MX2010014082A - Proteina de fusion de somatostatina deficiente en cloranfenicol-acetil-transferasa y usos de la misma. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan polipéptidos quiméricos basados en somatostatina, polinucleótidos usados para codificar para los polipéptidos, los métodos para aislar y producir los polipéptidos y los usos de los mismos. Además, se proporcionan adyuvantes de bajo costo para respuesta inmunogénica mejorada. Se incluyen vacunas que incluyen tanto polipéptidos quiméricos basados en somatostatina y nuevos adyuvantes, útiles en facilitar la productividad de animales de granja.

Description

PROTEINA DE FUSION DE SOMATOSTATINA DEFICIENTE EN CLO ANFENICOL-ACETIL-TRANSFERASA Y USOS DE LA MISMA Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos quiméricos basados en somatostatina, a polinucleótidos usados para codificar los polipéptidos, a los medios para aislar y producir los polipéptidos, y a los usos de los mismos. La presente invención también se refiere a nuevos adyuvantes y composiciones de inmunización para inmunogenicidad mejorada de, por ejemplo, polipéptidos quiméricos basados en somatostatina de la invención, así como otros antígenos similares .

Antecedentes de la Invención La somatostatina (también conocida como hormona inhibidora de la hormona de crecimiento o GHIH) es una hormona peptídica producida en el hipotálamo, así como en ciertas porciones del sistema digestivo. En general, la somatostatina está comprendida en la regulación del sistema endocrino mediante interacciones con receptores de somatostatina, acoplados a proteína G. Esta cascada de señalización basada en somatostatina conduce a varias acciones extendidas a todo lo largo del cuerpo.

Pertinentes a los aspectos de la presente invención, se sabe que la somatostatina inhiben la liberación Ref. 216522 de la hormona de crecimiento y la hormona estimuladora de tiroides de la pituitaria anterior. (Patel YC y Srikant CB, Somatostatin and its receptors Adv Mol Cell Endocrinol, 1999. 343-73) . Otras hormonas inhibidas por la somatostatina incluyen insulina, glucagón, secretina, gastrina, pepsina, maletina, etc. (Patel YC y Srikant CB Somatostatin and its receptors Adv Mol Cell Endocrinol, 1999. 3 43-73). La capacidad de la somatostatina para regular tantos factores/hormonas como sean necesarios para el crecimiento y la utilización de alimento hacen de la somatostatina un objetivo central para controlar el crecimiento animal en el campo de la zootecnia, es decir, la inhibición de la somatostatina da por resultado niveles incrementados de hormona de crecimiento que está presente en un animal objetivo y de este modo da por resultado animales con capacidad mejorada para producir leche, para proporcionar mayores cantidades de carne, etcétera.

En particular, se ha reconocido la inmunización de animales a la somatostatina como un medio para neutralizar la somatostatina en un animal objetivo y para remover de este modo los efectos inhibitorios normales de la somatostatina en varios aspectos de la productividad del animal, por ejemplo, producción de leche en una vaca lechera. Reichlin S., ed., 1987, Somatostatin, Basic and Clinical Status, Plenum Press, New York (páginas 3-50, 121-136, 146-156, 169-182, 221-228, 267-274) Spencer G.S., 1985, Hormonal systems regulating growth, review, Livestock Production Science, 12, 31-46. De manera importante, estos procedimientos de inmunización basados en somatostatina evitan el uso directo de hormonas anabólicas, por ejemplo, hormona de crecimiento y similares, en el animal y permiten pequeños cambios en la concentración de los factores anabólicos endógenos y de este modo productos alimenticios ecológicamente puros.

Se sabe que la somatostatina tiene una relativamente corta vida en sangre. A fin de mejorar los efectos inmunológicos de la somatostatina, se han desarrollado protocolos de inmunización para mejorar la vida media de las proteínas al conjugar la somatostatina a las proteínas portadoras objetivo. Estas proteínas conjugadas de somatostatina se diseñan para tener vida media incrementada y antigenicidad incrementada en la sangre y por lo tanto para proporcionar beneficios mejorados (especialmente en vista del costo de preparar la somatostatina) . Por ejemplo, se describen proteínas quiméricas de somatostatina en la patente de los Estados Unidos No. 6,316,004, (y Patente Europea correspondiente EP0645454) , donde se muestran varias proteínas conjugadas que contienen somatostatina como que tienen antigenicidad incrementada y función incrementada con respecto a la productividad de animales de granja en comparación a otros procedimientos convencionales basados en hormonas anabólicas o inmunización.

Sin embargo, para mejorar la productividad completa y la oportunidad en el campo de zootecnia, se necesitan procedimientos y composiciones de inmunización, basados en mayor antigenicidad y menor dosis. La presente invención se refiere a la provisión de estos procedimientos, composiciones y compuestos de inmunización, basados en somatostatiná, más antigénicos y funcionalmente activos.

Contra este fondo se proporciona la siguiente descripción.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona nuevos polipéptidos , y los polinucleótidos que codifican para los mismos, que tienen inmunogenicidad mejorada de somatostatiná. Los polipéptidos de la invención incluyen somatostatiná- 14 fusionada a una proteína de cloranfenicol-acetil-transferasa sustancialmente inactivada mediante un ligador funcionalmente optimizado. Los polipéptidos quimérico de la invención proporcionan materiales altamente efectivos y de bajo costo para su uso en el campo de la zootecnia, como se describe en más detalle más adelante. Las modalidades de la invención incluyen las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico como se define en SEQ ID NOs : 1-14.

La presente invención también proporciona procedimientos de producción y purificación para producir los polipéptidos quiméricos de la invención en un estado libre de endotoxinas y altamente funcional. Los polipéptidos libres de endotoxinas proporcionan una ventaja sustancial e inesperada para su uso en ciertos animales objetivo, donde pequeñas cantidades de endotoxina, típicamente aunque ventajosas para producir una respuesta inmunogénica conducen realmente a una desventaja funcional significativa. Esto es particularmente el caso cuando los polipéptidos de la invención se usan para inmunizar vacas lecheras criadas y reproducidas en los Estados Unidos. Además, debido a que los polipéptidos quiméricos de la invención muestran función mejorada en comparación a materiales convencionales, se usan menos y más pequeñas dosis para inmunizar los animales objetivo. Esta disminución en las cantidades requeridas también proporciona una reducción resultante de endotoxina en las vacunas de la invención. La combinación de aislamiento libre de endotoxina y cantidad más pequeña de uso de los polipéptidos quiméricos de la invención permite vacunas sustancialmente libres de endotoxina para que se usen en la presente .

La invención también proporciona composiciones adyuvantes que tienen función mejorada y seguridad mejorada en comparación a materiales adyuvantes convencionales. Los adyuvantes de la presente no contienen materiales derivados de animal y están libres de la mayoría de los carcinógenos químicos conocidos, por ejemplo, benceno y otros materiales similares. Las composiciones adyuvantes de la presente han probado ser inesperadamente efectivas en producir respuesta inmunitaria cuando se combinan con los antígenos objetivo.

La invención proporciona además vacunas que contienen los polipéptidos quiméricos de la invención con composiciones adyuvantes de la invención. Las vacunas en la presente se usan para inducir respuestas inmunitarias en mamíferos vacunados y animales objetivo de granja como, por ejemplo, aves. Los animales ilustrativos de granja para la presente incluyen: vacas lecheras, cerdos, ovejas, cabras, pavos, conejos y terneros. En algunos aspectos, los polipéptidos de la invención se preparan y purifican con poca o ninguna endotoxina asociadas. Estas vacunas se han optimizado para producir reacciones inmunogénicas seguras y mejoradas en el animal objetivo.

La invención incluye además métodos para vacunar mamíferos y aves objetivo usando las vacunas de la invención. Se proporcionan métodos ilustrativos para la vacunación de vacas lecheras para mejorar la producción de leche de una manera segura (tanto para el animal como para el usuario final), efectiva en el costo y altamente útil. Otros métodos ilustrativos incluyen vacunación de cerditos, ovejas, pavos, cabras, conejos o terneros para mejorar la producción de carne (y particularmente carne magra) en un animal objetivo de una manera segura y efectiva en el costo.

Estas y varias características y ventajas diferentes de la invención serán evidentes a partir de una lectura de la siguiente descripción detallada y de una revisión de las reivindicaciones anexas.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una vista esquemática ilustrativa de un plásmido pET30b CatSom de acuerdo con las modalidades de la presente invención. El plásmido incluye un marcador de resistencia a Canamicina, un operador Lac, promotor T7, secuencia codificadora CAT, todos de acuerdo con las modalidades de la invención, también se incluyen una región ligadora de acuerdo con la invención de la presente y una región codificadora de somatostatina de acuerdo con la invención.

La Figura 2 es un SDS-PAGE teñido ilustrativo que muestra una banda de 28KD que corresponde al tamaño previsto de un polipéptido de somatostatina, defectuosa en CAT optimizado por codón de la invención. La senda 1 es LB + IPTG, reducido, la Senda 2 es LB, reducido, la Senda 3 es LB + IPTG y la Senda 4 es LB.

Breve Descripción de las Tablas Las Tablas 1 y 2 muestran la producción de leche en litros por día de ganado lechero (BSY) vacunado (usando las vacunas como se describe en los Ejemplos) y de control. Cada vaca tiene un número específico de identificación como se muestra en cada tabla.

Identificación de secuencias e identificadores de secuencia SEQ ID NO: 1 AGCKNFFWKTFTSC SEQ ID NO 15 GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACA TCCTGT SEQ ID NO: 2 (Hisl 92->Gly, Hisl 93->Gly): Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatató.tcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtttt ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt acggígaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag gttggtggtgCGgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag SEQ ID NO: 3: (Hisl92->Gly, Hisl93->Gly): Mekkitgyttvdisqwhikehfeafqsvaqctynqtvqldte vhpcytvfheqtetfsslwseyhddfftjflhiysqdvacygenlayf^ kyytqgdkvhnplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqq SEQ ID NO: 4 (Hisl 93->Gly) Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtttt ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgfltttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt acggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac gtggocaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag gttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag SEQ ID NO: 5 (1 Hisl93->Ala) Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaaga.ccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgltacaccgtttt ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt acggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag gttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag SEQ ID NO:6 (1 His+CAT wt) Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtttt ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt acggigaaaacctggcctatttcx;ctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac gtggccaalatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag gttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaactgcagcag SEQ ID NO: 7 (one H->G): Mekkitgyttvdisqwhxkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkl<-nkhk vhpcytvflieqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenl^^ kyytqgdkvlmplaiqvhgavcdgfhvgrmlnelqq SEQ ID NO: 8: (H->A) Mel&itgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqcty^^ vhpcytvfheqtetfsslwseyhddftqflhiysqdvacygenlay^ kyytqgdkvlraplaiqvhaavcdgflivgnnlnel qq SEQ ID NO: 9 tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg SEQ ID NO: 10 welhrsgprprprprpefm SEQ ID NO: 1 1 we1hrsgp(rp)nefm donde ?>1 SEQ TD NO: 12 Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtttt ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt acggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag gttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagtgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgc cctcgcccacgtccggaattcatggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgc SEQ I NO: 13 mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqrt hpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacyg^ ytqgdkvlm laiqvggavcdgfllvgmlnelqqweltasg f fr^ SEQ ID NO: 14 mekkitgyttvdisqwtokehfeafqsvaqctynqtvqldit^^ hpcytvfheqtetfsslwseyhddf iflhiysqdvacy^ yytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgnnlnelqqwelhre Descripción Detallada de la Invención Las modalidades de la presente invención proporcionan polipéptidos quiméricos, y construcciones de ácido nucleico que codifican para los mismos, que tienen inmunogenicidad mejorada de somatostatina. Las modalidades de la presente incluyen métodos para preparar la proteína quimérica, así como métodos para usar la proteína quimérica para incrementar cierta productividad de animales de granja, objetivo, y especialmente para incrementar la producción de leche en vacas lecheras y la producción de carne de ganado, cerdos, ovejas, conejos, cabras, terneros, etcétera.

Las modalidades de la presente invención también incluye nuevos adyuvantes para el uso con las proteínas quiméricas de la invención para inmunogenicidad mejorada en un animal objetivo, seguridad mejorada para el animal objetivo que se vacuna y seguridad mejorada para un usuario del animal objetivo, es decir, el consumidor del animal vacunado o el consumidor del de un producto del animal vacunado.

En un aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica de somatostatina diseñada para inmunogenicidad mejorada de somatostatina. Las modalidades de las proteínas quiméricas de somatostatina incluyen una secuencia de aminoácidos de somatostatina-14 enlazada por una secuencia ligadora a una proteína truncada de cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT) sustancialmente inactivada. En algunos casos, el ligador (también referido en la presente como un separador) se ha optimizado para mejorar la producción del polipéptido quimérico en células hospedadoras objetivo. En otros casos, se proporcionan métodos para producir y aislar estas cantidades mejoradas de proteína quimérica en un estado sustancialmente libre de endotoxina.

En otro aspecto, la invención proporciona nuevas composiciones adyuvantes (que no contienen ninguna proteína derivada de animal ni producto químico tal como benceno) y vacunas que incorporan las proteínas quiméricas de somatostatina de la invención. Las modalidades incluyen adyuvante inesperadamente efectivo/proteína quimérica de somatostatina (típicamente, libre de forma sustancial de endotoxina) , es decir, nuevas vacunas, composiciones para inducir antigenicidad en animales de granja objetivo, vacunados. En algunas modalidades, el animal de granja objetivo, es una vaca lechera, ternero, cerdo, cabra, etcétera. Se señala que aunque los adyuvantes de la presente invención se describen en combinación con las proteínas quiméricas de somatostatina de la presente, se contempla que los adyuvantes inventivos de la presente se pueden usar con otras vacunas y en una variedad de animales objetivo, por ejemplo, humanos, cerdos, perros, gatos, etcétera.

En otros aspectos, se proporcionan métodos para vacunar a animales de granja objetivo, usando tan poco' como una dosis de esta nueva vacuna para obtener productividad mejorada y, en particular, producción mejorada de leche en vacas lecheras y otros animales de granja similares. Estos procedimientos de dosis mejorada (menor número de vacunaciones y más pequeña concentración de somatostatina quimérica) proporcionan efectividad en tiempo y menores costos, que cuando se extienden a la industria lechera representan una mejora significativa en la productividad de animales de granja. También, los métodos de la presente evitan el uso de terapia con hormona de crecimiento, recombinante, que es una cuestión dentro de la industria de cuidado de la salud, es decir, tanto para el animal de granja, objetivo, como para el usuario final y ambiente donde se libera la excreción de la hormona de crecimiento, recombinante, en el suministro de agua subterránea.

Definiciones Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar el entendimiento de ciertos términos usados frecuentemente en la presente y no se proponen para el alcance de la presente descripción.

El término "aminoácido" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos que se presentan de forma natural, así como cualquier secuencia modificada de de aminoácidos . Las modificaciones pueden incluir procesos naturales tal como procesamiento post-transduccional, o pueden incluir modificaciones químicas que se conocen en la técnica. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a: fosforilación, ubiquitinación, acetilación, amidación, glicosilación, unión covalente de flavina, ADP-ribosilación, reticulación, yodación metilación, y similares.

Los términos "polipéptido quimérico" o proteína de fusión se refieren a un primer polipéptido que tiene unido a un segundo polipéptido heterólogo, tal que el primero y el segundo polipéptidos se expresan en cuadro. Frecuentemente, se pueden unir los dos polipéptidos mediante un segmento ligador o separador para optimizar la expresión y función de los polipéptidos quiméricos de la invención.

El término "endotoxina" se refiere a toxinas asociadas en las paredes celulares de bacterias gran negativas . En algunos casos, las toxinas son componentes de lipopolisacárido de membranas bacterianas, componentes de la membrana exterior de las paredes celulares de bacterias gram negativas.

El término "célula hospedadora" o "células hospedadoras" se refiere a células establecidas en cultivo ex vivo. Es una característica de las células hospedadoras analizadas en la presente que son capaces de expresar las proteínas quiméricas de la invención. Los ejemplos de células hospedadoras adecuadas útiles para los aspectos de la invención incluyen, pero no se limitan a, células bacterias, de levadura, insectiles y mamíferas. Los ejemplos específicos de estas células incluyen células insectiles SF9 (Summers y Smith, 1987, Texas Agriculture Experiment Station Bulletin, página 555) , células E.Coli (BL21(DE3), Novagen) , células de levadura (Pichia Pastoris, Invitrogen) y células de hígado humano (Hep G2 (ATCC HB8065) .

El término "secuencia de ácido nucleico" se refiere al orden de la secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico . El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de una cadena de polipéptido. La secuencia de desoxirribonucleótido codifica para la secuencia de aminoácidos .

Los términos "proteína" , "péptido" y "polipéptido" se usan de manera indistinta para denotar un polímero de aminoácido o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácido interactuantes o unidos.

El término "sustancialmente" se refiere a un "gran grado", por ejemplo, sustancialmente removido significa que al menos 75%, más típicamente al menos 80%, 85%, 90%, 95% y más típicamente 96%, 97%, 98%, 99% del material objetivo se remueve; sustancialmente inactivo significa que está inactivo al menos 75%, más típicamente 80%, 85%, 90%, 95% y más típicamente 96%, 97%, 98%, 99% de una enzima. Como tal, una enzima de CAT sustancialmente inactiva es una que tiene 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de su actividad removida. (La Actividad de CAT se puede determinar usando ensayos funcionales conocidos, por ejemplo, unión de n-Butiril-Coenzima A a cloranfenicol radiomarcado y medición subsiguiente por Conteo de Esintilación Líquida (LCS) , al determinar la cantidad de marca radiactiva transferida desde el [14Cacetil CoA a cloranfenicol por cromatografía en capa delgada (ver Molecular Cloning: A Laboratory Model, 3- edición, J Sambrook y DW Russell, 2001. Cold Spring Harbor Press] u otras ensayos conocidas o similares) .

El término "vector" se usa en referencia a moléculas de ácido nucleico que transfieren segmentos de DNA de una célula a otra célula. El término "vehículo" se usa algunas veces de forma indistinta con vector. Dos tipos comunes de vectores son plásmidos y vectores virales .

Somatostatina Varios estudios han mostrado que los animales inmunizados con somatostatina tienen una ganancia diaria promedio de 10-20%, un apetito reducido por 9% y un incremento por 11% en la eficiencia de utilización de alimento. Los animales inmunizados con somatostatina, y también su descendencia, tienen proporciones correctas, y la distribución del peso de los animales entre los músculos, huesos y grasa es la misma como en los animales de control (ver Reichlin, 1987) . Por lo tanto, la inmunización con somatostatina proporciona una manera útil y segura para mejorar la productividad del animal objetivo. Esto es particularmente el caso en comparación con el uso de hormona de crecimiento, recombinante, uso que ha formulado cuestiones con respecto a la hormona en leche o carne de los animales tratados o por la seguridad de los animales mismos o por la acumulación de la hormona en el ecosistema, particularmente en el suministro de agua subterránea.

La somatostatina-14 es un tetradecapéptido biológicamente activo, producido en el hipotálamo y tracto gastrointestinal. La secuencia de aminoácidos del tetradecapéptido es AGCK FFWKTFTSC (SEQ ID NO: 1) . La secuencia de somatostatina-14 está altamente conservada entre los mamíferos (Lin XW et al. Evolution of neuroendocrine peptide systems: gonadotropin-releasing hormone and somatostatin. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol. 1998 119(3): 375-88) . El tetradecapéptido se codificada por una secuencia de ácido nucleico GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT (SEQ ID NO: la) (se señala que se pueden usar otras secuencias de ácido nucleico para codificar para SEQ ID NO: 1; sin embargo, SEQ ID NO: la se proporciona para propósitos ilustrativos) .

Se conoce que la somatostatina-14 tiene un fuerte efecto inhibitorio en un gran número de hormonas comprendidas en el crecimiento y utilización de alimento en animales. Como se describe anteriormente en la patente de los Estados Unidos No. 6,316,004 (incorporada en la presente como referencia para todos los usos) , la somatostatina-14 y las versiones quiméricas de la somatostatina se pueden usar en la inmunización de animales para incrementar el peso diario y donde es apropiado, para la producción de leche. Estos procedimientos de inmunización se realizaron con adyuvantes convencionales y no utilizan los materiales basados en somatostatina de esta invención. Se señala que el tratamiento de los animales objetivo con anticuerpos anti-somatostatina ha probado ser excesivamente costoso y funcionalmente no dramático, eliminando de este modo el tratamiento directo con anticuerpos como no práctico. Muromtsev G.S., et al., 1990, Basics of agricultural biotechnology, Agropromizdat, Moscow, páginas 102-106. Un aspecto de la presente invención se basa en el concepto que los anticuerpos anti-somatostatina formados por las composiciones y métodos descritos en la presente atenúan pero no eliminan completamente las acciones principalmente inhibidoras de la somatostatina en el animal objetivo. Este proceso produce un incremento natural y proporcional en el crecimiento y productividad en animales objetivo inmunizados.

Como tal, los aspectos de la presente invención facilitan la inmunización basada en somatostatina al proporcionar materiales altamente inmunogénicos para el uso en la inmunización de animales objetivo. Estos compuestos de inmunización basados en somatostatina se han optimizado para la expresión y antigenicidad. En algunas modalidades, se expresa somatostatina-14 como un polipéptido quimérico de somatostatina, deficiente en CAT optimizado por codón. Estos materiales proporcionan una mejora inesperada sobre otras vacunas basadas en inmunización.

Nuevas construcciones de somatostatina, deficientes en CAT optimizadas por codón Un aspecto de la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para proteínas quiméricas que tienen actividad inmunogénica optimizada de somatostatina. En particular, las modalidades de la invención incluyen nuevas construcciones de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión de CAT que tienen actividad inmunogénica para somatostatina. Estos polipéptidos se han identificado para actividad funcional óptima en procedimientos de inmunización.

En una modalidad, se proporciona una construcción que tiene una vista esquemática como se muestra en la Figura para codificar para los polipéptidos quiméricos de la invención. Las construcciones de ácido nucleico de la invención codifican en general para una enzima de CAT inactiva sin 10 aminoácidos C-terminales, e incluyen uno o dos aminoácidos reemplazados con histidina. La inactivación sustancial de CAT evita reacciones adversas a CAT en un animal objetivo inyectado (y de este modo la evasión de la resistencia a CAT) . Se señala que el cloranfenicol es un antibiótico comúnmente usado en la industria del ganado y la resistencia a cloranfenicol en el ganado será adversa a la seguridad de los animales vacunados usando los materiales de la invención. Como tales, las construcciones que tienen una CAT inactivada tienen la inmunogenicidad de CAT sin los efectos secundarios adversos de resistencia en animales vacunados (una cuestión problemática de seguridad para los animales) .

La enzima de CAT se inactiva al remover el grupo imidazol de Hisl93 (Hisl95 en la variante de CAT m canónica, ver Lewendon et al, más adelante) . En otra modalidad, la enzima de CAT se inactiva al remover los grupos imidazol tanto de Hisl93 como de Hisl92 cercano (respectivamente Hisl95 y Hisl94 para CATin) . La remoción del grupo imidazol Hisl93 (Hisl95 en CATm) esencial del sitio activo de CAT y el reemplazo con una alanina, glicina u otro aminoácido similar da por resultado la inactivación sustancial de la enzima de CAT (Lewendon A et al. (1994) . Replacement of catalytic histidine-195 of chloramphenicol acetyl transferase: evidence for a general base role for glutamate. Biochemistry. 33 (7) : 1944-50) . Finalmente, las modalidades de la presente también pueden incluir inactivación de la enzima de CAT a través de la remoción del grupo imidazol de solo Hisl92 (Hisl94 para CTm) . Como para Hisl93, el reemplazo puede ser con una alanina, glicina u otro aminoácido similar.

En algunos aspectos, el uno o más aminoácidos de histidina reemplazados se codifican por ácidos nucleicos localizados en las posiciones números 574-576 y 577-579 de SEQ ID NO: 2 (que corresponde a los aminoácidos números 192 y 193 en SEQ ID NO: 3) . En algunas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de la invención incluyen SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Las proteínas quiméricas de la invención que incluyen las construcciones reemplazadas de histidina de la presente proporcionan proteínas altamente inmunogénicas con poca o ninguna actividad de CAT, una mejora significativa con respecto a la técnica existente. Las modalidades de la enzima de CAT sustancialmente inactivada, se unen a un polipéptido de somatostatina de la invención. Esta unión se puede hacer directamente o con un ligador (como se describe más completamente más adelante) .

La inactivación de sitios objetivo (Hisl92 y/o Hisl93) se puede lograr mediante cualquier número de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica incluyendo mutagénesis dirigida al sitio y montaje sintético de genes. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para histidina 193 se modifica para codificar para una alanina, glicina u otro aminoácido similar. En otra modalidad, las secuencias de ácido nucleico que codifican para histidina 192 se modifican para codificar para alanina, glicina u otros aminoácidos similares. Los reemplazos típicos de combinación para el polipéptido quimérico de 192 y 193 incluyen: alanina; alanina; alanina; glicina; glicina; alanina y glicina, glicina.

Las modalidades de la presente invención también incluyen las secuencias de aminoácidos para polipéptidos deficientes de CAT de la invención, que incluyen la secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NOS : 7, 8 y 3 (que corresponden a his->gly a 193, his->ala a 193 y his->gly en tanto 192 como 193) .

Como se muestra en la Figura 1, la enzima de CAT sustancialmente no activa se puede enlazar a somatostatina-14 mediante un separador de longitud variable. El separador que se requiere para asegurar la presentación de la somatostatina codificada en una superficie global. Las modalidades de los separadores de la presente proporcionadas para resistencia óptima a proteasas y exposición óptima a epítopos y la inclusión en polipéptidos quiméricos de la invención han mostrado mejora inesperada con respecto a construcciones que no tienen las secuencias ligadoras de la presente invención.

Por lo tanto, las modalidades de los separadores, se han optimizado en la longitud y en composición para asegurar la expresión de somatostatina defectuosa en CAT en varios microorganismos, y, en particular en E. Coli. Las construcciones originales como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,316,004, incluyeron un separador que tiene codones raros de E. Coli y requirieron la co-expresión de ARNt raros de un segundo plásmido o plásmido auxiliar. Las modalidades de separadores de la presente remueven estos codones raros de E. Coli y remueve de este modo la necesidad de un segundo plásmido auxiliar, una mejora con respecto a la tecnología anterior.

En modalidades típicas, el separador tiene una secuencia de ácido nucleico de tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg (SEQ ID NO: 9) . Un ejemplo de un separador de la invención tiene una secuencia de aminoácidos de welhrsgprprprprpefm (SEQ ID NO: 10) . Una secuencia típica de aminoácidos para un separador de la invención es welhrsg (rp) nefm donde n> 1 (SEQ ID NO: 11) . Como se señala anteriormente, estas nuevas secuencias de separadores proporcionan resistencia mejorada a proteasa (permitiendo de esto modo producción incrementada en comparación a construcciones descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 6,316,004) y exposición óptima a somatostatina-14. La combinación de somatostatina-14 unida a una enzima de CAT sustancialmente inactivada (construcciones reemplazadas de histidina) por un ligador óptimamente configurado mostraron mejora inesperada y sorprendente con respecto a otros materiales convencionales cuando se usaron para inmunizar animales objetivo para productividad mejorada.

Aunque no como óptimo en función, otras secuencias ligadoras de longitud variable se puede usar para unir la somatostain-14 a la enzima de CAT sustancialmente inactiva. Además, se contempla que una fusión directa de la somatostain-14 a la enzima de CAT sustancialmente inactiva también se puede usar en la presente, y se considera que está dentro del alcance de la presente invención.

Vectores y células hospedadoras La presente invención también se refiere a vectores que comprenden las moléculas de polinucleótido de la invención, así como células hospedadoras transformadas con estos vectores. Cualquiera de las moléculas de polinucleótido de la invención se puede unir a un vector, que incluyen en general un marcador de seleccionable y un origen de replicación, para el hospedador de propagación de interés. Las células hospedadoras se manejan genéticamente para incluir estos vectores y expresan de este modo los polipéptidos de la invención. En general, los vectores incluyen en la presente moléculas de polinucleótidos de la invención operablemente enlazadas a secuencias reguladoras transcripcionales o transduccionales, adecuadas, tal como aquellas para células hospedadoras microbianas o virales. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores o intensificadores, sitios de unión ribosomal a mRNA, y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos se enlazan de manera operable cuando las secuencias reguladoras se refieren en la presente de manera funcional al polipéptido quimérico que codifica para los polinucleótidos de la invención.

Los vehículos típicos incluyen plásmidos, vehículos de transposición de levadura, baculovirus, adenovirus inactivados y similares. En una modalidad el vehículo es un plásmido pET30b CatSom modificado (ver Figura 1) . Las células hospedadoras objetivo para el uso en la presente incluyen hospedadores bacterianos, por ejemplo, E. Coli., levadura, células insectiles SF-9, células mamíferas, células vegetales y similares.

En una modalidad, las secuencias reguladoras incluyen un promotor T7lac, CAT, Trp o T5 para la expresión de los polipéptidos quiméricos de la invención en E. coli u otros microbios similares . Estas secuencias reguladoras se conocen en la técnica y se usan bajo condiciones apropiadas y conocidas.

Donde para la expresión se utilizan células de plantas verdes, genéricamente modificadas, se pueden utilizar sistemas como el desarrollado por Planet Biotechnology y otros .

Se han construido varios plásmidos de la invención para la expresión de polipéptidos quiméricos de la invención a través de la utilización de secuencias reguladoras objetivo. Los plásmidos ilustrativos pueden incluir un promotor T71ac (ver Figura 1) .

Las células hospedadoras para la expresión de polipéptidos quiméricos objetivo incluyen procariotas, levadura y células eucarióticas superiores . Los hospedadores procarióticos ilustrativos incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella así como de los géneros Pseudo onas y Streptomyces. En modalidades típicas la célula hospedadora es de los géneros Escherichia y puede ser Escherichia Coli (E. Coli) .

Como se muestra en los ejemplos posteriores, las construcciones de la invención proporcionan la expresión óptima de somatostatina deficiente de CAT bajo una variedad de condiciones. Estas construcciones son particularmente eficientes para la expresión en hospedadores procarióticos y en particular, bacterias de los géneros Escherichia. Se señala que también se pueden usar varios sistemas de expresión vegetal en el contexto de la presente invención, usando típicamente Agrobacterium trameficies.

Purificación de Proteína de Fusión Libre de Endotoxina Los aspectos de la presente invención incluyen el uso de somatostatina deficiente de CAT optimizada por condón libre de endotoxina para el uso en la vacunación de animales y, en particular para la vacunación de animales de granja, que en algunos casos son vacas lecheras reproducidas en los Estados Unidos. Los materiales libres de endotoxina son particularmente importantes para ganado reproducido y criado en los Estados Unidos (ver, por ejemplo, Drackley, JK 2004. Physiological adaptations in transition dairy cows. Páginas 74-87 in Proc. Minnesota Dairy Herd Health Conf., St Paul, MN. University of Minnesota, St. Paul) .

En una modalidad, las proteínas quiméricas, inmunogénicas que comprenden somatostatina, de la invención, se preparan al transformar células objetivo con vehículos apropiados que contienen somatostatina. Como se señala anteriormente, los vehículos para el uso en la presente incluyen sistemas conocidos de plásmido y vector adecuados para la expresión en las células objetivo, seleccionadas.

En un aspecto de la invención, las proteínas quiméricas, inmunogénicas que comprenden somatostatina se expresan en células hospedadoras objetivo. La expresión de las proteínas quiméricas se realiza usando secuencias reguladoras objetivo. En algunos aspectos los polipéptidos quiméricos se han optimizado (especialmente con respecto a secuencias separadoras descritas en la presente) para la expresión en E. Coli.

La proteína quimérica entonces se puede purificar de acuerdo con tecnologías conocidas de purificación de proteínas, incluyendo, por ejemplo, lisis por lisozimas, centrifugación diferencial de anticuerpos de inclusión, cromatografía de tamiz y similares. Se pueden llevar a cabo procedimientos de repliegue en cloruro de guanidina y urea a pH alcalino seguido por diálisis y liofilización.

En una modalidad, las células de E. coli se transforman usando el plásmido -pET30b CatSom que contiene somatostatina deficiente de CAT optimizado por codón; el pET30b CatSom que tiene secuencias reguladoras base de E. coli apropiadas, para la expresión. En algunos casos, la fermentación de aproximadamente diez litros de estas células proporciona al menos 500 gramos y en algunos casos 600 gramos de biomasa total, produciendo cerca de 4 - 6 gramos de proteína total. Se estima de la tinción con azul de Coomassie y plata que hasta la mitad de la proteína puede ser proteína quimérica (ver Ejemplo 2 y Figura 2) .

En algunas modalidades de la presente, la proteína quimérica de la invención se purifica de células hospedadoras transformadas en un estado sus ancialmente libre de endotoxina. El darse cuenta que la endotoxina, y en particular múltiples exposiciones a endotoxina, en algunos animales, y en particular vacas lecheras, da por resultado animales sustancialmente comprometidos (mastitis y choque por endotoxina en vacas lecheras reproducidas y criadas en los Estados Unidos) fue un resultado inesperado y sorprendente que los presentes inventores obtuvieron. Este logro dio por resultado un intento de remover o disminuir la cantidad de dosis de endotoxina o el número de exposiciones en las vacunaciones de las vacas lecheras. Se señala que este efecto basado en endotoxina se efectúa mucho menos en vacas reproducidas y criadas en Rusia y en otros países puesto que el ganado lechero es descendiente de una diferente raza de vacas, Holstein Association, 1 Holstein Place, Brattleboro, Vermont 05302-0808. Este hallazgo en las vacas lecheras de Estados Unidos en general es contrario a la expectación que una vacuna debe incluir alguna poca cantidad de endotoxina para ayudar a aumentar al máximo la respuesta inmunitaria de un animal, como es el caso de vacas lecheras cuando se vacunan con somatostatina en algunos otros mercados Europeos (ver patente de los Estados Unidos No. 6,316,004).

Como tales, algunas modalidades de la presente se refieren a la producción de proteínas quiméricas sustancialmente libres de endotoxina para el uso en vacunas, y especialmente para el uso en vacunas usadas en la industria del ganado y usadas en la industria del ganado dentro de los Estados Unidos. En ciertas modalidades, los niveles de endotoxina están en o por abajo de 1 EU/ml y en otras modalidades, los niveles de endotoxina se eliminan de manera sustancial, es decir, los polipéptidos quiméricos de la invención están sustancialmente libres de endotoxina.

En una modalidad, el IB recuperado de células hospedadoras lisadas se lavó múltiples veces usando una solución de lavado desprovista de endotoxina, es decir, solución o agua libre de endotoxina. El granulo de IP recuperado se puede lavar opcionalmente hasta que los niveles de endotoxinas estén por abajo de aproximadamente 1 EU/ml (se pueden realizar pruebas de endotoxina usando uno o más ensayos conocidos, incluyendo equipos de pruebas comercialmente disponibles de MP Biochemicasl, Charles River, etcétera) . En algunas modalidades, la solución de lavado está libre de endotoxinas e incluye uno o más inhibidores de proteína proteolítica, por ejemplo, fluoruro fenilmetanosulfonilo (PMSF) , fluoruro de 4- (2-aminoetil) -bencenosulfonilo (AEBSF), etcétera. En algunas modalidades, la solución de lavado en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que tiene una cantidad efectiva inhibitoria de PMSF, AEBSF o una combinación tanto de PMSF como de AEBSF.

En algunos aspectos, se pueden tratar los gránulos sustancialmente libres de endotoxina con una solución de desplegado de protelna a pH 12.5 que contiene urea y replegar en una solución de replegado de proteína que contiene una molaridad reducida de urea con arginina, glicerol y/o sacarosa. La concentración de proteína quimérica purificada se modifica para estar entre 1 y 3 mg/ml y típicamente cerca de 1.4 a 1.8 mg/ml. En algunos casos, se proporciona proteína quimérica sustancialmente libre de endotoxina a formulaciones de vacuna a aproximadamente 1.5 a 5 mg/2ml de dosis y más típicamente de 2.0 a 3,5 mg/2ml de dosis.

Se contempla que otros procedimientos de remoción de endotoxinas están dentro del alcance de la presente invención e incluyen, por ejemplo, columna de remoción de endotoxina por intercambio iónico, comercialmente disponibles, columnas hidrófobas, etcétera (ver, por ejemplo columnas Mustang E o G (Millipore) ) .

Adyuvante de Respuesta Inmunitaria Mejorada Las modalidades de la invención proporcionan nuevos adyuvantes para la inducción mejorada en inmunidad humoral. Estos adyuvantes proporcionan una mejora significativa con respecto a materiales convencionales para la inducción de una respuesta humoral. Los adyuvantes de la presente se pueden usar con numerosas vacunas, pero se muestran en los ejemplos en el uso con polipéptidos de la invención para la vacunación en vacas lecheras, cerdos o terneros.

De forma importante todos los componentes de los adyuvantes de la presente son de origen no animal, eliminando de este modo contaminación cruzada potencial de animales vacunados de componentes adyuvantes potencialmente contaminados. Por ejemplo, las modalidades de la presente pueden utilizar Tween 80 libre de origen animal. Esto es particularmente importante cuando el animal objetivo es una vaca lechera, debido a cuestiones con respecto a la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) u otras dolencias bovinas similares. Se señala que estas cuestiones son igualmente apropiadas para tratamiento humano donde el adyuvante de origen no mamífero proporciona beneficios significativos de seguridad. Adicionalmente, las modalidades de adyuvante de la presente están libres de benceno y otros compuestos carcinogénicos similares. Estas modalidades proporcionan un beneficio de seguridad no disponible en la mayoría de los compuestos adyuvantes convencionales. Por ejemplo, las modalidades de la presente pueden utilizar Carbopol"11 974P o ácido policíclico libre de benceno.

En una modalidad, el adyuvante inmunológico comprende una emulsión de aceite en agua en combinación con antígenos seleccionados, mezclados dentro de una premezcla de emulsión.

Las emulsiones ilustrativas de aceite en agua para el uso en la presente incluyen combinaciones de aceite mineral, Tween 80, Span 85 y polímeros objetivo (ácido Poliacrílico libre de benceno) . En algunos casos, el polímero objetivo se selecciona del grupo que consiste de Homopolímero de Carbómero Tipo B. Las emulsiones típicas de aceite-agua comprenden de aproximadamente 8-10% (v/v) , de 0.003 a 0.004% de Tween 80 (v/v) , de 0.007 a 0.008 Span 85 (v/v) y de 0.04 a 0.06% de polímero (p/v) .

Las premezclas ilustrativas de emulsión de la invención están compuestas de un polímero de alto peso molecular, agente tensoactivo y emulsionador en una base aceite-acuosa de aproximadamente 50%. Los polímeros de alto peso molecular para el uso en la presente incluyen ácidos acrílieos reticulados con éteres alílieos de pentaeritritol . En algunos casos, los polímeros de alto peso molecular tienen una viscosidad de Brookfield RVT de entre aproximadamente 29.000 y 40.000, por ejemplo, Carbopol"11974P (Noveon, Inc) .

Método para la Obtener Respuesta Inmunitaria Optimizada en Vacas Lecheras u otros Animales de Granja, Objetivo De acuerdo con las composiciones y métodos de la presente invención, las composiciones inmunogénicas descritas en. la presente (construcciones de somatostatina deficientes de CAT optimizadas por codón, libres de endotoxina) se combinan con nuevos adyuvantes, como se describe anteriormente, para proporcionar las vacunas de la invención. En una modalidad, se administran construcciones de somatostatina deficientes de CAT optimizadas por codón, libres de endotoxinas a una dosis total de 2.98 mg/2ml (de lo cual de 5% y 25% es adyuvante (v/v) , más típicamente de 10% a 20% es adyuvante y más típicamente cerca de 20% es adyuvante) . Se señala que se contemplan otros adyuvantes convencionales para estar dentro del alcance de la invención y se puede usar con las construcciones de somatostatina deficientes de CAT optimizadas por codón de la invención, sin embargo, se han mostrado resultados óptimos cuando los nuevos adyuvantes de la presente se usan en esta capacidad.

El propósito de las nuevas construcciones de somatostatina y de adyuvante es incrementar la productividad de un animal objetivo, típicamente un animal de granja, y más típicamente una vaca lechera, ternero, oveja, cerdo o cabra.

La preparación se inyecta de manera intramuscular o subcutáneamente, de manera preferente menos de 12 veces, de manera más preferente menos de 6, y en algunos casos tan poco como solo una vez. Cuando se requiere más de una inyección en un animal objetivo, es típico un intervalo de 14 a 28 días antes de la siguiente inyección. Como se señala anteriormente, las modalidades de la presenten evitan el uso de tratamiento con hormona recombinante a los animales objetivo, un beneficio principal en el campo de zootecnia (se ha asociado hormona de crecimiento recombinante, con comienzo temprano de pubertad en mujeres jóvenes y varias cuestiones ambientales que el estiércol del ganado tratado puede afectar de manera adversa tanto los ambientes del agua en superficie como subterránea) .

Se pueden administrar composiciones estériles de la invención por rutas subcutáneas o intramusculares. En casos típicos, el sitio de administración es el cuello o cola del animal objetivo, aunque se pueden utilizar otros sitios. Se señala que se debe usar un sitio tal que una reacción adversa no impida la capacidad del animal para moverse, comer, beber, etcétera.

Como se señala anteriormente, las vacunas de la presente, típicamente en un estado libre de endotoxina, que usan los nuevos adyuvantes descritos en la presente, proporcionan una mejora significativa en la producción de carne y leche de vacas lecheras, ganado, cerdos, etcétera. Estos tratamientos, sin embargo, no se acompañan por un incremento en el consumo de alimento.

Ejemplos Se proporcionan' los siguientes ejemplos para sólo propósitos ilustrativos y no se proponen que limiten el alcance de la invención.

Ejemplo l: Construcción de Proteina de Fusión de Somatostatina Defectuosa de CAT El presente ejemplo ilustra la producción de una proteína de fusión de somatostatina deficiente de CAT de acuerdo con las modalidades de la presente invención. Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido pET30b-Cat-Som para reemplazar Hisl92 y Hisl93 con residuos de glicina (después de la modificación: Glyl92 y Glyl93) . La inactivación de los residuos Hisl93 (y Hisl92) elimina la capacidad de la enzima de CAT para aceptar protones, proporcionando de este modo inactivación completa de la CAT.

El separador en el mismo pET30b-Cat-Som (que tiene reemplazos de His) ) se optimizó por codón para la expresión por E. coli en la ausencia de moléculas de AR t co-expresadas .

La construcción modificada de ácido nucleico de somatostatina defectuosa en CAT se muestra como SEQ ID NO: 12. La secuencia de proteína de fusión de somatostatina defectuosa en CAT se describe como SEQ ID NO: 13, que se compara a una proteína no modificada de fusión de somatostatina de CAT (SEQ ID NO: 14) . Ejemplo 2: La Proteína de Fusión de Somatostatina Defectuosa en CAT se Puede Expresar a Altos Niveles La construcción de somatostatina defectuosa CAT optimizada por codón como se describe en Ejemplo 1 se uso para expresar la proteína de fusión en células BL21(DE3). Se cultivaron células transformadas en LB y se incubaron con IPTG 0.4 mM durante aproximadamente tres horas. Un mililitro de células de una densidad de cultivo OD 0.7 se sedimentó y se calentó a 70°C durante diez minutos en 100 µ? de amortiguador de muestra de SDS . Se cargó una muestra de 40 µ? de extracto celular por senda para SDS-PAGE.

Como se muestra en la Figura 2, una banda de 28 KD que corresponde al tamaño previsto de una proteína de fusión de somatostatina defectuosa de CAT optimizada por codón fue visible en las sendas 1 (LB + IPTG, reducido) y 3 (LB + IPTG) después de la inducción con IPTG. No se vio expresión en las sendas 2 (LB, reducido) y 4 (LB) de control. Como se espera, no hubo diferencia en el tamaño de la proteína de fusión cuando se corre bajo condiciones normales o reductoras .

Ejemplo 3: Vacuna que Contiene Somatostatina Deficiente de CAT, Utilizada por Codón, Libre de Endotoxina Una vacuna ilustrativa de acuerdo con la presente invención : a. JH 14 (adyuvante) 24 mi aceite mineral Tween 80 a 0.1694 Span 85 a 0.1915% (v/v) Carbopol 974NP - 0.125% (p/v) Proteína Replegada de la invención 95.6 mi (2,96 mg / mi) - ver ejemplo 2 c. Solución salina amortiguada con fosfato 35.6 mi Antibacteriano/antifunguide 0.36 mol 120 mi Ejemplo 4: Péptidos Quiméricos Libres de Endotoxina/Adyuvantes Proporcionan Producción Incrementada de Leche Se identifico un grupo aleatorio de vacas lecheras (Cruza Holstein - reproducidas y criadas en Estados Unidos) , cada uno fue de 31 a 65 días después del parto {3- hasta 5- lactación) . Cada vaca se examinó y aw determinó que está en salud óptimo por un veterinario.

El peso promedio de la vaca del estudio fue aproximadamente de 453.59 kilogramos a 544.31 kilogramos (1.000 a 1.200 libras) . Se trataron seis vacas lactantes con 1.96 mg/proteína quimérica/2 mi de dosis en JH14. De manera alternativa, se proporcionaron 9 vacas lactantes un tratamiento convencional de rBST. Los tratamientos y el estudio de producción de leche se llevaron a cabo en una lechería de producción intensiva de leche a gran escala.

Las vacunaciones se llevaron a cabo en el día 0. Los anticuerpos anti-suero de SST y los niveles de suero de IGF-1 se probaron a las 4 semanas. La producción de leche y la identificación de la salud general de los animales se llevaron a cabo en un programa regular.

Seis vacas que se vacunaron usando composiciones inventivas descritas en la presente tienen una apariencia normal, sin reacción de endotoxina o retiro de alimento. Las seis vacas tienen una respuesta serológica positiva a SST con un título medio de 1 : 14. La producción de leche de las seis vacas se obtuvo con solo una vacunación (ver Tabla 1) , que muestra un incremento de rendimiento medio de 23.7%.

Nueve vacas tratadas usando inyecciones convencionales de rBST a 0 y 14 días con un incremento medio total en la productividad de leche de 2% (ver Tabla 2) .

Los datos de este ejemplo muestran la mejora drástica en la efectividad para usar las construcciones libres de endotoxina en combinación con los adyuvantes inventivos en vacas lecheras. Estos resultados se mejoran dramáticamente hacia la salud y productividad del animal en comparación a las vacas rechazadas dos veces con rBST.

Ejemplo 5: Péptidos Quiméricos Libres de Endotoxina/Adyuvantes Proporcionan Producción Incrementada de Carne en Cerditos de Cerdas Tratadas Se identificará un grupo aleatorio de cerdas, cada uno que está al menos 35-36 días antes parir los cerditos. Cada puerca se examinará y determinará que está en salud óptima por un veterinario. Las cerdas preñadas se inmunizarán dos veces usando las vacunas de la invención (ver Ejemplo 3) , una vez a los 35-36 días antes del parto, y una vez a los 8 días antes del parto. Un grupo de control de cerdas preñadas se mantendrá para propósitos de comparación (sin vacunaciones ni vacunación con solución salina estéril) .

Los cerditos paridos desde grupo vacunado tendrán mayor capacidad de supervivencia y será de un mayor tamaño promedio. Es el incremento en el tamaño del cerdito lo que mejora el porciento de capacidad de supervivencia, puesto que los cerditos más grandes son menos probables que se aparten de la teta de la cerda o puerca. Los cerditos tratados y de control se pesaron al día 21, día 30 y día 75. Las vacunaciones de la presente invención incrementarán el peso diario del cerdito por un promedio de 35% durante el transcurso del período de 75 días.

De forma importante, la capacidad de supervivencia y peso de los cerditos se incrementa a través del uso de las vacunas de la presente invención en la ausencia de hormona de crecimiento, recombinante. Esto es una mejora significativa con respecto a la terapia de hormona recombinante.

Ejemplo 6: Péptido Quimérico Libre de Endotoxina/Adyuvantes Proporcionan Producción Incrementada de Carne en Terneros Tratados Se identificará un grupo aleatorio de terneros, de uno a tres meses de edad, y se inyectará con las composiciones de la invención. El incremento en peso durante un período de aproximadamente diez meses se monitorizará y comparará a un grupo de control, el grupo de control que se trata de la misma manera en cada sentido como el grupo inyectado excepto por las inyecciones de vacuna de la invención. Cada ternero se examinará y determinará que j está en salud óptima por un veterinario durante el transcurso de los tratamientos.

Las inyecciones de la presente para el grupo vacunado se realizan a las cero semanas, 4 semanas y 8 (tres vacunaciones en total) . Las vacunaciones se proporcionarán de forma subcutánea o intramuscularmente al cuello usando agujas ce de calibre 18-21. También se proporcionarán inyecciones de refuerzo (4 refuerzos, tres refuerzos o sin refuerzos) . Las inyecciones de vacunación incluyeron 2 mg/2ml del polipéptido quimérico. El polipéptido quimérico se preparó como se describe en la presente que tiene ambos residuos de histidina en CAT reemplazado con aminoácidos de glicina de la invención y un ligador optimizado como se describe por SEQ ID NO: 3.

Los terneros vacunados y los terneros de control se pesaron cada uno para tomar un peso inicial. Se espera que los animales vacunados de la presente, mostrará un incremento de peso 15 a 40% con respecto a los animales de control. Este incremento en el peso promedio para los terneros tratados muestra una ventaja significativa con respecto a ningún tratamiento.

De forma importante, la carne recolectada de los terneros tratados no contiene hormona de crecimiento recombinante .

En tanto que la invención no se ha mostrado y descrito de forma particular con referencia a varias modalidades, se entenderá por los expertos en la técnica que se pueden hacer cambios en la forma y en los detalles a las varias modalidades descritas en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y que las varias modalidades descritas en la presente no se proponen que actúen como limitaciones en el alcance de las reivindicaciones.

Tabla 1: Tratados con polipéptido quimérico Tabla 2 : BST Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Polipéptido quimérico que tiene la inmunogenicidad de somatostatina, caracterizado porque comprende: una secuencia de aminoácido de somatostatina-14 enlazada a un polipéptido sustancialmente inactivo y truncado de cloranfenicol-acetil-transferasa, en donde la somatostatina-14 se enlaza a la cloranfenicol-acetil-transferasa inactiva por un separador, el separador está optimizado para la expresión óptima del polipéptido quimérico en una célula hospedadora objetivo y en donde el cloranfenicol inactivo tiene al menos el residuo 193 de histidina reemplazado con una alanina, glicina u otro aminoácido similar .

2. Polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el separador tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

3. Polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido sustancialmente inactivo y truncado de cloranfenicol-acetil-transferasa tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 O SEQ ID NO 8.

4. Polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

5. Polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

6. Composición inmunogénica, caracterizada porque comprende el polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1 junto con un adyuvante farmacéuticamente adecuado en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunitaria.

7. Adyuvante inmunológico, caracterizado porque comprende una emulsión de aceite en agua mezclada con una premezcla de emulsión en donde la emulsión de aceite en agua comprende aceite mineral, Tween 80, Span 85 y uno o más polímeros.

8. Adyuvante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la premezcla de emulsión comprende un polímero de alto peso molecular, un agente tensioactivo, y un emulsionador en una base acuosa-aceite .

9. Adyuvante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende antígenos pre-seleccionados en donde los antígenos son polipéptidos, polisacáridos y glicoproteínas nativas, recombinantes o sintéticas .

10. Composición inmunogénica, caracterizada porque comprende el polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1 con untamente con el adyuvante de conformidad con la reivindicación 8.

11. Método para incrementar la producción de leche en vacas lecheras, caracterizado porque comprende: vacunar una vaca lechera con una o más dosis de la composición de conformidad con la reivindicación 6; y permitir durante al menos diez días durante lo cual se incrementará la producción de leche de la vaca lechera en comparación a la misma producción de leche de la vaca en la ausencia de la vacunación.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la vaca lechera se vacuna con solo una dosis de la composición de conformidad con la reivindicación 6.

13. Método para incrementar la producción de leche en vacas lecheras, caracterizado porque comprende: vacunar una vaca lechera con una o más dosis de la composición de conformidad con la reivindicación 10; y permitir durante al menos diez días durante lo cual se incrementará la producción de leche de una vaca lechera en comparación a la misma producción de leche de la vaca en la ausencia de la vacunación.

14. Método para incrementar la producción de carne magra en ganado de granja, caracterizado porque comprende; vacunar el ganado de granja.