DE3049831T1

DE3049831T1 -

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Publication number: DE3049831T1
Application number: DE19803049831
Authority: DE
Priority date: 1979-08-30
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1982-06-16
Anticipated expiration: 2000-08-30
Also published as: SE8303463D0; GB2070621A; SE462530B; JPS6362198B2; WO1981000577A1; DE3049831C2; NL8020315A; SE463459B; CH663796A5; FR2480779A2; LU88365I2; GB2070621B; SE8303463L; US4428941A; NL192880B; JPS56501128A; BE884988A; NL192880C; CA1163585A; FR2480779B2

Description

VOSSIUS- VOSSIUS- TAUCH N ER · HEUNEMANN - RAUH

PATENTANWÄLTE 3QA9831

SIEBERTSTRASSE 4 ■ 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (O89) 4-7 A-O 75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29 4-5 3 VOPAT D

U.Z. R 144 PCT ' 29. April 1981

CaserPL 0147 81 05

INSTITUT PASTEUR, Paris Cedex 15, Frankreich INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE Paris Cedex 13, Frankreich

"Für das Oberflächenantigen des Hepatitis B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, diese Nucleotidsequenz enthaltender Vektor, Verfahren zu ihrer Gewinnung und dabei erhaltenes Antigen"

Die Erfindung betrifft eine Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz enthält, welche in der Lage ist, für eine iramunogene Peptidsequenz zu kodieren, die dem Oberflächenantigen des Virus der Virushepatitis B entspricht, und die erhaltenen Polypeptide und Peptide.

Sie betrifft auch ein Verfahren, das die Gewinnung einer

solchen Nucleinsäure ermöglicht.

Die Hepatitis B ist eine Viruserkrankung, die besonders häufig im tropischen Afrika, in. Südostasien und im fernen

Orient auftritt.
30

Das äthiologische Agens ist ein Virus (HBV) oder Dane-Partikel, das eine Hülle (Australia-Antigen oder HBs-Antigen), ein Kapsid (HBc-Antigen), eine endogene Polymerase und ein ringförmiges, teilweise einsträngiges DNA-Molekül

enthält; der längere Strang dieses DNA-Moleküls weist etwa 3200 Nucleotide auf (J. Summers, A. 0'Connell und

L J

I. Millman , Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (1975) S. 4597 4601).

Die endogene DNA-Polymerase kann zur in_vitro-Reparatur des kürzeren Strangs verwändet werden (T. A. Landers, H. B. Greenbert und J. S. Robinson, J. Virol., 23 (1977), S. 368-376).

10 15

Die elektrophoretische Analyse der Hüllproteine hat die Anwesenheit von 2 bis 7 Polypeptiden gezeigt/von denen die wichtigsten Polypeptid I und Polypeptid II genannt werden (D.L. Peterson, I.M. Roberts und G.N. Vyas, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74 (1977), S. 1530 - 1534, sowie D.L. Peterson, D.Y. Chien, G.N. Vyas, D. Nitecki und H. Bond (1978) in Viral Hepatitis, Herausg. G. Vyas, S. Cohen und R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, S. 569 - 573).

20

25

30

35

Das Polypeptid I hat ein Molekulargewicht von 22 000 bis 26 000 Daltons. Das Polypeptid II ist glykosiliert und hat ein Molekulargewicht von 28 000 bis 30 000 Daltons. Die Aminosäure-Zusammensetzung dieser beiden Polypeptide ist sehr ähnlich. Die Sequenzen, die ihre ersten 15 Aminosäuren (beginnend am N-terminalen Ende) und ihre letzten drei Aminosäuren bilden, sind identisch, so daß die Hypothese aufgestellt wurde, daß sich das Polypeptid II vom Polypeptid I nur durch eine Glycosilierung unterscheiden könnte.

Die Untersuchung des Virus ist besonders erschwert im Hinblick darauf, daß man über kein Zellkultursystem verfügt, das die Vermehrung des Virus ermöglicht. Diese Schwierigkeit ist schon teilweise umgangen worden, insbesondere was den Serotyp ayw betrifft. Die gesamte DNA (Genom)', des Virus wurde identifiziert und nach ihrem vorherigen Einspleißen in die einzige EcoRI-Schnittstelle eines Vektors ^ gt.WES.^ B kloniert, insbesondere in E. coil» gemäß dem Verfahren von A. Fritsch,

Γ -JS-

C^ Pourcel, P. Charnay und P. Tiollais de Paris, 287 (1978), S. 1453 - 1456.

3049531

, C. R. Acad.

Bis zu diesem Tag wurde die Sequenz der Polypeptide I und . II selbst und die Lage der für diese Peptide kodierenden Sequenz in der viralen DNA nicht aufgeklärt.

Aufgabe der Erfindung ist die Gewinnung einer viel kleineren DNA-Sequenz als die virale DNA selbst, welche die Sequenz enthält, die in der Lage ist, für die Peptidsequenz mit den inKsunogenen Eigenschaften zu kodieren. Diese Peptidsequenz kann, wenn sie in einen lebenden Wirtsorganismus eingebracht wird, die Erzeugung von Antikörpern durch diesen induzieren, welche fähig sind, den nämlichen Wirt letztlich vor dem Virus der Virushepatitis B zu schützen, insbesondere wenn dieser sich im virulenten Stadium befindet.

Die Erfindung beruht nicht nur auf der vollständigen Nucleotidanalyse des Genoms des Dane-Partikels, welche die Erfinder vorgenommen haben, sondern auch auf der Idee, die sie zur Identifizierung des Gens hatten, welches für die oben erwähnten Polypeptide kodiert (nachstehend als "S-Gen" bezeichnet), nämlich in der derart vorbestimmten vollständigen Nucleotidstruktur des Genoms des Dane-Partikels diejenigen Nucleotidsequenzen zu suchen, die befähigt sind, für die bekannten proximalen .und terminalen Peptidsequenzen dieser Polypeptide zu kodieren.

Man wird sich erinnern, daß Peterson und Mitarbeiter berichtet haben, insbesondere in den Aufsätzen, deren Zitate vorstehend wiedergegeben wurden, daß die proximale Sequenz (erste Aminosäure N-terminal) der ersten 15 Aminosäuren im Prinzip

35 wie folgt analysiert wurde:

Met GIu Asn He Thr Ser Gly Phe Leu GIy Pro Leu Leu VaI Ser und daß die terminale Sequenz der gleichen Polypeptide (letzte Aminosäure C-terminal) die folgende ist:

VaI Tyr IIe . . :

Die Figur 1 ist eine schematische Karte des Genoms des Dane-Partikels . Sie enthält zwei Stränge b₁ und b₂; der ; kürzere von ihnen (b₂) enthält normalerweise nicht den Teil, der in der Zeichnung durch eine gestrichelte. Linie wiedergegeben

ist. .

Es ist bekannt, daß diese DNA nur eine einzige EcoRI-Schnittstelle aufweist.

Der Pfeil f. bezeidhnet -die: Richtung der Nutimerierung der Nucleotide, aus denen der längere Strang b.. besteht. Der Pfeil f~ bezeichnet die Richtung der Transcription der Virus-DNA, insbesondere durch die zelluläre Maschinerie der vom Hepatitis B-Virus befallenen Zellen, soweit es die Expression des S-Gens betrifft.

Die EcoRI-Schnittstelle kann demnach mit O numeriert werden oder, wie es jetzt für diejenige des zum Serotyp ayw gehörenden Hepatitis B-Virus genauer bestimmt wurde, mit 3182. 25

Der innere Kreis mit ausgezogener Linie e_ stellt die Skala in.Prozent für die Länge der DNA dar und erlaubt die Bestimmung der Lage bestimmter Teile von ihr.

Die Ziffern 3¹, 5¹ und 5', 3' im unteren Teil der Karte bezeichnen die terminalen Enden, die die gleichen Zahlen in den üblichen Wiedergaben der Kettenenden von Nucleinsäuren

j tragen.

Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß das S-Gen im wesentlichen das Fragment des längeren Strangs b.. darstellt, das sich zwischen den Positionen 73,6 und 95,1 der.schematischen

r 6 π

Karte von Figur 1 befindet. Die Abkürzungen "Start" und "Stop" bezeichnen den Start- bzw. Haltepunkt der Transkription des S-Gens.

Die Figuren 2A, 2B und 2C stellen den terminalen Teil des vorstehend genannten Genoms dar, enthalten insbesondere den zwischen den Positionen 60,4 und 100 (in % der Länge der DNA) .

Jeder der in der Figur 2 erscheinenden Buchstaben entspricht in üblicher Weise einer der vier Nucleotidbasen I der DNA:

A : Adenin
G : Guanin
T : Thymin
C : Cytosin
15

Die unteren Zeilen in jedem der Zeilenpaare, aus denen die Figuren 2A, 2B und 2C bestehen, entsprechen der Nucleinsäure, die mit der Nucleotidkette b₂ übereinstimmt.

Das zur Aufstellung der stärker aufgegliederten Kurte, diie in den Figuren 2A, 2B und 2C wiedergegeben ist, benutzte Analysenverfahren wird nachstehend kurz erläutert.

Die Charakterisierung der Nucleotidsequenz des S-Gens, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, und deren proximales Ende ρ "S" und terminales Ende t "S" in den Figuren 2A, 2B und 2C angegeben sind, ergibt sich aus der Feststellung daß:

- die 14 ersten Tripletts (in der Leserichtung f₂) ,beginnend mit dem gegenüber dem terminalen EcoRl-Ende mit 3Ο3Ο nummerierten Nucleotid , sind entsprechend in der Lage, für die 14 ersten Aminosäuren der proximalen Sequenz der 15 ersten Aminosäuren der vorstehend genannten Polypeptide ^zu kodieren;

- die 4 letzten Tripletts GTA TAC ATT TAA, gelesen auf der zu der transkribierten Kette b.. komplementären Kette b₂, entsprechen den 3 terminalen Aminosäuren der oben erwähn-

^r -J- 30Α983Γ

ten Polypeptide und einem Stop-Kodon;

- diese Nucleotidsequenz (678 Nucleotide) enthält kein Stop-Kodon, zumindest wenn man den Leserahmen anwendet,

bei dem das erste von der Zellmaschinerie *

auf der DNA gelesene Triplett AUG ist (entsprechend ATG auf dem Komplementärstrang);

- die vollständige übersetzung der genetischen Information, > welche mit dem Start-Kodon ATG beginnt, führt zu einem : theoretischen Polypeptid von 226 Aminosäuren, das ein MoIekulargewicht von 25 422 Daltons aufweist.

Die Nucleotidsequenz des S-Gens sowie die Polypeptidkette die durch Übersetzung des S-Gens erhalten wird, sind in

den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellt. 15

Diese Werte sind vollständig im Einklang mit den analytischen Daten, die aufgrund der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit des. Polypeptids I auf Polyacrylamidgelen erhalten werden, welche von den vorstehenden Autoren bereits beschrieben wurden ^ (Literaturstellen 9 bis ,12 im Literaturverzeichnis, das sich am Ende der Beschreibung der vorliegenden Patentanmeldung befindet).

Der Unterschied, der an der Stelle der 15. Aminosäure der proximalen Peptidsequenz des Polypeptids I beobachtet wird: Leucin nach den vorstehend erwähnten Sequenzdarstellüngen der Figuren 2A, 2B, 2C und 3A, 3B, 3C , und nicht Serin, wie in den Feststellungen der vorstehend genannten Verfasser, kann vielleicht der Tatsache zugeschrieben werden, daß diese Verfasser mit einer genetischen Variante garbeitet haben, die sich von derjenigen unterscheidet, die Gegenstand der vorliegenden Untersuchung war. Man wird bemerken, daß der Unter-

ί schied auf die Substitution eines einzigen

, Nucleotide in dem in Frage kommenden Triplett "ttä" in dem

|i betreffenden S-Gen zurückgeführt werden kann, das in den

_; ^: Figuren 2A, 2B,.2C und 3A, 3B, 3C dargestellt ist, an-

stelle von "TCA", das

■ . L ^J

30

^Γ -*- 3 O A 9 a 3

eines der Tripletts ist, die in der Lage sind, in Serin übersetzt zu werden.

Die Erfindung betrifft deshalb insbesondere die Nucleinsäurefragmente, die aus der DNA des Dane-Partikels herausgeschnitten werden können, wobei diese Fragmente insbesondere dadurch gekennzeichnet sind, daß sie den Teil des S~Gens enthalten, der in der Lage ist, für den Teil des Hüllproteins des Virus zu kodieren, der verantwortlich ist für die immunologischen Eigenschaften des Hepatitis B-Virus.

In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung demnach eine Nucleinsäure mit mindestens etwa 1000 bis 1100 Nucleotiden, die insbesondere dadurch gekennzeichnet ist,, daß sie in der Lage ist, für eine immunogene Peptidsequenz zu kodieren, welche ihrerseits in der Lage ist, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die gegen das Hepatitis B-Virus aktiv sind, wobei diese Peptidsequenz im wesentlichen die in den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellte Struktur aufweist, oder für irgendeine Peptidsequenz mit äquivalenten immunogenen Eigenschaften.

Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor im Hinblick auf die Expression der genannten Nucleotidsequenz in einem ²^ Mikroorganismus oder in eukariotischen Zellen mit der Maßgabe, daß bei der genetischen Verknüpfung die Ablesephase des S-Gens beibehalten wurde.

Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen weisen im Verhältnis zueinander eine Veränderlichkeit auf, die bei ihrer Expression zur Entstehung von Determinanten führt,die je nach dem Subtyp des Hepatitis B-Virus variiren ,(Subtypen d, w, y, r der Gruppe a) .

Bei der Peptidsequenz, die in den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellt ist, wird man feststellen, daß die erste

-*- 304983

Aminosäure der vorstehend erläuterten Sequenz: Methionin, N-terminal, und daß die Aminosäure des entgegengesetzten Endes: Isoleucin, C-terminal ist.

Die Erfindung betrifft insbesondere auch die in den Figuren 4A und 4B wiedergegebene Nucleotidsequenz, die für eine solche Peptidsequenz kodiert, wie sie aus Figur 5 hervorgeht, oder für irgendeine analoge Peptidsequenz, die mit äquivalenten immunogenen Eigenschaften versehen ist.

:

Es versteht sich von selbst, daß mit dem vorstehend er- . wähnten Begriff "äquivalente Peptidsequenz" jede Peptidsequenz gemeint ist, in der bestimmte Teile nicht streng identisch mit den entsprechenden Teilen der in den Figuren 3A, 3B, 3C und 5 wiedergegebenen Peptidsequenz sein können, wobei diese Variationen auf lokale Mutationen zurückzuführen sein können, welche den allgemeinen immunogenen Charakter des Proteins nicht beeinflussen, oder auf Modifikationen der Struktur, die auf den unterschiedlichen Serotypen beruhen, unter denen die Proteine der in Frage stehenden Art in Erscheinung zu treten vermögen (insbesondere die Serotypen adw, adr und ayr). .

Die Erfindung betrifft insbesondere die Nucleotidsequenz, welche für eine derartige Peptidsequenz kodiert, wie sie in Figur 6 dargestellt ist, oder für irgendeine analoge Peptidsequenz, die äquivalente immunogene Eigenschaften aufweist.

Insbesondere betrifft die Erfindung auch folgende Peptid-30

-'·■', .30 Sequenzen:

; Alanin-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin

Threonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin Threonin-ThreoninrAlanin-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin 35

~ι

15

Im ersten der vorstehend aufgeführten Peptide ist das Alanin-Ende N-terminal und Serin-Ende C-terminal. Im zweiten und dritten der vorstehend aufgeführten Peptide ist das Threonin-Ende N-terminal und das Serin-Ende C-terminal.

Beispielsweise kann man insbesondere das Pentapeptid ausgehend vom C-terminalen Serin herstellen, an das man das Threonin nach dem von Castro in Tetrahedron Letters, .. 1975, Nr. 14, S. 1219 - 1222 beschriebenen Verfahren anhängt. Anschließend werden die Aminosäuren Glycin, Glutamin und Alanin nach dem wiederholten gemischten Anhydrid-Verfahren (Methode Rema) angehängt, welches von Beierman in Chemistry and Biology of Peptides, Herausg. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann, Arb. Mich. (1972), S. 351 beschrieben wurde.

20 25

Die Erfindung betrifft auch die Produkte, die sich aus der. Anheftung des Pentapeptids an ein größeres Trägermolekül,

insbesondere vom Polypeptid-r oder Proteintyp, ergeben, ferner Mittel, welche dieses Pentapeptid in Form der Verknüpfungsprodukte enthalten, Insbesondere zusanmen mit einsm pharmazeutisch verträglichen Träger und weiter insbesondere impfstoffe gegen die Hepatitis B. Die pharmazeutischen Träger sind in an sich üblicher Weise der ausgewählten Verabreichungsart angepaßt, die insbesondere oral, parenteral, rektal oder durch Aufsprühen auf die Schleimhäute, insbesondere der Nase,erfolgen kann.

Das Hexapeptid und das Polypeptid aus 7 Aminosäuren können nach den üblichen Verfahren der Peptidsynthese hergestellt werden.

35

Diese Peptide sind, gemäß vorliegender Erfindung, vermutlich die Stellen mit Antigenwirkung der größeren, vorstehend erläuterten Polypeptide und verantwortlich für die Vaccin-Wirkung der. viralen Hülle (Journal of Biol. Stand. 4 ,(1976),

S. 295 bis 304, RAO und VYAS "Biochemical Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologie Activity").

Die Erfindung betrifft ferner noch die DNA-Fragmente, die in der Lage sind, für die Herstellung dieses Pentapeptids, Hexapeptids und Polypeptids mit 7 Aminosäuren zu kodieren. Es handelt sich:

- Für das Pentapeptid insbesondere um das Polynücleotid der Formel:

5' GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' GGA GTT CCT TGG AGA 5¹

- Für das Hexapeptid insbesondere um das Polynücleotid der Formel:

5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'·

3¹ TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5"

- Für das Poly peptid aus 7 Aminosäuren um das Polynücleotid der Formel:

5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' oder in jedem der drei Fälle um das zu den drei jeweiligen vorstehenden Polynucleotiden komplementäre Polynücleotid, oder auch um irgendein Polynücleotid in dem jedes der Tripletts durch irgendein analoges Triplett ersetzt sein kann, das in der Lage ist, für die Herstellung der gleichen Aminosäure zu kodieren.

Die Nucleinsäure der Erfindung kann ferner dadurch gekennzeichnet sein, daß sie mindestens einen der zwei wechselseitig komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthält, wie sie in den Figuren. 4A und 4B dargestellt ist (in denen die Ziffern, die den Positionen der ersten Nucleotide jedes der aufeinanderfolgenden Fragmente von 10 Nucleotiden entsprechen, ebenfalls hinsichtlich der EcoRI-Stelle, die in der Figur nicht dargestellt ist, aufgeführt sind:
natürlich haben diese Zahlen keinen Einfluß auf die Charak-

L . ■ J

terisierung der Nucleotidsequenz der in Frage stehenden Art). Das DNA-Fragment ist von 2 HincII-Schnittstellen begrenzt.

Man wird anerkennen, daß diese Nucleotidsequenz der genetischen Information entspricht, deren übersetzung zu der Peptidsequenz führt, die in Figur 5 dargestellt ist.

Die Erfindung betrifft natürlich die äquivalenten, einsträngigen oder doppelsträngigen Nucleotidsequenzen, darunter insbesondere den Strang mit der Sequenz , die sich aus der Folge der unteren Zeilen der Figuren 4A und 4B ergibt, die entsprechende doppelsträngige DNA oder die entsprechenden Boten-RNAs, insbesondere diejenige, die durch die Komplementärketten der Nucleotide wiedergegeben wird, die aus den unteren Linien der Linienpaare der Figuren 4A und 4B bestehen (Richtung des Pfeils f₂).

Ebenfalls gehören zur Erfindung die Nucleotidketten, die sich von den vorstehenden durch bestimmte Tripletts oder kurze Triplettsequenzen unterscheiden, mit der Maßgabe, daß diese Nucleotidsequenzen befähigt bleiben, für ein Polypeptid zu kodieren, das die immunogenen Eigenschaften bewahrt, die für den Virus der Virushepatitis B charakteristisch sind. Allgemein handelt es sich, um Nucleotidketten, die gegebenenfalls nach Denaturierung der doppelsträngigen' DNA zur Erzeugung der entsprechenden einsträngigen Nucleinsäuren die Fähigkeit behalten, sich auf mindestens etwa 90 % ihrer Länge mit einem der DNA-Stränge der Figuren 4A und 4B zu hybridisieren.

Bevorzugte Nucleinsäuren der Erfindung sind auch diejenigen, die aus der DNA des Hepatitisvirus herausgeschnitten werden können und die, falls sie doppelsträngig sind- durch die Existenz einer HincII-, Hhal-, Aval- oder EcoRI-Schnittstel-Ie an dem einen ihrer Enden und durch eine Avalll-, HincII- oder Hhal-Schnittstelle an ihrem anderen Ende gekennzeichnet sind. . ι

_J

Die Lagen dieser verschiedenen Enden im Vergleich zur EcoRi-Schnittstelle sind schematisch in den Figuren 2A, 2B und. 2C angegeben.

Die Nucleinsäure der Erfindung ist für den Einbau in einen Vektor bestimmt, der ihre Expression in einem Bakterium und in eukaryotischen Zellen ermöglicht, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung eines Proteins oder eines Peptids, das in der Lage ist, in einem lebenden Wirtsorganismus die Herstellung von Antikörpern zu induzieren, die gegen das Virus der Virushepatitis B aktiv sind. Das aus der übersetzung der Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung hervorgehende Protein oder Peptid kann als Impfstoff oder als Hilfsmittel zur Diagnose verwendet werden.

Die Nucleinsäure der Erfindung kann auch als Reagenz verwendet werden, um in Blut- oder Serumproberi die Anwesenheit oder Abwesenheit des Dane-Partikels des Antigens HBs oder von Fragmenten davon und dergl.festzustellen (nach dem übliehen Verfahren der DNA-DNA-Hybridisierung).

Weitere Kennzeichen der Erfindung werden sich noch aus der kurzen Beschreibung ergeben, die sich auf Analyseverfahren, die Identifizierungj.urid Gewinnung der DNA-Fragmente gemäß der Erfindung bezieht. Natürlich wird auf die Zeichnungen Bezug genommen, deren Figuren bereits in den vorangehenden Ausführungen in Betracht gezogen wurden. Die Ziffern oder Zahlen in Klammern entsprechen den Zitaten im Literaturverzeichnis, das der vorliegenden Beschreibung angefügt ist.

30

Die Erfindung betrifft auch besondere Vektoren, die die Expression der vorstehend beschriebenen Nucleotxdsequenzen ermöglichen, insbesondere in Form eines Hybridproteins, in welchem ein Proteinfragment, das die immunologischen Eigenschäften des HBsAg aufweist, an ein Trägermolekül gebunden ist, wobei dem Ganzen immunpgene oder immunoreaktive Eigen-

3049631

schäften verliehen werden, die es dazu befähigen, die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die im Wirtsorganismus, in den dieses Protein vorher eingebracht wurde, eine Schutzwirkung gegen die virale Infektion ausüben..

30

Insbesondere betrifft die Erfindung einen Vektor - Phage oder Plasmid - der mindestens einen Teil des Lactose-Operons enthält, insbesondere den Promotor und das Z-Gen dieses Operons. Dieser Vektor ist dadurch gekennzeichnet, daß er modifiziert ist für den phasengerechten Einbau eines der DNA-Fragmente des Hauptpatents, insbesondere derjenigen, die

den größeren Teil des S-Gens enthalten, in eine geeignete Stelle des Z-Gens, wie die EcoRI-Schnittstelle.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen dieser modifizierten. Vektoren, in denen mindestens ein Teil des Fragments der DNA, die für den größeren Teil .der ß-Galactosidase kodiert, durch ein DNA-Fragment ersetzt, ist, das in der Lage ist, für irgendein anderes nicht-immunogenes Trägermolekül zu kodieren, oder für ein Molekül, dessen mögliche immunologischen Eigenschaften, falls solche existieren,

nicht diejenigen des Peptidteils beeinflussen, welcher die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist, beispielsweise hauptsächlich diejenige, die sich in Leserichtung von seiner Hhal-Schnittstelle weg erstreckt.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auch auf ein Hybridprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Polypeptidsequenz enthält, welche die spezifischen immunologischen Eigenschaften des HBsAg enthält. Dieses Hybridprotein ist mit einer Polypeptidsequenz verbunden, die aus dem größeren Teil der ß-Galactosidase besteht, welche die Rolle eines Trägerproteins spielt.

Die Erfindung erstreckt sich nicht nur auf dieses besondere Hybridmolekül, dessen wesentliche Rolle darin besteht, ein Beispiel für ein Protein darzustellen, das nach dem Verfah-

1 ren der Gentechnik aufgebaut-wurde und die charakteristik ·

sehen immunogenen und immunoreaktiven Eigenschaften des " Antigens HBsAg aufweist. Vielmehr erstreckt sich die Erfin-

. dung auch auf jedes andere Hybridprotein, in dem der ganze -

^! 5 oder ein Teil des ß-Galactosidase-Anteils durch irgendein anderes Trägermolekül ersetzt sein kann, das nicht immunogen ist, oder dessen mögliche immunologische Eigenschaften, wenn solche existie-

^: ren, nicht diejenigen des Peptidteils beeinflussen,

der die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist. »

j 10

j Weitere Merkmale der Erfindung werden noch im Verlauf 'deir

; Beschreibung der bevorzugten Beispiele, in Kombination mit

■ den Zeichnungen erscheinen, in denen:

j - die Figuren 1a bis 1h schematisch die aufeinanderfolgen-

ί; ■ . 15 den Stufen der Herstellung eines Vektors vom Plasmidtyp

f darstellen, wobei ein Fragment der HBV-DNA eingebaut .

I wird; .

I - die Figuren 2a bis 2c schematisch die Ausgangsstrukturen

■*. des verwendeten Vektors (Figur 2a) , des erhaltenen modi-

ί 20 fizierten Vektors (Figur 2b) und diejenige des Hybrid-

I . proteins zeigen,.das sich aus der Expression dieses modi-,

' fizierten Vektors in E. coli ergibt (Figur 2c).

I A. Nucleotidsequenzen

II ²⁵ Die Produkte und die angewendeten Verfahren

I Die verwendeten Enzyme und chemischen Verbindungen

': Die verwendeten Restriktionsenzyme: BamHI, Hhal, Hindi.,

I Haelll, Xbal, Mbol, Hinfl, Hpall, Xhol stammen von

I ³⁰ Biolabs. Es wird die DNA-Polymerase I von

j Boehringer verwendet. Die bakterielle alkalische Phosphata-

f se und die Polynucleotid-Kinase wurden von P.L. Biochemicals

;j geliefert. Die chemischen Verbindungen waren die folgenden:

'{ Dimethylsulfat (Aldrich) ;

I Hydrazin (Eastman Kodak);

I Acrylamid und Bisacrylamid (zweifach kristallisiert -

I Serva);

Dideoxynucleotidtriphosphat und Deoxynucleotidtriphosphat (P.L. Biochemicals); Piperidin (Merck) unter Vakuum redestilliert.

Herstellung der HBV-DNA ' .

Das gesamte HBV-Genom (Untertyp ayw) wurde in E. coli . kloniert, wobei die einzige EcoRI-Schnittstelle des Vektors y^gt.WES. ^. B (14) benutzt wurde. Die klonierte DNA wird nachstehend als "Eco HBV DNA" bezeichnet.

Der rekombinante Bakteriophage wurde in einer Petrischale auf Agar vermehrt. Die gesuchte DNA wurde iⁿ an sich bekannter Weise extrahiert. Nach Verdauung der DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI wurde die Sequenz Eco HBV DNA durch ultrazentrifugieren in einem Sucrosegradienten. gemäß dem Verfahren gereinigt, das in den Literaturzitaten (16, 17) beschrieben ist.

32

Herstellung der 5' P-markierten DNA-Fragmente

10 bis 20 Picomol der Eco HBV DNA wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen mit den verschiedenen Restriktionsenzymen vollständig hydrolysiert. Die DNA-Fragmente wurden durch die alkalische Phosphatase dephosphoryliert, welche danach durch eine alkalische Behandlung inaktiviert wurde. Sodann wurde die DNA nach dem in dem Aufsatz (18) beschriebenen Verfahren mit Äthanol ausgefällt. Nach dem Wiederauflösen in einem Puffer auf der. Basis von Spermidin wur-

32

den die DNA's an ihren 5'-Enden mit einem ATP (y P) (3000 Ci/mM, hergestellt von New England Nuclear) und mit Polynucleotid-Kinase markiert (nach dem im Aufsatz (19) beschriebenen Verfahren).

Die Restriktionsfragmente der DNA wurden durch Elektrophorese in . Polyacrylamidgel getrennt und danach eluiert. Die markierten Enden wurden in an sich bekannter Weise nach Spaltung mit einem anderen Restriktionsenzym oder durch Denaturierung der DNA-Fragmente der in Frage stehenden Art durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel voneinander getrennt.

Bestimmung der Struktur der Nucleotidsequenzen der DNA

Die Primärstruktur der doppelsträngigen oder einsträngigen DNA-Fragmente wurde im wesentlichen nach dem von Maxam und Gilbert (19) beschriebenen Verfahren bestimmt- Es wurde

auch das Verfahren der terminalen Ketteninhibitoren benutzt, das von Sanger und Mitarb. (20) beschrieben und von Maat und Smith (21) für doppelsträngige Fragmente abgewandelt wurde, die: an einem ihrer 5'-Enden markiert sind.

ί Die Produkte der chemischen und enzymatischen Umsetzung wurden

²⁰ durch Elektrophorese in Acrylamid-Sequenzierungsgelen von 8, 16, j oder 25 % und 1 mm Dicke analysiert.

■ ' ■ ' ' ' ■

Die Verfahren und die Ergebnisse der Analyse

■j ²⁵ Um zu bestimmen, ob das HBV-Genom in der Lage ist, für die

Polypeptide I und II zu kodieren, wurden alle Haelll-Fragmente ,(die Haelll-Schnittstellen des HBV-Genoms sind in Figur 1 durch kleine Pfeile angezeigt) an ihren 5'-Enden markiert. Erhebliche Teile ihrer Primärstruktur wurden nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt. Die Nucleotidsequenzen, die befähigt sind, für die proximalen und terminalen Aminosäuresequenzen der Polypeptide I und II zu kodieren, wurden in den Fragmenten Haelll E und Haelll F lokalisiert, welche vorher auf der Restriktionskarte des

35

HBV-Genoms lokalisiert wurden (nach dem in der Literaturstelle (17) beschriebenen Verfahren). Dies sind die Nucleotid

^r . - Ji 3049^3V

Sequenzen, von denen aus den bereits angegebenen Gründen angenommen wurde, daß sie die Enden des S-Gens enthalten, welche selbst die Positionen 73,6 und 95,1 gegenüber der EcoRI-Schnittstelle (Figur 1) besetzen.

Die Nucleotidsequenz zwischen diesen beiden Positionen wurde analysiert, wobei bekannte chemische Verfahren benutzt wurden, insbesondere durch das Verfahren des chemischen Abbaus mit Dimethylhydrazinsulfat und das Verfahren der Kettenbeendi- '<

gung. Unter den verschiedenen von Maxam und

Gilbert vorgeschlagenen chemischen Utiisetzungen wurden die teilweise Depurinierung mit Ameisensäure und die Spaltung mit Piperidin benutzt. Dies sind Verfahren, die Banden gleicher Intensität bei den Autoradiogrammen für die Fragmente ergeben, die mit einem

Guanin und mit einem Adenin enden. Es wurden auch die Umsetzungen mit Hydrazin durchgeführt, gefolgt von einer Spaltung mit Piperidin, um Bänden gleicher Intensität zu erhalten für die Nucleotide Cytosin und Thymidin. Die elektrophoretische Auftrennung der Produkte dieser beiden Umsetzungen ergibt für jede Base einen Fleck in einer der beiden Spuren des verwendeten Gels. Dieses Verfahren erleichtert die Ablesung des Autoradiogramms des Gels. Die Umsetzung mit Hydrazin in Gegenwart von Natriumchlorid, die spezifisch für das Cytosin ist, ermöglicht die Unterscheidung dieses Nucleotids vom

Thymidin. Die Umsetzung mit Dimethylsulfat gefolgt von
einer Spaltung mit Piperidin, die spezifisch für Guanin ist, ermöglicht die Unterscheidung dieses letztgenannten Nucleotids von Adenin.

Um einen möglichst hohen Grad an Genauigkeit sicherzustellen, wurden durch Hydrolyse der Eco HBV DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen: BamHI, Hinfl, Hpall, Haelll und
Hindi verschiedene Nucleotidsequenzen hergestellt, die
unterschiedliche, sich gegenseitig übergreifende Fragmente

bilden.

^Γ - $- 3Q49831ⁿ

Auf diese Weise wurde die Analyse jeder der Schnittstellen, die als Ausgangspunkt für die Untersuchung der ersten Fragmente benutzt wurden, durch die Analyse unterschiedlicher Fragmente bestätigt, in denen sich die Schnittstellen des :

ersten Fragments zwischen den neuen Enden dieser anderen Fragmente befinden.

Das S-Gen, das in den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellt ist, : und das mit dem Startkodon ATG beginnt, enthält 227 Tripletts, darunter ein Stopkodon TAA. Die drei Kodons, die den drei Aminosäuren am carboxyterminalen< Ende des korrespondierenden Polypeptids entsprechen, befinden sich im gleichen Leserahmen, unmittelbar vor dem Stopkodon TAA. Der eine der beiden anderen Leserahmen ., (entsprechend versetzt gegenüber dem vorangehenden um ein und zwei Nucleotide), weist ebenfalls keinstopkodon auf, kodiert jedoch für ein Protein, das vollständig verschieden von den vorstehend beschriebenen Polypeptiden 1 und II ist. Der dritte Leserahmen enthält 10 Stopkodons (5 TAG, .4 TGA, 1 TAA). Auf dem anderen Strang der DNA werden die drei Leserahmen durch .11, 11 bzw. 6 Stopkodons tpiterbrochen, die über die DNA-Sequenz verteilt sind.

Wie vorstehend bereits angegeben wurde, führt die vollständige übersetzung der genetischen Information, beginnend mit dem Startkodon ATG, zu einem theoretischen Polypeptid mit 226 Aminosäuren, entsprechend einem Molekulargewicht von 25 422 DaI-tons.

Es ist wichtig zu unterstreichen, daß die Nucleotidsequenz, die dem S-Gen entspricht, normalerweise vollständig im Verlauf der übersetzung abgelesen werden muß.

■ .

Teil der Erfindung sind auch Nucleotidketten von der Art

_QC des vorstehend beschriebenen S-Gens die kleine zusätzliche Sequenzen tragen, welche bis zu etwa 100 Nucleotide enthalten können, oder denen im Gegenteil auch solche kleine Sequenzen fehlen können, ohne daß deshalb die .entsprechende genetische Infor-L mation verändert wird (22, 23). J

°- 304983 Γ

r _ 4-

Die verschiedenen Fragmente der Erfindung, die vorstehend definiert wurden, können ausgehend von der DNA-Sequenz der genannten Eco HBV DNA erhalten werden. Dabei werden die entsprechenden Restriktionsenzyme und die bekannten Trennver- !

fahren für DNA-Fragmente angewendet, insbesondere in Polyacrylamidgelen, und es werden ihre unterschiedlichen Wanderungsstrecken ausgenutzt, die eine Funktion ihres Molekulargewichts sind. So kann man . ', beispielsweise ein Fragment enthalten, von dem ein Ende durch eine EcoRI-Schnittstelle und das andere Ende durch eine Avalll-Schnittstelle begrenzt ist, indem man eine Spaltung der Eco HBV DNA mit den Enzymen EcoRI und Avalll durchführt, wobei das gesuchte Fragment das kleinere Fragment ". ist (eine einzige Avalll-Schnittstelle in der Eco HBV DNA) .-·

Das Fragment, das durch gegenüberliegende EcoRI- und Hhal-Enden begrenzt wird, wird durch Hydrolyse der Eco HBV DNA zunächst mit EcoRI und danach durch teilweise Hydrolyse mit dem Restriktionsenzym Hhal erhalten. Man gewinnt dann aus den Spaltungsprodukten dasjenige, das die Avalll-Schnittstelle enthält.

Diese Spaltungsverfahren wurden natürlich nur als Beispiele vorgeschlagen, wobei klar ist, daß der Fachmann selbst die Reihenfolge der Behandlung mit den Restriktionsenzymen bestimmen kann, um insbesondere ausgehend von Eco HBV DNA die Fragmente zu isolieren, die wertvolle Restriktionsenden aufweisen.

Jedenfalls wird man sich erinnern, daß diese Spaltungsverfahren in einem Puffer durchgeführt werden können, der 10 ittmol/lTris vom pH-Wert 7,8, 6 mmol/1 MgCl₂ und 6 mmol/1 ß-Mercaptoäthanol enthält. Der gleiche Puffer enthält außerdem vorzugsweise 50 mmol/1 NaCl, wenn EcoRI benutzt wird.

Wie bereits ausgeführt wurde, betrifft die Erfindung die. Verwendung der beschriebenen DNA-Fragmente als Reagens, das die Diagnose der Anwesenheit von Dane-Partikeln oder davon abgeleiteten Teil-

.L ■ ^J

r ■ # -ι

1 im Serum ermöglicht,. welche eine DNA enthalten,

die in der Lage ist,

¹ . für ein für Hepatitis B charakteristisches immunogenes

i · Protein zu kodieren.
j " ■ . 5

i . Die DNA der Erfindung kann auch in einen Vektor eingebaut

; sein, der die Expression dieser DNA in einem Bakterium oder

I einem anderen Mikroorganismus oder in eukariotischen Zellen

I ermöglicht, wenn der Einbau in Phase durchgeführt wurde.

10

! B. Vektoren, die, eine Nucleotidsequenz des Antigens HBs

! enthalten

' Herstellung eines rekoinbinanten Bakteriophagen ^lac HBs-I

:! . 15 Die Produkte der verschiedenen Stufen dieses Herstellungsver-

i ■ ' '

i fahrens sLnd in den Figuren 1a bis lh dargestellt. Sie sind

■.j . .

auch mit den Zahlen 1a bis 1h bezeichnet.

In der Figur 1a sind die Positionen des S-Gens und bestimmte

j 20 Restriktionsenzym-Schnittstellen angegeben.

i ■■■'.. . ' ' ■ · ■

\ Nach der Behandlung der HBV-DNA mit dem Restriktionsenzym

] Hhal trennt man ein DNA-Fragment (1b), das 1084 Basenpaare

\ und insbesondere das gesamte S-Gen enthält, durch Elektro- ;| ²⁵ phorese im Agarosegel und Elektroelution ab (Figur 1b). Man bell reitet, ausgehend von diesem Unterfragment, das vorher mit Λ der Endonuclease S1 behandelt wurde, ein Unterfragment (1c) I (Figur 1c), das durch Verlängerung des Unterfragments (1b) I an seinen Enden mit DNA-Elementen erhalten wird, welche als i ³⁰ "ecoRI Linker" bezeichnet werden und folgende Formel aufwei-J sen:
] 5' GGAATTCC

I CCTTAAGG 3¹

s ·

ι . ■

Si ^ Das erhaltene Fragment wird nach Bildung von kohäsiven EcoRI-

:] Enden in das Plasmid pBR322 kloniert.

^Γ - ™ - 304983

Das erhaltene Plasmid, das nachstehend als pBRHBs (Figur 1d)

eine
bezeichnet wird, enthält nur /Xbal-Restriktionsstelle, die

sich in der Nähe des Kopfes des Gens S befindet.

Durch Verdauung des rekombinierten Plasmids pBRHBs mit einem Enzymgemisch aus EcoRI und Xbal erhält man ein DNA-Fragment, das etwa 980 Basenpaare aufweist und den größeren Teil des S-Gens enthält (Figur 1e). Dieses Fragment wird abgetrennt und durch Elektrophorese in Agarosegel gereinigt. Das erhal tene Fragment wird erneut mit Endonuclease S1 behandelt, danach wieder mittels der vorstehend erwähnten EcoRI-Linker mit EcoRIrEnden versehen und danach einer Behandlung mit der Endonuclease EcoRI unterzogen, um die entsprechenden kohäsiven - Enden wieder zu erhalten. Das Fragment der Figur 1e, das etwa 980 Basenpaare enthält, wird danach in vitro in die,EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pBR322 eingebaut, wobei das Plasmid pXbaHBs erhalten wird (Figur If).. Dieses Plasmid wird in üblicher Weise wie das Plasmid pBR322 kloniert. . '

Es wurden mehrere Klonen erhalten..Nach der Behandlung der DNA's von drei dieser Klone, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 und pXbaHBs-3 (Figur 1g), mit EcoRI werden die Fragmente, die nachstehend als "HBs-Fragmente" bezeichnet werden (Fig. 1h), extrahiert und gereinigt.

Die Nucleotidsequenzen der Enden der vorstehend bezeichneten Fragmente, (diei.normalerweise im Inneren des S-Gens erhalten werden) werden unter Anwendung des von Maxam und Gilbert beschriebenen Verfahrens bestimmt (Proc. Nat. Acad.

Sei. USA 74 (1977), S. 560 bis 564).Diese Bestimmungen haben ergeben, daß die Nucleotidsequenzen der terminalen Enden, , die dem S-Gen entsprechen, in den drei Klonen nicht identisch i-.ind (Figur Ig), wobei die unterschiede wahrscheinlich auf Heterogenitäten beruhen, die im Verlauf der Verdauung mit der Endonuclease S1 entstanden sind.

r ■ η ' ■ π

.- & - 3QA9831

Die von pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 stammenden Fragmente werden durch Verknüpfung in vitro in das Genom des Bakteriophagen Ap-Lac 5-1 (21) eingebaut, welcher nur eine einzige EcoRI-Schnittstelle aufweist, die in der Nähe des Endes des lac Z-Gems liegt. Aufgrund des Leserahmens des Iac Z-Gens, wie er aus der Aminosäuresequenz der ß-Galactosidase abgeleitet werden kann (23), stellt man fest - und der Versuch wird es bestätigen - daß der Einbau des HBs-Fragments von pXbaHBs-1 in die EcoRI-Schnittstelle des Iac Z-Gens des " Äplac 5-1 zur Beibehaltung der zum S-Gen gehörenden Lesephase führen muß. Im Gegenteil müßte sich beim Einbau des HBs-Fragments von pXbaHBs-2 ergeben, daß es nicht unter Beibehaltung des richtigen Leserahmens in den vorstehend genannten Vektor eingebaut werden kann. Es wurde trotzdem zur Kontrolle in den folgenden Versuchen verwendet.

Diese Versuche wurden unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt. Insbesondere wurden die HBs-Fragmente von pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 mit Hilfe einer Ligase in die DNA von <\plac 5-1 eingebaut, welche vorher mit EcoRI geschnitten wurde . Die Gemische der erhaltenen DNA-Fragmente wurden dann zur Transfektion des Stamms C6OORecBC rk mk von E. coli verwendet. Die Klone des Bakteriophagen, die infolge des Einbaus der HBs-Fragmente in die EcoRI-Schnittstelle des

^⁵ Iac Z-Gens l^ac geworden sind, werden vermehrt und nach dem in (21) beschriebenen Verfahren gereinigt.

Die DNA's von verschiedenen Bakteriophagen wurden extrahiert und die Orientierungen der eingebauten DNA-Fragmente durch elektrophoretische Analyse ihrer BamHI-Restriktionsfragmente bestimmt. Man kann so feststellen, daß zwei mit AlacHBs-1 und ^lacHBs-2 bezeichnete Phagen, die den Plasmiden pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 entsprechen, ein HBs-Fragment in richtiger Orientierung enthalten.

Die Figur 2a ist eine schematische Karte des Vektors /Iplac 5-1 vor seiner Modifizierung mit dem aus pXbaHBs-1 stammenden Fragment HBs-1.

Die Figur 2c ist eine schematische Karte eines Teils des gleichen Vektors, welche die in seinem z-Gen durch Einschub des oben erwähnten Fragments HBs-1 in seine EcoRI-Schnittstelle eingeführte Modifikation zeigt.

Die Figur 2c zeigt schematisch die Struktur des als Ergebnis der Expression des modifizierten Vektors gemäß Figur 2b erhaltenen Hybrid-Polypeptids.

Die Expression wurde durch Transfektion . eines Bakterien-Stamms E. coli, insbesondere des Stammes HfrΔlacX74, erhalten.

E. coli-Stämme, insbesondere ein Stamm E. coli Hfr^ lacX74 wurden mit . plac 5-1, ^lacHBs-i bzw. ,A.lacHBs-2 transformiert. Nach der Kultivierung werden die Zellen lysiert und die erhaltenen Lysate werden durch Elektrophorese auf PoIyacrylamidgel SDS (24) analysiert. Die Proteine werden durch Anfärbung mit Coomassie-Blau aufgezeigt. Man findet eine stärkere Bande unter den Expressionsprodukten von /tplac 5-1 auf Höhe der Position der ß-Galactosidase (Molekulargewicht 116 248), welche als Marker benutzt · . wurde. Unter den Expressionsprodukten von /LlacHBs-1 findet man eine andere Bande (nicht anwesend unter den Expressionsprodukten von A.lacHBs-2), die einem neuen Protein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 135 000 bis 141 000 entspricht.

Die Proteine, die von den sowohl mit _f\.lacHBs-1 als auch mit pt plac 5-1 transformierten Bakterien synthetisiert .worden sind, werden durch (³⁵S) Methionin markiert. Das Zusammenbringen dieser Proteine mit einem Anti-HBsAg-Serum und die Aufnahme

L ■ J

Γ Λ

- ** - 304-993 V

eines Autoradiogramms eines SDS-Polyacrylamidgels zeigen nur unter den Expressionsprodukten ■ von AlacHBs-1 die Anwesenheit einer Bande, der keine äquivalente Bande unter den Expressionsprodukten der anderen Vektoren entspricht.

Diese Bande verschwindet in spezifischer Weise, wenn die Immunopräzipitation in Gegenwart von nicht markiertem HBsAg durchgeführt wird. Man beobachtet noch die gleiche Bande unter den Expressionsprodukten von ^llacHBs-1 , wenn die Immunopräzipitation mit einem Antiserum gegen die ß-Galactosidase durchgeführt wird.

Die vermutete Struktur des Teils des erhaltenen Hybridproteins an der Verbindungsstelle zwischen dem Iac Z-Gen und dem Fragment HBs-1 ergibt sich aus der Figur 2c. Diese Figur zeigt das Fragment "ß-gal", das der ß-Galactosidase (1005 Aminosäuren) entspricht, und das Fragment HBsAg (192 Aminosäuren) _t wobei diese Fragmente durch eine Aminosäure Prolin getrennt sind, die einem Teil des "EcoRI Linker" entspricht, der im Vektor ^lacHBs-1 enthalten ist.

C. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Moleküls unter Verwendung des Vektors der Erfindung

Die Erfindung kann deshalb die Herstellung eines Proteins mit geringerer molekularer Masse als die vorstehend erläuterten Polypeptide I oder II ermöglichen, das die gleichen immunogenen Eigenschaften aufweist.

Die Ergebnisse zeigen, daß E. coli, oder jeder andere geeignete Mikroorganismus, wie Bakterien oder Kulturen von eukary-

können otischen Zellen, durch das ^lacHBs-1 infiziert werden/und ein Protein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 138 000 synthetisieren können, welches die Antigen-Determinanten sowohl von HBsAg als auch von ß-Galactosidase besitzt. Dieses Molekül ist repräsentativ für Hybrid-Polypeptide, die nach den Verfahren der Erfindung erhalten werden können, in

dem HBsAg an ein Trägerprotein gebunden wird (das aus der teilweisen oder vollständigen Substitution des ß-Galactosidase-Fragments stammt)', wobei diese Hybride trotzdem die Antigen-Eigenschaften von HBsAg besitzen. Diese neuen Molekü-Ie sind zur Herstellung von Arzneistoffen geeignet, die gegen die Virushepatitis B aktiv sind.

Wie sich von selbst versteht und wie bereits aus den vorstehenden. Ausführungen hervorgeht, ist die Erfindung keinesfalls auf die Anwendungsformen und praktischen Ausführungen

beschränkt, die genauer erläutert wurden; sie umfaßt im . Gegenteil auch alle Variationen.

Im Anhang·zu dieser Beschreibung erscheint das Literaturverzeichnis, und insbesondere die Literaturstellen, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung zitiert wurden.

^Γ - J*- 3 O 4 9 8

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L ■ ■ J

Claims

Patentansprüche

1. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens etwa 1000 bis 1100 Nucleotide umfaßt, und daß sie in der Lage ist, für eine immunogene Peptidsequenz zu kodieren, die ihrerseits in der Lage ist,in vivo die Produktion von Antikörpern :zu induzieren, die aktiv gegen das Virus der Hepatitis B sind.

2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz aufweist, die in der Lage ist, für die Peptidsequenz zu kodieren, die in den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellt ist, oder für eine analoge Peptidsequenz, welche äquivalente immunogene Eigenschaften aufweist.

3. Nucleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekonnzeichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz enthält, die in den Figuren 4A und 4B dargestellt ist, und in der Lage ist, für die Peptidsequenz zu kodieren, die in Figur 5 dargestellt ist, oder für eine analoge Peptidsequenz, welche äquivalente immunogene Eigenschaften aufweist.

4. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn ze ichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz aufweist, die in der Lage ist, für. die Peptidsequenz zu kodieren, die in Figur 6 dargestellt ist, oder für eine analoge Peptidsequenz, welche äquivalente immunogene Eigenschaften

wie die in Figur 6 dargestellte, aufweist. 30

5. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

■ gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz enthält., die in der Lage ist für die Peptidsequenz Alanin (N-terminal) Glutamin - Glycin - Threonin - Serin (C-terminal) zu ^⁵ kodieren.

^Γ -" 304983Τ

6. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch qekenir/.e i chne t:, daß sic eine Sequenz enthüll·., die in der Lage ist, für die Peptidsequenz Threonin (N-terininal) - Alanin - Glutamin - Glycin - Threonin - Serin (C-terminal) zu kodieren.

7. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, für die Peptidsequenz Threonin (N-terminal) Threonin - Alanin - Glutamin - Glycin -. Threonin - Serin (C-terminal) zu kodieren. .

8. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gezeichnet, daß sie mindestens einen.der zwei wechselseitig komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthält, . wie sie in den Figuren 4A und 4B dargestellt ist, oder einen Strang, der befähigt ist, sich mit dem vorstehenden zu hybridisieren.

9. Nucleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,, daß siemindestens einen der zwei wechselseitig komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthält, die in den Figuren 3A, 3B und 3C dargestellt ist, oder einen Strang, der befähigt ist, sich mit dem vorstehenden zu hybridisieren.

- · · '■

10. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß. sie doppelsträngig ist, und daß sie an einem ihrer: Enden durch ein HincII-, HhaI-,AvaI- oder EcoRI-Ende und an ihrem anderen Ende durch ein Avalll-,

HincII- oder Hhal-Ende begrenzt ist.

11. Nucleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz 5'· GCT CAA GGA ACC TCT 3' oder die _zu dieser komplementäre Sequenz enthält/oder eine Sequenz,

in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, welches aber befähigt

ist, für die gleiche Aminosäure zu kodieren.

12. Nucleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz 5¹ ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' oder ■ die zu dieser . . komplementäre Sequenz enthält,

oder eine Sequenz, in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, welches aber . befähigt ist, für die gleiche Aminosäure zu kodieren.
10

13. Nucleinsäure nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz .5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3¹ oder die zu dieser komplementäre Sequenz enthält, oder eine Sequenz, in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, welches

aber ■ in der Lage ist, für die gleiche Aminosäure zu kodieren.

14. Verwendung der DNA nach einem.der Ansprüche 1 bis 13

zur Bildung eines Vektors, der in der Lage ist, in einem

Mikroorganismus oder einer eukaryotischen Zelle expri-■ miert zu werden,zur Herstellung eines Proteins, das eine .durch die erwähnte Nucleinsäure kodierte Peptidsequenz enthält.
25

15. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Peptidsequenz enthält, die durch eine Nucleinsäure nach einem der An- ■ sprüche 1 bis 13 kodiert wurde.

16. Peptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Sequenz aufweist: Alanin - Glutamin- Glycin Threonin - Serin, wobei das Alanin-Ende N-terminal und das Serin-Ende C-terminal ist.

.

L ■ ^J

Si ' "ι

^Γ . - 3* - 3Ό49831

17. Peptid, nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet:, daß es folgende Sequenz aufweist: Threonin - Alanin - Glutamin Glycin - Threonin - Serin, wobei das Threonin-Ende N-terminal und das Serin-Ende C-terminal ist.

'

18. Peptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Sequenz aufweist: Threonin - Threonin - Alanin - ,",

. Glutamin - Glycin - Threonin - Serin, wobei das Threonin-Ende N-terminal und das Serin-Ende C-terminal ist.

gegen

19. Arzneimittel, insbesondere Impfstoff/oder Reagens für die

Diagnose von Hepatitis B, enthaltend im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16, 17 oder 18, entweder allein oder vorher auf einem Trägermolekül, insbesondere vom Polypeptid- oder Proteintyp, fixiert.

20. Vektor, insbesondere vom Typ der Phagen oder Plasmide nach einem der Ansprüche 1 bis 18, enthaltend mindestens einen Teil des Laktose-Operons, insbesondere den Promotor und das ZrGen dieses Operons, wobei dieser Vektor dadurch gekennzeichnet ist, daß er modifiziert ist für den phasengerechten Einbau eines der DNA-Fragmente des Hauptpatents,

insbesondere derjenigen, die den größeren Teil des S-Gens enthalten, in eine geeignete Stelle des Z-Gens,.beispielsweise die EcoRI-Schnittstelle,

21. Vektor nach Anspruch 2O> dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des DNA-Fragments,, das für den größeren Teil der ß-Galaktosidase kodiert, durch ein DNA-Fragment ersetzt ist, das in der Lage ist, für irgendein anderes Trägermolekül zu kodieren, das nicht immunogen ist, oder dessen mögliche immunologischen Eigenschaften, falls

solche existieren, nicht : diejenigen des Peptidteils beeinflussen/ der die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist.

L · ■ .. ^J

3 0 4 9 8 3 Γ

22. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte ersetzende DNA-Fragment sich in Leserichtung von der Hhal-Schnittstelle weg erstreckt, die vorher in dem für den größeren Teil der ß-Galaktosidase kodierenden DNA-Fragment enthalten war.

23. Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor vom Plasmid pBR 322 abgeleitet ist.

.24. Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte eingebaute Fragment durch EcoRI-Enden begrenzt ist und daß es ein Original-DNA- ■ Fragment, das aus dem Virus der Hepatitis B stammt, ent-

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hält, welches in jenem dem Fragment entspricht, das durch Hhal- und Xbal-Schnittstellen begrenzt ist und selbst den größeren Teil des Gens S enthält.

25. Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch ge-20

kennzeichnet, daß er eine Nucleotidsequenz mit ungefähr .1200 Nucleotiden enthält, die aus dem Virus der Hepatitis B stammt, und daß er sich in einem Mikroorganismus oder in einer eukaryotischen Zelle vermehrt.

26. Hybridprotein, das in der Lage ist, durch das in den

genannten Vektor eingebaute DNA-Fragment kodiert zu werden.

27. Hybridprotein nach Anspruch 26, enthaltend eine PoIy-■ .

peptidsequenz, welche die spezifischen immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist und mit einer Polypeptidse'quenz verbunden ist, die aus dem größeren Teil der ß-Galaktosidase besteht.

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^Γ . - Jf- . 3 O 4 9 8 31^Ί

.1 28. Hybridprotein nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der gesamte oder ein Teil des ß-Galaktosidase-Anteils durch irgendein anderes Trägermolekül ersetzt ist, das nicht immunogen ist oder dessen mögliche immunologischen

⁵ Eigenschaften, falls solche existieren, nicht diejenigen des Peptidtexls beeinflussen, der die immunologischen !Eigenschaften des HBsAg aufweist.

29. Impfstoff, enthaltend als Wirkstoff ein Hybridprotein ^ nach einem der Ansprüche 26 bis