溶液を少なくとも６倍、好ましくは１０倍に希釈する 。希釈液はその後、一つの、好ましくは一連のカラムに通され、突然変異タンパ ク質が単離される。好適なカラムの例としては、少なくとも一つのイオン交換カ ラム、疎水相互作用カラム、そして／またはゲル濾過カラムが挙げられる。

代替的なプロトコールにおいては、突然変異タンパク質は、還元剤の不存在下で 、５０ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣＬ　ｐＨ８，５，１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ ｍＭのＥＤＴＡ等のバッファーに対して透析するか、これに希釈される。得られ る透析物は、引き続いてのカラム保持と除去のステップによって精製され、分画 される。いくつかの良く知られた透析、酸化及びカラム分画のプロトコールのい ずれをも用いることができる。例えば、”ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１８２−Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、アカデミツク・プレス、サン・デイ エゴ、１９９０”参照。

第一および第二のシスティン残基がそれぞれ他のアミノ酸残基と置換し、一方、 第三と第四のシスティン残基が保持されているＩＬ−６突然変異タンパク質の主 要な利点は、酸化工程において、分子内に形成されつるシスティン−システィン （シスチン）ジスルフィド結合はただひとつだけであることである。更に、分子 間のジスルフィド結合を形成するために利用できる残基が少ない。この、より選 択的な酸化ステップによって、本発明突然変異タンパク質の精製と単離が促進さ れる。

トランケーションとシスティンの除去の相乗作用Ｂｒａ、ｋｅｎｈｏｆｆは、Ｉ Ｌ−６のＮ−末端が除去された突然変異タンパク質（−２８ａａ　ＩＬ−６ＣＣ ＣＣ）は、親水性が増すために、発現のレベルが完全長のＩＬ−６よりも高いで あろうと示唆していた。Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９　４１１６−４１２１　（１９８７）参照。予期せずし て、天然のマチニアなＩＬ−６のＮ−末端の端部をトランケートし、一対のシス ティン残基、特に第一と第二のシスティン残基を他のアミノ酸で置き換えること の両方に優れた利点があることが見出された。例えば、融合タンパク質が形成さ れなくても、Ｅ、ｃｏｌｉにおいて発現すれば、驚くべき高収率（１０１５ｍｇ ／リットル）で−２２ａａ　ＩＬ−６ＫＸＣＣ−２２ａａ　、特に−２２ａａ　 ＩＬ−６５ＳＣＣが得られる。

トランケートされ、かつシスティンが減少した突然変異タンパク質の改善された 収率を示すために、以下の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列が調製さ れ、実施例１−５において基本的開示がなされている、発現ベクターｐｋｋ２３ ３−２　（ファルマシア）に挿入されたニー２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣＣ；　− ２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳ；−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ；　−２２ａａ　 ＩＬ−６ＣＣ３Ｓ；ＩＬ−６ＣＣＣＣ，ＩＬ−６５ＳＳＳ；　ＩＬ−６５ＳＣＣ ，及びＩＬ−６ＣＣ３Ｓ。

発現ベクターｐｋｋ２３３−２は実施例２に記載されている。

ＩＬ−６分子はＥ、ｃｏｌｉのＨＢｌ、０１株に発現され、６Ｍの尿素で可溶化 され、単離され、実施例１１Ａに従ってＥＬＩＳＡ法にて試験された。その結果 を表１と２に示す。

表１は、天然のＩＬ−６タンパク質（ＣＣＣＣ）と、一対または二対のシステイ ン残基がセリン残基によって置換されているＩ　Ｌ−６突然変異タンノ（り質（ ＳＳＳＳ、５ＳＣＣ，ＣＣ３５）のそれぞれからＮ−末端の２２のアミノ酸を除 去することが、修復レベルに及ぼす影響を示す。修復レベルは、転写、駐訳、安 定性因子等の影響を受ける。それぞれの完全長タン１（り買または突然変異タン ノくり質の修復レベルは、任意に値１を与えられ、対応するトランケートタン） ＜り質ないしトランケート突然変異タンパク質の相対的修復レベルが与えられる 。

この結果から、各トランケートタンパク質ないしトランケート突然変異タンノク ク質は、これらに対応する完全長タンパク質ないし突然変異タンノくり質よりも 約２−５０倍高いレベルで修復することがわかる。

表１ １Ｌ−６タンパク質／突然変異タンパク質　相対的修復レベル１ＣＣＣＣ２，４ ＳＳＳ５　１８．２ ＳＳＣＣ’　１０．６ ＣＣ３Ｓ　４６．５ １、トランケートタンパク質または突然変異タンノ（り質の完全長タンパク質ま たは突然変異タンパク質に対する発現の比。

２、本発明による完全長およびトランケート突然変異タン７＜り質。

これかられかるように、最大の効果が得られたのは、少なくとも一対のシスティ ン残基がセリン残基で置換された突然変異タン／（り質においてであった。

表２は、完全長またはトランケー）ＩＬ−６配列、ＩＬ−６ＣＣＣＣ及び−２２ ａａＩＬ−６ＣＣＣＣのそれぞれにおける、少なくとも一対のシスティン残基を セリン残基で置換することの相対修復レベルに及ぼす影響を示す。この上ヒ較に おいて、実施例１１八に記載の手順に従い、完全長及びトランケー）ＩＬ−６タ ンパク質について得られた修復レベルは任意に値１とした。表２のデータ部分の 最初の列は、完全長システィン・フリー（Ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｓ）と減システィン（Ｓ ＳＣＣおよびＣＣ３５）突然変異タンパク質の相対修復レベルは、それぞれの修 復レベルの、完全長天然ＩＬ−６（ＩＬ−６ＣＣＣＣ’）のそれに対する比であ る。同様に、表２のデ゛−タ部分の二番目の列は、トランケートシスティン・フ ’Ｊ　（ＳＳＳＳ）突然変異タンパク質及び減システィン（ＳＳＣＣ及びＣＣ３ ５）ＩＬ−６突然変異タンパク質の相対修復レベルを、それら個々の修復レベル の、トランケート天然ＩＬ−６（−２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣＣ）の修復レベル に対する比として示している。

表２のデータ列の最初の列について考察する。データかられかるように、一対ま たは二対のシスティン残基の置換は、修復レベルにおいて、完全長、天然のＩＬ −６の修復レベルに比べ、８−３４倍の増加となっている。

予期せずして、この効果は、Ｎ−末端の２２個のアミノ酸が除去されたとき増幅 される。表２のデータ中、二番目のカラムは、トランケート天然ＩＬ−６配列に おける、一対または二対のシスティン残基の置換は、修復レベルにおいて、１０ ０−１６０倍の増加をもたらしている。

表１からは、トランケートＩ　Ｌ−６タンパク（−２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣＣ ）は完全長ＩＬ−６タンパク（ＩＬ−６ＣＣＣＣ）と比べ、修復レベルにおいて ２．４倍の増加があることがわかる。この増加を考慮すると、トランケート・シ スティン・プリー（−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳ）及び減システィン（−２２ ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ及び−２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣ５５）ＩＬ−６突然変異 タンパク質の修復レベルは、天然完全長のＩＬ−６ＣＣＣＣのそれのおよそ２５ ０−４００倍であることが見込まれる。上述のように、−２２ａａ　ＩＬ−６５ ＳＣＣの修復レベルは、予期せずして完全長天然ＩＬ−６のそれより２５０−４ ００倍高い高活性を示している。

表２ Ｉ　Ｌ　−６Ｑ禽北列１の　トランケート配列２のＩＥ列　レベル　相対修復レ ベル ｃｃｃｃ　Ｌ、ｏ　ｔ ＳＳＳＳ　８．３　１６０ ＳＳＣＣ’　３３．５　１４７ ＣＣ３Ｓ　１４．４　１０９ １、システィン・フリー（ＳＳＳＳ）及び減システィン（ＳＳＣＣ及びＣＣ３５ ）完全長突然変異タンパク質の修復レベルの、天然完全長ＩＬ−６タンパク質（ ＣＣＣＣ）の修復レベルに対する比。

２、システィン・フリー（ＳＳＳＳ）及び減システィン（ＳＳＣＣ及びＣＣ３５ ）トランケート突然変異タンパク質の修復レベルの、天然トランケー）ＩＬ−６ タンパク質（ＣＣＣＣ）の修復レベルに対する比。

３、本発明の完全長トランケート突然変異タンパク質。

表１と２に記載した八つの異なるＩＬ−６分子の修復レベルはＰＢＳに希釈し、 透析を行うことによって再生された。表３は、再生ＩＬ−６の修復率を、６Ｍの 尿素で抽出した場合のレベルと比較して示す。

完全長天然のＩＬ−６ＣＣＣＣ分子も、完全長突然変異タンパク質ＩＬ−６ｓｓ ｃｃ分子も両方とも、はぼ同等に（それぞれ３５％及び４４％）再生されること がわかる。完全長システィン・フリー突然変異タンパク質ＩＬ−６ＳＳＳＳ及び 完全長城システィンＩＬ−６ＣＣ３Ｓのそれぞれ１３％及び１５％だけが正しく 再生される。これらの分子のトランケートされたものも同様の様子を示す。

−２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣＣ及び−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ）ランケート 突然変異タンパク質は６Ｍの尿素で抽出した場合のレベルに比べ、１９−２６％ の修復レベルであった。−２２ａａ　ＩＬ−６ＣＣ３Ｓ及び−２２ａａＩＬ−６ ＳＳＳＳの修復は、６Ｍの尿素で抽出した場合のレベルに比べ、はぼ５％の修復 レベルにすぎなかった。

表３ 変性された形態から再生したＩＬ−６の修復率配列　完全長配列１の修復率　ト ランケート配列２の修復率ＣＣＣＣ３５１９ ＳＳＳＳ　ｌ　５　５ ＳＳＣＣ’　４４　２６ ＣＣ３Ｓ　１３　６ １．６Ｍ尿素中の量に関する、完全長ＩＬ−６タンパク質と突然変異タンパク質 の、希釈と透析による修復率。

２．６Ｍ尿素中の量に関する、Ｎ−末端の２２個のアミノ酸を欠いた、トランケ −）ＩＬ−６タンパク質と突然変異タンパク質の、希釈と透析による修復率。

３、本発明の完全長トランケート突然変異タンパク質。

−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの予期しえぬ活性、修復レベル及び再生後の修復 レベルから、−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは本発明における好ましい突然変異 タンパク貢である。同様に優れた特性の組み合わせが、４−２８、好ましくは１ ２−２８さらに好ましくは２２−２８のトランケーションにおいて期待される。

加えて、完全長天然ＩＬ−６の位置４５と５１に対応する、トランケートＩＬ− ６突然変異タンパク質中のシスティン残基が二つのセリン残基以外のアミノ酸で 置換されるとき、同様に優れた特性の組み合わせが期待される。好ましくは、他 のアミノ酸残基は、中性アミノ酸、具体的にはアラニン、スレオニン、プロリン またはグリシンであり、より好ましくはアラニンである。

有用性 本発明のＩＬ−６突然変異タンパク質はインビトロ及びインビボにおける細胞調 整に有用である。例えば、ＩＬ−６突然変異タンパク質はＢ細胞、Ｔ細胞、巨核 球、全能造血始原細胞の増殖と分化を促進刺激する。巨核球の増殖の刺激は血小 板産生につながる。加えて、ＩＬ−６突然変異タンパク質は、肝細胞における種 々の急性期タンパク質を誘導する。

上述の生物学的活性から、ＩＬ−６突然変異タンパク質は免疫治療組成物や抗炎 症組成物として有用である。突然変異タンパク質は、血小板減少症の患者及び、 化学療法や骨髄移転を受けている患者の治療にも有用であろう。

実施例 実施例１．システィン・フ９−ＩＬ−６を含有する融合タンパク質を発現するプ ラスミドｐＢｇａ　ｌ／ＥＫ／ｃ　ｆ　Ｈ，−６図３に示されるプラスミドｐＢ ｇａ　ｌ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＩＬ−６は、ベーターガラクトシダーゼを含む融合タ ンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、これに、エンテロキナーゼ開裂部位が 続き、さらに合成ＩＬ−６ペプチド配列が直ぐに続く。

ｃｆｌＬ−６ペプチド配列は、マチニアな完全長のＩＬ−６分子の４５．５１゜ ７４．８４の位置の４つのシスティン残基がセリン残基によって置換され、最初 のアミノ酸残基（アラニン）が欠如しているという点を除き、天然ＩＬ−６と同 じである。即ち、−１ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳである。（本出願の目的のために 、マチニアなＩＬ−６分子は、Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏで始まるものと 定義される。）ｐＢｇａ　Ｉ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＩＬ−６においては、最初の４つ のＮ−末端アミノ酸を欠く、トランケー）’０．５８ｋｂシスティン・フリーＩ Ｌ−６配列は、Ｅｃｏ　ＲＩＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限位置によって囲まれて いる。

０．５８０ｋｂ　ＩＬ−６断片の配列を、図２に示す。

ｐＢｇａ　ｌ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＩＬ−６は、ＰＣＴ出１ｊ［Ｗｏ　９０１０６３ ７０に記載された方法によって調製される。

また、ｐＢｇａ　Ｉ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＩＬ−６は、米国メリーランド州ロックビ ルの＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ ＡＴＣＣ）に、１９８９年１１月３０日に寄託した。受託番号は、ΔＴＴＣ６８ １８７゜実施例２．非融合型の完全長ＩＬ−６をコードするベクター　ｐＫＫ２ ３３−２ｆＴＬ−６ ＰＣＴｌ際特許出願ＷＯ９０１０６３７０のセクション５．　１０．　２に記載 されているｐＢｇａ　ｌ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ｌ−６ベクター（図３）を酵素Ｅｃｏ ＲＩＩとＨｉｎｄＩＴＩを用いて分解する。そのベクターは、プラスミド２０ｕ ｇ当たり各酵素を２０単位使用し、以下のバッファーの中で、３７℃で２時間分 解される。（Ｔ’ｒｉｓ、’ＨＣＩ　５０ｍＭ（ｐＨ７，４）、ＭｇＣｌ。

６ｍＭ、ＫＣＩ　５’０ｍＭ５ＮａＣ１５０ｍＭ、及びジチオトレイトール（Ｄ ＴＴ）１ｍＭ）、電気溶離により０．５８０ｋｂのＥｃｏＲＴ　Ｉ／Ｈ４ｎｄＩ ＩＩ　Ｌ−６断片が単離される。以下、この断片を配列へと呼ぶ。配列へによっ てコードされたＩＬ−６は、完全長でマチニアなＩＬ−６の最初の４つのＮ−末 端アミノ酸１、Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｐｒｏのためのヌクレオチドを欠いて いる。さらに、天然ＩＬ−６の４つのシスティンの全てがセリン残基で置換され ている。即ち、−４ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳ　（シーケンス　ＩＤ　ＮＯ：３及 びシーケンス　ＩＤ　ＮＯ：４）。

発現ベクターｐＫＫ２３３−２はＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。ｐＫ Ｋ２３３−２の転写ユニットは、強力なｔｒｃプロモーター（Ｐｔ、ｃ）、１ａ ｃＺ’！Ｉボソ一ム結合部位、ＡＴＧ開始コドンにおけるユニークなＮｃｏ１部 位及び２つのｒＲＮＡ転写ターミネータを含んでいる。／ｕｎａ曲とＢｒｏｓｉ ｕｓ。

Ｇａｎｅ４０，１８３　（１９８５年）参照。

配列Ａを、ｐＫＫ２３３−２発現ベクターのポリリンカーに挿入する。このため 、ｐＫＫ２３３−２発現ベクター（２０ｕｇ）を、Ｔｒ　ｉ　ｓ、　ＨＣ１５０ ｍＭ（ｐＨ８，０）　、ＭｇＣ１１１０ｍＭ及びＮａＣｌ　１００ｍＭの存在下 、ＮｃｏｌとＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断する。約４．６Ｋｂのベクター断片が 単離され、以下、これを配列Ｂと言う。

配列へから欠落しているＩＬ−６の４つのアミノ酸を復元して最終物質にし、配 列へを配列已に結合するため、合成二重鎖オリゴヌクレオチド、配列Ｃを調製し た。オリゴヌクレオチドは、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩＩ重複部位を用いて調製され 、ＩＬ−６断片配列Ａとベクター断片配列Ｂとを組み立てる。オリゴヌクレオチ ドの配列Ｃは以下のとおりである： ＡＰＶＰ 配列Ｃのそれぞれの鎮ｌｕｇを、Ｔｒｉｓ、ＨＣＩ　５０ｍＭ（ｐＨ７，６）、 ＭｇＣ１ａ　１０ｍＭ％ＤＴ７　５ｍＭ、スペルミジン　０．１ｍＭ、及び？Ｅ ＤＴＡ　０．１ｍＭを含むバッファーの中で、１ｍＭのｒＡＴＰの存在下、１０ 〜２０単位のポリヌクレオチドキナーゼにより、３７℃で４５分間処理する。反 応混合液の容量は、２５ｕ１であった。１０μｌのアニーリングバッファー（Ｔ ｒｉｓ、ＨＣｌ　５０ｍＭ（ｐＨ７，８）とＭ　ｇ　Ｃ＋　２１０　ｒｎＭ）を ２５μｍのキナーゼ反応混合液に加え、１００℃で５分間加熱し、そして２５℃ まで徐冷する。

配列ＡＳＢ及びＣを連結するため、配列Ｂ及びＣのそれぞれ１ピコモル（ｐｍｏ 　ｌ　ｅ）を３ピコモルの配列へを用いて共析出する。連結は、Ｔｒｉｓ。

ＭＣＩ　２０ｍＭ（ｐＨ７，６）、ｒＡＴＰ　０．５ｍＭＳＭｇＣＩｚ　１０ｍ Ｍ。

ＤＴＴ　５ｍＭ、及びＴ４誘導リガーゼ　１ユニツトを含む２０ｕｌの反応混合 液中において、１６℃、１６時間で完了する。この連結反応溶混合液１０マイク ロリットルをコンピテント細胞ＨＢＩＯＩ及びＪＭＩｏ　１に加える。３７℃で １晩インキニベーシヨンを行った後、アンピシリン耐性コロニーを選択スる。こ のアンピシリン耐性クローンは、制限酵素分析、配列データ（Ｓａｎｇｅｒら、 １９７７年Ｐｒｏｃ、Ｎ＋ａｔ、Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ、、　７４：５４６ ３）及びＴＬ−６タンパクの発現により、ｒＬ−６遺伝子を持っていることが確 認されている。上記の手法によって得られるクローンはｐＫＫ２３３−２　ｃｆ ｌＬ−６と呼ばれる。図４参照。

Ｂｇａ　ｌ／ＥＫ／−ｃ　ｆ　ＩＬ−６ベクターをＴｒｉｓ、ＨＣｌ　５０ｍＭ （ｐＨ８，０）、ＭｇＣ１ｚ　１０ｍＭ、ＮａＣｌ　５０ｍＭを含むバッファー の中で、酵素Ｃ１ａ　ＩとＨｉｎｄｌｌＩを用いて分解する。上記のようにして ０．５２ｋｂのＩＬ−６断片が単離され、以下、この断片を配列りと呼ぶ。図３ 参照。この配列りの断片は、下記の配列Ｅに連結される時最初の２６個のアミノ 酸が除去されたＩＬ−６配列を作り出す。

配列Ｅと呼ばれる合成オリゴヌクレオチドは、ＮｃｏｌとＣ１ａ　Ｉの重複部位 とアミノ酸残基２３〜２６を復元する配列情報を用いて調製する。オリゴヌクレ オチドの配列Ｅは以下のとおりである：そのオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し 、上記実施例２で述べたようにアニールを行う。

ｐＫＫ２３３−２ベクターを、酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化さ せ、断片Ｆと呼ぶ大きい方の断片を単離する。配列ＤＳＥ及びＦの連結は、上記 実施例２で述べたように行う。断片の比率は、それぞれ３ピコモル：１ピコモル ：１ピコモルである。この連結によってえられるクローンを、ｐＫＫ−２２ａａ ｃｆｌＬ−６と呼ぶ。そのトランケートＩＬ−６の配列は、完全長システィン・ フリーＩＬ−６の２３番目のアミノ酸残基から始まる（Ｓ　ｅ　ｒ　Ｇ　１　ｕ Ａｒｇなど）。図５参照。

実施例４．アミノ末端の２２のアミノ酸を欠くシスティン・フリーＩＬ−６にお ける第３、第４システイン残基の復元−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣＰ　ｒ　ｏ ｍｅ　ｇ　ａ社から商業的に入手可能なインビトロの突然変異誘発手法、＝Ａｌ ｔｅｒｅｄ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ３ｙｓｔ ｅｍ″を使用し、ｐＫＫ−２２ａａ　ｃｆＩＬ−６のＴＬ−，６のコドン７４と ８４に対応する位置のセリン残基のためのコドンをシスティン残基のためのコド ンと置換する。ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ社から提供された説明書は、米国特許商 標子における本明細書から入手可能である。位置４５と５１のセリン残品のため のコドンは残存される。

その手法では、ｐＫＫ２３３−２　ｃｆＩＬ−６ベクターを、Ｔｒｉｓ。

ＨＣＩ　５０ｍＭ（ｐＨ８，０＞、ＭｇＣ１ａ　１０ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍＭ を含むバッファーの中で、酵素ＥｃｏＲＩを用いて分解する。配列Ｇと呼ぶ０． ７５ｋｂのＩＬ−６断片が単離される。そのＰｒｏｍｅｇａ社から提供されるｐ ｓｅｌｅｃｔベクターを、酵素ＥｃｏＲＩを用いて分解し、配列■（と呼ぶ５． ７ｋｂのベクターを単離する。３ピコモル＝１ピコモルの比率でＩＬ−６の断片 Ｇをｐｓｅｌｅｃｔベクターに連結する。テトラサイクリン耐性のクローンが選 択され、ｐＳｅ　１　ｅｃ　ｔ−ＩＬ−６と呼ばれるポジティブなＩＬ−６クロ ーンを、制限酵素解析によって確認し、ＩＬ−６の挿入が正しい方向で行われて いることを確認する。Ｐｒｏｍｅｇａ社の説明書に従って単鎖のｐＳｅｌｅｃｔ −ＩＬ−６ＤＮＡを調製する。配列■と呼ばれる、マチニアで天然ＩＬ−６の７ ４と８４に対応する位置のシスティンの為のコドンを含む合成オリゴヌクレオチ ドを調製する。オリゴヌクレオチドの配列Ｉは以下のとおりである：下線を施し たヌクレオチドは、マチニアな天然ＩＬ−６における位置７４と８４に対応する 位置の第３及び第４のシスティン残基をコードする。

Ｐｒｏｍｅｇａ社の手続きに従って突然変異誘発の処理が行われた。この突然変 異誘発で得られるクローンは、まずアンピシリンとテトラサイクリンの両プレー トを用いて選択する。ポジティブな薬物耐性クローンを直接配列することによっ て、そのクローンがシスティンを含んでいることを確認する。

両方のシスティンを含んでいると確認されたプラスミドは、Ｔｒｉｓ、ＨＣ１５ ０ｍＭ（ｐＨ８，０＞、ＭｇＣ１ｚ　１０ｍＭ、ＮａＣ１５０ｍＭを含むバッフ ァーの中で、酵素Ｃ１ａＩとＢｇｌｌｌを用いて分解する。得られた０、４３Ｋ ｂのｒＬ−６断片を単離する。ｐＫＫ−２２ａａ　ｃｆ　ＩＬ−６（実施例２及 び図４）をＣ１ａＩとＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉとによって分解した後単離された４、８ Ｋｂの断片１ピコモルにＩＬ−６断片３ピコモルを連結する。この連結反応液を コンピテント細胞ＨＢＩＯＩ及びＪＭＩＯＩに加える。アンピシリン耐性クロー ンを選択し、これらが、位置７４．８４にシスティンを持つＩＬ−６突然変異タ ンパク質をコードするＤＮＡを含んでいることを、配列分析、最終的にはＩＬ− ６タンパク質生成によって確認する。ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６ｓｓｃｃと呼 ばれるプラスミドを含むクローンは、これらのシスティン残基を含み、アミノ末 端の２２のアミノ酸を欠＜ＩＬ−６を、Ｅ、ｃｏｌｉ系ＨＢＩＯＩとＪＭＩ　Ｏ ｌ中で発現する。Ｎ−末端の２２のアミノ酸を欠き、完全長の天然ＩＬ−６のア ミノ酸４５．５１に対応する位置のセリン残基を含むＩＬ−６、即ち、−２２ａ ａ　ＩＬ−６ＳＳＣＣは、Ｅ、ｃｏｌｉ系ＨＢＩＯＩとＪＭＩ　Ｏ１においてイ ソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシドを用いて誘導することによっ て高い収率で発現した。

実施例４で得られたｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣクローンを酵素Ｃ１ａ ＩとＢｇｌ　ＩＩを用いて分解する。得られる０、４３Ｋｂ断片３ピコモルを、 ｐＫＫ２３３−２　ｃｆ　ＩＬ−６（実施例２及び図４）をＣ１ａ　ＩとＢｇＩ 　ＩＩとによって分解して得られる大きな断片１ピコモルに加える。ｐＫＫ２３ ３−２　ＩＬ−６５ＳＣＣと呼ばれる得られたプラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ系Ｈ ＢＩＯＩとＪＭＩ　Ｏ１において、第３及び第４のシスティン残基を含む完全長 のＩＬ−６を発現する。ＩＬ−６５ＳＣＣをコードするｐＫＫ２３３−２のＮｃ ｏｌ／Ｈｉｎｄ断片が図６に示されている。

Ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ社のｐＱｅｍ−１ベクターを変形し、元のＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ及びＥｃｏ　ＲＩ多クり−ニング部位間のＮｃｏＩとＫｐｎＩクローニング 部位だけを持たせる。これは、Ｅｃｏ　ＲＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩとの間にオリゴ ヌクレオチドを置くことによって達成される。このオリゴヌクレオチドの配列は 次の通りである： ３’　ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＴＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡ ＴＴＴＣＡＡＴＴＴ得られたベクターはｐＶ２と呼ばれる。発現を増強するため 、２つのシャインーダルガルノ　（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列及び、 一端の重複ＥｃｏＲＩ位置と他端の重複ＮｃｏＩ位置とを用いてオリゴヌクレオ チドを作る。

これらの重複端により、ｐＶｘにおける一つのＡＵＧ翻訳開始位置から直ぐ上流 にシャインーダルガルノ配列が挿入される。このオリゴヌクレオチドの配列は以 下のとおりである。

上記のオリゴヌクレオチドを持つ変形されたｖ２ベクターは、ｐ　Ｖ　ｓと呼ば れる。−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ断片は、ＣＩａＩ／ＨｉｎｄＩ１１部位で ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣクローン（実施例４）から単離される（天 然Ｉ　Ｌ−６の７４．８４に対応する位置にシスティン残基を持つことによって 変形された配列Ｄ）。そのＩＬ−６断片りとＥを、Ｎｃｏ　ＩとＨｉｎｄｌＩＩ によって分解されたｐｖｆｆベクターに結合する；図５と実施例３参照。この連 結から得られるアンピシリン耐性クローンは［）Ｖｓ　−２２ａａＩＬ−６５Ｓ ＣＣと呼ばれ、Ｅ、ｃｏｌｉ系ＢＬ２１　（＝、−ヨーク州リサーチ・ファウン デーション及びブルックヘブン・ラボラトリーズ）の中で発現する。

ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ社から入手可能なりＬ２１、ＪＭ１０９　（ＤＥ３）の 誘導体も好適である。実施例６で得られる一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは、実 施例８と同様に可溶化し、実施例９Ａ、ＩＩＢまたはＩＩＣの方法で精製する。

実施例？、ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを含むＥ、ｃｏｌｉ系ＨＢ１０ １の成長 ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを含むＨＢＩＯＩ細胞の培養物１リツトル の凍結ストックから始める。培養物をＬＢ培地中において３７°Ｃで一装置く。

Ｍ９培地を含む１０リツトルの醗酵槽に１晩培養した培養物を接種する。その培 養液が５９５ｎｍ（約１０’　ＣＦＵ／ｍｌ）で吸光度０．　５に達した時、イ ソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭで誘 導する。４時間の誘導後、細胞を収穫する。最終的な湿重量での収率は、１リツ トル当たり細胞ペースト約１０ｇである。

実施例８．ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを単離するための細菌溶解物の 調製 実施例６または７で得られた細胞ペーストを、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　２０ｍＭ（ｐ Ｈ８，０）　、ＮａＣｌ　５０ｍＭ５ＥＤＴＡ　１０ｍＭ、フェニルメチルスル フォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）　（ＴＮＥバッファー）０．１ｍＭに再９渇 するとともに、リゾチームを用いて氷冷下１５分間インキュベートすることによ り、ｐＶ３−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣまたはｐＫＫ−２２Ａａａ　ＩＬ−６ ＳＳＣＣからりコンビナンド細胞溶解物を調製する。リゾチームによるインキ二 一ベションに続き、その懸濁液に水冷下で音波処理を行い、５０００Ｘｇで３０ 分遠心分離を行う。得られたペレットは、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むＴＮ Ｅバッファーで２回洗浄する。上清を除去する。−２２ａａｌＬ−６５ｓｃｃの 細胞封入体を含むペレットを、塩酸グアニジン６Ｍ、ＥＤＴＡｌｍＭ、Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ　５０ｍＭ（ｐＨ８，５）を含む溶液に懸濁する。−２２ａａ　［、− ６５ＳＣＣの存在は、ＥＬＩＳＡによって確認された。

実施例９Ａ、−２２ａａ　［Ｌ−６５ＳＣＣの精製実施例８で得られた可溶化さ れた一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ抽出物を、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　２０ｍＭ　ｐ Ｈ（８，５）、ＮａＣ１１００ｍ３ＥＤＴＡ　１ｍＭに対して透析することによ り再生し、得られた不溶物を遠心分離によって除去する。その透析抽出物を、硫 酸アンモニウムによって４５％の飽和状態に調製し、４℃で２時間、析出させる 。−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは、可溶化分画中に残り、Ｅ、ｃｏｌｉ不純物 の大部分は沈澱して、遠心分離によって除去される。

一２２ａａ　ＩＬ−６３ＳＣＣ分子の最初の特性同定のため、再生された抽出物 を逆相クロマトグラフィーで精製する。そのサンプルを、ＶｙｄａｃＣ＋ｓカラ ムに通し、１０％〜９０％ＣＨ３ＣＮ１０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０の線形勾配で溶 出する。精製された一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを含む２つのサンプル（Ｒ４ ２８及びＲ４２９）を、Ｂ９及び５ＫＷ６．４アツセイにおいて生物学的活性に ついて試験する。実施例１２参照。

実施例９Ｂ、ｐＫＫ　−２２ａａ　ＩＬ−６ＡＡＣＣの調製実施例４で記載した ように、ｐｒｏｍｅｇａ社から商業的に入手できるインビトロ突然変異誘発手法 によって、ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣクローンの位置４５．５１のセ リン残基のためのコドンをアラニン残基で置換した。その手法では、ｐＫＫ−２ ２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを、酢酸カリウム５０ｍＭ、Ｔｒ　ｉ　ｓ−アセテー ト（ｐＨ７，９＞　２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ及びＤＴＴ　１ｍＭを 含むバッファーの中で、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＣ１ａｌを用いて分解させる 。０．５２ｋｂのＩＬ−６断片が単離される。ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ社から提 供されるテトラサイクリン耐性ｐ３ｅ　ｌ　ｅｃ　ｔベクターを、上記したバッ ファー中で、酵素Ｃ１ａ　ＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩを用いて分解し、５．３ｋｂの ｐｓｅｌｅｃｔベクター断片を単離する。３ピコモル：１　′ピコモルの比率で ０．５２ｋｂ　のＩＬ−６の断片を５，３ｋｂのｐｓｅｌｅｃｔベクター断片に 結合する。テトラサイクリン耐性のクローンが選択され、ｐｓｅｌｅｃｔ−ＩＬ −６（Ｃ１ａ／Ｈｉｎｄ）と呼ばれるｐｓｅｌｅｃｔ　ＩＬ−６クローンを、制 限酵素解析によって確認する。

Ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ社の説明書に従って単鎖のｐｓｅｌｅｃｔ−ＩＬ−６（ Ｃ１ａ／Ｈｉｎｄ）を調製する。位置４５と５１のアラニンのためのコドンを含 む合成オリゴヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレオチドの配列は以下のとふ りである：Ｐｒｏｍｅｇａ社の手法に従って突然変異誘発処理を行った。１つの 突然変異誘発からのクローンは、まず、アンピシリンとテトラサイクリンの両プ レートを用いて選択する。ポジティブな薬物耐性クローンを直接配列することに よって、そのクローンがアラニンを含んでいることを確認する。

両方のアラニンを含んでいると確認されたｐｓｅｌｅｃｔ　ＩＬ−６プラスミド は、上記のようにして、酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩとＣ１ａｌを用いて分解する。

ＩＬ−６をコードする０、５２ｋｂの断片を単離する。ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ −６Ｓ　Ｓ　ＣＣベクターをＣ１ａＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩによって分解し、４． ６ｋｂの断片を単離する。３ピコモルの０．５２ｋｂのＩＬ−６断片を４．６ｋ ｂのｐｋｋ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ断片に連結し、ｐＫＫ−２２ａａ　Ｉ Ｌ−６ＡＡＣＣを形成する。アンピシリン耐性クローンを選択し、これが、位置 ４５．５１にアラニンを持つＩ　Ｌ　−６突然変異タンパク質をコードするＤＮ Ａを含んでいることが、配列分析、最終的にはＩＬ−６タンパク質生成によって 確認される。−２２ａａ　ＩＬ−６ＡＡＣＣは、実施例６〜８に記載された方法 によって発現され、実施例９Ａ、ＩＩＢまたはＩＩＣに記載された方法によって 精製される。

実施例１０．−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ（７）大規模精製のため（ＤＨＰＬ Ｃａ、実施例９Ａから得られた硫酸アンモニウムがらの析出物を、（ＮＨ４）２ ｓｏ４　ｉ、７Ｍ５Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　２０ｍＭによって平衡 化したフェニール−セファロース疎水相互作用カラムに通す。カラムをＴｒｉｓ −ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　２０ｍＭの線形勾配を用いて溶出し、−２２ａａ　 ＴＬ−６５ＳＣＣを含む分画を収集する（図７）。

ｂ、フェニール−セファロースを通した収集物をＧ−２５カラム上で脱塩し、Ｔ ｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ８，０）２０ｍＭによって平衡化したＱ−セファロース カラムにかける。ＮａＣ１５００ｍＭの線形勾配を用いて溶出し、−２２ａａＩ Ｌ−６５ＳＣＣを含む分画を収集する（図８）。

ｃ、　Ｑ−セファロースを通した収集物を、酢酸ナトリウム　２０ｍＭによって 平衡化したＣＭ−セファロース　イオン交換カラムにかける。カラムを酢酸ナト リウム　５００ｍＭ（７）線形勾配を用いて溶出し、−２２ａａ　ＴＬ−６ＳＳ ＣＣを含む分画を収集する（図９）。

実施例１１．精製さｆＬｆ＝−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ（７）特性同定実施 例８〜ｌＯにおいては、−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣが、細胞溶解後において ９５％より高いヒ）ＩＬ−６活性が不溶分画に残留している細胞封入体として産 生される。その突然変異タンパク質は、カオトロープ　グアニジン−塩酸によっ て可溶化し、カオトロープの除去によって再生する。還元条件下での５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥによる細胞溶解は、ウェスタン・プロット内のモノクローナル抗ｈｌＬ− ６によって検出されるが、コントロールの溶解物では検出されない単一の１８ｋ ｂバンドの出現を示した。−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの等電点電気泳動法に よって測定されたｐ＋は〜６．７である。

上記した方法によって精製された一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ、ウェスタン・プロット、及びＮ−末端配列分析によって、９５％をこえ る純度であると測定された。配列分析の結果、最初の１３のアミノ酸は、予測さ れた配列と同じであること、及び、精製された一２２ａａＩＬ−６ｓｓｃｃ種の １０％未満のものが、Ｎ−末端メチオニン残基を含んでいることが示されている 。さらに、アミノ酸分析の結果、その突然変異タンパク質−２２ａａＩＬ−６分 子は、２つのシスティン残基を含むことが確認されている。

実施例１１Ａ９回収レベル比較のためのＩＬ−６分子の生産、分離、同定。表１ 発現ベクターｐｋｋ２３３−２（実施例１〜５参照）内の、異なった完全長を持 つか、または切断され、システィンを含むか、システィンを含まないか、または システィンが少ないＩＬ−６分子をコードするＤＮＡを含むＥ、ｃｏｌｉ系ＨＢ １０１の５０ｍ１の各培養物を、カサミノ酸とチアミンを添加したＭ９培地内で 、３７℃で振とう培養した。吸光率が、６００ｎｒｒＨで０．４の時、その培養 物を、１ｍＭのイソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ ）を用い４時間誘導した。細胞を３００　Ｏｒ　ｐｍで収穫し、沈殿物を、ＰＭ ＳＦを１ｍＭ含有する１ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　５０ｍＭの 中で再懸濁した。最終濃度７５ｕｇ／ｍｌで細胞にリゾチームを添加し、水冷下 １５分間放置した。膵［ＤＮＡ５ｅとＭｇＣ１ｚを最終濃度がそれぞれ７５％ｇ ／ｍｌ。

６５ｍＭとなるまで添加した。さらに、３７℃で４５分間インキュベーションを 続けた。固形尿素を加え、短時間音波処理することにより、全細胞抽出物を６Ｍ 尿素まで引き上げた。混合物を１３．０００ｒｐｍで遠心分離し、可溶化された タンパク質を含む上清を回収した。残渣沈殿物からはＩＬ−６が検出されなかっ 再生を促進するため、６Ｍ尿素可溶化タンパク質溶液を、１ｍＭのＤＴＴを含む リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって直ちにＩＭに希釈し、そして透析バ ッファーを３回（各１リツトル）交換して、常温で一晩ＰＢＳ／ＤＴＴに対して 透析を行った。タンパク質溶液は、１０，０００ｒｐｍの遠心分離により浄化し 、Ｂｊｏ−Ｒａｄプロティン・アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、リッチモンド、カル フォルニア州）によって上溝内のタンパク質の濃度を測定した。

ＩＬ−６の同定： 全細胞抽出物と再生されたタンパク質を、ファンチキン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ）ＩＬ−６アツセイキツト（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ 州）を使用し、ＥＬＩＳＡにて試験した。簡単に述べると、マイクロタイター・ プレート上に被覆されたＩＬ−６に対して特異的なモノクローナル抗体を使用し て、各サンプルに含有されるＩＬ−６を捕獲した。洗浄後、ＩＬ−６に対しての 特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を添加し、ＩＬ−６との結合を検出できる ようにした。サンプルの光学密度値を（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ社のマ イクロタイター・プレート読取器を用いて）記録し、ＩＬ−６８準カーブ（１０ 〜２０００　ｐｇ／ｍｌ）の値と比較した。

実施例１’ｌＢ、ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの他の精製プロセスと特 性口！ ａ、他の精製プロセスの流れ図が図９に示されている。簡単に述べると、実施例 ６または７で得られたそれぞれの細胞ペーストを、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８， ０）２０ｍＭ、ＮａＣ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ　１０ｍＭ、ＰＭＳＦ（ＴＮＥバッ ファー）０．１ｍＭに再懸濁し、４℃で３０分、リゾチームを用いてインキュベ ートすることにより、リコンビナント細胞溶解産物ｐＶ３−２２ａａ　ＩＬ−６ ５ＳＣＣまたはｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを調製する。リゾチームを 用いたインキュベーションの後、懸濁液を氷冷下でホモジナイズし、５０００Ｘ ｇで３０分間遠心分離する。得られる沈殿物を、０．　５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００を含むＴＮＥバッファーにて２回洗浄し、上清を捨てる。−２２ａａ　Ｉ Ｌ−６５ＳＣＣ細胞封入体を、塩酸グアニジン　６Ｍ。

ＥＤＴＡ　１ｍＭとＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）　５０ｍＭの中に 再懸濁し、室温で２時間インキュベートする。その抽出物を、１０．０００Ｘｇ にて６０分遠心分離することにより浄化する。

ｂ、　可溶化された一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ抽出物は、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 　（ｐＨ８，５）２０ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍ１％ＥＤＴＡ　１ｍＭにでて希釈 し、４℃で２０〜２４時間、ゆっくり混合するすることにより再生する。

希釈された抽出物を、固形硫酸アンモニウムを用いて４５％飽和に調整し、４℃ で２時間、不純物を沈澱させる。抽出物は、０．４５ｕの阻止膜による接線流微 小穴濾過によって浄化しクロマトグラグラフィーにかける。

Ｃ６浄化された抽出物を、（ＮＨ，）２　ＳＯｓ　ｔ、８Ｍ、リン酸ナトリウム （ｐＨ７，０）　２０ｍＭによって平衡化したフェニール−セファロース高速流 カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通す。サンプルは、毎時１５０ｃｍの流速で通 し、リン酸す）　ＩＪウム（ｐＨ７，０）２０ｍＭの線形勾配を用い、毎時９５ ｃｍで溶出させる。

ｄ、このフェニール−セファロースのプールは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ ｅｘ）Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）上で脱塩し、クエン酸塩−リ ン酸塩（ｐＨ６，０）２０ｍＭによって平衡化したＳ−セファロース高速流カラ ムに通す。そのサンプルは、毎時２００　ａｍの流速で通し、ＮａＣｌ　５００ ｍＭをクエン酸塩−リン酸塩に溶解した、ｐＨ６，０の複合勾配を用い、毎時１ ２０ｃｍで溶出させる。

ｅ、このＳ−ファロースＦＦのプールを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４ ）によって前もって平衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−１００ＨＲ カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）に通す。溶出は毎時２４ｃｍの流速で行い、 ＩＬ−６のファンクションをプールし、無菌濾過し、後での使用のために凍結す る。

上記の精製過程は、５ＤＳ−ＰＡＧＥとＨＰＬＣ分析によって測定されるように 、活性のある一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを９５％より高い純度で提供する。

このプロセスから得られるＩＬ−６の最終的な収率は、２５〜４０％であり、よ り大規模なプロセスではより高い収率となる。

実施例１１Ｃ，−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの大規模精製実施例６または７で 得られたＥ、ｃｏｌｉ細胞ペーストを、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　２０ ｍＭ、ＮａＣｌ　５０ｍＭ、ＥＤＴＡ　１０ｍＭ、ＰＭＳＦ　（ＴＮＥバッフｙ ）０．１ｍＭに再懸濁し、４℃で３０分、リゾチームを用いてインキュベートす ることにより、リコンビナント細胞溶解産物−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを調 製する。リゾチームを用いたインキュベーションの後、懸濁液を水冷下でホモジ ナイズし、５０００Ｘｇで３０分間遠心分離する。

得られる沈殿物を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むＴＮＥバッファー を用いた遠心分離で２回洗浄し、上清を捨てる。−２２ａａ　ＩＬ−６ＳＳＣＣ 細胞封入体を含む沈殿物を、グアニジン−塩酸　６Ｍ５ＥＤＴＡ　１ｍＭとＴｒ ｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）５０ｍＭの中に再懸濁する。その再懸濁された沈 殿物を、４℃で１８〜２０時間攪拌し、１０，００００Ｘｇにて６０分遠心分離 することにより浄化する。

可溶化された一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは、Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ ８，５）　２０ｍＭ５ＮａＣＩ　１００ｍ１ＳＥＤＴＡ　１ｍＭ％ＰＭＳＦ０． １ｍＭで希釈して再生する。必要であれば、２ＭのＴｒｉｓによりｐＨを調整し 、４℃で２０〜２４時間、ゆっくり混合する。再生された抽出物は、ｌｕｍのフ ィルターを用いた濾過によって浄化し、１０ｋｄ阻止膜による接線流超濾過（Ｐ ｅｌｌｉｃｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　（ｐＨ８，５）２０ｍＭにおいて脱塩する。再生された抽出物の導電率は、 クロマトグラフィーの前で３．０ｍＳ／ａｍ未満である。

脱塩された抽出物を、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）　２０ｍＭによって平 衡化したＳ−セファロース高速流カラム（５ｃｍＸ１０ｃｍ；Ｐｈ　ａ　ｒｍａ 　ｃ　ｉ　ａ）に通す。Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）２０ｍＭとＮａＣ１ ５００ｍＭの多段勾配を用い、毎分３４ｍ１の流速で溶離する。

−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを含有する分画をプールし、硫酸アンモニウム１ ．８Ｍに調整する。

このＳ−７７０−スのプールを、Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）　２０ ｍＭ。

硫酸アンモニウム１．８Ｍによって平衡化したフェニル−セファロースＨＰカラ ム（２，６ｃｍＸ１０ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通す。Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（ ｐＨ８，５）２０ｍＭの複合勾配を用い毎分８ｍｌで溶離する。

その９５％より高い純度の一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣを含むフェニル−セフ ァロース分画をプールし、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）　、５％マンニ トールを用い、１ｍｌ当たり２５０ｕｇの一２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣとなる ように調整する。得られた材料を無菌濾過し、１ｍｌの分割量をガラス血清小瓶 に分配し、凍結乾燥する。凍結乾燥された小瓶を一２０℃で貯蔵する。

実施例１２．ＩＬ−６の生物学的検定 ＩＬ−６とＩＬ−６突然変異タンパク質の存在を調べるために２つの標準的な生 物学的検定を行う。これらは、マウスのハイブリドーマ細胞系（Ｂ−９）を必要 とするＩＬ−６の増殖と、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系（ＳＫＷ６．４）における ＩｇＭ産生のＩＬ−６刺激であるＨＨｅｉｌｅら、　Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８．１５３５　（１９８８年）及び５ａｉｋｉら、　Ｅｕｒ 、Ｊ。

ッセイにおいて、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（ＢＭ）から入手 可能な細菌由来１−６と、ＷＯ９０１０６３７０に記載されている完全長システ ィン・フリーＩＬ−６（ＩＬ−６５ＳＳＳ）が標準として使用される。

−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣの２つのサンプルであるＲ−４２８とＲ−４２９ の活性を調べ、標準と比較する。Ｒ−４２８とＲ−４２９は、クローンｐＫＫ− ２２ＩＬ−６５ＳＣＣ（実施例９Ａ）の逆相ランから得られる精製されたサンプ ルである。

８９了ツセイにおいては、サンプルを２．５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９Ｇ穴 プレートで連続的に希釈する。２０００個のＢ９細胞を各ウェルに加え、３７℃ で３日間インキュベートする。細胞は、１ウエル当たり２ｕＣｉのトリチウム標 識チミジンを用い１８時間パルス処理を行い、ガラス繊維フィルター上に収穫し 、計数する。その結果を図１０に示す。

５ＫＷ６．４アツセイにおいては、サンプルを５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９ ６穴プレートで連続的に希釈する。５０００個の５ＫＷ６．４細胞を各ウェルに 加え、４日間インキュベートする。サンドイッチＥＬＩ　ＳＡ法によってＩｇＭ の産生を測定する。ポリクローナルヤギ抗ヒト抗体で９６穴イムロン・プレート をコートする。細胞上清の分割量を１％ＢＳＡで１＝１に希釈し、３７°Ｃで１ 時間インキュベートする。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩ ｇとＴＭＢとを用いてＩｇＭ産生を測定する。その結果を図１１に示す。

両方のアッセイの結果は、Ｒ−４２８とＲ−４２９は、少なくともＢｏｅｒｈｉ ｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍのＩＬ−６と比較して、同等以上の活性を示す。

び−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣ融合ベクターａ、−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣ Ｃはまた、上記した方法と類似の方法により、融合タンパク質として発現し得る 。融合タンパク質は、Ｎ一端末にｔｒｐＥ遺伝子の生産物である、アントラニル 酸シンターゼを含んでおり、これに酵素的開裂部位が続き、この直後に一２２ａ ａ　ＩＬ−６５ＳＣＣが続く。その融合タンパク質は、新しいりコンビナンド・ プラスミドｐｔｒｐＥ／Ｘａ／−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣによって発現され る。このプラスミドを調製するためには、ＰＣＴ出願ＷＯ９０１０６３７０のセ クション５．　１０．　１．に記載されたｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＩＬ６ベ クターを、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）２０ｍＭ、ＭｇＣ１，５ｍＭ及び ＫＣｌ　５０ｍＭのバッファー中で、Ｋｐｎ　Ｉによって分解する。ｐＴｒｐＥ ／ＥＫ／ｃ　ｆ　ＴＬ−６は、米国メリーランド州ロックビルの＾ｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に、１９ ８９年１１月１７日に寄託したく受託番号は、ＡＴＴＣ６８１８０）。

Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｋｐｎ　Ｉ断片の配列を図１２に示す。２時間後、Ｎａ Ｃ１５０ｍ１をＨｉｎｄ　ＩＩＩとともに加える。そのベクターは、プラスミド ２０μｇ当たり２０ユニツトの量の各酵素を用いて、３７°Ｃで２時間分解され る。

電気溶出によって大きな３．７Ｋｂ断片を単離し、これを配列Ｊと呼ぶ。あるい は、ｐＡＴＨ２３発現ベクターを使うこともでき、上記と同じ酵素によって分解 される。ＤｉｅｃｋｍａｎｎとＴｚａｇｏｌｏｆ　ｆ、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ。

主見立、１５１３〜１５２０　（１９８５年）に記載されたｐＡＴＨ２３は、Ｈ ｉｎｄＩＩＩ部位を含むポリリンカーに隣接し、３°端のリーディング・フレー ム内のｔｒｐＥ（アントラニル酸シンターゼ成分Ｉ）のアミノ末端３３７のアミ ノ酸をコードする遺伝子を含むアンピシリン耐性プラスミドである。ｔｒｐＥオ ペロンの一般的な記述は、ＭｉｌｌｅｒとＲｅｚｎｉｋｏｆｆ編、ＴｈｅＯｐｅ ｒｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

２６３−３０２ページ（１９７８年）に見出されるであろう。ｔｒｐＥと１ａｃ Ｚの全てまたは一部をコードするＤＮＡの他の原料は、容易に人手できる。

そのような他の原料は、例えば、ｐｏｕｗｅｌｓら、ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏ ｒｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

１９８５年に記載されている。好ましいｔｒｐＥ配列は、Ｐｏｕｗｅｌｓらのマ ニュアルに記載されている下記の認識コードを持つプラスミドから単離される： Ｉ−Δ−ｉ　ｉ　−３（ｐＤＦ４１と４２）　、Ｉ　−Ａ−ｉ　ｖ−２３（ｐＲ Ｋ３５３）、Ｉ−Ｂ−目−４（ｐＭＢＬ２４）　、Ｉ　−Ｂ−ｉ　ｉ　−１（ｐ ｔｒｐＥＤ−５−１）　、Ｉ−Ｄ−ｉ−３（ｐＥＰ７０−ｐＥＰ７５）及びＩ　 −Ｄ−ｉ　−４（ｐＥＰｌ　６５−ｐＥＰ　１６８）。

ｂ、ｐＫＫ−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣは、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４ ）　２０ｍＭ、ＭｇＣ１ａ　５ｍＭ、ＫＣｌ　５０ｍＭのノイツファー中１ごお いて酵素Ｃ１ａＩと）（ｐｎ　Ｉとにより分解し、０．４９Ｋｂ断片を電気溶離 によって分離する。配列にと呼ばれるこの断片は、天然のマチニアなタンパク質 の２６番目のアミノ酸から始まり、ＩＬ−６の天然メチオニン　カルボキシ−末 端アミノ酸まで連続するＩＬ−６断片をコードする。この断片を下記のオリコ゛ ヌクレチオドに結合すると、ＩＬ−６の２３．２４．２５番目のアミノ酸が、こ の断片のすぐ上流にコードされ、２３番目のアミノ酸のすぐ上流にＸａ開裂部位 がコードされる。

Ｃ９重複するＨｉｎｄｌＩＩとＣｌａｌ位置を含み、ＩＬ−６の２３．２４．２ ５番目のアミノ酸（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、、、）へと続いているＸａ開裂部 位（Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ＞を含むアミノ酸の配列をコードする合 成オリゴヌクレチオドを調製する。

そのオリゴヌクレチオドの配列は下記のとおりである：５′八Ｇ［：ＴＴＧＡＴ ＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣ３′　＾ＣＴ八ＧへＣＣＧ ＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴ［：ＧへＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣＣＧ ＡＡＣＧＴへＴ３’ＴＡＧＣＴＴＣＣ八ＧＣ八ＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴＡＧＣ５’ ｄ、上記のオリゴヌクレチオド（１ピコモル）を、配列Ｊの１ピコモルと配列に の３１ピコモルに連結する。連結反応混合物１０ｕｌをコンピテント旦ｌＣｏ１ １ＨＢ１０１細胞に形質転換する。この連結によって得られるａｍｐ”クローン は、ｐＴｒｐＥ　Ｘａ　−２２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣと呼ばれ、７ｒｐｅ遺伝 子を含んでいる。このＴｒｐｅ遺伝子の後ろにファクターＸａの開裂部位が続き 、ＩＬ−６の２３番目のアミノ酸がすぐに続いている（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ　Ａｒｇ 、、、）ｏ　３−ベーターインドールアクリル酸（ＩＡＡ）の誘導に続き、ＨＢ ＩＯＩ細胞は、Ｎ−末端の２２のアミノ酸残基を欠き、完全長の天然ＩＬ−６の アミノ酸残基４５と５１に対応する位置にセリン残基を含むＩＬ−６突然変異タ ンパク質を発現する。そのＴｒｐＥ／Ｘａ／−２２ａａ　ＩＬ−６ｓｓｃｃ突然 変異突然変異式ク質は、ファクターＸａで開裂し、実施例１３Ａ、他のＩＬ−６ 突然変異タンパク貢実施例１〜１３のプロトコールに従い、せいぜい僅かな変更 を加えるだけで、以下の様な本発明の範囲の、付加的な突然変異タン７　ｓｊり 質が調製される：ＩＬ−６ＡＡＣＣ，−ＡＳＣＣ，−５ＡＣＣ，−ＧＧＣＣ，− ３ＧＣＣ，−ＧＳＣＣ。

−ＤＲＣＣ，−ＲＤＣＣｌ−ＴＴＣＣｌ−ＡＴＣＣ，−ＴＳＣＣ，−ＰＰＣＣ１ −ＰＧＣＣ。

マチニアで天然のＩＬ−６の配列が変化した、上記以外のＩＬ−６突然変異タン パク質の変種を、この実施例に記載されている物質を開始物質とし、公知の方法 によって調製する。ＤＮＡは、商業的に入手可能なキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ 　Ｋｉｔ；Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　 オハイオ州、クリーブランド）を用い、鎮成長停止反応法によってシーケンシン グされる。ＤＮＡ！作は全て標準的な手続きに従って実行される。

１つの例では、マチニアで天然のＩＬ−６の最初の２つのアミノ酸ＡｌａＰｒｏ をＭｅｔＧｌｙによって置換する。このような手続きは、ＴＬ−６の変種をコー ドするＤＮＡ配列を含む２つのプラスミドを準備することから始まる。両方のＤ ＮＡ配列は、ＡｌａＰｒｏの代わりに、最初の２つのアミノ酸残基としてＭｅｔ Ｇｌｙを含む変種をコードする。１つのＤＮＡ配列は、マチニアで天然のＩＬ− ６の位置４５．５１．７４及び８４に対応する位置のシスティン残基をコードす る。この変種は、ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣＣと呼ばれる。もう １つのＤＮＡ配列は、これらの位置のそれぞれにセリン残基を含む。この変種は 、ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳと呼ばれる。セリンまたはシステ ィンを含むＩＬ−６の変種のための好ましいプラスミドは、それぞれｐ３６５と ｐ４６９である。

ｐ３６５の＆ｌＩ！ｌｌ１ｌについては、Ｊａｍｂｏｕら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　 ｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．９４２６−９４３０　（１９８８年）に記載されている 。

簡単に述べると、最初の２つのアミノ酸のＡｌａＰｒｏがＭｅｔＧｌｙに置換さ れ、４つのネイティブなシスティン残基の全てがセリン残基によって置換された ＩＬ−６の変種をコードするＤＮＡ配列は、２２の合成オリゴヌクレオチドから 構築され、まず変形されたｐＢｓＭ１３＋クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａ ’ｇｅｎｅ、カルフォルニア州ロサンゼルス　ジョラ）にクローン化する。自然 遺伝子の停止コドンは、合成オリゴヌクレオチドでカセット式変異誘発によりセ リンコドンに変換され、プラスミドｐ３６５を生産する。

ｐ３６５のＩＬ−６変種遺伝子は、Ｊ　ａｍｂ　ｏ　ｕら（同上）によって以前 に記載されたように発現ベクターｐ３４０にサブクローン化する。そのｐ３４０ ベクターは、Ｇｅｒｍｉｎｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ■、４６９２　（１９８４年）に記載された発現ヘク９−ｐＪＧ２００（７） λＰ。

プロモータを、ｐＫＫ２３３−２のＰ−ｔｒｃプロモータ（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　 ｃ　ｉ　ａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎＣ，、ニューシャーシー 州ビスカタウエー）と置換することによって構築される。Ｐ−ｔｒｃプロモータ のすぐ下流のＮｃｏ１部位に合成ミニシストロンを挿入する。開始メチオニンか ら始まり、変種ＩＬ−６遺伝子の開始メチオニンまで延びているこのミニシスト ロンは、５゜−ＡＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣ ＡＴＧ−３゜である。システィン含有ＩＬ−６変種ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　Ｉ Ｌ−６ｃｃｃｃをコードする遺伝子は、ｐ３６５内のセリン含有変種ＭｅｔＧｌ ｙ−２ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳのＥｃｏＲＶから５ｔｕｌの断片を、６個の合成 オリゴヌクレオチドによって構成される断片によって置換することによって構築 する。この断片は、天然ＩＬ−６の４つのシスティンコドンに対応するコドンが 、セリンコドンから５”　−３“方向に野性タイプのシスティンコドン、ＴＧＣ ｌＴＧＣ，ＴＧＴ及びＴＧＴへと戻るように変えられることを除き、もとのＥｃ ｏＲＶから５ｔｕｌの断片と同一である。配列の確認後、得られたプラスミドル ４６３内のシスティン含有ＩＬ−６変種ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ｃｃ ｃｃをコードするＤＮＡを除去し、ｐ３４０発現ベクターに挿入してプラスミド ｐ４７８を作る。

システィンコドンのそれぞれの対がセリンコドンの対で置換された遺伝子を、Ｊ ｏｎｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ　８．１７８−１８３　（１９９０年）に 記載されているリコンビナント環複製連鎖反応法によって構築する。

ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６５ＳＳＳとＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ− ６ＣＣＣＣをそれぞれコードする遺伝子を含むプラスミドｐ３６５とｐ４６９を この手続きで使用する。

プラスミドｐ３６５は前述した。ｐ４６９の構築は、ｐ３３４に類似の合成オリ ゴヌクレオチドからの断片を組み立てることによって行われる。Ｊａｍｂｏｕら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．９４２６（１９８８ 年）参照。これを変形したｐＢＳベクターへクローン化し、ｐ４６３を生成する 。ｐ４６３からの断片を使用し、ｐ３６５中の類似の断片（ＲＶ−３ｔｕ）を置 換する。遺伝子が野性タイプのシスティンをコードすることを除いて、ｐ３６５ ど類似のこの得られたベクターは、ｐ４６９と呼ばれる。このベクターの遺伝子 を発現ベクターにクローン化し、Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら、Ｊ。

Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、２６６．２３０９７−２３１０２　（１９９１年）にお いてＳｎｏｕｗａｅｒｔらが述べているように、ｐ４６９とｐ３６５は、それぞ れ別のプライマーセットを用いて増幅される。ａと称する一方のプライマーセッ トは、天然のマチニアなＩＬ−６のコドン４５と５１に対応する位置を含む領域 を除き、各プラスミドの全長を増幅するために使用される。これらのコドンは、 ｐ３６５の場合にはセリン残基を、ｐ４６９の場合にはシスティン残基を表す。

この種の反応によって得られる物は、反応に使用された鋳型によりｐ３６５ａま たはｐ４６９ａと呼ばれる。

同様にして、プライマーセラ）ｂを使用したＰＣＲの第２ラウンドでの鋳型とし てｐ４６９とｐ３６５を使用し、生成物ｐ３６５ｂまたはｐ４６９ｂを生成する 。これらの増幅生成物は、天然のマチュ了なＩＬ−６のコドン７４と８４に対応 する位置を含む領域を除き、完全長の各プラスミドを含有している。

ゲル精製の後、生成物ｐ３６５ａ及びｐ４６９ｂを合体し、変性し、アニーリン グを行って、２本の単鎖結合ギャップを有するリコンビナントサークルを生成す る。第１のギャップを横切る単鎖結合ＤＮＡは、ｐ４６９ｂのコドン４５．５１ に対応する位置のシスティン残基をコードする。第２のギャップを横切る単鎖結 合ＤＮＡは、１）３６５ａのコドン７４．８４に対応する位置のセリン残基をコ ードする。Ｅ、ｃｏｌｉへの形質転換後、これらのギャップを有するサークルを 修復し、位置７４．８４のシスティン残基がセリン残基に置換されたＩ　Ｌ−６ 突然変異タンパク質変種ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＣＣ３Ｓをコードす るＤＮＡを有するｐ６４２を生成する。ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ｃｃ ｓｓは、比較の目的では有用であるが、本発明による突然変異タンパク質の変種 ではない。

同様の方法で、ｐ３６５ｂとｐ４６９ａをアニールし、形質転換して、位置４５ ．５１のシスティン残基がセリン残基によって置換されたＩＬ−６突然変異タン パク質変種ＭｅｔＧＩｙ　−２ａａ　ＩＬ−６５ＳＣＣをコードするＤＮＡを有 するｐ６４３を生成する。ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ｓｓｃｃは、本発 明による突然変異タンパク質の変種である。

実施例１４Ｃ，定方向突然変異誘発によって調製された、ＩＬ−６の本来のシス ティン位置にアラニンと荷電−アミノ酸を含む突然変異タンパク質変種アラニン または荷電残基（アスパラギン酸とアルギニン）が天然のＩＬ−６の２個または ４個全部のシスティンに対応する位置に存在するＩＬ−６の突然変異タンパク質 変種が、Ｔ、−ＧＥＮ　（商標）突然変異誘導キラ）（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅ ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、オハイオ州クリーブランド）を使用し、そのキ ットに添付の指示書に従って、ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ｃｃｃｃから 構築される。突然変異誘発反応で必要とされる単鎖結合ＤＮＡの収率を向上させ るために、ＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＣ’ＣをコードするＤＮＡを 、Ｍｌ　３ｍｐ１９のＨｉｎｄｌＩＩとｐｖｕＩ部位の間でサブクローン化する 。−末鎖ＤＮＡは、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎによって”Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編＞ 　１．　１５．　２〜１．　１５．　３頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ 、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９年）に記載されている方法のような標準的な手 続きによって得られる。突然変異誘発性のオリゴスクレオチドを使用し、−組の システィンを突然変異させる。システィンの両方の組がアラニンまたは荷電残基 （アスパラギン酸とアルギニン）によって置換された突然変異株は、突然変異誘 発の２つの連続する工程によって生成される。

ジデオキシ・シーケンシングによる配列の確認の後、ＩＬ−６の変種のそれぞれ をコードするＤＮＡを、実施例１４Ａで述べられているｐ３４０発現ベクターに サブクローン化する。ｐ４７８　（実施例１４Ａ参照）の前駆物質であるこれら のベクターは、ＩＬ−６変種をベーターガラクトシダーゼ融合タンパク質として 高レベルで発現させる。この融合タンパク質は、Ｎ−末端　ベーターガラクトシ ダーゼ断片を有し、これには、コラゲナーゼ開裂部位が続き、さらにＸＬ−６突 然変異株変種が続く。

実施例１４Ｄ、ＩＬ−６突然変異タンパク質変種の発現、精製及び定量ＩＬ−６ 変種（実施例１４Ｂと１４０）のための遺伝子を含有する発現ベクターをＥ、ｃ ｏｌｉ　ＪＭＩＯＩに形質転換する。シングル・アンピシリン耐性コロニーを使 用して１０ｍ１のプロスカルチャーを接種し、イソプロピル　ベーターＤ−チオ ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりベーターガラクトシダーゼ融合タ ンパク質が誘導されるにつれてＩＬ−６突然変異タンパク質変種を発現させる。

ベーターガラクトシダーゼの活性が最大になった時、細菌を遠心分離によって沈 殿させ、−２０°Ｃで貯廐する。細菌を再懸濁し、リゾチーム処理に続く凍結と 解凍によって溶解する。溶解物を音波処理して粘性を低下させ、融合タンパク質 を他の不溶物質とともに、遠心分離によって沈殿させる。この沈澱物を洗浄する ことによって可溶性の不純物を除去し、融合タンパク質は、２％ラウロイルサル コシンナトリウム中で可溶化する。不可溶性の不純物を遠心分離によって除去し 、選択的硫酸アンモニウム析出を２回行うことによって融合タンパク質を更に精 製する。生物学的検定または定量の前に、ＩＬ−６変種は、コラゲナーゼを用い てベーターガラクトシダ・−ゼから分割する。タンパク質は、還元条件下での変 性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって定量し、その後クーマシー染色、 走査型レーザーデンシトメーターによる測定を行う。

結合を調べるため、公知の方法によりＩＬ−６突然変異株を明らかに均一になる まで精製する。簡単に述べると、ｐ４７８変種によって形質転換されたＥ。

ｃｏｌｉを１０リツトルの回分培養において育成し、ＩＰＴＧにて誘導し、ベー ターガラクトシダーゼの活性が最大になった時に細菌を遠心分離によって沈殿さ せる。この融合タンパク質は、量を適宜に増大させたことを除き、本質的には上 記のようにして部分的に精製する。コラゲナーゼによる処理の後、汚染されたベ ーターガラクトシダーゼの殆どが選択的硫酸アンモニウム析出によって除去され る。硫酸アンモニウムの濃度を増加させることによってＩＬ−６突然変異タンパ ク質変種を析出させ、得られた析出物を、遠心分離の後、浮遊薄膜として回収す る。その薄膜をトリフルオロ酢酸　０．１％／アセトリトリル　３０％に再懸濁 し、逆相高速液体クロマトグラフィーによってＩＬ−６突然変異タンパク質変種 を残留不純物から分離する。ＩＬ−６突然変異タンパク質変種を含む分画を凍結 乾燥し、リン酸緩衝した０、０１％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅ　ｅ　ｎ−２０を含む生 理食塩水に再懸濁する。精製したＩＬ−６突然変異タンパク質変種の濃度は、部 分的に精製されたタンパク質のための上記の方法で測定する。

実施例１４Ｅ、その他の突然変異タンパク質変種上述のものに加え、実施例１４ Ａ〜Ｌ４Ｄに記載の方法と同様の方法により、天然ＩＬ−６の最初の２つのアミ ノ酸ＡｌａＰｒｏを、ＭｅｔＧＩｙ及び、第１組目のシスティン残基（位置４５ 及び５１）と第２組目のシスティン残基（位置７４及び８４）の何れか一方また はその両方のシスティン残基の組が、１組または２組のアラニン（Ａ）残基、１ 組または２組の逆荷重アミノ酸残基（アスパラギンｅ　（Ｄ）とアルギニン（Ｒ ））によって置換された突然変異タンパク質変種を調製する。上記と同様の命名 法によると、調製される突然変異株は下記の通りである：ＭｅｔＧｔｙ　−２ａ ａ　ＩＬ−６ＡΔＡＡＳＭｅ　ｔＧｌ　ｙ−２ａａ　ＩＬ−６ＤＲＤＲ，Ｍｅｔ Ｇｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＡＡＣＣｌＭｅｔＧｌｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＤＲ ＣＣ，ＭｅｔＧＩｙ　−２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＡＡＳＭｅｔＧＩｙ　−２ａａ　 ＩＬ−６ＣＣ３Ｓ及びＭｅｔＧ１３Ｆ−２ａａ　ＩＬ−６ＣＣＤＲ０実施例１５ 、バイオアッセイ Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４６．５８５−５９１（１９ ９１）の記載に従ってバイオアッセイを行う。簡略に言えば、細胞を９６穴マイ クロタイター・プレートにおいてＩＬ−６突然変異タンパク質の濃度をかえて処 理する。各々の突然変異タンパク質に対し、二個か三個の独立のタンノくり質調 製物を各バイオアッセイにおいて二回ずつテストする。ヘキソサミニダーゼレベ ルの比色測定を用いてマウス−マウスハイブリッド細胞系（７ＴＤ１）の増殖を 測定し、ハイブリドーマ成長因子活性を測定する。ＩＬ−６の刺激によるヒ）Ｅ ＢＶ形賞転換Ｂ細胞系（ＳＫＷ６．４＞からのＩｇＭの分泌を測定することによ り、Ｂ細胞の分化能を決定する。ｒｇＭは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッ セイ（ＥＬＩＳＡ）を使用することにより定量する。ＩＬ−６の刺激によるヒト （ＨＥＰ　３Ｂ２）とラット（ＦＡＺＡ　９６７）肝がん細胞からのフィブリノ ーゲンの分泌を測定することにより、肝細胞刺激活性をめる。フィブリノーゲン は、ヒトまたはラットのフィブリノーゲンに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡに よって定量する。

生物的活性の定量は、公知の方法によって行う。簡単に言えば、ノλイブリドー マ成長アッセイにおける活性は、最大増殖の半分の増殖を起こすのに必要とされ るＩＬ−６またはＩＬ−６突然変異種の濃度であると定義され、肝細胞刺激活性 とＢ細胞の分化能のアッセイは、フィブリノーゲンまたはＩｇＭの分泌をそれぞ れ２倍または４倍にするのに必要なＩＬ−６の濃度であると定義されている。活 性を計算するため、半対数の目盛り上に用量反応曲線をプロットし、コンピュー タ・プログラムによって、各曲線のほぼ直線に近い部分を２次多項式で表す。各 アッセイの活性は、同じアッセイを行った突然変異でないｒｌＬ−６の活性に対 する百分率で表される。その結果は、表４と図１４とに示されている。

突然変異種　ＦＡＺＡ　９６℃　７ＴＤ１℃　ＨＯＰ　３Ｂ２℃　５ＫＷ６．４ ℃ＣＣＣＣ１００１００１００１００ ＾ＡＡＡ　５２±１２　５．７±、４　０．８±、０５　０．３±、０８ＳＳＳ Ｓ　２２±２．５　１．０７±、１７　０．０７±、００７　０．０２±、００ ５１１ＲＤＲ８，８±１．６　０．８±、０７　＜０．１　＜０．０５ＡＡＣＣ ９２±９．７　９０±４．７　７８±１０　１（１９±１１ＳＳＣＣ１２８±６ ，８　６６±９．０　１２１±９．０　１０３±１１ＤＲＣＣ７８±１１　１０ １±９．４　９９±６．０　９０±１４ＣＣＡＡ　６７±１１２０±４．７　２ ．４±、１４　１．１±、２１ＣＣ３Ｓ　３９±８．５　９．０±３．３　（１ ，７±、１４　０．１４±、０３ＣＯＤＲ２０±６．２　３．５±、６４　０Ｊ ±、０８　０．０６±、００８１全ての突然変異種の活性は、ｒＩＬ−６の％活 性±ＳＥＭで与えられる。ｒＩＬ−６は全てのバイオアッセイにおいて活性が１ ００％であるとする。正確な定量を行うのには活性が低すぎる突然変異種におい ては、活性をくＣで表わす。

ここでＣは所定のアッセイにおいて正確な活性測定が行える最小レベルを示して いる。

ｂＭｅｔＧＩｙ　−２２ａａ　ＩＬ−６ＸＸＸＸ変種は、実施例１４Ｅにおいて 記述された様に命名されている。

Ｃ４つのバイオアッセイにおける活性は、実施例１５に記載されたように測定さ れた。

補助的な可能性 クレームされた本発明は、本明細書と、容易に利用できる引用文献及び出発原料 とにしたがって実施できる。しかしながら、下記の細胞系が本発明を実施し、利 用することを容易とするために米国メリーランド州のロックビルの＾ｍｅｒｉｃ ａ口Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）から入手 可能である。

ｐＢｇａ　ｌ／ＥＫ／ｃｆ　ＩＬ−６ （ＡＴＴＣ寄託番号　６８１８７．１９８９年１１月３０日寄託）ｐＴｒ　ｐＥ ／ＥＫ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ−６（ＡＴＴＣ寄託番号　６８１８０．１９８９年１１ 月１７日寄託）これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約の条項及びその規則の下で行われた（ブダペスト条約）。これ は、寄託の日から３０年間生きた培養物を維持することを保証している。ブダペ スト条約の条件の下で、且つ、関係する米国特許の発行後は制限の無い利用性を 保証する出願人とＡＴＣＣとの間の契約に従い、ＡＴＴＣはその有機体を利用で きるようにすることができる。寄託された株の利用可能性は、特許法に従い政府 の権限の下で許可される権利に違反して特許を実施するための実施許諾であると 解釈してはならない。

さらに、有用なプロトコールと情報を含む下記のカタログは、本出願の出願経過 書類から入手可能である。

”Ａｌｔｅｒｅｄ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳ ｙｓｔｅｍ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ’　Ｐｒｏｍｅｇａ社配　列　 表 （１）一般的情報： （ｉ　）　出願人ニスケリー、スーザン、エム。

フォウルケス、ダナ、エム。

（１、発明の名称：減システィンＩＬ−６突然変異タンパク質（ｉｉｉ）配列の 数＝８ （ｉｖ）あて名： （Δ）あて先ニイムクローン　システムズ　インフーポレーテッド（Ｂ）ストリ ート：１８０　バリツク　ストリート（Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１００１４ （ｖ）コンピュータ入力形式： （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：　 ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウニＴ　：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ ｅａｓｅ　＃１，０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｌ）本出願データ： （Ａ）出願番号；ＵＳ （Ｂ）出願日： （Ｃ）分頌： （ｖｉｉｉ）代理人： （Ａ）氏名：フェイト、イルピング　エヌ。

（Ｂ）登録番号：２８，６０１ （Ｃ）照会／処理番号：５ＫＥ−１−ＰＴ（ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号：２１２−６４５−１４０５（Ｂ）テレファックス＋２１２−６ ４５−２０５４Ｅ＃＜ｏｏｃ　ｏａ＋ （Ｊ　−じ　Ｉ＋Ｉ　←　； ｕａ　Ｈ←　←　− （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号：２： Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　 Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　八ｌａ　Ｐ’ｒｏ　Ｈｉ■ ｌ　５　１０　１５ Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ工 ｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｉｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ２０　２５　：１Ｏ １１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒコ５　４０　４５ Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌ ｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　［’ｈａ　 Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ａｓ■ Ｃ＋ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ｉｌｅ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌ■ Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　にｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　 Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎＡｌａ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｈａｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｉ ｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｎ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒ ｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ１〕ｏ　１３５　１４０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　 Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　にｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎＡｓｐ　１４ｅｔ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｑ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｇ１■ ５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｍｅしく ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ じ　Ｏ１ｌ’ｌ　（ＪＱ、　ＣＪ　−リ　ψ　ト　−（Ｊｌ＋１．−１　＜ψ　 リφ　く論　Ｕ；（ＪＩＩＬ、　Ｕ（＜ψ　＜−＜ト ロｅ　ＣＪコロ　ロ１　ロｏ　くコ ＜−Ｅ−ｉａｌｒ’ｌＥ＋Φ　Ｑし　く−ｕａ　ｕ−＜ｘ　ｕＱ＋ｏａ （■　（Ｊ　の　（Ｊｅｕ’１　！−コ　０　コＱ１．＋　１ｍｍ　（ψマ　← ω　に−＜＜　＜１−１＜＜　ＣＪ、Ｊ　ｖａ Ｏの　ＣＪｌ＋Ｉ　？１．Ｉ　ＣＪｅロ　トロ＜°Ａ　＜＞　リｏＪ　急＝″　 ゴ芝 ０＝　ト←　（り ｔｔｏ　ｌｊｅ’　（ｊｌｌｌ　ｕ２　（ＪＩＪ（ＪＱ、　（Ｊ（＜ｗ　ｕ−肛 ｉ Ｑ−ロレ　（＞トΦ ＣＪ（ＣＪｅ　＜洲 り番　仁２　＜Ｖ＋　（＋１１　０−’り＜　＜Ｗ　（（＜に　じＱ ＜　０、−＋　ＣＪ　Ｌｌ　＜Φ　（Ｊｌａ　トｆｉＵ１．Ｉ　Ｕ二　←−Ｌｊ φ　υ− Ｑ山　く←　＜１−　＜Ｃ／ｌ　Ｌｊ＜い　１−　Φ　く　コ　Ｃコ　υ　−〇 　＝　い　Ｃコ＞　ｅ−：　＜　−１−ａ！　○ニ　トΦい　シω←Ｃ−じじ　 ＣＪ　−＋　＜　’−（Ｊ　Ｊ−〇＝（Ｊ　Ｑｌ　（Ｊ　（ＯＣＪ　Ｉ−Ｉ＜　 ｍ　’Ｊ　：）　”Ｊ　’：：←−くりＯ（ＪＪ：　Ｌｌ−←ω　２のく−　に ＜−＜←　Ｑ＜　ＣＪ−１乙＝ロ　ω い　い コ５　４０　４５ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　（１；ｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ａｓ ｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　！Sｅｔ ＾１ａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃ；ｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅ■ Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　ｒｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇ ｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｃ１ｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｎ　八ｌａ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ｖａｌｌｏｏ　１０５　１１０ Ｇｉｎ　Ｈｅｊ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｉ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　Ｇｉｎ　 Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ａ ｓｐ　Ａｌａ　ｒｙｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｎ　Ａｌａ　にｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｍｅ ｔ　Ｔｈｒ　ＴｂｒＨＬｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ 　Ｌｙｓ　にｌｕ　ｒ’ｂｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒ ■ ０レロ　←０＋　リｍ　ｉΦ　トコ ＣＪｃｌｘ　＜Ｖ＋　（＞　ｃ−＋　Ｅ−４０１ト切−〇＜　＜Ｊ　（ＨＣＪＪ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （１１）配列の種類：タンパク質 （Ｘｉ）配列：Ｖり番号：６： Ｍａｔ　八ｌａ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒ。

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アメリカ合衆国　０７１０９　ニューシャーシー州、ベルビル、グレイロック　 パークウェイ　２７４ （７２）発明者　タックニー、チャールズ、ティー。

Ｉ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　スノーワード、ジョン、エヌ。

（７２）発明者　フォウルケス、ダナ、エム。

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. １．天然ＩＬ−６の、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置における各システイン残基が他のアミノ酸で置換されるとともに、位置 ７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイ ン残基が保持されているＩＬ−６突然変異タンパク質。
2. ２．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置における 他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項１記載の突然変異タンパク質。
3. ３．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置における 他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項１記載の突然変異タンパク質 。
4. ４．天然１Ｌ−６の、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置における各システイン残基がセリン残基で置換されるとともに、位置７ ４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン 残基が保持されているＩＬ−６突然変異タンパク質。
5. ５．天然１Ｌ−６の、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置における各システイン残基が他のアミノ酸で置換され；位置７４と８４ における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン残基が保 持され；さらに１から２８のＮ−末端アミノ酸が欠如しているＩＬ−６突然変異 タンパク質。
6. ６．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置における 他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項５記載の突然変異タンパク質。
7. ７．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置における 他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項５記載の突然変異タンパク質 。
8. ８．２２のＮ−末端アミノ酸が欠如している、請求項５記載の突然変異タンパク 質。
9. ９．Ｎ−夫端のアラニン残基が欠如している、請求項５記載の突然変異タンパク 質。
10. １０．天然１Ｌ−６の、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対 応する位置における各システイン残基がセリン残基で置換され；位置７４と８４ における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン残基が保 持され；さらに２２のＮ−末端アミノ酸が欠如しているＩＬ−６突然変異タンパ ク質。
11. １１．天然の完全長ＩＬ−６をコードする核酸分子を転換して、少なくとも天然 のＩＬ−６と比肩しうる活性を有する突然変異タンパク質をコードする核酸分子 とする方法であって、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンを、他のアミノ酸残基に対する コドンで置換し、位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持するステップを含む方法。
12. １２．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項１１記載の方法。
13. １３．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項１１記載の方法。
14. １４．ＩＬ−６分子をコードする核酸分子を転換して、少なくとも天然のＩＬ− ６と比肩しうる活性を有する突然変異タンパク質をコードする核酸分子とする方 法であって、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置 におけるシステイン残基に対するコドンを、セリン残基に対するコドンで置換し 、位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシ ステイン残基に対するコドンを保持するステップを含む方法。
15. １５．ＩＬ−６をコードする核酸分子を転換して、少なくとも天然のＩＬ−６と 比肩しうる活性を有する突然変異タンパク質をコードする核酸分子とする方法で あって、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置にお けるシステイン残基に対するコドンを、他のアミノ酸残基で置換し；位置７４と ８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン残基 に対するコドンを保持し；１−２８の末端アミノ酸に対するコドンを除去するス テップを含む方法。
16. １６．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項１５記載の方法。
17. １７．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項１５記載の方法。
18. １８．２２のＮ−末端アミノ酸が欠如している、請求項１５記載の方法。
19. １９．Ｎ−末端のアラニン残基が欠如している、請求項１５記載の方法。
20. ２０．ＩＬ−６をコードする核酸分子を転換して、少なくとも天然のＩＬ−６と 比肩しうる活性を有する突然変異タンパク質をコードする核酸分子とする方法で あって、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置にお けるシステイン残基に対するコドンを、セリン残基で置換し；位置７４と８４に おける、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン残基に対す るコドンを保持し；Ｎ末端の２２のアミノ酸に対するコドンを除去するステップ を含む方法。
21. ２１．天然ＩＬ−６をコードする核酸分子を転換して、少なくとも天然のＩＬ− ６と比肩しうる活性を有する突然変異タンパク質をコードする核酸分子とする方 法であって、位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置 におけるシステイン残基に対するコドンを、セリン残基で置換し；位置７４と８ ４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイン残基に 対するコドンを保持し；Ｎ末端アラニン残基に対するコドンを除去するステップ を含む方法。
22. ２２．少なくとも天然のＩＬ−６と比肩しうる生物学的活性を有するタンパク質 を調製する方法であって、 Ａ．天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを、それぞれ他の了ミノ酸に対す るコドンで置換し、位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持するステップと、Ｂ．好適 な宿主細胞にて突然変異タンパク質を発現するステップとを含む方法。
23. ２３．宿主細胞がＥ．ｃｏ１１細胞である、請求項２２記載の方法。
24. ２４．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項２２記載の方法。
25. ２５．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項２２記載の方法。
26. ２６．少なくとも天然のＩＬ−６と比肩しうる生物学的活性を有するタンパク質 を調製する方法であって、 Ａ．天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを、それぞれ他のセリン残基に対 するコドンで置換し、位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持するステップと、Ｂ．好 適な宿主細胞にて突然変異タンパク質を発現するステップとを含む方法。
27. ２７．主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項２６記載の方法。
28. ２８．少なくとも天然のＩＬ−６と比肩しうる生物学的活性を有するタンパク質 を調製する方法であって、 Ａ．天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを、それぞれ他のアミノ酸に対す るコドンで置換し；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持し；１から２８のＮ−末端 アミノ酸に対するコドンを除去するステップと、Ｂ．好適な宿主細胞にて突然変 異タンパク質を発現するステップとを含む方法。
29. ２９．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項２８記載の方法。
30. ３０．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸に対するコドンが中性アミノ酸に対するコドンである、請求項２ ８記載の方法。
31. ３１．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸に対するコドンがセリン残基に対するコドンである、請求項２８ 記載の方法。
32. ３２．２２のＮ−末端アミノ酸に対するコドンが欠如している、請求項２８記載 の方法。
33. ３３．Ｎ−末端のアラニン残基に対するコドンが欠如している、請求項２８記載 の方法。
34. ３４．少なくとも天然のＩＬ−６と比肩しうる生物学的活性を有するタンパク質 を調製する方法であって、 Ａ．天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを、それぞれセリン残基に対する コドンで置換し；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持し；２２のＮ−末端アミノ酸 に対するコドンを除去するステップと、Ｂ．好適な宿主細胞にて突然変異タンパ ク質を発現するステップとを含む方法。
35. ３５．少なくとも天然のＩＬ−６と比肩しうる生物学的活性を有するタンパク質 を調製する方法であって、 Ａ．天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応す る位置におけるシステイン残基に対するコドンを、それぞれセリン残基に対する コドンで置換し；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンを保持し；Ｎ−末端アラニン残基に 対するコドンを除去するステップと、Ｂ．好適な宿主細胞にて突然変異タンパク 質を発現するステップとを含む方法。
36. ３６．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項３４又は３５記載の方法。
37. ３７．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンが他のアミノ酸に対するコドンで置換され；位 置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステ イン残基に対するコドンが保持された核酸分子。
38. ３８．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項３７に記載の核酸分子。
39. ３９．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項３７記載の核酸分子。
40. ４０．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対するコドンで置換され；位置 ７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステイ ン残基に対するコドンが保持された核酸分子。
41. ４１．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンが他のアミノ酸に対するコドンで置換され；位 置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシステ イン残基に対するコドンが保持され；１〜２８の末端アミノ酸に対するコドンが 欠如している、核酸分子。
42. ４２．突然変異タンパク質の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１ に対応する位置における他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項４１記載の 核酸分子。
43. ４３．突然変異タンパク質の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１ に対応する位置における他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項４１ 記載の核酸分子。
44. ４４．突然変異タンパク質の２２のＮ−末端アミノ酸が欠如している、請求項４ １記載の核酸分子。
45. ４５．突然変異タンパク質のＮ−末端のアラニン残基が欠如している、請求項４ １記載の核酸分子。
46. ４６．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する１つのコドンで置換され ；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシ ステイン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ酸に対するコド ンが欠如している核酸分子。
47. ４７．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコドンで置換され ；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシ ステイン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ酸に対するコド ンが欠如している核酸分子。
48. ４８．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコドンで置換され ；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシ ステイン残基に対するコドンは保持され；Ｎ−末端アラニン残基に対するコドン が欠如している核酸分子。
49. ４９．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子であって、天然ＩＬ −６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ るシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコドンで置換され ；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置におけるシ ステイン残基に対するコドンは保持され；Ｎ−末端アラニン残基に対するコドン が欠如している核酸分子。
50. ５０．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンが他のアミノ酸に対するコドン で置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置 におけるシステイン残基に対するコドンが保持された核酸分子を含む宿主細胞。
51. ５１．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項５０記載の宿主細胞。
52. ５２．位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応する位置におけ る他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項５０記載の宿主細胞。
53. ５３．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対するコドンで 置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置に おけるシステイン残基に対するコドンが保持された宿主細胞。
54. ５４．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンが他のアミノ酸に対するコドン で置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する位置 におけるシステイン残基に対するコドンが保持され；１〜２８の末端アミノ酸に 対するコドンが欠如している宿主細胞。
55. ５５．突然変異タンパク質の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１ に対応する位置における他のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項５４記載の 宿主細胞。
56. ５６．突然変異タンパク質の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１ に対応する位置における他のアミノ酸が両者ともセリン残基である、請求項５４ 記載の宿主細胞。
57. ５７．突然変異タンパク質の２２のＮ−末端アミノ酸が欠如している、請求項５ ４記載の宿主細胞。
58. ５８．突然変異タンパク質のＮ−末端のアラニン残基が欠如している、請求項５ ４記載の宿主細胞。
59. ５９．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する１つのコ ドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ 酸に対するコドンが欠如している宿主細胞。
60. ６０．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコ ドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンは保持され；２２のＮ−末端アミノ 酸に対するコドンが欠如している宿主細胞。
61. ６１．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンがそれぞれセリン残基に対する 複数のコドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に 対応する位置におけるジステイン残基に対するコドンは保持され；Ｎ−末端アラ ニン残基に対するコドンが欠如している宿主細胞。
62. ６２．ＩＬ−６の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞であ って、天然ＩＬ−６の位置４５と５１における、あるいは位置４５と５１に対応 する位置におけるシステイン残基に対するコドンがセリン残基に対する複数のコ ドンで置換され；位置７４と８４における、あるいは位置７４と８４に対応する 位置におけるシステイン残基に対するコドンは保持され；Ｎ−末端アラニン残基 に対するコドンが欠如している宿主細胞。