FI95045B - Menetelmä hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän proteiinin valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät yhdistelmä-DNA-vektorit ja -kontameerit sekä nisäkässolut - Google Patents

Description

95045

Menetelmä hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän proteiinin valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät yh-distelmä-DNA-vektorit ja -konkatameerit sekä nisäkässolut Tämä keksintö kohdistuu bakteeriperäisiin plasmideihin, jotka käsittävät PreSj-PreSj-S-proteiinia koodaavan alueen, mutta joista puuttuvat hepatitis B-viruksen ytimen antigeeniä koo-daavat ketjut ja joita plasmideja käytetään eukarioottisten solulinjojen transfektioon PreSj-PreSj-S-proteiinia koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävien partikkeleiden tuottamiseksi.

Viime aikoina geenitekniikassa tehdyt kehitysaskeleet tekevät mahdolliseksi sen, että lukuisia peptidejä ja proteiineja voidaan ilmentää bakteeri-, hiiva- sekä nisäkässoluissa yhä suurempina määrinä. Vaikka monia proteiineja ja peptidejä onkin ilmennetty bakteereissa huomattavia määriä, niin kuitenkin erityisenä toiveena on ihmislääketieteessä käytettävien proteiinien ja polypeptidien ilmentäminen suurina määrinä nisäkäs-soluissa, jolloin voidaan välttää ne haitat, jotka johtuvat bakteerisoluista peräisin olevista, mahdollisesti kontaminoi-vista tuotteista, tai jotka liittyvät bakteerisoluissa ilmentämiseen.

Erityisen mielenkiinnon kohteena on hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiinin ilmentäminen suurina määrinä nisäkäs-soluissa. Näiden proteiinien ilmentymistaso nisäkässoluissa ei toistaiseksi ole ollut niin korkea, että näiden polypeptidien taloudellinen tuotanto olisi ollut mahdollista.

Hepatitis B-virus siirtyy ihmisestä toiseen ja aiheuttaa kroonisen ja heikentävän infektion, joka johtaa maksan vakavaan vaurioitumiseen, pääasiassa karsinoomaan, ja kuolemaan. Useimmissa tapauksissa täydellinen toipuminen hepatitis B-viruksen aiheuttamasta infektiosta on odotettavissa. Kuitenkin monissa Afrikan ja Aasian maissa hepatitis 2 95045 B-viruksen aiheuttama infektio on endeemistä. Hyvin moni yksilö näiden maiden väestöstä on hepatitis B-viruksen krooninen kantaja, jolloin vaarana on, että he voivat mahdollisesti levittää tautia edelleen.

Rokottaminen on ainoa tunnettu suojakeino hepatitis B-vi-rusta vastaan. Viime aikoina monet yritykset (esimerkiksi Merck, Sharp & Dohme, USA sekä Pasteur Institute, Ranska) ovat tuoneet markkinoille plasmasta saadun rokotteen hepatitis B-virusta vastaan. Tämä rokote sisältää antigeeninä hepatitis B-viruksen proteiineja, jotka sijaitsevat tavallisesti viruspartikkelin kotelon pinnalla. Tällaista antigeeniä kutsutaan yleisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniksi (HBsAg) ja tätä antigeeniä koodaavaa virusgeeniä kutsutaan HBsAG-geeniksi. Edellä mainitut rokotteet sisältävät pinnan antigeeniä, joka on eristetty hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten plasmasta. Vaikka itse pinnan antigeeni ei olekaan patogeeninen niin kuitenkin se kiihottaa ihmisessä hepatitis B-viruspartikkeleita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotantoa.

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavana oleva lähde on hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten veri. Pinnan antigeenin eristäminen ja puhdistaminen ihmisseerumista on vaivalloista ja aikaa vievää ja näin ollen se on suhteellisen kallista. Tämän lisäksi, niin kauan kun ihmisseerumi on pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavilla oleva lähde, rokotteisiin käytettävissä olevan pinnan antigeenin määrä pysyy rajoitettuna.

Ajatellen suuressa mitassa toteutettavia rokotuksia, erityisesti niillä alueilla, joilla hepatitis B-virus on endeeminen, olisi erittäin tärkeätä, että käytettävissä olisi hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin halpa ja käytännöllisesti katsoen ehtymätön lähde, johtuen siitä, että on olemassa vaara kontaminoitua patogeenisillä aineilla, kun pinnan antigeeniä eristetään ihmisseerumista, niin on toivottavaa, ettei 3 95045 ihmisseerumia käytetä pinnan antigeenin lähteenä. Tällä hetkellä ei myöskään tunneta ihmisten ja simpanssien lisäksi mitään sellaista biologista järjestelmää, jossa hepatitis B-virus voisi kasvaa ja missä se voitaisiin saada lisääntymään.

Molekyylibiologian viimeaikainen kehittyminen on tehnyt mahdolliseksi sen, että järjestys hepatitis B-viruksen täydellisessä genomissa voidaan kloonata (Siddiqui, A. et ai., Proc. Natl. Aca. Sei., USA, Voi. 76, s. 4664, 1979; Sninsky, J.J. et ai., Nature, Voi. 279, s. 346, 1979; sekä Charnay, P. et ai. Nucl. Acids Res., Voi. 7, s. 335, 1979). Tämän lisäksi hepatitis B-viruksen eri virusprote-iineja koodaavat alueet on tunnistettu (katso esimerkiksi eurooppalaiset patenttihakemukset, joiden julkaisunumerot ovat 13828, 20251 ja 38765 sekä Galibert et ai., Nature,

Voi. 281, sivut 646-650, 1979; Pasek et ai., Nature,

Voi. 282, sivut 575-579, 1979; sekä Valenzuela et ai., Nature, Voi. 280, sivut 815-819, 1979).

Tämän kehityksen mukaisesti lukuisia isäntäjärjestelmiä on testattu virusgenomin sen osan, joka koodaa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiineja, ilmentämiseksi.

Monissa yhteyksissä on osoitettu,että tiettyjen eukarioottis-ten tuotteiden ollessa kyseessä voivat bakteerit toimia halpana tuotantojärjestelmänä. Kuitenkin kohdataan monia vaikeuksia kun eukarioottisia tuotteita syntetoidaan bakteereissa. Esimerkiksi: . 1) eukarioottinen rakenteellinen geeni ei ehkä kopioidu tehokkaasti bakteereissa, koska kodonien käyttö bakteereissa eroaa kodonien käytöstä eukariooteissa; 2) eukarioottinen geenituote voi olla toksinen isäntänä toimineelle bakteerisolulle; 3) eukarioottisen geenituotteen rakenne ja toiminta voi riippua tietyistä luennan jälkeisistä prosesseista, kuten 4 95045 glykosylaatiosta tai disulfidisidosten erityisestä kytkeytymisestä, joista kumpaakaan ei saada aikaan bakteeri-isännässä; 4) geenituote erittyy ainoastaan harvoin isäntänä toimineesta bakteerisolusta; 5) eukarioottiset promoottorit eivät tavallisesti toimi bakteereissa ja ne on korvattava bakteerista saadulla promoottorilla, ja tällainen korvaaminen voi johtaa eukari-oottisen geenituotteen muuntumiseeen, esimerkiksi tuotteen N-päätteen osa on peräisin bakteerista ja tämä osa käsittää ensimmäisenä aminohapponaan N-formyylimetioniinin, jota ei esiinny eukariooteissa, ja joka saattaa toimia uutena immunogeenisena determinanttina nisäkkään immuunijärjestelmälle; ja 6) puhdistamisvaiheen aikana bakteerin soluseinämistä peräisin olevia komponentteja voi puhdistua geenituotteen mukana ja ne voivat aiheuttaa vakavia allergisia reaktioita tai ne voivat johtaa geenituotetta vastaanottavassa nisäkkäässä anafylaktiseen shokkiin.

Bakteereissa tuotettuun hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniin on liittynyt vaikeuksia. Ensinnäkin, tuotannon taso bakteereissa on hyvin alhainen ja tämän lisäksi puhdis-. taminen on aloitettava bakteerilysaatista, koska tuote ei erity bakteerisolujen ulkopuolelle. Toisen ongelman aiheuttaa se, ettei bakteereissa esiinny tiettyjä luennan jälkeisiä prosesseja, esimerkiksi pinnan antigeenin glykosy-laatiota, mikä vaikuttaa immuunireaktion spesifisyyden tasoon. Kaikista näistä syistä johtuen on toivottavaa, ettei bakteereita käytetä isäntinä proteiinin tuotannossa.

Hiivasolut, jotka on transformoitu hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä koodaavan ketjun sisältävällä, asianmukaisella yhdistelmävektorilla, syntetoivat mainittua pinnan antigeeniä, jota kerääntyy huomattavia määriä hiivaviljel-mään. Tälläkin isäntäjärjestelmällä on eräitä huomattavia haittoja, kuten 1) pinnan antigeeni ei erity hiivasoluista 5 9 E O 4 5 ja se on eristettävä näiden solujen solulysaatista, ja 2) hiivasoluissa muodostuneet pinnan antigeenin monomeerit eivät muodosta kovalenttisesti liittyneitä dimeerejä, kuten nisäkässoluista erittynyt pinnan antigeeni.

Alalla on yritetty monta kertaa saada aikaan sellaisia ni-säkässolulinjoja, jotka tuottavat pinnan antigeeniä. Nämä solulinjat ovat olleet peräisin ihmisen hepatosellulaari-sista (maksasolujen) karsinoomista (Alexander, J.J. et ai., Afr. Med. J., Voi. 50, s. 2124, 1976) sekä soluista, jotka on transfektoitu kloonatulla hepatitis B-viruksen DNA:11a. Lisäksi apinan munuaissoluja on infektoitu simian-virukseen 40 (SV40) pohjautuvilla yhdistelmä-DNA-vektoreilla, jotka käsittävät 40 % hepatitis B-viruksen genomista (Laub, 0. et ai., J. of Virol., Voi. 48, s. 271, 1983). Samoin yhteistransfektointiin perustuvia menetelmiä on käytetty pinnan antigeeniä ilmentävien solulinjojen valikointiin (Standring, D.N. et ai., J. of Virol., Voi. 50, s. 563, 1984). Dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) - geeniä on käytetty suuria määriä antigeeniä tuottavien nisäkässolu-linjojen aikaansaamiseksi (Michel et ai., Proc. Natl.

Aca. Sei., Voi. 81, s. 7708, 1984). Samoin eukarioottisia virusvektoreita, joissa valikoitavissa olevana merkitsi-menä käytetään transformoitua fenotyyppiä (Hsiung, N. et ai., Molec. and Applied Genetics, Voi. 2, s. 497, 1984), on käytetty pinnan antigeenin geenin siirtämiseen nisäkäs-solujen sisään. Näissä tapauksissa onkogeenisiä DNA-ket-juja sisältäviä DNA-muodosteita, tai onkogeenisistä viruksista saatuja DNA-ketjuja, käytettiin pinnan antigeeniä tuottavien solulinjojen valikointiin. Onkogeenisen ketjun käyttö valikoinnin merkitsimenä aiheuttaa jälleen uusia turvallisuusongelmia, mikäli näiden solujen pinnan antigeeniä käytetään rokotuksissa.

Monissa julkaisuissa tarkastellaan hepatitis B-viruksen koodaavan ketjun syntetoimien polypeptidien ilmentymistä.

6 95045

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 013 828-A1 todetaan, että nukleotidiketjut, jotka koodaavat 163 aminohappojäännöksen muodostamaa pätkää (PreS:ää koo-daava alue) ja jotka sijaitsevat HBV-genomissa välittömästi ennen S-proteiinia koodaavaa aluetta, voidaan myös sisällyttää niihin kappaleisiin, joita käytetään käyttökelpoisten yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseen, sellaisten polypeptidien, joilla on hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin antigeenisyyttä, tuottamiseksi. Lisäksi esitetään, että geenikappaleita, jotka käsittävät sekä HBsAg-proteiiniin liittyvän esiasteen ketjun että siihen liittyvän rakenteellisen geenin, voidaan leikata käyttämällä yhtä tai useampaa lukuisista restriktioendonukleaaseista ennen kloonaavan vektorin muodostamista tai sen aikana. Edelleen esitetään, että HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste tulisi leikata S-pro-teiinia koodaavan ketjun sisältävästä kloonaavasta kul-jettimesta, ennen kuin vektoria käytetään transformoi-miseen.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 072 318-82 kuvataan menetelmä HBsAgsn valmistamiseksi kasvattamalla sellaisella vektorilla transformoituja hiivasoluja, joka vektori käsittää hiivan replikonin, hiivan promoottorin sekä S-proteiinia koodaavan DNA-osan ja josta vektorista puuttuu erityisesti HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste. Samoin kuvataan HBsAg-antigeenin käsittävä rokote, sekä menetelmä HBsAg-antigeenin vasta-aineen saamiseksi puhdistamalla vasta-aine HBsAg-antigeeniä vastaan immunoitujen eläinten seerumista. Samoin kuvataan 14 - 18 nm:n antigeenipartik-keli, joka kykenee muodostamaan immuunikompleksin HBsAg:n vasta-aineen kanssa.

7 95045

Julkaisussa Feitelson et ai., Virology, Voi. 130, sivut 75-90, 1983, todetaan, että monia pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä voidaan koodata osittain PreS-proteiinia koodaavan ketjun puitteissa, esimerkiksi 24 000, 28 000, 32 000, 43 000 ja 50 000 daltonin poly-peptidit.

Julkaisussa Laub et ai., J. Virol., Voi. 48, no 1, sivut 271-180, 1983, kuvataan simian-virukseen perustuva, varhaisen korvausvektorin muodostaminen, joka vektori käsittää HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteellisen geenin sekä välittömästi tätä rakenteellista geeniä edeltävän, 163 kodonin suuruisen esiasteketjun sekä tämän koodaavan ketjun ilmentäminen SV40-viruksella transformoiduissa CV-1-soluissa (COS-soluissa), jotka on transformoitu tällaisella vektorilla. Laub et ai. esittävät samoin, että HBsAg-antigeeniä ilmentyy enemmän sellaisissa COS-soluissa, jotka on transformoitu ainoastaan S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä vektorilla kuin niissä COS-soluissa, joiden transformointiin käytetty vektori sisältää 163 kodonin suuruisen esiasteen välittömästi HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteel lisen geenin edellä.

JP-patenttihakemuksessa no. J5-8194-897-A (Takeda I), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polypeptidiä sekä tämän DNA:n sisältävä vektori, ja tällä DNA:11a transfoimoitu isän-. tä. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9080-615-A (Takeda II), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polypeptidiä , sekä tällä DNA:11a tuotettu polypeptidi ja sen käyttö rokotteena. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9074-985-A (Takeda III) kuvataan DNA-kappsle, joka sisältää yhden tai usearcman, koko adw-tyypin PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun, S-proteiinia 8 95045 koodaavan ketjun tai hepatitis B-viruksen ytimen antigee-·· nia (HBcAg) koodaavan ketjun, tällaista DNA:ta sisältävän vektorin, sekä tällä DNA:11a transformoidut isäntäsolut. Takeda III -julkaisussa todetaan, että PreS-S -proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa 43 000 daltönin polypeptidiä "voidaan käyttää rokotteena HBV-infektioiden ehkäisemiseksi". Takeda III -julkaisussa kuvataan PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun kloonaaminen E. coli -bakteeriin sekä tämän ketjun tuottaman polypeptidin tunnistaminen.

Gerlich esitti eurooppalaisen kliinisen mikrobiologian seuran "European Association of Clinical Microbiology" järjestämässä tilaisuudessa, Bolognassa, lokakuun 18. päivänä 1983, pitämässään esitelmässä, että HBV:n neljä mahdollista geeniä on päätelty kloonatun HBV-DNA:n DNA-ketjun perusteella; että HBV-viruksen pinnan proteiinien geeni (S-gee-ni) koostuu yhdestä keskeytymättömästä koodaavasta ketjus-ta, joka luetaan vähintään kolmeksi polypeptidiksi; että pääasiallisen proteiinin, P24, ja sen glykosyloituneen muodon, GP27, ketju alkaa S-geenin kolmannen säilyneen, luentaan liittyvän käynnistyssignaalin kohdalta; että vähäisemmät pinnan proteiinit, GP33 tai GP36, alkavat toisen käynnistyssignaalin kohdalta; että ainoastaan HBV:n .' P41-polypeptidi todennäköisesti käyttää S-geenin täysi- pituista koodaavaa ketjua; että P41 sisältää HBV:n pääasiallisen antigeenisen determinantin; ja että se on läsnä ainoastaan täydellisissä viruspartikkeleissa, muttei ylimääräisen pinta-antigeenin 20 nm:n partikkeleissa, joista nykyiset hepatitis B-rokotteet ovat peräisin.

Gerlich ei puutu esityksessään erityisesti P41 -polypeptidin PreS^-alueeseen eikä siihen, että tämä PreS^-alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.

Julkaisussa Stibbe et ai., Develop. Biol. Standard, Voi.

54, sivut 33-43, 1983, joka esitettiin Ateenassa pidetyssä 9 95045 virusperäistä hepatitista käsittelevässä, toisessa WHO/IABS-symposiumissa: Standardization in Immunoprophylaxis of Infections by Hepatitis Viruses, Ateena, Kreikka, 1982, todetaan, että HBV:n infektoimien ihmisten seerumista eristetyn HBsAg-antigeenin 20 nm:n partikkelit sisältävät vähintään kolme vähäisempää proteiinia, GP33, GP36 ja P41, mikä on varmistettu elektroforeettisesti SDS-geelillä. Stibbe et ai. päättelevät, että GP33 ja GP36 eivät todennäköisesti ole HBV-rokotteen olennaisia komponentteja. Stibbe et ai. eivät puutu erityisesti P41-proteiinin PreS^-alueeseen tai siihen, että tämä alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.

Julkaisussa Stibbe et ai., J. Virol., Voi. 46, no. 2, sivut 626-628, 1983, esitetään, että HBsAg-antigeenin koodaavasta alueesta peräisin olevia vähäisiä glykoproteiineja, joista « · käytetään lyhenteitä GP33 ja GP36, koodaa PreS2-S-proteiinin koodaava ketju. PreS2~alue on osa PreS-koodaavaa aluetta hepatitis B-viruksen genomissa, ja se koodaa ensimmäistä 55 aminohappoa välittömästi ennen S-proteiinia.

Julkaisussa Neurath et ai., Science, 224, sivut 392-394, ' 1984, esitetään, että polypeptidi, jonka järjestys on ident tinen PreS2~alueen aminopäätteessä olevien 26 aminohapon kanssa, toimii erittäin tehokkaana immunogeeninä, ja julkaisussa ehdotetaan, että tämän immunogeenin vaikutuksesta muodostuneita vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa kokeissa.

Julkaisussa Heerman et ai., J. Virol., Voi. 52, no. 2, sivut 396-402, 1984, kuvataan sekä S-proteiinia koodaavan ketjun että PreS-proteiinia koodaavan ketjun sisältävä, 389 aminohappoa koodaava koko ketju, joka koodaa luonnosta saaduissa HBV-partikkeleissa sekä viruksen pinnan antigeeni-rihmoissa esiintyvää polypeptidiä P39, sen glykosyloituneen 10 - 95045 muodon GP42 ohella, sekä muita HBV-viruksen pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä P24, GP27, GP33 ja GP36. Heerman et ai. esittävät samoin, että P39/P42-proteiinin ainutlaatuinen osa eli sen PreS^-alue, sitoi monoklonaa-lisia vasta-aineita, jotka oli indusoitu HBV-partikkeleil-la immunoimalla. He esittävät, että tämä PreS^-alue on todennäköisesti erittäin immunogeeninen. PreS^-alue on PreS-proteiinia koodaavan alueen se osa, joka sijaitsee välittömästi ennen PreS2~aluetta, ja se käsittää aminohappoja 1-108 (tai 1-122, viruksen alatyypistä riippuen) koodaavat ketjut, jotka aminohapot muodostavat välittömästi PreS2~ptoteiinia koodaavaa ketjua edeltävän pätkän. Heerman et ai. toteavat samoin, että PreS-alueen ketjut saattavat olla mielenkiintoisia etsittäessä HBV-virusta vastaan vaikuttavana, vaihtoehtoisena rokotteena toimivia, immunogee-nisia ja suojaavia poly- tai oligopeptidejä.

: Julkaisussa Michel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

Voi. 81, sivut 7708-7712, 1984, esitetään ihmisseerumin polyalbumiinin reseptoreita kantavan HBsAg-antigeenin synteesi kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO-soluissa), jotka on transfektoitu PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun käsittävällä plasmidilla.

*

Julkaisussa Cattaneo et ai., Nature, Voi. 305, sivut 335-338, 1985, esitetään, että HBV-genomin S-geeni käynnistää luennan PreS-alueen alussa (eli 489 nukleotidiä tai 163 kodonia ylävirran puolella S-geenistä), ja mRNA muokkau- . tuu/polyadenyloituu eräässä kohdassa tämän ydingeenin sisällä.

Julkaisussa Persing et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 82, sivut 3440-3444, 1985, esitetään, että PreS2~S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat kolmea, HBsAg-antigeeniin liittyvää poly-peptidiä, joiden molekyylipainot ovat 24 000, 27 000 ja 35 000 daltonia, ja jotka kaikki ovat järjestäytyneet moni- 1 1 95045 mutkaisiksi immunoreaktiiviksi HBsAg-partikkeleiksi, joiden halkaisija on 22 nm, ja jotka sitoutuvat polymeroituun ihmisseerumin albumiiniin (HSA; human serum albumin); kun taas PreS2~alueen 3'-pään läheisyydessä kehyssiirtymämutaa-tion käsittävällä, PreS2-S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat pelkästään 24 000 ja 27 000 daltonin polypeptidejä, jotka ovat järjestäytyneet halkaisijaltaan 22 nm:n suuruisiksi, immunoreaktii-visiksi HBsAg-partikkeleiksi, jotka eivät kykene sitoutumaan ihmisseerumin albumiiniin. Persing et ai. päättelevät, että PreS2~S-proteiinia koodaava ketju koodaa 35 000 daltonin polypeptidiä; PreS2~proteiinia koodaava osa saa aikaan HBsAg-antigeenin kyvyn sitoutua ihmisseerumin albumiiniin, mutta sitä ei tarvita HBsAg-partikkeleiden muodostumiseen ja erittymiseen; ja että HBsAg-antigeenin hallitsevaa po-pypeptidiä (eli 24 000 daltonin polypeptidiä) ei saada .. pääasiallisesti PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun koodaa- mia, suurempia esiasteita (eli 27 000 ja 35 000 daltonin polypeptidejä) pilkkomalla.

Julkaisussa Milich et ai., Science, Voi. 228, sivut 1195-1199, 1985, esitetään, että rokotteilla, jotka sisältävät sekä PreS2~että HBsAg-aminohappoja käsittäviä HBsAg-partikkeleita, jotka HBsAg-partikkelit olivat erittyneet PreS2-S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä plasmidilla trans-fektoiduista kiinanhamsterin munasarjasoluista (CHO-soluis-ta), voidaan välttää epäreaktiivisuus pelkkää HBsAgita sisältäville rokotteille, koska HBsAg:n aiheuttama immuno-; geeninen reaktio ei riipu PreS2:n aiheuttamasta immunogee- nisestä reaktiosta ja että PreS2~S-proteiinin koodaavan ketjun koodaaman 33 000 daltonin suuruisen polypeptidin aminopäätteessä olevat 26 aminohappojäännöstä muodostavat vasta-aineiden hallitseman sitoutumiskohdan PreS2~alueessa.

Julkaisussa Neurath et ai., Nature, Voi. 315, sivut 154-156, 1985 esitetään, että PreS2-alue koodaa HBV-kotelon pinnan 95045 12 proteiinia, jonka immunologisia alueita (domain) erityisesti maksasolut tunnistavat; PreS2-S-proteiinia koodaava ketju koodaa HBV-partikkeleissa läsnäolevaa proteiinia; PreS2-ptoteiinia koodaavaa geeniä vastaavat synteettiset peptidit ovat erittäin immunogeenisiä ja julkaisussa päätellään, että HBV-rokotteiden tulisi sisältää PreS2~pro-teiinia.

Valenzuela julkaisi toukokuun 15. päivänä 1985 Bostonissa pidetyssä Bio-Expo-5 -kongressissa koko PreS2~proteiinia koodaavan ketjun ilmentämisen hiivassa ja hän esitti, että tällaiset hiivasolut todellakin syntetoivat sekä HBsAg-että PreS2~peptidiä sisältäviä partikkeleita, jotka ovat elektronimikroskopian ja laskeumaominaisuuksiensa perusteella hyvin samankaltaisia kuin pelkästään HBsAg:tä sisältävät partikkelit, ja ettei PreS2-alue häiritse kykyä muodostaa 22 nanometrin HBsAg-partikkeleita. Valenzuela : esittää samoin, että on esitetty hypoteesi, että HBV jou tuu maksaan sitomalla polyalbumiinia polyalbumiinin reseptoriinsa, joka polyalbumiini puolestaan sitoutuu maksassa olevaan polyalbumiinin reseptoriin, jolloin virus sisäistyy. PreS2~alue koodaa HBV-viruksen polyalbumiinin reseptoria. Valenzuela päättelee, että PreS2:ta sisältävä proteiini saa aikaan vasta-aineita, jotka sen lisäksi, että ne inaktivoivat HBV-virusta normaalilla mekanismilla, saattavat vaikuttaa siihen mekanismiin, jonka avulla virus tunkeutuu maksasoluihin. Katso myös julkaisua Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3. sivut 317-320, 1985.

Julkaisussa Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3, sivut 323-327, 1985, esitetään PreS2-proteiinin koodaavan alueen koodaaman, HBsAg-antigeeniin liittyvän polyalbumiinin reseptorin käyttö moniarvoisten rokotteiden valmistamiseksi. Valenzuela valmisti hybridipartikkelin HBsAg-an-tigeenista* ja ja Herpes simplex 1-viruksen glykoproteiinis-ta D (HSVIgD) ilmentämällä koko HSV1gD-PreS2_S-proteiinia koodaavan ketjun hiivassa.

,3 95045

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 154 902-A2 kuvataan hepatitis B -rokote, jonka sisältämä peptidi käsittää vähintään kuudesta, peräkkäisestä, hepatitis-B-viruksen kotelossa PreS-geenin koodaamaan alueeseen kuuluvasta aminohaposta muodostuvan aminohappoketjun.

Tämä rokote ei sisällä aminohappoketjuja, jotka vastaavat hepatitis B -viruksen luonnossa esiintyviä kotelo-proteiineja, eikä fysiologisesti hyväksyttävää laimen-ninta. Peptidi voi olla vapaana tai se on voitu kytkeä kantajaan.

Julkaisussa Kent et ai., Pept. Chem., Voi. 22, sivut 167-70, 1984, esitetään , että kemiallisesti syntetoitu peptidi, joka käsittää N-päätteen 26 aminohappoa PreS2~alueesta, on erittäin hyvä antigeeni, ja että se on synteettisen rokotteen eräs mahdollisuus.

i Julkaisussa Lo et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm.,

Voi. 129, no 3, sivut 797-803, 1985, esitetään HBV-vi-tuksen eri alatyyppien (adw, adr, ayw ja ayw) tapauksessa täysipituisesta HBV DNA:sta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan tunnusomaiset piirteet, mukaan lukien koko PreS-alueesta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan ·' tunnusomaiset piirteet. Lo et ai. julkaisevat samoin täysipituisen HBV DNA:n kloonaamisen ja ilmentämisen E. coli-bakteerissa käyttäen ilmentämisvektoria pUC8 ja he toteavat, että heidän aikomuksenaan on käyttää tällaista HBV-geenin tuotetta, joka on ilmennetty joko prokari-oottisissa tai eukarioottisissa soluissa, diagnostisena aineena sekä rokotelähteenä.

Julkaisussa Wong et ai., J. Virology, Voi. 55, no 1, sivut 223-231, 1985, esitetään PreS-proteiinin koko avoimen lukukehyksen koodaaman kahden HBV-polypeptidin eli 42 ja 46 kilodaltonin glykosyloidun polypeptidin tunnistaminen, jotka polypeptidit sisältävät determinant- 95045 teja sekä HBsAg- että PreS -alueesta. Wong et ai. esittävät samoin kolminkertaisen fuusioproteiinin ilmentämisen, joka fuusioproteiini sisältää 108 N-päätteen aminohappoja 27-133 vastaavaa aminohappoa PreS-alueen 174 aminohaposta (adw2_alatyyppi) sekä β-galaktosidaasin ja kloramfenikoli-asetylitransferaasin ketjut. Tämä peptidi sisältää 15 aminohappoa PreS2~alueesta ja 93 aminohappoa PreS^-alueesta. Wong et ai. esittävät samoin, että (a) tämän kolminkertaisine fuusioproteiinin vaikutuksesta muodostunut polyklonaalinen antiseerumi kykeni tunnistamaan 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit osittain puhdistettujen viruspartikkeleiden preparaateista, sekä (b) glykosyloituneet 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit tuntuvat vastaavan edellä mainitussa Heermanin et ai. julkaisussa kuvattuja 39 ja 42 kilodaltonin glykosyloi-mattomia polypeptidejä.

: Julkaisussa Offensperger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, Voi. 82, sivut 7540-7544, 1985, esitetään PreS2~ peptidin ja β-galaktosidaasin välistä fuusioproteiinia koodaavan kloonatun DNA-ketjun ilmentäminen E. coli-soluissa.

Lukuisissa kirjallisuusviitteissä tarkastellaan plasmideja, jotka sisältävät hiiren metallotioneiinigeenin promoottorin .

Sekä US-patenttihakemuksessa no. 452 783 että julkaisussa Pavlakis et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 80, sivu 397, 1983, esitetään naudan papillomavirukseen perustuva yhdistelmäplasmidi, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin (hGH) geenin sekä metallotioneiinigeenin (MMT) promoottorin.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no EP 0 105 141A2 esitetään yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät S-prote- 15 95045 iinia koodaavan ketjun ja joko naudan papillomavirus-tyypin 1 DNA:n tai Maloney-hiiren sarkoomaviruksen DNA:n.

Hofschneiderin et ai. julkaisemissa plasmideissa käytetään mieluiten luonnollista, S-proteiinia koodaavaan ketjuun liittyvää promoottoria, mutta Hofschneider-viitteessä mainitaan myöskin (esimerkkiä kuitenkaan esittämättä), että "/eräänä7 muuna esimerkkinä edullisesta luonnollisesta eukarioottisesta ilmentämissignaalista voidaan mainita metallotioneiinisignaali hiirisoluista".

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 096 492A2 esitetään koko metallotioneiinigeenin ketjun, promoottorialue mukaan lukien, sisältävien plasmidien käyttö MMT-geenin suhteen alavirran puolella sijaitsevien geenien voimakkaan ilmentymisen aikaansaamiseksi isäntinä toimivissa, tällaisella plasmidilla transformoiduissa nisäkäs-soluissa .

« PCT-patenttihakemuksessa no WO 83/01783 sekä julkaisussa Palmiter et ai., Cell, Voi. 29, sivu 701, 1982, esitetään plasmidi, joka käsittää hiiren MT-1-geenin promoottorin, joka promoottori on sulautettu yhteen rakenteellisen geenin kanssa (mieluiten tymidiinikinaasin geeniin herpes simplex-viruksesta) sekä näiden plasmidien mikroinjektoiminen hiiri-sikiöihin ja siinä todetaan, että tuloksena olevan yhteen-sulautetun polypeptidituotteen geneettistä ilmentymistä näistä sikiöistä muodostuneiden täysikasvuisten hiirien erikoistuneissa soluissa voidaan tämän jälkeen säädellä antamalla hiirelle raskasmetallien ioneja. Palmiter et ai. julkaisevat samoin plasmidit, jotka sisältävät rotan kasvuhormoniin yhteensulautetun hiiren MT-1-promoottorin, näiden plasmidien mikroinjektoimisen hiirisikiöihin sekä tuloksena olevan yhteensulautetun polypeptidituotteen geneettisen ilmentymisen säätelyn raskasmetalleja antamalla.

ie 95G45 Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-vektoriin, joka käsittää PreSi-PreSj-S-proteiinia koodaavan alueen sekä hiiren metallotioneiini (MMT) -promoottorin. On suotavaa, että tämä vektori käsittää lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan sekä valikoinnin merkitsimen.

Tämä keksintö kohdistuu samoin isäntänä toimivaan tran-fektoituun nisäkässoluun, joka on transfektoitu PreS^ PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen ja MMT-promoottorin käsittävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. On suositeltavaa, että tähän vektoriin sisältyy lisäksi kopioitumisen päättymiskohta sekä valikoinnin merkitsin. Keksintö kohdistuu lisäksi menetelmään tällaisen tranfektoidun, isäntänä toimivan solun valmistamiseksi, joka menetelmä käsittä solun transfektoimisen tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävien partik-keleiden valmistamiseksi siten, että vähintään yksi tällaisista proteiineista vastaa koko PreS,-PreS2-S-proteii-nin koodaavien alueiden koodaamaa polypeptidiä, tämän : menetelmän käsittäessä (a) tämän keksinnön mukaisen, transfektoidun tai kotransfektoidun isäntäsolun viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että isäntäsolu kykenee ilmentämään tämän partikkelin; ja (b) tämän partikkelin eristämisen. Transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään näiksi ; partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit kasvualustaan.

Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelyaluetaan, mikä edistää proteiinien ilmentymistä.

17 95045 Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-konkatameeriin, joka käsittää vektorin, joka käsittää hepatitis B-viruksen PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä toisen vektorin, joka käsittää hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai S-prote-iinin koodaavan alueen; sekä MMT-promoottorin. Tällainen konkatameeri käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen sekä kopioitumisen päättymiskohdan. Tällaisia konkatameereja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla.

Tämä keksintö kohdistuu samoin tämän keksinnön mukaisella konkatameerilla transfektoituun, isäntänä toimivaan nisäkässoluun. Lisäksi tämä keksintö kohdistuu menetelmään tällaisen transfektoidun isäntäsolun valmistamiseksi keksinnön mukaisella konkatameerilla, joka menetelmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen keksinnön > i« mukaisella konkatameerilla.

Kuva 1 esittää plasmidin pBPV342-12 osittaista restriktio-endonukleaaseilla saatua karttaa. Kuvassa 1 esitetään myös plasmidista pML2 peräisin olevan DNA:n, naudan papillooma-·.· viruksen (BPV) DNA:n, MMT-promoottorin ja kopioinnin päät- tymisalueen sv-PAS-t sijainti plasmidissa pBPV342-12. Kuva 1 esittää samoin plasmidin pBPV342-12 pilkkomista restrik-tioendonukleaasilla BamHI.

Kuva 2 esittää hepatitis B-viruksen täydellisen, lineaari-" sessa muodossa olevan genomin sisältävän plasmidin pAOl osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa.

ie 95045

Samoin, kuva 2 havainnollistaa plasmidin pA01 pilkkomista restriktioendonukleaasilla EcoRI, entsyymillä EcoRI saadun lineaarisen HBV-tuotteen ligatoimista T4 DNA-ligaasilla konkatameerien muodostamiseksi ja saadun konkatameeri-tuotteen pilkkomista restriktioendonukleaasilla Bglll spesifisen DNA-kappaleen aikaansaamiseksi, joka DNA-kappale sisältää PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavan alueeseen liittyvän vahingoittumattoman koodaavan DNA-ketjun.

Kuva 3 esittää plasmidin pDM1 osittaista, restriktioendo-nukleaaseilla saatua karttaa ja se havainnollistaa samoin sen muodostamista ligatoimalla plasmidin pMMT-neo käsittävä, entsyymillä BamHI saatu DNA-kappale entsyymillä Bglll saatuun, hepatitis B -viruksen genomiseen kappaleeseen, joka koodaa PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavaa ketjua.

Kuvat 4A ja 4B esittävät plasmidin pDM2 osittaista, restrik-tioendonukleaaseilla saatua karttaa, ja niissä havainnollistetaan sen muodostamista ligatoimalla restriktioendonukleaasilla BamHI saatu kappale ja restriktioendonukle-aaseilla BamHI ja Bglll saatu kappale, molemmat plasmi-dista pDM1.

' Kuva 5 esittää plasmidin pDM3 osittaista, restriktio- endonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista plasmideista pDM1 ja PMMT-neo.

Kuva 6 on graafinen esitys, joka havainnollistaa tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden eluoitumista BioRad- *: kolonnista A5m.

19 95045

Kuva 7 on graafinen esitys tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tyypillisestä isopyknisestä CsCl-sentri-fugoinnista, lähtien noin 30 fraktiosta, jotka ovat peräisin BioRad-kolonnista A5m saadusta ensimmäisestä piikistä.

Kuvat 8A, 8b ja 8C ovat käyriä, jotka havainnollistavat seropositiivista muuntumista, jonka tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden erilaiset laimennokset indusoivat hiirissä.

Kuvat 9A ja 9B esittävät plasmidin pENDO-1 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja niissä havainnollistetaan sen monivaiheista muodostamista.

Kuva 10 esittää plasmidin pENDO-2 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnolliste-/' taan sen muodostamista ligatoimalla plasmideista pENDO-1 ja pDM2 restriktioendonukleaaseilla saatuja DNA-kappaleita.

Kuva 11 esittää plasmidin pENDO-Q osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa, ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista.

Käsitteellä "PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaava alue" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS.]-PreS2_s-P°lypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metionii-nin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämis-kodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä vaan joka saa aikaan luennan päättymisen tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS^-PreS2~S-polypeptidi (389 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw esimerkiksi), PreS2-S-polypeptidi (281 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi) sekä 20 95045 S-polypeptidi (226 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreS-j-PreS2-S -proteiinia koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaa-van alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen PreS^-PreS2~S -proteiinin koo-daavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut, sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat tällaisen koodaavan alueen muuntamiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat esimerkiksi käsittely kemiallisella tai biologisella mutageenilla, . säteilyttäminen tai suora geneettinen manipulointi, kuten • nukleiinihappojen istuttaminen, hävittäminen tai korvaa minen entsyymejä tai muita yhdistelmä-DNA-tekniikan ja molekyylibiologian menetelmiä käyttäen.

Käsitteellä "PreS2“S -proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS2-S-polypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä, ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodo-nista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esitetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä ta-·· hansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS2-S-polypeptidi (218 aminohappo jäännöstä HBV-alatyypissä adw) ja S-polypeptidi (226 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreS2~S -proteiinin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdan 21 95045 naista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen Pres2~S-prote-iinin koodaavan alueen kodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Tällaisia johdannaisia ovat esimerkiksi PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen osittaiset ketjut, sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla, ja eräitä näistä on kuvattu edellä.

Käsitteellä "S-proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa S-poly-peptidinä tunnettua koko polypeptidiä, ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esi-·' tetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toi minnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi S-peptidi (226 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat S-proteii-nin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista HBV-ala-tyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat esimerkiksi S-proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla, ja eräitä niistä on kuvattu edellä.

22 95045 Käsitteellä "promoottori" tarkoitetaan DNA-molekyyIissä geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa DNA-ketjua, joka ohjaa isäntäsolun asianmukaisen RNA-polymeraasikomp-leksin kiinnittymistä DNA-molekyyliin, tiettyyn kohtaan tässä DNA-molekyylissä siten, että RNA-polymeraasikomp-leksi sijoittuu oikealla tavalla geenin kopioitumisen aloittamiseksi tietystä pisteestä DNA-molekyylissä, mikä johtaa yhden DNA-juosteen RNA-kopion synteesiin.

Käsitteellä "kopioituminen" tarkoitetaan isäntäsolun bio-synteesimekanismin, RNA-polymeraasikompleksit mukaan lukien, suorittamaa prosessia, jossa, yhtä kahdesta toisiaan täydentävästä DNA-juosteesta mallina käyttäen, ribonukleo-tidit polymeroituvat peräkkäin, suunnassa 5' - 3' (suunnassa 3' - 5' mallina toimivan DNA-juosteen suhteen), jolloin saadaan tämän yhden DNA-juosteen täsmällinen kopio, joka kuitenkin sisältää ribonukleotidejä deoksiribonukleo-tidien asemasta.

Käsitteellä "kopioitumisen päättävä ketju" tarkoitetaan DNA-molekyyIin sitä aluetta, josta käytetään merkintää t, joka alue antaa kopiointiprosessiin osallistuvalle RNA-polymeraasikompleksille signaalin tämän kopioimis-prosessin päättämiseksi, jolloin saatua RNA-molekyyliä voidaan jatkokäsitellä asianmukaisesti, mikä käsittää esimerkiksi polyadenylaation ja kuljettamisen niiden RNA-molekyylien tapauksessa, joita RNA-molekyylejä on tarkoitus käyttää lähetti-RNA-molekyyleinä isäntäsolun sytoplasmassa.

• Käsitteellä "polyadenylaatio" tarkoitetaan prosessia, jossa isäntäsolun biosynteesikoneisto tunnistaa RNA-molekyylistä erityisen ketjun, tavallisesti 51-AATAAA-3', jota nimitetään polyadenylaation signaaliksi, PAS, ja se ohjaa malliin perustumattoman polyriboadenylaattiryhmän liittämistä mainitun molekyylin 3'-päähän, noin 15-20 nukleotidiä sig - 95045 23 naalista alavirtaan (3'-pään suunnassa), tämän liittämisen tapahtuessa erityisesti entsyymillä poly-A-polymeraasi.

Käsitteellä "valikoinnin merkitsin" tarkoitetaan geeni-determinanttia, joka solussa ilmentyessään saa soluun aikaan tiettyjä ominaisuuksia, joiden avulla tällainen solu on tunnistettavissa tai valikoitavissa muista soluista, jotka eivät sisällä tai ilmennä mainittua geenidetermi-nanttia.

Edullisia valikoinnin merkitsimiä ovat esimerkiksi lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvat merkitsimet. Käsitteellä "lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin" tarkoitetaan valikoinnin merkitsimien erityistä luokkaa, joka solun ilmentäessä tällaista merkitsintä saa aikaan sen, että solu kykenee vastustamaan sellaisen lääkeaineen tai antibiootin tappavia vaikutuksia, jotka lääkeaineet tai antibiootit tavallisesti salpaavat solun kasvun tai tappavat so-lun, mikäli se ei käsitä tai ilmennä mainittua lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvaa merkitsintä.

Edullisia lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvia merkitsimiä ovat esimerkiksi neomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin, neo, koodaava ketju; Eco-gpt -geenin (Mulligan, R.C. ja Berg, P., Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980) koodaava ketju: dihydrofolaattireduktaasi(DHFR)- geenin koodaava ketju (Ringold, G. et ai., J. of Molec. and Appld. Genet., Voi. 1, sivu 165, 1981).

Käsitteellä "partikkelit, jotka käsittävät vähintään yhden, koko PreS^-PreS2-S -proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin" tarkoitetaan hepatitis B-partikkelia, joka ei sisällä lainkaan nukleiinihappoa ja joka on muodostunut kasautumalla koko PreS^-, PreS2~ ja S-alueella transfek-toidun eukarioottisen solun viljelmän hajotteeseen (ly-saatti) tai hajotteesta, tällaisen partikkelin sisältäessä 24 95045 pääasiallisesti S-polypeptidistä (dimeeri) muodostuneita alayksiköitä, jotka ovat myös muodostuneet pienemmistä määristä koko PreS^-PreS2~S-polypeptidiä, valinnaisesti, PreS2-S-polypeptidiä.

Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-vektoriin, joka käsittää PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi (hepatitis B -viruksen promoottori) tai hepatitis B -viruksen promoottorin tilalle. MMT-vektori sijoitetaan DNA-vektorissa mieluiten välittömästi ylävirran puolelle PreS.|-PreS2~S-proteiinin koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään samoin kopioitumisen päättämisketjun sekä valikoinnin merkitsimen. Tällainen valikoinnin merkitsin on mieluiten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Täi- 9 lainen kopioitumisen päättämisketju on mielellään SV40-vi-ruksen päättämiskohta (sv-PAs-t) tai mieluummin DEF-alue (mg-PAS-t) hiiren globiinigeenistä. SV40-päättämisketju on alalla hyvin tunnettu ja se kuvataan monissa julkaisuissa, kuten Mulligan ja Berg, Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980. Hiiren globiinigeenin DEF-alue kuvataan julkaisussa Falck-Pederson et ai., Cell, Voi. 40, sivu 897, 1985. Tällainen vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t -aluetta käyttäen, tämä vektori ei sisällä lainkaan virus-DNA:n kappaleita ja se ei ole onkogeeninen eli se ei transformoi *- (tee syöpää aiheuttavaksi) yhtäkään isäntäsolua, johon se on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isäntään, mikäli se ei sisällä autonomista replikaatio-ketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan tällä vektorilla transfektoidussa isännässä, niin se yhtenäistyy isän-täkromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa.

„ 95045 25 Tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektori11a tulisi mielellään olla seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) PreS^-PreS2-S -proteiinin koodaava alue; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavasta alueesta; 3) tämän vektorin tulisi kyetä replikoitumaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on transformoitu, kasvamiseksi, monistumiseksi sekä yhdistelmävek-torin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäisen tai muun prokarioot-tisen replikonin eli DNA-kappaleen, joka sisältää ne kaikki toiminnot, joita tarvitaan autonomiseen replikoitu-miseen sekä vektorin ylläpitämiseen kromosomien ulkopuolella isäntänä toimivassa prokarioottisessa solussa, kuten isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja; * 4) vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen helppo geneettinen ja molekyylibiologinen manipuloiminen olisi mahdollista; 5) vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva: merkitsin tällä vektorilla transformoiduissa isäntänä toimivissa bakteerisoluissa käyttöä varten; 6) vektorin tulisi käsittää toinenkin valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin, tällä vektorilla transfek-toiduissa eukarioottisissa isäntäsoluissa sellaisenaan . . käytettäväksi; 7) vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restriktiokohtia kloonaamista varten; 8) vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättämisketju ja polyadenylaation ketju.

Tämän keksinnön mukainen vektori ei mieluiten käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia) , joka kykenee toimimaan tällä 26 95045 vektorilla transfektoidussa, eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy siihen, että eukarioottisissa isäntä-soluissa käytetään replikoituina tonta vektori järjestelmää, on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuoliseen replikoitu-miseen isäntänä toimivassa, eukarioottisessa, tällaisella vektorilla transfektoidussa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista saatuja replikoneja. On toivottavaa, että farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja koodaavien DNA-ketjujen ilmentämiseen käytetään vektoreita, joiden käsittämä DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista.

Tämän keksinnön mukainen vektori käsittää MMT-promoottorin. MMT-promoottori ei ole virusperäinen, ja se on voimakas kopioitumisen promoottori. MMT-promoottorin koodaava ketju esitetään julkaisussa Pavlakis ja Hamer, Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 11, sivu 397, 1983. MMT-promoottoria voidaan säätää raskasmetallien ioneilla, kuten sinkin ja kadmiumin ioneilla sekä steroidihormoneilla kuten deksametasonilla. Tällainen säätely on hyvin tunnettua (katso esimerkiksi julkaisu Yagle ja Palmiter, Molecular and Cellular Biol., Voi. 5, sivu 291, 1985).

Tämä keksintö kohdistuu myös transfektoituun eukarioottiseen isäntäsoluun, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tämä isäntä on mielellään nisäkässolu, mieluiten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) solulinja, verosolulinja, L-solulinja tai hiirestä tai rotasta saatu fibrcblastinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan valmistaa transfektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla käyttäen tavanomaisia tekniikoita, kuten esimerkiksi menetelmää, joka esitetään julkaisussa Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, tai Wigler, M. Cell, Voi. 14, sivu 725, 1978.

27 95045 Tämä keksintö kohdistuu samoin tällä menetelmällä valmistettuihin partikkeleihin. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu erittää keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetut partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljely-alustasta proteiinien eristämiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin tällöin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseksi tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Nämä partikkelit saadaan glykolysoituneina, ja ne muodostavat PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista, käsittäen vähintään yhden koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja, PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia partikkeleita voidaan käyttää diagnostisena välineenä HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiinissa olevia PreSj-PreS2-S-alueita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi tietystä näytteestä. PreS,-PreS2-S-polypeptidiä sisältäviä partikkeleita absorboidaan kiinteään substraattiin, jonka ·.! pinnalla on sitoutumiskohtia, esim. polystyreenihelmien pinnalle. Tämän jälkeen substraatti saatetaan kosketuksiin erään aineen, esim. gelatiinin, BSA:n tai maitojauheen kanssa substraatin pinnalla olevien epäspesifisten sitoutumiskohtien kyllästämiseksi. Tämän jälkeen substraatti pestään puskuroidulla liuoksella ja sitten puskuri poiste- i 1 taan. Substraattiin lisätään eläimen seerumilla laimennet tu näyte, esim. ihmisseerumin näyte. Tuloksena saatua massaa inkuboidaan ja se pestään. Tämän jälkeen massaan lisätään ihmisen IgGrtä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, 28 9 5 0 4 5 radioaktiivisesti merkittyjä, esim. jodattuja (125I) vasta-aineita. Tuloksena olevaa massaa inkuboidaan, ja sitten se pestään ja lasketaan, esim. gammalaskurilla. Mikäli laskurilla saatu tulos on suurempi kuin vertailuna toimineesta normaalista seerumista gammalaskurilla saatu tulos, niin tällöin näyte sisältää HBV-viruksen PreS1-PreS2-S-koodaavia alueita vastaan vaikuttavia vasta-aineita.

Oletetaan, että edellä esitettyä toimenpidesarjaa HBV-viruksen PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi voidaan käyttää diagnostisena välineenä, jolla voidaan ilmaista hepatitis B-viruksen aiheuttama infektio.

Diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti HBV-ge-nomissa olevien PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamien antigeenien toteamiseksi testattavasta näytteestä voi käsittää seuraavat komponentit: 1. tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa HBV-viruksen pinnan antigeenipartikkeleissa olevia PreS,-PreS2-S-alueita vastaavia aminohappoketjuja käsittävää partikkelia vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla pinnoitettu kiinteä substraatti; 2. proteiinia sisältävä liuos tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 3. tietty määrä radioaktiivisesti merkittyä vasta-ainetta, esim. HBV-viruksen pinnan antigeenipolypeptidejä vastaan vaikuttavaa vasta-ainetta.

29 - 95045

Toinen diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti hepatitis B-viruksen genomissa olevan PreSj-PreSj-S-prote-iinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteamiseksi testattavasta näytteestä käsittää seuraavat komponentit: 1. kiinteä substraatti, jonka pinnalle on adsorboitu tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuihin HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiineihin liittyviä PreS^ PreS2-S-proteiinin koodaavia alueita vastaavia aminohappo-ketjuja sisältäviä partikkeleita, ja tämä substraatti käsitellään proteiinia sisältävällä liuoksella tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien epäspesifisten proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 2. tietty määrä ihmisen IgG:tä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, radioaktiivisesti merkittyjä vasta-aineita.

« · '

Edellä kuvatuissa reagenssikiteissä käytettävät, radioaktiivisesti merkityt vasta-aineet voidaan pakata liuoksen muotoon tai lyofilisoituun muotoon, joka voidaan palauttaa alkuperäiseen muotoonsa. Tämän lisäksi entsyymiin kytke-·. tyillä tai fluoresoivasti merkityillä vasta-aineilla voi daan korvata kuvatut radioaktiivisesti merkityt vasta-aineet .

Edellä kuvattua reagenssikittiä ja toimenpidesaarjaa hepatitis B-viruksen PreSi-PreSj-S-koodaavaa aluetta vastaavia " polypeptidejä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteami seksi voidaan käyttää hyväksi eräissä sovellutuksissa, 95045 kuten määritettäessä HBV-infektio potilaasta ottamalla potilaasta seerumia ja käyttämällä edellä kuvattua koetta tai edellä kuvattua reagenssikittiä; ja ennustettaessa mahdollisuus parantua HBV-infektiosta ottamalla seerumia infektoidusta potilaasta ja käyttämällä kuvattuja toimenpiteitä vasta-aineen ilmaisemiseksi.

Koetoimenpiteitä ja reagenssikittejä vasta-aineen ilmaisemiseksi voidaan käyttää eri HBV-rokotteiden kvalitatiiviseen vertailuun siten, että rokotetuista potilaista otetaan seerumia, jonka jälkeen käytetään edellä kuvattuja koetoimenpiteitä tai kittejä vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään tätä antigeeniä reagenssina, voidaan suorittaa käyttäen tämän keksinnön mukaisia, PreS.j-, PreS2~ tai S-pro-teiinia sisältäviä partikkeleita. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään vasta-ainetta sisältävää seerumia tai reagensseja, voidaan toteuttaa käyttäen vasta-aineseerumia, joka on tuotettu käyttämällä tämän keksinnön mukaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tuotettua peptidiä. Näihin immunologisiin kokeisiin kuuluvat kaikki ne kokeet, jotka Langone ja Van Vunakis esittävät teoksessa Methods of Enzymology, Academic Press,

Voi. 70, 73 ja 74. Ne kokeet, jotka esitetään seuraavissa US-patenttijulkaisuissa:4 459 359, 4 343 896, 4 331 761, 4 292 403, 4 228 240, 4 157 280, 4 152 411, 4 169 012, 4 016 043, 3 839 153, 3 654 090 ja Re 31 006 sekä teoksen Methods of Enzymology volyymeissa 70, 73 ja 74, liitetään oheen tällä viittauksella.

Tämä keksintö kohdistuu samoin yhteistransfektoituun euka-rioottiseen isäntäsoluun, joka on transfektoitu sekä tämän 31 95045 keksinnön mukaisella yhdistelmävektorilla että toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2-S-prote-iinin koodaavan alueen, tai pelkästään S-proteiinin koo-daavan alueen, sekä MMT-promoottorin. Tämä toinen yhdis-telmävektori käsitää mielellään lisäksi kopioitumisen päät-tymiskohdan ja valinnaisesti valikoinnin merkitsimen. Valinnaisesti, tämä yhteistransfektoitu isäntä on transfek-toitu sekä tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla että kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää MMT-promoottorin ja valikoinnin merkitsimen. Tämä kolmas yhdis-telmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan. Toinen ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori sisältävät mielellään myös replikonin, joka mahdollistaa kasvun ja monistumisen prokarioottisessa isäntäsolussa, kuten bakteerin muodostamassa isäntäsolussa, kun tällainen isäntä transformoidaan mainitulla toisella . tai valinnaisella kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla.

Tämä keksintö kohdistuu lisäksi menetelmään näiden yhteis-transfektoitujen isäntäsolujen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen sekä tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, edel-. lä kuvatulla toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, että valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla. Toinen ja valinnainen kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla tekniikoilla. Mikäli valinnaista kolmatta vektoria ei käytetä, niin toinen yhdistelmä-DNA-vektori käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen, kuten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen. Mikäli toinen ja/tai valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori käsittää kopioitumisen päättymiskohdan, niin tämä kohta on mielellään mg-PAS-t-päättymiskohta. Edellä kuvatussa toisessa yhdis-telmä-DNA-vektorissa MMT-promoottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella PreS2~ S-proteiinin koodaavasta alueesta. Edellä kuvatussa va- - 95045 32 linnaisessa kolmannessa yhdistelmä-DNA-vektorissa MMT-promoottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella valikoinnin merkitsimestä.

On suotavaa, ettei edellä kuvattu toinen yhdistelmävektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori sisällä lainkaan virus-DNA-kappaleita, jotka eivät ole peräisin HBV-vi-ruksesta, ja että nämä yhdistelmävektorit eivät ole onko-geenisiä. Näin ollen, kun nämä edulliset vektorit transfek-toidaan isäntään, ne yhdentyvät isännän kromosomiin ja replikoituvat passiivisesti yhdessä isäntägenomin kanssa.

Tämän keksinnön mukainen vektori, edellä kuvattu toinen yhdistelmä-DNA-vektori sekä valinnaisesti kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan yhdessä eukarioottiseen isäntään pareittaisina yhdistelminä, tai kaikki kolme vektoria yhdessä, tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Vaihtoehtoisesti, tämän keksinnön mukainen vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnaisesti kolmas yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan eukarioottiseen isäntään eri vaiheissa. Tämän keksinnön mukainen vektori transfektoidaan ensin eukarioottiseen isäntään tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntä. Tämän jälkeen tämä transfektoitu isäntä transfektoidaan toisella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla, ja valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vekto-rilla, tavanomaisia menetelmiä käyttäen, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen yhteistransfektoitu isäntä.

Tämän keksinnön mukainen vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori käsittävät kukin valikoinnin merkitsimen, jotka poikkeavat toisistaan, jolloin uuden transfektoidun isännän tunnistaminen kussakin peräkkäisessä, lopulliseen, tämän keksinnön mukaiseen transfektoituun isäntään johtavassa transfektointivaiheessa on mahdollista. Tällaiset sekun- 33 95045 dääriset transfektointivaiheet toteutetaan moninkertaisesti transfektoidun isäntäsolun käsittämän PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi. On edullista, ettei toinen yhdistelmävektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori käsitä repiikonia, joka kykenee toimimaan eukarioottisessa solussa.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään tämän keksinnön yh-teistransfektoidun isännän tuottaman partikkelin valmistamiseksi, joka partikkeli käsittää vähintään yhden, koko PreSj-PreSj- S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin, tämän menetelmän käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisen yhteistransfek-toidun eukarioottisen isäntäsolun viljelemisen sellaisissa viljelysalue tässä vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja; ja b) tämän partikkelin eristämisen. Tällainen yhteistransfektoitu isäntä kykenee mielellään erittämään nämä tällaiseksi partikkeliksi kasautuneet proteiinit alustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelysalustaan, mikä edistää yhteistransformoitujen vektoreiden sisältämän PreSt-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen ilmentymistä. Mieluiten käytetään raskasmetallien ioneja, erityisesti sinkin tai kadmiumin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonien optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisin menetelmin. Tämä keksintö kohdistuu samoin tällä menetelmällä valmistettuihin partikkeleihin. Mikäli tämän keksinnön mukainen yhteistransfektoitu isäntä erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää tämän keksinnön mukaisen yhteis-transformoidun isännän viljelyalustasta tekniikoilla, joita käytetään tavanomaisesti proteiinien eristämiseen. Mikäli yh-** teistransfektoitu isäntä ei eritä näitä partikkeleita viljely- alustaan, niin tällöin ne saadaan tämän yhteistransfektoidun isännän viljelmän hajotteesta tavanomaisilla viljelmän hajotus-tekniikoilla. Nämä partikkelit eristetään glykosyloituneessa muodossa, ja ne muodostuvat PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen sekä S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista.

34 95045

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Ensimmäinen edullinen suoritusmuoto

Ensimmäisessä edullisessa suoritusmuodossa yksi tämän keksinnön mukainen vektori käsittää vektorimuodosteen, joka sisältää gee-niketjut yhdistelmäplasmideista pBPV342-12 (Law et ai., Molecular and Cellular Biol., Voi. 3, sivu 2110, 1983) sekä pfiOI (Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca. Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980). Eräitä näistä plasmideista peräisin olevia geneettisiä elementtejä on yhdistetty tämän keksinnön mukaisen vektorin, josta käytetään lyhennettä pDMl, aikaansaamiseksi (katso kuva 3). Plasmidi pDMl, jonka sisältämä geenisegmentti käsittää PreSi-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen mainittuun proteiinin koodaavaan alueeseen liittyvän luonnollisen promoottorijärjesteitään säätelyn alaisena, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, MMT-promoottorin ja SV40-viruksen PAS-t-toiminnon, viedään tämän jälkeen transfektoimalla mihin tahansa yhteen lukuisista eukarioottisista soluista, kuten nisäkässoluista, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ilmentämiseksi suurina määrinä ja mielellään niiden erittämiseksi.

Plasmidi pBPV342-12 (katso kuva 1) sisältää geeniketjut, jotka käsittävät MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, S40-viruksen PAS-t-toiminnon ja naudan papilloomaviruksen (BPV) genomin. Plasmidin pDMl muodostamisen aikana plasmidi pBPV342-12 pilkotaan entsyymillä BamHI, minkä seurauksena plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi. Nämä kappaleet erotetaan, minkä jälkeen 7,95 kiloemäsparin (kb) kappale, joka käsittää koko BPV-genomin, heitetään pois. BPV DNA:n eliminointi on erittäin edullista, sillä siten vältetään BPV DNA:n tai BPV-proteiinien sisältyminen tämän keksinnön mukaiseen partikkeliin, jota on tarkoitus käyttää rokotevalmisteessa. Jäljellä oleva BamHI-kap-pale (6,65 kb) plasmidista pBPV342-12, joka kappale sisältää MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja SV40-vi-ruksen PAS-t-alueen geeniketjut, ligatoidaan tämän jälkeen tavanomaisia tekniikoita käyttäen plasmidista pAOI saatuun DNA-ketjuun, joka kuitenkin sisältää vahingoittumattoman PreS,-PreS2-S-proteiinin koodavan alueen (tarkasteltu jäljempänä; katso myös kuvaa 2).

35 9 5 0 4 5

Plasmidi pAOI (katso kuva 2), joka sisältää koko hepatitis B-viruksen genomin, pilkotaan entsyymillä EcoRI, jolloin saadaan 3,2 kiloemäsparin kappale. Tämä 3,2 kiloemäsparin kappale ligatoidaan itseensä peräkkäisten toisintojen muodostamiseksi, jotka toisinnot käsittävät sekä hepatitis B-viruksen ytimen että pinnan antigeenejä koodaavia geeni-ketjuja sisältävän, pitkän konkatameerisen DNA-rakenteen.

Tämä menetelmä hepatitis B-viruksen geeniketjujen tällaiseksi manipuloimiseksi, joka on välttämätöntä plasmidiin pAOI toteutetun molekulaarisen kloonaamisen aiheuttaman permutaation välttämiseksi sekä toiminnallisen järjestäytymisen palauttamiseksi PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen suhteen, esitetään julkaisussa Cummings et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Tämän jälkeen toteutetaan pilkkominen entsyymillä Bglll, jolloin HBV-viruksen ytimen antigeenin geenisegmentti saadaan eliminoiduksi, ja tällöin jäljelle jää DNA-kappale (2,78 kb), joka käsittää hepatitis B-virusgenomista PreS.j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sekä tämän alueen luonnollisen promoottorijärjestelmän (PHB)· Tämän jälkeen lineaarinen, plasmidista pBPV342-12 saatu BamHI-kappale (katso kuva 1) ja plasmidista pAOI saatu Bglll-kappale (katso kuva 2) ligatoidaan yhdistelmäplasmi-din pDM1 (katso kuva 3) aikaansaamiseksi, joka yhdistelmä-plasmidi käsittää PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen luonnollisen promoottorin (PHB)·

Toinen edullinen suoritusmuoto Tämän keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa plas-midissa pDM1 oleva luonnollinen promoottori irrotetaan pilkkomalla entsyymeillä Bglll ja BamHI siten, että MMT-pronoottori sijoittuu suoraan ennen PreS^ -S-proteiinin koodaavaa aluetta, jolloin MMT-promoottori säätelee mainitun koodaavan alueen kopioitumista. Entsyymeillä BamHI ja Bglll pilkkomisen jälkeen saadaan kolme erillistä DNA- 36 - 9 5 0 4 5 kappaletta (katso kuvat 4A ja 4B): 1) 5,1 kiloemäsparin kappale, joka sisältää polyadeny-laatiokohdan ja MMT-promoottorin; 2) 3,0 kiloemäsparin kappale, joka sisältää neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja luonnollisen promoottorin; ja 3) 1,4 kiloemäsparin kappale, joka sisältää PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen.

Puhdistamisen jälkeen 5,1 ja 1,4 kiloemäsparin kappaleet ligatoidaan tavanomaisilla tekniikoilla, jolloin saadaan yhdistelmäplasmideja (6,46 kb), jotka sisältävät PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, nyt kuitenkin MMT-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Koska näiden kahden ligatoidun kappaleen suhteelliset suuntautumiset ovat satunnaisia, ja koska syntyy kaksi erilaista plasmidityyppiä, joista ainoastaan toinen on suuntautunut oikealla tavalla kopi-ointivaiheen luentaa ajatellen, alkaen MMT-promoottorista ja jatkuen pinnan antigeenien geeniketjuihin, niin oikea toiminnallinen plasmidi pDM2 varmistetaan pilkkomalla puhdistetut, kyseeseen tulevat plasmidit entsyymeillä EcoRI ja Xbal. Oikealla tavalla suuntautuneesta plasmi-dista saadaan tällä tavalla pilkkoen 2,1 kiloemäsparin ja 4,4 kiloemäsparin suuruinen kappale.

Plasmidin pDM2 sisältävä bakteerikanta HB101 talletettiin kantakokoelmaan Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Göttingen, tunnusnumerolla DSM 3285, huhtikuun 4. päivänä 1985. Lisäksi talletettiin muita mikro-organismeja, mm. mikro-organismi pMMT-neoplasmidi, joka sisältää PreS^-PreS2~S-proteiinia koodaavan DNA-ketjun, talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,

Maryland 11.4.1986 seuraavilla talletusnumeroilla: pBR322.G2 — 44 67073 POLINK 23456 — 44 67072 pBlg/2.8 — 44 67075 pMMT-neoplasmidi — 44 67074.

Il 95045

Kolmas edullinen suoritusmiioto

Kolmannessa edullisessa suoritusmuodossa MMT-promoottori jatkostetaan PreS-j-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään HBV-geenisegmenttiin siten, että luonnollinen promoottorijärjestelmä eliminoituu ja että mainittu koo-daava ketju saadaan MMT-promoottorin suoran säätelyn alaisuuteen (katso kuva 9).

Neljäs edullinen suoritusmuoto

Neljännessä edullisessa suoritusmuodossa plasmidista pBR322.G2 saadulla hiiren globiinigeenin mg-PAS-t-segmentillä, joka toimii polyadenylaation päättymissignaalina (PAS-t), korvataan SV4 0-viruksesta saatu PAS-t-alue. mg-PAS- t-segmen-tillä korvaamisella saadaan aikaan DNA-siirtovektoreita, jotka eivät käsitä lainkaan muista kuin HPV-viruksesta peräisin olevia genomisia osia (katso kuvat 9, 10 ja 11).

Viides edullinen suoritusmuoto

Viides edullinen suoritusmuoto on menetelmä plasmidi-DNA:n sekakonkatameerien valmistamiseksi, geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi ligatoimalla PreS^-PreS2~S-, PreS2-S-tai S-proteiinin koodaavaa aluetta koodaavia geenimuodos-teita sisältäviä plasmideja suuria määriä plasmideihin, jotka sisältävät lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen, ja jotka tämän jälkeen transfektoidaan solu-linjoihin.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan yksityiskohtaisemmin tämän keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-vektoreiden, isän-? tien ja partikkeleiden valmistamista sekä sisällyttämistä nisäkkään solulinjaan. Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on pelkästään havainnollistaa keksintöä, ja ne eivät pyri rajoittamaan sitä millään tavalla.

38 - 9 5 0 4 5

Esimerkit

Materiaalit ja menetelmät A. Nisäkässolulinjojen alkuperä ja kuvaus 1. L-solut

Tutkijat K.K. Sanford, W.R. Earle ja G.D. Likely (J. Nat. Cancer Inst., Voi. 9, sivu 229, 1948) saivat aikaan NCTC-kloonin 929 maaliskuussa 1948 lähtökannasta L, jonka tutkija W.R. Earle (J. Nat. Cancer Inst., Voi. 4, sivu 165, 1943) oli muodostanut 1940. Lähtökanta L saatiin 100 vuorokauden ikäisen uroshiiren C3H/An normaalista ihonalaisesta areolaari- ja adipoosi- (rasva-) kudoksesta, ja klooni 929 saatiin lähtökannan 95. aliviljelmän sukupolvesta (kapil-laaritekniikalla yhden ainoan solun eristämiseksi).

Tutkijat D.R. Dubbs ja S. Kit (S. Kit et ai., Exp. Cell Res., Voi. 31, sivut 297-312, 1963; sekä D.R. Dubbs & S. Kit, Exp. Cells Res., Voi 33, sivu 19, 1964) eristivät hiiren L-solujen alilinjan LM(TK”), joka on puutteellinen tymidiinikinaasin suhteen. Se ei kykene kasvamaan alustassa, joka sisältää HAT:ia. Tässä solulinjassa ei ole havaittu HAT-vastustuskyvyn spontaania palautumista, ja vaikuttaa erittäin todennäköiseltä, että siinä on tapahtunut tämän geenin käsittämä häviämä.

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 648; klooni, 553.

Pakastusalusta: Viljelyalusta, 90 % DNSO 10 %; antibioot teja sisältämätön.

Elinkyky: 81-96 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).

Viljelyalusta: DMEM + 10 % FBS (Dulbeccon ja Vogtin muunnettu Eagle-alusta + 10 % FBS).

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka käsittää 6-8 x 10^ solua 5 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan aikaan 95045 500-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kahdesti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,3 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljelmät valmistetaan raaputtamalla tai ravistelemalla. Solut kasvavat myös hyvin muissa alustoissa (Waymouth, Eagle, NCTC 135, jne), joita on täydennetty 10-30 % hevosen seerumia.

Maljauksen tehokkuus: 70 %.

Morfologia: Fibroblastien kaltainen.

Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 100 solua: 2n = 40.

Solut:_2 2 1 4 2 9 4 12 16 17 4 13 2

Kromosomit: 56-58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Solut:_2 2 11_6

Kromosomit: 70 71-76-82-125-241

Sekundäärisen rajoitteen (konstriktio) käsittävä pitkä metasentrinen kromosomi todettiin 77/100 solussa.

Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: Varmistettu hiirestä saaduksi agglutinaation ja ' hemagglutinaation sekakokein.

Virusalttius: Altis pseudorabiesvirukselle ja vesikulaari- selle stomatitisvirukselle (intialainen kanta). Kun soluja viljeltiin edellä esitetyssä viljelyalustassa, niin Herpes simplex B-virus ja vaccinia tuottivat sytopaattisia vaikutuksia vain ensimmäisessä vaiheessa. Alttius tietyille :* viruksille voi vaihdella käytetyn viljelyalustan mukaan.

Ei altis polioviruksen tyypille 1, Coxsackie-viruksen tyypille B-5 eikä polyomavirukselle.

Tuumorigeenisyys: Siirroste, joka käsitti 1x10® solua hiirtä kohden, injektoitiin ihonalaisesti karvattomiin hiiriin. Säteilyttämättömissä hiirissä muodostui 0/25 40 95045 tuumoria. Röntgensäteillä käsitellyissä hiirissä (425 r, koko kehoon) muodostui 11/18 tuumoria (sarkoomia) injektio-kohtaan .

Käänteistranskriptaasi: positiivinen.

Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection/ Rockville,

Maryland.

2. Vero-solut

Vero-solulinjan valmistus aloitettiin normaalin, täysikasvuisen afrikkalaisen marakatin munuaisesta maaliskuun 27. päivänä 1962, ja valmistajina olivat Y. Yasumuar ja Y. Kawakita Chiba-yliopistosta, Chiba, Japani (Nippon,

Rinsho, Voi. 21, sivu 1209, 1963).

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 121.

Pakastusalusta: Olennainen vähimmäisalusta (Eagle), joka käsittää ei-olennaisia aminohappoja ja Earle-BSS, 85 %; sikiöasteisen naudan seerumia, 5 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), 10 %; antibiootteja sisältämätön.

Elinkyky: Suurin piirtein 97 % (kykenemättömyys ottaa vastaan väriä).

Viljelyalusta: DMEM, 5 % FBS.

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka käsittää 3 x 10^ elävää solua 3 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan ' aikaan 30-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kolmasti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,4 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljel-mät valmistetaan trypsinisoimalla.

Maljauksen tehokkuus: Suurin piirtein 24 % edellä mai nitussa viljelyalustassa.

41 95045

Morfologia: Epiteelisten fibroblastien kaltainen.

Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 60.

Solut:_212 2345721 17 22

Kromosomit: 47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: Varmistettu apinasta saaduksi immunofluoresenssi- kokeella.

Virusalttius: Altis polioviruksen tyypille 3, Getah, NNdumu, Pixuna, Ross River, Semliki, Paramaribo, Kokobera, Modoc, Murutucu, Germiston, Guaroa, Pongola ja Tacaribe Arboviruksille. Ei altis Stratford, Apeu, Caraparu, Madrid, Nepuyo ja Ossa Arboviruksille.

Käänteistranskriptaasi: ei todettavissa.

• <

Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland.

3. CHO-KI-solut /· CHO-KI-solut saatiin alikloonina lähtö-CHO-solulinjasta, jonka valmistuksen tutkija T.T. Puck aloitti täysikasvuisen kiinanhamsterin munasarjasta otetusta kudosnäytteestä, vuonna 1957 (J. Exp. Med., Voi. 108, sivu 945, 1958) . CHO-KI-solut tarvitsevat proliinia, ja niiden modaalinen kromosomiluku on 20 (Proc. Nat. Acad. Sei., Voi. 60, sivu 1275, 1968). Näistä soluista puuttuu ilmeisesti se aktiivinen geenimuoto, joka tarvitaan proliinin synteesiin, ja salpautuminen biosynteettisessä ketjussa tapahtuu vaiheessa, jossa glutaamihappo muunnetaan glutaamiseksi gamma-semialdehydiksi. Proliinin omavaraisuuden palautumistoden-näköisyys on 10 ® (Genetics, Voi. 55, sivu 513, 1967).

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: suurin piirtein 400; 7 kantakokoelmassa ATCC.

42 9 5 0 4 5

Pakastusalusta: Viljelyalusta, 92 %; glyseroli, 8 %; antibiootteja sisältämätön.

Elinkyky: Suurin piirtein 90 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).

Viljelyalusta: F-12 -alusta (Ham) 90 %; sikiöasteisen naudan seerumi, 10 %; antibiootteja sisältämätön.

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirroste, joka käsittää 105 elävää solua 1 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa 37 °C:n lämpötilassa lisääntyy 15-20 kertaiseksi 7 vuorokaudessa.

Maljauksen tehokkuus: suurin piirtein 90 % edellä maini tussa viljelyalustassa.

Morfologia: epiteelin kaltainen.

Kariologia: kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 22.

Solut:_2 2 35 3 4 1 1 1 1

Kromosomit: 18 19 20 21 22-24-32-39-42

Steriilisyys: mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: varmistettu kiinanhamsterista saaduksi sytoksisella ·* vasta-aineella, värin vastaanottamattomuuden kokeella ja isoentsyymianalyysillä.

Virusalttius: altis vesikulaariselle stomatitisvirukselle (intialainen kanta) sekä Getah-arbovirukselle. Ei altis polioviruksen tyypille 2, Modoc- ja Button William-arbovi-ruksille.

Käänteistranskriptaasi: ei todettu.

Erityisiä ominaisuuksia: viitesolut tarvitsevat proliinia kasvaakseen.

Myöntäjä: T.T. Puck, Eleanor Roosevelt Institute for

Cancer Research, University of Colorado Medical Center,

Denver, Colorado.

43 95045 4. NIH/3T3-solut NIH/3T3, joka on jatkuva solulinja erittäin kosketusinhi-boiduista soluista, saatiin NIH-sveitsinhiiren sikiövil-jelmistä samalla tavalla kuin alkuperäinen satunnaissii-tetty 3T3 (ATCC CCL 92) sekä sukusiitetty BALB/c3T3 (ATCC CCL 163). Aikaansaadulla NIH/3T3-linjalla toteutettiin enemmän kuin 5 peräkkäistä alikloonausvaihetta sellaisen alikloonin kehittämiseksi, jonka alikloonin morfologiset ominaisuudet sopivat parhaiten transformaatiokokeisiin. Tämän alikloonin varhaisimmat saatavat vaiheet (passage) ovat suurin piirtein 120 vaiheen päässä ensimmäisestä sikiöviljelmästä. NIH/3T3 on erittäin herkkä sarkoomavi-ruksen fokuksen muodostumiselle ja leukemiaviruksen lisääntymiselle, ja se on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi DNA:n transfektiotutkimuksissa. J. Virol., Voi. 4, sivut 549-553, 1969; Cell, Voi. 16, sivut 63-75 sekä 347-356, 1979.

B. Alustat, puskurit ja liuokset 1. Nisäkässolujen viljelmiin a. Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta, joka sisältää runsaasti glukoosia (DMEM).

Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, ja siihen lisätään täydennykseksi: 26 mMNaHC03 2 mM L-glutamiini (Gibco) 1 mM Na-pyruvaatti (Gibco) 60 yg/ml gentamysiiniä tai 100 yksikköä/ml penisil- • .

liiniä +100 yksikköä/ml 1 streptomysiiniä.

b. Hamin F12 Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, johon lisätään täydennykseksi: 1 4 mM Na HC03 60 pg/ml gentamysiiniä 44 95045 c. Solujen pakastamisalusta 90 % (tilavuus/tilavuus) PBS-DMEM 10 % (tilavuus/tilavuus) dimetyylisulfoksidia Pakastusalusta valmistetaan juuri ennen käyttöä. Kaikki alustat steriloidaan suodattamalla 0,45 ja 0,2 mikronin suodattimien läpi (Gilman). Alustojen steriilisyys varmistetaan inkuboimalla antibioottia sisältämättömästä alustasta otettua näytettä 37 °C:n lämpötilassa 1 viikko. Staattisessa viljelmässä käytettävään alustaan lisätään täydennykseksi 10 % FBS. Sikiöasteisen naudan seerumi (FBS) inaktivoidaan lämmöllä 56 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Steriiliä alustaa säilytetään 40 °C:n lämpötilassa ennen käyttöä.

d. Trypsiiniliuos 0,5 g/1 trypsiiniä 0,2 g/1 EDTA (tetranatrium) Hankin tasapainotetussa suolaliuoksessa *

Koska EDTA todettiin toksiseksi Vero-soluille, niin näiden solujen kanssa käytetään EDTA:ta sisältämätöntä trypsiini-liuosta.

e. PBS (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), GIBCO

; 183 mM NaCl 8,6 mM Na2HP04 2,2 mM KH2P04

f. TN E

160 mM NaCl 10 mM Tris, pH 7,5

1 mM EDTA

2. Molekyylibiologisiin tarkoituksiin a. liuokset SDS-PAGE -toimenpiteisiin

Akryyliamidi (varasto): 30 % (paino/paino) akryyliamidia (BioRad) 0,8 % (paino/paino) N1,N-metyleeni-bisakryyliamidia (BioRad) 45 9 5 0 4 5 4 x puskuri erottavaa geeliä varten 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8 0,4 (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaatti (SDS) (Serva) 4 x puskuri väligeeliä varten

0,5 M Tris-Cl, pH 6,8 0,4 (paino/tilavuus) SDS

3 x näytepuskuri 22,3 % (tilavuus/tilavuus) glyserolia 0,03 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä

6,7 (paino/tilavuus) SDS

10 x elektrodipuskuri 0,25 M Tris, pH 8,2

1,90 M glysiini 1 % (paino/tilavuus) SDS

b. Liuokset hopeavärjäyksen toimenpiteisiin

Liuos I 50 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 10 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoa

Liuos II 10 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 5 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoa

Liuos III 10 % glutaraldehydiä

Liuos IV 20 % AgNO^ vedessä (varastoliuos)

Liuos V 3 % (paino/tilavuus) 0,1 % (tilavuus/tilavuus) formaldehydiä c. Liuokset luentaan avoimen fosfodiesterisillan ("nick") kohdalta 10 x reaktiopuskuri

500 mM Tris-Cl, pH 7,2 100 mM MgS04 1 mM DTT

- 95045 46

Nukleotidiseos:

100 mM dGTP 100 mM dATP 100 mM dTTP

10 mM Tris-puskurissa, pH 7,5 d. Hybridisaatiossa käytettävät liuokset 20 x SSC: 3 M NaCl 0,3 M Na2~sitraatti 50 x Denhardtin liuos 1 % (paino/paino) Ficoll 400 (PL-Pharmacia) 1 % (paino/paino) polyvinyylipyrrolidoni (Sigma)

1 % (paino/paino) BSA

Steriloidaan suodattamalla ja säilytetään -20 °C:n lämpötilassa . Esihybridisaatioseos

50 % (tilavuus/tilavuus) formamidia 5 x Denhardtin liuos 5 x SSC

50 mM Na-fosfaatti pH 7,0 . 250 iig/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta

Hybridisaatioseos:

50 % formamidia 5 x SSC

20 mM Na-fosfaatti, pH 7,0 1 x Denhardtin liuos ·’ 100 yg/ml denaturoidun lohen sperman DNA:ta e. Puskurit restriktioentsyymejä varten

Joko valmistajien esittämät puskurit, tai: Vähän suolaa Keskimääräisesti suolaa Runsaasti suolaa sisältävä puskuri sisältävä puskuri sisältävä puskuri

Sma I Bglll BamHI

Hpal PstI PvuI

Xbal EcoRI Sali

Spel BstEII (60 °C) 47 9 5 0 4 5

Restriktiopuskurit: Vähän suolaa Keskimääräisesti Paljon suolaa suolaa

Tris, pH 7,4 10 mM 6,6 mM 6,6 mM

MgCl2 10 6,6 6,6 suolaa 20 (KCl) 60 (NaCl) 150 (NaCl) β-merkaptoetanoli 10 6,6 6,6 f. Alustat 1. L-alusta: 10 g Baktotryptonia 5 g hiivauutetta 10 g NaCl 1 litra vettä 2. L-alustaa sisältävät agarmaljat: L-alustaa, joka sisältää 15 g/1 Difco- agaria 3. L-alusta-amp-agarmaljät: L-alustasta tehty agar, joka sisältää 20-50 yg/ml ampisilliiniä C. Entsyymit

Seuraavia entsyymejä käytetään: 1. Deoksiribonukleaasi I (Worthington) 2. DNA-polymeraasi I ("Klenow-kappale") (Boehringer Mannheim) 3. T4-DNA-ligaasi (Boehringer Mannheim) 4. Restriktioentsyymit:

EcoRI, Xbal, BamHI,. Bglll, BstEII, Spel,

Sali, Hpal, Smal, PvuI, PstI (Boehringer : Mannheim, BRL, New England BioLabs) 5. Lysozyme (SIGMA) 6. Pronaasi 48 95045 D. Analyyttiset ja kvantitatiiviset toimenpiteet 1. Värin sitomiskoe

Kokonaisproteiinipitoisuus tämän keksinnön mukaisten, puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään BioRad-yhtiön proteiinikokeen kittiä käyttäen. Tässä menetelmässä käytetään Bradford-koetta, jossa Coomassie-sinisen sitoutuminen proteiiniin mitataan spektrofotometrisesti. Standardina käytetään ovalbumiinia.

2. Radioimmuunikoe (RIA) 1 25 "Kerrosteenä” (sandwich) toteutettavassa NML RIA I radio-immuunikokeessa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä vastaan vaikuttavalla hiiren vasta-aineella (anti-HBs) pinnoitettuja helmiä inkuboidaan seerumin tai plasman sekä asianmukaisten vertailunäytteiden kanssa. PreS^-PreS2~S-proteii-nin koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävät partikkelit sitoutuvat kiinteän faasin vasta-aineeseen. Si- toutumattoman materiaalin pois imemisen ja helmien pese- 1 25 misen jälkeen ihmisen I-anti-HBs:n annetaan reagoida helmien pinnalla olevan, vasta-aineen ja antigeenin välisen kompleksin kanssa. Tämän jälkeen helmet pestään si-125 toutumattoman I-anti-HBs:n poistamiseksi.

Helmiin jäävä radioaktiivisuus lasketaan gamma-tuikelasku-rilla. Reaktiivisena pidetään niitä näytteitä, joista saatujen sykäysten lukumäärä minuutissa (cpm) on suurempi tai yhtä suuri kuin se erotusarvo (cut off), joka saadaan kertomalla tietyllä tekijällä negatiivisen vertailun keskimää-: räinen sykäysten määrä (NCx).

3. Immuunisaostaminen

Solut kasvatetaan 100 % yhteen T75-pullossa. Tämän jälkeen viljelyalustaksi vaihdetaan 5 ml metioniinia sisältämätöntä —35 — alustaa, joka sisältää 400 yCi L-/ S/-metioniinia ja 400 -35 - ” yCi L-/ S/-kysteiiniä (NEN), ja inkubointia jatketaan koko yön. Alusta väkevöidään 10-kertaiseksi fraktiosaosta- 49 95045 maila polyetyleeniglykolia käyttäen. Väkevöityä proteiinia (noin 10** cpm) inkuboidaan ennen immunointia saadun, marsun seerumin 10 μ-litran kanssa tai marsun anti-HBsAg-see-rumin 1 ja 10 mikrolitran kanssa 50 mikrolitrassa TEN-liu-osta (10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA, 130 mM NaCl), joka käsitti 0,5 % Tween 20 -tuotetta, 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. Immunoglobuliinia sidotaan 20 mikrolitraan proteiinin A ja Sepharose d-4B-geenin (Pharmacia) seosta 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, pestään kerran liuoksella TEN-Tween 20 ja liuoksella, joka käsittää 500 mM LiCl, ja jälleen liuoksella TEN-Tween 20. Näytteet käsitellään elektroforeettisesti jäljempänä kuvattua SDS-PAGE-järjestelmää käyttäen. Geelejä kiinnitetään 60 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 10 % trikloorietikkahappoa, 10 % jääetikkaa ja 30 % metanolia, ja inkuboidaan Enlightning-liuoksessa (NEN) 30 minuuttia. Geelit kuivataan ja auto-radiografoidaan KODAK XAR-5-filmille.

« 4. SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu elektroforeesi (PAGE) Näytteen ja geelin esikäsitteleminen: PAGE-analyysiä varten tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkelinäyttei-den pitoisuus asetetaan arvoon 10 yg/ml. Kustakin näyttees-

* tä otetaan 10 yl, joka sekoitetaan 10 mikrolitraan 1 M DDT

10 % SDS-liuoksessa ja 10 mikrolitraan näytepuskuria. Tätä seosta keitetään 5, 10 tai 15 minuuttia juuri ennen sen laittamista geelille 20 nanometrin partikkeleiden rikkomiseksi ja monomeeristen molekyylien aikaansaamiseksi. Sen jälkeen, kun seokseen on lisätty 10 yl siirtopuskuria (loading buffer), se käsitellään elektroforeettisesti 0,75 mm paksuisessa geeliliuskassa (12 x 18 x 0,1 cm), joka käsitti 12,5 % polyakryyliamidia ja 0,4 % bisakryyli-amidia käyttäen Laemmlin (1970) puskurijärjestelmää sekä arvoja 15 mA ja 100 V 6 tunnin ajan. Proteiinivyöhykkeet tehdään näkyviksi hopealla värjäämällä (katso seuraava, hopealla värjäämistä käsittelevä kappale).

50 95045 5. Hopealla värjääminen PAGE-geeli värjätään hopealla Merrilin et ai. (1981) mukaisesti. Proteiini kiinnitetään geeliin liuoksella, joka käsittää 50 % metanolia ja 10 % etikkahappoa, 30 minuuttia. Geeliä pestään 30 minuuttia liuoksella, joka käsittää 10 % metanolia ja 5 % etikkahappoa. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 10 % glutaraldehydissä 30 minuuttia, sitä pestään ionittomassa vedessä yön yli. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 0,1 % AgNC^-liuoksessa 30 minuuttia, sitä pestään lyhyesti vedessä. Värjätty geeli kehitetään 100 millilitrassa 3 % Na2CC>2-liuosta ja 30 mikrolitrassa formaldehydiä ja kiinnitetään 1 % etikkahapolla. Geeli suljetaan muovipussin sisään ja valokuvataan.

E. Geneettinen manipuloiminen 1. Yhdistelmä-DNA-toimenpiteet a. Puhdistetun DNA:n pilkkominen restriktioendonukleaa-seilla

Toteutetaan kunkin endonukleaasin kohdalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

b. Plasmidi-DNA:n eristäminen 1.1 litra plasmidin sisältäviä soluja kasvatetaan L-alus- * t tässä optiseen tiheyteen ODg0Q0,5, jonka jälkeen viljelmän annetaan laajentua 12-20 tuntia siten, että läsnä on 200 yg/ml kloram fenikoliä.

2. Viljelmä sentrifugoidaan Sorval-sentrifugilla RC5b, nopeudella 8000 rpm 20 minuuttia.

. 3. Solut suspendoidaan uudestaan 18 millilitraan kylmää - ♦ liuosta, joka käsittää 25 % sakkaroosia, 50 mM Tris, pH 8,0.

4. Suspensio siirretään 250 millitran Erlenmeyeriin. Pidetään jäissä.

5. Suspensioon lisätään 6 ml 5 mg/ml lysotsyymiä liuoksessa, joka käsittää 250 mM Tris, pH 8,0, ja annetaan seisoa 10-15 minuuttia.

Il 51 95045 6. Seokseen lisätään 6 ml 250 inM EDTA-liuosta, pH 8,0 ja sekoitetaan varoen; seosta inkuboidaan 15 minuuttia jäissä.

7. Seokseen lisätään 30 ml detergenttiseosta: 0,01 % Triton X-100 60 mM EDTA, pH 8,0 50 mM Tris, pH 8,0.

8. Seosta inkuboidaan 30 minuuttia jäissä.

9. Se sentrifugoidaan nopeudella 25 000 rpm, 4 °C:n lämpötilassa, 90 minuuttia SW28-roottorissa.

10. Supernatanttiin lisätään pronaasia pitoisuudeksi 250 ug/ml, ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa.

11. Supernatantti uutetaan kertaalleen fenolilla, käyttäen 1/2 tilavuudesta fenolia, joka on tasapainotettu TE-liuok-sella (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).

12. Vesikerros poistetaan; natriumasetaattia lisätään pitoisuudeksi 300 mM; 2 tilavuutta kylmää 100 % etanolia 4 ** V lisätään; sekoitetaan huolellisesti. Pidetään -20 C:n lämpötilassa yön yli.

13. Seos sentrifugoidaan ja suspendoidaan 6 millilitraan TE-10 -liuosta (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0).

14. Suspensioon lisätään 9,4 g CsCl:ia ja 0,65 ml etidium-bromidia, jonka pitoisuus on 6 mg/ml; tilavuudeksi saatetaan 10 ml lisäämällä steriiliä, kahdesti tislattua vettä.

15. Liuoksella täytetään Beckman-yhtiön lämmön avulla suljettavat gradienttiputket; niitä sentrifugoidaan nopeudella 48 000 rpm 40 tuntia Ti70.1-Beckman-roottorissa.

16. Plasmidivyöhykkeet tehdään näkyviksi UV-säteillä ja plasmidi-DNA poistetaan ruiskun ja numeron 18 neulan avulla putken seinämän läpi työntämällä.

17. Etidiumbromidi poistetaan plasmidifraktiosta uuttamalla kolmasti peräkkäin yhtä suurilla tilavuuksilla isobutanolia.

18. DNA dialysoidaan yhtä 2 litran suuruista liuoserää vastaan, tämän liuoksen käsittäessä 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,5, 5 mM NaCl, 2 tuntia tai enemmän 4 °C:n lämpötilassa.

52 95045 19. DNA uutetaan kertaalleen fenolilla käyttäen 1/3 tilavuutta fenolia, joka on tasapainotettu edellä kuvatulla TE-liuoksella.

20. DNA:han lisätään NaAc-yhdistettä pitoisuudeksi 300 mM, ja 2 tilavuutta 100 % etanolia; säestetään -20 °C:n lämpötilassa yön yli, tai -70 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia.

c. Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta ("nick")

Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta suoritetaan

Rigby et ai. mukaisesti (J. Mol. Biol. Voi. 113, sivut 32 237-251, 1977). Reaktioseos DNA:n P-merkitsemiseksi sisältää tavallisesti 0,5 yg esimerkiksi plasmidin EcoRI-Xbal-kappaletta kokonaistilavuudessa 30 yl, käsittäen edelleen 50 mM Tris, pH 7,8, 5 mM MgCl9, 10 mM merkaptoetano- Δ 32 lia, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 50 yCi P-dCTP, 10 yksikköä DNA-polymeraasia I, 3 yl pitoisuudeltaan 1 mg/ml -5 olevan DNaasin 2 x 10 -kertaista laimennosta, ja seosta inkuboidaan 90 minuuttia 15 °C:n lämpötilassa, jolloin saa- ♦ 6 7 7 daan yhteensä 3 x 10 - 12 x 10 cpm, eli 1x10 -5x10 cpm/yg DNA.

d. Kykenevien bakteerisolujen transformaatio

Tiheästä, yön aikana muodostuneesta viljelmästä otetaan 1 ml bakteerisolujen suspensiota, joka siirrostetaan 100 millilitraan kasvualustaa (L-alusta). Soluja kasvatetaan 37 °C:n lämpötilassa optiseen tiheyteen OD^q = 0,7, johon päästään 2 tunnissa voimakkaasti ravistellen 500 millilit-ran Erlenmeyer-pulloissa. Kasvu pysäytetään jäähdyttämällä viljelmää jäissä 10 minuuttia. Tästä viljelmästä otetaan . 3 ml, josta eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat bak teerisolut otetaan talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia. Solut suspendoidaan uudestaan 1,5 milli-litraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2"yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0, ja niitä inkuboidaan jälleen jäissä 15 minuuttia. Solut otetaan jälleen talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia, ja ne suspen- 53 95045 doidaan uudestaan 200 mikrolitraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2-yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0 ja pidetään 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tämän jälkeen ligaatioseoksen kokonaistilavuus saatettiin 70 mikrolitraksi liuoksella, joka käsittää 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, ja se lisättiin 200 mikrolitraan bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin.

Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, jonka jälkeen siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C:n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yl ampisilliinia/ml agaria, siten, että maljalle levitettävän solususpension tilavuus oli 50-300 yl. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointijakson jälkeen maljoille oli muodostunut yksit-täisiä, erillisiä bakteeripesäkkeitä.

e. Southernin täpläanalyysi

Jotta saataisiin selville tämän keksinnön mukaisten vektoreiden järjestäytyminen isäntäsolun genomissa, kromosomaa-linen DNA tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista ·, solulinjoista eristetään ja pilkotaan sopivilla restriktio- entsyymeillä, ja analysoidaan Southernin menetelmällä (J.

Mol. Biol., Voi. 98, sivut 503-517, 1975) käyttäen ^2P-mer-kittyä DNA-koetinta. Sen jälkeen, kun kromosomaalinen DNA (20 yg) on pilkottu restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal, niin tuloksena olevat kappaleet erotetaan elektroforeetti-sesti 0,7 % agaroosigeelillä. Tämän jälkeen DNA denaturoidaan käsittelemällä sitä 366 nanometrin UV-säteillä 10 minuuttia, ja inkuboimalla 45 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 0,5 N NaOH ja 1 M NaCl. Geelit neutraloidaan inkuboimalla 60 minuuttia liuoksessa 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5. DNA siirretään nitroselluloosaa olevalle suodatti-melle kastelemalla sitä 20 tuntia liuoksella, joka käsittää 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraattia (20 x SSC), geelin läpi - 95045 54 laittamalla nitroselluloosasuodattimen päälle pino kuivia paperipyyhkeitä. Nitroselluloosasuodatinta pidetään 2 tuntia vakuumiuunissa 80 °C:n lämpötilassa.

Radioaktiivinen DNA-koetin plasmidin pDMl (4,3 kb) EcoRI-Xbal -kappaleesta valmistetaan nick-luennalla.

DNA-koettimen kanssa hybridisaatiota varten nitroselluloosa-suodatin suljetaan muovipussiin, joka sisältää 10 ml esi-hybridisaatioseosta: 50 % formamidia, 5 x SSC, 50 mM natrium-fosfaattia, pH 7,0, 5 x Denhardtin liuos, 250 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta. Suodatinta inkuboidaan tässä seoksessa 4 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen esi-hybridisaatioseos korvataan hybridisaatioseoksella: 50 % formamidia, 5 x SSC, 20 mM Na-fosfaattia, pH 7,0, 1 x

Denhardtin liuos, 100 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta 5 32 5 x 10 cpm/ml P-koetinta. Sen jälkeen, kun suodatinta M _ • on inkuboitu hybridisaatioseoksessa 18 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, sitä pestään kolmasti kulloinkin 5 minuuttia 50 °C:n lämpötilassa liuoksella 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.

Suodatinta kuivataan 60 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia, ja sillä valotetaan kahta röntgensädefilmiä (XAR-5, KODAK) kahden voimistavan varjostimen välissä, ja pidetään -80 " o °C:n lämpötilassa. Ensimmäinen röntgensädefilmi kehitetään 3 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen; toinen filmi 7 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen. Merkityn DNA-koettimen hybridisoituminen yhteen solun DNA:sta saatuun restriktiokappaleeseen, joka on peräisin tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista transfektanteis- i « ‘ ta, osoittaa, että solun DNA sisältää todellakin tämän keksinnön mukaisen yhtenäistyneen vektorin. Koska Southernin täpläanalyysin perusteella solu-DNA:n restriktioprofiili on sama kuin alkuperäisessä plasmidimuodosteessa, niin voidaan todeta, ettei plasmidi-DNA:n huomattavaa uudestaan-järjestäytyrnistä tapahtunut sen yhtenäistyessä isäntäsolun DNA;hän.

2. Nisäkkään solulinjojen transfektio ja tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja partikkeleita tuotta vien kloonien tunnistaminen.

55 9 5 0 4 5

Solut transfektoidaan käyttäen Wiglerin et ai. esittämää (Cell, Voi. 14, sivu 725, 1978), kalsiumfosfaatilla saosta-miseen perustuvaa menetelmää. Tämän jälkeen solut ositetaan suhteessa 1:6 uusiin viljelymaljoihin, ja ne solut, joihin on siirtynyt lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkit-simen geeni (neo), valikoidaan kasvattamalla G4l8-pitoisessa alustassa. Sen jälkeen, kun solut ovat kasvaneet 10 vuorokautta selektiivisellä alustalla, lääkeaineelle vastustuskykyiset pesäkkeet kloonataan mikrotiitterilevyille. Sen jälkeen, kun solut ovat kasvaneet yhteen, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden ilmentyneet määrät varmistetaan RIA-tekniikalla.

Kudosviljelymaljoille (halkaisija 100 mm) siirrostetaan 5 x 105 solua ja niitä inkuboidaan yön yli 37°C:n lämpötilassa. Neljä tuntia ennen transfektoimista viljelyalusta korvataan uudella alustalla. Transfektoitava DNA suspendoidaan 1 ml:aan liuosta, joka sisältää 250 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7,1 sekä 0,75 mM NaHP04. Tämä kalsiumfosfaatin ja DNA:n välinen saostuma lisätään viljelmän soluihin. Viljelmää inkuboidaan yön yli, minkä jälkeen soluviljelmään lisätään uutta alustaa ja soluja inkuboidaan edelleen kaksi vuorokautta.

F. Toimenpiteet, joilla saadaan nisäkässolujen staattinen soluviljelmä

Ampullillinen soluja, joita on pidetty -196°C:n lämpötilas-sa nestemäisessä typessä, sulatetaan nopeasti laittamalla ampulli 5 minuutiksi vesihauteeseen, minkä lämpötila on 37°C. Yksi ml tätä juuri sulatettua solususpensiota laimennetaan lisäämällä siihen hitaasti 10 ml asianmukaista viljelyalustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentri-fugoimalla, suspendoidaan uudestaan 10 ml:aan viljely-alustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentrifu- 56 95045 goimalla ja ne suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan viljelyalustaa, siirretään T25-viljelypulloihin ja niitä kasvatetaan inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa siten, että läsnä on 5 % CC^ita. Näissä olosuhteissa L-solujen ja CHO-solujen kaksinkertaistumiseen tarvittava aika on suurin piirtein 15-20 tuntia ja Vero-solujen tapauksessa 30-40 tuntia. L-solut ja CHO-solut saadaan pysymään hengissä ja kasvamaan myös sen jälkeen, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen, kun taas Vero-solut siirretään, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen.

G. Toimenpiteet nisäkässolujen kasvattamiseksi ACUSYST-P-laitteessa ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen 1. Siirrosten kasvatus ja esikäsittely

Soluja pidetään T75- tai T150-pulloissa, jotka sisältävät 2 DMEM-10 % FBS. Pyöritettävissä pulloissa (850 cm ) inku-boidaan 10-15 x 10^ solua, jotka on saatu T-pulloista.

Kun soluja on kasvatettu 3-5 vuorokautta, yhteensä noin 9 10 solua otetaan talteen kuudesta pyöritettävästä pullosta ja ne siirrostetaan kuuteen onttokuituhylsyyn (HFC) ACUSYST-P-laitteessa, jonka valmistaja on yhtiö Endotronics, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA.

2. ACUSYST-P-viljelmä ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen

Siirrostamisen jälkeen HFC-hylsyt laitetaan ACUSYST-P-vil jelyjärjestelmään ja hylsyjen läpi kulkevan alustan virtausnopeus asetetaan arvoon 50 ml/tunti ja se pidetään tässä arvossa. Alustasta määritetään päivittäin pH, pC^, glukoosi ja laktaatti. Kasvatuksen kestettyä 2-3 viikkoa, 600 millilitran nestetilavuus otetaan kahdesti viikossa kunkin ACUSYST-P-laitteessa olevan onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden muodostuminen todetaan radioimmunokokeella (RIA). Koska pakastaminen tuhoaa RIA-kokeella määritettä- 57 95045 vän aktiivisuuden, niin talteen otettuja näytteitä säilytetään 4 °C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Proteaasiak-tiivisuutta ei todeta lainkaan näissä olosuhteissa Azocoll-substraatin proteolyysillä (SIGMA) määritettynä.

3. Toimenpiteet laadun tarkkailemiseksi a. Kokeet bakteereiden ja sienten läsnäolon toteamiseksi Solujoukosta, joka sisältää noin 5 x 105 solua/ml ja jotka on suspendoitu siihen soluviljelyalustaan, josta ne otettiin talteen, määritetään bakteereiden ja sienten läsnäolo. Yksi ml soluja vedetään tryptikaasi-soija-agaria (BBL) sisältäville maljoille, ja toinen 1 ml siirrostetaan tioglykolaat-tialustaan (DIFCO) aerobisten sekä anaerobisten bakteereiden läsnäolon toteamiseksi. Sienikontaminaatio ilmaistaan vetämällä 1 ml soluja Sabouraud-agaria (DIFCO) sisältäville maljoille. Nämä kokeet toteutettiin säännöllisesti, jolloin voitiin varmistua kasvualustan steriiliydestä sekä siitä, etteivät soluviljelmät olleet kontaminoituneet bakteereilla tai sienillä.

b. Kokeet mykoplasman läsnäolon toteamiseksi Fluoresenssivärjäys. Mykoplasma-DNA:n läsnäolo solun sytoplasmassa määritetään värjäysmenetelmällä käyttäen fluoro- ;*! kromia, Hoechst 33258. Tämä DNA:n värjäävä väri fluoresoi ultraviolettivalossa, ja se toimii mykoplasmojen läsnäolon osoittavan, erittäin nopean ja herkän kokeen perustana. Tässä menetelmässä käytetään testattavien solujen peitelasivil-jelmiä, joita käytetään kun solut ovat kasvaneet 50-70-prosenttisesti yhteen. Kiinnittämisen ja värjäämisen jälkeen ·. peitinlaseja tarkastellaan fluoresenssimikroskoopilla. Syto- plasminen fluoresenssi osoittaa mykoplasman läsnäolon.

Hoechst 33258 bisbentsamidi-fluorokromin varastoliuos valmistetaan liuottamalla 5 mg fluorokromia 100 millilit-raan PBS-liuosta magneettisekoittajaa käyttäen. Se steri 58 95045 loidaan suodattamalla 0,22 mikronin kalvon läpi, säilytetään pimeässä, 4 °C:n lämpötilassa, ja laimennetaan tuhat-kertaisesti PBS-liuoksella ennen käyttöä. Peitinlasiviljel-mien, jotka ovat kasvaneet yhteen 50-70 -prosenttisesti, alusta erotetaan soluista imulla, ja kiinnitetään 4 °C:n lämpötilassa vaihtamalla kahdesti seos, joka käsittää etanolia ja etikkahappoa suhteessa 3:1. Peitinlasit pestään kerran ionittomalla vedellä ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa laimennetun, fluorokromina toimivan bisbentsamidin (Hoechst 33258} kanssa, jonka jälkeen pei-tinlasit huuhdellaan ionittomalla vedellä. Peitinlasit laitetaan solupuoli alaspäin mikroskooppilasille käyttäen upotinnesteenä glyserolia (22,2 ml 2 % sitruunahappoa; 1 ml H20; 27,8 ml 2,8 % Na^PO^; 50 ml glyserolia, pH 5,5).

C. Kokeet virusten läsnäolon toteamiseksi 1) Kokeet soluviljelmissä.

Testisoluja tarkastellaan normaalin morfologian suhteen vähintään 14 vuorokauden pituisen inkubointijakson aikana, testattavan solulinjan suspensiolla siirrostamisen jälkeen. Tämän lisäksi 3.-5. vuorokautena ja jälleen 12. vuorokauden jälkeen, vähintään 4 % siirrostetuista testiviljelmistä pestään, ja siitä määritetään hemadsorptio käyttäen lampaan ja ihmisen punasoluja. Tulokset luetaan sen jälkeen kun viljelmiä on inkuboitu 30 minuuttia 3-4 °C:n lämpötilassa, ja jälleen 30 minuutin kuluttua 34-37 °C:n lämpötilassa. Kokeista, joilla voidaan määrittää viruksella infektoituneiden, erytrosyyttejä absorboivien solujen läsnäolo, saadut tulokset osoittivat viruskontaminaation puuttumisen.

2) Kokeet eläimissä.

Testattavat solut suspendoidaan liuokseen, joka käsittää 140 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,1 mM Na2HP0^, pH 7,2, pitoisuudeksi 10^/ml, ja niitä siirrostetaan eri eläinryhmiin. Yhdessä ryhmässä, vähintään 10 eläintä vähintään kahdesta imevien hiirten pesueesta saa siirrostetta. Soluja siir- 59 95045 rostetaan kuhunkin eläimeen 0,1 ml vatsaontelon sisäisesti ja 0,01 ml aivojen sisäisesti. Hiiriä tarkkaillaan päivittäin, vähintään 14 vuorokauden ajan. Jokaiselle hiirelle, joka kuolee kokeen 24 ensimmäisen tunnin jälkeen tai joka tapetaan sairastumisen vuoksi, tehdään ruumiinavaus ja siitä etsitään jälkiä virusinfektiosta. Tämä tutkimus käsittää lisätestaamisen, joka toteutetaan alisiirrostamalla sopivia kudossuspensioita aivojen sisäisesti ja vatsaontelon sisäisesti vähintään viidestä imevästä hiirestä muodostuvaan lisäryhmään, jota tarkkaillaan 14 vuorokautta. Tämän lisäksi tehdään sokeakoe yhdistetystä, emulgoidusta kudoksesta (ihoa ja elimiä (viscus) lukuunottamatta), joka on saatu alkuperäisen 24 vuorokauden pituisen kokeen jälkeen eloon jääneistä hiiristä.

Toisessa ryhmässä myös 10 täysikasvuista hiirtä saa siir-rostetta. Kuhunkin eläimeen siirrostetaan 0,5 ml soluja vatsaontelon sisäisesti ja 0,03 ml soluja aivojen sisäisesti. Eläimiä tarkkaillaan neljä viikkoa, ja jokainen eläin, joka sairastuu, tai jossa esiintyy poikkeavuutta tavallisuudesta, tutkitaan sairastumisen syyn selvittämiseksi. Kontaminoivien virusten läsnäolon osoittavista, eläimissä toteutetuista kokeista saadut tulokset eivät ilmaisseet viruskontaminaatiota.

d. Koe tuumorigeenisyyden selvittämiseksi.

Sopivassa tuumorigeenisyyden ilmaisevassa kokeessa, jossa käytetään karvattomia hiiriä (nu/nu>, 20 eläimeen siirrostetaan 24 tunnin sisällä syntymisestä 0,1 ml voimakasta seerumia. Tämä injektio annetaan joko lihaksen sisään tai ihonalaisesti ja se toistetaan 2., 7. ja 14. elinpäivänä.

Yksi miljoona vertailuna käytettyä tuumorisolua tuottaa säännöllisesti asteittain kasvavia tuumoreita ja etäispesäkkeitä. Yksi miljoona elävää solua tutkittavasta solu-linjasta siirrostetaan ihon alaisesti mihin tahansa sellaiseen kohtaan, jossa kehittyvät tuumorit voivat puhjeta ao - 95045 (raajat ovat sopivia). Eläimiä tarkkaillaan 21 vuorokautta sen toteamiseksi, muodostuuko injektiokohtaan solmuketta, ja mittauksia suoritetaan ajoittain asteittaisen kasvun toteamiseksi. 21 vuorokauden pituisen havainnointijakson päätyttyä kaikki eläimet tapetaan ja niistä etsitään jälkiä tuumorin muodostumisesta injektiokohtaan sekä muihin elimiin, kuten imurauhasiin, keuhkoihin, munuaisiin ja maksaan. Kaikki tuumorin kaltaiset muutokset ja kaikki siirrostamiskohdat tutkitaan histopatologisesti. Tämän lisäksi, koska eräät solulinjat voivat muodostaa etäispesäkkeitä paikallisen tuumorikasvun kuitenkin puuttuessa, niin kaikkien eläinten keuhkot ja alueelliset imusolmukkeet tutkitaan histologisesti.

Tämän kokeen tavoitteita ajatellen asteittain kasvava tuumori määritellään kosketeltavaksi solmukkeeksi, jonka koko suurenee 21 vuorokauden pituisen havaintojakson aikana, ja jossa voidaan todeta eläviä ja mitoottisesti aktiivisia siirrostesoluja histologisesti tutkittaessa. Asteittain kasvavana tuumorina ei pidetä sitä, että läsnä on mikros-kooppisesti eläviä soluja liittyneenä muuttumattomaan tai regressiiviseen solmukkeeseen.

• H. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden puhdistaminen 1. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG)

Alusta otetaan talteen kapillaarien ulkopuolisesta tilasta, ACUSYST-P-viljelyjärjestelmästä, ja yhdistetään 3000 milli-litran tilavuuksiksi. Kuhunkin tilavuuteen lisätään 180 g PEG 8000-tuotetta (SIGMA), joka liuotetaan sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatketaan edelleen 3 tuntia 4 °C:n lämpötilassa. Saostuma otetaan talteen sentrifugoimalla 500 millilitran suuruisissa pulloissa GS 3-roottorissa nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10 °C:n lämpötilassa. Supernatant-ti otetaan talteen ja siihen lisätään jälleen 180 g PEG 8000 -tuotetta, joka liuotetaan huoneen lämpötilassa edellä 61 -95045 kuvatusta.. Liuosta sekoitetaan 4°C:n lämpötilassa edelleen 3 tuntia. Tämän liuoksen saostuma otetaan talteen edellä kuvatusta, paitsi että sentrifugointi toteutetaan nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspendoidaan uudestaan fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS).

2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia Materiaali, joka saatiin PEG-saostamalla ja joka on liuotettu uudestaan PBS-liuokseen, käsitellään kromatografisesti geelillä suodattamalla käyttäen BioRad-yhtiön A-5m-hartsia 4°C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet ovat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus on 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 /xg tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 ml:n tilavuudessa laitetaan kolonniin ja eluoidaan PBS-tai TNE-liuoksella, virtausnopeuden ollessa 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h) ja eluaatista kerätään 3 ml:n fraktioita. Kuvassa 6 esitetään A-5m-kolonnista eluoituneen, RIA-ilmais-tavan materiaalin profiili. Yhtenäinen viiva osoittaa kunkin fraktion absorbanssin aallonpituudella 280 nm, ja pisteet osoittavat RIA-tuloksien perusteella lasketun materiasiimää-rän.

62 95045 dientin pinnalta (kuva 7). Puhdistuneet partikkelit erottuvat hyvin kontaminoivan proteiinin pienestä määrästä, joka muodostaa vyöhykkeen grandientin keskelle. Liuoksesta poistetaan suola dialysoimalla, ensin vettä vastaan, sitten 3 suolaliuoksen erää vastaan, 24 tunnin pituisen ajanjakson aikana.

Ylimääräisenä laaduntarkkailutoimenpiteenä osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoidaan uudestaan lineaarista CsCl-gradienttia käyttäen. Odotusten mukaisesti saadaan yksi ainoa puhdistettujen partikkeleiden piikki tiheyteen 1,2 g/cm3.

1. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuskoe

Rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi steriilissä suolaliuoksessa toivottuna pitoisuutena olevaan antigeeniin lisätään 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua 0,2 M AIK(SO)2:12 H20-liuosta, pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuok-sella, ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saostettu antigeeni otetaan talteen sentri-fugoimalla 10 minuuttia nopeudella 200 rpm, suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen alunaan absorboituneiden partikkeleiden stabiilisuuden määrittämiseksi antigeeni otettiin talteen tekemällä aluna uudestaan liukoiseksi 3 % natriumsitraattiin, mitä seurasivat peräkkäiset dialyysit 3 % natrium-sitraattia ja PBS-liuosta vastaan. Tämän jälkeen 63 95045 partikkeleiden määrä määritetään yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun HBsAg-standardin laimennoksia vastaan, näiden laimennosten käsittäessä PBS-50 % juuri syntyneen vasikan seerumia .

Taulukko 1

Stabiilisuuskokeen parametrit Näytteet: kaksi näytettä sellaisenaan ja kaksi alunaan absorboituna Näytteen pitoisuus: 5 yg/ml Säilytysastia: lasiampulli

Säilytyslämpötila: 2-8 °C

Kokeet: (a) kvalitatiivinen: SDS-PAGE

(b) kvantitatiivinen: radioimmunokoe

Esimerkki 1

PreS^-PreSj-S -proteiinin koodaavan alueen koodaamia polypeptide jä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen A. Yhdistelmäplasmidin pMMT-neo valmistaminen

Plasmidi pBPV342-12 pilkottiin restriktioendonukleaasilla BamHI (katso kuva 1 sekä kappaletta Materiaalit ja menetel-" mät). Tällöin saatiin kaksi DNA-molekyyliä: yksi molekyyli (7,95 kb) käsittää naudan papillomaviruksen (BPV) koko ge-nomin; toinen molekyyli (6,65 kb) sisältää osan bakteeri-plasmidista pML2 (pBR322, josta on hävitetty "myrkkyketju"), hiiren metallotioneiiniproftioottorin (pMMT), neomysiinin vastustuskyvyn geenin (neo) sekä SV40 PAS-t-alueen (katso • kuva 1). Kun tämä kappale ligatoidaan itseensä (tehdään rengasmaiseksi), niin tällöin saadaan plasmidi pMMT-neo (katso myös kuva 5).

Reaktio toteutettiin reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus on 400 yl, ja lopullinen pitoisuus 0,2 yg/yl pBPV342-12; sekä 80 yksikköä entsyymiä BamHI, ja reaktio toteutettiin 37 °C:n lämpö 64 95045 tilassa 4 tuntia. Pilkkoutumisen täydellisyys varmistettiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä (katso materiaalit ja menetelmät). Reaktio pysäytettiin lisäämällä 40 yl 8 M LiCl-liuosta ja DNA saos-tettiin 1 millilitralla etanolia -80 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Saostettu DNA suspendoitiin uudestaan 100 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8.

B. Koko PreS1-PreS2"S-proteiinin koodaavan alueen sekä kopioitumisen luonnollisen promoottorin sisältävän kappaleen eristäminen HBV-genomin adw-alatyypin valmistus ja kloonaaminen kuvataan julkaisussa Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca.

Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Rengasmainen HBV-genomi tehdään lineaariseksi ainoasta EcoRI-kohdasta bakteriofagiin lambda kloonaamista varten sekä bakteeriplasmidin alikloo-naamista varten, jolloin saadaan plasmidi pA01 (katso kuva 2). Koska EcoRI-restriktiokohta sijaitsee PreS.j-PreS2~S-proteiinin koodaavassa alueessa, niin tämä alue katkeaa lineaarisessa EcoRI-muodossa. Vahingoittumattoman PreS.j-PreS2“S-proteiinin koodaavan alueen aikaansaamiseksi plas-midin pA01 3,2.kiloemäsparin suuruinen EcoRI-istute eristettiin ja erotettiin plasmidi-DNA:sta pilkkomalla 100 mikrogrammaa plasmidia pA01 reaktiopuskurissa, jota oli yhteensä 400 yl (katso materiaalit ja menetelmät), ja joka sisälsi 200 yksikköä EcoRI-entsyymiä, 4 tuntia 37 °C:n lämpötilassa. 3,2 kiloemäsparin suuruinen DNA-istute eristettiin plasmidi-DNA:sta preparatiivisella elektroforeesilla 0,7 % agaroosigeeliä käyttäen (katso Materiaalit ja menetelmät). DNA eluoitiin sähköisesti agaroosigeeliltä ioninvaihtosuodattimelle DE 81 Whatman, josta DNA poistetaan runsaasti suolaa sisältävään liuokseen. DNA puhdistettiin uuttamalla kerran fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. Tämän jälkeen puhdistettu lineaarinen 3,2 kb EcoRI-kappale, joka koodaa täydellistä HBV-genomia, ligatoitiin itseensä käyttäen 65 95045 korkeata DNA-pitoisuutta, joka suosii konkatameerien muodostumista: 30 yg EcoRI-kappaleen DNA:ta ligatoitiin reak-tiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 50 μΐ, ja joka sisälsi 1,8 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 2 mM ATP:tä, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C lämpötilassa yön yli; tämän jälkeen DNA puhdistettiin uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kertaalleen kloroformilla, jonka jälkeen kahteen kertaan saostaminen etanolilla. DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja pilkottiin restrik-tioentsyymillä Bglll reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus oli 50 μΐ, ja joka sisälsi 50 yksikköä entsyymiä Bglll, 37 °C:n lämpötilassa 4 tuntia.

Tässä reaktiossa muodostuneet DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen 1,5 % agaroosigeeliä. Agaroo-sigeeliltä eristettiin 2,78 kiloemäsparin suuruinen Bglll-kappale, joka sisältää vahingoittumattoman PreS-j -PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen, sekä sen luonnollisen promoot-torijärjestelmän, jota tarvitaan pinnan antigeenipolypep-tidien ilmentämiseksi, ja tämä kappale puhdistettiin edellä esitetysti (katso kuva 2).

C. PreS^-PreS2“S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän kappaleen istuttaminen pMMT-neo-plasmidiin: plasmidin pDM1 muodostaminen

Edellä osassa A kuvatusti valmistetusta DNA-liuoksesta : otettiin 1 μΐ, ja se sekoitettiin 5 mikrolitraan edellä osassa B kuvattua, 2,78 kiloemäsparin suuruista Bglll-kappaletta (0,25 yg/yl).

Seos alistettiin ligaatioreaktioon yhteensä 10 mikrolit-rassa reaktiopuskuria, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

66 95045

Bakteerisoluja, mieluiten HB101-soluja käsiteltiin siten, että ne kykenivät ottamaan vastaan DNA:ta transformaatio-reaktiossa, joka toteutetaan osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatun menetelmän mukaisesti. Ligaatioseos käsitti 10 mM Tris, pH 7,5 1 mM EDTA, kokonaistilavuuden ollessa 70 yl, ja se lisättiin 200 mikrolitraan kykeneväksi tehtyjen bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin.

Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, sitten siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C:n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin LB-agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yg ampisilliinia/ml siten, että kullekin maljalle saatiin 50-300 yl solususpensiota. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointi-jakson jälkeen yksittäiset eristetyt bakteeripesäkkeet . seulottiin toivotun, 2,78 kiloemäsparin suuruisen, Bglll- entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostaman istutteen sisältävän bakteeriplasmidin pMMT-neo läsnäolon suhteen (katso kuva 3).

Seulonta toteutetaan mieluiten pesäkehybridisäätiöön perus-: tuvalla menetelmällä. Tätä tarkoitusta varten yksittäiset pesäkkeet nostettiin hammastikulla, ja ne siirrettiin ampisilliinia sisältävälle LB-agarmaljalle ristikon muotoon, joka mahdollistaa kloonien tunnistamisen. Maljaa inkuboitiin yli yön 37 °C:n lämpötilassa.

Pesäkkeet siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle laittamalla suodatin agarpinnan päälle, ja pitämällä sitä agarin pinnalla niin kauan, kunnes se oli märkä. Suodatin poistettiin varovaisesti agarin pinnalta, jonka jälkeen toteutettiin peräkkäinen siirtäminen Whatman 3M-paperin kolmeen kerrokseen, joista kukin oli kasteltu liuoksella, joka käsitti joko 0,5 M NaOH, tai 1 M Tris, pH 7,0, 1,5 M NaCl/ 0,5 M Tris, pH 7,4, tai 2 x SSC. Suodattimet laitettiin 67 95045 pesäkepuoli ylöspäin kasteltujen papereiden päälle solujen hajottamisen ja tämän jälkeen toteutettavien neutralointeja kiinnitystoimenpiteiden ajaksi.

Sen jälkeen, kun suodattimet oli kuivattu ilmassa, niitä kuumennettiin vakuumissa 80 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen nitroselluloosasuodattimilla toteutettiin DNA-hybridi-saatio käyttäen edellä osassa B Kuvatulla tavalla valmistetun PreS.j -PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävästä, 2,78 kiloemäsparin suuruisesta Bglll-kappaleesta saatua, radioaktiivisesti merkittyä DNA-koetinta sekä luentaa avoimen fosfodiesterisillan (nick) kohdalta (katso Materiaalit ja menetelmät).

Nitroselluloosasuodatinta inkuboitiin esihybridisaatioseok- sessa, joka sisältää 50 % formamidia, 20 mM natriumfosfaatti- puskuria, pH 6,6; 1 x Denhardt:in liuosta; 100 yg/ml denatu- 7 32 roitua lohen sperman DNA:ta sekä 1x10 cpm P-merkittyä DNA:ta, joka oli sulatettu 0,2 N NaOH-liuokseen, 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia.

Tätä suodatinta inkuboitiin tässä seoksessa 16 tuntia 45 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen suodatinta pestiin kahdesti ' liuoksessa, joka käsitti 2 x SSC, 0,1 % SDS, kummallakin kerralla huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan, ja kahdesti liuoksessa, joka käsitti 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 15 minuuttia, kummallakin kerralla 50 °C:n lämpötilassa. Suodatti-milla valotettiin kahden varjostimen välissä röntgensä-defilmiä (mieluiten 3M) -80 °C:n lämpötilassa kahden vuoro-kauden ajan.

Kloonatun 2,78 kiloemäsparin suuruisen Bglll-kappaleen käsittävän yhdistelmäplasmidin sisältävät pesäkkeet nähtiin mustina pisteinä. 50 pesäkkeestä tunnistettiin neljä, ja näiden pesäkkeiden plasmidi-DNA eristettiin minipreparaat-teina menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res., Voi. 7, sivu 1513, 1979, ja se 68 95045 analysoitiin pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktio-endonukleaaseilla Bglll ja Xbal. Analyysit vahvistivat edellä kuvatun, odotetun rakenteen (katso kuva 3).

D. PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavien alueiden luonnollisen promoottorin korvaaminen metallotioneiinipromootto-rilla: plasmidin pDM2 muodostaminen

Edellä kuvattu plasmidi pDMl pilkottiin täydellisesti restrik-tioentsyymeillä Bglll ja BamHI reaktiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 100 μΐ, ja joka sisälsi 20 yg plasmidi-DNA:ta ja ensin 50 yksikköä entsyymiä Bglll, reaktiopuskurin käsittäessä 6,7 mM Tris, pH 7,8; 6,7 mM MgC^J 6»7 mM β-merkaptoetanolia, 37 °C;n lämpötilassa 4 tunnin ajan; tämän jälkeen suolapitoisuus nostettiin arvoon 150 mM NaCl, ja pilkkominen suoritettiin loppuun lisäämällä 40 yksikköä entsyymiä BamHI, ja seosta inkuboitiin 37 °C;n lämpötilassa yön yli. Tällöin saatiin kolme kappaletta, suurimman kappaleen ollessa kooltaan 5,1 kb, seuraavan kappaleen 2,97 kb, ja pienimmän kappaleen ollessa kooltaan 1,4 kb. Nämä kappaleet erotettiin preparatiivisella elektroforeesilla käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä, josta kappaleet (5,1 kb ja 1,4 kb) eristettiin elektroforeettisesti käyttäen ioninvaihtosuodatinta Whatman DE 81.

DNA poistettiin tältä suodattimelta inkuboimalla sitä runsaasti suolaa sisältävässä puskurissa 4 tuntia 4 °C:n lämpötilassa, ja DNA puhdistettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. DNA suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8. Yhdestä mikrolitrasta määritettiin puhtaus ja siitä arvioitiin DNA-määrä elektroforeettisesti agaroosigeeliä käyttäen.

Suuri (5,1 kb) kappale, joka sisälsi metallotioneiinipro-moottorin Bglll-päässä, ligatoitiin PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään pieneen kappaleeseen (1,4 kb), 69 95045 joka ei kuitenkaan sisältänyt tämän geenin luonnollista promoottoria tai PreS^-osaa. Suuri kappale sisälsi samoin luonnollisen päättämis-polyadenylaatiosignaalin (hb-PAS-t), joka on välttämätön hepatitis B-viruksen PreS2~S-pro-teiinin koodaavan alueen ilmentämiseksi (katso myös kuva 4) .

Koska suuri kappale sisältää myös bakteeriplasmidin, niin on mahdollista, että tämä kappale ligatoituu itseensä automaattisesti ilman, että pienikokoinen BamHI-kappale sisältyy ligaatio-tuotteeseen. Tästä syystä suuren kappaleen preparaatista, jota oli yhteensä 20 μΐ, otettiin 10 yl, ja se käsiteltiin alkalisella fosfataasilla lisäämällä tätä entsyymiä 28 yksikköä ja inkuboimalla 37 °C:n lämpötilassa 20 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 yl 50 mM EGTA, ja inkuboimalla 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia. DNA puhdistettiin saostamalla kahdesti etanolilla 0,8 M LiCl-liuoksessa.

* · DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja tästä puskurista otettiin 5 yl vertailunäytteeksi, josta määritettiin ligatoituminen itseensä, ja toinen 5 mikrolitraa sekoitettiin 5 mikrolitraan elektroeluoitua pientä (1,4 kb) BamHI-kappaletta.

'· Kummankin näytteen ligatoiminen toteutettiin 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, kuten edellä esitettiin. Transfor-mointi HB101-bakteereihin toteutettiin edellä kuvatusti.

Kaksitoista erillistä pesäkettä otettiin ja niitä kasvatettiin 2 millilitran viljelmissä, ja plasmidi-DNA eristettiin tutkijoiden Birnboim ja Doly, mainittu edellä, mukaisesti. Plasmidi-DNA:sta määritettiin pienikokoisen BamHI-kappaleen liittyminen ja suuntautuminen pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal.

Näistä 12 plasmidi-DNA:sta kahdessa tämä pieni (1,4 kb) BamHI-kappale on saatu istutetuksi samalla tavalla suuntautuneena kuin metallotioneiinipromoottori.

70 95045 Nämä plasmidi-DNA:t kasvatetaan massaviljelmässä, ja esi-käsitellään eukarioottisiin soluihin siirtämistä varten, joka siirtäminen toteutetaan yhteistransfektiolla.

Vaihtoehtoisesti, metallotioneiinipromoottorin käsittävästä plasmidista pMMT-neo saadulla EcoRI/Bglll-kappaleella (1,9 kb) korvataan plasmidissa pDM1 PreS2~S-proteiinin koo-daavan alueen edessä sijaitseva lyhyt (32 emäsparin) EcoRI-BamHI-kappale, jolloin saadaan plasmidi pDM3, kuten kuvassa 5 esitetään.

E. Kohdissa C ja D saatujen yhdistelmä-DNA-vektoreiden vieminen nisäkässoluihin ja tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja partikkeleita tuottavien solulinjojen muodostaminen

Yhdistelmäplasmidit pDM1 ja pDM2 transfektoitiin yhdessä hiiren L-soluihin, vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibroblasteihin käyttäen tavanomaisia transfektointimenetelmiä (Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, edellä) (katso Materiaalit ja menetelmät). Solut, jotka ottavat vastaan plasmidi-DNA: ta ja joissa plasmidi-DNA säilyy, ovat vastustuskykyisiä lääkeaineelle G418, ja ne säilyvät hengissä tätä lääkeainetta sisältävällä selektiivisellä alustalla. Ne solut, jotka eivät ota vastaan DNA:ta, eivät pysy hengissä selektiivisellä alustalla. Nämä solut todetaan erillisinä klooneina viljelymaljän pinnalla. Solut otettiin talteen kloo-naussylinterillä ja niitä kasvatettiin massaviljelmää varten tavanomaiseen tapaan käyttäen tavallista ravintoalustaa, kuten Dulbeccon muunnettua Eagle-alustaa, johon on lisätty täydennykseksi 10 % vasikan seerumia ja 500 yg lääkeainetta G418/ml (katso Materiaalit ja menetelmät). Viidestä saadusta kloonista muodostettiin solulinja, joista käytettiin nimityksiä ENDO-I, -XI, -III, -IV ja -V,ja niistä valmistettiin pakastetut varastolinjat (katso Materiaalit ja menetelmät). Näiden solulinjojen tuotantonopeus staattisessa viljelmässä määritettiin radioimmuunikokeella (RIA; 71 95045 ks. Materiaalit ja menetelmät) ja sitä verrattiin tunnettujen solulinjojen tuotantonopeuteen. Tämän keksinnön mukaiset soluiinjät tuottavat keskimäärin 500-1000 ng tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua partikkelia ml:aan vil-jelyalustaa vuorokaudessa.

F. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja partikkeleita tuottavien solulinjojen viljeleminen Acusyst-P-laitteessa

Kuudessa pyöritettävässä pullossa DMEM + 10 % FBS-alustassa kasvatettua (ks. Materiaalit ja menetelmät), yhteensä noin 109 solua siirrostettiin kuuteen onttokuituhylsyyn Acusyst-P-viljelyjärjestelmässä (ks. Materiaalit ja menetelmät). Nestettä otettiin talteen noin 600 ml kahdesti viikossa Acusyst-P-järjestelmän kunkin onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta, ja säilytettiin 4°C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Partikkeleiden pitoisuus määritettiin RIA-menetelmällä (ks. Materiaalit ja menetelmät).

G. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden puhdistaminen Acusyst-P-järjestelmässä käytetystä viljelyalustasta Näiden uusien solulinjojen tuottamat partikkelit, jotka sisältävät PreS!-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja, puhdistettiin polyetyleeniglykolilla (PEG) saostamalla, geelisuodattamalla ja isopyknisellä ultrasent-rifugoinnilla CsCl-gradienteissa (ks. jäljempänä esitetty).

1. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG) Kapillaarien ulkopuolisessa tilassa oleva alusta otettiin talteen Acusyst-P-viljelyjärjestelmästä ja yhdistettiin 3000 • ml:n suuruisiksi määriksi. Kuhunkin 3000 ml:n määrään lisät tiin 180 g tuotetta PEG 8000 (SIGMA), ja se liuotettiin sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatkettiin edelleen 3 tuntia 4°C:n lämpötilassa. Saostuma otettiin talteen sentrifugoimalla 500 ml:n pulloissa, GS 3-roottorissa, nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10°C:n lämpötilassa. Supernatantti otettiin talteen, ja 72 95045 siihen lisättiin jälleen 180 g tuotetta PEG 8000, ja liuotettiin huoneen lämpötilassa edellä kuvatusti. Liuosta sekoitettiin edelleen 4°C:n lämpötilassa 3 tuntia. Saostuma otettiin talteen tästä liuoksesta edellä esitetysti, paitsi että sentrifugointi toteutettiin nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspendoitiin uudestaan 20 ml:n fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS).

2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia PEG-saostamisen jälkeen saatu, PBS-puskuriin uudestaan liuotettu materiaali käsiteltiin kromatografisesti geelisuodat-tamalla, käyttäen BioRad A-5m -hartsia, 4°C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet olivat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus oli 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 μg tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 ml:n tilavuudessa laitetaan kolonniin ja eluoidaan PBS- tai TNE-liu-oksella nopeudella 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h), ja elu-aatista kerätään 3 ml:n fraktioita. Kuvassa 6 nähdään A-5m-kolonnista eluoituneiden, partikkeleiden profiili. Yhtenäinen viiva tarkoittaa kunkin fraktion absorbanssia aallonpituudella 280 nm, ja pisteillä merkitään kiinnostuksen kohteena olevien partikkeleiden määrää kussakin fraktiossa, RIA-määrityksen perusteella laskettuna.

' 3. Isopykninen sentrifugointi CsCl-liuoksessa

Geelisuodatuksena toteutetussa pylväskromatografiässä tuloksena olevan ensimmäisen piikin (ks. kuva 6) kattavat, noin 30 fraktiota, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja, osittain puhdistettuja partikkeleita, yhdistettiin (suurin piirtein 100 ml). Tämän liuoksen tiheys saatettiin arvoon 1,30 g/cm3 yhdisteellä CsCl, minkä jälkeen se siirrettiin nitroselluloosaputkiin, jotka sopivat SW 27- tai SW 28-roottoriin (Beckman). Gradientit saatiin aikaan laittamalla putken pohjalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,35 g/cm3, ja pinnalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,25 g/cm3 sekä 4 ml liuosta, jonka tiheys on 1,20 g/cm3. Gradientteja sentrifugoitiin nopeudella 28 000 rpm 50 - 95045 73 tuntia 10°C:n lämpötilassa, jaettiin fraktioihin ja puhdistunut antigeeni saatiin talteen tiheydeltään 1,20 g/cm3 olevasta kerroksesta, gradientin pinnalta. Kiinnostavat partikkelit erottuivat hyvin pienestä määrästä kontaminoivia proteiineja, jotka muodostivat vyöhykkeen gradientin keskelle (ks. kuva 7). Liuoksesta poistettiin suolat dialysoimalla 24 tunnin ajan kolmea suolaliuoserää vastaan.

Laadun varmistamiseksi osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoitiin lineaarista CsCl-gra-dienttia käyttäen. Tällöin odotusten mukaisesti tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut partikkelit muodostivat yhden piikin tiheyteen 1,2 g/cm3.

H. Solulinjojen tuottamien, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden tunnusomaiset piirteet Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden sisältämien polypeptidien puhtaus ja fysikaaliset ominaisuudet eri preparaateissa määritetään tavanomaisilla laboratoriomenetelmillä, kuten radioimmuunikokeella, immuunisaostuksella ja SDS-PAGE-määrityksellä (ks. Materiaalit ja menetelmät).

I. Puhtauden määrittäminen : a. Kontaminoivien plasmaproteiinien pitoisuuden määrittä minen

Eri seerumiproteiinien pitoisuudet puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään tavallisella RIA-tekniikalla käyttäen spesifisiä vasta-aineita naudan seerumin albumiinia, IgA:ta, IgGrtä, IgMrää jne. vastaan. Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista nähdään, ettei immunoglobuliineilla kontaminoitumista voitu todeta, ja albumiinilla kontaminoituminen oli vain vähäistä.

74 95045

Taulukko 2

Kontaminoivien plasmaproteiinien määrittäminen RIA-menetel-mällä

Proteiini %-osuus kaikista proteiineista

Albumiini 0,05

IgG 0,2

IgA 0,2

IgM 0,2 b. Kontaminoivien isäntäsoluista peräisin olevien tai PreSj-PreS2-S-nukleiinihappoketjujen pitoisuuksien määrittäminen tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden puhdistetuista preparaateista piste-täplä -menetelmällä.

Puhdistetuilla partikkeleilla toteutetaan piste-täplä-hybridisaatio (dot-blot) kontaminoivien PreSj-PreS^S-DNA-ketjujen tai isännän kromosomaalisten DNA-ketjujen ilmaisemiseksi. Kutakin läiskää varten 100 nanogramman suuruista määrää puhdistettuja partikkeleita kuumennettiin 68°C:n lämpötilassa 10 minuuttia 40 mikrolitrassa 0,225 N NaOH-liuosta. Positiivisena vertailuna 20 pg tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin pDMl DNA:ta 40 mikrolitrassa 0,25 N NaOH-liuosta käsitellään samalla tavalla. Välittömästi NaOH-liuoksessa denaturoinnin jälkeen liuos täp-litetään nitroselluloosasuodattimelle. Seuraavassa esitetty suodattimien käsitteleminen ja hybridisaatiotoimenpiteet ovat analogiset Southernin täplitysmenetelmässä käytettä-: vien toimenpiteiden kanssa, paitsi että 32P-merkitty koetin on tämän keksinnön mukaisen kromosomaalisen DNA:n ja plas-midi-DNA:n 50:50-seos, tämän plasmidi-DNA:n sisältäessä 75 95045

PreS^-PreS2"S -proteiinin koodaavan alueen. Odotusten mukaisesti hybridisoiva koetin tuottaa voimakkaan signaalin tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin DNA:n kanssa, mutta ainoastaan heikon taustasignaalin puhdistetun par-tikkelipreparaatin kanssa. Tämä hybridisaatiokuvio osoittaa, ettei näytteessä ole läsnä PreS^-PreS2~S-DNA:ta tai kromo-somaalista DNA:ta.

2. Immunosaostaminen ja SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu analyysi Tämän keksinnön mukaisten transfektanttien tuottamien PreS1-PreS2~S-polypeptidien osuuksien määrittämiseksi näiden transfektanttien tuottamat proteiinit merkitään biosynteet-tisesti, immunosaostetaan ja analysoidaan SDS-PAGE-geeleil-' lä (katso Materiaalit ja menetelmät). Luonnollisesta lähteestä saatua HBV-virusta vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla viljelyalustasta immunosaostamalla eristettyjen proteiinien elektroforeettinen kuvio tehtiin näkyväksi hopealla värjäämällä. Kaksi pääasiallista proteiinia vastaa kooltaan S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa glykosyloimatonta ja glykosyloitunutta polypeptidiä (24 kd ja 27 kd, vastaavasti). Kaksi vähäisempää proteiinia, 33 kd ja 36 kd, vastaa kooltaan PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa kahta polypeptidiä. Tämä menetelmä ei ole niin herkkä, että sillä voitaisiin ilmaista PreS^-PreS2-S -polypeptidejä sisältävien polypeptidien pieniä määriä, mutta koko PreS1-PreS2"S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolo voitiin ilmaista Westernin immunotäplämenetelmällä (katso jäljempänä).

Heikot vyöhykkeet geelin huipulla johtuvat kasautuneesta proteiinista, ja ne ovat nähtävissä myös luonnollisista lähteistä saatujen HBV-partikkeleiden tapauksessa. Näin ollen, PreS-j-PreS2-S-proteiinin koodaavalla alueella trans-fektoidut solut erittävät proteiineja, jotka eivät ainoastaan reagoi luonnollista tuotetta vastaan vaikuttavien vasta-aineiden kanssa, vaan jotka ovat myös samanlaisia 95045 kokonsa suhteen. Sellaisten proteiinien, jotka ovat kooltaan samanlaisia hepatitis B-viruksesta peräisin olevien, luonnollisten, glykosyloituneiden PreS,-PreS2-S-, PreS2-S- ja S-polypeptidien kanssa, läsnäolon perusteella voidaan olettaa, että glykosylaatioreitit toimivat normaalisti näissä soluissa.

3. Immunotäplitys (Western)

Westernin immunotäplitystoimenpiteellä varmistettiin, että kukin hopealla värjätyssä SDS-PAGE -geelijärjestelmässä esiintyvä erilainen polypeptidi reagoi spesifisen anti-HBV-vasta-aineen kanssa. SDS-PAGE -geelillä erottuneet proteiinit siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle (Schleicher & Schull) sähkötäplityksellä (BioRad) 4°C:n lämpötilassa, 100 V, 3 tunnin ajan. Siirtämisen jälkeen suodatin kyllästetään proteiineilla peroksidaasilla merkityn vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen välttämiseksi. Tätä varten suodatinta inkuboidaan 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa PBS-liuokses-sa, joka käsittää 20 % vastasyntyneen vasikan seerumia, ja keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikke-leiden käsittämät polypeptidit tehtiin näkyviksi peroksidaa-siin konjugoiduilla HBV-spesifisillä vasta-aineilla. Suodatin laitetaan parafilmin päälle ja peitetään konjugoitujen vasta-aineiden liuoksella 3 tunniksi huoneen lämpötilassa kosteassa kammiossa. Suodatin pestään kuuteen kertaan liuok-: sella, joka käsittää 0,5 % Tween, 10 mM Tris ja 5 mM CaCl2, minkä jälkeen se peitetään kromogeenillä, POD (o-fenyyli-diamiinidihydrokloridi) vetyperoksidissa (0,3 g/1), sitraat-tifosfaatti-puskurissa. Pysäytysliuoksena käytetään 0,5 N rikkihappoa. Kaikkia kuutta virusperäistä polypeptidiä vastaavat proteiinivyöhykkeet saadaan näkyviin eli läsnä on • kaikkia PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja.

77 95045 4. Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden käsittämässä puhdistetuissa proteiineissa, joita PreS^-PreS2-S-proteiinin koo-daava alue koodaa

Hapolla hydrolysoimisen jälkeen aminohappokoostumus PreS.j-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista puhdistetuissa proteiineissa määritetään ja sitä verrataan poly-peptidikoostumukseen, joka on saatu laskemalla S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen,nuk-leotidiketjusta. Taulukossa 3 esitetyt tulokset vastaavat hyvin DNA-ketjuista ennustettuja arvoja sekä jo julkaistuja tuloksia (Shiraishi et ai., J. Gen. Virol., Voi. 48, sivu 31, 1980). Erityisesti näiden polypeptidien tunnusomaisena piirteenä on seriinin, proliinin ja leusiinin suhteellisen suuret prosenttiset osuudet.

Taulukko 3

Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa puhdistetuissa partikkeleissa Jäännöksen prosenttinen osuus

Odotettu

Aminohapot* Määritetty S PreS^-S PreS-j-PreS^-S

ASN + ASP 5,5 4,2 5,2 7,3 1HR 7,5 8,0 7,9 7,8 SER 12,5 11,3 12,0 10,8 GLN + GLU 7,5 4,2 4,5 5,1 PRO 12,5 10,8 10,5 12,6 GLY 8,6 6,6 7,1 8,3 ALA 5,0 2,8 4,5 5,4 VAL 4,2 5,2 5,2 4,8 CYS 3,2 6,6 5,2 3,8 MET 1,9 2,3 2,2 1,9 ILE 4,9 7,5 7,5 6,7 LEO 12,8 15,5 13,9 12,1 T¥R 2,0 2,8 2,6 1,9 PHE 5,6 7,5 6,0 5,4 LYS 2,1 1,9 1,5 1,3 HIS 0,9 0,5 1,1 1,9 AFG 2,1 2,4 3,0 .3,0 98,8% 100,1% 99,9% 100,1% t ♦Tryptofaani menetetään hapolla hydrolysoitaessa 78 9 5 0 4 5 I. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen, puhdistettujen hepatitis B-partikkeleiden tarkastelu elekt-ronimikroskooppisesti

Elektronimikroskooppisesti todettiin, että puhdistetut partikkelit ovat pallomaisia 22 nanometrin partikkeleita, jotka ovat samankaltaisia kuin ne partikkelit, joita tyypillisesti muodostuu hepatitis B-viruksen S-proteiinin polypeptidien kasaantuessa.

J. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuden testaaminen

Rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua, 0,2 M Ai K(S04)2: 12 H20-liuosta lisätään steriiliin suolaliuokseen, joka sisältää antigeeniä toivottuna pitoisuutena. pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuoksella ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saostettu antigeeni otetaan talteen sentri-fugoimalla 10 minuuttia nopeudella 2000 rpm, minkä jälkeen se suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.

Alunaan absorboitujen partikkeleiden stabiilisuuden määrit-: tämiseksi antigeeni otetaan talteen liuottamalla aluna uu destaan 3 % natriumsitraattiin, minkä jälkeen sitä dialysoi-daan peräkkäin 3 % natriumsitraattia ja PBS-liuosta vastaan. Partikkeleiden määrä määritettiin sitten yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun standardin laimennoksia vastaan, jotka laimennokset oli tehty 50 % vas-• tasyntyneen vasikan seerumia sisältävään PBS-liuokseen. Sta- biilisuuskokeissa saadut tulokset (taulukko 4) osoittavat, että puhdistetut partikkelit (joko sellaisenaan tai alunaan absorboituina) ovat stabiileja 2-8°C:n lämpötilassa vähintään 7 kuukautta.

79 9 5 0 4 5

Taulukko 4 Stabiilisuuskokeet SDS-PAGE;

Tulokset vyöhykkeiden muodostumisesta Säilytys Näyte sellaisenaan Alumaan absorboitu kuukausina näyte J_2_ _J_2_

Aloitus normaali normaali normaali normaali

1 II H

2 II Π II II

2 II II II II

^ It M II II

g II n II II

g II II II M

•y II II II II

Kvantitatiivinen määritys RIA-menetelmällä

Prosenttia (%) aktiivisuudesta_ Säilytys Näyte sellaisenaan Alumaan absorboitu kuukausina näyte _ 1_2_ 1_2_

Aloitus 101 101 1 101 101 100 100 • · 2 99 99 99 100 3 100 100 99 101 4 99 100 101 99 5 102 99 99 98 6 100 101 100 100 '! 7 99 98 98 101 bo 95045 K. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden serokonversio ja EDJ0-arvo Serokonversiokokeet suoritetaan viidellä ryhmällä, jotka muodostuvat kymmenestä täysikasvuisesta valkoisesta hiirestä (kuvat 8A, 8B ja 8C). Naaraspuolisten sveitsinhiirien Gm 1CR-kantaan injektoidaan ihonalaisesti 1 ml partikkeleita sisältävää, apuaineena alunaa käyttävää rokotetta seuraavina laimennoksina: 1/1 (5,0 μg), 1/4 (1,3 μg) , 1/16 (0,31 μg), 1/64 (0,16 μg) ja 1/256 (0,078 μg). Hiirien veri otetaan talteen 28 vuorokauden kuluttua, ja vasta-ainetiitteri kvan-titoidaan AUSAB-kokeella käyttäen vertailuna HBIG-standardia. Kustakin eläimestä saatu seeruminäyte laimennettiin sarjana nelinkertaisesti ja testattiin kolminkertaisesti.

Niiden hiirien, joiden serotyyppi oli positiivinen, prosenttinen osuus väheni partikkeleiden laimennoksen suurentuessa.

Se annos, jolla 50 prosenttiin eläimistä saatiin aikaan se-ropositiivinen reaktio (EDS0) , on noin 0,05-0,25 μg partikkeleita sisältävää rokotetta. Yleisesti ottaen rokotteella saatuja serokonversion tuloksia ei voida erottaa luonnollisesta lähteestä saadulla rokotteella saaduista tuloksista.

Esimerkki 2

PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia polypeptide jä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen : : A. Yhdistelmäplasmidin pENDO-1 valmistus

Yhdistelmäplasmideista pBGHI2.8, pBR322.0G2 (plasmidi, joka on valmistettu alikloonaamalla plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan 7 kiloemäsparin suuruinen EcoRI jSG2- kappale plasmi-dista pMB9.jSG2, kuvattu julkaisussa Tilghman, S.M. et ai., Proceeding Natl. Acad. Sei., Voi. 75, sivu 725, 1978, pDM2, • POLINK 23456 (ks. jäljempänä) sekä plasmidista pMMT-neo 81 95045 saatuja geenikappaleita käytetään vektorimuodosteiden valmistusvaiheissa pyrittäessä saamaan aikaan sellaisia yhdistelemällä saatuja ilmentämisvektoreita, joissa ei ole lainkaan muita kuin HPV-peräisiä virusgenomin osia.

Kuvista 9A ja 9B nähdään, että plasmidi pBglII2.8 sisältää PreS-j-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän geeni-kappaleen (1,34 kiloemäsparin suuruisen BstEII-Hpal-kappale), ja se käsittää luonnollisen voimakkaan promoottorin PreS2“ S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, mutta siitä puuttuu luonnollinen (heikko) promoottori PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, sekä kopioitumisen päättävät toiminnot ja polyadenylaation signaali. Plasmidi pBglH2.8 pilkottiin entsyymeillä BstEII ja Hpal, jolloin saatiin kaksi DNA-kappaletta. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 3,5 % polyakryyliamidigeelillä, jonka jälkeen toinen niistä (1,34 kb), joka sisältää PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, puhdistettiin ja säilytettiin. Hpal-pää on tylppä. BstEII-pää tehtiin tylpäksi täyttämällä (tekemällä kaksijuosteiseksi) käyttäen DNA-poly-meraasia I (Klenow-kappale) ja neljää dNTP-molekyyliä, sekä tavanomaisia tekniikoita, jolloin saatiin DNA-kappale, jossa on kaksi tylppää päätä.

Polykytkijäplasmidia POLINK 23456, jossa polykytkijäalue sisältää lukuisia restriktiokohtia (jäljempänä), käytettiin.

Xbal Bell Hpal Clal Hindin Kpnl BamHI Sohi Sacl Sali

GAATTCTAGATCTGATCAGTTAACATCCATAAGCTTGGTACCGGATCCCGGGCATGCGAGCTCGAGTCGAC

* · EcoRI gain Seal XhoI

Xmal Aval

Aval

Polykytkijän sovitin (adapter) sijaitsee plasmidin pBR328 EcoRI-Sall-rajoitteisessa runkokappaleessa (3,1 kb).

82 95045 POLINK 23456 pilkotaan entsyymillä Hpal plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. Tällaisessa Hpal-entsyymillä lineaariseksi tehdyssä plasmidissa on kaksi tylppää päätä. Tämän jälkeen lineaarinen plasmidi ligatoidaan tylpistä päistään PreS1-PreS2“S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän, plas-midista pBglII2.8 (edellä) saadun, 1,34 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen kanssa. Koska 1,34 kiloemäsparin kappale voidaan sisällyttää polykytkijäplasmidiin kummallakin mahdollisella tavalla suuntautuneena, niin oikea suuntautuminen (myötäpäivään luonnollisen kopioitumissuunnan suhteen) varmistetaan pilkkomalla entsyymillä EcoRI, mitä seuraa koon analysointi 1 % agaroosigeeleillä. Kun plasmidi, joka käsittää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen oikealla tavalla suuntautuneena, pilkotaan entsyymillä EcoRI, niin tällöin saadaan kaksi 0,4 ja 4,1 kiloemäsparin suuruista kappaletta; väärä suuntautuminen johtaa kahden 1,0 ja 3,5 kiloemäsparin suuruisen kappaleen muodostumiseen. Tämän jälkeen PreS^-PreS2“S-proteiinin koodaavan alueen sisältävä uusi plasmidi pilkotaan entsyymillä Hpal ja pilkotaan "osittain" entsyymillä BamHI. Restriktiokohtien Hpal ja BamHI välinen lyhyt (24 emäsparia) ketju erotetaan "osittaisesta" Hpal-BamHI-rungosta (5,0 kb), ja heitetään pois täydellisen pilkkomisen seurauksena reaktioseoksessa olevien kappaleiden : kanssa.

Plasmidi pBR322.6G2 pilkotaan entsyymeillä Ball (tylppä pää) ja Bglll ("tarttuva" pää), jolloin saadaan hiiren globiinigeenistä peräisin olevan polyadenylaation päättä-misketjun mg-PAS-t sisältävä geeniketju (1,6 kb). Tämän * jälkeen mg-PAS-t-ketju ligatoidaan avattuun, entsyymeillä Hpal-BamHI lineaariseksi tehtyyn plasmidiin, kuvattu edellä, suunnissa Ball-Hpal ja Bglll-BamHI ("tarttuvat" Bglll-ja BamHI-päät ovat identtiset ja näin ollen yhteen sopivat, ja ne voidaan ligatoida toisiinsa), jolloin saadaan uusi välivaiheena toimiva yhdistelmäplasmidi (6,0 kb), joka sisältää sekä PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen 83 95045 että mg-PAS-t-ketjun oikealla tavalla suuntautuneina ja oikeassa järjestyksessä. Tämän jälkeen PreS1-PreS2-s“ proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävä plasmidi pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (2,95 kb ja 3,05 kb), mikä todetaan elektroforeettisesti 1 % agaroosi-geelillä. 3,05 kiloemäsparin suuruinen kappale pilkotaan entsyymillä PvuI , jolloin saadaan kaksi pienempää kappaletta (1,08 kb ja 1,98 kb), jonka jälkeen jäljellä oleva 2,95 kiloemäsparin suuruinen BglII-SalI-rajoitteinen DNA-kappale (joka ei sisällä Pvul-kohtaa), joka sisältää siihen yhteen sulautettuna PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun, puhdistetaan ja säilytetään.

Sitten plasmidi pMMT-neo, joka muodostettiin ligatoimalla osan A esimerkistä 1 saatu 6,65 kiloemäsparin kappale (katso kuva 9), pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, mikä johtaa kahteen DNA-kappaleeseen (4,23 kb ja 2,42 kb). Neo-mysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen ja SV40-viruk-sen PAS-t-ketjun sisältävä, 2,42 kiloemäsparin suuruinen kappale heitetään pois. Jäljelle jäävä 4,23 kiloemäsparin kappale puhdistetaan elektroforeettisesti käyttäen 0,8 % agaroosigeeliä, jonka jälkeen se ligatoidaan edellä saa-tuun 2,95 kiloemäsparin suuruiseen PreS^-PreS2~S-proteii-nin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävään, Bglll-Sall-rajoitteiseen DNA-kappaleeseen, jolloin saadaan 7,15 kiloemäsparin suuruinen yhdistelmäplasmidi, joka sisältää MMT-promoottorin, PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen , ja polyadenylaation ja päättymisen mg-PAS-t-ketjun, tässä järjestyksessä, ja tästä plasmidista käytetään nimitystä pENDO-1. Plasmidi pENDO-1 ei sisällä muun kuin HBV-viruksen virusgenomin osia (katso kuva 9).

B. Yhdistelmäplasmidin pENDO-2 valmistaminen

Kuten kuvasta 10 nähdään, plasmidi pDM2, joka käsittää MMT-promoottorin, PreS2”S-proteiinin koodaavan alueen ja proteiinin X koodaavan alueen, pilkotaan resktriktio- 84 95045 entsyymeillä Spel ja Sali. Spei-restriktiokohta sijaitsee PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen S-proteiinin alueessa, ja se on ainut Spel-kohta plasmidissa pDM2, Sali-kohdan tavoin, joka sijaitsee myöhemmin geenissä. Näitä kahta entsyymiä käyttäen plasmidi katkaistaan kahdeksi DNA-kap-paleeksi (1,58 ja 4,88 kb), ja PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen karboksipään ja proteiinin X koodaavan alueen sisältävä 1,58 kiloemäsparin kappale heitetään pois, kun taas 4,88 kiloemäsparin kappale puhdistetaan ja säilytetään.

Plasmidi pENDO-1 pilkotaan samoin entsyymeillä Spel ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi, jotka ovat kooltaan 1,9 ja 5,25 kb. 1,9 kiloemäsparin suuruinen kappale, joka sisältää PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta S-proteiinin alueen karboksipään, sekä mg-PAS-t-alueen, puhdistetaan ja säilytetään.

Tämän jälkeen kaksi säilytettyä DNA-kappaletta (1,9 kb ja 4,88 kb) ligatoidaan uuden yhdistelmäplasmidin (6,8 kb), pENDO-2, muodostamiseksi, joka pENDO-2 sisältää MMT-pro-moottorin, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun. Plasmidi pENDO-2 ei sisällä muun kuin HBV-virus-genomin osia (katso kuva 10).

• * C. Yhdistelmäplasmidin pENDO-O valmistaminen

Neomysiiniin perustuva valikoinnin merkitsimen sisältämä kolmas uusi plasmidi, josta käytetään nimitystä pENDO-0 (katso kuva 11), muodostetaan pilkkomalla pMMT-neo, joka : on muodostettu osan A esimerkissä 1 saadun 6,65 kiloemäs parin suuruisen kappaleen ligaatiolla (katso kuva 11), rekstriktioentsyymeillä Smal (tylppä pää) ja BamHI. Plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (5,5 kb ja 1,15 kb). Plasmidin pMMT-neo rungosta peräisin oleva, 5,5 kiloemäsparin suuruinen, MMT-promoottorin ja neomysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen sisältävä kappale säilytetään. Tämän jälkeen viimeksi mainittu kappale ligatoidaan 1,6 85 95045 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleeseen, joka sisältää Ball-Bglll-rajoitteisen mg-PAS-t-ketjun, kuten plasmidin pENDO-l muodostamisen yhteydessä esitetään. Nyt tuloksena oleva 7,2 kiloemäsparin yhdistelmäplasmidi pENDO-O sisältää MMT-promoottorin, neomysiiniin perustuvan valikoinnin mer-kitsimen ja mg-PAS-t-ketjun, eikä lainkaan virusperäisiä DNA-ketjuja (ks. kuva 11).

D. Plasmidivektoreiden pENDO-O, pENDO-l ja pENDO-2 vieminen nisäkässoluihin yhteistransfektiolla

Yhdistämällä saadut plasmidivektorit pENDO-O, pENDO-l ja pENDO-2 yhteistransfektoidaan nisäkässoluihin, kuten hiiren L-soluihin, Vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibroblasteihin käyttäen yhteistrans-fektoimiseen tavanomaisesti soveltuvia toimenpiteitä. Lääkeaineelle G418 vastustuskykyiset transfektantit eristetään ja seulotaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen partikkeleiden tuotannon suhteen käyttäen RlA-menetel-mää.

E. Plasmidien pENDO-O, pENDO-l ja pENDO-2 DNA:sta muodostuvien sekakonkatameerien valmistaminen ja transfektoiminen soluiinjoihin

Kukin plasmideista pENDO-l, pENDO-2 ja pENDO-O sisältää ainutlaatuisen restriktiokohdan PvuI, joka sijaitsee Amp-geenissä, vastapäivään EcoRI-restriktiokohdasta (ks. kuvat 9, 10 ja 11). Kukin näistä plasmideista pilkotaan erikseen entsyymillä PvuI niiden tekemiseksi lineaariseksi. Tämän jälkeen nämä plasmidit polymeroidaan sekakonkatameerien muodostamiseksi, joissa sekakonkatameereissä eri plasmideja on läsnä eri suhteissa. Esimerkiksi, kun lineaariseksi teh- \ tyjä plasmideja pENDO-l pENDO-O polymeroidaan käyttäen li- gaasia, kuten T4 DNA-ligaasia, niin tällöin voi muodostua sekakonkatameerejä, joissa plasmidien välinen suhde pENDO-l; pENDO-O on 10:1, mikäli komponentteina käytettävien, line- 86 95045 aariseksi tehtyjä plasmideja käytetään suhteessa pENDO-1: pENDO-O 10:1. Tuloksena oleva, plasmideista pENDO-1 ja pENDO-O muodostunut sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun, ja solut valikoidaan lääkeaineen G418 vastustuskyvyn perusteella. Oletetaan, että keskimäärin jokainen lääkeaineelle G418 vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää noin kymmenen kopiota PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavasta alueesta neo-geenin yhtä kopiota kohden.

Samoin pENDO-O -kappale polymeroidaan pENDO-2 -kappaleen kanssa ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla plasmidien suhteen pENDO-2:pENDO-0 ollessa 10:1, esimerkiksi, jolloin saadaan plasmideja pENDO-2 ja pENDO-O sisältäviä seka-konkatameerejä.Tämän jälkeen tämä konkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun. Sitten solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn perusteella, ja G418-vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää keskimäärin plasmidin pENDO-2 kymmenen kopiota pENDO-0:aa kohden, tässä esimerkissä.

Samoin plasmidit pENDO-1, pENDO-2 ja pENDO-O polymeroidaan ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla, sekakonkatameerin muodostamiseksi, jossa konkatameerissä suhde pENDO-1:pENDO-2: pENDO-O on esimerkiksi 10:10:1. Tuloksena oleva sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, esimerkiksi nisäkässoluun, ja solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn • perusteella. Vastustuskykyisten (transfektoituneiden) so lujen tulisi sisältää keskimäärin kymmenen kopiota plasmi-dista pENDO-1, kymmenen kopiota plasmidista pENDO-2 ja yhden kopion plasmidista pENDO-O.

Kunkin tuloksena olevan, lääkeaineelle vastustuskykyisen solun tulisi tuottaa suurempina saantoina PreS^-PreS2~S-pro-'* teiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja sisältäviä partikkeleita. 1 87 95045

Replikoitumattornien, hiiren metallotioneiinipromoottorin käsittävien vektorien käyttäminen muiden proteiinien ilmentämiseen transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntä-soluissa .

Tämä keksintö käsittää samoin yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadut siirtovektorit, joissa käytetään mitä tahansa toiminnallista DNA-ketjua ihmisen tai rotan kasvuhormonin tuottamiseksi transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntäsoluissa.

Käsitteellä toiminnallinen DNA-ketju tarkoitetaan mistä tahansa lähteestä suoraan tai epäsuoraan saatua erillistä DNA-aluetta, joka toimii tämän keksinnön mukaisella vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa täydellisenä ilmentyvänä geeniyksikkönä, rakenteellisena geeninä, promoottorina tai säätelevänä alueena.

Täydellisellä ilmentyvällä geeniyksiköllä tarkoitetaan rakenteellista geeniä, promoottoria ja sääteleviä alueita, jotka ovat edellytyksenä sen kopioitumiseen ja luentaan.

Promoottorilla tarkoitetaan mitä tahansa rakenteellisen geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa aluetta, joka mahdollistaa RNA-polymeraasin sitoutumisen ja kopi-oitumisen tapahtumisen.

Säätelevällä alueella tarkoitetaan mitä tahansa aluetta, joka säätelee rakenteellisen geenin kopioitumisnopeutta.

Rakenteellisella geenillä tarkoitetaan koodaavaa ketjua, joka toimii mallina lähetti-RNA:n synteesissä.

Edullisia rakenteellisia geenejä ovat esimerkiksi farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavat ra-. kenteelliset geenit ja näistä polypeptideistä mainittakoon virusantigeeni, insuliini, interferoni, lymfokiinit, rotan 88 95045 tai ihmisen kasvuhormonit, kudoksen plasminogeeniaktivaat-tori, alfa-l-antitrypsiini ja muut vastaavat. Edullisin on rotan tai ihmisen kasvuhormoni.

Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-vektoriin, joka käsittää toiminnallisen DNA-ketjun ja MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko tämän DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi tai luonnollisen promoottorin tilalle. MMT-promoottori sijaitsee mieluiten DNA-vektorissa välittömästi ylävirran puolella DNA-ketjun proteiinia koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään myös kopioitumisen päätty-misketjun ja valikoinnin merkitsimen. Tällainen merkitsin on mielellään lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Tällainen kopioitumisen päättymisketju on mielellään SV40-päättymiskohta (sv-PAS-t) tai mieluummin hiiren globiinigeenin DEF-alue (mg-PAS-t). Tällainen vektori voidaan valmistaa tavanomaisilla yh-distelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t-aluetta käyttäen vektori ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-kappaleita, ja se ei ole onkogeeninen, eli se ei transformoi (tee syöpää muodostavaksi) isäntäsolua, johon se : on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isän tään, se yhtenäistyy isännän kromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa, mikäli vektori ei sisällä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa isännässä.

Tämän keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-vektorin tulisi mielellään käsittää seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) mielenkiinnon kohteena oleva DNA-ketju; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella mielenkiinnon kohteena olevasta DNA-ket-justa; 3) vektorin tulisi kyetä replikoitumaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on trans- 89 95045 formoitu, kasvua ja monistumista varten, yhdistelmävektorin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäinen tai muu prokariootti-nen replikoni, eli sellainen DNA-kappale, joka käsittää ne kaikki toiminnot, jotka ovat välttämättömiä vektorin autonomiseen replikoitumiseen ja sen säilymiseen kromosomien ulkopuolella prokarioottisessa isäntäsolussa, esimerkiksi isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja.

i 4) Vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli mielellään pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen geneettinen ja molekyylibiologinen manipulointi olisi helppoa.

5) Vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin/ mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva valikoinnin merkitsin^ jota voidaan käyttää vektorilla transformoidussa, isäntänä toimivassa bakteeri-solussa .

6) Vektorin tulisi käsittää myös toinen valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin/ jota voidaan käyttää tällä vektorilla transfektoidussa, isäntänä toimivassa eukarioottisessa solussa.

* 7) Vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restriktiokohtia kloonaamista varten.

8) Vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättymisketju ja polyadenylaatioketju.

9) Ilmentyvä geeniyksikkö ei sisällä lainkaan viruspe- : räisiä kappaleita ja se ei ole onkogeeninen.

* »

Edullisimmassa tapauksessa tämän keksinnön mukainen vektori ei käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy replikoitu-. mattoman vektorijärjestelmän käyttöön eukarioottisissa isäntäsoluissa on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuolella 90 95045 tapahtuvaan replikoitumiseen vektorilla transfektoidussa, eukarioottisessa, isäntänä toimivassa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista peräisin olevia rep-likoneja. On toivottavaa käyttää vektoreita, joiden DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista, ilmennettäessä farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavia DNA-ketjuja.

Tämä keksintö kohdistuu samoin transfektoituun eukarioot-tiseen isäntäsoluun, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisen toiminnallisen DNA-ketjun sisältävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tällainen isäntä on mielellään nisäkäs-solu,' mieluiten kiinanhamsterin munasarjasta (CHO) saatu solulinja, verosolulinja, L-solulinja tai hiiren tai rotan fibroblastinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan saada aikaan transfektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, tavanomaisia tekniikoita käyttäen.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään mielenkiinnon kohteena olevan DNA-ketjun koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, jossa partikkelissa vähintään yksi näistä proteiineista vastaa mielenkiinnon kohteena : olevan DNA-ketjun koodaamaa polypeptidiä, tämän menetelmän käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja, ja b) tällaisen partikkelin eristämisen.

. Tällainen transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittä- • mään nämä partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit alustaan. Tällaiseen viljelyalustaan lisätään mielellään raskasmetallien ioneja tai steroidihormonia, kuten deksametasonia, MMT-promoottorin indusoimiseksi ja täten tällaisen koodaa-van alueen ilmentymisen edistämiseksi. Raskasmetallien ioneina käytetään mieluiten kadmiumin tai sinkin ioneja.

• !

Raskasmetallien ionien tai steroidihormonin optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisilla menetelmillä .

Il 9, 95045

Mikäli tämän keksinnön mukaisella menetelmällä transfektoitu isäntäsolu erittää nämä partikkelit suoraan viljely-alustaan, niin nämä partikkelit voidaan tällöin eristää tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelyalustasta proteiinien puhdistamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla.

Esimerkki 3

Ihmisen kasvuhormonin ilmentäminen

Ihmisen kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin käsittäessä metallotioneiinip-romoottorin A. Ihmisen kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappaleen eristäminen siten, ettei DNA-kappale käsitä kopioitumisen luonnollista promoottoria

Yhdistelmäplasmidi pBR322, jonka sisältämä 2 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostama istute koodittaa ihmisen kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkotaan restriktioendonukleaasilla BamHI 500 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 100 μ<3 plasmidi-DNA:ta, 240 yksikköä entsyymiä BamHI,

BamHI-puskurissa (runsaasti suolaa sisältävä puskuri).

Tällöin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on noin 5,6 kb ja toinen kappale 0,8 kb. Nämä kappaleet erotetaan elekt-roforeettisesti käyttäen preparatiivista 0,8 % agaroosigee-liä. Suurempi kappale, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin rakenteellisen geenin ilman tämän geenin luonnollista promoottoria, eluoidaan sähköisesti geeliltä ja puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kahdesti kloroformilla ja saostamalla kahdesti 92 95045 etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mik-rolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

B. Metallotioneiinipromoottorin ja vektorin pML2 rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminen

Plasmidi pMMT-neo (katso kuva 5) pilkotaan restriktioendo-nukleaaseilla Bglll ja BamHI, jolloin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on 4,5 kiloemäsparin suuruinen ja sisältää MMT-promoottorin ja pML2-vektorin rungon, ja toinen 2,15 kiloemäsparin suuruinen, ja se sisältää sv-PAS-t-alu-eeseen kytkeytyneen neo-geenin. Jotta itsestään ligatoitu-minen voitaisiin estää, lineaarinen DNA käsitellään alkali-sella fosfataasilla 100 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 25 yg DNA-kappaletta ja 28 yksikköä alkalista fosfataasia. Seosta inkuboidaan 20 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, ja reaktio pysäytetään lisäämällä 10 yl 50 mM EDTA-liuosta ja kuumentamalla 10 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa. Kappaleet erotetaan elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeeliä käyttäen. 4,5 kiloemäsparin kappale elu-oidaan sähköisesti geeliltä kuvatulla tavalla, ja se puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, kahdesti kloroformilla ja seostamalla kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

C. Edellä kohdissa A ja-B eristettyjen DNA-kappaleiden ligaatio ·. Edellä kohdassa A eristettyä 5,6 kiloemäsparin suuruista kappaletta otetaan 1,5 mikrogramman suuruinen määrä ja se sekoitetaan 0,3 mikrogrammaan edellä kohdassa B eristettyä kappaletta 10 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 1 x ligaatiopuskuria, sekä 100 mM ATP:tä. Seosta inkuboidaan 1 tunti 15 °C:n lämpötilassa ja yön yli 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen ligaatioseos viedään bakteerikantaan HB101 käyttäen mene 93 95045 telmää, joka kuvataan osassa Materiaalit ja menetelmät. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliinia sisältäville LB-agarmaljoille, ja eristetystä pesäkkeistä seulotaan ne, jotka sisältävät 10,1 kiloemäs-parin suuruisia, restriktioendonukleaasilla BamHI lineaariseksi tehtävissä olevia plasmideja. Suuntautuminen määritetään entsyymillä EcoRI pilkkomalla. Plasmideista, jotka sisältävät istutteen oikealla tavalla suuntautuneena, saadaan kaksi EcoRI-kappaletta, jotka ovat kooltaan 3,5 kb ja 6,6 kb. Näitä plasmideja, joista käytetään nimitystä pMMT-hGH, kasvatetaan suuressa mitassa ja ne puhdistetaan kuvatulla tavalla.

D. Edellä kohdassa C saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vieminen nisäkässoluihin ja ihmisen kasvuhormonia tuottavien so-lulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-hGH transfektoidaan eukarioot-tisiin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) käyttäen yhteis-transfektoinnin tavanomaisia tekniikoita, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat ihmisen kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen ihmisen kasvuhormonia vastaan vaikut-. tavia vastai-aineita. Ihmisen kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solusukupolvi tavanomaisia tekniikoita käyttäen.

Esimerkki 4

Rotan kasvuhormonin ilmentäminen

Rotan kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin sisältäessä metallotioneiini-promoottorin A. Restriktioendonukleaasin Bglll kohdan muuntaminen plas-midissa pMMT-neo Xhol-kohdaksi 200 mikrogramman suuruinen määrä plasmidia pMMT-neo pilkotaan 500 yksiköllä restriktioendonukleaasia Bglll keskimää- 94 95045 räisesti suolaa sisältävässä puskurissa, reaktion kokonaistilavuuden ollessa 1000 yl. 6,65 kiloemäsparin suuruisen lineaarisen plasmidi-DNA:n päät tehdään ensin tylpiksi täyttämällä Bglll-päät DNA-polymeraasilla I (Klenow-kappale) ja käyttämällä neljää dNTP-molekyyliä kuten aikaisemmin esitetään, jonka jälkeen siihen kiinnitetään re-striktioendonukleaasin XhoI tunnistamis- ja pilkkomiskoh-dan sisältävä seuraava synteettinen DNA-kytkijäkappale (yhtiöstä PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin 53205): 5'-CCTCGAGG-3' 3'-GGAGCTCC-5' Täyttämisreaktio toteutetaan 30 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 2,5 yg 6,65 kiloemäsparin suuruista kappaletta, 20 mM neljää dNTP molekyyliä, 3 yl NT-pusku-ria, 1 yl Klenow-kappaletta. Seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio pysäytetään lisäämällä • 2 yl 0,25 mM EDTA-liuosta ja DNA pestään kertaalleen yhtä suurella tilavuudella fenolin ja kloroformin seosta, ja sitten yhtä suurella tilavuudella pelkkää kloroformia. Ve-sifaasin sisältämä DNA puhdistetaan edelleen seostamalla kahteen kertaan etanolilla. Saostunut DNA suspendoidaan uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0, pitoisuudeksi 50 ng/yl.

Kytkijäkappale liuotetaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,1, pitoisuudeksi 1 pikomooli/yl. Päistään tylppä 6,65 kiloemäsparin kappale ligatoidaan kytkijä-kappaleeseen 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka * sisältää 2 pikomoolia kytkijäkappaletta, 0,5 yg 6,65 kilo emäsparin kappaletta, 9 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim), 30 yl 2 x tylpän pään ligaatiopuskuria sekä 100 mM ATPjtä. Ligaatioreaktion annetaan edetä 15 °C:n lämpötilassa tunnin ajan ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tätä ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 trans-formoimiseen, joka kanta on tehty vastaanottavaksi (compe- 95 95045 tent) osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatulla tavalla. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliiniä sisältäville LB-agarmaljoille. Bakteeripesäkkeet jotka kykenevät kasvamaan ampisilliinia sisältävillä maljoilla otetaan talteen ja kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä ja niistä eristetään plasmidi edellä kuvatusti.

Todettiin, että 12 bakteeripesäkkeestä neljä (OK 3, OK 4, OK 11 ja OK 12) käsitti plasmidin, joka oli odotetun kokoinen pelkällä entsyymillä XhoI tai sekä entsyymillä BamHI että entsyymillä EcoRI pilkkomisen jälkeen. Kloonien OK 3 ja OK 11 plasmidi-DNA:n annettiin lisääntyä HB101-kannassa plasmidin tuottamiseksi suuressa mitassa.

B. Metallotioneiinipromoottorin ja pML2-vektorin rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminen

100 mikrogramman suuruinen määrä sekä kloonia OK 3 että v kloonia OK 11 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla BamHI

ja XhoI, jolloin saatiin kaksi kappaletta, joista toinen (5,8 kb) käsitti MMT-promoottorin Xhol-pään läheisyyteen sijoittuneena ja pML2-osan BamHI-päässä, ja toinen (0,85 kb) kappale sisälsi sv-PAS-t-ketjun. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeelillä. 5,8 kiloemäs-parin kappale puhdistettiin sähköisesti eluoimalla, jonka jälkeen se uutettiin kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uutettiin kahdesti kloroformilla ja se saos-tettiin kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

C. Rotan kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappaleen eristäminen

Plasmidi pBR322.rGH, jonka sisältämä genominen BamHI-istute koodittaa rotan kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkottiin entsyymeillä BamHI ja XhoI. Rakenteellisen geenin sisältävä genominen BamHI-XhoI-kappale eristetään edellä kuvatusti 0,8 % preparatiiviselta agaroosigeeliltä.

96 9 5 0 4 5 D. Edellä kohdissa B ja C eristettyjen kappaleiden ligaatio Nämä kappaleet ligatoidaan toisiinsa siten, että MMT-pro-moottori kytkeytyy tarttuvan Xhol-pään välityksellä suoraan rakenteelliseen geeniin tarttuvan Xhol-päänsä välityksellä, oikealla tavalla suuntautuneena.

Ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 tranformoin-tiin edellä esitetystä. Ampisilliinia sisältäville LB-agar-maljoille pesäkkeitä muodostavat transformantit otetaan talteen ja niitä kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä plasmidin pienten määrien valmistamiseksi. Plasmideja, joista saadaan kaksi odotusten mukaista kappaletta entsyymeillä BamHI ja XhoI pilkottaessa, ja joista käytetään nimitystä pMMT-rGH, kasvatetaan suuressa mitassa nisäkäs-soluihin transfektointia varten.

’ E. Edellä kohdassa D saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vie minen nisäkässoluihin ja rotan kasvuhormonia tuottavien solulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-rGH transfektoidaan eukariootti-siin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) yhteistransfektoin-^ nissa tavanomaisesti käytettävillä tekniikoilla, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat rotan kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen rotan kasvuhormonia vastaan vaikuttavia vasta-aineita'. Rotan kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solulinja tavanomaisia ·. tekniikoita käyttäen.

Vaikka tämä keksintö onkin kuvattu edullisten suoritusmuoto jensa avulla, niin kuitenkin alan asiantuntijalle on selvää, että keksintöön voidaan tehdä muodollisia ja yksityiskohtaisia muutoksia kuitenkaan poikkeamatta keksinnön hengestä ja tavoitteista.

Claims (23)

97 9 5 0 4 5

1. Rekombinant-DNA-vektor, kännetecknad av att den inne-hdller en DNA-kedja som kodar ett omräde som kodar PreS,- '· PreS2-S-protein av hepatitis B virus och som vidare innehäl-ler en metalltioneinpromotor hos mus, och att den inte inne-häller onkogena virala sekvenser.

1. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsittää DNA-ketjun, joka koodaa hepatitis B-viruksen PreSi-PreS2- S-proteiinia koodaavan alueen ja joka lisäksi käsittää hiiren metallitioneiinipromoottorin, ja että se ei sisällä on-kogeenisiä viraalisia sekvenssejä.

2. Vektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att metall-tioneingenpromotorn ingär i vektorn som innehäller DNA-ked- ... jän antingen jämte den naturliga promotorn av hepatitis B eller i stället för den, heist omedelbart uppströms frän de omräden som kodar PreS,-PreS2-S-protein.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, tunnettu siitä, että metallotioneiinigeenin promoottori sisältyy DNA-ketjun käsittävään vektoriin joko hepatitis B:n luonnollisen promoottorin lisäksi tai sen asemasta, mieluiten välittömästi ylävirran puolelle PreSj-PreS^S-proteiinia koodaavista alueista.

3. Vektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den vidare omfattar en selektionsmarkör, gärna en medicinresis-tensmarkör, säsom en neomycinresistensgen, och/eller kopie- 95045 ringens slutpunkt, exempelvis slutpunkten för SV40-virus eller DEF-omradet for globingen hos mus.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen valikointimerkitsimen, mielellään lääkeaineresistenssimerkitsimen, kuten neomysiinin resis-tenssigeenin, ja/tai kopioitumisen päättymiskohdan, esimerkiksi SV40-viruksen päättymiskohdan tai hiiren globiinigee-nin DEF-alueen.

4. Vektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att denna vektor inte innehäller andra DNA-segment härstammande frän virus.

4. Patenttivaatimuksen l mukainen vektori, tunnettu siitä, että tämä vektori ei sisällä muita virusperäisiä DNA-segmenttejä. ·; 5. Yhdistelmä-DNA-konkatameeri, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisenä vektorinaan patenttivaatimuksen 1 mukaisen vektorin ja toisen vektorin, joka käsittää hepatitis B:n pinta-antigeenin PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai S-proteiinin koodaavan alueen. * 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen konkatameeri, tunnettu siitä, että metallotioneiinigeenin promoottori sisältyy li-sävektoriin, ja se sijaitsee mielellään välittömästi ylävirran puolella PreS2-S-proteiinia koodaavasta alueesta.

5. Rekombinant-DNA-konkatamer, kännetecknad av att den som första vektor innehäller vektorn enligt patentkrav l och en andra vektor, som omfattar ett omräde som kodar PreS2-S-protein av en ytantigen av hepatitis B eller ett omräde som kodar S-protein.

6. Konkatamer enligt patentkrav 5, kännetecknad av att metal It ioneingenpromo torn ingär i en tillsatsvektor, och den befinner sig gärna omedelbart uppströms frän omrädet som kodar PreS2-S-protein.

7. Konkatamer enligt patentkrav 5, kännetecknad av att den första vektorn och/eller tillsatsvektorn innehäller kopie-ringens slutpunkt, säsom DEF-omrädet i globingen hos mus, och/eller en selektionsmarkör.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen konkatameeri, tunnettu siitä, että ensimmäinen vektori ja/tai lisävektori käsittää τ 98 95045 kopioitumisen päättymiskohdan, kuten hiiren globiinigeenin DEF-alueen, ja/tai valikointimerkitsimen.

8. Konkatamer enligt patentkrav 5, kännetecknad av att nämnda DNA-vektorer inte innehäller andra DNA-segment härstammande frän virus.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen konkatameeri, tunnettu siitä, että mainitut DNA-vektorit eivät sisällä muita virusperäisiä DNA-segmenttejä.

9. Däggdjurscell, kännetecknad av att den transfekterats med en rekombinant-DNA-vektor enligt nägot av patentkraven 1-4, eller en konkatamer enligt nägot av patentkraven 5-8.

9. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on transfektoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla tai jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukaisella konkatameerillä.

10. Däggdjurscell, kännetecknad av att den kotransfekterats med en rekombinant-DNA-vektor enligt patentkrav 1-4 definie-rad som första rekombinant-DNA-vektor samt en andra rekombinant -DNA- vektor, som omfattar ett omräde som kodar PreS2-S-protein, samt en tredje rekombinant-DNA-vektor, som omfattar en metalltioneingenpromotor och en selektionsmarkör, varvid 102 95045 denna metalltioneingenpromotor befinner sig i denna tredje vektor gärna omedelbart uppströms frän selektionsmarkören.

10. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on kotransfektoitu patenttivaatimuksien 1-4 mukaisella, ensimmäiseksi yhdistelmä -DNA- vektoriksi määritetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla sekä toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2- S-proteiinia koodaavan alueen sekä kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää metallotioneiinigeenin promoottorin ja valikointimerkitsimen, tämän metallotioneiinigeenin promoottorin sijaitessa tässä kolmannessa vektorissa mielellään välittömästi ylävirran puolella valikointimerkit-simestä.

11. Cell enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad av att metalltioneingenpromotorn ingär i en andra vektor och att den befinner sig gärna omedelbart uppströms frän omrädet som kodar PreS2-S-protein.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että metallotioneiinigeenin promoottori sisältyy toi- • seen vektoriin, ja se sijaitsee mielellään välittömästi ylä virran puolella PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta.

12. Cell enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad av att den andra och/eller tredje vektorn innesluter kopieringens slutpunkt, säsom DEF-omrädet i globingen hos mus, och/eller den andra vektorn omfattar en selektionsmarkör.

12. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että toinen ja/tai kolmas vektori käsittää kopioitu-misen päättymiskohdan, kuten hiiren globiinigeenin DEF-alu- « een, ja/tai toinen vektori käsittää valikointimerkitsimen.

13. Cell enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad av att den andra och/eller tredje DNA-vektorn inte innehäller andra DNA-segment härstammande frän virus.

13. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että toinen ja/tai kolmas DNA-vektori ei sisällä muita virusperäisiä DNA-segmenttejä. 99 95045

14. Cell enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad av att nämnda DNA-vektorer innehäller olika selektionsmarkörer.

14. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainitut DNA-vektorit käsittävät erilaiset vali-kointimerkitsimet.

15. Cell enligt patentkrav 10, kännetecknad av att den första, andra och/eller tredje vektorn innehäller en repii-kon.

15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että ensimmäinen, toinen ja/tai kolmas vektori käsittää rep-1ikonin.

16. Cell enligt nägot av patentkraven 9-15, kännetecknad av : : att den eukaryotiska cellen är en däggdjurscell, säsom en äggstockscell frän kinesisk hamster, vero-cell, L-cell, en fibroblastisk cell frän mus eller en fibroblastisk cell frän rätta.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 9-15 mukainen solu, tunnettu siitä, että eukarioottinen solu on nisäkässolu, kuten kii-nanhamsterin munasarjasolu, vero-solu, L-solu, hiiren fibro-blastinen solu tai rotan fibroblastinen solu.

17. Förfarande för framställning av den eukaryotiska cellen enligt patentkrav 9, kännetecknat av att förfarandet omfattar transfektering av den eukaryotiska cellen med en rekom-binant-DNA-vektor enligt nägot av patentkraven 1-4 eller en konkatamer enligt nägot av patentkraven 5-8.

17. Menetelmä patenttivaatimuksen 9 mukaisen eukarioottisen solun valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla tai jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukaisella konkatameerillä.

18. Förfarande för framställning av den eukaryotiska cellen enligt patentkrav 9, kännetecknat av att förfarandet omfat- 103 9 5 0 4 5 tar kotransfektering av den eukaryotiska cellen med en re-kombinant-DNA-vektor enligt nägot av patentkraven 1-4 samt en andra rekombinant-DNA-vektor, som definieras i nägot av patentkraven 10 och 11-14.

18. Menetelmä patenttivaatimuksen 9 mukaisen eukarioottisen solun valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää eukarioottisen solun kotransfektoimisen jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla sekä toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka määritellään jossakin patenttivaatimuksessa 10 sekä 11-14. • · »

19. Förfarande för framställning av den eukaryotiska cellen enligt patentkrav 10, kännetecknat av att förfarandet omfattar kotransfektering av den eukaryotiska cellen med en re-kombinant-DNA-vektor enligt nägot av patentkraven 1-4 samt en andra och tredje rekombinant-DNA-vektor, som definieras i nägot av patentkraven 10-16.

19. Menetelmä patenttivaatimuksen 10 mukaisen eukarioottisen solun valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää eukarioottisen solun kotransfektoimisen jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla sekä toisella ja kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, jotka määritellään jossakin patenttivaatimuksessa 10-16.

20. Förfarande enligt patentkrav 19, kännetecknat av att DNA-vektorerna kotransfekteras som parvisa kombinationer eller transfekteras alla tillsammans eller transfekteras i successiva steg.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-vektorit kotransfektoidaan parittaisina yhdistelminä tai ne kaikki transfektoidaan yhdessä tai ne transfektoidaan peräkkäisissä vaiheissa. loo 95045

21. Förfarande för framställning av en partikel som omfat-tar proteiner som kodas av ett omräde som kodar PreS,-PreS2- S-protein av en ytantigen av hepatitis B virus, kännetecknat av att minst en av dylika proteiner motsvarar hela den poly-peptid som kodas av omrädet som kodar PreS^PreSj-S-protein, varvid förfarandet omfattar: a) odling av en transfekterad eller kotransfekterad värdcell enligt nägot av patentkraven 9-16 under sädana förhällanden pä ett odlingssubstrat att värdcellen förmär uttrycka denna partikel; och b) isolering av denna partikel.

21. Menetelmä hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin PreS^ PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vähintään yksi tällaisista proteiineista vastaa koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamaa polypepti-diä, tämän menetelmän käsittäessä: a) jonkin patenttivaatimuksen 9-16 mukaisen transfektoidun tai kotransfektoidun isäntäsolun viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että isäntäsolu kykenee ilmentämään tämän partikkelin; ja b) tämän partikkelin eristämisen.

22. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat av att tungmetaller säsom kadmium eller zink, eller steroidhormoner säsom dexametason tillsätts i odlingssubstratet för att in-ducera metalltioneingenpromotorn.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raskasmetalleja, kuten kadmiumia tai sinkkiä, tai steroidihormoneja, kuten deksametasonia, lisätään vilje-lyalustaan metallotioneiinigeenin promoottorin indusoimisek- si.

23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että partikkelit eristetään isäntäsolun viljelmän lysaatista.

23. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat av att partiklarna isoleras frän lycatet i värdcellodlingen.