CN114907468A

CN114907468A - 一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法

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Publication number: CN114907468A
Application number: CN202210652954.5A
Authority: CN
Inventors: 王际辉; 李娜; 肖珊; 王晗
Original assignee: Dongguan University of Technology
Current assignee: Dongguan University of Technology
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN114907468B

Abstract

本发明提供了一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法，属于抗体制备技术领域，本发明成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白，将其免疫小鼠后能够成功得到仿刺参整合素多克隆抗体，克服了现有技术中缺少仿刺参整合素抗体的问题，为仿刺参的生物学研究提供有意义的工具和实验支持。本发明还成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白的编码基因、重组表达载体，通过本发明提供的制备方法能够制得仿刺参整合素抗原蛋白。本发明还提供了仿刺参整合素βG基因编码区全序列，填补了相关研究的空白，通过本发明引物对能够成功扩增出上述仿刺参整合素βG基因编码区全序列，可用于仿刺参整合素的其他相关研究。

Description

一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法。

背景技术

整合素家族是细胞黏附分子中的一类，属于跨膜糖蛋白，在维持组织细胞结构稳定、参与细胞黏附反应、介导细胞间信号传导等方面发挥重要作用。整合素是由非共价键结合的α和β亚基组成的异质二聚体，每个亚基都是I型跨膜蛋白，具有一个保守的结构，包括一个较大的细胞外多结构域部分、一个单通道跨膜区域和一个通常较短的细胞质尾部，能够与细胞外基质蛋白结合，并与细胞内信号和细胞骨架复合物结合，进行“由外向内”和“由内向外”的双向信号传导，在细胞外基质蛋白和细胞内分子之间进行信息交换。

哺乳动物中的整合素功能及相关调节机制有关研究已相对成熟，但是目前，针对仿刺参整合素蛋白水平的研究较少，尤其是对仿刺参整合素的抗体制备等研究目前还无相关报道，研究制备仿刺参整合素的抗体，将为仿刺参的生物学研究提供有意义的工具和实验支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法，解决现有技术中缺少仿刺参整合素抗体的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种仿刺参整合素抗原蛋白，所述仿刺参整合素抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述仿刺参整合素抗原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种仿刺参整合素抗原蛋白的重组表达载体，包括上述述基因和初始载体。

优选的，所述初始载体为pColdⅡ，所述基因插入初始载体的NdeI和HindIII酶切位点之间。

本发明还提供了一种仿刺参整合素抗原蛋白的制备方法，包含如下步骤：

将上述重组表达载体转化大肠杆菌、表达，得到仿刺参整合素抗原蛋白。

本发明还提供了一种仿刺参整合素多克隆抗体，所述多克隆抗体是以上述仿刺参整合素抗原蛋白免疫小鼠后得到。

本发明还提供了一种仿刺参整合素βG基因编码区全序列，如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种扩增上述仿刺参整合素βG基因编码区全序列的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.4～5所示。

本发明的技术效果和优点：

本发明成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白，将其免疫小鼠后能够成功得到仿刺参整合素多克隆抗体，这将为仿刺参的生物学研究提供有意义的工具和实验支持，并且，实验过程中还成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白的编码基因、重组表达载体，通过本发明提供的制备方法能够制得仿刺参整合素抗原蛋白。本发明还提供了仿刺参整合素βG基因编码区全序列，填补了相关研究的空白，通过本发明引物对能够成功扩增出上述仿刺参整合素βG基因编码区全序列，可用于仿刺参整合素的其他相关研究。

附图说明

图1为氨基酸序列比对结果图；

图2为IPTG诱导重组蛋白表达结果图；

图3为Elisa检测结果图；

图4为蛋白免疫印迹检测结果图；

图5为间接免疫荧光分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1扩增仿刺参整合素βG基因编码区全序列

根据NCBI基因序列GenBank:MRZV01000012.1Apostichopusjaponicus putativeintegrin beta G subunit isoform X1(仿刺参整合素βG亚基X1)基因编码区及非翻译区(UTR)设计引物对①，进行PCR，结果发现仅能扩增出部分片段，5'端起始密码子开始的300多bp无法PCR扩增得到。PCR扩增出的片段测序后与已知序列比对，有连续90bp的碱基插入。

反转录获得cDNA，应用PCR扩增出部分基因编码区，并利用5'RACE技术获得5'端PCR未能扩增出的序列，进一步根据获得的基因信息设计引物对②(合成公司为宝生物(大连)有限公司)，PCR扩增基因编码区全长，获得一条新的仿刺参整合素βG基因编码区全序列(2364bp，核苷酸序列：ATGGATTGTAAACATTCAATATTCTTATTACTGTTACTGTACTGTGCGAGGTCTATACATGCCCAGAACCTAGCTGCTAGCCCTTGCAATGATGCCAAGACATGTGGGGCCTGTATTGTGTTGGACCCGTCCTGTGGCTGGTGCACACAAGGAAACTTCACAGATACCGGCAGTCCTAGATGTGACACCATTCCAAATCTCCGTATGCAAGGATGCAGTGAATATACAAGTCCTAATAGTTCTTATACGATTGATTTGGACAAAGAATTGAGTAATGCAGGAAACACAACCAATTTAGGTGAAGCTGTACAAGTGAAACCACAGGAAATAACTCTGAAATTGAGACCAGGTCAACCTACTCAGTTTACATTTCAAGTGAGGCAGGCAGAAGATTACCCTGTTGATCTTTACTACGTCATGGATCTTTCCAAATCGATGGAGGATGATTTGGTCAATTTGCGGAAAGTTGGAGATGTTCTTGCTGAAGAGATGAGTCAAATCACAAGTGACTTTCGAATGGGTTTTGGATCGTTTGTGGACAAGGTGGTGATGCCATATGTCAGCACCGTACCGGCCAAGCTAGCAGAACCTTGTAGCGGTTGTCAGGCTCCATATGGCTTTAAGAACGAACTCAGTCTGACTGGGGATACAAGTGAATTCTCTAGAACAATTAACCAGCTGCAAGTCTCTGGAAATCTCGATGCCCCTGAAGGGGGCATGGATGCCCTTATGCAAGTTACAGTATGCAAGGAGGCGATTGGTTGGAGGGACATGGCGAGACATTTAGTTATCTTCACCACCGATGCGTCCTTCCATTATGCGGGAGATGGCAAGCTTGGTGGTATCGTTAAACCTAACGATGGAAACTGTTACACCACAGCCCTTGACAATACGTACACCATGTCAAGTGAATTGGACTATCCTTCGATTAGTCAACTGAATGCTGCCATGAGAGATAACAGCATCATTCCAATTTTTGCTGTGACACAGTCTGAATTTTCAGTTTATCAGAATCTTACGGAATACATTGAGGGCGCTCAAGCGGCCGTGTTGGCGGCAGATTCTCGAAATATTGTGGAAATTGTGAAGAATAATTACGCAGCAATCACCAGTAAAGTTGAAGTGGTGGATACAGCACCAGAGGACGTACTTGTGGAATACACTGCTATCTGCTTGGACGGTGTTCGGCGGCCTGGTACACAAGTATGTGAAGGATTGACCCTTGGAGACACTGTCAGCTTTGATGTCACGGTAACAGGCAATACCTGCCCTGATAGTAGAACCTCCAGTTTCACCATTCGTCCTGTTGGCTTCAGCGAGGAGCTTCAGGTCAACATTGATTACTTGTGTGATTGTGACTGTGAAGGTTCGGGGATTCCAAACAGCCCAGATTGCTCTGATGGGGCTGGTACTCTGGAGTGCGGGGCCTGCGATTGCAACGCTGGACATTACGGACGTAACTGTGAATGCAGCTCTGATGGCCCAACACTGGAGGACAGCGATAAGCTATGTAAAGCAGGAAATTCTACCATCATCTGTTCAGGACGAGGATCTTGTGTCTGTGGTGATTGTGTTTGCTTCCCTAGACCGAATCCAGAGGAAGTGGTGAAGGGAACTTTCTGCGAATGCGATAATTTTTCTTGTGATAGGCACAGAGGTCAACTCTGTGGAGGTGAAGAACACGGCACCTGTGTCTGTGATGAGGCATCGAGGAAGAGTAAATGTCAGTGTAAGGCCGGGTGGTCTGGACCTTCTTGTGCCTGCTCAACTACGACAGACACTTGCATAGCTGCTAATGGGGAAACATGCAATGGTTACGGAGAGTGCGTCTGTGGTGCTTGTATTTGTAACGCCAATTCAAGCTACAGTGGTGCCAAATGTGAAGAATGCAGGGCATGTCCAGGAAAATGCCAAGCCAACAAAGACTGTGTGGAATGTAAAGCATTTGGAACTGGCTTGACCAGAGAACAGTGTGACAAGTGCCCATATAAGGTCATCCCCGTCACCGGCGACCTACAGATTCCAAATGGTTCGGAACGTTGTCTGGTTCCTGACAACGATGGCTGTTCTTTCATTTTCACCTATGAACAGTTTAGCAACGATACATTTGTCCTCTACGTACTTGCAGAAAAGAGCTGTCCAGAGCCGATCAATCCTCTCGTAGTCATCATTCCCATCGTGATCGGTATCATTCTCATCGGATTACTCTTGCTTATTCTCTGGCGTGTCCTGATTTATCTATGGGACAGGAAGGAATACAAACAATTTGAAAAGGATAGGGCAAATGCTAAATGGGAAATGGGAGAAAATCCGATATACAAGCCATCGACCACAATCCACAAAAACCCAATGTATGGGAAGTAA，如SEQ ID NO.3所示)，将该序列与已知仿刺参整合素βG亚基X1(NCBI序列编号：PIK62419.1)推测的氨基酸序列进行比对，相似度为93％，比对结果如图1所示。

实施例1中的引物序列如下表1所示：

表1引物序列

实施例2设计抗原蛋白编码基因

对上述仿刺参整合素βG基因编码区全序列进行截取，去掉信号肽和跨膜区及胞内段；并进行优化，减少半胱氨酸的数量，得到优化后的编码序列：ACCAGCCCGAACTCTTCTTACACCATCGATCTGGATAAAGAACTGAGCAACGCGGGTAACACCACCAACCTGGGTGAAGCGGTTCAGGTTAAACCGCAGGAAATCACCCTGAAACTGCGTCCGGGCCAGCCGACCCAGTTCACCTTCCAGGTTCGTCAGGCGGAAGATTACCCGGTTGACCTGTATTACGTGATGGACCTGTCTAAAAGCATGGAAGATGATCTGGTTAACCTGCGTAAAGTTGGTGATGTTCTGGCTGAAGAAATGAGCCAGATCACCAGCGATTTCCGTATGGGCTTCGGCAGCTTCGTTGATAAAGTTGTAATGCCGTACGTTAGCACCGTTCCGGCGAAACTGGCGGAACCGTGCAGCGGTTGCCAGGCGCCGTACGGCTTCAAAAACGAACTGTCTCTGACCGGTGATACCTCTGAATTCTCCCGCACCATTAACCAGCTGCAGGTGTCTGGTAACCTGGATGCTCCGGAAGGTGGTATGGATGCGCTGATGCAGGTTACCGTTTGCAAAGAAGCTATCGGTTGGCGTGACATGGCACGCCACCTGGTTATCTTCACCACCGATGCTAGCTTCCACTATGCAGGTGATGGTAAACTGGGCGGTATCGTTAAACCGAACGATGGTAACTGCTACACCACCGCGCTGGACAACACCTACACCATGAGCTCCGAACTGGATTACCCGTCCATCTCTCAGCTGAACGCGGCGATGCGTGATAACAGCATCATCCCGATCTTCGCGGTGACCCAGTCTGAATTCTCTGTTTACCAGAACCTGACCGAATACATCGAAGGTGCGCAGGCGGCGGTGCTGGCTGCGGATAGCCGTAACATCGTTGAAATCGTTAAAAACAACTATGCGGCGATCACCTCTAAAGTTGAAGTTGTTGATACCGCTCCGGAAGATGTTCTGGTGGAATACACCGCAATTTGCCTGGATGGTGTGCGTCGTCCGGGCACCCAGGTTTGCGAAGGTCTGACCCTGGGTGATACCGTTAGCTTCGACGTTACCGTTACCGGTAACACCTGCCCGGATAGCCGTACCAGCTCTTTCACCATCCGCCCGGTTGGCTTCAGCGAAGAACTGCAGGTTAACATCGAATACCTGTGCGATTGCGATTGCGAAGGTAGCGGTATCCCGAACTCTCCGGATTGCAGCAAAGGTGCGGGCACCCTGGAATGCGGCGCTTGCGATTGCAACTAA，如SEQ ID NO.2所示(体外合成片段由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)。

实施例3构建重组表达载体、转化大肠杆菌

利用实施例2中得到的优化后的编码序列构建重组表达载体pColdⅡ-AjIntegrin-βG-his，克隆位点为NdeI与HindIII之间；大肠杆菌选用大肠杆菌BL21(DE3)；构建重组表达载体、转化均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例4诱导重组蛋白表达并进行纯化

4.1菌种活化

无菌操作，接种环挑取一环重组大肠杆菌BL21(DE3)甘油菌，通过平板划线分离法接种到氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h。

4.2重组菌株液体培养

无菌操作，接种环挑取单菌落接种到20mL氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm，过夜培养12h。

4.3重组蛋白的诱导表达

无菌操作，取1mL活化菌种，接种到氨苄青霉素终浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，共接种六瓶菌液，并分别将其标记为实验组1～5和对照组，37℃，180rpm条件下培养至菌液OD600达到0.5～0.6左右。无菌操作，实验组1～5分别加入IPTG，使其终浓度为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM，对照组不添加IPTG。菌液于16℃，180rpm摇床继续培养24h。标记并称重离心管，分别收集菌液至离心管中，4℃，15000g离心1min，弃上清，收集菌体沉淀，-80℃冻存备用。

4.5重组目的蛋白的鉴定

将收集的实验组和对照组的菌体沉淀称重，按1﹕5的质量体积比加入非变性裂解液。按体积比1﹕100比例向非变性裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合物(100×)，反复吹打混匀，使蛋白酶抑制剂混合物(100×)终浓度为1×。然后向菌体沉淀与裂解液的混合溶液中加入100mg/mL的溶菌酶溶液至终浓度为1mg/mL。冰水浴下，超声破碎20min，功率300W，超声3s，间隔9s。冰上静置30min。4℃，15000g离心10min。收集菌体非变性裂解上清液置于冰上，将两组菌体裂解沉淀装入不同的离心管中，-20℃保存备用，避免反复冻融。对菌体非变性裂解上清液和菌体非变性裂解沉淀进行SDS-PAGE，确认重组蛋白表达在非变性裂解上清液或沉淀中，结果如图2所示(图2中M：Marker；1：对照组非变性裂解上清液；2：实验组非变性裂解上清液；3：对照组非变性裂解沉淀；4：实验组非变性裂解沉淀)。

4.6重组蛋白的变性提取

将收集的实验组和对照组的菌体非变性裂解沉淀称重，按1﹕5的质量体积比加入含有8M尿素的变性裂解液，反复吹打重悬菌体沉淀。冰水浴下，超声破碎30min，功率300W，超声3s，间隔9s，超声至溶液澄清透亮。冰上静置10min。4℃，15000g离心10min。收集菌体变性裂解上清液置于冰上，-20℃保存备用，避免反复冻融。

4.7重组蛋白的纯化

本研究采用镍亲和层析法对重组蛋白进行纯化，具体操作步骤如下：

1)取1mL混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)放入离心管中，4℃，1000g离心10s，弃去上清储存液，移液枪吸取1mL变性裂解液加入到凝胶中，反复颠倒使二者充分混匀，以平衡凝胶。

2)4℃条件下，1000g离心10s，弃去上清液，重复3次。

3)吸取4mL实验组菌体变性裂解液上清液加入凝胶中，将菌体裂解液置于4℃层析柜中，旋转混匀仪上缓慢摇动1h。

4)将菌体裂解液和BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)的混合物，4℃，1000g离心10s，缓慢吸取上清溶液作为穿流液，分装后-80℃保存。

5)向凝胶沉淀中加入500μL变性裂解液，旋转混匀仪上慢速混匀5min，4℃，1000g离心10s，以洗去未结合的蛋白，缓慢吸取上清溶液作为变性裂解洗涤液1，分装后-80℃保存。

6)重复5)操作4次，并分别收集上清液作为变性裂解洗涤液2～变性裂解洗涤液5，分装后-80℃保存。

7)向凝胶沉淀中加入500μL变性洗涤液，旋转混匀仪上慢速混匀5min，4℃，1000g离心10s，以洗去结合的杂蛋白，缓慢吸取上清溶液作为变性洗涤液1，分装后-80℃保存。

8)重复7)操作8次，分别收集上清液作为变性洗涤液2～变性洗涤液9，分装后-80℃保存。

9)向凝胶沉淀中加入500μL变性洗脱液，旋转混匀仪上慢速混匀10min，4℃，1000g离心10s，进行目的蛋白的洗脱，缓慢吸取上清溶液作为洗脱液1，分装后-80℃保存。

10)重复操作7次，分别收集上清液作为洗脱液2～洗脱液8，分装后-80℃保存。

11)将变性菌体裂解上清液、穿流液、洗涤液和洗脱液进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白纯化效果。

4.8梯度透析

用镊子取出保存在1％甲醛溶液内的透析袋，将透析袋内装满双蒸水然后排出，重复两次，将之清洗干净。取出镍柱纯化的重组蛋白溶液，4℃条件下，15000g离心10min，吸取上清溶液置于冰上待用。将离心后的重组蛋白溶液10mL用移液枪装于截留量为7000Da的透析袋中，用聚丙烯夹子夹紧透析袋。将透析袋放入装有1L含有6M尿素透析液的烧杯中，在烧杯中放入转子，并置于磁力搅拌器上，于4℃下梯度透析60h，期间每12h更换一次透析液，透析液中尿素浓度逐步减少，尿素浓度分别为4M、2M、1M、0M，以逐步除去重组蛋白溶液中高浓度的尿素与咪唑。透析结束后，小心拆掉透析袋夹子，用移液枪吸取透析带内的蛋白溶液，4℃条件下，15000g离心10min，吸取上清溶液，分装后-80℃保存。

4.9重组蛋白抗原溶液浓度测定

取含量分别为1μg、2μg、3μg、5μg、8μg、10μg、12μg的BSA溶液以及纯化后的目的蛋白3μL分别与1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，制成等体积溶液并进行SDS-PAGE。使用Tanon Image数据分析软件进行半定量法的灰度分析，计算透析后纯化的重组蛋白浓度，结果显示重组蛋白溶液浓度达到0.67μg/μL。

实施例5免疫获得多克隆抗体

以重组蛋白(重组蛋白序列：TSPNSSYTIDLDKELSNAGNTTNLGEAVQVKPQEITLKLRPGQPTQFTFQVRQAEDYPVDLYYVMDLSKSMEDDLVNLRKVGDVLAEEMSQITSDFRMGFGSFVDKVVMPYVSTVPAKLAEPCSGCQAPYGFKNELSLTGDTSEFSRTINQLQVSGNLDAPEGGMDALMQVTVCKEAIGWRDMARHLVIFTTDASFHYAGDGKLGGIVKPNDGNCYTTALDNTYTMSSELDYPSISQLNAAMRDNSIIPIFAVTQSEFSVYQNLTEYIEGAQAAVLAADSRNIVEIVKNNYAAITSKVEVVDTAPEDVLVEYTAICLDGVRRPGTQVCEGLTLGDTVSFDVTVTGNTCPDSRTSSFTIRPVGFSEELQVNIEYLCDCDCEGSGIPNSPDCSKGAGTLECGACDCN，如SEQ ID NO.1所示)溶液为抗原，与快速抗体佐剂混匀后对6～8周龄昆明小鼠(购买自大连医科大学实验动物中心)进行两次免疫，第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为重组仿刺参整合素βG蛋白20μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为重组仿刺参整合素βG蛋白20μg，收集血清在第一次免疫后的第35天进行(两次免疫过程中使用的佐剂为五周标准鼠单抗/多抗佐剂，英文名称SoFastAntibody-Mouse5W，生产厂家：北京索莱宝科技有限公司Solarbio life sciences)，获得鼠抗整合素βG多克隆抗体。

实施例6效价测定

包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至1μg/mL，每孔200μL加于96孔板中，4℃过夜包被。

洗涤：包被结束，倾去包被液，在吸水纸上轻拍板将各孔中残余液体拍干。用洗涤缓冲液每孔300μL洗涤96孔板3次，每次3min。

封闭：每孔加入200μL 5％山羊血清，37℃孵育1h。

洗涤：倾去封闭液，在吸水纸上轻拍板将各孔中残余液体拍干。用洗涤缓冲液每孔300μL洗涤96孔板3次，每次3min。

一抗孵育：用一抗稀释液按1﹕100～1﹕51200的比例对抗血清进行倍比稀释，封闭结束后，将稀释好的样品依次加入96孔板中，每孔100μL，37℃孵育1h。

洗涤：一抗孵育结束后，重复步骤(4)进行洗板。

二抗孵育：将0.5μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(HRP-IgG)加入到5mLPBS中，混匀后，将稀释好的二抗溶液依次加入96孔板中，每孔100μL，37℃孵育1h。

洗涤：二抗孵育结束后，重复步骤(4)进行洗板。

显色：按照每孔100μLTMB显色液加入到96孔板中，37℃避光孵育30min。

终止：按照每孔50μL终止液加入到96孔板中，酶标仪在450nm处测定OD₄₅₀的值，经测定，多克隆抗体效价为1﹕12800，结果如图3所示。

实施例7蛋白免疫印迹(Western blot)检测

7.1SDS-PAGE

制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶以及蛋白上样溶液，依次将仿刺参体腔细胞蛋白上样溶液、预染蛋白Marker和重组蛋白(实施例4获得)上样溶液上样，并进行电泳。

7.2转膜

转膜过程中，使用洁净的手套。将海绵、滤纸、玻璃棒、平口镊子等转膜专用的器具放入转膜盒，并用1×转膜缓冲液浸泡，备用。电泳结束后取出凝胶，根据预染的蛋白Marker用洁净的工具剪切目的条带，并将目的胶条转移至1×转膜缓冲液中浸没。根据目的胶条的大小，使用专用剪刀裁剪略大于目的胶条的PVDF膜。将PVDF膜放在甲醇溶液中活化3min，然后转移到1×转膜缓冲液中平衡10min左右。按照一层海绵、三层滤纸、PVDF膜、目的胶条、三层滤纸、一层海绵的顺序在白色夹板上制作转膜“三明治”，每一步都要避免气泡的产生，最后用玻璃棒在海绵层轻轻滚动以赶走气泡，扣紧夹板，在转膜槽中加满1×转膜缓冲液，放入夹板，注意电源正负极，转膜装置组装完全。将转膜装置保持垂直置于冰水浴中，连接电泳仪，设置电泳仪恒流(175mA)，时间90min。

7.3抗原抗体反应

封闭：提前配制5％脱脂奶粉封闭液，置于冰水浴中备用。转膜完成后，用转膜专用平口镊子取出PVDF膜，正面朝上放入封闭液，往复式摇床室温低速封闭1h。

一抗孵育：以专用薄膜和封口机制作封口袋，将PVDF膜装入封口袋中，加入一抗工作液(实施例5中获得的多克隆抗体)，赶出气泡并用封口机封口，4℃过夜孵育。

一抗洗脱：往复式摇床低速TBST洗膜5次，每次10min。

二抗孵育：将PVDF膜放入二抗工作液中，往复式摇床室温孵育1h。

二抗洗脱：往复式摇床低速TBST洗膜5次，每次10min。

ECL显影：配制ECL发光显影液。将PVDF膜转移至凝胶成像仪中，蛋白正面朝上，将显影液均匀地滴加到膜上，发光成像适当曝光记录结果，如图4所示，由图4可知，制备所得多克隆抗体能够与抗原蛋白特异性结合。

实施例8间接免疫荧光分析体腔细胞整合素βG蛋白的表达

以制备的多克隆抗体为一抗，进行细胞免疫间接荧光，实验方法如下：

在每块玻底平皿中央滴加1×多聚赖氨酸300μL(无菌操作)，室温过夜；过夜后，用移液枪吸出液体，用大风吹干表面，使用时用抗凝溶液洗2次，每次2min。弃去溶液后，盖上盖子，待用；制备细胞浓度达到1×10⁶个/mL的仿刺参体腔细胞悬液，在玻底平皿中央加入300μL细胞悬液，16℃沉降5min；在周围缓慢加入1mL抗凝溶液，16℃沉降20min，弃去上清，PBS洗3次，每次3min；在玻底平皿中央加入300μL的4％多聚甲醛，室温下固定细胞20min。弃去玻底平皿液体，PBS洗3次，每次3min，缓慢加入5％的山羊血清300μL，室温封闭30min，弃去玻底平皿液体，PBS洗3次，每次3min。

进行一抗孵育：1﹕50用PBS稀释实施例5中制备的多克隆抗体溶液，缓慢加入玻底平皿中央300μL，室温孵育1h。洗涤：弃去玻底平皿液体，PBS洗3次，每次3min。二抗孵育：1﹕200用PBS稀释罗丹明标记的羊抗鼠IgG溶液，缓慢加入玻底平皿中央300μL，室温避光孵育1h。洗涤：弃去玻底平皿液体，PBS洗3次，每次3min。弃去上清，最后加入200μLPBS。在共聚焦显微镜下观察，随机记录15～20区域的图像，如图5所示(图5中A：罗丹明标记的羊抗鼠IgG；B：明场下的细胞；C：细胞和荧光标记的二抗的复合图像)，由图5可知，成功检测到仿刺参体腔细胞阳性表达。

由以上实施例可知，本发明成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白，将其免疫小鼠后能够成功得到仿刺参整合素多克隆抗体，这将为仿刺参的生物学研究提供有意义的工具和实验支持，并且，实验过程中还成功得到了仿刺参整合素抗原蛋白的编码基因、重组表达载体，通过本发明提供的制备方法能够制得仿刺参整合素抗原蛋白。本发明还提供了仿刺参整合素βG基因编码区全序列，填补了相关研究的空白，通过本发明引物对能够成功扩增出上述仿刺参整合素βG基因编码区全序列，可用于仿刺参整合素的其他相关研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东莞理工学院

<120> 一种仿刺参整合素多克隆抗体、抗原蛋白及其制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 405

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ser Pro Asn Ser Ser Tyr Thr Ile Asp Leu Asp Lys Glu Leu Ser

1 5 10 15

Asn Ala Gly Asn Thr Thr Asn Leu Gly Glu Ala Val Gln Val Lys Pro

20 25 30

Gln Glu Ile Thr Leu Lys Leu Arg Pro Gly Gln Pro Thr Gln Phe Thr

35 40 45

Phe Gln Val Arg Gln Ala Glu Asp Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Val

50 55 60

Met Asp Leu Ser Lys Ser Met Glu Asp Asp Leu Val Asn Leu Arg Lys

65 70 75 80

Val Gly Asp Val Leu Ala Glu Glu Met Ser Gln Ile Thr Ser Asp Phe

85 90 95

Arg Met Gly Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Val Val Met Pro Tyr Val

100 105 110

Ser Thr Val Pro Ala Lys Leu Ala Glu Pro Cys Ser Gly Cys Gln Ala

115 120 125

Pro Tyr Gly Phe Lys Asn Glu Leu Ser Leu Thr Gly Asp Thr Ser Glu

130 135 140

Phe Ser Arg Thr Ile Asn Gln Leu Gln Val Ser Gly Asn Leu Asp Ala

145 150 155 160

Pro Glu Gly Gly Met Asp Ala Leu Met Gln Val Thr Val Cys Lys Glu

165 170 175

Ala Ile Gly Trp Arg Asp Met Ala Arg His Leu Val Ile Phe Thr Thr

180 185 190

Asp Ala Ser Phe His Tyr Ala Gly Asp Gly Lys Leu Gly Gly Ile Val

195 200 205

Lys Pro Asn Asp Gly Asn Cys Tyr Thr Thr Ala Leu Asp Asn Thr Tyr

210 215 220

Thr Met Ser Ser Glu Leu Asp Tyr Pro Ser Ile Ser Gln Leu Asn Ala

225 230 235 240

Ala Met Arg Asp Asn Ser Ile Ile Pro Ile Phe Ala Val Thr Gln Ser

245 250 255

Glu Phe Ser Val Tyr Gln Asn Leu Thr Glu Tyr Ile Glu Gly Ala Gln

260 265 270

Ala Ala Val Leu Ala Ala Asp Ser Arg Asn Ile Val Glu Ile Val Lys

275 280 285

Asn Asn Tyr Ala Ala Ile Thr Ser Lys Val Glu Val Val Asp Thr Ala

290 295 300

Pro Glu Asp Val Leu Val Glu Tyr Thr Ala Ile Cys Leu Asp Gly Val

305 310 315 320

Arg Arg Pro Gly Thr Gln Val Cys Glu Gly Leu Thr Leu Gly Asp Thr

325 330 335

Val Ser Phe Asp Val Thr Val Thr Gly Asn Thr Cys Pro Asp Ser Arg

340 345 350

Thr Ser Ser Phe Thr Ile Arg Pro Val Gly Phe Ser Glu Glu Leu Gln

355 360 365

Val Asn Ile Glu Tyr Leu Cys Asp Cys Asp Cys Glu Gly Ser Gly Ile

370 375 380

Pro Asn Ser Pro Asp Cys Ser Lys Gly Ala Gly Thr Leu Glu Cys Gly

385 390 395 400

Ala Cys Asp Cys Asn

405

<210> 2

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accagcccga actcttctta caccatcgat ctggataaag aactgagcaa cgcgggtaac 60

accaccaacc tgggtgaagc ggttcaggtt aaaccgcagg aaatcaccct gaaactgcgt 120

ccgggccagc cgacccagtt caccttccag gttcgtcagg cggaagatta cccggttgac 180

ctgtattacg tgatggacct gtctaaaagc atggaagatg atctggttaa cctgcgtaaa 240

gttggtgatg ttctggctga agaaatgagc cagatcacca gcgatttccg tatgggcttc 300

ggcagcttcg ttgataaagt tgtaatgccg tacgttagca ccgttccggc gaaactggcg 360

gaaccgtgca gcggttgcca ggcgccgtac ggcttcaaaa acgaactgtc tctgaccggt 420

gatacctctg aattctcccg caccattaac cagctgcagg tgtctggtaa cctggatgct 480

ccggaaggtg gtatggatgc gctgatgcag gttaccgttt gcaaagaagc tatcggttgg 540

cgtgacatgg cacgccacct ggttatcttc accaccgatg ctagcttcca ctatgcaggt 600

gatggtaaac tgggcggtat cgttaaaccg aacgatggta actgctacac caccgcgctg 660

gacaacacct acaccatgag ctccgaactg gattacccgt ccatctctca gctgaacgcg 720

gcgatgcgtg ataacagcat catcccgatc ttcgcggtga cccagtctga attctctgtt 780

taccagaacc tgaccgaata catcgaaggt gcgcaggcgg cggtgctggc tgcggatagc 840

cgtaacatcg ttgaaatcgt taaaaacaac tatgcggcga tcacctctaa agttgaagtt 900

gttgataccg ctccggaaga tgttctggtg gaatacaccg caatttgcct ggatggtgtg 960

cgtcgtccgg gcacccaggt ttgcgaaggt ctgaccctgg gtgataccgt tagcttcgac 1020

gttaccgtta ccggtaacac ctgcccggat agccgtacca gctctttcac catccgcccg 1080

gttggcttca gcgaagaact gcaggttaac atcgaatacc tgtgcgattg cgattgcgaa 1140

ggtagcggta tcccgaactc tccggattgc agcaaaggtg cgggcaccct ggaatgcggc 1200

gcttgcgatt gcaactaa 1218

<210> 3

<211> 2364

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattgta aacattcaat attcttatta ctgttactgt actgtgcgag gtctatacat 60

gcccagaacc tagctgctag cccttgcaat gatgccaaga catgtggggc ctgtattgtg 120

ttggacccgt cctgtggctg gtgcacacaa ggaaacttca cagataccgg cagtcctaga 180

tgtgacacca ttccaaatct ccgtatgcaa ggatgcagtg aatatacaag tcctaatagt 240

tcttatacga ttgatttgga caaagaattg agtaatgcag gaaacacaac caatttaggt 300

gaagctgtac aagtgaaacc acaggaaata actctgaaat tgagaccagg tcaacctact 360

cagtttacat ttcaagtgag gcaggcagaa gattaccctg ttgatcttta ctacgtcatg 420

gatctttcca aatcgatgga ggatgatttg gtcaatttgc ggaaagttgg agatgttctt 480

gctgaagaga tgagtcaaat cacaagtgac tttcgaatgg gttttggatc gtttgtggac 540

aaggtggtga tgccatatgt cagcaccgta ccggccaagc tagcagaacc ttgtagcggt 600

tgtcaggctc catatggctt taagaacgaa ctcagtctga ctggggatac aagtgaattc 660

tctagaacaa ttaaccagct gcaagtctct ggaaatctcg atgcccctga agggggcatg 720

gatgccctta tgcaagttac agtatgcaag gaggcgattg gttggaggga catggcgaga 780

catttagtta tcttcaccac cgatgcgtcc ttccattatg cgggagatgg caagcttggt 840

ggtatcgtta aacctaacga tggaaactgt tacaccacag cccttgacaa tacgtacacc 900

atgtcaagtg aattggacta tccttcgatt agtcaactga atgctgccat gagagataac 960

agcatcattc caatttttgc tgtgacacag tctgaatttt cagtttatca gaatcttacg 1020

gaatacattg agggcgctca agcggccgtg ttggcggcag attctcgaaa tattgtggaa 1080

attgtgaaga ataattacgc agcaatcacc agtaaagttg aagtggtgga tacagcacca 1140

gaggacgtac ttgtggaata cactgctatc tgcttggacg gtgttcggcg gcctggtaca 1200

caagtatgtg aaggattgac ccttggagac actgtcagct ttgatgtcac ggtaacaggc 1260

aatacctgcc ctgatagtag aacctccagt ttcaccattc gtcctgttgg cttcagcgag 1320

gagcttcagg tcaacattga ttacttgtgt gattgtgact gtgaaggttc ggggattcca 1380

aacagcccag attgctctga tggggctggt actctggagt gcggggcctg cgattgcaac 1440

gctggacatt acggacgtaa ctgtgaatgc agctctgatg gcccaacact ggaggacagc 1500

gataagctat gtaaagcagg aaattctacc atcatctgtt caggacgagg atcttgtgtc 1560

tgtggtgatt gtgtttgctt ccctagaccg aatccagagg aagtggtgaa gggaactttc 1620

tgcgaatgcg ataatttttc ttgtgatagg cacagaggtc aactctgtgg aggtgaagaa 1680

cacggcacct gtgtctgtga tgaggcatcg aggaagagta aatgtcagtg taaggccggg 1740

tggtctggac cttcttgtgc ctgctcaact acgacagaca cttgcatagc tgctaatggg 1800

gaaacatgca atggttacgg agagtgcgtc tgtggtgctt gtatttgtaa cgccaattca 1860

agctacagtg gtgccaaatg tgaagaatgc agggcatgtc caggaaaatg ccaagccaac 1920

aaagactgtg tggaatgtaa agcatttgga actggcttga ccagagaaca gtgtgacaag 1980

tgcccatata aggtcatccc cgtcaccggc gacctacaga ttccaaatgg ttcggaacgt 2040

tgtctggttc ctgacaacga tggctgttct ttcattttca cctatgaaca gtttagcaac 2100

gatacatttg tcctctacgt acttgcagaa aagagctgtc cagagccgat caatcctctc 2160

gtagtcatca ttcccatcgt gatcggtatc attctcatcg gattactctt gcttattctc 2220

tggcgtgtcc tgatttatct atgggacagg aaggaataca aacaatttga aaaggatagg 2280

gcaaatgcta aatgggaaat gggagaaaat ccgatataca agccatcgac cacaatccac 2340

aaaaacccaa tgtatgggaa gtaa 2364

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggattgta aacattcaat attc 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacttccca tacattgggt ttttgtgg 28

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcagaagat taccctgttg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggccttaa agagttcttg c 21

Claims

1.一种仿刺参整合素抗原蛋白，其特征在于，所述仿刺参整合素抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的仿刺参整合素抗原蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种仿刺参整合素抗原蛋白的重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的基因和初始载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述初始载体为pColdⅡ，所述基因插入初始载体的NdeI和HindIII酶切位点之间。

5.权利要求1所述的仿刺参整合素抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

将权利要求3或4所述的重组表达载体转化大肠杆菌、表达，得到仿刺参整合素抗原蛋白。

6.一种仿刺参整合素多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体是以权利要求1所述的仿刺参整合素抗原蛋白免疫小鼠后得到。

7.仿刺参整合素βG基因编码区全序列，其特征在于，如SEQ ID NO.3所示。

8.一种扩增权利要求7所述仿刺参整合素βG基因编码区全序列的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.4～5所示。