CN112778415A - 一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多克隆抗体制备技术领域。本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：将仿刺参AjCYTB基因中非跨膜区域序列拼接后进行密码子优化并构建AjCYTB表达载体；将表达载体转化到感受态细胞中，经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白并用其对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。本发明制备的AjCYTB多克隆抗体，具有高灵敏度和较高的效价，给仿刺参AjCYTB蛋白的检测提供了的优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，为促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

Description

一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及多克隆抗体制备技术领域，尤其涉及一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法。
背景技术
细胞色素b(cytochromeb，CYTB)存在于线粒体中，与其他细胞色素一起参与线粒体的氧化磷酸化电子传递。近年来，研究人员通过转录水平表达分析，发现AjCYTB在仿刺参的11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树组织中稳定表达；并且在细菌脂多糖(LPS)刺激前后，仿刺参多个发育阶段和幼参的四种组织中AjCYTB转录水平表达量无显著差异，为其作为内参基因的可行性提供了依据。
目前针对仿刺参AjCYTB蛋白水平的相关研究较少，尤其是对AjCYTB的抗体制备等研究目前还无相关研究报道，研究制备仿刺参AjCYTB的多克隆抗体，将为仿刺参内参基因的研究提供有力工具，进而为仿刺参的生物学研究提供实验支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，为仿刺参的生物学研究提供实验支持。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列，得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到感受态细胞中，依次经过扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。
作为优选，所述表达载体为pCold II，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态菌体。
作为优选，所述蛋白纯化过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。
作为优选，所述动物为6～8周的昆明鼠。
作为优选，所述两次免疫的过程中第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg。
作为优选，所述两次免疫后收集血清，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
作为优选，所述收集血清在第一次免疫后的第35天进行。
作为优选，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体的效价为1：50000。
本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：将仿刺参AjCYTB基因中非跨膜区域序列拼接后进行密码子优化并构建AjCYTB表达载体；将表达载体转化到感受态细胞中，经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白并用其对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。本发明制备的AjCYTB多克隆抗体，具有高灵敏度和较高的效价，给仿刺参AjCYTB蛋白的检测提供了优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，为促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。
具体实施方式
本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到感受态细胞中，依次经过扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。
在本发明中，所述表达载体优选为pCold II。
在本发明中，所述感受态细胞优选为大肠杆菌BL21感受态菌体。
在本发明中，所述蛋白纯化过程中优选利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。
在本发明中，所述扩大培养的方法优选为：在36～38℃条件下，用含90～110μg/ml氨苄西林的LB培养基扩大培养至OD600＝0.4～0.5。
在本发明中，所述扩大培养的温度优选为37℃。
在本发明中，所述氨苄西林的的浓度优选为100μg/ml。
在本发明中，所述诱导表达的方法优选为：在14～16℃、IPTG浓度为0.1～1.0mM的条件下诱导20～24h。
在本发明中，所述诱导表达的温度优选为15℃。
在本发明中，所述IPTG浓度优选为0.15～0.8mM，进一步优选为0.2～0.5mM，再进一步优选为0.25mM。
在本发明中，所述动物优选为6～8周的昆明鼠，进一步优选为7周的昆明鼠。
在本发明中，所述两次免疫过程中使用五周标准鼠单抗/多抗作为佐剂。
在本发明中，所述五周标准鼠单抗/多抗的英文名称SoFastAntibody-Mouse5W，生产厂家：北京索莱宝科技有限公司Solarbio life sciences。
在本发明中，所述两次免疫的过程中第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg。
在本发明中，所述两次免疫的过程中每只昆明鼠免疫量优选为AjCYTB蛋白20μg。
在本发明中，优选在两次免疫后收集血清，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
在本发明中，所述收集血清优选在第一次免疫后的第35天进行。
在本发明中，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体的效价优选为1：50000。
下面结合实施例对本发明提供的仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列和pCold II构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到大肠杆菌BL21感受态菌体中，在36℃条件下，用含90μg/ml氨苄西林的LB培养基扩大培养至OD600＝0.4，再在14℃、IPTG浓度为0.1mM的条件下诱导20h，后经过菌体收集、菌体破碎，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对6周的昆明鼠进行两次免疫，第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjAIF-1蛋白15μg，在第一次免疫后的第35天收集血清，仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
实施例2
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列和pCold II构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到大肠杆菌BL21感受态菌体中，在37℃条件下，用含100μg/ml氨苄西林的LB培养基扩大培养至OD600＝0.45，再在15℃、IPTG浓度为0.25mM的条件下诱导22h，后经过菌体收集、菌体破碎，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对6周的昆明鼠进行两次免疫，第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白20μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjAIF-1蛋白20μg，在第一次免疫后的第35天收集血清，仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
实施例3
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列和pCold II构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到大肠杆菌BL21感受态菌体中，在38℃条件下，用含110μg/ml氨苄西林的LB培养基扩大培养至OD600＝0.5，再在16℃、IPTG浓度为1.0mM的条件下诱导24h，后经过菌体收集、菌体破碎，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对6周的昆明鼠进行两次免疫，第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白25μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjAIF-1蛋白25μg，在第一次免疫后的第35天收集血清，仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
结论：本申请的制备方法简单，工艺易于推广，通过本发明方法制备的AjCYTB多克隆抗体，具有高灵敏度，效价1：50000，使用效果优异，能够在蛋白免疫印迹等方法中应用。能够给仿刺参AjCYTB蛋白的检测提供优质抗体，为减少因仿刺参病害带来的经济损失和促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。
由以上实施例可知，本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：将仿刺参AjCYTB基因中非跨膜区域序列拼接后进行密码子优化并构建AjCYTB表达载体；将表达载体转化到感受态细胞中，经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白并用其对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。本发明制备的AjCYTB多克隆抗体，具有高灵敏度和较高的效价，给仿刺参AjCYTB蛋白的检测提供了的优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，为促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 大连工业大学
<120> 一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Gly Pro Leu Arg Lys Ser His Pro Leu Phe Arg Ile Leu Asn
1 5 10 15
Gly Ser Leu Val Asp Leu Pro Ala Pro Ser Asn Leu Ser His Tyr Thr
20 25 30
Ala Asp Ile Ser Leu Ala Phe Ser Ser Val Ser His Ile Cys Arg Asp
35 40 45
Val Asn Tyr Gly Trp Leu Leu Arg Asn Ile His Ala Asn Ser Val Asn
50 55 60
Gln Glu Thr Pro Trp Gly Gln Met Ser Glu Met Leu Val Gln Trp Val
65 70 75 80
Trp Gly Gly Phe Ser Val Asp Asn Ala Thr Leu Thr His Gln Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Asn Pro Thr Gly Leu Asp Ser Asn Tyr Asp Lys Ala Pro Phe
100 105 110
Arg Val Tyr Phe Ser Thr Lys Asp Asn Asp Pro Glu Asn Phe Ile Pro
115 120 125
Ala Asn Pro Leu Val Thr Pro Thr His Ile Gln Pro Glu Trp Tyr Phe
130 135 140
Leu Phe Ala Tyr Ala Ile Leu Arg Ser Ile Pro Asn Lys Leu Gly Gly
145 150 155 160
Asn Gln Ala Ser Thr Phe Arg Pro Leu Ser Gln Gln Pro Val Glu Glu
165 170 175
Glu Asn Lys Leu Leu Leu Arg
180

Claims (8)

1.一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列，得到拼接后的AjCYTB基因序列；
(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列构建AjCYTB表达载体；
(4)将AjCYTB表达载体转化到感受态细胞中，依次经过扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；
(5)用AjCYTB蛋白对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pCold II，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态菌体。
3.根据权利要求2所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。
4.根据权利要求3所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物为6～8周的昆明鼠。
5.根据权利要求4所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述两次免疫的过程中第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg。
6.根据权利要求5所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述两次免疫后收集血清，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。
7.根据权利要求6所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述收集血清在第一次免疫后的第35天进行。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体的效价为1：50000。
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