JPH09509182A

JPH09509182A - 合成逆転またはレトロ逆転ｔ細胞エピトープ

Info

Publication number: JPH09509182A
Application number: JP7522025A
Authority: JP
Inventors: コミス，アルフィオ; イザベルタイラー，マーガレット; フィッシャー，ピーター
Original assignee: デイーキンリサーチリミテッド
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 1997-09-16
Also published as: WO1995023166A1; EP0751960A1; CA2183977A1; EP0751960A4; AUPM411994A0; ZA951591B

Abstract

(57)【要約】未変性のＴ細胞エピトープに関して部分的または完全に逆転、またはレトロ逆転修飾された、未変性のＴ細胞エピトープの合成ペプチドＴ細胞エピトープ類似体。これらのＴ細胞エピトープ類似体は、ワクチン中で未変性のＴ細胞エピトープの代わりに使用すると免疫応答を剌激する。本発明はさらに、これらのＴ細胞エピトープ類似体の使用、Ｔ細胞エピトープ類似体を含むワクチン、これらのＴ細胞エピトープ類似体を含むワクチンの製造方法、およびこれらのＴ細胞エピトープ類似体を用いて産生される抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】合成逆転またはレトロ逆転Ｔ細胞エピトープ技術分野本発明は、部分的または完全な逆転（inverso）またはレトロ逆転（retro-inv erso）修飾を有する、未変性のＴ細胞エピトープの合成Ｔ細胞エピトープ類似体に関する。これらのＴ細胞エピトープ類似体は、ワクチン中で未変性のＴ細胞エピトープの代わりに使用すると、免疫応答を剌激する。本発明はさらに、これらのＴ細胞エピトープ類似体の使用、Ｔ細胞エピトープ類似体を含むワクチン、これらのＴ細胞エピトープ類似体を含むワクチンの製造方法、およびこれらのＴ細胞エピトープ類似体を用いて産生される抗体に関する。背景技術ポリペプチドの立体化学は、アミノ酸残基と結合残基のα−炭素原子の間のペプチド結合で規定される、ポリペプチド骨格の回りのアミノ酸残基の立体化学的配置により説明される。さらにポリペプチド骨格は、明確な末端、従って明確な方向を有する。天然に存在するアミノ酸の大部分は、Ｌ−アミノ酸である。天然に存在するポリペプチドは、大部分Ｌ−アミノ酸よりなる。Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸の鏡像異性体であり、本明細書において逆転ペプチド（inverso peptide）と呼ぶペプチド（すなわち、未変性のペプチドに対応するが、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸より構成される）を形成する。天然に存在するポリペプチドのレトロ逆転（retro-inverso）修飾は、対応するＬ−アミノ酸のα−炭素立体化学とは反対のアミノ酸（すなわち、Ｄ−またはＤ−アロ−アミノ酸）の、未変性のペプチド配列とは反対の方向の合成的集合が関与する。すなわち、レトロ逆転類似体は、ペプチド末端と方向が逆転しているが、ほぼ未変性のペプチド配列の側鎖の形態を保持している。部分的レトロ逆転ペプチド類似体は、配列の一部のみが逆転しており、鏡像異性体アミノ酸残基で置換されているポリペプチドである。このような類似体のレトロ逆転部分は、逆転したアミノ末端とカルボキシ末端を有するため、レトロ逆転部分に隣接する（flanking）アミノ酸残基は、それぞれ側鎖類似体α−置換ジェムの（geminal）ジアミノメタンおよびマロン酸塩で置換されている。レトロ逆転ペプチド類似体の合成法（ボネリ（Bonelli）ら、１９８４、ベルジニとビスコミ（Verdini and Viscomi）、１９８５）、および部分的レトロ逆転ペプチド類似体の固相合成法（ペッシ（Pessi）ら、１９８７）は、文献に記載されている。基質に対する酵素の立体特異性のために、ペプチド基質中のＬ−アミノ酸残基をＤ−アミノ酸残基で置換すると、例外もあるが一般的には蛋白分解酵素による認識および／または活性がなくなることが観察されている。ペプチドホルモンの類似体は治療薬としての可能性を有するため、レトロ逆転の標的としてペプチドホルモンは特に興味深い。多くのペプチドホルモンの部分的（いくつかのケースでは完全な）レトロ逆転類似体が調製され試験されている（例えば、グッドマンとチョレブ（Goodman and Chorev）、１９８１を参照）。完全なまたは伸長した部分的レトロ逆転類似体は、一般的に生物活性がないことがわかっている。生物活性の欠如は、おそらく広範な修飾、逆転した鎖の末端の存在、または配列中のプロリン残基の存在による複雑な構造変化が原因であろう。いくつかの部分的レトロ逆転類似体（すなわち、選択された残基のみが修飾されている）は、生物活性を保持または増強していることが証明されている。レトロ逆転はまた、酵素インヒビターの理論的設計の分野にも応用されている。生物活性ペプチドのレトロ逆転が未変性のペプチドの活性をうまく保持または増強できないことには、おそらくいくつかの理由があるであろう。ペプチドとそのレトロ鏡像異性体は構造は似ているが、形態は同一ではなく、これは結晶構造や溶液コンフォメーションの研究により支持されている。ペプチドホルモンや神経伝達物質の生物活性は、おもにその受容体との動的相互作用、そしてペプチド −受容体複合体の変換過程に依存する。現在では、この相互作用は、多くのコンフォメーションおよび立体化学的性質が関与する複雑な過程であることが知られている。従ってレトロ逆転類似体は、これらの性質のすべてを模倣することができないことは明らかである。免疫系の細胞成分を活性化するためには、ワクチンは、Ｔ細胞エピトープおよび病原体特異的Ｂ細胞エピトープを提示しなければならない。Ｔ細胞は可溶性抗原を認識しない。Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）にコードされる分子と協働して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される必要がある。従来のワクチンを構成する大きな蛋白の場合は、蛋白は細胞内で酵素的消化を受ける必要がある。得られるペプチド断片のいくつかのは、ＭＨＣ分子に結合でき、次にペプチド−ＭＨＣ複合体はＡＰＣの表面に運搬される。ＭＨＣ分子に結合できるペプチドは、Ｔ細胞エピトープである。ＭＨＣの遺伝的制限のために、Ｔ細胞エピトープとして作用する配列は、非近交系集団の個人間で異なる。従ってこれらの事実に関して、完全に合成のワクチン（ジョリベット（Jolivet）ら、１９９０）を設計する必要がある。関連するＢ細胞エピトープペプチドを担体蛋白に結合させて、ペプチドワクチン中にＴ細胞エピトープを提示することも可能であるが、これはペプチドワクチンの本質的な利点（例えば、化学的安定性および生産の容易さ）を否定することになるため好ましくない。合成ワクチンに有用な可能性のある適当なＴ細胞エピトープ「カクテル」の同定が、活発に研究されている（シュワルツ（Schwarts）、１９８６）。発明の開示定義本明細書および請求の範囲において、「レトロ修飾された」とは、レトロ修飾されたペプチドの未変性のペプチドとは反対の方向にＬ−アミノ酸残基が集合した、Ｌ−アミノ酸より作成されるペプチドを意味する。本明細書および請求の範囲において、「逆転修飾された」とは、逆転修飾されたペプチドの未変性のペプチドと同じ方向にＤ−アミノ酸残基が集合した、Ｄ− アミノ酸より作成されるペプチドを意味する。本明細書および請求の範囲において、「レトロ逆転修飾された」とは、レトロ逆転修飾されたペプチドの未変性のペプチドとは反対の方向にＤ−アミノ酸残基が集合した、Ｄ−アミノ酸より作成されるペプチドを意味する。本明細書および請求の範囲において、「未変性の」という用語は、部分的または完全なレトロ、逆転またはレトロ逆転類似体の調製の出発物質として使用されるＬ−アミノ酸の任意の配列に関して用いる。本明細書および請求の範囲において、「ペプチド」という用語は、任意の長さのペプチドを意味するものと理解すべきである。本明細書および請求の範囲において、「抗原性断片」という用語は、それ自身が免疫原性があるかまたは抗体に結合することができるペプチドを意味する。本明細書および請求の範囲において、「抗原」という用語は、文脈に応じて免疫原を含むものと理解すべきである。本明細書および請求の範囲において、「抗原類似体」という用語は、部分的または完全にレトロ、逆転またはレトロ逆転修飾されたペプチドに関する、未変性のペプチド抗原の免疫活性を模倣することができるペプチド分子を意味する。レトロペプチドはＬ−アミノ酸より構成され、アミノ酸残基が未変性のペプチド配列とは反対の方向に集合したペプチドである。本明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞エピトープ類似体」という用語は、部分的または完全に逆転またはレトロ逆転修飾されたＴ細胞エピトープに関する、未変性のＴ細胞エピトープの免疫活性を模倣することができるペプチド分子を意味する。部分的修飾とは、２つという少ない連続する残基が修飾された類似体を含む。典型的には少なくとも５または６個の連続する残基が修飾される。本発明は、ワクチン中で未変性のＴ細胞エピトープの代わりに使用すると、免疫応答を剌激する、未変性のＴ細胞エピトープの部分的または完全に逆転またはレトロ逆転修飾されたＴ細胞エピトープに関する。Ｔ細胞エピトープ類似体中にＤ−アミノ酸を導入すると、投与後の分解に対する安定性が上昇する。さらにＤ −アミノ酸の導入は、類似体を経口投与できる可能性がある。部分的なレトロ逆転または逆転Ｔ細胞エピトープ類似体は、未変性のＴ細胞エピトープの代わりに使用すると免疫応答を剌激することができることが証明されたため、Ｔ細胞エピトープ−ＭＨＣ分子相互作用は基本的にケースバイケースで異なることはないことから、一般的にこれらの類似体はうまくいくことが予測される。第１の面において本発明は、未変性のＴ細胞エピトープに関して部分的または完全に逆転またはレトロ逆転修飾された、未変性のＴ細胞エピトープの合成ペプチドＴ細胞エピトープ類似体を提供する。本発明のＴ細胞エピトープ類似体は、未変性のＴ細胞エピトープの代わりに使用すると免疫応答を剌激する。本発明のＴ細胞エピトープ類似体の有効性は、例２のマラリアＴ細胞エピトープについて説明される。第２の面において本発明は、Ｂ細胞エピトープおよび薬剤学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または補助剤とともに、第１の面のＴ細胞エピトープ類似体を含んでなるワクチンを提供する。典型的には本発明のワクチンは、Ｔ細胞エピトープ類似体と、予防接種が必要な症状に応じて作成されたＢ細胞エピトープのカクテルである。好ましくはＴ細胞エピトープ類似体は、Ｂ細胞エピトープと結合している。Ｂ細胞エピトープは、標準的化学的結合法によりＴ細胞エピトープに結合しているか、または結合体は、連続ペプチドとして合成される。Ｂ細胞エピトープは、抗体応答が必要なエピトープを与える、任意のエピトープまたは任意の無傷の分子である。本発明のワクチンに導入されるＢ細胞エピトープは、そのアミノ酸配列が、例えば、小児麻痺、Ｂ型肝炎、家畜の口蹄疫、破傷風、百日咳、ＨＩＶ、コレラ、マラリア、インフルレンザ、狂犬病またはジフテリア起因物質のような病原体のポリペプチド、またはロバストキシン（robustoxin）、病原性大腸菌の熱不安定性毒素若しくは赤痢菌（Shigella dyscenteriae）のシガ（Shiga）毒素のような毒素由来の、任意の長さのペプチドまたはポリペプチドを含む。関係のある他のＢ細胞エピトープには、アミロイドβ蛋白（アルツハイマー病）および絨毛性性腺剌激ホルモンや性腺刺激ホルモン放出ホルモン（避妊ワクチン）のエピトープがある。Ｂ細胞エピトープは、好ましくはレトロ、レトロ逆転または逆転抗原類似体である。本発明の好適なＴ細胞エピトープ類似体は：ジフテリア毒素： H-Gln-Val-Val-His-Asn-Ser-Tyr-Asn-Arg-Pro-Ala-Tyr-Ser-Pro-Gly-OH（配列番号１）百日咳毒素： H-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-OH（配列番号２）マラリアＣＳＡ蛋白： H-Pro-Ser-Asp-Lys-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Se r-OH（配列番号３）マラリアＣＳＢ蛋白： H-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Ser-OH（配列番号４）マラリアＣＳＴ３蛋白： H-Gly-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-As n-Val-Val-Asn-Ser-OH（配列番号５）鶏卵リゾチーム： H-Cys-Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile-Thr-Ala-Ser-Val-Asn-Cys-Ala-OH（配列番号６）卵白アルブミン： H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-OH（配列番号７）および H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Tyr-Thr-Tyr-Thr-OH（配列番号８）の類似体である。他の好適なＴ細胞エピトープ類似体は：はしかウイルスＦおよびＨ糖蛋白：（パーチドス・シー・ディー（Partidos C.D .）ら、１９９１）ＭＶＦ：２５８−２７７ H-Gly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Val-Asp-Thr-Gl u-Ser-Tyr-OH（配列番号９）ＭＶＦ：２８８−３０２ H-Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-OH（配列番号１０）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウイルス）ＬＡ蛋白：（ニコラス・ジェイ・エー（ Nicholas J.A.）ら、１９８８）ＲＳＩＡ：４５−６０ H-Cys-Glu-Tyr-Asn-Val-Phe-His-Asn-Lys-Thr-Phe-Glu-Leu-Pro-Arg-Ala-OH（配列番号１１）インフルエンザ血球凝集素Ａ／ＰＲ／８／３４Ｍｃ／Ｓ．：１０９−１１９（ハケット・シー・ジェイ（Hackett C.J.）ら、１９８３）（配列番号１２）１３０−１４０（フーウィッツ・ジェイ・ジェイ（Hurwitz J.J.）ら、１９８４）（配列番号１３）３０２−３１３（ラム・ジェイ・アール（Lamb J.R．）ら、１９８２；フーウィッツ・ジェイ・エル（Hurwitz J.L.）ら、１９８４）（配列番号１４）ブタインスリン：（Ａ）４−１４（ローゼンタール・エー・エス（Rosenthal A.S.）、１９７８）（配列番号１５）（Ｂ）５−１６（トーマス・ジェイ・ダブリュー（Thomas J.W．）ら、１９８１）（配列番号１６）Ｂ型肝炎ウイルスプレＳ：１２０−１３２（ミリチ・ディー・アール（Milich D.R．）ら、１９８６）（配列番号１７）Ｂ型肝炎ウイルス主要表面抗原：３８−５２（ミリチ・ディー・アール（Milich D.R．）ら、１９８６）（配列番号１８）９５−１０９（ミリチ・ディー・アール（Milich D.R．）ら、１９８６）（配列番号１９）１４０−１５４（ミリチ・ディー・アール（Milich D.R．）ら、１９８６）（配列番号２０）口蹄疫ウイルスＶＰ１：１４１−１６０（フランシス・エム・ジェイ（Francis M.J.）ら、１９８５）（配列番号２１）狂犬病ウイルス−スパイク糖蛋白前駆体：３２−４４（マクファーラン・アール・アイ（Macfarlan R.I.）ら、１９８４）（配列番号２２）の類似体である。第３の面において本発明は、治療の必要な宿主に第２の面のワクチンの有効量を投与することよりなる、宿主の予防接種方法を提供する。第４の面において本発明は、第２の面のワクチンで宿主を免疫することにより産生される抗体を提供する。第５の面において本発明は、本発明のＴ細胞エピトープ類似体を含む部分的または完全な逆転またはレトロ逆転ペプチドを合成することよりなる、該類似体の調製方法を提供する。第６の面において本発明は、第１の面のＴ細胞エピトープ類似体をＢ細胞エピトープに結合させるか、または第１の面のＴ細胞エピトープ類似体にＢ細胞エピトープを混合し、得られる混合物または結合体の有効量に薬剤学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを混合することよりなる、第２の面のワクチンの調製方法を提供する。本発明のワクチンは、ワクチン製剤の分野で公知の標準的方法を用いて調製される。適当な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントの選択は、この分野の標準的方法に従って行われる。本発明のワクチンは、治療の必要な宿主に注射により投与してもよい。Ｄ−アミノ酸含有類似体を取り込んだワクチンは、経口投与してもよい。略号ＢＯＰ（ベンゾトリアゾリルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（カストロ（Castro's）試薬）ＤＭＦジメチルホルムアミドＥＬＩＳＡ酵素結合免疫吸着測定法Ｆｍｏｃ９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーＩｇ免疫グロブリンｉｎ逆転ｉ．ｐ．腹腔内ｎｏ正常（未変性）ＰＢＳリン酸緩衝化生理食塩水（１０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）ＰｆＰペンタフルオロフェニルＰＶＣポリビニルクロリドＴＦＡトリフルオロ酢酸アミノ酸Ｌ−アミノ酸は大文字の後に小文字を続けて表し、例えばＡｌａはＬ−アラニンを表す。Ｄ−アミノ酸はすべて小文字で表し、例えばａｌａはＤ−アラニンを表す。図面の簡単な説明図１は、Ｔ細胞エピトープペプチドである、ｎｏＭａ１ＣＳＴ３（配列番号５）、ｉｎＭａ１ＣＳＴ３およびｒｉＭａ１ＣＳＴ３を用いて行なった、細胞増殖実験の結果である。図２は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ若しくはｒｉＭａ１ＣＳＴ３とともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。図３は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ（配列番号３）若しくはｒｉＭａ１ＣＳＡとともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。図４は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ（配列番号４）若しくはｒｉＭａ１ＣＳＢとともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。図５は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ（配列番号１）若しくはｒｉＤｉｐｈＴとともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。図６は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ（配列番号２）若しくはｒｉＰｅｒｔＴとともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。図７は、Ｂ細胞エピトープH-(Asn-Ala-Asn-Pro-)₃-OH（配列番号２３）単独で、またはｎｏ（配列番号７）若しくはｒｉＯｖａ１Ｔとともに免疫したマウスで測定した抗体産生を示す。発明の最前の態様本発明のＴ細胞エピトープ類似体は、標準的技術を用いて、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸含有ペプチド（特に、例１に概説したもの）について調製される。本発明のワクチンは、経口投与用または注射用ワクチンに適した、標準的担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを用いてワクチン調製の標準的技術により調製される。ワクチンに取り込まれるＴ細胞エピトープ類似体の有効量は、標準的方法に従って決定される。結合法を使用する時は、標準的化学的結合技術が使用される。使用される予防接種方法は、動物またはヒト宿主の予防接種の標準的方法である。これらの方法は、宿主の免疫が必要な時または体外で使用するための抗体を産生するのに宿主が使用される時に、使用される。本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。例１ペプチド合成ペプチドは、側鎖保護Ｆｍｏｃアミノ酸（カルピノとハン（Carpino & Han）、１９７２）を用いて、ポリアミド（アーシャディ（Arshady）ら、１９８１）またはポリハイプ（polyhipe）支持体上で、固相法により合成した。市販のまたは合成して得た純粋なアミノ酸誘導体のみを使用した。ｐ−アルコキシベンジルアルコールベースの結合剤で誘導体化したポリアミド合成樹脂を、０．２モル当量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよびＮ−メチルモルホリンの存在下で、適当なあらかじめ作成したＣ−末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸対称無水物を用いて、定量的にエステル化した。Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋリンカー（リンク（Ringk）、１９８７）で誘導体化したポリハイプ（polyhipe）樹脂は、そこに結合した最初のアミノ酸のエステル化は必要なかった。鎖の伸長は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（アサートン（Atherton）ら、１９８８）またはカストロ（Castro's）試薬／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールカプリング（ハドソン（ Hudson）、１９８８）を用いて行なった。各合成の進行は、特異的な発色試薬（ハンコックとバッターズビー（Hancock & Battersby）、１９７６）および／または酸加水分解ペプチジル樹脂試料のアミノ酸解析を用いて追跡した。ペプチドを樹脂から切断し、側鎖をスカベンジャー化合物の適当な混合物（タム（Tam）、１９８８）を含有するＴＦＡで脱保護した。濾過し真空下で蒸発させてから、ペプチドをジエチルエーテルで粉砕し、遠心分離して集め、重炭酸アンモニウム水溶液で凍結乾燥した。次にすべてのペプチドを、まず水性溶媒中の適当なゲル濾過媒体上でのカラムクロマトグラフィーにより脱塩と精製を行なった。次にこれらを、水−アセトニトリル（０．０５−０．１％ＴＦＡ含有）勾配溶出を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーにより、均一になるまで精製した。合成ペプチドの純度を、気相および加水分解／アミノ酸解析（ビドリングマイナー（Bidlingmeyer）ら、１９８７）、および必要であれば自動気相配列決定法（フンカピラーとフード（Hunkap iller & Hood）、１９８３）により、さらに評価した。例２マラリアＴ細胞エピトープペプチド熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイト周囲蛋白（cir cumsporozoite protein）のマラリア免疫優性Ｂ細胞エピトープ（Asn-Ala-Asn-P ro-）₃（配列番号２３）に対する非応答性は、同じ蛋白からの特定のＴ細胞エピトープペプチド（シニガグリア（Sinigaglia）ら、１９８８）の存在下で克服できることが証明されている。問題のペプチドは多くのＴ細胞エピトープとは異なり、ほとんどのヒトＭＨＣクラスII分子に会合していることが認識されており、マラリアに対する合成ペプチドワクチンの適当な成分として示唆されている。ペプチドが得られたスポロゾイト周囲蛋白の領域は、異なる寄生体単離物中で、明らかに保存されている。以下のペプチドは通常のプロトコールに従って調製された：ｎｏＭａ１ＣＳＴ３ H-Gly-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Al a-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser-OH（配列番号５）ｉｎＭａ１ＣＳＴ３ H-Gly-asp-ile-glu-lys-lys-ile-ala-lys-met-glu-Iys-al a-ser-ser-val-phe-asn-val-val-asn-ser-OH ｒｉＭａ１ＣＳＴ３ H-ser-asn-val-val-asn-phe-val-ser-ser-ala-lys-glu-me t-lys-ala-aile-lys-lys-glu-aile-asp-Gly-OH 等量の完全フロイントアジュバント中に乳化した前記Ｔ細胞エピトープペプチドを、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの尾の根元の皮下に投与して免疫した。１０日後、頸部脱臼によりマウスを屠殺し、鼠径部および膝窩リンパ節を取り出した。リンパ節の細胞懸濁物を調製し、種々の濃度の試験抗原および非関連対照抗原の存在下で細胞を培養した。放射能標識チミジンの細胞への取り込みを測定することにより、細胞の増殖を定量した。実験の結果を図１に示す。マウスを任意の型のペプチドでプライム（prime）し、マウスの培養したＴ細胞を同じペプチドで刺激すると、いずれの場合も増殖が観察された。１つの型のペプチドでプライムし別の２つの型のいずれかで剌激すると、各場合に活性化が観察された。非特異的細胞増殖による影響の可能性を除去するために、Ｔ細胞測定法を以下のように改良した。リンパ節の細胞懸濁物を、フィコール−イソペーク（Ficoll-Isopaque）で遠心分離して、赤血球から単核球を分離した。得られた細胞調製物を大量のＰＢＳで洗浄し、抗マウスＩｇＧでコーティングしたダイナビーズ（Dynabeads）とインキュベートしてＢリンパ球を除去した。次に種々の濃度の試験抗原および非関連対照抗原の存在下で、この調製物を培養した。放射能標識チミジンの細胞への取り込みを測定するか、またはプロメガセルタイター（Promega Cell Titer）９６ＡＱキットにより、細胞の増殖を定量した。Ｔ細胞エピトープ類似体の有効性が再度証明された。Ｂａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内投与後、スポロゾイト周囲蛋白の免疫優性Ｂ細胞エピトープ（Asn-Ala-Asn-Pro-）₃（配列番号２３）である合成ペプチドに対する抗体応答を測定した。等量の完全フロイントアジュバント中で単独でまたはｎｏＭａ１ＣＳＴ３（配列番号５）若しくはｒｉＭａ１ＣＳＴ３との混合物で、１００μｇのＢ細胞エピトープを投与した。陰性対照として、別の群のマウスをＢ細胞エピトープの非存在下で、ｎｏＭａ１ＣＳＴ３（配列番号５）若しくはｒｉＭａ１ＣＳＴ３で免疫した。プライムの３週間後、同じ経路でかつ不完全フロイントアジュバント中の同用量のペプチドで、マウスを追加免疫した。５日後眼後方出血により血液試料を取り、遠心分離後直ちに血清を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した。卵白アルブミンに架橋させた合成ペプチド０．５μ ｇで４℃で一晩コーティングしたマイクロタイタープレート中で、Ｂ細胞エピトープに対する抗体力価を測定した。Ｂ細胞エピトープ単独で免疫したマウスの抗体力価は低かったが、同じペプチドといずれかのＴ細胞エピトープで同時免疫したマウスでは、はるかに高力価の抗体が観察された（図２）。まとめるとこれらの知見は、ｒｉＭａ１ＣＳＴ３と iｎＭａ１ＣＳＴ３のワクチン成分としての有用性を示している。これらが誘導する細胞性免疫応答は、正常の抗原に応答性である。文献から選択し合成した以下の５つのＴ細胞エピトープを用いて、同じＢ細胞エピトープに対する抗体応答も測定した：マラリアスポロゾイト周囲蛋白：ｎｏＭａ１ＣＳＡ（グッド（good）ら、１９８７）： H-Pro-Ser-Asp-Lys-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Se r-NH₂（配列番号３）ｒｉＭａ１ＣＳＡ： H-ser-ile-ser-asn-lys-ile-lys-lys-leu-tyr-gln-glu-ile-his-lys-asp-ser-pr o-NH₂ ｎｏＭａ１ＣＳＢ（グッド（good）ら、１９８８）： H-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Ser-NH₂（配列番号４）ｒｉＭａ１ＣＳＢ： H-ser-ile-ser-asn-lys-ile-lys-lys-leu-tyr-gln-glu-ile-his-NH₂ ジフテリア毒素：ｎｏＤｉｐＴ（ビクスラー（Bixler）ら、１９８９） H-Gln-Val-Val-His-Asn-Ser-Tyr-Asn-Arg-Pro-Ala-Tyr-Ser-Pro-Gly-NH₂（配列番号１）ｒｉＤｉｐＴ： H-Gly-pro-ser-tyr-ala-pro-arg-asn-tyr-ser-asn-his-val-val-gln-NH₂ 百日咳毒素：ｎｏＰｅｒｔＴ（キム（Kim）ら、１９９０）（配列番号２）： H-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-NH₂ ｒｉＰｅｒｔＴ： H-arg-Gly-ala-arg-glu-ala-glu-val-ala-glu-gln-met-arg-his-NH₂ 卵白アルブミンｎｏＯｖａ１Ｔ（セッテ（Sette）ら、１９８９）（配列番号７）： H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-NH₂ ｒｉＯｖａ１Ｔ： H-glu-asn-ile-glu-ala-his-ala-ala-his-val-ala-gln-ser-ile-NH₂ 上記ペプチドの合成は、ポリハイプリンク（Polyhipe Rink）樹脂上で行なった。使用した側鎖保護基は：セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびチロシンについてはｔ−ブチル；ヒスチジン、グルタミンおよびアスパラギンについてはトリチル；リジンについてはｔ−ブトキシカルボニル、そしてアルギニンについては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルである。ジフテリアと百日咳ペプチドについて、切断と側鎖脱保護は、ペプチジル樹脂をＴＦＡ中０．２５Ｍ１，２−エタンジチオール（５％ｖ／ｖ）を含有するＴＦＡ中の１Ｍ臭化トリメチルシリル−チオアニソールで０℃で９０分間、そしてＴＦＡ中の水（５％ｖ／v）で室温で９０分間反応させて、行なった。各場合にマウスは、Ｂ細胞エピトープ単独で免疫した時Ｂ細胞エピトープに対する非常に低い力価を示したが、免疫原調製物中にＢ細胞エピトープと任意のｎｏ−またはｒｉ−型のＴ細胞エピトープの混合物を使用した時は、はるかに高い抗体力価を示した（図３〜７）。工業的応用本発明のＴ細胞エピトープ類似体は、宿主に免疫原性応答を誘発するためのある範囲の応用の可能性を有する。これらの類似体は、疾患の治療および／または予防、そして病状の治療に使用できる。特にこれらの類似体は、病原体などに対する防御のために、動物（ヒトを含む）のワクチン中に使用できる。文献アーシャディ，アール、アサートン，イー、クリーブ，ディー・エル・ジェイ、シェパード，アール・シー（Arshady，R.，Atherton，E.，Clive，D.L.J．& She ppard，R.C．）(1981)ペプチド合成、第１部、ポリ（ジメチルアクリルアミド）に基づく極性支持体の調製と使用、J．Chem．Soc．Perkin Trans．I，529-537。アサートン，イー、カメロン，エル・アール、シェパード，アール・シー（Athe rton，E.，Cameron，L.R．& Sheppard，R.C.）(1988)ペプチド合成第１０部、固相ペプチド合成におけるフルオエニルメトキシカルボニルアミノ酸のペンタフルオロフェニルエステルの使用、Tetrahedron，44，843-857。ビドリングマイアー，ビー・エー、タービン，ティー・エル、コーエン，エス・エー（Bidlingmeyer，B.A.，Tarvin，T.L．& 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/135 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/135 39/145 ＡＤＹ 9284−4Ｃ 39/145 ＡＤＹ 39/165 9284−4Ｃ 39/165 39/205 9284−4Ｃ 39/205 39/29 9284−4Ｃ 39/29 Ｃ０７Ｋ 5/113 9356−4ＨＣ０７Ｋ 5/113 7/06 9356−4Ｈ 7/06 7/08 9356−4Ｈ 7/08 14/02 9356−4Ｈ 14/02 14/03 9356−4Ｈ 14/03 14/09 9356−4Ｈ 14/09 14/11 9356−4Ｈ 14/11 14/12 9356−4Ｈ 14/12 14/135 9356−4Ｈ 14/135 14/195 9356−4Ｈ 14/195 14/235 9356−4Ｈ 14/235 14/62 9356−4Ｈ 14/62 14/76 9356−4Ｈ 14/76 16/08 9356−4Ｈ 16/08 16/10 9356−4Ｈ 16/10 16/12 9356−4Ｈ 16/12 16/18 9356−4Ｈ 16/18 16/26 9356−4Ｈ 16/26 Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フィッシャー，ピーターノルウェー国エヌ − 0371 オスロ, ガウストアダレーン 21，ニコメドビオレグアクチーゼルスカブ気付

Claims

【特許請求の範囲】１．未変性のＴ細胞エピトープに関して部分的または完全に逆転修飾された、未変性のＴ細胞エピトープの合成ペプチドＴ細胞エピトープ類似体。２．未変性のＴ細胞エピトープに関して部分的または完全にレトロ逆転修飾された、未変性のＴ細胞エピトープの合成ペプチドＴ細胞エピトープ類似体。３．未変性のＴ細胞エピトープは、以下よりなる群から選択される、請求の範囲第１項または第２項に記載の合成ペプチドＴ細胞エピトープ類似体：ジフテリア毒素からの、 H-Gln-Val-Val-His-Asn-Ser-Tyr-Asn-Arg-Pro-Ala-Tyr-Ser-Pro-Gly-OH（配列番号１）；百日咳毒素からの、 H-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-OH（配列番号２）；マラリアＣＳＡ蛋白からの、 H-Pro-Ser-Asp-Lys-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Se r-OH（配列番号３）；マラリアＣＳＢ蛋白からの、 H-His-Ile-Glu-Gln-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ile-Lys-Asn-Ser-Ile-Ser-OH（配列番号４）；マラリアＣＳＴ３蛋白からの、 H-Gly-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-As n-Val-Val-Asn-Ser-OH（配列番号５）；鶏卵リゾチームからの、 H-Cys-Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile-Thr-Ala-Ser-Val-Asn-Cys-Ala-OH（配列番号６）；卵白アルブミンからの、 H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-OH（配列番号７）および H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Tyr-Thr-Tyr-Thr-OH（配列番号８）；はしかウイルスＦおよびＨ糖蛋白からの、ＭＶＦ：２５８−２７７ H-Gly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Val-Asp-Thr-Gl u-Ser-Tyr-OH（配列番号９）およびＭＶＦ：２８８−３０２ H-Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-OH（配列番号１０）；呼吸器合胞体ウイルス１Ａ蛋白からの：ＲＳ１Ａ：４５−６０ H-Cys-Glu-Tyr-Asn-Val-Phe-His-Asn-Lys-Thr-Phe-Glu-Leu-Pro-Arg-Ala-OH（配列番号１１）；インフルエンザ血球凝集素Ａ／ＰＲ／８／３４Ｍｃ／Ｓ．：残基１０９−１１９（配列番号１２）、１３０−１４０（配列番号１３）、および３０２−３１３（配列番号１４）；ブタインスリンからの残基（Ａ）４−１４（配列番号１５）および（Ｂ）５−１６（配列番号１６）；Ｂ型肝炎ウイルスプレＳ残基１２０−１３２（配列番号１７）；Ｂ型肝炎ウイルス主要表面抗原：残基３８−５２（配列番号１８）、９５−１０９（配列番号１９）、および１４０−１５４（配列番号２０）；口蹄疫ウイルスＶＰ１：残基１４１−１６０（配列番号２１）；および狂犬病ウイルス−スパイク糖蛋白前駆体：残基３２−４４（配列番号２２）。４．レトロ逆転配列に隣接する（flanking）アミノ酸残基は、それぞれ側鎖類似体α−置換ジェムの（geminal）ジアミノメタンおよびマロン酸塩で置換されている、請求の範囲第２項または第３項に記載のＴ細胞エピトープ類似体。５．Ｂ細胞エピトープおよび薬剤学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと一緒の、請求の範囲第１項〜第４項までのいずれか１項に記載のＴ細胞エピトープ類似体を含んでなるワクチン。６．Ｔ細胞エピトープ類似体はＢ細胞エピトープに結合している、請求の範囲第５項に記載のワクチン。７．Ｔ細胞エピトープ類似体と、予防接種が必要な症状に応じて作成されたＢ細胞エピトープのカクテルである、請求の範囲第５項に記載のワクチン。８．請求の範囲第５項に記載のワクチンであって、Ｂ細胞エピトープはそのアミノ酸配列が：小児麻痺、Ｂ型肝炎、家畜の口蹄疫、破傷風、百日咳、ＨＩＶ、コレラ、マラリア、インフルレンザ、狂犬病またはジフテリア起因物質を包含する病原体のポリペプチド；ロバストキシン（robustoxin）、病原性大腸菌の熱不安定性毒素若しくは赤痢菌（Shigella dyscenteriae）のシガ（Shiga）毒素を包含する毒素由来；アミロイドβ蛋白；ヒト絨毛性性腺剌激ホルモン；性腺剌激ホルモン放出ホルモン、に由来する、任意の長さのペプチドまたはポリペプチドである、上記ワクチン。９．Ｂ細胞エピトープは、レトロ、レトロ逆転または逆転抗原類似体である、請求の範囲第５項に記載のワクチン。 10．請求の範囲第５項に記載のワクチンの有効量を宿主に投与することよりなる、治療の必要な宿主の予防接種方法。 11．未変性のＴ細胞エピトープの部分的または完全な逆転またはレトロ逆転類似体を合成することよりなる、請求の範囲第１項または第２項記載のＴ細胞エピトープ類似体の調製方法。 12．請求の範囲第５項に記載のワクチンで宿主を免疫することにより産生される抗体。 13．請求の範囲第５項に記載のワクチンの調製方法であって：請求の範囲第１項または第２項記載のＴ細胞エピトープ類似体をＢ細胞エピトープに結合させるか、または請求の範囲第１項または第２項記載のＴ細胞エピトープ類似体にＢ細胞エピトープを混合し、得られる混合物または結合体の有効量に薬剤学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを混合することよりなる、上記方法。