JP3103592B2 - 駆虫薬剤及び感染防御免疫原の製造及び使用 - Google Patents
駆虫薬剤及び感染防御免疫原の製造及び使用Info
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Description
本発明は、駆虫薬剤及び感染防御免疫原として用いる
物資の製造、並びにこれらの物資の使用に関する。
物資の製造、並びにこれらの物資の使用に関する。
血液を栄養とするネマトーダ（線虫）である捻転胃虫
（Haemonchus）は、反芻動物の胃腸管の内壁に感染す
る。これは家畜の体重増加の減少や生産性の損失、無乳
症などから死亡までの範囲にわたる影響を有し、世界的
にみて非常に大きな経済的重要性を持つ。同類のネマト
ーダであるオステルタギア（Ostertagia）も同様の作用
を及ぼす。捻転胃虫症及びオステルタギア症は、一つに
は重い感染と結びついた食欲不良による瘠痩によって特
徴付けられる。羊及び牛では、冬期降雨地域においてオ
ステルタギア（Ostertagia）が最も顕著であるが、夏期
降雨地域においては捻転胃虫（Haemonchus）がより顕著
である。例えばオーストラリアにおいては、同国の300
万頭の羊の約３分の１が捻転胃虫（Haemonchus）に感染
されていると見積もられている。他に２つの属、毛様線
虫（Trichostrongylus）及びネマトディルス（Nematodi
rus）が、経済的に重要なものである。毛様線虫（Trich
ostrongylsu）は、温暖な地域における寄生虫性胃腸炎
の最も重大な原因の一つである。ネマトディルス（Nema
todirus）、特にネマトディルス・バッタス（N.battu
s）は、子羊における急性の、多くは致死性の腸炎を惹
起しうる。 同類の血液摂取ネマトーダである鉤虫は、反芻動物、
イヌ、ネコ、他の肉食動物およびヒトに感染する。700
万人を越える人が鉤虫、特にアメリカ鉤虫（Necator am
ericanus）に感染しており、毎年新たな感染が70から90
万件発生しており、また５から６万人がこれらの寄生虫
の惨害のために死亡している。ズビニ鉤虫（Ancylostom
a）及びこれと同類の鉤虫である極東鉤虫（Uncinaria）
は、イヌ及びネコの小腸について最も病原性の蠕虫であ
ると考えられている。鉤虫の他の種であるブノストムム
（Bunostomum）は反芻動物に感染し、牛に感染するブノ
ストムム・フレボトマム（B.phlebotomum）は北アメリ
カにおいて特に商業的に重要なものである。ズビニ鉤虫
（Ancylostoma）の種はまたヒトにも感染する。これま
でに、捻転胃虫（Haemonchus）及び鉤虫である犬猫鉤虫
（Ancylostoma caninum）が、それらの腸の管腔表面に
おける副細胞質成分の構造において多くの重要な類似性
を有することが示されている（E.A.Munn及びC.A.Greenw
ood,Parasitology（1983）87,129−137及びPhilosophic
al Transactions of the Royal Society B,306,1−18,1
984）。従って、反芻動物について経済的に重要な意味
のある寄生虫であると同時に、捻転胃虫（Haemonchus）
は鉤虫に対するワクチンの開発について有用なモデルを
提供する可能性がある。 捻転胃虫（Haemonchus）から得られたタンパク質ダブ
レットH110Dを含有する抽出物は、羊に注射した場合に
捻転胃虫症に対する防御を与える。このダブレットH110
Dは、捻転胃虫（Haemonchus）の腸の管腔表面において
見いだされる。H110Dの調製及び使用については国際公
開WO−Ａ−88/00835号に記述されている。しかしなが
ら、この国際公開WO−Ａ−88/00835号に記述された方法
はタンパク質ダブレットH110Dを特徴付けるのに十分な
ものではあるが、実験的及び商業的に有用な量でもって
タンパク質ダブレットH110Dを容易に製造することがで
きるようにこの方法をスケールアップすることは簡単に
は許されない。 国際公開WO−Ａ−89/00163号には、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
上での分子量が41Kdであるタンパク質が、寄生性ネマト
ーダであるトリコストロンギルス・コルブリフォルミス
（Trichostrongylus colubriformis）の幼虫にあること
が記述されている。このタンパク質は、トリコストロン
ギルス・コルブリフォルミス（Trichostrongylus colub
riformis）の純一発生の第３期幼虫から抽出された。こ
のタンパク質の遺伝子はクローニングされている。非常
に類似したDNA配列が針虫（Haemonchus contortus）で
も例証されたが、in vivoでの捻転胃虫（Haemonchus）
の遺伝子タンパク質合成は報告されていない。この文書
はまた、組換え有機体により合成された抗原で、羊を針
虫（Haemonchus contortus）に対してワクチン接種する
試みの結果を報告している。これらの試みにおいては糞
中の卵の数の減少が報告されており、全体平均では卵の
数は40％減少している。ワクチン接種から63日後の屠殺
にあたり、ワクチン接種されたグループの羊が有してい
た虫は平均で、対照グループよりも52％少なかったこと
が見いだされている。
（Haemonchus）は、反芻動物の胃腸管の内壁に感染す
る。これは家畜の体重増加の減少や生産性の損失、無乳
症などから死亡までの範囲にわたる影響を有し、世界的
にみて非常に大きな経済的重要性を持つ。同類のネマト
ーダであるオステルタギア（Ostertagia）も同様の作用
を及ぼす。捻転胃虫症及びオステルタギア症は、一つに
は重い感染と結びついた食欲不良による瘠痩によって特
徴付けられる。羊及び牛では、冬期降雨地域においてオ
ステルタギア（Ostertagia）が最も顕著であるが、夏期
降雨地域においては捻転胃虫（Haemonchus）がより顕著
である。例えばオーストラリアにおいては、同国の300
万頭の羊の約３分の１が捻転胃虫（Haemonchus）に感染
されていると見積もられている。他に２つの属、毛様線
虫（Trichostrongylus）及びネマトディルス（Nematodi
rus）が、経済的に重要なものである。毛様線虫（Trich
ostrongylsu）は、温暖な地域における寄生虫性胃腸炎
の最も重大な原因の一つである。ネマトディルス（Nema
todirus）、特にネマトディルス・バッタス（N.battu
s）は、子羊における急性の、多くは致死性の腸炎を惹
起しうる。 同類の血液摂取ネマトーダである鉤虫は、反芻動物、
イヌ、ネコ、他の肉食動物およびヒトに感染する。700
万人を越える人が鉤虫、特にアメリカ鉤虫（Necator am
ericanus）に感染しており、毎年新たな感染が70から90
万件発生しており、また５から６万人がこれらの寄生虫
の惨害のために死亡している。ズビニ鉤虫（Ancylostom
a）及びこれと同類の鉤虫である極東鉤虫（Uncinaria）
は、イヌ及びネコの小腸について最も病原性の蠕虫であ
ると考えられている。鉤虫の他の種であるブノストムム
（Bunostomum）は反芻動物に感染し、牛に感染するブノ
ストムム・フレボトマム（B.phlebotomum）は北アメリ
カにおいて特に商業的に重要なものである。ズビニ鉤虫
（Ancylostoma）の種はまたヒトにも感染する。これま
でに、捻転胃虫（Haemonchus）及び鉤虫である犬猫鉤虫
（Ancylostoma caninum）が、それらの腸の管腔表面に
おける副細胞質成分の構造において多くの重要な類似性
を有することが示されている（E.A.Munn及びC.A.Greenw
ood,Parasitology（1983）87,129−137及びPhilosophic
al Transactions of the Royal Society B,306,1−18,1
984）。従って、反芻動物について経済的に重要な意味
のある寄生虫であると同時に、捻転胃虫（Haemonchus）
は鉤虫に対するワクチンの開発について有用なモデルを
提供する可能性がある。 捻転胃虫（Haemonchus）から得られたタンパク質ダブ
レットH110Dを含有する抽出物は、羊に注射した場合に
捻転胃虫症に対する防御を与える。このダブレットH110
Dは、捻転胃虫（Haemonchus）の腸の管腔表面において
見いだされる。H110Dの調製及び使用については国際公
開WO−Ａ−88/00835号に記述されている。しかしなが
ら、この国際公開WO−Ａ−88/00835号に記述された方法
はタンパク質ダブレットH110Dを特徴付けるのに十分な
ものではあるが、実験的及び商業的に有用な量でもって
タンパク質ダブレットH110Dを容易に製造することがで
きるようにこの方法をスケールアップすることは簡単に
は許されない。 国際公開WO−Ａ−89/00163号には、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
上での分子量が41Kdであるタンパク質が、寄生性ネマト
ーダであるトリコストロンギルス・コルブリフォルミス
（Trichostrongylus colubriformis）の幼虫にあること
が記述されている。このタンパク質は、トリコストロン
ギルス・コルブリフォルミス（Trichostrongylus colub
riformis）の純一発生の第３期幼虫から抽出された。こ
のタンパク質の遺伝子はクローニングされている。非常
に類似したDNA配列が針虫（Haemonchus contortus）で
も例証されたが、in vivoでの捻転胃虫（Haemonchus）
の遺伝子タンパク質合成は報告されていない。この文書
はまた、組換え有機体により合成された抗原で、羊を針
虫（Haemonchus contortus）に対してワクチン接種する
試みの結果を報告している。これらの試みにおいては糞
中の卵の数の減少が報告されており、全体平均では卵の
数は40％減少している。ワクチン接種から63日後の屠殺
にあたり、ワクチン接種されたグループの羊が有してい
た虫は平均で、対照グループよりも52％少なかったこと
が見いだされている。
寄生性ネマトーダに対して有効なさらなる免疫原を提
供することに対するニーズもある。 従って本発明は、ネマトーダに対して使用することの
できる新規な感染防御免疫原及びその製造法を提供する
ことを目的としている。
供することに対するニーズもある。 従って本発明は、ネマトーダに対して使用することの
できる新規な感染防御免疫原及びその製造法を提供する
ことを目的としている。
ヒトの鉤虫であるアメリカ鉤虫（Necator americanu
s）は、実験室の動物宿主で培養することができる。本
発明者らは、鉤虫（Necator）の成虫の腸の副細胞質構
造は、ズビニ鉤虫（Ancylostoma）のそれに非常に似て
おり、また鉤虫（Necator）からの膜内在性タンパク質
を含有している抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）上での挙動
が、同じ抽出方法により捻転胃虫（Haemonchus）から得
られたタンパク質のパターンと非常に合致していること
を見いだした。注目すべきは、かかる抽出物が捻転胃虫
（Haemonchus）から得たH110Dに相当する110,000ドルト
ンの相対分子量のタンパク質ダブレットを有し、また捻
転胃虫（Haemonchus）からの他の腸内微絨毛膜タンパク
質の一群に対応する、約53,000、約49,000及び約45,000
ドルトンの相対分子量（還元型）の一群のタンパク質バ
ンドを含有するということである。この一群のタンパク
質を本明細書においてはタンパク質複合体H45と呼ぶ。
最初に本発明者らは、約45,000ドルトンの相対分子量
（Mr）を有するこの複合体のタンパク質成分を同定し、
これをタンパク質H4.5と表した。約53,000ドルトンと約
49,000ドルトンの相対分子量（還元型）を有するタンパ
ク質複合体H45の他のタンパク質は、それぞれH5.3及びH
4.9と表し得る。 タンパク質ダブレットH110D及びタンパク質複合体H45
の両方を含有する捻転胃虫（Haemonchus）からの抽出物
は、羊に注射した場合に捻転胃虫症に対する防御をもた
らす。ワクチン接種の試みにおいて、本発明者らは寄生
虫卵の排出が98％以上減少し、またH220Dを含有してい
るワクチンにより虫の負荷が92％以上減少したことを観
察した。タンパク質複合体H45に基づくワクチンもま
た、羊において針虫（Haemonchus contortus）に対する
防御をもたらした。この場合、ワクチン接種された羊は
平均で、羊の対照グループと比較して雌の成虫の数の38
％の減少と、卵の産生の68％の減少を示した。H4.5、H
4.5及びH5.3もまた捻転胃虫（Haemonchus）の腸の管腔
表面において見いだされる。 タンパク質複合体H45は、SDS−PAGE上での相対分子量
（還元型）がそれぞれ約53,000、約49,000及び約45,000
ドルトンである３つのタンパク質バンドを示す。このグ
ループの成分は共に精製され、また同じモノクローナル
抗体に結合するエピトープを共通に有している。Mrが約
53,000ドルトンのバンド（タンパク質H5.3）及び約45,0
00のバンド（タンパク質H4.5）はタンパク質染色でより
強く染色され、またMrが約49,000ドルトンのバンドより
も広かった。低濃度でSDS−PAGEにかけられた場合、タ
ンパク質複合体H45の３つのバンドを作っているこれら
のタンパク質は各々、非常に近接して一緒に展開する２
つのバンドへとさらに分解される（即ちこれらはダブレ
ットである）。 本発明はさらに、タンパク質H4.5、H4.9及びH5.3、並
びにこれらの２つ又はそれ以上の混合物を提供する。特
に本発明は、部分的に精製され又は完全に精製された
形、つまり変性しない条件下での電気泳動に際し又は適
切なクロマトグラフィー技術において本質的に干渉性成
分として挙動する形において、タンパク質複合体H45を
提供する。本発明はまた、タンパク質複合体H45及びそ
の構成成分を単独で、又はタンパク質ダブレットH110D
若しくはこのH110Dダブレットの成分との混合物として
捻転胃虫（Haemonchus）及び他の寄生性ネマトーダに対
する感染防御免疫原として使用することにも関する。従
って本発明は、タンパク質複合体H45の成分の何れか又
は全部を単独で、或いは１つ又はそれ以上の寄生性ネマ
トーダに対する免疫性を惹起する１つ以上の免疫源、例
えばタンパク質ダブレットH110D又はこのダブレットの
成分タンパク質の１つとの混合物として含有するワクチ
ンをさらに提供するものである。 肺吸虫であるジクチオカウルス（Dictyocaulus），糸
状虫であるジロフィラリア（Dirofilaria）、並びに吸
虫類のファスキオラ（Fasciola）、二腔吸虫（Dicrocoe
lium）及び住血吸虫（Schistosoma）といった他の蠕虫
の血液採取段の消化管もまた、H110D及びタンパク質複
合体H45と同族の又は相同の膜表在性糖タンパク質を含
んでいると予想されることから、H110D及び／又はH45或
いはその同族体若しくは相同体に基づくワクチンも恐ら
くこれらの蠕虫の１又はそれ以上に対して使用可能であ
ると考えられている。 全体としてタンパク質複合体H45を形成するタンパク
質H4.5、H4.9及びH5.3は、針虫（Haemonchus contortu
s）の腸の微絨毛に存在している膜内在性糖タンパク質
である。これらはレクチンであるコンカナバリンＡと相
互作用し、20mM−Tris HCl、pH7.2、0.1％Thesit中での
強アニオン交換樹脂であるMonoQ（Pharmacia）に結合し
ない。（「MonoQ」は登録商標である。）H110Dはこれら
の条件の下でMonoQに結合する。H4.5は、還元条件下で
展開させた場合にSDS−PAGE上で約45,000ドルトンの見
かけ上の分子量（Mr）を有し、非還元条件下で展開させ
た場合に約90,000ドルトンのMrを有する。しかしなが
ら、タンパク質複合体H45の他の成分、すなわちタンパ
ク質H5.3及びH4.9はそれぞれ、還元条件下及び非還元条
件下の何れの場合にも、SDS−PAGE上で展開させた場合
に約53,000及び約49,000ドルトンの見かけ上の分子量
（Mr）を有する。H4.5及びH45複合体の他のタンパク質
は、非変性のH110Dと共通する１つ以上のエピトープを
有している。 本発明はさらに、免疫源タンパク質複合体H45を含有
している溶液からこの複合体を分離する方法に関する。
この方法は、かかる溶液をレクチン、H110Dに対する抗
体及びタンパク質複合体H45に対する抗体から選択され
た固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合した成
分を選択的に溶出させてタンパク質複合体H45を含有す
る溶出液を形成し、アニオン交換樹脂上でタンパク質複
合体H45を吸着させ、続いてこれから溶出させることか
らなる。タンパク質複合体H45を含有している溶液は、
針虫（Haemonchus contortus）或いはアメリカ鉤虫（Ne
cator americanus）の抽出により得られる。 本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質複合体
H45又はそのタンパク質構成成分を、恐らくはH110D又は
１又はそれ以上の寄生性ネマトーダに対する免疫を誘発
する他の免疫原との何らかの組み合わせにおいて含有し
ているワクチンが提供される。 かくして本発明は、還元条件下においてドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）上で約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約45,
000ドルトンの見かけ上の分子量をそれぞれ有し、非還
元条件下で約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約
90,000ドルトンの分子量をそれぞれ有する、第一、第二
及び第三のタンパク質成分からなり、寄生性ネマトーダ
から誘導された精製タンパク質複合体（H45）を提供す
る。このような精製タンパク質複合体は、アメリカ鉤虫
（Necator americanus）又は針虫（Haemonchus contort
us）から誘導することができる。 本発明による好ましいタンパク質は次のものを含む： （ａ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能な、本明細書でH4.5と表されている精製タンパク
質。この精製タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動上で還元条件下に約45,000
ドルトンの、非還元条件下では約90,000ドルトンの見か
け上の分子量を有する。 （ｂ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場
合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で約49,000ドルトンの見かけ上の分子量を有
し、本明細書でH4.9と表されている精製タンパク質。 （ｃ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場
合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で約53,000ドルトンの見かけ上の分子量を有
し、本明細書でH5.3と表されている精製タンパク質。 このようなタンパク質を誘導することのできる寄生性
ネマトーダは、アメリカ鉤虫（Necator americanus）又
は針虫（Haemonchus contortus）である。 また本発明により提供されるものは、有効量の本発明
によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含み、
生きている哺乳類について、寄生性ネマトーダ又は適当
な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチン、
並びにタンパク質複合体H45又はその成分タンパク質の
有効量を含み、生きている哺乳類に寄生性ネマトーダ又
は適当な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワク
チンである。これらのワクチンはさらに、タンパク質ダ
ブレットH110D、或いはその成分の一つの一定量を含む
ことができる。ワクチンはまたさらに、タンパク質コン
トルチンの一定量を含有することができる。典型的に
は、かかるワクチンは、タンパク質ダブレットH110Dと
選択的に混合された、感染防御すべき哺乳類の生体重量
に対し1kg当たり約0.1から約25μｇの範囲の、単位投与
量当たり一定量のタンパク質複合体H45を含む。従って
典型的な体重が25kgの子羊の場合、単位投与量当たりの
量は約0.25μｇから約625μｇの範囲となるが、これに
対して典型的な体重が70kgのヒトの成人の場合、単位投
与量当たりの量は約７μｇから約1750μｇの範囲とな
る。好ましくは、単位投与量当たりの量は体重1kg当た
り約１μｇから約20μｇの範囲、さらにより好ましくは
約２μｇから約15μｇの範囲に相当する。 このようなワクチンは、関連する単数又は複数の感染
防御抗原を有効量含有している単位投与量を注射するこ
とにより、寄生性ネマトーダに対して生体哺乳類に感染
防御を引き起こすのに使用することができる。 図３において、レーン（ａ）及び（ｂ）は既知の分子
量のタンパク質を示し、レーン（ｃ）は図１のステージ
１への精製を示し、レーン（ｄ）はアニオン交換クロマ
トグラフィーにより得られたタンパク質複合体H45に富
むフラクションを示し、レーン（ｅ）は図１のステージ
３への精製を示し、レーン（ｆ）は電気泳動的に精製さ
れたH110Dを示している。 別の好ましい方法においては、タンパク質ダブレット
H110D及びレクチン親和性カラムから溶出されたH110Dを
含有するフラクション中に存在している他のタンパク質
に特異なモノクローナル抗体が、２つの方法により製造
された。最初の方法においては、在来の方法論に従っ
た。マウスに対し、添付の概略の図１に示す如くステー
ジ２まで精製された捻転胃虫（Haemonchus）の界面活性
剤抽出物、或いはステージ３（図１）まで精製された抽
出物又はタンパク質複合体H45に富むフラクションを注
射する。注射されたタンパク質の標本を抗原として用い
てELISAにより測定し、血清サンプル中の抗体の力価が
十分に高いと判断した場合にマウスを殺して脾臓細胞を
得る。これらの細胞をマウスの骨髄腫細胞系NSO及び653
細胞と融合させる。捻転胃虫（Haemonchus）の成分に対
する抗体を産生する融合細胞を選択し、クローニングす
る。これらのクローンにより産生された抗体は、培養さ
れてから集められ、その特異性がウエスターン法の技術
により判定される。この技術では、SDS−PAGEにより分
離された抗原が電気泳動によりニトロセルロースに転写
され、抗体によりプローブすることができる。第二の方
法では、羊に対し、ステージ１（図１）まで精製された
捻転胃虫（Haemonchus）の界面活性剤抽出物を注射す
る、血清サンプル中における特異抗体の力価が十分に高
くなったところで血液サンプルを取り出し、そこからリ
ンパ球を分離する。つまり羊を殺して膝窩のリンパ腺を
切除し、そこからリンパ球を得る。このリンパ球をマウ
スの骨髄腫細胞系NSOと融合させて、羊−マウスのヘテ
ロハイブリドーマを形成する。捻転胃虫（Haemonchus）
のタンパク質に対して特異な羊抗体を産生するヘテロハ
イブリドーマを選択し、クローニングして、それらが産
生する抗体を収集する。かかるモノクローナル抗体、つ
まりタンパク質H110D、タンパク質複合体H45及びその成
分タンパク質、例えばタンパク質H4.5、及び捻転胃虫
（Haemonchus）の界面活性剤抽出物中に生ずる他のタン
パク質と（及びオステルタギア（Ostertagia）の抗原
と）特異的に反応するモノクローナル抗体は、本発明の
方法の親和性クロマトグラフィーのステップにおいて、
H110D、その成分及びフラグメント、並びにタンパク質
複合体H45の精製におけるリガンドとして別々に、又は
連続的に、代替的に用いることができる。 本発明を以下の実施例においてさらに説明する。 実施例 １ （ステージは図１に示した如く番号付けしてある。） 新鮮な又は冷凍融解した針虫（Haemonchus contortu
s）を細かく破砕し、燐酸塩で緩衝した約６容積の生理
的食塩水（PBS、10mM燐酸ナトリウム、0.9％塩化ナトリ
ウム、pH7.2）中でホモジナイズした。こうして得られ
たホモジネートを次いで17分間、約20,000gで遠心分離
した。上澄液を除去し、ペレットを約４容積のPBS中で
再度ホモジネートした。再度遠心分離した後、上清を除
去し、ペレットを１％のTween 20（ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート）を含有している約５容積の
PBS中で再度懸濁し、反転により時折混合しながら氷上
で１時間放置した。この抽出物を17分間、約20,000gで
遠心分離し、上澄液を捨てた。このペレットをこのよう
にして再度、PBS中１％のTweenで抽出し、次いでPBS中
１％のThesit界面活性剤（Boehringer Mannheim）で16
時間までの時間にわたって３回抽出した（Thesitはポリ
オキシエチレン９−ラウリルエーテルである）。“Twee
n"及び“Thesit"は商品名である。各々の抽出物を約20,
000gで17分間遠心分離することにより３つの抽出物から
得られた上澄液を一緒にし、約11×106g.min.で遠心分
離した。これにより得られる上澄液は保存した（図１、
ステージ）。これを濃縮し、緩衝液を1mMの塩化カルシ
ウム、1mMの塩化マンガン、0.1％のThesit及び0.02％の
アジドナトリウム含有するpH5.2の5mMアセテート緩衝液
（Con A緩衝液）と交換した。次いでこの溶液を、affi
−gel（Bio−Rad）に結合したレクチンであるコンカナ
バリンＡ（Con A）を用いて、親和性クロマトグラフィ
ーにかけた。（「affi−gel」は登録商標である。）タ
ンパク質ダブレットH110Dはカラムに結合し、またタン
パク質複合体H45も同様であった。未結合のタンパク質
は、Con A緩衝液と共に溶出させた。次いでH110D及びタ
ンパク質複合体H45を、Con A緩衝液中0.5Mのメチル−Ｄ
−グルコピラノシドで溶出させた（図１、ステージ
２）。次いでこの物質を濃縮し、0.1％のThesitを含有
している20mMのTris−HCl、pH7.2に移し、MonoQ（Pharm
acia）のイオン交換クロマトグラフィーカラムにかけ
た。タンパク質複合体H45は結合しなかった。タンパク
質H110Dは、1M M−NaClを含有している適用緩衝液の０
−25％グラジエントで溶出させた。H110Dを含有してい
るフラクションはプールし、イオン交換カラムで再度ク
ロマトグラフィーにかけた（ステージ３）。 実施例 ２ 実施例１の手順を、リガンドであるコンカナバリンＡ
を親和性クロマトグラフィーの段階においてレンズ豆レ
クチン又は麦芽アグルチニンと代替して繰り返した場合
に、これらは両方ともH110D及びH45の炭化水素部分と特
異的に結合し、同様の結果が得られた。 実施例 ３ リガンドがH110Dに特異なモノクローナル（又はポリ
クローナル）抗体からなる点を除き、実施例１の手順を
繰り返した。この手順において、未精製の又は部分的に
精製されたH110Dの成分は、H110D又は他の捻転胃虫（Ha
emonchus）のタンパク質に特異な抗体が結合しているカ
ラム又は膜に吸着された。抗体によって結合されなかっ
たタンパク質は洗い出し、結合したタンパク質はpHの変
化、高い塩濃度、カオトロピック剤又はこれらの組合わ
せの何れかを用いて溶出した。リガンドは、次のような
何らかの適当なマトリックスに結合し得る。すなわちCN
Brで活性化したSepharoseまたはCH−Sepharose（Pharma
cia）、Affi−Prep（Bio−Rad Laboratories）、Zetaff
inityディスク或いはカートリッジ（CUNO Inc,Life Sci
ences Division）、またはImmobilonの親和性膜（Milli
pore Corporation）が適当なマトリックスである。（Se
pharose、Affi−Prep、Zetaffinity及びImmobilonは商
標である。） 抗体は、前述した方法により製造された。 マトリックスに対する抗体の結合は、反応性基を適当
に活性化することによって達成された。 実施例 ４ ステージ１の後にZetaPrep QAEディスク（CUNO Inc,L
ife Sciences Division）を用いたイオン交換クロマト
グラフィーのステップを導入した点を除いては、実施例
１の手順を繰り返した。（ZetaPrepは商標である。）ス
テージ１からの上澄液を濃縮し、0.1％Thesitを含有し
ているpH7.2の20mM Tris−HClに移し、ZetaPrep QAEデ
ィスクを通過させた。H110Dに富むフラクションを0.05
M、0.1M、0.2M及び0.25MのNaClのステップグラジエント
を含有している適用緩衝液で溶出させた。この緩衝液は
次いで、Con A緩衝液と交換した。 実施例 ５ Tween 20の溶液で抽出した後に、ペレットを20mM−Tr
is−HClで洗浄し、次いでpH7.2の20mM Tris−HCl中１％
のThesitで３回抽出した点を除き、実施例４の手順に従
った。 実施例 ６ Tween20及びThesitの溶液による抽出を省略し、その
代わりに1.8％TritonX−114で抽出を行った点を除き、
実施例１の手順に従った。超遠心分離段階の後に上澄液
を30℃として、相分離を行った。約20℃における低速で
の遠心分離の後に、大気温度においてCon A緩衝液中１
％のThesitで界面活性剤相を希釈した。かくして得られ
た均一溶液を次に、実施例１に示したようにして、親和
性及びイオン交換クロマトグラフィーにかけた。この方
法は、H45タンパク質複合体グループを殆ど可溶化しな
い。 実施例 ７ 界面活性剤溶液、Con Aを用いた親和性クロマトグラ
フィー及びイオン交換クロマトグラフィーでの分画抽出
による抽出物から、実施例１の方法によりステージ３
（図１）まで精製されたタンパク質H110Dの、捻転胃虫
症に対するワクチンにおける薬効を検証した。上述した
手順により精製したH110Dを生体重量当たり約15μg/kg
使用して注射することにより、Clun Forest羊を６頭中
５頭、感染防御した。10,000の感染性第三期幼虫で実験
的に感染してから35日後に５頭の動物から回収した虫の
平均重量は、対照に比較して98.6％減少した。この寄生
虫による卵の産生は、対照に比較して99.1％減少した。
６頭目の動物は、部分的に感染防御した。対照の平均と
比較すると、その虫による負荷は53％だけ減少し、また
寄生虫卵の産生は72.3％減少した。精製されたH110Dが
注射された６頭の動物全部を考えると、対照グループと
比較して虫の重量の合計における平均91％の減少があ
り、また寄生虫卵の産生における平均94.5％の減少があ
った。対照グループは、受けた注射液が捻転胃虫（Haem
onchus）のタンパク質を含有していない点を除き、同様
に処理された。 感染防御された羊からの抗血清は、ステージ１（図
１）まで精製された抽出物のウエスターンブロットにお
いて、H110D及びタンパク質複合体H45のタンパク質、例
えばタンパク質H4.5に強く結合した。このことは、H4.5
並びにH4.5とH5.3及びH4.9の１つ以上との混合物が特に
良好な免疫原であろうことを示している。なぜならステ
ージ３まで精製したH110Dのクーマシーブルー染色から
判断すると、注射された物質の約１％（即ち生体重量当
たり約0.15μg/kg）のみがタンパク質複合体H45からな
り、注射総量の約98％がH110Dであったからである。或
いはまたこれは、H110D及びタンパク質混合物H45の成分
の少なくとも一つが共通のエピトープを有することを示
している。これらの選択枝は相互に排他的なものではな
い。ELISA及びウエスターン法によるH110D及びタンパク
質複合体H45の両者に対する羊及びマウスのモノクロー
ナル抗体による交差反応が例証された。 タンパク質H4.5、およびタンパク質複合体H45の他の
タンパク質は、H110Dと共に捻転胃虫（Haemonchus）の
腸の微絨毛膜中に存在している（図２参照）。ズビニ鉤
虫（Ancylostoma）、極東鉤虫（Uncinaria）及び鉤虫
（Necator）の腸のThesit抽出物もまた、還元条件下にS
DS−PAGE上で展開した場合に、Mrが45,000ドルトンのバ
ンドと、それぞれ約49,000及び約53,000ドルトンのMrを
有するタンパク質複合体H45のタンパク質に対応するバ
ンドを有していた。非還元条件下にSDS−PAGEにかけた
場合には、H4.5は約90,000ドルトンのMrを有し、これに
対しH5.3とH4.9は依然としてそれぞれ約49,000及び約5
3,000ドルトンのMrを有しており、またMrが45,000ドル
トンのバンドはなかった。 図面の簡単な説明
s）は、実験室の動物宿主で培養することができる。本
発明者らは、鉤虫（Necator）の成虫の腸の副細胞質構
造は、ズビニ鉤虫（Ancylostoma）のそれに非常に似て
おり、また鉤虫（Necator）からの膜内在性タンパク質
を含有している抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）上での挙動
が、同じ抽出方法により捻転胃虫（Haemonchus）から得
られたタンパク質のパターンと非常に合致していること
を見いだした。注目すべきは、かかる抽出物が捻転胃虫
（Haemonchus）から得たH110Dに相当する110,000ドルト
ンの相対分子量のタンパク質ダブレットを有し、また捻
転胃虫（Haemonchus）からの他の腸内微絨毛膜タンパク
質の一群に対応する、約53,000、約49,000及び約45,000
ドルトンの相対分子量（還元型）の一群のタンパク質バ
ンドを含有するということである。この一群のタンパク
質を本明細書においてはタンパク質複合体H45と呼ぶ。
最初に本発明者らは、約45,000ドルトンの相対分子量
（Mr）を有するこの複合体のタンパク質成分を同定し、
これをタンパク質H4.5と表した。約53,000ドルトンと約
49,000ドルトンの相対分子量（還元型）を有するタンパ
ク質複合体H45の他のタンパク質は、それぞれH5.3及びH
4.9と表し得る。 タンパク質ダブレットH110D及びタンパク質複合体H45
の両方を含有する捻転胃虫（Haemonchus）からの抽出物
は、羊に注射した場合に捻転胃虫症に対する防御をもた
らす。ワクチン接種の試みにおいて、本発明者らは寄生
虫卵の排出が98％以上減少し、またH220Dを含有してい
るワクチンにより虫の負荷が92％以上減少したことを観
察した。タンパク質複合体H45に基づくワクチンもま
た、羊において針虫（Haemonchus contortus）に対する
防御をもたらした。この場合、ワクチン接種された羊は
平均で、羊の対照グループと比較して雌の成虫の数の38
％の減少と、卵の産生の68％の減少を示した。H4.5、H
4.5及びH5.3もまた捻転胃虫（Haemonchus）の腸の管腔
表面において見いだされる。 タンパク質複合体H45は、SDS−PAGE上での相対分子量
（還元型）がそれぞれ約53,000、約49,000及び約45,000
ドルトンである３つのタンパク質バンドを示す。このグ
ループの成分は共に精製され、また同じモノクローナル
抗体に結合するエピトープを共通に有している。Mrが約
53,000ドルトンのバンド（タンパク質H5.3）及び約45,0
00のバンド（タンパク質H4.5）はタンパク質染色でより
強く染色され、またMrが約49,000ドルトンのバンドより
も広かった。低濃度でSDS−PAGEにかけられた場合、タ
ンパク質複合体H45の３つのバンドを作っているこれら
のタンパク質は各々、非常に近接して一緒に展開する２
つのバンドへとさらに分解される（即ちこれらはダブレ
ットである）。 本発明はさらに、タンパク質H4.5、H4.9及びH5.3、並
びにこれらの２つ又はそれ以上の混合物を提供する。特
に本発明は、部分的に精製され又は完全に精製された
形、つまり変性しない条件下での電気泳動に際し又は適
切なクロマトグラフィー技術において本質的に干渉性成
分として挙動する形において、タンパク質複合体H45を
提供する。本発明はまた、タンパク質複合体H45及びそ
の構成成分を単独で、又はタンパク質ダブレットH110D
若しくはこのH110Dダブレットの成分との混合物として
捻転胃虫（Haemonchus）及び他の寄生性ネマトーダに対
する感染防御免疫原として使用することにも関する。従
って本発明は、タンパク質複合体H45の成分の何れか又
は全部を単独で、或いは１つ又はそれ以上の寄生性ネマ
トーダに対する免疫性を惹起する１つ以上の免疫源、例
えばタンパク質ダブレットH110D又はこのダブレットの
成分タンパク質の１つとの混合物として含有するワクチ
ンをさらに提供するものである。 肺吸虫であるジクチオカウルス（Dictyocaulus），糸
状虫であるジロフィラリア（Dirofilaria）、並びに吸
虫類のファスキオラ（Fasciola）、二腔吸虫（Dicrocoe
lium）及び住血吸虫（Schistosoma）といった他の蠕虫
の血液採取段の消化管もまた、H110D及びタンパク質複
合体H45と同族の又は相同の膜表在性糖タンパク質を含
んでいると予想されることから、H110D及び／又はH45或
いはその同族体若しくは相同体に基づくワクチンも恐ら
くこれらの蠕虫の１又はそれ以上に対して使用可能であ
ると考えられている。 全体としてタンパク質複合体H45を形成するタンパク
質H4.5、H4.9及びH5.3は、針虫（Haemonchus contortu
s）の腸の微絨毛に存在している膜内在性糖タンパク質
である。これらはレクチンであるコンカナバリンＡと相
互作用し、20mM−Tris HCl、pH7.2、0.1％Thesit中での
強アニオン交換樹脂であるMonoQ（Pharmacia）に結合し
ない。（「MonoQ」は登録商標である。）H110Dはこれら
の条件の下でMonoQに結合する。H4.5は、還元条件下で
展開させた場合にSDS−PAGE上で約45,000ドルトンの見
かけ上の分子量（Mr）を有し、非還元条件下で展開させ
た場合に約90,000ドルトンのMrを有する。しかしなが
ら、タンパク質複合体H45の他の成分、すなわちタンパ
ク質H5.3及びH4.9はそれぞれ、還元条件下及び非還元条
件下の何れの場合にも、SDS−PAGE上で展開させた場合
に約53,000及び約49,000ドルトンの見かけ上の分子量
（Mr）を有する。H4.5及びH45複合体の他のタンパク質
は、非変性のH110Dと共通する１つ以上のエピトープを
有している。 本発明はさらに、免疫源タンパク質複合体H45を含有
している溶液からこの複合体を分離する方法に関する。
この方法は、かかる溶液をレクチン、H110Dに対する抗
体及びタンパク質複合体H45に対する抗体から選択され
た固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合した成
分を選択的に溶出させてタンパク質複合体H45を含有す
る溶出液を形成し、アニオン交換樹脂上でタンパク質複
合体H45を吸着させ、続いてこれから溶出させることか
らなる。タンパク質複合体H45を含有している溶液は、
針虫（Haemonchus contortus）或いはアメリカ鉤虫（Ne
cator americanus）の抽出により得られる。 本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質複合体
H45又はそのタンパク質構成成分を、恐らくはH110D又は
１又はそれ以上の寄生性ネマトーダに対する免疫を誘発
する他の免疫原との何らかの組み合わせにおいて含有し
ているワクチンが提供される。 かくして本発明は、還元条件下においてドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）上で約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約45,
000ドルトンの見かけ上の分子量をそれぞれ有し、非還
元条件下で約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約
90,000ドルトンの分子量をそれぞれ有する、第一、第二
及び第三のタンパク質成分からなり、寄生性ネマトーダ
から誘導された精製タンパク質複合体（H45）を提供す
る。このような精製タンパク質複合体は、アメリカ鉤虫
（Necator americanus）又は針虫（Haemonchus contort
us）から誘導することができる。 本発明による好ましいタンパク質は次のものを含む： （ａ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能な、本明細書でH4.5と表されている精製タンパク
質。この精製タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動上で還元条件下に約45,000
ドルトンの、非還元条件下では約90,000ドルトンの見か
け上の分子量を有する。 （ｂ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場
合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で約49,000ドルトンの見かけ上の分子量を有
し、本明細書でH4.9と表されている精製タンパク質。 （ｃ） 寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分
離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場
合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で約53,000ドルトンの見かけ上の分子量を有
し、本明細書でH5.3と表されている精製タンパク質。 このようなタンパク質を誘導することのできる寄生性
ネマトーダは、アメリカ鉤虫（Necator americanus）又
は針虫（Haemonchus contortus）である。 また本発明により提供されるものは、有効量の本発明
によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含み、
生きている哺乳類について、寄生性ネマトーダ又は適当
な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチン、
並びにタンパク質複合体H45又はその成分タンパク質の
有効量を含み、生きている哺乳類に寄生性ネマトーダ又
は適当な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワク
チンである。これらのワクチンはさらに、タンパク質ダ
ブレットH110D、或いはその成分の一つの一定量を含む
ことができる。ワクチンはまたさらに、タンパク質コン
トルチンの一定量を含有することができる。典型的に
は、かかるワクチンは、タンパク質ダブレットH110Dと
選択的に混合された、感染防御すべき哺乳類の生体重量
に対し1kg当たり約0.1から約25μｇの範囲の、単位投与
量当たり一定量のタンパク質複合体H45を含む。従って
典型的な体重が25kgの子羊の場合、単位投与量当たりの
量は約0.25μｇから約625μｇの範囲となるが、これに
対して典型的な体重が70kgのヒトの成人の場合、単位投
与量当たりの量は約７μｇから約1750μｇの範囲とな
る。好ましくは、単位投与量当たりの量は体重1kg当た
り約１μｇから約20μｇの範囲、さらにより好ましくは
約２μｇから約15μｇの範囲に相当する。 このようなワクチンは、関連する単数又は複数の感染
防御抗原を有効量含有している単位投与量を注射するこ
とにより、寄生性ネマトーダに対して生体哺乳類に感染
防御を引き起こすのに使用することができる。 図３において、レーン（ａ）及び（ｂ）は既知の分子
量のタンパク質を示し、レーン（ｃ）は図１のステージ
１への精製を示し、レーン（ｄ）はアニオン交換クロマ
トグラフィーにより得られたタンパク質複合体H45に富
むフラクションを示し、レーン（ｅ）は図１のステージ
３への精製を示し、レーン（ｆ）は電気泳動的に精製さ
れたH110Dを示している。 別の好ましい方法においては、タンパク質ダブレット
H110D及びレクチン親和性カラムから溶出されたH110Dを
含有するフラクション中に存在している他のタンパク質
に特異なモノクローナル抗体が、２つの方法により製造
された。最初の方法においては、在来の方法論に従っ
た。マウスに対し、添付の概略の図１に示す如くステー
ジ２まで精製された捻転胃虫（Haemonchus）の界面活性
剤抽出物、或いはステージ３（図１）まで精製された抽
出物又はタンパク質複合体H45に富むフラクションを注
射する。注射されたタンパク質の標本を抗原として用い
てELISAにより測定し、血清サンプル中の抗体の力価が
十分に高いと判断した場合にマウスを殺して脾臓細胞を
得る。これらの細胞をマウスの骨髄腫細胞系NSO及び653
細胞と融合させる。捻転胃虫（Haemonchus）の成分に対
する抗体を産生する融合細胞を選択し、クローニングす
る。これらのクローンにより産生された抗体は、培養さ
れてから集められ、その特異性がウエスターン法の技術
により判定される。この技術では、SDS−PAGEにより分
離された抗原が電気泳動によりニトロセルロースに転写
され、抗体によりプローブすることができる。第二の方
法では、羊に対し、ステージ１（図１）まで精製された
捻転胃虫（Haemonchus）の界面活性剤抽出物を注射す
る、血清サンプル中における特異抗体の力価が十分に高
くなったところで血液サンプルを取り出し、そこからリ
ンパ球を分離する。つまり羊を殺して膝窩のリンパ腺を
切除し、そこからリンパ球を得る。このリンパ球をマウ
スの骨髄腫細胞系NSOと融合させて、羊−マウスのヘテ
ロハイブリドーマを形成する。捻転胃虫（Haemonchus）
のタンパク質に対して特異な羊抗体を産生するヘテロハ
イブリドーマを選択し、クローニングして、それらが産
生する抗体を収集する。かかるモノクローナル抗体、つ
まりタンパク質H110D、タンパク質複合体H45及びその成
分タンパク質、例えばタンパク質H4.5、及び捻転胃虫
（Haemonchus）の界面活性剤抽出物中に生ずる他のタン
パク質と（及びオステルタギア（Ostertagia）の抗原
と）特異的に反応するモノクローナル抗体は、本発明の
方法の親和性クロマトグラフィーのステップにおいて、
H110D、その成分及びフラグメント、並びにタンパク質
複合体H45の精製におけるリガンドとして別々に、又は
連続的に、代替的に用いることができる。 本発明を以下の実施例においてさらに説明する。 実施例 １ （ステージは図１に示した如く番号付けしてある。） 新鮮な又は冷凍融解した針虫（Haemonchus contortu
s）を細かく破砕し、燐酸塩で緩衝した約６容積の生理
的食塩水（PBS、10mM燐酸ナトリウム、0.9％塩化ナトリ
ウム、pH7.2）中でホモジナイズした。こうして得られ
たホモジネートを次いで17分間、約20,000gで遠心分離
した。上澄液を除去し、ペレットを約４容積のPBS中で
再度ホモジネートした。再度遠心分離した後、上清を除
去し、ペレットを１％のTween 20（ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート）を含有している約５容積の
PBS中で再度懸濁し、反転により時折混合しながら氷上
で１時間放置した。この抽出物を17分間、約20,000gで
遠心分離し、上澄液を捨てた。このペレットをこのよう
にして再度、PBS中１％のTweenで抽出し、次いでPBS中
１％のThesit界面活性剤（Boehringer Mannheim）で16
時間までの時間にわたって３回抽出した（Thesitはポリ
オキシエチレン９−ラウリルエーテルである）。“Twee
n"及び“Thesit"は商品名である。各々の抽出物を約20,
000gで17分間遠心分離することにより３つの抽出物から
得られた上澄液を一緒にし、約11×106g.min.で遠心分
離した。これにより得られる上澄液は保存した（図１、
ステージ）。これを濃縮し、緩衝液を1mMの塩化カルシ
ウム、1mMの塩化マンガン、0.1％のThesit及び0.02％の
アジドナトリウム含有するpH5.2の5mMアセテート緩衝液
（Con A緩衝液）と交換した。次いでこの溶液を、affi
−gel（Bio−Rad）に結合したレクチンであるコンカナ
バリンＡ（Con A）を用いて、親和性クロマトグラフィ
ーにかけた。（「affi−gel」は登録商標である。）タ
ンパク質ダブレットH110Dはカラムに結合し、またタン
パク質複合体H45も同様であった。未結合のタンパク質
は、Con A緩衝液と共に溶出させた。次いでH110D及びタ
ンパク質複合体H45を、Con A緩衝液中0.5Mのメチル−Ｄ
−グルコピラノシドで溶出させた（図１、ステージ
２）。次いでこの物質を濃縮し、0.1％のThesitを含有
している20mMのTris−HCl、pH7.2に移し、MonoQ（Pharm
acia）のイオン交換クロマトグラフィーカラムにかけ
た。タンパク質複合体H45は結合しなかった。タンパク
質H110Dは、1M M−NaClを含有している適用緩衝液の０
−25％グラジエントで溶出させた。H110Dを含有してい
るフラクションはプールし、イオン交換カラムで再度ク
ロマトグラフィーにかけた（ステージ３）。 実施例 ２ 実施例１の手順を、リガンドであるコンカナバリンＡ
を親和性クロマトグラフィーの段階においてレンズ豆レ
クチン又は麦芽アグルチニンと代替して繰り返した場合
に、これらは両方ともH110D及びH45の炭化水素部分と特
異的に結合し、同様の結果が得られた。 実施例 ３ リガンドがH110Dに特異なモノクローナル（又はポリ
クローナル）抗体からなる点を除き、実施例１の手順を
繰り返した。この手順において、未精製の又は部分的に
精製されたH110Dの成分は、H110D又は他の捻転胃虫（Ha
emonchus）のタンパク質に特異な抗体が結合しているカ
ラム又は膜に吸着された。抗体によって結合されなかっ
たタンパク質は洗い出し、結合したタンパク質はpHの変
化、高い塩濃度、カオトロピック剤又はこれらの組合わ
せの何れかを用いて溶出した。リガンドは、次のような
何らかの適当なマトリックスに結合し得る。すなわちCN
Brで活性化したSepharoseまたはCH−Sepharose（Pharma
cia）、Affi−Prep（Bio−Rad Laboratories）、Zetaff
inityディスク或いはカートリッジ（CUNO Inc,Life Sci
ences Division）、またはImmobilonの親和性膜（Milli
pore Corporation）が適当なマトリックスである。（Se
pharose、Affi−Prep、Zetaffinity及びImmobilonは商
標である。） 抗体は、前述した方法により製造された。 マトリックスに対する抗体の結合は、反応性基を適当
に活性化することによって達成された。 実施例 ４ ステージ１の後にZetaPrep QAEディスク（CUNO Inc,L
ife Sciences Division）を用いたイオン交換クロマト
グラフィーのステップを導入した点を除いては、実施例
１の手順を繰り返した。（ZetaPrepは商標である。）ス
テージ１からの上澄液を濃縮し、0.1％Thesitを含有し
ているpH7.2の20mM Tris−HClに移し、ZetaPrep QAEデ
ィスクを通過させた。H110Dに富むフラクションを0.05
M、0.1M、0.2M及び0.25MのNaClのステップグラジエント
を含有している適用緩衝液で溶出させた。この緩衝液は
次いで、Con A緩衝液と交換した。 実施例 ５ Tween 20の溶液で抽出した後に、ペレットを20mM−Tr
is−HClで洗浄し、次いでpH7.2の20mM Tris−HCl中１％
のThesitで３回抽出した点を除き、実施例４の手順に従
った。 実施例 ６ Tween20及びThesitの溶液による抽出を省略し、その
代わりに1.8％TritonX−114で抽出を行った点を除き、
実施例１の手順に従った。超遠心分離段階の後に上澄液
を30℃として、相分離を行った。約20℃における低速で
の遠心分離の後に、大気温度においてCon A緩衝液中１
％のThesitで界面活性剤相を希釈した。かくして得られ
た均一溶液を次に、実施例１に示したようにして、親和
性及びイオン交換クロマトグラフィーにかけた。この方
法は、H45タンパク質複合体グループを殆ど可溶化しな
い。 実施例 ７ 界面活性剤溶液、Con Aを用いた親和性クロマトグラ
フィー及びイオン交換クロマトグラフィーでの分画抽出
による抽出物から、実施例１の方法によりステージ３
（図１）まで精製されたタンパク質H110Dの、捻転胃虫
症に対するワクチンにおける薬効を検証した。上述した
手順により精製したH110Dを生体重量当たり約15μg/kg
使用して注射することにより、Clun Forest羊を６頭中
５頭、感染防御した。10,000の感染性第三期幼虫で実験
的に感染してから35日後に５頭の動物から回収した虫の
平均重量は、対照に比較して98.6％減少した。この寄生
虫による卵の産生は、対照に比較して99.1％減少した。
６頭目の動物は、部分的に感染防御した。対照の平均と
比較すると、その虫による負荷は53％だけ減少し、また
寄生虫卵の産生は72.3％減少した。精製されたH110Dが
注射された６頭の動物全部を考えると、対照グループと
比較して虫の重量の合計における平均91％の減少があ
り、また寄生虫卵の産生における平均94.5％の減少があ
った。対照グループは、受けた注射液が捻転胃虫（Haem
onchus）のタンパク質を含有していない点を除き、同様
に処理された。 感染防御された羊からの抗血清は、ステージ１（図
１）まで精製された抽出物のウエスターンブロットにお
いて、H110D及びタンパク質複合体H45のタンパク質、例
えばタンパク質H4.5に強く結合した。このことは、H4.5
並びにH4.5とH5.3及びH4.9の１つ以上との混合物が特に
良好な免疫原であろうことを示している。なぜならステ
ージ３まで精製したH110Dのクーマシーブルー染色から
判断すると、注射された物質の約１％（即ち生体重量当
たり約0.15μg/kg）のみがタンパク質複合体H45からな
り、注射総量の約98％がH110Dであったからである。或
いはまたこれは、H110D及びタンパク質混合物H45の成分
の少なくとも一つが共通のエピトープを有することを示
している。これらの選択枝は相互に排他的なものではな
い。ELISA及びウエスターン法によるH110D及びタンパク
質複合体H45の両者に対する羊及びマウスのモノクロー
ナル抗体による交差反応が例証された。 タンパク質H4.5、およびタンパク質複合体H45の他の
タンパク質は、H110Dと共に捻転胃虫（Haemonchus）の
腸の微絨毛膜中に存在している（図２参照）。ズビニ鉤
虫（Ancylostoma）、極東鉤虫（Uncinaria）及び鉤虫
（Necator）の腸のThesit抽出物もまた、還元条件下にS
DS−PAGE上で展開した場合に、Mrが45,000ドルトンのバ
ンドと、それぞれ約49,000及び約53,000ドルトンのMrを
有するタンパク質複合体H45のタンパク質に対応するバ
ンドを有していた。非還元条件下にSDS−PAGEにかけた
場合には、H4.5は約90,000ドルトンのMrを有し、これに
対しH5.3とH4.9は依然としてそれぞれ約49,000及び約5
3,000ドルトンのMrを有しており、またMrが45,000ドル
トンのバンドはなかった。 図面の簡単な説明
【図１】 タンパク質ダブレットH110D及び複合タン
パク質H45の調製のための概略的な流れ図である。
パク質H45の調製のための概略的な流れ図である。
【図２】 （ａ）分子量既知の標準タンパク質及び
（ｂ）針虫（Haemonchus contortus）の腸の微絨毛から
界面活性剤Thesitにより抽出された膜タンパク質をSDS
−PAGEで分離してクーマシーブルー染色することにより
得られた結果を示す。標本は２−メルカプトエタノール
で還元されており、また還元条件下で展開された。
（ｂ）針虫（Haemonchus contortus）の腸の微絨毛から
界面活性剤Thesitにより抽出された膜タンパク質をSDS
−PAGEで分離してクーマシーブルー染色することにより
得られた結果を示す。標本は２−メルカプトエタノール
で還元されており、また還元条件下で展開された。
【図３】 図１に要約した精製手順の種々の段階にお
けるフラクションのSDS−PAGEのパターンを含む。
けるフラクションのSDS−PAGEのパターンを含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）上で
約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約45,000ドル
トンの見かけ上の分子量をそれぞれ有し、非還元条件下
で約53,000ドルトン、約49,000ドルトン及び約90,000ド
ルトンの分子量をそれぞれ有する、第一、第二及び第三
のタンパク質成分からなり、アメリカ鉤虫（Necator am
ericanus）及び針虫（Haemochus contortus）から選択
された寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離
可能であり、本明細書でH45と表されている精製タンパ
ク質複合体。 - 【請求項２】アメリカ鉤虫（Necator americanus）及び
針虫（Haemochus contortus）から選択された寄生性ネ
マトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
上で還元条件下に約45,000ドルトン、非還元条件下では
約90,000ドルトンの見かけ上の分子量を有する、本明細
書でH4.5と表されている精製タンパク質。 - 【請求項３】アメリカ鉤虫（Necator americanus）及び
針虫（Haemochus contortus）から選択された寄生性マ
ネトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、還
元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約4
9,000ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細書でH
4.9と表されている精製タンパク質。 - 【請求項４】４ アメリカ鉤虫（Necator americanus）
及び針虫（Haemochus contortus）から選択された寄生
性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であ
り、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上
で約53,000ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細
書でH5.3と表されている精製タンパク質。 - 【請求項５】請求項１のタンパク質複合体又は請求項２
から４の何れか一つによるタンパク質、或いはこれらの
２以上の混合物を有効量含み、生きている哺乳類につい
て寄生性ネマトーダ又は吸虫に対する感染防御を惹起さ
せるためのワクチン。 - 【請求項６】タンパク質ダブレットH110D,或いはその成
分の一つの一定量をさらに含む、請求項５のワクチン。 - 【請求項７】タンパク質コントルチンの一定量をさらに
含有する、請求項５又は６のワクチン。 - 【請求項８】請求項１に規定されたタンパク質複合体H4
5を含有している溶液からこの複合体を分離する方法で
あって、かかる溶液をレクチン、H110Dに対する抗体及
びタンパク質複合体H45に対する抗体から選択された固
定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合した成分を
選択的に溶出させてタンパク質複合体を含有する溶出液
を形成し、アニオン交換樹脂上でタンパク質複合体H45
を吸着させ、続いてこれから溶出させることからなる方
法。 - 【請求項９】タンパク質複合体H45を含有している溶液
がアメリカ鉤虫（Necator americanus）又は針虫（Haem
ochus contortus）の抽出によって得られる、請求項８
による方法。
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