JPH04504118A

JPH04504118A - 駆虫薬剤及び感染防御免疫原の製造及び使用

Info

Publication number: JPH04504118A
Application number: JP2504756A
Authority: JP
Inventors: ムン，エドワード，アルバート; スミス，トレヴァー，スタンレー
Original assignee: ザ・バブラハム・インスティテュート
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1992-07-23
Anticipated expiration: 2015-10-30
Also published as: DK0463053T3; DE69032323D1; AU5276790A; CA2305966A1; JP3103592B2; IN176658B; NZ232984A; EP0463053B1; DE69032323T2; CA2046601A1; ATE166231T1; EP0846760A1; CA2046601C; HK1013951A1; WO1990011086A1; AU641148B2; ZA902054B; GB8906156D0; JP2000060557A; ES2118720T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２１　請求項１から３の何れか一つによる少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを遺伝子合成するように遺伝子的に修正された原核生物、真核生物又は細胞。

２２　請求項６から９の何れか一つによるタンパク質複合体又は請求項１Ｏから１６の何れか一つによるタンパク質を注射することにより、を椎動物において誘導された循環抗体により特異的に認識されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド。

２３　請求項６から９の何れか一つによるタンパク質複合体又は請求項１Ｏから１６の何れか一つによるタンパク質に対して抗体が隆起されることからなる、抗体のｉｎ　ｙｉｉｒθ産生のための方法。

２４　タンパク質ダブレット）ＩＩＩＯＤ、その構成成分またはそのポリペプチドフラグメントを、これらを含む供給溶液から回収するための方法であって、供給溶液をＨＩＩＯＤのレクチン及び抗体から選択された固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合したＨＩＩＯＤ、その構成成分又はフラグメントを選択的に溶出させることからなる方法。

２５　請求項２４の方法により調製されたタンパク質ダブレッ）ＨＩＩＯＤ０２６　タンパク質ダブレット旧１０Ｄが請求項２４の方法により調製されている、請求項１８によるワクチン。

２７　哺乳動物に対して請求項１６から１９の何れか一つによるワクチンを有効量注射することからなる、生きている哺乳動物に寄生性ネマトーダに対する感染防御を誘発するための方法。

明　細　書駆虫薬剤及び感染　御　の製造　び使用本発明は、駆虫薬剤及び感染防御免疫原として用いる物質の製造、並びにこれらの物質の使用に関する。

血液を栄養とするネマトーダ（線虫）である捻転青虫Ｃ／／５ｅｚｏｎｃｈｕｓ）は、反別動物の胃腸管の内壁に感染する。これは家畜の体重増加の減少や生産性の損失、無孔症などから死亡までの範囲にわたる影響を有し、世界的にみて非常に大きな経済的重要性を持つ。同類のネマトーダであるオステルタギア（θ５ｔｅｒｔ；ｔｚｉｓ）も同様の作用を及ぼす。捻転青虫症及びオスデルタギア症は、一つには重い感染と結びついた食欲不良による痔痩によって特徴付けられる。羊及び牛では、冬期降雨地域においてオステルタギア（θ５ｔｅｒｉＨ７ｓ）が最も顕著であるが、夏期降雨地域においては捻転青虫＜／／５ｅｚｏｎｃｈｕｓ）がより顕著である。例えばオーストラリアにおいては、同国の３００万頭の羊の約３分の１が捻転青虫（１／５ｅｚｏｎｃｈｔｔｓ）に感染されていると見積もられている。他に２つの属、毛様線虫Ｃ７’ｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｔｔｓ＞及びネマトデイルスＵｅｘｓｔｏｄｉｒｔｔｓ）が、経済的に重要なものである。毛様線虫Ｕｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎ（ｙｌｕｓ）は、温暖な地域における寄生虫性胃腸炎の最も重大な原因の一つである。ネマトディルスＵｅｚｓｔｏｄｉｒｕｓ）、特にネマトディルス・バッタス（Ｊ’、　ｂｓｉｉｔｔｓ）は、子羊における急性の、多くは致死性の腸炎を惹起しうる。

同類の血液摂取ネマトーダである鉤虫は、反別動物、イヌ、ネコ、他の肉食動物およびヒトに感染する。７００万人を越える人が鉤虫、特にアメリカ鉤虫（１／ｅｃｓｉｏｒ　ｚｚｅｒｉｃｚｎｔｔｓ）に感染しており、毎年新たな感染が７０から９０万件発生しており、また５から６万人がこれらの寄生虫の惨害のために死亡している。ズビニ鉤虫（ＡＯｃｙｌｏｓｉｏｉａ＞及びこれと同類の鉤虫である極東鉤虫（１／１ｔｃｉｎｓｒｉｓ）は、イヌ及びネコの小腸について最も病原性の嬬虫であると考えられている。鉤虫の他の種であるブノストムムＵｔｔｔｒｏｓｔａｉｔｔｚ）は反別動物に感染し、牛に感染するプノストムム・フレボトマム（β、　ｐｈｌｅｂｏｉｏｚｕｚ）は化アメリカにおいて特に商業的に重要なものである。ズビニ鉤虫ＣＡｎｃｙ１０ｓｌｏｚａ）の種はまたヒトにも感染する。これまでに、捻転青虫（／／；ｖｅｘσ〃ｃ力ｔｔＳ＞及び鉤虫である犬猫鉤虫＜ＡｎｃｙｌｏｓｉｏＩｓ　ｃｚｔｙｉ／７Ｕ＃）が、それらの腸の管腔表面における副細胞質成分の構造において多くの重要な類似性を有することが示されている（Ｅ、Ａ、　Ｍｕｎｎ及びＣ，Ａ、　Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ　（１９８３）　８７．１２９−１３７及びＰｈ１ｌｏｓｏ　ｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏ　ａｌ　５ｏｃｉｅｔ　Ｂ、　３０６゜１−１８．１９８４）。従って、反別動物について経済的に重要な意味のある寄生虫であると同時に、捻転青虫（ｌｌａｅｚｏｎｃｈｕｓ）は鉤虫に対するワクチンの開発について有用なモデルを提供する可能性がある。

捻転青虫（／／５ｅｉｐσｎ　ｃｈ　ｕｓ）から得られたタンパク質ダブレッ）　）ＩＩＩＯＤを含有する抽出物は、羊に注射した場合に捻転胃虫症に対する防御を与える。このダブレットＨ１１０Ｄは、捻転青虫（１／５ｅｚｏｎｃｈｔｔｓ）の腸の管腔表面において見いだされる。旧１ｏＤの調製及び使用については国際公開ｉ１’０−Ａ−８８１００８３５号に記述されている。しかしながら、この国際公開ＷＯ−Ａ−８８７００８３５号に記述された方法はタンパク質ダブレッ１−ＨＩＩＯＤを特徴付けるのに十分なものではあるが、実験的及び商業的に有用な量でもってタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄを容易に製造することができるようにこの方法をスケールアップすることは簡単には許されない。

国際公開ＷＯ−Ａ−８９１００１６３号には、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での分子量が４１Ｋｄであるタンパク質が、寄生性ネマトーダであるトリコストロンギルス・コルブリフォルミ７、　（ｒｒｉｃｈｏｓｔｒａｔＨｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｉｉｓ）の幼虫にあることが記述されている。このタンパク質は、トリコストロンギルス・コルブリフォルミスＵｒｉｃｈｏｓｉｒｏｎｇｙｌｔｉｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｉｉｓ）の純−発生の第３期幼虫から抽出された。このタンパク質の遺伝子はクローニングされている。

非常に類似したＤＮＡ配列が針虫（／／、ｔｅｚｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｔｔｓ）でも例証されたが、ｉｎ　ｙｉｙｏでの捻転青虫（ｌｌａｅｚｏｎｃｈｕｓ）の遺伝子タンパク質合成は報告されていない。この文書はまた、組換え有機体により合成された抗原で、羊を針虫Ｕｉｅｉｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｔ＃ｏｒｔｕｓ）に対してワクチン接種する試みの結果を報告している。これらの試みにおいては真中の卵の数の減少が報告されており、全体平均では卵の数は４０％減少している。

ワクチン接種から６３日後の屠殺にあたり、ワクチン接種されたグループの羊が有していた虫は平均で、対照グループよりも５２％少ながったことが見いだされている。

針虫Ｃ／１ｓｅｉｐｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｉｏｒｔｔｔｓ）又はその他の寄生性ネマトーダのポモジェ不一トのような、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤを含有している溶液から、或いは遺伝子変換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動物又は細胞その他の遺伝子的に適宜修正された原核生物又は真核生物から遺伝子合成された如きタンパク質を含有している溶液から、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤ及びその成分を非変性形態で単離するための簡便な方法を提供することに対するニーズがある。また、寄生性ネマトーダに対して有効なさらなる免疫原を提供することに対するニーズもある。

従って本発明は、タンパク質ダブレット旧１０Ｄ及びそれを構成するタンパク質、並びにそれらから誘導されたタンパク質フラグメントを製造するための新規且つ改良された方法を提供することを目的としている。本発明はさらに、ネマトーダに対して使用することのできる新規な感染防御免疫原を提供することをも目的としている。

本発明の一つの側面によれば、（ａ）から（ｏ）のアミノ酸残基配列又はその相同物の１つ又はそれ以上を含むタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが提供される：（ａ）　Ｍ　Ｇ　Ｙ　Ｐ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｅ　Ｆ（ｂ）Ｍ　ＧＦ　ｐ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　ｖ　Ｅ　５（ｃ）　Ｍ　Ｅ／Ｆ　Ｎ　Ｆ　Ｌ　Ｉ　Ｅ／Ｖ　Ｔ／Ｅ　Ａ　Ｇ（ｄ）　Ｍ　Ｋ　Ｐ／Ｅ　Ｔ／Ｖ　Ｌ　Ｄ／Ａ　Ｔ／Ｋ　Ｌ　−Ｉ　Ｔ（ｅ）　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｙ　ＨＳ　−Ｆ　Ｖ（ｆ）　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｅ／Ｙ　Ｄ　Ｑ／Ａ　Ｅ　Ｄ　Ｖ（ｇ）　Ｍ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｙ（ｈ）　Ｍ　Ｋ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｆ　Ａ　Ｖ／Ｌ　Ｑ　Ａ　Ｆ／Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｓ／Ｇ　Ｆ　Ｐ（ｉ）　Ｋ　Ｈ／Ｙ　Ｎ／Ｖ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｎ／Ｌ　Ｌ　Ｎ／Ｇ（ｊ）　Ｋ　−Ｔ　Ｓ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｎ（ｋ）　Ｋ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｄ　−Ｉ　−−−Ｋ　Ｇ＜１）　Ｋ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｖ／Ｐ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｄ　Ｄ　Ｉ　Ｔ？Ｙ　−−Ｇ　Ｐ　Ｓ（ｍ）　Ｋ　−Ｅ　Ｑ　Ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　Ｍ（ｎ）　Ｋ　−−−Ｐ　Ｆ　Ｎ／Ｄ　Ｉ　Ｅ　Ａ　Ｌ（ｏ）　Ｄ　Ｑ　Ａ　Ｆ　Ｓ　Ｔ　Ｄ　Ａ　Ｋ（ａ）から（０）の上記の配列においては１文字のアミノ酸コードが用いられており、そこにおいて文字は次のものを意味する。Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、■はイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、■はバリン、Ｙはチロシンである。また、曖昧なものはＰ／Ｅという形か、又はクエメチョンマークで示されている。Ｐ／Ｅという形では、分子側の文字が信号の強さに基づいて最も正しい可能性のあるアミノ酸を表している。「−」という符号は未知残基を意味する。

好ましいタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは一般式がｘ−ｙ−２のものであり、式中のＸ及びＺはそれぞれ相互に無関係に水素原子か、又はアミノ酸、防御されるアミノ酸、ペプチド、若しくはポリペプチドの残基を表し、ｙは上述した配列（ａ）から（０）の一つを表す。

このようなタンパク質、ポリペプチド又はペプチドはグリコジル化されているか、又はグリコジル化されていない。少なくともＸかＺの一方は、前述の配列（ａ）から（ｏ）の少なくとも一つでｙと同じか又は異なるものを含むことができる。

本発明はさらに、かかるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドについてのＤＮＡのコード付け、及びかかるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドについてのポリヌクレオチド配列のコード付けを提供するものである。

本発明はさらに、タンパク質ダブレット）ＩＩＩＯＤ、その構成成分またはそのポリペプチドフラグメントを、これらを含む供給溶液から回収するための方法にも関する。この方法は、供給溶液をＨＩＩＯＤのレクチン及び抗体から選択された固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合したＨＩＩＯＤ、その構成成分又はフラグメントを選択的に溶出させることからなる。

ヒトの鉤虫であるアメリカ鉤虫Ｕｅｃｚｔｏｒ　ａＩｅｒｉｃ；ｚｎｕｓ）は、実験室の動物宿主で培養することができる。本発明者らは、鉤虫（１／ｅｃｓｔｏｒ）の成虫の腸の副細胞質構造は、ズピニ鉤虫＜Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｚ；ｔ）のそれに非常に似ており、また鉤虫（Ａ／ｅｃｚｉｏｒ）からの膜内在住タンパク質を含有している抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での挙動が、同じ抽出方法により捻転青虫（１／５ｅｚｏｎｃｈｕｓ）から得られたタンパク質のパターンと非常に合致していることを見いだした。注目すべきは、かかる抽出物が捻転青虫（Ｉｌａｅｉｏｎｃｈｕｓ）から得た）ＩＩＩＯＤに相当する１１０．０００ドルトンの相対分子量のタンパク質ダブレットを有し、また捻転青虫（Ｉｌａｅｉｏｎｃｈｕｓ）からの他の腸内微絨毛膜タンパク質の一群に対応する、約５３．０００、約４９．０００及び約４５．０００ドルトンの相対分子量（還元型）の一群のタンパク質バンドを含有するということである。この一群のタンパク質を本明細書においてはタンパク質複合体Ｈ４５と呼ぶ。最初に本発明者らは、約４５．０００ドルトンの相対分子量（Ｍｒ）を有するこの複合体のタンパク質成分を同定し、これをタンパク質Ｈ４，５と表した。約５３．０００ドルトンと約４９．０００ドルトンの相対分子量（還元型）を有するタンパク質複合体Ｈ４５の他のタンパク質は、それぞれＨ５，３及びＨ４，９と表し得る。

タンパク質ダブレッ）ＨＩＩＯＤ及びタンパク質複合体）１４５の両方を含有する捻転青虫（Ｉｌａｅｉｏｎｃｈｕｓ））からの抽出物は、羊に注射した場合に捻転胃虫症に対する防御をもたらす。ワクチン接種の試みにおいて、本発明者らは寄生虫卵の排出が９８％以上減少し、またＨ２２０Ｄを含有しているワクチンにより虫の負荷が９２％以上減少したことを観察した。タンパク質複合体Ｈ４５に基づくワクチンもまた、羊において針虫Ｕｓｅｚｏｎｃｈｔｔｓｔａｎｔｏｒｔｔｔｓ）に対する防御をもたらした。この場合、ワクチン接種された羊は平均で、羊の対照グループと比較して雌の成虫の数の３８％の減少と、卵の産生の６８％の減少を示した。■４．５、Ｈ４，９及びＨ５，３もまた捻転青虫（ｌｌｓｅｉｏｎｃｈｕｓ＞の腸の管腔表面において見いだされる。

タンパク質複合体Ｈ４５は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での相対分子量（還元型）がそれぞれ約５３．０００、約４９．０００及び約４５．０００ドルトンである３つのタンパク質バンドを示す。このグループの成分は共に精製され、また同じモノクローナル抗体に結合するエピトープを共通に有している。Ｍｒが約５３、０００ドルトンのバンド（タンパク質Ｈ５，３）及び約４５，０００のバンド（タンパク質Ｈ４，５）はタンパク質染色でより強く染色され、またＭｒが約４９．０００ドルトンのバンドよりも広かった。低濃度で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、タンパク質複合体Ｈ４５の３つのバンドを作っているこれらのタンパク質は各々、非常に近接して一緒に展開する２つのバンドへとさらに分解される（即ちこれらはダブレットである）。

本発明はさらに、タンパク質Ｈ４，５、Ｈ４，９及びＨ５，３、並びにこれらの２つ又はそれ以上の混合物を提供する。特に本発明は、部分的に精製され又は完全に精製された形、つまり変性しない条件下での電気泳動に際し又は適切なりロマトグラフィー技術において本質的に干渉性成分として挙動する形において、タンパク質複合体Ｈ４５を提供する。本発明はまた、タンパク質複合体Ｈ４５及びその構成成分を単独で、又はタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄ若しくはこの）ＩＩＩＯＤダブレットの成分との混合物として捻転青虫（／１ｓｅｔｔｏｎｃｈｕｓ’）及び他の寄生性ネマトーダに対する感染防御免疫原として使用することにも関する。従って本発明は、タンパク質複合体）Ｈ４５の成分の何れか又は全部を単独で、或いは１つ又はそれ以上の寄生性ネマトーダに対する免疫性を惹起する１つ以上の免疫源、例えばタンパク質ダブレットＨＩＩＯＤ又はこのダブレットの成分タンパク質の１つとの混合物として含有するワクチンをさらに提供するものである。

肺吸虫であるジクチオカウルス＜１）ｉｃｉｙｏｃｚｕ／ｕｓ）　、糸状虫であるジロフィラリア（１）ｉｒｏｆｉ　ＩＪｒｊｓ）、並びに吸虫類のファスキオラ＜Ｆｓｓｃｉｏｌｓ＞、二腔吸虫Ｕｉｃｒｏｃｏｅ／ｉｕｉ＞及び住血吸虫（！；ｃｈｉｒｌｏｓｏｚｓ）といった他の嬬虫の血液摂取段の消化管もまた、）１１］、ＯＤ及びタンパク質複合体Ｈ４５と同族の又は相同の膜表在性糖タンパク質を含んでいると予想されることから、旧］、ＯＤ及び／又はＨ４５或いはその同族体若しくは相同体に基づくワクチンも恐らくこれらの嬬虫の１又はそれ以上に対して使用可能であると考えられている。

タンパク質ダブレット旧１０Ｄを回収するための本発明の方法において使用される供給溶液は、針虫（／／ａｅｉｏｎｃｈｔｔｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、針虫から得たその腸又は膜、或いは別の適当な寄生性ネマトーダをホモジナイザーにかけることにより作られる、ＨＩＩＯＤを含有するホモジネート、又は適切な遺伝子工学操作が施された原核生物、原核細胞又は真核生物、真核細胞により遺伝子合成されたＨＩＩＯＤ、その成分若しくはそのフラグメントを含有しているブイヨンや血清でありうる。或いはまた、本発明の方法において使用される供給溶液は、例えばかかるホモジネート、ブイヨン又は血清から得られた部分的に精製された抽出物であってもよい。このような部分的精製に関しては、次の実験的な観察を利用することができる。即ちＨＩＩＯＤは、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００やＴｈｅｓｉｔ　（ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル）のような同様の非イオン性界面活性剤、及びＣＨＡＰＳ　Ｕ−［３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）のような両性イオン性界面活性剤に可溶であるが、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ　２０　（ポリオキシエチレンソルビクンモノラウレート）には不溶である。しかし膜に関連する他のタンパク質はこの界面活性剤に可溶である。（ｒＴｒｉｔｏｎＪは登録商標であり、また［Ｔｗｅｅｎ　Ｊは商標である。）この界面活性剤中での溶解性のこの相違が、本発明の方法に従い親和性クロマトグラフィーにより対象とする糖タンパク質を選択する前に、界面活性剤には可溶であるが必要でない幾つかのタンパク質を除去することを可能にする。

本発明による一つの好ましい方法においては、ダブレットＨＩＩＯＤのタンパク質の各々に炭化水素基が付いているという、別の実験的観察を利用することができる。これらの炭化水素基の存在により、旧ｌＯＤダブレットのタンパク質、並びにやはり炭化水素基を担持しているそのフラグメントを本発明の方法において、不溶性の支持マトリックスに固定化された相補性結合物質（又はリガンド）のような、レクチンとして知られている種類のタンパク質の一つを用いた親和性クロマトグラフィーにより分離することが可能とされる。

全体としてタンパク質複合体Ｈ４５を形成するタンパク質Ｈ４，５、Ｈ４，９及びＨ５，３は、針虫＜／１ｓｅｉｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｔｔｔｏｒｉｕｓ）の腸の微絨毛に存在している膜内在性糖タンパク質である。これらはレクチンであるコンカナバリンＡと相互作用し、２０ｍＭ−Ｔｒｆｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７，２，０，１％Ｔｈｅｓｉｔ中での強アニオン交換樹脂であるＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）に結合しないｏ　（ｒＭｏｎｏＱＪは登録商標である。）　１（ＩＩＯＤはこれらの条件の下でＭｏｎｏＱに結合する。Ｈ４，５は、還元条件下で展開させた場合に５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約４５．０００ドルトンの見かけ上の分子量（Ｍｒ）を有し、非還元条件下で展開させた場合に約９０、０００ドルトンのＭｒを有する。しかしながら、タンパク質複合体Ｈ４５の他の成分、すなわちタンパク質Ｈ５，３及びＨ４，９はそれぞれ、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にも、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開させた場合に約５３．０００及び約４９．０００ドルトンの見かけ上の分子量（Ｍｒ）を有する。

Ｈ４，５及びＨ４５複合体の他のタンパク質は、非変性の）ＩＩＩＯＤと共通する１つ以上のエピトープを有している。

本発明はさらに、免疫原タンパク質複合体Ｈ４５を含有している溶液からこの複合体を分離する方法に関する。この方法は、かかる溶液をレクチン、）ＩＩＩＯＤに対する抗体及びタンパク質複合体Ｈ４５に対する抗体から選択された固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合した成分を選択的に溶出させてタンパク質複合体）１４５を含有する溶出液を形成し、アニオン交換樹脂上でタンパク質複合体Ｈ４５を吸着させ、続いてこれから溶出させることからなる。タンパク質複合体Ｈ４５を含有している溶液は、針虫（ｌｓｅｚｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｔｔｔｏｒｔｔｔｓ）の抽出により、或いはアメリカ鉤虫Ｕｅｃｓｉｏｒ　５ｉｅｒｉｃｚｎｔｔｓ）などの別の寄生性ネマトーダから、又は遺伝子工学的に操作された生物若しくは細胞培養液から得られる。

本発明はさらに、以下のアミノ酸配列の１つ又はそれ以上を含む免疫原に関する：（ｐ）　Ｍ　Ｇ　Ｙ　Ｐ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｅ　Ｆ　−Ａ　Ｔ　Ａ　Ｌ（Ｑ）　Ｍ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ｓ　−Ｙ？−Ｔ（ｒ）　Ｍ　Ｅ／Ｆ　Ｎ　Ｆ　Ｌ　Ｉ　Ｅ／Ｖ　Ｔ／Ｅ　Ａ　Ｇ　−Ｉ　Ｔ（ｓ）　Ｍ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｙ　−Ｔ　５（ｔ）　Ｍ　Ｋ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｆ　Ａ　Ｖ／Ｌ　Ｑ　Ａ　Ｆ／Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｓ／Ｇ　Ｆ　Ｐ（ｕ）　Ｍ　Ｋ　Ｐ／Ｅ　Ｔ／Ｖ　Ｌ　Ｄ／Ａ　Ｔ／Ｋ　Ｌ　−Ｉ　Ｔ　−Ｇ（ｖ）　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｙ　ＨＳ　−Ｆ　Ｖ　Ｇ？（ｗ）　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｅ／Ｙ　Ｄ　Ｑ／Ａ　Ｅ　Ｄ　Ｖ（ｘ）　Ｋ　Ｈ／Ｙ　Ｎ／Ｖ　Ｓ、Ｐ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｎ／Ｌ　Ｌ　Ｎ／Ｇ＜り　Ｋ　−Ｔ　Ｓ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｎ（ｚ）　Ｋ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｄ　−Ｉ　−−−Ｋ　Ｇ（ａａ）　Ｋ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｖ／Ｐ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｄ　Ｄ　Ｉ　Ｔ？Ｙ　−−Ｇ　Ｐ（ｂｂ）　Ｋ　−Ｅ　Ｑ　Ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　Ｍ（ｃｃ）　Ｋ　−−−Ｐ　Ｆ　Ｎ／Ｄ　Ｉ　Ｅ　Ａ　Ｌ（ｄｄ）　Ｄ　Ｑ　Ａ　Ｆ　Ｓ　Ｔ　Ｄ　Ａ　Ｋ（曖昧なものはＰ／Ｅという形か、又はクエメチョンマークで示されている。Ｐ／Ｅという形では、分子側の文字が信号の強さに基づいて最も正しい可能性のあるアミノ酸を表している。「−」という符号はその位置については同定可能な残基が得られなかったことを意味する。）本発明はさらに、（ａ）から（ｏ）又は上記の（ｐ）から（ｄｄ）のアミノ酸残基配列の何れか一つに基づくオリゴヌクレオチドに関する。これは例えば、５°ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＣＧ　ＴＴＧ　ＧＴＣＡＣＡ　ＧＴＣＧＡＡ　ＧＣＣＴＴＣＴＡＣ３’という配列を有するものであり、針虫Ｕｓｅｚｏｔｔｃｈｕｓ　ｃｏｎｉｏｒｉｕｓ））から得たゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡに結合する。

本発明はさらに、哺乳類の宿主に注射された場合に捻転青虫症に対する免疫を誘発し、捻転青虫（Ｉｌｓｅｉｏｎｃ力〃ｓ）から調製されたタンパク質ｆ−ｊレットＨＩＩＯＤ及びタンパク質複合体Ｈ４５に特異なモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有する免疫原を提供する。

本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質複合体Ｈ４５又はそのタンパク質構成成分を、恐らくはＨＩＩＯＤ又は１又はそれ以上の寄生性ネマトーダに対する免疫を誘発する他の免疫原との何らかの組み合わせにおいて含有しているワクチンが提供される。

かくして本発明は、還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）上で約５３．０００ドルトン、約４９．０００ドルトン及び約４５．０００ドルトンの見かけ上の分子量をそれぞれ有し、非還元条件下で約５３．０００ドルトン、約４９．０００ドルトン及び約９０、０００ドルトンの分子量をそれぞれ有する、第一、第二及び第三のタンパク質成分からなり、寄生性ネマトーダから誘導された精製タンパク質複合体（Ｈ４５）を提供する。このような精製タンパク質複合体は、捻転青虫Ｕｓｅｉｏｎｃｈｔｔｓ）、鉤虫（Ａ／ｅｃｘｉｏｒ）、ズビニ鉤虫（Ａｔｙｃｙｌｏｓｉｏｚｓ）、極東鉤虫（１／ＢＣ７ｎｓｒ＃）、オエソファゴストムム（θｅｓｏｐｈＨｏｓｔｏｚｔｔｉ）、ジクチオカウルス＜１）＃：ｔｙｏｃｓｔｔｌｔｔｓ＞、ストロンギルス＜Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、ジロフィラリア（１）ｉｒｏｆｉ　／２ｒｉｓ）、ブノストムム（ｌｔｔｎｏｓｉｏｘｕｔｐ）、オステルタギア（ θ５ｉｅｒｉＨｉａ）、毛様線虫（ｒｒｉｃｈｏｓｌｒｏｔＨｙｌｕｓ）またはネマトディルス（１／ｅｔｔｔｓ　１ｏｄｊｒｕｓ）の種、例えば針虫（／Ｉｔｅｚｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｔｔｔ）から誘導することができる。タンパク質複合体Ｈ４５の同族体、相同体、誘導体、フラグメント又は成分であるタンパク質も考慮されている。

本発明による好ましいタンパク質は次のものを含む：（ａ）寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能な、本明細書でＨ４，５と表されている精製タンパク質。この精製タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で還元条件下に約４５．０００ドルトンの、非還元条件下では約９０．０００ドルトンの見かけ上の分子量を有する。

（ｂ）寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約４９．０００ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細書でＨ４，９と表されている精製タンパク質。

（ｃ）寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約５３．０００ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細書でＨ５，３と表されている精製タンパク質。

このようなタンパク質を誘導することのできる寄生性不マトーダは、捻転青虫（／／５ｅｉｏｎｃｈｔｔｓ）、鉤虫（Ｎｅｃｓｔｏｒ＞、ズビニ鉤虫（ＡｎＣｙｌｏｓｔｏｉｓ）、極東鉤虫＜ｌ／ｎｃｉｎｓｒｉｓ＞、オエソファゴストムム（θｆ、；Ｏｐｈ；ｔｌＯ３ｔ０１ＵＥ）、ジクチオカウルス（１）ｉｃｌｙｏｃ；ｔｔｔｌｕｓ）、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｙｙｌｕｓ）、ジロフィラリア＜１）ｉｒｏｆｉ／１ｒｉｓ）、プノストムムＵｕｎｏｓｉｏｉｕｉ）、オステルタギア（θ５ｔｅｒｂｌｉｓ）、毛様線虫Ｕｒｉｃｈｏｓｉｒｏｎ（ｙｌｕｓ）またはネマトデイルスＣＡ’ｅｉｓｉｏｄｉｒｕｓ）の種、例えば針虫（ｌｌｓｅｚｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｉｕｓ））である。

また本発明により提供されるものは、有効量の本発明によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含み、生きている哺乳類について、寄生性ネマトーダ又は適当な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチン、並びにタンパク質複合体Ｈ４５又はその成分タンパク質の有効量を含み、生きている哺乳類に寄生性ネマトーダ又は適当な吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチンである。これらのワクチンはさらに、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤ、その成分の一つ、或いはその少なくとも一つの成分の同族体、相同体、誘導体又はフラグメントの一定量を含むことができる。ワクチンはまたさらに、タンパク質コンドルチン、或いはその同族体、相同体、誘導体又はフラグメントの一定量を含有することができる。典型的には、かかるワクチンは、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤ或いはその同族体、相同体又は誘導体と選択的に混合された、感染防御すべき哺乳類の生体重量に対し１ｋｇ当たり約０．１から約２５μｇの範囲の、単位投与量適たり一定量のタンパク質複合体Ｈ４５を含む。従って典型的な体重が２５ｋｇの子羊の場合、単位投与量適たりの量は約０．２５μｇから約６２５μｇの範囲となるが、これに対して典型的な体重が７０ｋｇのヒトの成人の場合、単位投与量適たりの量は約７μｇから約１７５０μｇの範囲となる。好ましくは、単位投与量適たりの量は体重１ｋｇ当たり約１μｇから約２０μｇの範囲、さらにより好ましくは約２μｇから約１５μｇの範囲に相当する。

このようなワクチンは、関連する単数又は複数の感染防御抗原を有効量含有している単位投与量を注射することにより、寄生性ネマ）　−ダに対して生体哺乳類に感染防御を引き起こすのに使用することができる。

また本発明の範囲の中には、タンパク質複合体Ｈ４５の少なくとも一つの成分、或いはその同族体、相同体、誘導体又はフラグメントを遺伝子合成するように遺伝子的に修正された、或いは前述したアミノ酸配列（ａ）から（０）又は（ｐ）から（ｄｄ）の１又はそれ以上からなる少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを遺伝子合成するように遺伝子的に修正された、原核生物、真核生物又は細胞が含まれる。

本発明はそのさらに別の側面において、抗体のｉｎ　ｙｉｉｒｏ産生のための方法を提供する。この方法において、抗体はタンパク質複合体Ｈ４５又はＨＩＩＯＤ、或いはこれらのタンパク質成分に対して隆起される。

さらに有用であるのは、タンパク質複合体Ｈ４５又はＨＩＩＯＤ、或いはこれらのタンパク質成分を注射することにより、を椎動物において誘導された循環抗体により特異的に認識されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。

添付図面において：図１は、タンパク質ダブレット旧１０Ｄ及び複合タンパク質Ｈ４５の調製のための概略的な流れ図である。

図２は、ＨＩＩＯＤをＣＮＢｒで開裂することにより得られたペプチドの５ＤＳ −ＰＡＧＥでのクーマシーブルー染色により得られた結果を示す。

図３は、（ａ）分子量既知の標準タンパク質及び（ｂ）針虫（／１ｓｅｔｓｏｒｔｃｈｔｔｓｃｏｎｉｏｒｔｕｓ）の腸の微絨毛から界面活性剤Ｔｈｅｓｉｔにより抽出された膜タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離してクーマシーブルー染色することにより得られた結果を示す。標本は２−メルカプトエタノールで還元されており、また還元条件下で展開された。

図４は、図１に要約した精製手順の種々の段階におけるフラクションの５ＤＳ− ＰＡＧＥのパターンを含む。

図２において、レーンａ及びｂは既知のＭｒのタンパク質及びペプチドを含んでおり、これらはｋＤで示されている。レーンＣは、ＣＮＢｒによる旧１０Ｄの開裂により得られたペプチドを含んでいる。番号を付したバンドはアミノ酸配列の分析のために取り出したものであり、その結果は後述する表１に示されている。

図４において、レーン（ａ）及び（ｂ）は既知の分子量のタンパク質を示し、レーン（Ｃ）は図１のステージｌへの精製を示し、レーン（ｄ）はアニオン交換クロマトグラフィーにより得られたタンパク質複合体Ｈ４５に富むフラクションを示し、レーン（ｅ）は図１のステージ３への精製を示し、レーン（ｆ）は電気泳動的に精製された）ＩＩＩＯＤを示している。

別の好ましい方法においては、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤ及びレクチン親和性カラムから溶出された旧１０Ｄを含有するフラクション中に存在している他のタンパク質に特異なモノクローナル抗体が、２つの方法により製造された。最初の方法においては、在来の方法論に従った。

マウスに対し、添付の概略の図１に示す如くステージ２まで精製された捻転青虫Ｕｓｅｉｙｏｎｃｈｕｓ）の界面活性剤抽出物、或いはステージ３（図１）まで精製された抽出物又はタンパク質複合体Ｈ４５に富むフラクションを注射する。

注射されたタンパク質の標本を抗原として用いてＥＬＩＳＡにより測定し、血清サンプル中の抗体の力価が十分に高いと判断した場合にマウスを殺して肺臓細胞を得る。これらの細胞をマウスの骨髄腫細胞系ＮＳＯ及び６５３細胞と融合させる。捻転青虫（Ｉｌｓｅｚｏｎｃｈｕｓ）の成分に対する抗体を産生ずる融合細胞を選択し、クローニングする。

これらのクローンにより産生された抗体は、培養されてから集められ、その特異性がウェスターン法の技術により判定される。この技術では、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された抗原が電気泳動によりニトロセルロースに転写され、抗体によりプローブすることができる。第二の方法では、羊に対し、ステージ１（図１）まで精製された捻転青虫（１／５ｅｚｔｏｎｃｈｕｓ）の界面活性剤抽出物を注射する。血清サンプル中における特異抗体の力価が十分に高くなったところで血液サンプルを取り出し、そこからリンパ球を分離する。つまり羊を殺して腋窩のリンパ腺を切除し、そこからリンパ球を得る。このリンパ球をマウスの骨髄腫細胞系ＮＳＯと融合させて、羊−マウスのヘテロハイブリドーマを形成する。捻転青虫Ｕ；ｔｅｘｏｎｃｈｔｔｓ）のタンパク質に対して特異な羊抗体を産生ずるヘテロハイブリドーマを選択し、クローニングして、それらが産生ずる抗体を収集する。次のモノクローナル抗体、つまりタンパク’ＪｔＨｎｏｐ、タンバり質複合体Ｈ４５及びその成分タンパク質、例えばタンパク質Ｈ４，５、及び捻転青虫（ｔｔｓ　ｅｔｐｏｎ　ｃｈ　ｔｔｓ）の界面活性剤抽出物中に生ずる他のタンパク質と（及びオステルタギア（θ５ｔｅｒｈｚｉｓ）の抗原と）特異的に反応するモノクローナル抗体は、本発明の方法の親和性クロマトグラフィーのステップにおいて、ＨＩＩＯＤ、その成分及びフラグメント、並びにタンパク質複合体）！４５の精製におけるリガンドとして別々に、又は連続的に、代替的に用いることができる。

本発明を以下の実施例においてさらに説明する。

衷皇匠−上（ステージは図１に示した如く番号付けしである。）新鮮な又は冷凍融解した針虫Ｃ／ｌ；ｔｅｉｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｉｏｒｌｔｔｓ＞を細かく破砕し、燐酸塩で緩衝した約６容積の生理的食塩水（ＰＢＳ、　１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ７，２）中でホモジナイズした。こうして得られたホモジネートを次いで１７分間、約２０．０００ｇで遠心分離した。

上澄液を除去し、ペレットを約４容積のＰＢＳ中で再度ホモジネートした。

再度遠心分離した後、上清を除去し、ベレットを１％のＴｗｅｅｎ　２０を含有している約５容積のＰＢＳ中で再度懸濁し、反転により時折混合しながら氷上で１時間放置した。この抽出物を１７分間、約２０．０００ｇで遠心分離し、上澄液を捨てた。このベレットをこのようにして再度、ＰＢＳ中１％のＴｖｅｅｎで抽出し、次いでＰＢＳ中１％のＴｈｅｓｉｔ界面活性剤（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で１６時間までの時間にわたって３回抽出した。各々の抽出物を約２０．０００ｇで１７分間遠心分離することにより３つの抽出物から得られた上澄液を一緒にし、約１１Ｘ　１０’ｇ、　ｍｉｎ、で遠心分離した。これにより得られる上澄液は保存したく図１、ステージ１）。これを濃縮し、緩衝液を１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの塩化マンガン、０．１％のＴｈｅｓｉｔ及び０．０２％のアジドナトリウムを含有するｐＨ５，２の５ｍＭアセテート緩衝液（ＣｏｎＡ緩衝液）と交換した。次いでこの溶液を、ａｆ　ｆ　ｉ−ｇｅｔ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に結合したレクチンであるコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）を用いて、親和性クロマトグラフィーにかけた。（ｒａｆｆｉ−ｇｅｌＪは登録商標である。）タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤはカラムに結合し、またタンパク質複合体Ｈ４５も同様であった。未結合のタンパク質は、Ｃｏｎ　Ａ緩衝液と共に溶出させた。次いでＨＩＩＯＤ及びタンパク質複合体Ｈ４５を、Ｃｏｎ　Ａ緩衝液中０．５Ｍのメチル−〇−グルコピラノシドで溶出させた（図１、ステージ２）。

次いでこの物質を濃縮し、０．１％のＴｈｅｓｉｔを含有している２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，２に移し、ＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のイオン交換り０７トグラフイーカラムにかけた。タンパク質複合体Ｈ４５は結合しなかった。タンパク質ＨＩＩＯＤは、Ｉ　Ｍ　Ｍ−ＮａＣ１を含有している適用緩衝液のｏ−２５％グラジェントで溶出させた。ＨＩＩＯＤを含有しているフラクションはプールし、イオン交換カラムで再度クロマトグラフィーにかけた（ステージ３）。

寒亘匠−主実施例１０手順を、リガンドであるコンカナバリンＡを親和性クロマトグラフィーの段階においてレンズ豆レクチン又は麦芽アグルチニンと代替して繰り返した場合に、これらは両方とも旧１０Ｄ及びＨ４５の炭化水素部分と特異的に結合し、同様の結果が得られた。

Ｘ塁匹−１リガンドがＨＩＩＯＤに特異なモノクローナル（又はポリクローナル）抗体からなる点を除き、実施例１の手順を繰り返した。この手順において、未精製の又は部分的に精製された旧１０Ｄの成分は、旧１０Ｄ又は他の捻転青虫Ｃ／／５ｅｚｏｎｃｈｔｔｓ）のタンパク質に特異な抗体が結合しているカラム又は膜に吸着された。抗体によって結合されなかったタンパク質は洗い出し、結合したタンパク質はｐＨの変化、高い塩濃度、カオトロピック剤又はこれらの組合わせの何れかを用いて溶出した。リガンドは、次のような何らかの適当なマトリックスに結合し得る。すなわちＣＮＢｒで活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ）、Ｚｅｔａｆｆｉｎｉｔｙディスク或いはカートリッジ（ＣＵＮＯＩｎｃ、　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｄｆｖｉｓｉｏｎ）、またはＩｍｍｏｂｉｌｏｎの親和性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が適当なマトリックスであるｏ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ。

Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ、　Ｚｅｔａｆｆｉｎｉｔ）’及びＩｍｍｏｂｉｌｏｎは商標である。）抗体は、前述した方法により製造された。

マトリックスに対する抗体の結合は、反応性基を適当に活性化することによって達成された。

Ｘ嵐匠−土ステージｌの後にＺｅｔａＰｒｅｐ　ＱＡＥディスク（ＣＵＮＯＩｎｃ、　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓＤｉｖｉｓｉｏｎ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーのステップを導入した点を除いては、実施例１の手順を繰り返した。（ＺｅｔａＰｒｅｐは商標である。）ステージ１からの上澄液を濃縮し、０．１％Ｔｈｅｓｉｔを含有しているｐＨ１，２の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩに移し、ＺｅｔａＰｒｅｐ　ＱＡＥディスクを通過させた。旧１０Ｄに富むフラクションを０．０５Ｍ、　０．１Ｍ、０．２Ｍ及び０．２５ＭのＮａＣ１のステップグラジェントを含有している適用緩衝液で溶出させた。この緩衝液は次いで、Ｃａｎ　Ａ緩衝液と交換した。

寒塵五−１Ｔｗｅｅｎ　２０の溶液で抽出した後に、ペレットを２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ｔ（ＣＩで洗浄し、次いでｐＨ７，２の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ中１％のＴｈｅｓｉｔで３回抽出した点を除き、実施例４０手順に従った。

夾皇皿−１Ｔｖｅｅｎ　２０及びＴｈｅｓｉｔの溶液による抽出を省略し、その代わりに１．８％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４で抽出を行った点を除き、実施例１の手順に従った。超遠心分離段階の後に上澄液を３０℃として、相分離を行った。約２０℃ における低速での遠心分離の後に、大気温度においてＣｏｎ　Ａ緩衝液中１％のＴｈｅｓｉｔで界面活性剤相を希釈した。かくして得られた均一溶液を次に、実施例１に示したようにして、親和性及びイオン交換クロマトグラフィーにかけた。この方法は、）１４５タンパク質複合体グループを殆ど可溶化しない。

夾皇皿−１界面活性剤溶液、Ｃｏｎ　Ａを用いた親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーでの分画抽出による抽出物から、実施例１の方法によりステージ３（図１）まで精製されたタンパク質ＨＩＩＯＤの、捻転青虫症に対するワクチンにおける薬効を検証した。上述した手順により精製した旧１０Ｄを生体重量当たり約１５μｇ／ｋｇ使用して注射することにより、Ｃ１ｕｎ　Ｆｏｒｅｓｔ羊を６頭中５頭、感染防御した。１０，０００の感染性第三期幼虫で実験的に感染してから３５日後に５頭の動物から回収した虫の平均重量は、対照に比較して９８．６％減少した。この寄生虫による卵の産生は、対照に比較して９９．１％減少した。６頭目の動物は、部分的に感染防御した。対照の平均と比較すると、その虫による負荷は５３％だけ減少し、また寄生虫卵の産生は７２．３％減少した。精製された）１１１０Ｄが注射された６頭の動物全部を考えると、対照グループと比較して虫の重量の合計における平均９１％の減少があり、また寄生虫卵の産生における平均９４．５％の減少があった。対照グループは、受けた注射液が捻転青虫＜／１ｓｅｚｏｎｃｈｕｓ＞のタンパク質を含有していない点を除き、同様に処理された。

感染防御された羊からの抗血清は、ステージ１（図１）まで精製された抽出物のウェスターンプロットにおいて、ＨｌｌｏＤ及びタンパク質複合体Ｈ４５のタンパク質、例えばタンパク質Ｈ４４５に強（結合した。このことは、Ｈ４，５並びに＋（４，５とＨ５，３及びＨ４，９の１つ以上との混合物が特に良好な免疫原であろうことを示している。なぜならステージ３まで精製したＨｌｌｏＤのクーマシーブルー染色から判断すると、注射された物質の約１％（即ち生体重量当たり約０．１５μｇ／ｋｇ）のみがタンパク質複合体Ｈ４５からなり、注射総量の約９８％が１（ＩＩＯＤであったからである。或いはまたこれは、旧１０Ｄ及びタンパク質混合物Ｈ４５の成分の少なくとも一つが共通のエピトープを有することを示している。これらの選択枝は相互に排他的なものではない。ＥＬＩＳＡ及びウェスターン法による旧１０Ｄ及びタンパク質複合体Ｈ４５の両者に対する羊及びマウスのモノクローナル抗体による交差反応が例証された。

タンパク質Ｈ４，５、およびタンパク質複合体Ｈ４５の他のタンパク質は、ＨＩＩＯＤと共に捻転青虫（／ＩＪｅＥｏ／７ｃ力ｕｓ＞の腸の微絨毛膜中に存在している（図３参照）０ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔａｉｓ）、極東鉤虫（１／ｎｃｉｎｓｒｉａ）及び鉤虫（／Ｉｅｃａｉｏｒ）の腸のＴｈｅｓｉｔ抽出物もまた、還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開した場合に、Ｍｒが４５．０００ドルトンのバンドと、それぞれ約４９．０００及び約５３，０００ドルトンのＭｒを有するタンパク質複合体８４５のタンパク質に対応するバンドを有していた。非還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、Ｈ４，５は約９０．０００ドルトンのＭｒを有し、これに対しＨ５，３とＨ４，９は依然としてそれぞれ約４９．０００及び約５３．０００ドルトンのＭｒを有しており、またＭｒが４５．０００ドルトンのバンドはなかった。

タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤは、１％のＴｈｅｓｊ　を又は他の非イオン性界面活性剤を含有しているｐＨ８，４のバルビトール緩１ｉｆＪＥ中１％のアガロース中で電気泳動することにより、非変性形態でさらに精製できる。

このタンパク質は、ゲルから溶出したらすぐにｐＨ７，２の緩衝液へと移し戻す。或いはまた、タンパク質ダブレット旧１０Ｄは抗体親和性クロマトグラフィーによりさらに精製される。そこではＨＩＩＯＤ以外のタンパク質に特異な抗体が用いられてこれらのタンパク質が除去され、或いはＨＩＩＯＤに特異な抗体が用いられてこのタンパク質ダブレットが選択される。

同様の仕方で、適当な固定化された抗体を用いてタンパク質複合体Ｈ４５をさらに精製することができる。

タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び電気泳動による溶出によって、変性形態で精製することができる。このようにして調製された純粋なＨＩＩＯＤはワクチン接種には適してはいないが、タンパク質分解酵素及びＣＮＢｒの如き化学的開裂試薬での断裂などの化学的特性指摘に適している。図２は、４時間にわたって室温てＮ２雰囲気下に暗闇で７０％蟻酸中モル過剰のＣＮＢｒによるＨＩＩＯＤの開裂生成物の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたフラグメントの特性パターンを示している。同じ条件下で１８時間にわたり消化させると、本質的に同じパターンが得られた。

電気泳動によりニトロセルロースに転写し、クーマン−ブルーで軽く染色し、切除して気相アミノ酸配列分析装置で分析したＣＮＢｒフラグメントのエドマン分解により得られたＮ末端配列を、以下の表１のバー　）　（ａ）において示した。

表　１タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤの（ａ）ＣＮＢｒ開裂、（ｂ）Ｌｙｓ−Ｃ消化、及び（ｃ）トリプシン消化により得られたペプチドの部分的なアミノ酸配列データペプチド　大体の　配　列Ｎｏ、　Ｍｒ（ａ）　１　２３　Ｋｄ　ＭＧＹＰＶＶＫＶＥＥＦ−ＡＴＡＬ２　１６　Ｋｄ　ＭＧＦＰＶＬＴＶＥＳ−Ｙ？−Ｔ３　８　Ｘｄ　ＭＥ／ＦＮＦＬＩＥ／ＶＴ／ＥＡＧ−ＩＴ４　２５、５Ｋｄ　Ｍ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｙ　−Ｔ　Ｓ４Ａ　２７　Ｋｄ　ＭＫＴＰＥＦＡＶ／ＬＱＡＦ／ＴＡＴＳ／ＧＦＰ５　１５　Ｋｄ　ＭＫＰ／ＥＴ／ＶＬＤ／ＡＴ／ＫＬ−ＩＴ−Ｇ６　１７、５Ｋｄ　Ｍ　Ｌ　Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｙ　ＨＳ　−Ｆ　Ｖ　Ｇ？９　１８　Ｋｄ　ＭＬＡＥ／ＹＤＱ／ＡＥＤＶ（ｂ）　１．７　２４？　Ｋｄ　Ｋ　Ｈ／Ｙ　Ｎ／Ｖ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｎ／Ｌ　Ｌ　Ｎ　Ｇ２．３　４２　Ｋｄ　Ｋ−ＴＳＶＡＥＡＦＮ３．４　４７　Ｋｄ　ＫＡＡＥＶＡＥＡＦＤ−１−−−ＫＯ２，５４０Ｋｄ　ＫＡＶＥＶ／ＰＡＥＡＦＤＤＩＴ？Ｙ−−ＧＰＳ２．２　４３　Ｋｄ　Ｋ−ＥＱＴＥＩＦＮＭ２．７　１８　Ｋｄ　Ｋ−−−ＰＦＮ／ＤＩＥＡＬ（ｃ）１２　ＤＱＡＦＳＴＤＡＫ表１に対する注：１．１文字のアミノ酸フードは、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、■はインロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、■ はバリン、Ｙはチロシンである。

２、曖昧なものはＰ／Ｅという形か、又はクエメチョンマークで示されている。

Ｐ／Ｅという形では、分子側の文字が信号の強さに基づいて最も正しい可能性のあるアミノ酸を表している。「−」という符号は同定可能な残基がその位置にって得られなかったことを意味する。

３、分析された他のバンド（図２参照）は、有用でない信号か、又は強度の等しい混合物の何れかを与えた。

ＣＮＢｒ消化物のウェスターンプロットは、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びにレクチンでプローブしうる。これらの試薬を用いることにより、バンド１０（図２）は恐らく非常にグリコジル化されている。なぜならそれは大量のコンカナバリンＡを結合するが、タンパク質染料り−マシーブルーによりほんの軽くしか染色されないからである。バンド１．２．３．４及び７は、恐らくバンドｌＯはどには高度にグリコジル化されていない。これらはクーマシーブルーでの染色の度合いにほぼ比例してフンカナバリンＡを結合する。バンド７は、ＴＳＳ　１／９．７及びＴＳＳ　１／９．１６と表されたマウスのモノクローナル抗体が結合する、ＣＮＢｒ開裂により得られた唯一のペプチドである。

ＣＮＢｒフラグメント１．２及び４のＮ末端配列のそれぞれに対応する次の配列、即ち、Ｍ　Ｇ　Ｙ　Ｐ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｅ　Ｆ。

Ｍ　Ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ｓ、及びＭＧＦＰＬＶＴＶＥＡＦＹをそれぞれ有する、ＭＵＮ２、ＭＵＮ３及びＭＵＮ４と表した３つのペプチドを、在来法により合成してウサギと羊に注射した。特異的抗体が得られた。

これらの抗体は、ＰＡＧ　（ポリアクリルアミドゲル）中での電気泳動により精製された変性ＨＩＩＯＤに結合し、またＭＵＮ４に対する抗体は、精製された非変性の旧１０Ｄにも結合した。ＭＵＮ４に対する抗体は、非変性の旧１０Ｄの精製のために親和性クロマトグラフィーにおいて使用できる。これらのペプチド（ＭＵＮ２、ＭＵＮ３及びＭＵＮ４）はそれら自体では感染防御エピトープではないが、感染防御エピトープの一部を形成しうる。さらに、他のペプチド配列は感染防御エピトープを全体として又は部分的に形成しうる。

Ｆ　工　Ｃ，−１タンパク質ダブレッ）ＨＩＩＯＤ及びタンパク質複合体Ｈ４５の調製の概略的流れ図塩溶液中のホモジネート ↓溶出溶出フラクシ謬ン　（ステージ２）ＦＩＧ、２ＦＩＧ、３ＦＩＧ、４国際調査報告１１１１１１ＰＲ□、い、１Ａ、ユ、。１．い、。ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００４１６、ｐ＋＊ｎｎ＋１ｅｅａ＋　Ａｐｅｌ＋ｃａ＋＋ｅｅ　ｘ。ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００４１６国際調査報告ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００４１６１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号発　明　者　スミス、トレヴアー、スタンレ　イギリス国ケンブリー　ム、ザ・クロース・出　願　人　スミス、トレヴアー、スタンレ　イギリス国ケンブリー　ム、ザ・クロース・ νツジ・シービー２・４エイキユー、パブラバ・６１ツジ・シーと−２・４エイキユー、パブラバ・６

Claims

【特許請求の範囲】１　（ａ）から（ｏ）のアミノ酸残基配列又はその相同体の１つ又はそれ以上を含むタンパク質、ポリペプチド又はペプチド：（ａ）ＭＧＹＰＶＶＫＶＥＥＦ（ｂ）ＭＧＦＰＶＬＴＶＥＳ（ｏ）ＭＥ／ＦＮＦＬＩＥ／ＶＴ／ＥＡＧ（ｄ）ＭＫＰ／ＥＴ／ＶＬＤ／ＡＴ／ＫＬ−ＩＴ（ｅ）ＭＬＡＬＤＹＨＳ−ＦＶ（ｆ）ＭＬＡＥ／ＹＤＱ／ＡＥＤＶ（９）ＭＣＦＰＬＶＴＶＥＡＦＹ（ｈ）ＭＸＴＰＥＦＡＶ／ＬＱＡＦ／ＴＡＴＳ／ＧＦＰ（ｉ）ＫＨ／ＹＮ／ＶＳＰＡＡＥＮ／ＬＬＮ／Ｇ（ｊ）Ｋ−ＴＳＶＡＥＡＦＮ（ｋ）ＫＡＡＥＶＡＥＡＦＤ−Ｉ−−−ＫＧ（ｌ）ＫＡＶＥＶ／ＰＡＥＡＦＤＤＩＴ？Ｙ−−ＧＰＳ（ｍ）Ｋ−ＥＱＴＥＩＦＮＭ（ｎ）Ｋ−−−ＰＦＮ／ＤＩＥＡＬ（ｏ）ＤＱＡＦＳＴＤＡＫ２　一般式ｘ−ｙ−ｚを有し、式中ｘ及びｚがそれぞれ相互に無関係に水素原子か、或いはアミノ酸、防御されるアミノ酸、ペプチド又はポリペプチドの残基を表し、ｙが請求項１に記載の配列（ａ）から（ｏ）の一つを表す、請求項１のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド。３　少なくともｘかｚの一方が、請求項１に記載の配列（ａ）から（ｏ）の少なくとも一つでｙと同じか又は異なるものを含む、請求項２のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド。４　請求項１から３の何れか一つによるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのためのＤＮＡコード付け。５　請求項１から３の何れか一つによるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのためのポリヌクレオチド配列コード付け。６　本明細書においてＨ４５として示した精製タンパク質複合体。７　還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で約５３，０００ドルトン、約４９，０００ドルトン及び約４５，０００ドルトンの見かけ上の分子量をそれぞれ有し、非還元条件下で約５３，０００ドルトン、約４９，０００ドルトン及び約９０，０００ドルトンの分子量をそれぞれ有する、第一、第二及び第三のタンパク質成分からなり、寄生性ネマトーダから誘導された精製タンパク質複合体。８　前記寄生性ネマトーダが、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、極東鉤虫（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、オエソファゴストムム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、ジクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、シロフィラリア（ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、プノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇａ）、毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）又はネマトディルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）の種である、請求項７の精製タンパク質複合体。９　前記寄生性ネマトーダが針虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）である、請求項８の精製タンパク質複合体。１０　請求項９によるタンパク質複合体Ｈ４５の同族体、相同体、誘導体、フラグメント又は成分であるタンパク質。１１　寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、ドアシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で還元条件下に約４５，０００ドルトン、非還元条件下では約９０，０００ドルトンの見かけ上の分子量を有する、本明細書でＨ４．５と表されている精製タンパク質。１２　寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約４９，０００ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細書でＨ４．９と表されている精製タンパク質。１３　寄生性ネマトーダの腸内微絨毛の形質膜から分離可能であり、還元条件下及び非還元条件下の何れの場合にもドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル磁気泳動上で約５３，０００ドルトンの見かけ上の分子量を有し、本明細書でＨ５．３と表されている精製タンパク質。１４　前記寄生性ネマトーダが、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、極東鉤虫（Ｕｎｃｉｎａｒａ）、オエソファゴストムム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、ジクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、シロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｉａ）、プノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、オステルクギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）またはネマトディルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）の種である、請求項１１から１３の何れか一つのタンパク質。１５　前記寄生性ネマトーダが針虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）である、請求項１４によるタンパク質。１６　請求項１から３の何れか一つによるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを有効量含み、生きている哺乳類について寄生性ネマトーダ又は吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチン。１７　請求項７のタンパク質複合体又は請求項８から１５の何れか一つによるタンパク質、或いはこれらの２以上の混合物を有効量含み、生きている哺乳類について寄生性ネマトーダ又は吸虫に対する感染防御を惹起させるためのワクチン。１８　タンパク質ダブレットＨ１１０Ｄ、その成分の一つ、或いはその少なくとも一つの成分の同族体、相同体、誘導体又はフラグメントの一定量をさらに含む、請求項１６又は１７のワクチン。１９　タンパク質コントルチン、或いはその同族体、相同体、誘導体又はフラグメントの一定量をさらに含有する、請求項１６から１８の何れかのワクチン。２０　請求項７から９の何れか一つのタンパク質複合体Ｈ４５の少なくとも一つの成分、或いはその同族体、相同体、誘導体又はフラグメントを遺伝子合成するように遺伝子的に修正された原核生物、真核生物又は細胞。２１　請求項１から３の何れか一つによる少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを遺伝子合成するように遺伝子的に修正された原核生物、真核生物又は細胞。２２　請求項６から９の何れか一つによるタンパク質複合体又は請求項１０から１６の何れか一つによるタンパク質を注射することにより、脊椎動物において誘導された循環抗体により特異的に認識されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド。２３　請求項６から９の何れか一つによるタンパク質複合体又は請求項１０から１６の何れか一つによるタンパク質に対して抗体が隆超されることからなる、抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ産生のための方法。２４　タンパク質ダブレットＨ１１０Ｄ、その構成成分またはそのポリペプチドフラグメントを、これらを含む供給溶液から回収するための方法であって、供給溶液をＨ１１０Ｄのレクチン及び抗体から選択された固定化タンパク質試薬と接触させ、次いで結合したＨ１１０Ｄ、その構成成分又はフラグメントを選択的に溶出させることからなる方法。２５　請求項２４の方法により調製されたタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄ。２６　タンパク質ダブレットＨ１１０Ｄが請求項２４の方法により調製されている、請求項１８によるワクチン。２７　哺乳動物に対して請求項１６から１９の何れか一つによるワクチンを有効量注射することからなる、生きている哺乳動物に寄生性ネマトーダに対する感染防御を誘発するための方法。