SU1703691A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 14, кодирующа полипептид, со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине. Целью изобретени   вл етс  повышение уровн  синтеза интерферона. Получена плаз- мида pIF 14, кодирующа  конститутивный синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека. Рекомбинантна  плазмида pIF 14 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспресси  которых происходит путем трансл ции по- лицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА  вл етс  частью последовательности Шайн-Далыарно TAAGGA в участке инициации трансл ции дистального цистрона. Экспресси  тандема генов интерферона контролируетс  тандемом конститутивных промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7.. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК pIF 14 состоит из Hindlll/Kpnl- фрагмента ДНК плазмиды pTNF311 содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген/ -лак- тамазы и терминатор транскрипции фага Я, и Kpnl/Hindlll-фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансл ции и тандем двух искусственных генов лейкоцитарного интерферона человека. Получен штамм Escherichia coli, который обеспечивает высокий уровень биосинтеза лейкоцитарного интерферона а 2 человека (свыше 35% суммарного клеточного белка) при упрощенной технологии его выделени . 2 с.п. ф-лы. (Л С х| О со о ю

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии. и может быть использовано в медицине.

Целью изобретени   вл етс  повышение уровн  синтеза интерферона.

Получена рекомбинантна  плазмидна  ДНК plF14, кодирующа  полипептид со свойствами интерферона человека и характеризующа с  следующими признаками: кодирует аминокислотную последовательность зрелого лейкоцитарного интерферона а 2 человека, имеет молекул рную массу 2,74 МД (4,21 т.п.о), состоит из Hindlll/Kpn - фрагмента ДНК плазмиды pTNF311 Л содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген /3 -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я (3,4 т.п.о), Kpnl/Hindlll- фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансл ции и тандем двух

синтетических генов лейкоцитарного интер- ферона человека (1,05 т.п.о), и содержит тандем двух синтетических генов, в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой plF14 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавани  рестрикцион- ными эндонуклеазами, расположенными на следующих рассто ни х вправо от сайта Kpnl:Safl-1041 нуклеотид, Hindlll-1059 нук- леотидов, Ncol-1375 нуклеотидов.

Рекомбинантна  плазмида plF14 содержит тандем синтетических генов интерфе- рона, экспресси  которых происходит путем трансл ции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА  вл етс  частью последовательности Шайн-Дальгар- но TAAGGA в участке инициации трансл ции дистального дистрона. Така  организаци  полицистронной мРНК приводит к сопр жению трансл ции цистронов, что делает более эффективным биосинтез белка рибосомой.

Получен штамм - продуцент полипепти- да с биологической активностью лейкоцитарного интерферона человека путем трансформации компетентных клеток E.coli 0 путем плазмидой plF14.

Штамм характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. .

Культуральные признаки. Клетки хорорастут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые , гладкие, прижаты, мутные, блест щие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при 4-40°С при оптимуме рН 6,8- 7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме , так и органические соединени  в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин , углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки про вл ют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плаз- миды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодар  наличию транспозона.

Штамм E.coli SG20050/plF14 обусловливает конструктивный синтез полипептида

со свойствами интерферона а2 человека на уровне 1,5-2,5-10 МЕ/млклеточной суспензии, что составл ет более 35% суммарного клеточного белка бактерий. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ВКПМ В- 4788.

П р и м е р 1. Химический синтез олиго0 нуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполн ют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе с наращиванием олиго- нуклеотидной цепи в направленииотЗ-кон5 ца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов-5 -диметркситоитил-М-ацил- 2 -дезоксинуклеозид-3 -0-(метоксидиизоп- ропиламино)-фосфитов. активированных тетразолом. Синтез провод т в масштабе

0 0,5-0,7 мкмоль, использу  в качестве носител  пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3-сукцинатную св зь присоедин ют первое нуклеотидное звено (нагрузка 205 30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, при этом после реакции конденсации провод т промывку смолы смесью тегра- гидрофурана, пиридина и воды (5:3:2). После окончани  синтеза защитные группы

0 удал ют последовательной обработкой тиофенол том триэтиламмони  и концентрированным аммиаком, При этом происходит отделение олигонуклеотида от носител . 5х-Диметокситритильную груп5 пу удал ют кислотной обработкой и олиго- нуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Выход 1-5 о.е.

П р и м е р 2. Конструирование рекомби0 нантной плазмидной ДНК plF225.

Клетки бактерий E.coli HB101, содержащие плазмидную ДНК р6А23, выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной

5 фазы. Плазмидную ДНК выдел ют и высаживают этанолом. Осадок раствор ют в ТЕ- буфере, содержащем 1 М NaCI, прибавл ют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 0°С, цент0 рифугируют 10 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают и раствор ют в ТЕ-буфере.

Выдел ют ДНК плазмиды pLeulFt17, содержащей синтетический ген а 2 интерфе5 рона в виде BgPll/Safl-фрагмента. 2 мкг плазмиды р6А23 инкубируют с эндонуклеа- зой рестрикции Hlndlll (10 ед.) в 30 мкл буфера В, содержащего 20 мм трис-HCI. рН 7,5, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 7 мМ меркаптоэтанол , в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенола и хлороформа (1:1) и ДНК высаживают 70%-ным этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера А, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, при- бавл ют 0,1 мкг олигонуклеотида AGCTTAAGTCGACTTA и 20 ед. Т4 ДНК-лига- зы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем аликвоту реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток Е.соМ.

Клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиами- на. Единичную колонию внос т в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Клетки охлаждают , осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgClz, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугировани  клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCla и через 3 ч используют дл  трансформации. С этой целью 5 мкл лигаз- ной смеси смешиваютс 50 мкл 0,05 М CaCl2, затем прибавл ют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0°С, затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего прибавл ют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоту высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг-мл) и хлорамфени- кол (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду p6A23/SaO, идентифицируют гибридизацией с клонируемым оли- гонуклеотидом 32P-AGCTTAAGTCGACTTA. Из гибридизующихс  с этой пробой клонов выдел ют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Haflll, Mspl и НаИИ+Saft.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды P6A23/Saf1 в 80 мкл буфера В без NaCf прибавл ют 20 ед. каждой из рестрикционных нуклеаз Safl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Kpnl/Safl-фрагмента (3,4 т.п,о) провод т при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды pLeulFt 17 в 100 мкл буфера В обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз Bgftl и SaO, после чего фрагмент величиной около 500 п.о., содержащий синтетический ген а 2 интерферона, выдел ют при помощи электрофореза в 5%-ном геле.

Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соедин ют в присутствии дуплекса:

CTAATTTAATTTAAGGATTATCGATATGTGT (I)

CATGGATTAAATTAAATTCCTAATAGCTATAC ACACTAG(II)

с векторной ДНК (1,5 мкг) с помощью 30 ед.

Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера А в течение 6 ч при 15°С. Дес тую часть реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток E.coli HB101. Трансформанты высевают на агаризованную среду.

содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (30 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомби- нантную плазмиду plF225, провод т гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонуклеотидом (I). Из клонов, гибридизующихс  с радиоактивной пробой, выдел ют плазмидную ДНК plF225, строение которой подтверждают гидролизом ре- стриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса

П р и м е р 3. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК .

ДНК плазмиды plNF311 Д(10 мкг) гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции (по 20 ед. каждой) Kpnl и Hindlll в 100 мкл буфера В без NaCf в течение 1.5 ч при 37°С. После инкубации раствор экстрагируют дважды смесью фенола и хлороформа (1:1) и векторный фрагмент величиной 3,17 т.п.о. выдел ют электрофорезом в 1%- номагарозном геле. Затем 20 мкг ДНК плазмиды plF225 гидролизуют в 150 мкл того же буфера 2 ч при 37 С смесью рестриктаз Kpnl

и Hindlll (по 30 ед. каждой), после чего выдел ют электрофорезом в 5% ПААГ фрагмент величиной около 620 п.о., содержащий синтетические участок инициации трансл ции и ген а2 интерферона. После этого лигируют 0,1 мкг этого фрагмента с 0,3 мкг векторного Hindlll/Kpnl-фрагмента в 25 мкл буфера А в присутствии 50 ед. Т4 ДНК-ли- газы. Через 3 ч при 15°С 5 мкл лигазной смеси используют дл  трансформации

компетентных клеток E.coli НВ 101. Трансформанты высевают на LB-arap. содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из восьми ампициллиноустойчивых клонов выдел ют ДНК и анализируют ее рестриктным анэлизом с помощью рестриктаз Haelll и Mspl. Из проанализированных шести препаратов ДНК показывают нужный набор рестрикт- ных фрагментов. Окончательно структуру рекомбинантной ДНК plF226 подтверждают определением нуклеотмдной последовательности в области сайтов клонирова- ни .

П р и м е р 4. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК plF14.

Дл  приготовлени  вектора ДНК плаз- ми ды plF226 (10 мкг) обрабатывают в 70 мкл буфера В рестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Смесь депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией, ДНК высаживают этанолом, промывают в 70%- ным этанолом, высушивают и раствор ют в 50 мкл воды. Затем гидролизуют20 мкг ДНК плазмиды p280/21FN в 200 мкл буфера В рестриктазой Xhol (50 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 М раствора ЕДТА до концентрации 25 мМ и прогреванием в течение 3 мин при 100°С. Малый Xhol-фрагмент величиной 510 п.о. выдел ют при помощи электрофореза в 1,5%-ном геле легкоплавкой агарозы. 0,3 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера А с 1 мкг векторной ДНК, полученной указанным образом из плазмиды pTN F311 Д с помощью 50 ед. Т4 ДН К-лигазы в течение 6 ч при 15°С. Аликвоту реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток E.coli. Трансформанты высевают на чащки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл). Скрининг реком- бинантов провод т, анализиру  минипре- параты ДНК, выделенные из отдельных колоний, с помощью рестриктаз Mspl и Haelll по примеру 3. а также анализом клеточных лизатов на содержание интерферо- на по примеру 5.

П р и м е р 5. Получение штамма - продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферонаа2 человека.

Плазмидой plF14 трансформируют компетентные клетки E.coli SG20050 по методу примера 2 и получают штамм - продуцент полипептида со свойствами интерферона человека. Клетки выращивают при 37°С в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке, отбирают пробу 2 мл и клетки центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Содержание рекомбинантного интерферона а 2 определ ют трем  способами.

Радиоиммуноанализ.

Клеточный осадок раствор ют в 200 мкл раствора 8 М мочевины в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 20 мкг/мл п- метилсульфонилфторида. Перед внесением в лунки пробы центрифугируют в течение 2 мин при 12000 об/мин. Сначала в лунки полистирольного планшета внос т 50 мкл раствора кроличьих антител

(0,2 мкг/мл) против интерферона а 2 в буфере С, содержащем 0,02 М фосфат натри  рН 7.5, 0,15 М NaCC 1 мМ EDTA и 0.1% и инкубируют 1 ч при 20°С. Раствор удал ют из лунок, прибавл ют 200 мкл 0,4%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в буфере С (буфер Б) и инкубируют 1 ч при 20°С. После этого лунки тщательно промывак буфером С, затем внос т исследуемые и

0 калибровочные образцы и инкубируют 18 ч при 4°С. После трехкратной промывки 200 мкл буфера Б в лунки внос т раствор меченных J моноклональных антител NK-2 в буфере Ь и инкубируют 6 ч при . Лунки

5 промывают несколько раз буфером С, разрезают и просчитывают на гамма-счетчике. Дл  построени  калибровочных кривых используют высокоочищенный препарат интерферона «2с удельной активностью

0 1.6-10 МЕ/мг. Поданным радиоиммуноа- нализа продуктивность штамма составл ет 3.810 МЕ/мл культуры клеток.

Определение биологической активности .

5Клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 0,1 М трис-HCf. рН 7,0, 30 мМ NaCf, 1% SDS, 1% меркаптоэтанола и 5 М мочевины, нагревают 3 мин на кип щей вод ной бане и центрифугируют 10 мин при

0 12000 об/мин. Из супернатантов готов т образцы путем последовательных двукратных разбавлений в среде Эрла (начина  с разбавлени  1/100). Активность интерферона определ ют стандартным способом

5 по ингибированию цитопатического действи  вируса везикул рного стоматита надип- лоидные фибробласты человека. В качестве стандарта используют препараты лейкоцитарного интерферона человека, охарактери0 зеванные относительно международного стандарта В 69/19.

По данным определени  биологической активности продуктивность штамма E.coli составл ет 2,5-10 МЕ/мл культуры клеток.

5 Определение по отношению к суммарному клеточному белку.

Клетки суспендируют 120 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCI, рН 6,8, 20% глицерин, 3% SDS, 3% меркаптоэтанол.

0 0,005% бромфеноловый синий, нагревают 10 мин на кип щей вод ной бане и охлаждают во льду. Образцы 2,5 и 10 мкл подвергают электрофорезу в 12,5% SDS - ПААГ. По окончании электрофореза гель промывают

5 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и прокрашивают при помощи кумлсси R-250. После отмывки избытка красител  гель сканируют при 550 нм, использу  лазерный сканиметр. По данным сканировани  рекомбинантный интерферон а 2 составл ет всего белка E.coli.

Таким образом, изобретение позвол ет получить полипелтид со свойствами лейкоцитарного интерферона человека, причем уровень его биосинтеза составл ет 2,5- 3,8 -107 МЕ/мл культуры клеток, что составл ет свыше 35% суммарного клеточного белка E.coli (или 150-200 мг полипептида со свойствами интерферона а2 на 1 л культуры клеток), при этом возможно упрощение технологии его получени  за счет исключени  стадии индукции биосинтеза белка.

Claims (2)

1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК plF14, кодирующа  полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона «2 человека размером 4,21 т.п.о. и молекул рной массой 2.74МД. содержаща :

- Kpnl/Bgftl-Satl/HindIll-фрагмент ДНК плазмиды pLeulFtl с синтетическим геном интерферона размером 0,62 т.п.о.;

- Kpnl-Hindlll-фрагмент ДНК плазмиды pTNF 311 Дразмером 3,17 т.п.о., включающий тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7. ген/3 -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я;

- Xhol-Xhol-фрагмент ДНК плазмиды, P280/2IFN размером 0,51 т.п.о.;

-уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих рассто ни х

вправо от сайта Kpnl:Safl-1041 нуклеотид,

Hlndlll - 1059 нуклеотидов, Ncol - 1375 нуклеотидов;

- ген / -лактамазы, определ ющий ус- тойчивость к пенициллиновым антибиотикам;

- тандем двух синтетических генов лейкоцитарного интерферона человека.

2. Штамм бактерий Escherlchla coli ВКПМ В-4788 - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона а 2 человека.