KR100955668B1 - Ｔ 헬퍼 세포 에피토프 - Google Patents

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월터 앤드 엘리자 홀 인스티튜트 오브 메디칼 리서치
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Abstract

본 발명은 T 헬퍼 세포 에피토프 및 적어도 하나의 이러한 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 면역 반응 유도용 조성물을 제공한다. 상기 에피토프는 SSKTQTHTQQDRPPQPS; QPSTELEETRTSRARHS; RHSTTSAQRSTHYDPRT; PRTSDRPVSYTMNRTRS; TRSRKQTSHRLKNIPVH; SHQYLVIKLIPNASLIE; IGTDNVHYKIMTRPSHQ; YKIMTRPSHQYLVIKLI; KLIPNASLIENGTKAEL; AELGEYEKLLNSVLEPI; KLLNSVLEPINQALTLM; EPINQALTLMTKNVKPL; FAGVVLAGVALGVATAA; GVALGVATAAQITAGIA; TAAQITAGIALHQSNLN; GIALHQSNLNAQAIQSL; NLNAQAIQSLRTSLEQS; QSLRTSLEQSNKAIEEI; EQSNKAIEEIREATQET; TELLSIFGPSLRDPISA; PRYIATNGYLISNFDES; CIRGDTSSCARTLVSGT; DESSCVFVSESAICSQN; TSTIINQSPDKLLTFIA, SPDKLLTFIASDTCPLV; 및 SGRRQRRFAGVVLAGVA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유된다.
T 헬퍼 세포, 에피토프, 면역, 펩타이드, 아미노산, 바이러스

Description

Ｔ 헬퍼 세포 에피토프 {T HELPER CELL EPITOPES}
본 발명은 개 홍역 바이러스(Canine Distemper Virus; CDV)로부터 유래된 T 헬퍼 세포 에피토프에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프 및 선택적으로 B 세포 에피토프 및/또는 CTL 에피토프를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
유효한 항체 반응을 유도할 수 있는 임의의 펩타이드의 경우, 이것은 면역계에 의해 인식되는 에피토프라 알려진 특정한 아미노산 서열을 함유해야 한다. 특히 항체 반응의 경우, 에피토프는 B 림프구의 표면에 존재하는 특정한 면역글로불린(Ig) 수용체에 의해 인식될 필요가 있다. 이들 세포는 궁극적으로 그러한 에피토프에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 플라즈마 세포로 분화되는 것들이다. 면역원은 이러한 B 세포 에피토프 외에도, 헬퍼 T 림프구 상에 존재하는 특정 수용체에 대한 항원 제공 세포(APC)에 의해 제공되는 에피토프를 함유해야 하고, 이 세포는 B 세포가 항체 생산 세포로 분화되는 데 요구되는 신호를 제공하는 데 필요하다.
바이러스 감염의 경우와 많은 암의 경우, 항체는 회수에 있어 한정적으로 이 롭고, 면역계는 세포독성 T 세포(CTL)와 반응하여 바이러스에 감염된 세포 또는 암세포를 죽일 수 있다. T 세포와 같이, CTL은 먼저 표면 상에 존재하는 그들의 특유의 펩타이드 에피토프를 함유하는 APC와의 상호작용에 의해 활성화되며, 이는 MHC 클래스 Ⅱ 분자보다는 MHC 클래스 I과 관련있다. CTL은 한번 활성화되면 동일한 펩타이드/클래스 I 복합체를 함유하는 표적 세포와 맞물려 이것의 용균을 초래할 수 있다. 헬퍼 T 세포가 이러한 과정을 담당하는 것 또한 명확해 지고 있다. APC가 CTL을 활성화할 수 있기 전에, 이것이 먼저 필요한 공자극성 분자(cosimulatory molecule)의 발현을 상향 조절하는 헬퍼 T 세포로부터 신호를 받아야 한다.
헬퍼 T 세포 에피토프는 주 조직 적합 복합체(MHC)의 클래스 Ⅱ 유전자에 의해 코딩되는 APC 표면 상에 존재하는 분자에 의해 결합된다. 이어서, 클래스 Ⅱ 분자와 펩타이드 에피토프의 복합체는 T 헬퍼 림프구 표면 상의 특정한 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. 이런 식으로, MHC 분자와 관련된 항원 에피토프가 제공된 T 세포가 활성화될 수 있고 B 림프구의 분화에 필요한 신호를 제공할 수 있다. 통상적으로, 펩타이드 면역원에 대한 헬퍼 T 세포 에피토프의 공급원은 펩타이드가 공유 결합될 수 있는 담체 단백질이지만, 그 결합 과정은 결합 중 항원 결정체의 변형 및 펩타이드를 향하는 항체를 희생하고 담체에 대항한 항체가 유도되는 것과 같은 다른 문제를 일으킬 수 있다(Schutze, M.P., Leclerc, C. Jolivet, M. Audibert, F. Chedid, L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines, J. Immunol. 1985, 135, 2319-2322; DiJohn, D., Torrese, J. R. Murillo, J. Herrington, D.A. et al., Effect of priming with carrier on response to conjugate vaccine. The Lancet. 1989, 2, 14150-1416). 더욱이, 제조에 있어 부적절한 단백질의 사용은 품질 관리 문제를 일으킨다. 적합한 담체 단백질을 선택하는 것은 펩타이드 백신을 고안하는 데 있어 매우 중요하고, 그들의 선택은 독성 및 대규모 생산의 실행 가능성과 같은 인자들에 의해 제한된다. 이러한 점근법에 대한 다른 제한 사항으로서 연결될 수 있는 펩타이드 장전양의 크기 및 안전하게 투여될 수 있는 담체의 용량한다(Audibert, F. a. C., L. 1984. Modern approaches to vaccines. Molecular and chemical basis of virus virulence and immunogenicity., Gold Spring Harbor Laboratory, New York). 담체 분자가 강한 면역반응을 유도할지라도, 그들은 항-펩타이드 항체 반응의 억제와 같은 부적절한 반응과 연루된다(Herzenberg, L. A. and Tokuhisa, T. 1980. Carrier-priming leads to hapten-specific suppression. Nature 285:664; Schutze, M. P., Leclerc, C., Jolivet, M., Audibert, F., and Chedid, L. 1985. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J Immunol 135:2319; Etlinger, H. M., Felix, A. M., Gillessen, D., Heimer, E. P., Just, M., Pink, J. R., Sinigaglia, F., Sturchler, D., Takacs, B., Trzeciak, A., and et, a. 1988. Assessment in humans of a synthetic peptide-based vaccine against the sporozoite stage of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum. J Immunol 140:626).
일반적으로, 면역원은 표면 Ig 또는 세포독성 T 세포 상에 존재하는 수용체 에 의해 인식되는 에피토프 외에도 헬퍼 T 세포에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 함유해야 한다. 이러한 유형의 에피토프는 매우 상이할 수 있음을 이해해야 한다. B 세포 에피토프의 경우에는 B 세포 수용체가 천연 면역원에 직접 결합하기 때문에 형태가 중요하다. 반면, T 세포에 의해 인식되는 에피토프는 그 에피토프의 형태상의 완전성에 의존하지 않고, CTL의 경우에는 대략 9개의 아미노산으로 구성되는 짧은 서열로, 헬퍼 T 세포의 경우에는 길이에 대해 보다 덜 제한적인 이보다 약간 긴 서열로 이루어진다. 이들 에피토프에 대한 유일한 요건은 그들이 클래스 I 또는 클래스 Ⅱ 분자 각각의 결합 분절(cleft) 내에 수용될 수 있고, 복합체가 T 세포 수용체와 맞물릴 수 있어야 한다는 것이다. 클래스 Ⅱ 분자의 결합 자리는 종종 양쪽 단부에 자리하며 이는 결합된 펩타이드의 길이에 있어 훨씬 큰 다양성을 허용하고(Brown,J. H., T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern R. G. Urban, J. L. Strominger and D. C. Wiley. 1993. Three-dimensional structure of the human class II hstocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33), 8개 정도의 짧은 아미노산 잔기의 에피토프가 보고되었다(Fahrer, A.M., Geysen, H.M., White, D.O., Jackson, D.C. and Brown,L.E. Analysis of the requirements for class II-restricted T-cell recognition of a single determinant reveals considerable diversity in the T-cell response and degeneracy of peptide binding to I-Ed J. Immunol. 1995. 155: 2849-2857).
개 홍역 바이러스(CDV)는 음성 가닥 RNA 바이러스의 파라믹소바이러스과의 모빌리바이러스(morbillivirus) 아군에 속한다. 이런 군에 속하는 다른 바이러스 로는 홍역 바이러스(measeles virus) 및 우역 바이러스가 있다. 펩타이드계 백신의 개발은 단백질 서열로부터 유래된 B 및 T 세포 에피토프의 동정에 대한 상당한 관심을 불러일으켰다. CDV의 F 단백질과 같은 단백질 유래의 T 세포 에피토프의 사용에 대한 이론적 근거는 강아지가 어렸을 때 CDV에 대해 접종한 경우, 이 단백질 상에 존재하는 헬퍼 T 세포 에피토프에 대해 특이적인 헬퍼 T 세포를 간직한다는 것이다. 후속하여 하나 이상의 에피토프를 함유하는 백신에 노출시키면 기존의 헬퍼 T 세포가 원기를 회복하게되고 결과적으로 면역 반응이 향상된다. 그러나, 이러한 헬퍼 T 세포 에피토프는 항원자극을 받은 일이 없는 동물에게 투여될 수 있으며, 이 경우에도 여전히 면역계를 유도한다. 본 발명자들은 CDV 융합 단백질의 서열로부터 유래된 개의 T 세포 에피토프를 동정함으로써, 이들 에피토프를 특히 개 및 관련 종들을 위한 펩타이드계 백신의 고안에 사용하고자 한다.
LHRH(황체형성 호르몬 방출 호르몬)은 포유류 내에 보존된 10개 아미노산 길이의 펩타이드 호르몬이다. 이것은 시상하부에 의해 분비되며, 남성과 여성 모두의 생식에 관한 생리작용을 조절한다. LHRH 계통의 면역피임용 백신의 개발 원리는 LHRH에 대한 항체가 황체형성 호르몬 및 여포자극 호르몬의 뇌하수체 분비에 대한 호르몬 작용을 차단함으로써 포유류에서 생식선 위축 및 불임을 초래한다는 것이다.
지금까지 개발된 대부분의 LHRH 백신은 항-LHRH 항체의 생성을 위해 T 세포 헬퍼를 제공하는 단백질 담체와 화학적으로 접합된 LHRH로 이루어진다. LHRH 단백질 담체 접합체를 반복적으로 접종하면, "담체에 의해 유도되는 에피토프 억제"라 알려진 현상으로 인해 항-LHRH 역치가 감소되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 한가지 목적은 백신 내 단백질 담체를 규정된 T 헬퍼 에피토프로(TH 에피토프) 교체함으로써 "담체에 의해 유도되는 에피토프 억제"를 제거하는 것이다.
본 발명자들은 각각 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 다수의 17개 잔기의 펩타이드를 동정하였다. 당업자는 이들 펩타이드의 대부분이 최소의 T 헬퍼 세포 에피토프가 아님을 쉽게 이해할 것이다. 통상적으로, 클래스 Ⅱ 분자는 8개 아미노산 정도로 짧은 펩타이드와 관련된 밝혀졌으나(Fahrer et al., 1995, ibid), 일반적으로는 12-19개 아미노산의 펩타이드와 관련 있으며(Chicz, R. M., Urban, R. G., Gorga, J. C., Vignali, D. A. A., Lane, W. S. and Strominger, J. L. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J Exp Med 1993, 178, 27-47; Chicz, R. M., Urban, R. G., Lane, W. S., Gorga, J. C., Stern, L. J., Vignali, D. A. A. and Strominger, J. L. Predominant naturally processed peptides bound to BLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size. Nature 1992, 358, 764-8), 하지만 25개 아미노산 길이 이하의 펩타이드도 클래스 Ⅱ에 결합하는 것으로 보고되었다(reviewed in Rammensee, H,-G. Chemistry of peptide associated with class I and class II molecules. Curr Opin Immunol 1995, 7, 85-95.).
따라서, 8 내지 25개 아미노산 잔기 길이 범위의 펩타이드 에피토프는 클래스 Ⅱ 분자와 결합할 수 있다. 이보다 짧은 펩타이드는 이보다 긴 서열보다 활성이 작을 수 있는 "코어" 에피토프이지만, 긴 서열의 N 말단 또는 C 말단을 절단하면, 쉽게 모체 서열과 동일하거나 우수한 활성을 가지는 짧은 서열이 얻어진다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 T 세포 에피토프에 관한 것으로서, 상기 에피토프는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유된다: SSKTQTHTQQDRPPQPS; QPSTELEETRTSRARHS; RHSTTSAQRSTHYDPRT; PRTSDRPVSYTMNRTRS; TRSRKQTSHRLKNIPVH; SHQYLVIKLIPNASLIE; IGTDNVHYKIMTRPSHQ; YKIMTRPSHQYLVIKLI; KLIPNASLIENGTKAEL; AELGEYEKLLNSVLEPI; KLLNSVLEPINQALTLM; EPINQALTLMTKNVKPL; FAGVVLAGVALGVATAA; GVALGVATAAQITAGIA; TAAQITAGIALHQSNLN; GIALHQSNLNAQAIQSL; NLNAQAIQSLRTSLEQS; QSLRTSLEQSNKAIEEI; EQSNKAIEEIREATQET; TELLSIFGPSLRDPISA; PRYIATNGYLISNFDES; CIRGDTSSCARTLVSGT; DESSCVFVSESAICSQN; TSTIINQSPDKLLTFIA, SPDKLLTFIASDTCPLV; 및 SGRRQRRFAGVVLAGVA.
제2 양태에서, 본 발명은 동물 내에서 면역성을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유된 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함한다: SSKTQTHTQQDRPPQPS; QPSTELEETRTSRARHS; RHSTTSAQRSTHYDPRT; PRTSDRPVSYTMNRTRS; TRSRKQTSHRLKNIPVH; SHQYLVIKLIPNASLIE; IGTDNVHYKIMTRPSHQ; YKIMRPSHQYLVIKLI; KLIPNASLIENCTKAEL; AELGEYEKLLNSVLEPI; KLLNSVLEPINQALTLM; EPINQALTLMTKNVKPL; FAGVVLAGVALGVATAA; GVALGVATAAQITAGIA; TAAQITAGIALHQSNLN; GIALHQSNLNAQAIQSL; NLNAQAIQSLRTSLEQS; QSLRTSLEQSNKAIEEI; EQSNKAIEEIREATQET; TELLSIFGPSLRDPISA; PRYIATNGYLISNFDES; CIRGDTSSCARTLVSGT; DESSCVFVSESAICSQN; TSTILNQSPDKLLTFIA, SPDKLLTFIASDTCPLV; 및 SGRRQRRFAGVVLAGVA.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 다음으로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 펩타이드 서열을 포함한다: SSKTQTHTQQDRPPQPS; QPSTELEETRTSRARHS; RHSTTSAQRSTHYDPRT; PRTSDRPVSYTMNRTRS; TRSRKQTSHRLKNIPVH; SHQYLVIKLIPNASLIE; IGTDNVHYKIMTRPSHQ; YKIMTRPSHQYLVIKLI; KLIPNASLIENCTKAEL; AELGEYEKLLNSVLEPI; KLLNSVLEPINQALTLM; EPINQALTLMTKNVKPL; FAGVVLAGVALGVATAA; GVALGVATAAQITAGIA; TAAQITAGIALHQSNLN; GIALHQSNLNAQAIQSL; NLNAQAIQSLRTSLEQS; QSLRTSLEQSNKAIEEI; EQSNKAIEEIREATQET; TELLSIFGPSLRDPISA; PRYIATNGYLISNFDES; CIRGDTSSCARTLVSGT; DESSCVFVSESAICSQN; TSTIINQSPDKLLTFIA, SPDKLLTFIASDTCPLV; 및 SGRRQRRFAGVVLAGVA.
상기 조성물은 적어도 하나의 B 세포 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CTL 에피토프를 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
바람직한 다른 구현예에서, 적어도 하나의 B 세포 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CTL 에피토프는 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프에 연결된다. 상기 조성물은 각각 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프 및 적어도 하나의 B 세포 에피토프를 포함하는 다수의 에피토프 구조체를 포함하는 것도 바람직하다. 대안적으로, 상기 조성물은 각각 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프 및 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함하는 복수의 에피토프 구조체를 포함할 수 있다.
당업자는 B 세포 에피토프 또는 CTL 에피토프가 임의의 에피토프일 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에 바람직한 B 세포는 LHRH B 세포 에피토프이다.
본 발명의 조성물은 다수의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 이들 에페토프는 개별적인 것이거나 함께 연결되어 단일 폴리펩타이드를 형성하는 것일 수 있다. 당업자는 에피토프가 단일 폴리펩타이드 내에 함께 연결되는 경우, 에피토프들이 연속적이거나 T 헬퍼 세포 에피토프의 일부가 아닌 부가의 아미노산에 의해 간격을 두고 떨어져 있을 수 있음을 이해할 것이다.
상기에 기재된 바와 같이, 한 구현예에서 T 헬퍼 세포 에피토프 및 적어도 하나의 B 세포 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CTL 에피토프가 연결된다. 이는 펩타이드의 간단한 공유결합에 의해 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 에피토프들은 가장 바람직하게는 본 발명에 참고로 인용된 PCT/AU98/00076에 기재된 바와 같이 중합된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 바람직하게는 면역 보강제(adjuvant)를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물 내에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 제2 양태에 따른 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 경구, 직장, 비강, 국부(구강 및 설하 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 동맥내, 피부내, 경막내(intrathecal) 및 경막 포함) 투여에 적합한 조성물에 사용되는 것들을 포함한다. 이들은 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에 대해 비독성이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제의 대표적인 예는 비제한적으로 생리 pH에서 바람직하게 완충되고, 하나 이상의 만니톨, 락토스, 트레할로스, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 또는 폴리펩타이드(예를 들면, 인간 혈청 알부민)를 함 유할 수 있는 등장액(예를 들면, 인산염 완충 염수 또는 트리스 완충 염수)을 포함한다. 상기 조성물은 통상적으로 단일 용량 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 상기 조성물은 면역 보강제를 포함하는 것이 바람직하다. 당업자는 "면역 보강제"가 면역성 및 백신 조성물의 효능을 증대하는 하나 이상의 물질로 구성되는 조성물을 의미한다는 것을 이해할 것이다. 적합한 면역 보강제의 비제한적인 예로는 스쿠알란 및 스쿠알렌(또는 그 밖의 동물성 기름); 차단 코폴리머; Tweem(R)-80과 같은 세제; Quil(R) A, Drakeol 또는 Marcol과 같은 미네랄 오일, 땅콩기름과 같은 식물성 기름; Corynebacterium parvum과 같은 Corynebacterium 유래의 면역 보강제; Propionibacterium acne와 같은 Propionibacterium 유래의 면역 보강제; Mycobacterium bovis(Bacille Calmette 및 Guerin 또는 BCG); 인터루킨 2 및 인터루킨 12와 같은 인터루킨; 인터루킨 1과 같은 모노킨(monokine); 종양 괴사 인자; 감마 인터페론과 같은 인터페론; 사포닌-알루미늄 수산화물 또는 Quil-A 알루미늄 수산화물과 같은 조합물; 리포좀; ISCOM 면역 보강제; 미코박테리아 세포벽 추출물; 무라밀 디펩타이드 또는 기타 유도체와 같은 합성 글리코펩타이드; Avridine; 지질 A 유도체; 덱스트란 설페이트; DEAE-덱스트란 또는 알루미늄 포스페이트 함유 DEAE-덱스트란; Carbocol EMA와 같은 카르복시폴리메틸렌; Neocryl A640과 같은 아크릴 코폴리머 에멀젼(예를 들면, 미국특허 제5,047,238호); 백신 또는 동물 천연두 바이러스 단백질; 콜레라 독소와 같은 아바이러스 입자 면역 보강제 또는 이들의 혼합물이 있다.
당업자는 생물학적 활성을 완전히 없애지 않고도 본 발명의 펩타이드가 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 변형은 부가, 결실 및 치환, 특히 보존성 치환을 포함한다. T 헬퍼 세포 에피토프로서의 활성을 완전히 상시키지 않는 이러한 변형을 포함하는 펩타이드는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
치환의 개념은 당 기술분야에 공지된 것이며, 고려되는 치환의 유형은 이하에 설정하였다.
Figure 112008067155556-pat00001
고려되는 펩타이드의 다른 유형의 변형으로는 비제한적으로 측쇄 변형, 펩타이드 합성 중의 인공 아미노산 및/또는 그들 유도체의 혼입, 교차결합제의 사용 및 펩타이드에 대해 형태상 압박을 가하는 그 밖의 방법이 있다.
본 발명에서 고려되는 측쇄 변형의 예로는 비제한적으로, 알데하이드와의 반응에 의한 환원성 알킬화에 이은 NaBH4를 이용한 환원반응을 통한 아미노기의 변형; 메틸아세트이미데이트를 이용한 아미드화; 아세트산 무수물을 이용한 아실화; 시아네이트를 이용한 아미노기의 카바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 이용한 아미노기의 트리니트로벤질화; 숙신산 무수물 및 테트라하이드로프탈산 무수물을 이용한 아미노기의 아실화; 및 피리독살-5'-포스페이트를 이용한 리신의 피리독실화에 이은 NaBH4를 이용한 환원을 들 수 있다.
아르기닌 잔기의 구아니딘기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 반응물과의 이형고리 축합반응 산물의 형성에 의해 변형될 수 있다.
카르복시기는 O-아실이소우레아 형성 후, 예를 들면 해당 아미드에 대한 후속 유도체화(derivitisation)를 통한 카보디이미드 활성화에 의해 변형될 수 있다.
트립토판 잔기는 예를 들면, N-브로모숙신이미드를 이용한 산화 또는 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설페닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 반면, 티로신 잔기는 3-니트로티로신 유도체를 형성하는 테트라니트로메탄을 이용한 질화에 의해 변형될 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체를 이용한 일킬화 또는 디에틸프로카보네이트를 이용한 N-카보에톡시화에 의해 달성될 수 있다.
펩타이드를 합성하는 동안 인공 아미노산 및 그 유도체를 혼입하는 예는 비제한적으로, 노르류신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사코신, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성체의 사용을 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 CDV로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 재조합 DNA 방법에 의해 펩타이드 또는 펩타이드의 조합물이 만들어질 수 있다. 그러나, 펩타이드는 당 기술분야에 공지된 방법을 이용해 합성 제조되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 펩타이드는 용액 합성법 또는 고체상 합성법을 이용하여 합성될 수 있으며, 그 방법의 예는 Blackwell Scientific Publication 발행의 Nicholson 편집의 "Synthetic Vaccines"라는 표제의 간행물 중 Atherton and Sheppard의 "Peptide Synthesis" 표제의 제9장에 기재되어 있다. 폴리스티렌 겔 비드일 수 있는 고체상 담체가 사용되며, 여기서 폴리스티렌은 디클로로메탄과 같은 친지성 용매 또는 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 보다 극성의 용매에 의해 더욱 팽창된 소량의 디비닐벤젠(예를 들면, 1%)을 사용하여 교차결합될 수 있다. 폴리스티렌은 클로로메틸 또는 아미노메틸기로 기능화될 수 있다. 대안적으로, DMF 및 기타 쌍극성의 비양자성 용매에 의해 고도로 용매화되고 팽창될 수 있는 교차결합 및 작용성 폴리디메틸-아크릴아미드 겔이 사용될 수 있다. 그밖에도, 보편적으로 불활성 폴리스티렌 비드 표면에 접목되거나 다른 방식으로 부착된 폴리에틸렌 글리콜 계통의 담체가 사용될 수 있다. PAL-PEG-PS, PAC-PEG-PS, KA, KR 또는 TGR로부터 선택되는 상업용 고형 담체 또는 수지를 사용하는 것이 바람직하다.
고체상태 합성에서, α-아미노, 카복시 또는 측쇄 작용기 내의 부적합한 반 응성을 차폐하고, 그들을 불활성이 되게 하는 아미노산 및 펩타이드의 쌍극성을 파괴하는 두 가지 기능을 가지는 가역성 차단기가 사용된다. 이러한 작용기는 구조식 RCO-OCMe3-CO의 t-부틸 에스테르로부터 선택될 수 있다. 또한, 구조식 RCO-OCH2-C6H5를 가지는 상응하는 벤질 에스테르 및 벤질옥시카보닐 또는 Z-유도체라고 알려진 구조식 C6H5CH2OCO-NHR 및 t-부톡시카보닐 또는 Boc 유도체라고 알려진 Me3-COCO-NHR을 가지는 우레탄이 사용될 수 있다. 또한, 플루오레닐 메탄올 및 특히 플루오레닐-메톡시 카보닐 또는 Fmoc기의 유도체가 사용될 수 있다. 이러한 유형의 보호기는 각각 서로의 존재 하에서 독립적으로 절단하여, 예를 들면 종종 Boc-벤질 및 Fmoc-tert 부틸 보호 목적으로 사용될 수 있다.
보호된 아미노산 또는 펩타이드의 아미노기 및 카르복시기를 연결하는 축합제가 참고될 수 있다. 이는 카르복시기를 활성화함으로써 이들이 자발적으로 유리된 1급 또는 2급 아민과 반응하도록 함으로써 수행될 수 있다. 이러한 목적으로 위해 p-니트로페놀 및 펜타플루오로페놀로부터 유래된 것들과 같은 활성화 에스테르가 사용될 수 있다. 그들의 반응성은 1-하이드록시벤조트리아졸과 같은 촉매를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 트리아진 DHBT의 에스테르(상기에 기재된 Nicholson 참고문헌의 215-216 페이지에 기재됨)도 사용될 수 있다. 기타 아실화 종(즉, N-알파-보호된 이미노산 또는 펩타이드)은 축합제와 함께 카르복시산 처리에 의해 사용 위치에서 형성되며, 아미노 성분(카르복시 또는 C-보호 아미노산 또는 펩타이드)과 즉각적으로 반응한다. 디사이클로헥실카보디이미드, BOP 반응물 (상기에 기재된 Nicholson 참고문헌의 216 페이지에 기재됨), O'벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라 메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 이것과 유사한 테트라프루오로보레이트가 자주 축합제로 사용된다.
BOC-아미노산을 적절한 방식으로 사용하여 제1 아미노산을 고체상 담체에 부착시킬 수 있다. 한 방법에서, BOC-아미노산은 트리에틸 암모늄염과 수지의 가열에 의해 클로로메틸 수지에 부착된다. Fmoc-아미노산은 유사한 방식으로 p-알콕시벤질 알콜 수지에 연결될 수 있다. 대안적으로, 제1 아미노산을 수지에 결합시키는 데는 다양한 연결제 또는 "핸들(handle)"이 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, 아미노메틸 폴리스테렌에 연결된 p-하이드록시메틸 페닐아세트산이 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
본 명세서 전반에서, "포함하다"나 이것의 어미 변화된 용어는 언급된 요소, 정수 또는 단계나 요소, 정수 또는 단계의 군의 내포를 의미하는 것으로서 그 밖의 다른 요소, 정수 또는 단계나 요소, 정수 또는 단계의 군의 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 보다 명확한 이해를 돕기 위하여 하기의 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명의 바람직한 형태를 설명한다.
실시예 1
T 헬퍼 세포 에피토프의 동정
실험방법 및 결과:
개 홍역 바이러스(CDV)의 융합 단백질의 전체 서열을 포함하는 개의 T 세포 에피토프 94, 17 잔기의 중첩 펩타이드의 전방향 동정을 설계하였다. 17량체 펩타이드를 실질적으로 N-말단으로부터 출발하는 동정을 위해 번호 메겼다. 1987년 Barrett 등(Virus Res. 8, 373-386)에 의해 결정된 CDV 융합 단백질의 서열을 도 1에 나타내었다. 펩타이드는 살아 있는 CDV를 함유하는 1종 백신 내의 Canvac™ 3로 면역 접종된 개로부터 유래된 말초혈액 림프구(PBMC)를 사용한 T 세포 증식 분석에 사용하였다.
처음에는, 4마리의 개를 사용하고, 각각의 백신 접종 사이에 4주 내지 6주 동안 2회에 걸쳐 1종 백신 내의 Canvac™ 3를 추가 자극하였다. 각각의 추가 자극 백신 접종 후 개로부터 혈액을 채취하고, 펩타이드에 대해 테스트하였다. 펩타이드에 대해 유의한 증식이 관찰되지 않았다. CDV는 림프구성인 것으로 보고되었으며 백신은 살아있는 CDV로 이루어지기 때문에, 말초계로 들어가는 상당수의 전구체 T 세포를 방해하는 임파성 기관 내에 격리될 수 있을 가능성이 있다. 말초 혈액의 항-CDV T 세포의 빈도를 증가시키기 위하여, 개에게 가열 사균 CDV(바이러스 배지 유래의 펠릿으로서 얻어짐, CSL Limited)를 추가 자극하였다. 2주 후, 개의 혈액을 채취하고, 펩타이드에 대항한 증식에 대해 PBMC를 테스트하였다. 펩타이드 항원에 대한 증식은 더 이상 없었다.
CDV 펩타이드를 인식하는 특정한 T 세포의 전구체 빈도를 증가시키기 위해 대안적인 방법을 사용하였다. 과면역화된 개로부터 얻어진 새로운 PBMC를 37℃에서 30분 동안 모두 94개 펩타이드 푸울(pool)을 사용하여 시험관내 자극하였다. 이어서, 모든 세포를 세척하여 과량의 펩타이드를 제거하고 7일간 배양하였다. 그런 다음, 항원으로서 모두 단일 펩타이드를 가지는 유사한 APC를 사용하여 T 세포의 이러한 증식을 테스트하였다. 표 1은 유의한 증식 수준(자극 인덱스 > 2)을 나타낸 펩타이드를 기재한 것이다.
이러한 관찰결과를 확인하기 위하여, 개에게 사균 바이러스를 수여하고 5주 후 동일한 4마리의 개로부터 다시 혈액을 채취하였다. 모두 94개 펩타이드 또는 펩타이드 21-40(대부분의 활성은 이 부위에 있기 때문에)의 푸울을 사용하여 PBMC를 시험관 내에서 추가 자극하고, 7일 동안 배양한 후 자극된 T 세포를 각각의 펩타이드에 대해 다시 테스트하였다. 모든 펩타이드에서 유의한 자극 인덱스가 얻어졌으며, 이는 상기 결과를 입증한다. 시험관내 자극방법을 사용하여 1종 백신 내 1/3의 용량만을 수여한 4마리 이상의 개를 테스트하였다. 4마리의 개 모두 표 2에 기재된 대부분의 펩타이드에 대해 반응하였다.
상기 펩타이드들에 대해서도 다른 개로부터 유래된 세포를 테스트하여, 표 3에 나타난 결과를 얻었다. 펩타이드 P64, P74 및 P75 또한 CDV로 면역 접종된 다양한 품종의 개로부터 유래된 말초혈액 단핵 세포와 강렬하게 반응하는 것으로 나타났으므로(표 4), 강력한 T 헬퍼 에피토프로서 동정되었다.
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Figure 112008067155556-pat00003
Figure 112008067155556-pat00004
Figure 112008067155556-pat00005
다시, 동일한 펩타이드 및 부가의 펩타이드 P32를 부가의 개로부터 유래되 세포에 대해 테스트하였다. 이들 펩타이드 또한 CDV로 면역 접종된 다양한 품종의 개로부터 유래된 말초혈액 단핵 세포와 강렬하게 반응하는 것으로 나타났으며(표 5), 따라서 이들 또한 강력한 T 헬퍼 에피토프로서 동정되었다.
결론적으로, 26개의 펩타이드가 CDV의 융합 단백질 내에서 개의 T 헬퍼 세포 에피토프로 동정되었다. 이들 펩타이드 각각의 서열은 표 6에 기재하였다.
이들 T 헬퍼 세포 에피토프는 간단히 합성 펩타이드계 백신 및 보다 복잡한 항원을 함유하는 백신의 첨가물로서 동물, 특히 개의 백신 성분으로서 유용성을 가질 것이다.
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Figure 112008067155556-pat00007
동정된 T 세포 에피토프의 선택된 서열을 연결된 B 세포 에피토프에 대해 항체 반응을 유도하는 그들의 능력에 대해 테스트하였다. 항체 반응의 평가를 위해 개를 대상으로 실험을 하였다. N 말단에 T 세포 에피토프를 가지는 B 세포 에피토프 LHRH(황체 형성 호르몬 방출 호르몬) 및 카르복시 말단에 위치하는 LHRH에 T 세 포 에피토프를 연결하였다.
표준 화학법을 사용하여 Fmoc 보호기를 가지는 펩타이드를 합성하였다. 모든 펩타이드를 적어도 80%의 순도로 정제하고, 질량 분광분석기로 산물을 체크하였다.
연속적인 T 세포-B 세포 결정체로서 펩타이드를 제조하였다. Pyro Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly의 LHRH 서열 또는 이것의 변이체를 각각의 개별적인 CDV T-헬퍼 에피토프의 카르복시 말단에 연결하였다.
두 실험에서 T 헬퍼-LHRH 서열을 개에게 백신 접종하여 T 헬퍼 에피토프의 일부를 시험관내 평가하였다.
실시예 2(실험 K9 -5)
총 14마리의 혼성의 개를 본 실험에 사용하였다. 이들 모두에게 살아있는 CDV를 미리 백신 접종하고, LHRH에 대해서도 백신 접종하였다.
백신 제형
T 헬퍼 에피토프 각각의 C 말단에 LHRH를 가지는, CDV 유래의 테스트 펩타이드 P25, P27, P35를 합성하였다. 사용된 LHRH 서열은 전체 10개 아미노산으로 이루어진 천연 LHRH이었다. 백신 구조체 각각을 반복적인 포유류의 B 세포 에피토프에 연결된 마우스의 인플루엔자 T 세포 에피토프를 포함하는 대조용 펩타이드(하기 표에 나타난 서열)와 함께 ~80-90% 순도로 정제하였다. 멸균 염수를 사용해 적당한 부피로 희석하기 전, 모든 펩타이드를 4M 우레아에 용해시켜 1 ㎖ 용량당 40 nmol 농도로 만들었다. Iscomatrix™을 티오머살 보존제(0.01%)와 함께 면역 보강 제로서 첨가하여 최종 농도 150 ㎍/㎖으로 만들었다.
ISCOM™ 또는 면역 자극 복합체(Barr, Sjolander and Cox, 1998, Advanced Drug Delivery Systems 32: 247-271)는 인지질, 콜레스테롤 및 사포닌으로 구성되는 그 특징이 잘 밝혀진 부류의 면역 보강제이고, 일반적으로 단백질이 복합체에 혼입된다. 단백질 항원이 존재하지 않는 조건 하에서 복합체가 형성되는 경우, 이 복합체를 Iscomatrix™이라 칭한다. 이 면역 보강제의 제조에 사용된 사포닌은 Quil A 이었다.
백신 접종, 혈액 샘플 및 분석
모든 개에게 1 ㎖ 용량의 백신을 목덜미를 통해 전달하였다. 백신 접종은 0일과 4주 후에 이루어졌으며, 실험 기간 동안 간격을 두고 정맥혈 샘플을 채취하였다.
ELISA를 통해 LHRH에 대한 항체 반응성을 측정함으로써 유효한 T 세포 헬퍼를 결정하였다. 암컷 개의 프로게스테론 수준 및 수컷 개의 테스토스테론 수준을 측정함으로써 펩타이드계 백신의 생물학적 유효성을 결정하였다.
Figure 112008067155556-pat00008
결과
상이한 백신을 미리 면역 접종하였기 때문에 모든 개에서 LHRH에 대해 기존의 낮은 항체 수준이 나타났다. 대조군의 개는 항체 수준이 서서히 감소하는 것으로 나타났다.
P25-LHRH, P27-LHRH 및 P35-LHRH로 면역 접종된 개들은 B 세포 에피토프(LHRH)에 대해 모두 강한 항체 반응을 나타내었다. 이러한 반응은 추가 자극 백신 접종 후 6주 뒤까지 지속되었다(표 8 참조).
백신의 생물학적 효능은 프로게스테론 또는 테스토스테론 수준에 있어서의 현저한 감소에 의해 입증되었다(표 9 및 10 참조).
Figure 112008067155556-pat00009
Figure 112008067155556-pat00010
Figure 112008067155556-pat00011
개에서 항체 반응을 유도하는 T 헬퍼 세포를 제조하는 데 있어 CDV F-단백질 유래의 선택된 T 세포 에피토프의 유효성은 동정된 서열이 기능성임을 입증한다. 이러한 결과는 또한 시험관내 활성을 가지는 T 헬퍼 세포 에피토프를 동정하기 위 한 특정한 연구법 및 시험관내 스크리닝 방법의 유용성을 유효하게 한다.
실시예 3(실험 K9 -8)
총 35마리의 혼성의 개를 본 실험에 사용하였다. 이들 모두에게 살아있는 CDV를 미리 백신 접종하였으며, LHRH에 대해서는 백신 접종하지 않았다.
백신 제형
T 헬퍼 에피토프를 다음과 같은 10개의 천연 아미노산 서열의 아미노산 2-10을 함유하는 절단 형태의 LHRH에 연결하였다:
2-10 LHRH His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.
모든 백신을 실시예 2에서와 같이, 즉 각각 40 nmol의 펩타이드, 150 ㎍의 Iscomatrix™ 및 보존제로서 티오머살을 함유하는 1 ㎖의 용량의 백신으로 제형화하였다.
모든 개에게 펩타이드 푸울이 백신 접종된 곳에서 각 펩타이드의 농도는 동일한 농도와 1 ㎖ 용량당 총 40 nmol 양의 LHRH 에페토프로 조절하였다.
백신 접종, 혈액 샘플 및 분석
모든 개에게 1 ㎖ 용량의 백신을 목덜미를 통해 전달하였다. 백신 접종은 0일과 4주 후에 이루어졌으며, 실험 기간 동안 간격을 두고 정맥혈 샘플을 채취하였다.
ELISA를 통해 LHRH에 대한 항체 반응성을 측정함으로써 유효한 T 세포 헬퍼를 결정하였다. 암컷 개의 프로게스테론 수준 및 수컷 개의 테스토스테론 수준을 측정함으로써 펩타이드계 백신의 생물학적 유효성을 결정하였다.
Figure 112008067155556-pat00012
결과
T 세포 에피토프 P25, P27, P35, P62, P75를 함유하는 T 세포-LHRH 구조체 및 T-세포 에피토프 P25, P27과 P35의 조합물을 포함하는 T 세포-LHRH 펩타이드의 푸울로 면역 접종된 개에서 강한 항체 반응이 확인되었다(표 12).
P2 및 P8-LHRH 펩타이드로 면역 접종된 개에서는 감지되지 않을 정도로 낮은 항체 반응이 나타났다(표 12). 이는 이들 T 세포 펩타이드가 Beagle 여우사냥개에 의해 잘 인식되지 않았음의 의미하며, 이것은 다른 품종의 개로부터 유래된 PBMC를 사용한 그들의 동정결과와 일치한다. Beagle 여우사냥개에서의 초기 스크리닝은 이러한 품종의 개가 이들 두 T 세포 에피토프에 대해 반응하지 않음을 의미한다.
펩타이드 백신 분야의 당업자는 개개의 펩타이드에 대한 반응이 유전적으로 결정된다는 것을 잘 이해할 것이다. 클래스 Ⅱ Major Histocompatibility Complex(MHC Ⅱ)는 다중 형태이다. 세포 표면의 클래스 Ⅱ 분자는 T 세포에 제공되기 위한 펩타이드를 결합시키는 작용을 한다. 대립 형태의 MHC 클래스 Ⅱ는 펩타이드 항원의 분리된 쌍에 결합하므로, 그들 항원에 대한 반응은 유전적으로 측정된다. 따라서, 결과는 Beagle 여우사냥개 품종의 개가 적절한 MHC-Ⅱ 대립형질을 억제하지 않고 P2 및 P8에 대해 반응하는 것으로 해석된다. 그러나, 다른 품종의 개, 예를 들면 이들 펩타이드를 동정하는 데 사용되었던 Poodle Shitzu 품종은 그렇지 않다.
대조군 개는 실험 기간 동안 LHRH에 대한 항체 수준에 있어 변화를 나타내지 않았으며, 호르몬 수준은 개의 연령 및 성별에 대해 정상 범위였다(표 12 참조).
Figure 112008067155556-pat00013
Figure 112008067155556-pat00014
실시예 4
펩타이드 백신에 혼입된 TH - 에피토프의 인식을 입증하는 시험관내 T 세포 증 식 분석
펩타이드 백신으로 면역 접종된 개(실시예 2에서의 개)로부터 얻어진 펩타이드 면역원 PBMC 내에서 TH-에피토프의 인식을 입증하기 위해 각각의 TH-에피토프에 대해 테스트하였다. PBMC를 보충하지 않고 분석을 수행하였다. Ficoll 구배 정제 로부터 얻어진 PBMC를 각각의 TH-에피토프 및 이것의 절단체에 대해 직접 테스트하였다. 이러한 연구를 통해, 펩타이드 백신으로 면역 접종된 모든 개가 혼입된 TH-에피토프에 대해 반응하였음이 입증되었으며, 이는 T 세포 활성이 개별적인 서열에 있음을 확신시킨다(도 2-4). 각각의 TH-에피토프의 절단체를 테스트 한 결과, T 세포의 활성이 이러한 서열 내에 있음이 보다 명확히 입증되었다. P25에 대해 17개 잔기의 전체 서열이 각 서열의 N-말단으로부터 절단된 15개 및 12개 잔기의 짧은 펩타이드보다 우수한 것으로 관찰되었다(도 2). 이는 T 세포의 활성이 17개 잔기 펩타이드의 N-말단 또는 중간에 있음을 의미한다.
유사한 관찰결과가 P27에서도 얻어졌으며, 17개 잔기의 긴 펩타이드가 N-말단으로부터 절단된 15량체의 절단체보다 더 우수한 자극제였다(도 3). 이러한 관찰결과는 T 세포의 활성이 전체 길이 펩타이드의 N-말단 또는 중간에 있음을 다시 한번 입증한다.
P35 및 이것의 짧은 절단체의 경우, 1마리의 개를 제외한 다른 3마리의 개(#102)는 12개 잔기의 펩타이드뿐 아니라 전체 길이의 17개 잔기의 펩타이드와 반응하였다(도 4). 102번의 개에서 15개 잔기의 펩타이드는 전체 길이의 펩타이드보다 자극성이었다. 이로부터 P35 서열 내에 있는 처음 두 잔기는 필수적이지 않으며 활성은 펩타이드의 중간 또는 C-말단에 있음을 유추할 수 있다.
실시예 5
BALB /c 마우스에서의 실험
TH-에피토프가 상이한 동물종에서 기능성인가를 조사하기 위해 BALB/c 마우 스를 면역 접종하는 데 실시예 3에서 사용된 CDV-F 유래의 TH-에피토프 및 LHRH를 함유하는 개의 백신을 사용하였다.
백신 제형
100 ㎕ 용량이 2.7 nmol의 펩타이드 및 10 ㎍의 Iscomatrix™ 및 보존제로서 티오머솔을 함유하도록 백신을 더욱 희석한 것을 제외하고는 실시예 3에서와 동일한 방식으로 모든 백신을 제형화하였다.
백신 접종, 혈액 샘플 및 분석
마우스에게 100 ㎕의 백신을 꼬리의 기부를 통해 접종하였다. 백신 접종은 0일과 4주 후에 이루어졌으며, 역행 궤도총(retro-orbital plexus) 유래의 백신을 접종한 후 간격을 두고 동물의 핼액을 채취하였다. ELISA를 통해 LHRH에 대한 항체 반응성을 측정하여 유효한 T 세포 헬퍼를 결정하였다.
결과
P25-LHRH 및 P25-LHRH, P27-LHRH와 P35-LHRH로 이루어지는 펩타이드 푸울로 면역 접종된 마우스는 LHRH에 대해 높은 항체 역치를 나타내었다. 펩타이드 P35 및 P75는 낮은 항체 역치를 나타낸 반면 P2, P8 및 P62로 면역 접종된 마우스는 감지되지 않을 정도로 낮은 항-LHRH 항체 수준을 갖고 있었다.
당업자는 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 특정한 구현예에서 보여진 바와 같이 본 발명이 다양하게 변경 및/또는 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 구현예는 설명을 위한 것이며, 제한적인 것은 아니다.
Figure 112008067155556-pat00015
도 1은 CDV 융합 단백질의 아미노산 서열.
도 2는 P25-LHRH로 면역 접종된 개로부터 유래된 TH-에피토프 P25 및 이것의 절단체에 대한 자극 인덱스(X-축은 펩타이드 농도, nmol/well).
도 3은 P27-LHRH로 면역 접종된 개로부터 유래된 TH-에피토프 P27 및 이것의 15량체 절단체에 대한 자극 인덱스(X-축은 펩타이드 농도, nmol/well).
도 4는 P35-LHRH로 면역 접종된 개로부터 유래된 TH-에피토프 P35 및 이것의 절단체에 대한 자극 인덱스(X-축은 펩타이드 농도, nmol/well).
SEQUENCE LISTING <110> The University of Melbourne CSL Limited Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation The Council of the Queensland Institute of Medical Research Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research <120> T HELPER CELL EPITOPES <130> IPP 010322 AU <150> AU PP 8533 <151> 1999-02-05 <150> AU PQ 2013 <151> 1999-08-04 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 1 Ser Ser Lys Thr Gln Thr His Thr Gln Gln Asp Arg Pro Pro Gln Pro 1 5 10 15 Ser <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 2 Gln Pro Ser Thr Glu Leu Glu Glu Thr Arg Thr Ser Arg Ala Arg His 1 5 10 15 Ser <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 3 Arg His Ser Thr Thr Ser Ala Gln Arg Ser Thr His Tyr Asp Pro Arg 1 5 10 15 Thr <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 4 Pro Arg Thr Ser Asp Arg Pro Val Ser Tyr Thr Met Asn Arg Thr Arg 1 5 10 15 Ser <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 5 Thr Arg Ser Arg Lys Gln Thr Ser His Arg Leu Lys Asn Ile Pro Val 1 5 10 15 His <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 6 Ser His Gln Tyr Leu Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu Ile 1 5 10 15 Glu <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 7 Ile Gly Thr Asp Asn Val His Tyr Lys Ile Met Thr Arg Pro Ser His 1 5 10 15 Gln <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 8 Tyr Lys Ile Met Thr Arg Pro Ser His Gln Tyr Leu Val Ile Lys Leu 1 5 10 15 Ile <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 9 Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu Ile Glu Asn Cys Thr Lys Ala Glu 1 5 10 15 Leu <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 10 Ala Glu Leu Gly Glu Tyr Glu Lys Leu Leu Asn Ser Val Leu Glu Pro 1 5 10 15 Ile <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 11 Lys Leu Leu Asn Ser Val Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Met <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 12 Glu Pro Ile Asn Gln Ala Leu Thr Leu Met Thr Lys Asn Val Lys Pro 1 5 10 15 Leu <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 13 Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ala <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 14 Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile 1 5 10 15 Ala <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 15 Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn Leu 1 5 10 15 Asn <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 16 Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn Leu Asn Ala Gln Ala Ile Gln Ser 1 5 10 15 Leu <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 17 Asn Leu Asn Ala Gln Ala Ile Gln Ser Leu Arg Thr Ser Leu Glu Gln 1 5 10 15 Ser <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 18 Gln Ser Leu Arg Thr Ser Leu Glu Gln Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu 1 5 10 15 Ile <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 19 Glu Gln Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu Ile Arg Glu Ala Thr Gln Glu 1 5 10 15 Thr <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 20 Thr Glu Leu Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ser 1 5 10 15 Ala <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 21 Pro Arg Tyr Ile Ala Thr Asn Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 22 Cys Ile Arg Gly Asp Thr Ser Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly 1 5 10 15 Thr <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 23 Asp Glu Ser Ser Cys Val Phe Val Ser Glu Ser Ala Ile Cys Ser Gln 1 5 10 15 Asn <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 24 Thr Ser Thr Ile Ile Asn Gln Ser Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe Ile 1 5 10 15 Ala <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 25 Ser Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe Ile Ala Ser Asp Thr Cys Pro Leu 1 5 10 15 Val <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 26 Ser Gly Arg Arg Gln Arg Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Val 1 5 10 15 Ala <210> 27 <211> 662 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 27 Met His Arg Gly Ile Pro Lys Ser Ser Lys Thr Gln Thr His Thr Gln 1 5 10 15 Gln Asp Arg Pro Pro Gln Pro Ser Thr Glu Leu Glu Glu Thr Arg Thr 20 25 30 Ser Arg Ala Arg His Ser Thr Thr Ser Ala Glu Arg Ser Thr His Tyr 35 40 45 Asp Pro Arg Thr Ser Asp Arg Pro Val Ser Tyr Thr Met Asn Arg Thr 50 55 60 Arg Ser Arg Lys Gln Thr Ser His Arg Leu Lys Asn Ile Pro Val His 65 70 75 80 Gly Asn His Glu Ala Thr Ile Gln His Ile Pro Glu Ser Val Ser Lys 85 90 95 Gly Ala Arg Ser Gln Ile Glu Arg Arg Gln Pro Asn Ala Ile Asn Ser 100 105 110 Gly Ser His Cys Thr Trp Leu Val Leu Trp Cys Leu Gly Met Ala Ser 115 120 125 Leu Phe Leu Cys Ser Lys Ala Gln Ile His Trp Asp Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Ile Gly Ile Ile Gly Thr Asp Asn Val His Tyr Lys Ile Met Thr Arg 145 150 155 160 Pro Ser His Gln Tyr Leu Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu 165 170 175 Ile Glu Asn Cys Thr Lys Ala Glu Leu Gly Glu Tyr Glu Lys Leu Leu 180 185 190 Asn Ser Val Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ala Leu Thr Leu Met Thr Lys 195 200 205 Asn Val Lys Pro Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly Arg Arg Gln Arg Arg 210 215 220 Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 225 230 235 240 Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn Leu Asn Ala 245 250 255 Gln Ala Ile Glu Ser Leu Arg Thr Ser Leu Glu Gln Ser Asn Lys Ala 260 265 270 Ile Glu Glu Ile Arg Glu Ala Thr Glu Glu Thr Val Ile Ala Val Gln 275 280 285 Gly Val Gln Asp Tyr Val Asn Asn Glu Leu Val Pro Ala Met Gln His 290 295 300 Met Ser Cys Glu Leu Val Gly Gln Arg Leu Gly Leu Arg Leu Leu Arg 305 310 315 320 Tyr Tyr Thr Glu Leu Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro 325 330 335 Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ile Tyr Ala Leu Gly Gly 340 345 350 Glu Ile His Lys Ile Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Ser Asp Met 355 360 365 Ile Ala Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Thr Lys Ile Thr His Val 370 375 380 Asp Leu Pro Gly Lys Phe Ile Ile Leu Ser Ile Ser Tyr Pro Thr Leu 385 390 395 400 Ser Glu Val Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Ala Val Ser Tyr 405 410 415 Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Arg Tyr Ile Ala 420 425 430 Thr Asn Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser Cys Val Phe 435 440 445 Val Ser Glu Ser Ala Ile Cys Ser Gln Asn Ser Leu Tyr Pro Met Ser 450 455 460 Pro Leu Leu Gln Gln Cys Ile Arg Gly Asp Thr Ser Ser Cys Ala Arg 465 470 475 480 Thr Leu Val Ser Gly Thr Met Gly Asn Lys Phe Ile Leu Ser Lys Gly 485 490 495 Asn Ile Val Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys Tyr Ser Thr 500 505 510 Ser Thr Ile Ile Asn Gln Ser Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe Ile Ala 515 520 525 Ser Asp Thr Cys Pro Leu Val Glu Ile Asp Gly Ala Thr Ile Gln Val 530 535 540 Gly Gly Arg Gln Tyr Pro Asp Met Val Tyr Glu Gly Lys Val Ala Leu 545 550 555 560 Gly Pro Ala Ile Ser Leu Asp Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly 565 570 575 Asn Ala Leu Lys Lys Leu Asp Asp Ala Lys Val Leu Ile Asp Ser Ser 580 585 590 Asn Gln Ile Leu Glu Thr Val Arg Arg Ser Ser Phe Asn Phe Gly Ser 595 600 605 Leu Leu Ser Val Pro Ile Leu Ser Cys Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 610 615 620 Leu Ile Tyr Cys Cys Lys Arg Arg Tyr Gln Gln Thr Leu Lys Gln His 625 630 635 640 Thr Lys Val Asp Pro Ala Phe Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys 645 650 655 Ser Tyr Val Arg Ser Leu 660 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Canis sp. <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> pyroglutamic acid <400> 28 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Canis sp. <400> 29 His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 <210> 30 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artipicial Sequence: Control peptide <400> 30 Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 20 25

Claims (19)

  1. 각각의 T 헬퍼 세포 에피토프(T helper cell epitope)가
    SSKTQTHTQQDRPPQPS (서열번호: 1); QPSTELEETRTSRARHS (서열번호: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (서열번호: 3); PRTSDRPVSYTMNRTRS (서열번호: 4); TRSRKQTSHRLKNIPVH (서열번호 :5); SHQYLVIKLIPNASLIE (서열번호: 6); IGTDNVHYKIMTRPSHQ (서열번호: 7); YKIMTRPSHQYLVIKLI (서열번호: 8); KLIPNASLIENGTKAEL (서열번호: 9); AELGEYEKLLNSVLEPI (서열번호: 10); EPINQALTLMTKNVKPL (서열번호: 12); FAGVVLAGVALGVATAA (서열번호: 13); TAAQITAGIALHQSNLN (서열번호: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (서열번호: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (서열번호: 17); QSLRTSLEQSNKAIEEI (서열번호: 18); EQSNKAIEEIREATQET (서열번호: 19); TELLSIFGPSLRDPISA (서열번호: 20); PRYIATNGYLISNFDES (서열번호: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (서열번호: 22); DESSCVFVSESAICSQN (서열번호: 23); TSTIINQSPDKLLTFIA (서열번호: 24); 및 SPDKLLTFIASDTCPLV (서열번호: 25)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유되어 있는 것인,
    다수의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 분리된 펩타이드로서,
    상기 다수의 T 헬퍼 세포 에피토프는 인접하여 함께 연결되어 추가의 아미노산에 의해 서로 간격을 두고 떨어져 있지 않은 하나의 단일 폴리펩타이드를 형성하는 것인, 다수의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 분리된 펩타이드.
  2. 하나 이상의 B 세포 에피토프 펩타이드 또는 하나 이상의 CTL 에피토프 펩타이드에, 추가의 아미노산에 의해 간격을 두지 않고 하나의 단일 폴리펩타이를 형성하도록 인접하여 연결된, 제1항에 기재된 펩타이드를 포함하는 분리된 펩타이드.
  3. 하나 이상의 B 세포 에피토프 펩타이드 및 하나 이상의 CTL 에피토프 펩타이드에, 추가의 아미노산에 의해 간격을 두지 않고 하나의 단일 폴리펩타이드를 형성하도록 인접하여 연결된, 제1항에 기재된 펩타이드를 포함하는 분리된 펩타이드.
  4. T 헬퍼 세포 에피토프(T helper cell epitope)가
    SSKTQTHTQQDRPPQPS (서열번호: 1); QPSTELEETRTSRARHS (서열번호: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (서열번호: 3); PRTSDRPVSYTMNRTRS (서열번호: 4); TRSRKQTSHRLKNIPVH (서열번호 :5); SHQYLVIKLIPNASLIE (서열번호: 6); IGTDNVHYKIMTRPSHQ (서열번호: 7); YKIMTRPSHQYLVIKLI (서열번호: 8); KLIPNASLIENGTKAEL (서열번호: 9); AELGEYEKLLNSVLEPI (서열번호: 10); EPINQALTLMTKNVKPL (서열번호: 12); FAGVVLAGVALGVATAA (서열번호: 13); TAAQITAGIALHQSNLN (서열번호: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (서열번호: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (서열번호: 17); QSLRTSLEQSNKAIEEI (서열번호: 18); EQSNKAIEEIREATQET (서열번호: 19); TELLSIFGPSLRDPISA (서열번호: 20); PRYIATNGYLISNFDES (서열번호: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (서열번호: 22); DESSCVFVSESAICSQN (서열번호: 23); TSTIINQSPDKLLTFIA (서열번호: 24); 및 SPDKLLTFIASDTCPLV (서열번호: 25)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유되어 있는 것인,
    하나 이상의 B 세포 에피토프 펩타이드 또는 하나 이상의 CTL 에피토프 펩타이드에, 추가의 아미노산에 의해 간격을 두지 않고 하나의 단일 폴리펩타이를 형성하도록 인접하여 연결된, 상기 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 분리된 펩타이드.
  5. T 헬퍼 세포 에피토프(T helper cell epitope)가
    SSKTQTHTQQDRPPQPS (서열번호: 1); QPSTELEETRTSRARHS (서열번호: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (서열번호: 3); PRTSDRPVSYTMNRTRS (서열번호: 4); TRSRKQTSHRLKNIPVH (서열번호 :5); SHQYLVIKLIPNASLIE (서열번호: 6); IGTDNVHYKIMTRPSHQ (서열번호: 7); YKIMTRPSHQYLVIKLI (서열번호: 8); KLIPNASLIENGTKAEL (서열번호: 9); AELGEYEKLLNSVLEPI (서열번호: 10); EPINQALTLMTKNVKPL (서열번호: 12); FAGVVLAGVALGVATAA (서열번호: 13); TAAQITAGIALHQSNLN (서열번호: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (서열번호: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (서열번호: 17); QSLRTSLEQSNKAIEEI (서열번호: 18); EQSNKAIEEIREATQET (서열번호: 19); TELLSIFGPSLRDPISA (서열번호: 20); PRYIATNGYLISNFDES (서열번호: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (서열번호: 22); DESSCVFVSESAICSQN (서열번호: 23); TSTIINQSPDKLLTFIA (서열번호: 24); 및 SPDKLLTFIASDTCPLV (서열번호: 25)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열 내에 함유되어 있는 것인,
    하나 이상의 B 세포 에피토프 펩타이드 및 하나 이상의 CTL 에피토프 펩타이드에, 추가의 아미노산에 의해 간격을 두지 않고 하나의 단일 폴리펩타이를 형성하도록 인접하여 연결된, 상기 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 분리된 펩타이드.
  6. 제2항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)의 B 세포 에피토프인 분리된 펩타이드.
  7. 제3항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)의 B 세포 에피토프인 분리된 펩타이드.
  8. 제4항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)의 B 세포 에피토프인 분리된 펩타이드.
  9. 제5항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)의 B 세포 에피토프인 분리된 펩타이드.
  10. 제1항의 분리된 펩타이드를 면역보강제(adjuvant), 부형제, 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  11. 제2항의 분리된 펩타이드를 면역보강제(adjuvant), 부형제, 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  12. 제3항의 분리된 펩타이드를 면역보강제(adjuvant), 부형제, 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  13. 제4항의 분리된 펩타이드를 면역보강제(adjuvant), 부형제, 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  14. 제5항의 분리된 펩타이드를 면역보강제(adjuvant), 부형제, 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 면역보강제(adjuvant)가 ISCOM 또는 Iscomatrix를 포함하는 것인, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 면역보강제(adjuvant)가 ISCOM 또는 Iscomatrix를 포함하는 것인, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 면역보강제(adjuvant)가 ISCOM 또는 Iscomatrix를 포함하는 것인, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 면역보강제(adjuvant)가 ISCOM 또는 Iscomatrix를 포함하는 것인, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 면역보강제(adjuvant)가 ISCOM 또는 Iscomatrix를 포함하는 것인, 동물의 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물의 제조 방법.
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