JP2002536384A

JP2002536384A - Ｔヘルパー細胞エピトープ

Info

Publication number: JP2002536384A
Application number: JP2000597449A
Authority: JP
Inventors: ジャクソン，デービッド，チャールズ; ソウラビ，ゴシュ; ウォルカー，ジョン
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-07
Publication date: 2002-10-29
Anticipated expiration: 2020-02-07
Also published as: AU2783600A; EP1147212A1; KR100905264B1; US7097844B2; CY1109710T1; KR20090015892A; JP4699612B2; US20050186220A1; ES2332701T3; KR100955668B1; PT1147212E; US7572454B2; US6685947B1; US20070248615A1; DK1147212T3; US20060199177A1; EP2103691A1; AU765164B2; ZA200106413B; EP1147212B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Tヘルパー細胞エピトープおよび該エピトープを少なくとも１種含む、免疫応答誘導のための組成物を提供する。該エピトープは、SSKTQTHTQQDRPPQPS; QPSTELEETRTSRARHS; RHSTTSAQRSTHYDPRT; PRTSDRPVSYTMNRTRS; TRSRKQTSHRLKNIPVH; SHQYLVIKLIPNASLIE; IGTDNVHYKIMTRPSHQ; YKIMTRPSHQYLVIKLI; KLIPNASLIENCTKAEL; AELGEYEKLLNSVLEPI; KLLNSVLEPINQALTLM; EPINQALTLMTKNVKPL; FAGVVLAGVALGVATAA; GVALGVATAAQITAGIA; TAAQITAGIALHQSNLN; GIALHQSNLNAQAIQSL; NLNAQAIQSLRTSLEQS; QSLRTSLEQSNKAIEEI; EQSNKAIEEIREATQET;TELLSIFGPSLRDPISA; PRYIATNGYLISNFDES; CIRGDTSSCARTLVSGT; DESSCVFVSESAICSQN; TSTIINQSPDKLLTFIA, SPDKLLTFIASDTCPLV 及び SGRRQRRFAGVVLAGVAからなる群より選択されるペプチド配列内に含まれている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、イヌジステンパーウイルス（Canine Distemper Virus）（CDV）由
来のTヘルパー細胞エピトープに関する。本発明は少なくとも1つのTヘルパー細
胞エピトープならびに場合によってはB細胞エピトープおよび／またはCTLエピト
ープを含む組成物に関する。

【０００２】発明の背景有効な抗体応答を誘導できるいずれのペプチドも、免疫系により認識されるエ
ピトープとして知られるアミノ酸の特定の配列を含有しなければならない。特に
、抗体応答については、エピトープは、Bリンパ球表面に存在する特異的な免疫
グロブリン（Ig）受容体により認識される必要がある。これらの細胞がこのエピ
トープに対して特異的抗体を産生する能力のある形質細胞に最終的に分化するか
らである。これらのB細胞エピトープに加えて、免疫原は、抗原提示細胞（APC）
がヘルパーTリンパ球上に存在する特異的受容体に対して提示するエピトープも
含有しなければならない、というのはヘルパーTリンパ球は、B細胞が抗体産生細
胞に分化するために必要とするシグナルを提供する必要があるからである。

【０００３】ウイルス感染症の場合におよび多くの癌の場合に、抗体の再生利用は限られて
おり、その免疫系はウイルス感染細胞または癌細胞を死滅し得る細胞傷害性T細
胞（CTL）と応答する。ヘルパーT細胞と同じように、CTLは最初、表面上に提示
された特異的なペプチドエピトープをもつAPCとの相互作用により活性化される
が、この時、MHCクラスII分子よりもむしろMHCクラスIに関連する。活性化され
ると、CTLは、上記ペプチド／クラスI複合体を保持する標的細胞を捕らえて（en
gage）、溶解を引き起こし得る。このプロセスにおいてヘルパーT細胞がある役
割を果たすことも明らかになっており；APCがCTLを活性化できるようになる前に
、該APCは最初にヘルパーT細胞から必要な同時刺激性分子(costimulatory molec
ules)の発現をアップレギュレートするためのシグナルを受けなければならない
。

【０００４】ヘルパーT細胞エピトープは、APC表面上に存在して主要組織適合性複合体（MH
C）のクラスII遺伝子によりコードされた分子と結合する。次いで、Tヘルパーリ
ンパ球表面の特異的T細胞受容体（TCR）は、クラスII分子とペプチドエピトープ
との複合体を認識する。このようにして、MHC分子と関係をもつ抗原エピトープ
を提示されたT細胞は活性化され、Bリンパ球が分化するために必要なシグナルを
提供することができる。伝統的にペプチド免疫原のためのヘルパーT細胞エピト
ープの供給源はペプチドが共有結合した担体タンパク質であるが、この結合過程
は、結合プロセスにおいて抗原決定基を改変することおよび担体に対する抗体誘
導にペプチドを指向する抗体を費やすことなどの、他の問題を引き起こしうる（
Schutze, M. P., Leclerc, C. Jolivet, M. Audibert, F. Chedid, L. "Carrier
-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccin
es（担体誘導エピトープ抑制、将来の合成ワクチンに対する大きな論点）". J I
mmunol. 1985, 135, 2319-2322；DiJohn, D., Torrese, J． R． Murillo， J．
Herrington， D. A.ら， "Effect of priming with carrier on response to c
onjugate vaccine（複合ワクチンへの応答に対する担体を用いた初回免疫の効果
）". The Lancet. 1989, 2, 1415-1416）。さらに、調製時における無関係なタ
ンパク質の使用は品質管理の議論を起こす。ペプチドワクチンの設計において適
当な担体タンパク質を選ぶことは非常に重要であり、それらの選択は毒性および
大規模生産の実施可能性などの因子により制限される。この方法には他の制限が
あり、結合可能なペプチド体のサイズおよび安全に投与できる担体の投与量が挙
げられる（Audibert, F. a. C., L. 1984. "Modern approaches to vaccines. M
olecular and chemical basis of virus virulence and immunogenicity（ワク
チンへの現代的手法ウイルス毒性および免疫原性の分子的および化学的基礎）
"., Cold Spring Harbor Laboratory, New York.）。担体分子は強い免疫応答の
誘導を可能にするが、これら担体分子はまた、抗ペプチド抗体応答の抑制のよう
な望まない効果も随伴する（Herzenberg, L. A. and Tokuhisa, T. 1980. "Carr
ier-priming leads to hapten-specific suppression（担体初回免疫はハプテン
特異的な抑制をもたらす）". Nature 285:664；Schutze, M. P., Leclerc, C.,
Jolivet, M., Audibert, F.およびChedid, L. 1985. "Carrier-induced epitopi
c suppression, a major issue for futrue synthetic vaccines（担体誘導エピ
トープ抑制、将来の合成ワクチンの大きな論点）". J Immunol 135:2319；Etlin
ger, H. M., Felix, A. M., Gillessen, D., Heimer, E.P., Just, M., Pink, J
. R., Sinigaglia, F., Sturchler, D., Takacs, Gl, Trzeciak, A.ら， 1988.
"Assessment in humans of a synthetic peptide-based vaccine against the s
porozoite stage of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum（ヒ
トマラリア寄生虫、Plasmodium falciparumの種虫（sporpzoite）段階に対する
合成ペプチドに基づくワクチンのヒトにおける評価）". J Immunol 140:626）。

【０００５】従って、一般的に、免疫原は、細胞傷害性T細胞上に存在する表面Igによりま
たは受容体により認識されるエピトープに加えて、ヘルパーT細胞により認識さ
れ得るエピトープも含有しなければならない。これらのエピトープのタイプは非
常に種々であることを理解されるべきである。B細胞エピトープについては、B細
胞受容体は元来の免疫原と直接結合するので、コンフォメーションが重要である
。対照的に、T細胞により認識されるエピトープは、エピトープのコンフォメー
ションの完全さに依存するのでなく、CTLに対してはほぼ9個のアミノ酸の短い配
列およびヘルパーT細胞に対しては長さの制限が少ない若干長い配列から構成さ
れる。これらのエピトープに対する要件は単に、該エピトープがクラスIまたは
クラスII分子の結合クレフト（cleft：裂け目）とそれぞれ適合し得て、かつそ
の複合体が次にT細胞受容体と結合し得ることである。クラスII分子の結合部位
は両方末端が開放されていて、結合されるペプチドの長さにおける非常に大きな
変化を許容し（Brown, J. H., T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R
. G. Urban, J. L. Strominger and D. C. Wiley. 1993. "Three-dimensional s
tructure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1（ヒト
のクラスII組織適合性抗原HLA-DR1の3次元構造）, Nature 364:33）"、8個とい
う短いアミノ酸残基のエピトープが報じられている（Fahrer, A. M., Geysen, H
. M., White, D. O., Jackson, D. C.およびBrown, L. E. "Analysis of the re
quirements for class II-restricted T-cell recognition of a single determ
inant reveals considerable diversity in the T-cell response and degenera
cy of peptide binding to I-Ed（単一決定基がクラスII制限されたT細胞を認識
するための要件の分析は、T細胞応答のかなりの多様性およびI-Edへのペプチド
結合の縮重（degeneracy）を表す）". J. Immunol 1995. 155:2849-2857）。

【０００６】イヌジステンパーウイルス（CDV）は、ネガティブ鎖RNAウイルスのパラミキソ
ウイルス（paramyxovirus）ファミリーのモルビリウイルス（morbillivirus）サ
ブグループに属する。このグループのメンバーである他のウイルスは麻疹ウイル
ス（measles virus）および牛疫ウイルス（rinderpest virus）である。ペプチ
ドベースのワクチンの開発は、タンパク質配列からのBおよびT細胞エピトープの
同定に大きな関心を喚起した。CDVのFプロテインのようなタンパク質由来のT細
胞エピトープを使う原理は、若いイヌを早期にCDVに対して接種すると、それに
よって、このタンパク質上に存在するヘルパーT細胞エピトープに対して特異的
なヘルパーT細胞を有するようになるだろうということにある。次いで1つ以上の
エピトープを含有するワクチンに曝すと、それによって、存在するヘルパーT細
胞の補強および従って、増強された免疫応答をもたらすであろう。しかし、この
ようなヘルパーT細胞エピトープは、初回刺激していない動物に投与して、さら
に免疫応答を誘導することもできる。本発明者らは、CDV融合タンパク質の配列
からイヌT細胞エピトープを同定し、そして、これらのエピトープを、特にイヌ
および関係種に対する、ペプチドベースのワクチンの設計に使い得るようにする
ことを目的とした。

【０００７】 LHRH（黄体形成ホルモン放出ホルモン）は10個のアミノ酸長のペプチドホルモ
ンであり、その配列は哺乳類に保存されている。該ホルモンは視床下部により分
泌され、雄性および雌性両方の生殖生理学を制御する。LHRHベースの免疫避妊ワ
クチンの開発の原理は、LHRHに対する抗体がホルモンの黄体形成ホルモンの下垂
体分泌および卵胞刺激ホルモンに対する作用をブロックし、哺乳類の生殖腺萎縮
および不妊に導くという観察に基づく。

【０００８】開発されているほとんどのLHRHワクチンはタンパク質担体と化学的にコンジュ
ゲートしたLHRHからなり、抗LHRH抗体の産生のためのT細胞ヘルプを提供する。L
HRT-タンパク質担体コンジュゲートの接種を繰り返すと、「担体に誘導されるエ
ピトープ抑制」として知られる現象により抗LHRH力価は低下することが分かって
いる。本発明の1つの目的は、ワクチンのタンパク質担体を、定義したTヘルパー
エピトープ（THエピトープ）によって置換え、「担体に誘導されるエピトープ抑
制」を排除することである。

【０００９】発明の概要本発明者らは、それぞれがTヘルパー細胞エピトープを含有する、多数の17残
基のペプチドを同定した。容易に認識されるように、大多数のこれらのペプチド
は最小のTヘルパー細胞エピトープではない。典型的には、クラスII分子は８個
のアミノ酸のような短いペプチド（Fahrerら， 1995、同書）、しかし通常は12
〜19個のアミノ酸のペプチド（Chicz, R. M., Urban, R. G., Gorga, J. C,． V
ignali, D. A. A., Lane, W. S.およびStrominger, J. L. 「Specificity and p
romiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles(HL
A-DR対立遺伝子と結合した天然にプロセシングを受けたペプチド間の特異性およ
び乱交雑性)」. J Exp Med 1993, 178, 27-47；Chicz, R. M., Urban, R. G., L
ane, W. S., Gorga, J. C．, Stern, L.J., Vignali, D. A. A.,およびStroming
er, J. L. 「Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 ar
e derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size（HLA-
DRIと結合した、天然にプロセシングを受けた主なペプチドはMHC関係分子から誘
導され、サイズは不均一である）」. Nature 1992, 358, 764-8）と結合してい
ることが分かっているが、長さで25個までのアミノ酸のペプチドがクラスIIと結
合していることも報じられている（Rammensee, H.G. 「Chemistry of peptide a
ssociated with class I and class II molecules.（クラスIおよびクラスII分
子に関連したペプチドの化学）」 Curr Opin Immunol 1995, 7, 85-95における
レビュー）。

【００１０】従って、長さが８〜25個の間のアミノ酸残基の範囲にあるペプチドエピトープ
がクラスII分子と結合し得る。より短いペプチドはより長い配列より低い活性を
有し得る「コア」エピトープであり、より長い配列をNまたはC末端で切断して親
配列と同じかまたはより高い活性を有するより短い配列を得ようとするのはつま
らない試みでしかない。

【００１１】従って第1の態様においては、本発明はTヘルパー細胞エピトープであって、上
記エピトープは、からなる群から選択されるペプチド配列内に含有されることを特徴とする。

【００１２】第2の態様においては、本発明は、動物に免疫応答を生起させるために使う組
成物であって、上記組成物は少なくとも1種のTヘルパー細胞エピトープを含んで
なり、少なくとも1種の該Tヘルパー細胞エピトープは、からなる群から選択されるペプチド配列内に含有されることを特徴とする。

【００１３】本発明の好ましい実施形態においては、該組成物はからなる群から選択される少なくとも1種のペプチドを含んでなる。

【００１４】該組成物はさらに少なくとも1種のB細胞エピトープおよび／または少なくとも
1種のCTLエピトープを含んでなることが、さらに好ましい。

【００１５】また他の好ましい実施形態においては、少なくとも1種の該B細胞エピトープお
よび／または少なくとも1種の該CTLエピトープは少なくとも1種のTヘルパー細胞
エピトープと連結している。該組成物はまた、各々が少なくとも1種のTヘルパー
細胞エピトープおよび少なくとも1種のB細胞エピトープを含んでなる複数のエピ
トープ構築物を含んでなることも好ましい。あるいは、該組成物は、各々が少な
くとも1種のTヘルパー細胞エピトープおよび少なくとも1種のCTLエピトープを含
んでなる複数のエピトープ構築物を含んでなっていてもよい。

【００１６】該B細胞エピトープまたは該CTLエピトープはいずれのエピトープであってもよ
いことは理解されるであろう。本発明で好ましいB細胞エピトープはLHRH B細胞
エピトープである。

【００１７】本発明の組成物は複数のTヘルパー細胞エピトープを含んでなってもよい。こ
れらのエピトープは単一であっても一緒に連結して単一のポリペプチドを形成し
てもよい。エピトープが一緒に単一のポリペプチドに連結される場合、エピトー
プ同士は近接していてもまたはそれ自身はTヘルパー細胞エピトープの部分でな
い追加のアミノ酸により隔たれて位置してもよいことは理解されるであろう。

【００１８】ある実施形態においては、上に考察したように、Tヘルパー細胞エピトープお
よび少なくとも1種のB細胞エピトープおよび／または少なくとも1つのCTLエピト
ープは、それらのエピトープが連結されている。この連結は、簡単なペプチドの
共有結合により実施し得る。他の実施形態においては、エピトープは、最も好ま
しくはその開示が参照により本明細書に組み入れられるPCT/AU98/00076に記載さ
れたように、重合されている。

【００１９】さらに他の好ましい実施形態においては、該組成物はさらに製薬上許容される
賦形剤、好ましくはアジュバントを含んでなる。

【００２０】さらなる態様においては、本発明は動物に免疫応答を誘導する方法であって、
動物に本発明の第２の態様の組成物を投与することを含んでなることを特徴とす
る方法である。

【００２１】製薬上許容される担体または希釈剤は、経口、直腸、鼻、局所（バッカルおよ
び舌下錠を含む）、膣、非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、くも膜下および硬
膜外を含む）投与に適した組成物に使われる担体または希釈剤を含む。これらは
受容者に無毒な投与量および濃度にて用いられる。製薬上許容される担体または
希釈剤の代表的な例は、限定するものでないが、水、好ましくは生理的pHに緩衝
された等張液（リン酸緩衝生理食塩水またはTris緩衝生理食塩水など）を含み、
また、マンニトール、ラクトース、トレハロース、デキストロース、グリセロー
ル、エタノールまたはポリペプチド（ヒト血清アルブミンなど）の1以上を含ん
でもよい。該組成物は単位投与形態で好都合に提示することができ、また製薬業
界でよく知られたのいずれかの方法により調製することができる。

【００２２】上記のように、該組成物はアジュバントを含むことが好ましい。理解されるよ
うに、「アジュバント」は、ワクチン組成物の免疫原性および効能を増強する1
以上の基質を含む組成物を意味する。適当なアジュバントの例は、限定するもの
でないが、スクアランおよびスクアレン（または他の動物由来の油）；ブロック
コポリマー；Tween(登録商標)-80のような洗剤；Quil(登録商標) A、Drakeolま
たはMarcolのような鉱質油、ピーナッツ油のような植物油；Corynebacterium pa
rvumのようなCorynebacterium由来のアジュバント；Propionibacterium acneの
ようなPropionibacterium由来のアジュバント；Mycobacterium bovis（Bacille
Calmette and GuerinまたはBCG）；インターロイキン2およびインターロイキン1
2のようなインターロイキン；インターロイキン1のようなモノカイン；腫瘍壊死
因子；γインターフェロンのようなインターフェロン；サポニン-水酸化アルミ
ニウムまたはQuil-A水酸化アルミニウムのような組合わせ；リポソーム；ISCOM
アジュバント；放線菌細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドまたは他の誘導体のよ
うな合成糖ペプチド；アビリジン；リピドA誘導体；硫酸デキストラン；DEAE-デ
キストランまたはリン酸アルミニウムを有するもの；Carbopol'EMAのようなカル
ボキシポリメチレン；Neocryl A640（例えば、米国特許第5,047,238号）のよう
なアクリルコポリマーエマルジョン；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタ
ンパク質；コレラ毒のようなサブウイルス粒子アジュバント、またはそれらの混
合物を含む。

【００２３】当業者には認識されるように、本発明のペプチドは生物学的活性の完全な抑止
をすることなしに改変することができる。これらの改変は、付加、欠失および置
換、特に保存的置換を含む。Tヘルパー細胞エピトープとしての活性の完全な消
失を生じない改変を含むペプチドは本発明の範囲内にあると考えられる。

【００２４】置換の概念は当技術分野では周知であるが、予想される置換の形式を以下に掲
げる。

【００２５】予想される他のタイプのペプチドの改変は、限定するものでないが、側鎖の改
変、ペプチド合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組込みな
らびに架橋剤の使用およびペプチドにコンフォメーションの制限を課する他の方
法を含む。

【００２６】本発明で考えられる側鎖改変の例は、限定するものでないが、アルデヒドとの
反応に続いてNaBH₄を用いて還元する還元アルキル化によるようなアミノ基の改
変；メチルアセトイミダート(methylacetimidate) によるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基のカルバ
モイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリ
ニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ
基のアシル化；およびピリドキサール-5'-リン酸によるリシンのピリドキシル化
と続いてNaBH₄を用いる還元を含む。

【００２７】アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキザー
ルおよびグリオキザールのような試薬を用いて複素環縮合産物の形成により改変
することができる。

【００２８】カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成を経由するカルボジイミド活性化
とその後、例えば対応するアミドへの続いての誘導体化により改変することがで
きる。

【００２９】トリプトファン残基は、例えばN-ブロモスクシンイミドによる酸化または2-ヒ
ドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルフェニルによるイン
ドール環のアルキル化により改変することができる。他方、チロシン残基は、テ
トラニトロメタンによるニトロ化により改変して3-ニトロチロシン誘導体を形成
することができる。

【００３０】ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル
化またはジエチルピロカルボン酸によるN-カルベトキシル化により改変すること
ができる。

【００３１】ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組込む例は、限定するもので
ないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペン
タン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシ
ン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸；2-
チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のD-異性体の使用を含む。

【００３２】本発明のペプチドはCDVから誘導することができる。あるいは、ペプチドまた
はペプチドエピトープの組合わせは、組換えDNA技術により産生させることがで
きる。しかし、ペプチドは当技術分野で公知の方法を使い合成によって製造する
のが好ましい。例えば、ペプチドは、溶液合成または固相合成を使って合成する
ことができる（例えば、Nicholsonにより編集されBlackwell Scientific Public
ationsにより出版された標題「Synthetic Vaccines（合成ワクチン）」の出版物
に含まれる、AthertonおよびSheppardによる標題「Peptide Synthesis（ペプチ
ド合成）」の第９章に記載）。好ましくは固相支持体を利用し、該固相支持体は
、小比率のジビニルベンゼン（例えば1%）により架橋されていてもよいポリスチ
レンゲルビーズであってもよく、さらにジクロロメタンのような親油性溶媒また
はジメチルホルムアミド（DMF）のようなより極性の高い溶媒により膨潤してい
る。該ポリスチレンはクロロメチルまたはアミノメチル基の官能基を付すことが
できる。あるいは、DMFおよび他の双極性非プロトン性溶媒により高度に溶媒和
されかつ膨潤した、架橋されかつ官能基の付されたポリジメチルアクリルアミド
ゲルを使う。不活性なポリスチレンビーズの表面に通常は移植するかまたは他の
方法で結合したポリエチレングリコールを基材にして、他の支持体を利用するこ
とができる。好ましい形態では、PAL-PEG-PS、PAC-PEG-PS、KA、KRまたはTGRか
ら選択される市販の固体支持体または樹脂を使用することができる。

【００３３】固相合成において使用するのは可逆性ブロッキング基であって、該可逆性ブロ
ッキング基はα-アミノ、カルボキシまたは側鎖官能基の望まない反応性をマス
キングしかつアミノ酸およびペプチドを不活性化するそれらの双極性を破壊する
二重の機能を有する。そのような官能基は、RCO-OCMe₃-COの構造をもつt-ブチル
エステルから選択することができる。RCO-OCH₂-C₆H₆の構造をもつ対応するベン
ジルエステルならびにベンジルオキシカルボニルまたはZ-誘導体として知られる
C₆H₆CH₂-OCO-NHRの構造およびt-ブトキシカルボニルまたはBoc誘導体として知ら
れるMe₃-COCO-NHRの構造を有するウレタンも使用することができる。フルオレニ
ルメタノールおよび特にフルオレニル-メトキシカルボニルまたはFmoc基の誘導
体も使用することができる。これらのタイプの保護基はそれぞれ、お互いが存在
するときに独立して切断することができるのでしばしば使用され、例えばBOC-ベ
ンジルおよびFmoc-三級ブチルの保護方法がある。

【００３４】保護されたアミノ酸またはペプチドのアミノ基およびカルボキシ基と連結する
縮合剤に対する対照（reference）も作るべきである。これは、カルボキシ基を
活性化して自発的に遊離した一級または二級アミンと反応するようにして行う。
この目的のためには、p-ニトロフェノールおよびペンタフルオロフェノールから
誘導したような活性化エステルを使うことができる。それらの反応性は、1-ヒド
ロキシベンゾトリアゾールのような触媒を加えて増加することができる。トリア
ジンDHBTのエステル（上記のNicholsonの参考文献の215-216頁に記述された）も
使うことができる。他のアシル化種は、縮合試薬によるカルボン酸（すなわち、
N-α保護したアミノ酸またはペプチド）の処理によりin situで形成させ、直ち
にアミノ成分（カルボキシまたはC-保護されたアミノ酸またはペプチド）と反応
させる。ジシクロヘキシルカルボジイミド、BOP試薬（Nicholson参考文献の216
頁を参照）、O'ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチル-ウロニウムヘキサ
フルオロリン酸（HBTU）およびその類似体のテトラフルオロホウ酸が縮合剤とし
てしばしば使用される。

【００３５】最初のアミノ酸の固相支持体への結合は、BOC-アミノ酸を使っていずれかの適
当な方法で行う。ある方法では、BOCアミノ酸は、そのトリエチルアンモニウム
塩を樹脂とともに暖めることによって、クロロメチル樹脂と結合させる。Fmoc-
アミノ酸は、同様の方法でp-アルコキシベンジルアルコール樹脂と結合させるこ
とができる。あるいは、様々な連結剤または「ハンドル（handle）」を使って、
最初のアミノ酸を樹脂に結合することができる。この点については、アミノメチ
ルポリスチレンと連結したp-ヒドロキシメチルフェニル酢酸をこの目的に使うこ
とができる。

【００３６】本明細書を通じて、用語「含んでなる（comprise）」、または「含んでなる（
comprises）」または「含んでなる（comprising）」のような変化は、述べられ
たエレメント、完全体もしくは段階、またはエレメント、完全体または段階の群
の包含を意味し、いずれの他のエレメント、完全体もしくは段階またはエレメン
ト、完全体または段階の群の排除を意味するものでないことは理解されるであろ
う。

【００３７】詳細な説明本発明の性質がより容易に理解されるように、本発明の好ましい型を、以下の
限定的ではない実施例を参照しながら記述する。

【００３８】実施例１ Tヘルパー細胞エピトープの同定方法および結果：イヌT細胞エピトープ94を同定するために、イヌジステンパーウイルス(CDV)の
融合タンパク質の全配列を包含する17残基オーバーラップするペプチドを設計し
た。同定のために、N-末端から始まるように17merペプチドに順番に番号を付し
た。Barrettら、1987(Virus Res. 8, 373-386)により決定されたCDVの融合タン
パク質の配列を図１に示す。該ペプチドを、１回分のワクチンとして生CDVを含
有するCanvac^TM 3 (CSL Limited)を用いて免疫化したイヌ由来の末梢血リンパ球
(PBMC)を用いるT細胞増殖アッセイに使用した。

【００３９】最初に、４匹のイヌを用いた。これらは、各ワクチン接種の間を４〜６週間あ
けて、１回分のワクチンとしてCanvac^TM 3 を用いて２回追加免疫した。各追加
免疫接種の後にイヌから採血し、ペプチドに対してPBMCを試験した。ペプチドに
対する有意な増殖は見られなかった。 CDVはリンホトロピックウイルスであるとの報告がなされ、前記のワクチンは
生CDVからなるため、有意な数の前駆体T細胞の末梢系への侵入を防ぐリンパ性器
官中に生CDVが隔離されている可能性があった。末梢血抗CDV T細胞の数を増加さ
せるため、イヌを熱で死滅させたCDV(ウイルス培養培地由来のペレットとして得
た。CSL Limited)を用いて追加免疫した。２週間後、イヌから採血し、PBMCをペ
プチドに対する増殖に関して試験した。再び、該ペプチド抗原に対する増殖は見
られなかった。

【００４０】別の方策を用いて、該CDVペプチドを認識する特異的T細胞の前駆体数を増加さ
せた。過剰に免疫化したこれらのイヌから得た新鮮なPBMCを、94のペプチド全て
のプールにより、37℃で30分間にわたりin vitroで刺激した。続いて細胞を洗浄
して過剰のペプチドの全てを除去し、７日間培養した。次いで、このT細胞の集
団を、自己由来APCについて、前記抗原の単一のペプチド全てについて試験した
。表１は、有意な増殖レベル(刺激指数＞２)の見られたペプチドを示している。この観察を確かめるため、死滅したウイルスの投与を受けた５週間後に、同じ
４匹のイヌから再び採血した。PBMCを、94のペプチド全てのプール、またはペプ
チド21〜40のプール(活性の大部分がこの領域に存在していたため)のいずれかを
用いて刺激して７日間培養した後、刺激したT細胞を個々のペプチドについて試
験した。全てのペプチドについて有意な刺激指数が得られ、上記結果を裏付けた
。１回分のワクチンとして３の１用量のみを受けたさらに４匹のイヌを、in vit
ro刺激法を用いて試験したところ、４匹のイヌの全てが表２に示したペプチドの
大部分に応答した。上記のペプチドを同様に、追加のイヌに由来する細胞についても試験し、表３
の結果を得た。ペプチドP64、P74およびP75もまた、CDVで免疫化された、多様な
種のイヌ(表４)に由来する末梢血単核細胞と強力に反応することを示しており、
それ故に強力なT-ヘルパーエピトープとして同定される。

【００４１】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【００４２】再度、同じペプチドと追加のペプチドP32を、追加のイヌに由来する細胞に対
して試験した。これらのペプチドもまた同様に、CDVで免疫化された、多様な種
のイヌ(表５)に由来する末梢血単核細胞と強力に反応し、それ故に強力なT-ヘル
パーエピトープとして同定される。結論として、26種のペプチドが、CDV融合タンパク質中のイヌTヘルパー細胞の
エピトープとして同定された。これらの各ペプチドの配列を表６に示す。これらのTヘルパー細胞エピトープは、動物用ワクチン（特にイヌ用ワクチン
）の成分として、単に合成ペプチドに基づくワクチンとして、またはより複雑な
抗原を含有するワクチンへの添加物としてのいずれかにおいて有用性を有するで
あろう。

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】同定されたT細胞エピトープから選択した配列を、結合したB細胞エピトープに
対する抗体応答を誘導する能力について試験した。試験は、イヌにおける抗体応
答の評価により行った。T細胞エピトープを、B細胞エピトープLHRH(黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン)へ、N-末端のT細胞エピトープと、カルボキシル末端に位置
させたLHRHと結合させることによって連結した。ペプチドは、Fmoc保護された標準的化学物質を用いて合成した。全てのペプチ
ドを少なくとも80％の純度まで精製し、生成物をマススペクトル法によりチェッ
クした。該ペプチドを、連続したT細胞-B細胞決定基として作成した。ピロGlu-His-Trp
-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyのLHRH配列、またはその変異型を、各CDV-Tヘル
パーエピトープのカルボキシル末端と結合させた。

【００４６】いくつかのTヘルパーエピトープのin vivoでの評価は、Tヘルパー-LHRH配列で
イヌにワクチン接種することにより2回行った。

【００４７】実施例２ (K9-5試験) 全部で14匹の、オスとメスが混在するイヌをこの試験で用いた。全てのイヌは
予め生CDVワクチンを接種されており、LHRHに対してもワクチン接種されていた
。

【００４８】ワクチン製剤 CDV由来の試験ペプチドP25、P27、P35は、各TヘルパーエピトープのC末端でLH
RHを有するよう合成した。使用したLHRH配列は全長が10アミノ酸の天然LHRHであ
った。各ワクチン構築物は、リピートマラリアB細胞エピトープ(配列を以下の表
に示す)に結合したマウスインフルエンザT細胞エピトープを含む対照ペプチドと
ともに純度80〜90％まで精製した。全てのペプチドを4M尿素に溶解させ、その後
適当な容量まで滅菌生理食塩水により希釈し、用量1mLあたり40nmoleとした。Is
comatrix^TMをアジュバントとしてチオメルサール保存剤(0.01％)とともに終濃度
150μg/用量1mLで添加した。 ISCOM^TM、すなわち免疫刺激性複合体(Barr, SjolanderおよびCox, 1998, Adva
nced Drug Delivery Systems 32:247-271)は十分に特性決定された種類のアジュ
バントで、リン脂質、コレステロールおよびサポニンの複合体と、通常は複合対
内に取り込まれたタンパク質を含有する。タンパク質抗原の不在下で複合体が形
成される場合、この複合体をIscomatrix^TMと称する。このアジュバント調製物中
で使用されたサポニンはQuil Aであった。

【００４９】ワクチン接種、血液サンプルおよびアッセイ全てのイヌに1mLの用量で首筋へ送達してワクチン接種した。ワクチン接種は
０週と４週に行い、試験期間の間隔で静脈血サンプルを得た。有効なT細胞へのヘルプを、ELISAによってLHRHに対する抗体応答を測定して決
定した。ワクチンに基づくペプチドの生物学的有効性を、メスのイヌおける黄体
ホルモンおよびオスのイヌにおけるテストステロンのレベルを測定して決定した
。

【表７】

【００５０】結果異なるワクチンを用いて予め免疫化したことにより、全てのイヌにおいて以前
から存在している低レベルでのLHRHに対する抗体が見られた。対照群のイヌでは
抗体レベルがゆっくり減少した。

【００５１】 P25-LHRH、P27-LHRHおよびP35-LHRHで免疫化したイヌは全て、B細胞エピトー
プ(LHRH)に対する強力な抗体応答を示した。この応答は追加免疫の接種後６週間
まで持続した(表８参照)。

【００５２】ワクチンの生物学的効力が、黄体ホルモンとテストステロンのレベルが有意に
減少したことで実証された(表９と表１０を参照)。

【００５３】

【表８】

【表９】

【表１０】

【００５４】 CDVのFタンパク質から選択したT細胞エピトープの、イヌにおいて抗体応答を
誘導するT細胞ヘルプを提供する際の有効性は、同定した配列が機能性であるこ
とを証明する。またこれらの結果は、in vivo活性を有するTヘルパーエピトープ
配列の同定のための、in vitroスクリーニング法の科学的アプローチと有用性が
妥当であること示す。

【００５５】実施例３ (K9-8試験) 全部で35匹の、オスとメスが混在するイヌをこの試験において用いた。全ての
イヌを予め生CDVワクチンでワクチン接種しておいたが、LHRHに対してはワクチ
ン接種をしていなかった。

【００５６】ワクチン製剤 Tヘルパー細胞エピトープを、天然の10アミノ酸配列の、２〜10のアミノ酸を
含有するトランケート型のLHRHと以下のように結合させた：２〜10 LHRH His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly 全てのワクチンは実施例２と同様に配合した、すなわちワクチンの1mL用量あ
たり40nmoleのペプチド、150μgのIscomatrix^TM、および保存剤としてのチオメ
ルサールを含有していた。イヌをペプチドのプールでワクチン接種した場合には、各ペプチドの濃度は等
しい濃度となるように調節し、全量で、1mL用量あたり40nmoleのLHRHエピトープ
となるように調節した。

【００５７】ワクチン接種、血液サンプルおよびアッセイ全てのイヌに1mLの用量で首筋へ送達してワクチン接種した。ワクチン接種は
０週と４週に行い、試験期間の間隔で静脈血サンプルを得た。有効なT細胞へのヘルプを、ELISAによってLHRHに対する抗体応答を測定して決
定した。ワクチンに基づくペプチドの生物学的有効性を、メスのイヌおける黄体
ホルモンおよびオスのイヌにおけるテストステロンのレベルを測定して決定した
。

【００５８】

【表１１】結果 LHRHに対する強力な抗体応答が、T細胞エピトープP25、P27、P35、P62、P75、
およびT細胞エピトープP25、P27およびP35を組み合わせて含むT細胞-LHRHペプチ
ドのプールを有するT細胞LHRH構築物で免疫化したイヌにおいて見られた(表１２
を参照)。 P2-LHRHペプチドおよびP8-LHRHペプチドで免疫化したイヌにおいては、低いか
または検出不能な抗体応答がみられた(表１２を参照)。このことは、これらのT
細胞ペプチドはビーグル-フォックスハウンド種のイヌによっては認識されない
ことを示すと結論付けたが、この結論は、他の種のイヌに由来するPBMCを用いて
T細胞ペプチドを同定したことに合致する。ビーグルフォックスハウンドドッグ
における最初のスクリーニングでは、この種のイヌはこれら２種のT細胞エピト
ープに応答しないことが示された。ペプチドワクチン分野の当業者にはよく理解される通り、個々のペプチドに対
する応答は遺伝子によって決定される。クラスII主要組織適合性複合体(MHCII)
は多型性である。クラスII分子は細胞表面でT細胞に対する表示のためのペプチ
ドと結合するよう機能する。これはヘルパーT細胞を含むT細胞の活性化プロセス
の一部として必要である。MHCクラスIIの対立遺伝子型は別のペプチド抗原のセ
ットと結合し、従って、これらの抗原の応答は遺伝子によって決定される。この
ように、この結果は、ビーグル-フォックスハウンド種のイヌはP2およびP8に応
答するための好適なMHC-II対立遺伝子を有しないが、これらのペプチドを同定す
るために用いた、プードルシチヅ(shitzu)種など他種のイヌは有することを示す
と解釈し得る。対照のイヌにおいては、試験期間中にLHRHに対する抗体レベルに変化は見られ
ず、ホルモンレベルもイヌの年齢、性別に対して正常レベル内であった(表１２
参照)。

【００５９】

【表１２】

【００６０】実施例４ペプチドワクチン中に取り込まれたTh-エピトープの認識を実証するためのin vi tro T細胞増殖アッセイペプチド免疫原内のTh-エピトープの認識を実証するために、ペプチドワクチ
ンで免疫化したイヌ(実施例２のイヌ)から得たPBMCを、各Th-エピトープに対し
て試験した。アッセイは、PBMCを富化することなく行った。フィコールグラジエ
ント精製により得たPBMCを、各Th-エピトープおよびそのトランケート型に対し
て直接試験した。この研究により、ペプチドワクチンで免疫化したイヌの全てが
、取り込まれたTh-エピトープに対して応答することが示され、T細胞活性が各配
列中に存在していることが確認された(図２〜４)。各Th-エピトープのトランケ
ート型も同様に試験し、配列内のT細胞活性をより詳細に同定した。P25について
は、17残基の全配列のほうが、より短い15残基や12残基のペプチド(各ペプチド
は配列のN末端から切断)よりも良好であることが観察された(図２)。この結果は
、T細胞活性は17残基のペプチドのN末端または中間に対するものであることを示
唆する。 P27についても同様のことが観察され、長さが17残基の配列のほうが、N末端か
ら切断されたより短い15残基のペプチドよりも良好なシミュレータであった(図
３)。この観察もまた、再度、T細胞活性は、全長ペプチドの中間またはN末端に
対して存在し得ることを示唆していた。 P35とその短い型の場合には、１匹のイヌ(番号102)を除いた他の３匹のイヌは
、12残基のペプチドにも全長17残基のペプチドにも同じように応答した(図４)。
番号102のイヌにおいては、15残基のペプチドは全長ペプチドよりも刺激性が高
かった。この結果から、P35の配列中で最初の２つの残基は必須ではなく、活性
はペプチドの中間またはC末端に対するものであることが推定され得る。

【００６１】実施例５ BALB/cマウスにおける試験実施例３で使用した、CDV-Fから誘導したTh-エピトープとLHRHを有するイヌ用
ワクチンを同様に用いてBALB/cマウスを免疫化して、Th-エピトープが異なる動
物種において機能性であるか否かを調べた。

【００６２】ワクチン製剤全てのワクチンは、100μlの用量で2.7nmoleのペプチドと10μgのIscomatrix^T ^M とチオメルソールを保存剤として含有するようにさらに希釈した以外は、実施
例３と同じように配合した。

【００６３】ワクチン接種、血液サンプルおよびアッセイマウスに、尾の付け根で100μlのワクチンを接種した。ワクチン接種は０週と
４週に行い、各ワクチン接種の後に間隔を開けて動物の眼窩後方(retro-orbital
)叢から採血した。有効なT細胞ヘルプは、ELISAによりLHRHに対する抗体応答を
測定して決定した。

【００６４】結果 P25-LHRHで免疫化したマウスと、P25-LHRH、P27-LHRHPおよびP35-LHRHを含む
ペプチドプールで免疫化したマウスでは、LHRHに対する高い抗体力価が生じた。
ペプチドP35およびP75では生じた抗体力価は低く、一方P2、P8およびP62で免疫
化したマウスでは、抗LHRH抗体のレベルは検出限界範囲外であった(表13)。

【００６５】当業者には、広く記載した本発明の意図と範囲から逸脱することなく、具体的
な実施例において示された本発明に対して多数の変形および/または改変をなし
得ることが理解されよう。従って、本実施形態はあらゆる観点で、例示的であり
制限的ではないと解されるべきである。

【００６６】

【表１３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 CDVの融合タンパク質のアミノ酸配列。

【図２】 P25-LHRHで免疫化したイヌからの、Th-エピトープP27およびそのトランケート
された型に対する刺激指数(X-軸はnmole/ウェルで示したペプチド濃度)。

【図３】 P27-LHRHで免疫化したイヌからの、Th-エピトープP25およびそのトランケート
された15残基のペプチドに対する刺激指数(X-軸はnmole/ウェルで示したペプチ
ド濃度)。

【図４】 P35-LHRHで免疫化したイヌからの、Th-エピトープP25およびそのトランケート
された型に対する刺激指数(X-軸はnmole/ウェルで示したペプチド濃度)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガニゼーションＣＯＭＭＯＮＷＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＮＤＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬＲＥＳＥＡＲＣＨＯＲＧＡＮＩＺＡＴＩＯＮオーストラリア国 2601 オーストラリアンキャピタルテリトリーキャンベルライムストーンアベニュー番地なしンドインスティテュートオブメディカルリサーチオーストラリア国 4029 クイーンズランド州，ハーストン，ハーストンロード 300 (71)出願人ウォルターアンドエリザホールインスティテュートオブメディカルリサーチオーストラリア国 3052 ヴィクトリア，パークヴィル，ロイヤルパレード，ロイヤルメルボーンホスピタル (72)発明者ジャクソン，デービッド，チャールズオーストラリア国 3104 ヴィクトリア，ノースバルウィン，74 ウッドヴィルストリート (72)発明者ソウラビ，ゴシュオーストラリア国 3083 ヴィクトリア，ブンドゥーラ，18 グレスウェルパークドライブ (72)発明者ウォルカー，ジョンオーストラリア国 3103 ヴィクトリア，バルウィン，26 クラファムストリートＦターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA22 NA14 ZB09 4H045 AA11 BA10 CA40 DA86 EA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の配列：からなる群より選択されるペプチド配列内に含まれる、Tヘルパー細胞エピトー
プ。
【請求項２】以下の配列：からなる群より選択されるペプチド配列内に含まれるTヘルパー細胞エピトープ
を少なくとも１種含んでなる、動物において免疫応答を上昇させるために使用す
る組成物。
【請求項３】以下の配列：からなる群より選択されるペプチドを少なくとも１種含んでなる、請求項２に記
載の組成物。
【請求項４】少なくとも１種のB細胞エピトープおよび/または少なくとも
１種のCTLエピトープをさらに含んでなる、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】少なくとも１種の前記B細胞エピトープおよび/または少なく
とも１種の前記CTLエピトープが少なくとも１種の前記Tヘルパー細胞エピトープ
と結合されている、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】各コンジュゲートが少なくとも１種のTヘルパー細胞エピト
ープおよび少なくとも１種のB細胞エピトープを含んでなる複数のエピトープ構
築物を含んでなる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】各コンジュゲートが少なくとも１種のTヘルパー細胞エピト
ープおよび少なくとも１種のCTL細胞エピトープを含んでなる複数のエピトープ
構築物を含んでなる、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】１種のLHRH B細胞エピトープを含んでなる、請求項４〜７の
いずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】複数のTヘルパー細胞エピトープを含んでなる、請求項２に
記載の組成物。
【請求項１０】複数の前記Tヘルパー細胞エピトープが単一のポリペプチ
ドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】少なくとも１種のB細胞エピトープおよび/または少なくと
も１種のCTLエピトープをさらに含んでなる、請求項９または１０に記載の組成
物。
【請求項１２】少なくとも１種の前記B細胞エピトープおよび/または少な
くとも１種の前記CTLエピトープが複数の前記Tヘルパー細胞エピトープと結合さ
れている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】１種のLHRH B細胞エピトープを含んでなる、請求項１１ま
たは１２に記載の組成物。
【請求項１４】アジュバントを含んでなる、請求項２〜１３のいずれか１
項に記載の組成物。
【請求項１５】前記アジュバントがISCOMまたはIscomatrixを含んでなる
、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】請求項２〜１５のいずれか１項に記載の組成物を動物に投
与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法。