CN111978413B - 一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体 - Google Patents

一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体，属于寄生虫学与免疫学领域。所述的抗体由PvMSP8+1重组蛋白制备，所述的PvMSP8+1重组蛋白为间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(PvMSP8)和1的C末端(PvMSP1‑19)组成的融合蛋白。在体外生长抑制试验中，PvMSP8+1抗体显示出了比PvMSP8和PvMSP1‑19单抗原抗体更为优越的抑制效果。这为人们在研制多抗原疟疾疫苗时提供了一定的科学依据，具有广阔的应用前景。

Description

一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体
技术领域
本发明涉及一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体，属于寄生虫学与免疫学领域。
背景技术
疟疾是由按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病，其严重影响着人类的生命健康。疟疾患者往往会出现周期性的寒战、发热和出汗退热三个阶段，患者继之会出现贫血和脾肿大等相关并发症，严重者会引发凶险型疟疾甚至导致死亡，不仅对人体造成严重的身心损害，也加重了全球的经济负担。疟疾主要有疟原虫感染引起，能够感染人类的疟原虫共有5种，其中间日疟原虫是除非洲地区外分布最广的疟原虫，致病性也较为严重。由于疟原虫的变异性和抗药性的出现，研发一种多抗原疫苗以提高单抗原疫苗的效力已成为亟待解决的关键问题，并且间日疟原虫不可以在体外长期培养，这严重限制了对于间日疟原虫的研究。
发明内容
因此本发明将间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(PvMSP8)的碳末端和1的碳末端(PvMSP1-19)融合成为一种新型嵌合蛋白PvMSP8+1。本发明中所使用的食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)是间日疟原虫的姊妹分类群，具有相似的表型，生物学和遗传特征，因此是研究间日疟原虫的理想体外模型。因此选择食蟹猴疟原虫作体外研究模型以评估PvMSP8+1特异性抗体抑制疟原虫生长的能力有着非常重要的意义，也可以为人们在研制血液阶段疟疾疫苗时提供一定的科学依据。
本发明提供了一种用于制备体外抑制疟原虫生长的抗体的抗原，所述抗原为由间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(GeneID:5472441)的部分C末端(PvMSP8)和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的C末端19kDa部分通过中间连接肽融合而成
在本发明的一种实施方式中，所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的GeneID为5472441；所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的GeneID为5474133。
在本发明的一种实施方式中，所述中间连接肽的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了表达所述抗原的载体，所述载体优选pET32a(+)。
本发明提供了一种表达所述抗原的微生物细胞，所述微生物细胞优选为E.coliBL21(DE3)。
本发明提供了所述抗原制备得到的抗体。
本发明提供了所述抗原或抗体在制备抑制疟原虫生长的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品可降低血液中疟原虫的数量。
在本发明的一种实施方式中，所述疟原虫为间日疟原虫。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括药物或药物组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
本发明的有益效果：本发明通过体外生长抑制试验检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫体外生长的抑制效果。在体外生长抑制试验中，PvMSP8+1抗体显示出了比PvMSP8和PvMSP1-19单抗原抗体更为优越的抑制效果，IC50值为0.9459ug/mL。这为人们在研制多抗原疟疾疫苗时提供了一定的科学依据，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为PvMSP1-19蛋白考马斯亮蓝染色示意图(A)和Western blotting检测图(B)；M为蛋白分子量标准；
图2为间接免疫荧光法(IFA)检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面MSP8和MSP1-19天然蛋白的识别图；
图3为体外抑制试验验证PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫的生长抑制效率。
具体实施方式
原核表达质粒pET32a(+)、宿主菌BL21(DE3)及诱导用的IPTG均购自北京全式金生物科技有限公司。
基因的合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
琼脂糖亲和介质镍柱(Ni)购自QIAGEN公司。
His-Taq标签抗体购自Cell Signaling Technology公司。
实施例1：PvMSP8+1特异性抗体的制备
重组载体的构建：
根据SEQ ID NO：1序列信息特异性合成PvMSP8+1基因片段并将其构建至pET32a(+)表达载体中，获得pET32a-PvMSP8+1重组质粒。
蛋白表达与纯化：
将pET32a-PvMSP8+1重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达细胞中，培养、测序，获得测序正确的阳性转化子BL21-PvMSP8+1，挑选单克隆接种5ml含氨苄霉素的LB培养基，37℃培养过夜，将菌液接种于新鲜500ml含氨苄霉素的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，加入反应体系终浓度为1mmol/L IPTG，诱导8h。取诱导的菌株PvMSP8+1进行超声破碎裂解，经10％SDS-PAGE电泳分析表明PvMSP8+1蛋白主要定位于包涵体中，分子量大小与预期相符。
通过8M尿素溶解包涵体释放PvMSP8+1蛋白，该蛋白在碳末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的His-tag镍柱，按试剂盒说明书进行Ni2+亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别为20mM、50mM、100mM、150mM和250mM，150mM咪唑洗下的蛋白经12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色验证分析。并进一步用Western Blot分析目的蛋白纯度。
考马斯亮蓝染色结果显示所得纯化产物为目的蛋白，分子量大小与预期相符(图1A)。Western Blot结果显示所表达蛋白的纯度较高、特异性强(图1B)。
实施例2：PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面蛋白的特异性识别
间接免疫荧光(IFA)法检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面蛋白的特异性识别
富集裂殖体阶段的疟原虫通过Percoll梯度离心纯化，点样到多孔载玻片上，在冰冷的丙酮中固定3分钟，风干。用含有5％脱脂奶粉的PBS在37℃下封闭非特异性结合位点30分钟。将载玻片与1：100稀释PvMSP8+1特异性抗体在37℃孵育1小时。用预冷的PBS洗涤3次后，将玻片用Alexa Fluor 546偶联的山羊抗兔IgG二抗染色，细胞核用DAPI(Invitrogen)在37℃下孵育30分钟。将载玻片用ProLong Gold Antifade试剂(Invitrogen)中的盖玻片固定，并使用配备60倍油镜的共聚焦激光扫描FV200显微镜在油浸下观察拍照。使用FV10-ASW v.3.0查看器软件(Olympus)捕获图像，并准备使用Adobe Photoshop CS5进行编辑发布。
结果如图2所示，明场显微镜下可以观察到完整的裂殖子，在A组合B组均可观察到细胞核，但仅A组可以染到裂殖子表面蛋白，而在B组无法染到裂殖子表面蛋白，说明而免疫前的血清无法识别裂殖子表面蛋白，而PvMSP8+1抗体可以特异性识别裂殖子表面蛋白。证明了PvMSP8+1抗体与食蟹猴疟原虫间的相互反应性。PvMSP8+1特异性抗体能够识别食蟹猴疟原虫裂殖子表面的天然蛋白(图2A)，而作为阴性对照的兔子的免疫前血清未能识别(图2B)，证明了PvMSP8+1特异性抗体与食蟹猴疟原虫裂殖子表面蛋白的相互反应性。
实施例3：PvMSP8+1特异性抗体在体外抑制食蟹猴疟原虫的生长
体外抑制试验检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫的生长抑制作用
将预先同步的培养物调整为1％的血细胞比容和0.5％的寄生虫血症，然后以0.63mL/孔的速度接种在96孔圆底培养皿中。通过以1mg/mL(第1孔)进行系列稀释来制备抗体。所有抗体均通过以食蟹猴(P.cynomolgi)为基础的培养基进行三倍系列稀释，制备10个浓度点。将大约7μL抗体一式两份添加到寄生虫中。孵育后48小时，每个孔均用7μL完全生长培养基刷新。孵育后96小时，将每个孔中的20μL培养物等分到新鲜的圆底板中，用8μMHoechst 34580和150nMMitoTracker Far Red分子探针(线粒体红色荧光探针)染色，并在Canto II流式细胞仪(Becton)上采集。将板与染料在室温下避光孵育20分钟，每次用200μLPBS洗涤两次，然后转移到3mL圆底聚苯乙烯管(Becton Dickinson)中进行采集。单克隆抗体Fy6 2C3(鼠抗Fy6)和多克隆抗体FyB被用作入侵抑制对照。使用FlowJo软件(Tree StarInc.)分析数据，在其中对单个细胞进行门控。将双重阳性种群Hoechst 34580+MitoTracker Far Red+中指示的值导出到Excel软件，并使用FlowJo软件进行分析。
结果如图3和表1所示，在所有抗体中，PvMSP8+1特异性抗体体外抑制食蟹猴疟原虫生长的IC50值为0.9459ug/mL，而PvMSP8和PvMSP1-19单抗原抗体的IC50值分别为4.402ug/mL和1.598ug/mL；阳性对照抗体Fy6 2C3和FyB的IC50值分别为13.14ug/mL和7.239ug/mL。由此可见，PvMSP8+1特异性抗体提高了PvMSP8和PvMSP1-19单抗原抗体单独作用时的抑制效率，有着良好的应用前景。
表1不同抗体体外抑制食蟹猴疟原虫的生长的IC50值
Figure BDA0002643866510000041
IC50：半数最大抑制浓度
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体
<130> BAA200778A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtctttaa agaaaattct gaaaatcgtg gatgaaatgg aaaacatcca aggtttactg 60
gatggcgact attctattct ggataaatat agcgtgaaac tggttgacga ggatgatggc 120
gagaccaaca agcgcaagat catcggcgag tacgatttaa agatgctgaa gaacatttta 180
ctgttccgcg agaaaatcag ccgcgtgtgc gaaaataaat ataacaaaaa tttaccggtg 240
ctgctgaaaa agtgcagcaa cgtggacgac cctaaactga gcaagagtcg cgagaagatc 300
aagaagggtt tagcaaaaaa caatatgagc attgaggatt tcgtggtggg cttactggaa 360
gatctgtttg aaaaaattaa cgaacacttt atcaaaggcg gtggcggcag tggtggcggt 420
ggtagtggcg gcggtggcag cagcaaactg attaaggaga acgagagcaa ggagattctg 480
agccagctgc tgaacgtgca gacccagctg ctgaccatga gcagcgagca cacttgtatt 540
gacacaaatg tgccggataa cgccgcatgc tatcgctatc tggacggtac cgaagaatgg 600
cgctgtttac tgacctttaa agaagagggc ggtaagtgcg tgccggccag caatgtgaca 660
tgcaaggaca acaacggtgg ctgcgcaccg gaggccgaat gcaaaatgta a 711
<210> 2
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Leu Lys Lys Ile Leu Lys Ile Val Asp Glu Met Glu Asn Ile
1 5 10 15
Gln Gly Leu Leu Asp Gly Asp Tyr Ser Ile Leu Asp Lys Tyr Ser Val
20 25 30
Lys Leu Val Asp Glu Asp Asp Gly Glu Thr Asn Lys Arg Lys Ile Ile
35 40 45
Gly Glu Tyr Asp Leu Lys Met Leu Lys Asn Ile Leu Leu Phe Arg Glu
50 55 60
Lys Ile Ser Arg Val Cys Glu Asn Lys Tyr Asn Lys Asn Leu Pro Val
65 70 75 80
Leu Leu Lys Lys Cys Ser Asn Val Asp Asp Pro Lys Leu Ser Lys Ser
85 90 95
Arg Glu Lys Ile Lys Lys Gly Leu Ala Lys Asn Asn Met Ser Ile Glu
100 105 110
Asp Phe Val Val Gly Leu Leu Glu Asp Leu Phe Glu Lys Ile Asn Glu
115 120 125
His Phe Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Lys Leu Ile Lys Glu Asn Glu Ser Lys Glu Ile Leu
145 150 155 160
Ser Gln Leu Leu Asn Val Gln Thr Gln Leu Leu Thr Met Ser Ser Glu
165 170 175
His Thr Cys Ile Asp Thr Asn Val Pro Asp Asn Ala Ala Cys Tyr Arg
180 185 190
Tyr Leu Asp Gly Thr Glu Glu Trp Arg Cys Leu Leu Thr Phe Lys Glu
195 200 205
Glu Gly Gly Lys Cys Val Pro Ala Ser Asn Val Thr Cys Lys Asp Asn
210 215 220
Asn Gly Gly Cys Ala Pro Glu Ala Glu Cys Lys Met
225 230 235

Claims (8)

1.一种用于制备体外抑制疟原虫生长的抗体的抗原，其特征在于，所述抗原由间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的部分C末端和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的C末端19kDa部分通过中间连接肽融合而成；
所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的Gene ID为5472441；所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的Gene ID为5474133；所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.表达权利要求1所述抗原的载体。
3.表达权利要求1所述抗原的微生物细胞。
4.权利要求1所述抗原免疫制备得到的抗体。
5.权利要求1所述抗原或权利要求4所述抗体在制备抑制疟原虫生长的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品可降低血液中疟原虫的数量。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疟原虫为食蟹猴疟原虫。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物。
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