KR20000065266A - 말라리아 원충 msp-1의 c-말단 단편을 함유하는 재조합 단백질 - Google Patents
말라리아 원충 msp-1의 c-말단 단편을 함유하는 재조합 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바큘로비루스에서 생성된 재조합 단백질에 관한 것이며, 이의 필수 구성 폴리펩티드 서열은 인간에 대해 감염성이 있는 말라리아원충, 특히 열대열 말라리아원충의 말라리아원충체 기생충의 표면 단백질(단백질 MSP-1)의 19킬로달톤(p19)의 C-말단 단편의 것이다. 상기 C-말단 단편은 감염 사이클에서 발생하는 인체 적혈구내로의 침입 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있다. 본 발명의 재조합 단백질은 말라리아용 백신 제조에 사용할 수 있다.
Description
이미 MSP-1은 많은 연구의 대상이 되어 왔다. MSP-1은 말라리아원충 유형의 기생체, 특히 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)의 번식체에서 합성되고, 말라리아의 간(肝)기 및 적혈구기에서 말라리아유충제의 주표면 성분중 하나의 형태로 발현된다(1,2,3,4). 공지된 모든 말라리아원충 종에서 단백질의 우점 형질과 보존성 때문에, 이를 항-말라리아 백신 성분에 사용할 수 있다고 제안되어 왔다(5,6).
예를 들어 감염된 숙주의 적혈구내로 기생체가 침입하는 동안, 형성되는 것으로 관찰되는 단백질의 단편, 특히 천연 절단 생성물도 백신 성분에 사용할 수 있다. 절단 생성물중에는 42kDa의 분자량을 갖는 C-말단 단편이 있으며(7, 8), 이는 통상 33kDa의 겉보기 분자량을 갖는 N-말단 단편과 통상 19kDa의 겉보기 분자량을 갖는 C-말단 단편으로 다시 한번 자가 절단되며, 변형을 수행한 후에 글리코실포스 파티딜이노시톨(GPI)기를 통해 기생체 막에 정상적으로 고정된다(10,11).
또한, 19kDa 단편이 아직 공지되지는 않았지만 의심할 여지 없이 재-침입 과정에 필수적인 역할을 한다는 것이 적혈구내 발육 사이클의 초기 고리기에서 관찰 결과 발견되었다. 이는 상기 단백질이 유효 백신에 사용하기에 특히 효과적인 표적을 구성할 수 있다는 과거에 설정된 가설을 기초로 한 것이다.
특정 유형의 말라리아원충에서 유래된 p42 및 p19단백질에 대해 하기 제시되는 참조문헌들은 그 말라리아원충의 MSP-1 단백질을 절단한 상응하는 C-말단 절단 생성물이나, 또는 신장에 의해 얻어지는 생성물이나, 유전자 재조합이나 예컨대 "Applied System" 합성기를 사용하는 종래 기법을 이용하는 화학적 합성법, 또는 "메리필드(Merrifield)" 유형의 고체상 합성에 의해 얻어지는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 생성물에 관하여 개시하고 있다. 편의상, "재조합 p42 및 "재조합 p19"는 각각 1가지 이상의 유전자 조작 단계를 포함하는 기술로 얻은 "p42" 및 "p19" 의미한다.
열대열 말라리아원충에 대한 다량의 기생체를 얻기 어렵고 생체외에서 삼일 열 말라리아원충(P. vivax)을 배양하는 것이 불가능하기 때문에, 항-말라리아 백신을 제조하는 유일한 방법은 재조합 단백질 또는 펩티드를 사용하는 기술을 이용해야 한다는 것은 명백해졌다. 그러나, MSP-1은 그 크기가 약 200kDa으로 크기 때문에 전체를 생성하기가 매우 어려우며, 이 때문에 C-말단 부분을 연구하게 되었으며, 이의 기능(여전히 알려지지 않은)은 아마도 더욱 중요할 것이다.
원숭이에서 생성되고 시험된(12,40,41) 열대열 말라리아원충 MSP-1의 C-말단 부에 관여하는 재조합 단백질은 하기와 같다:
ㆍ 이.콜리(E.coli)에서 생성된 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 융합된 p19(40);
ㆍ 이. 콜리에서 생성된 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 융합된 p42(12);
ㆍ 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)에서 생성된 보조 T 세포 에피토프를 보유하고 파상풍 아나톡신에서 유래된 폴리펩티드와 융합시킨 p19(12);
ㆍ 바큘로비루스 계에서 생성된 p42(41).
이. 콜리중에서 생성된 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 융합시킨 p19 단백질을 명반 또는 리포좀과 함께 함유하는 조성물은, 6마리의 백신접종한 아오투스 난시마이(Aotus nancymai) 원숭이중 어떤 원숭이에서도 감염방어 효과를 나타내지 않았다(40).
이. 콜리중에서 생성된 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 융합시킨 p42 단백질을 프로인트 완존 보조액과 함께 함유하는 조성물은, 2종류의 아오투스 원숭이[에이. 난시마이(A. nancymai) 및 에이. 보시페란스(A. vociferans)]에게 투여한 경우 감염방어 효과를 나타내지 않았다. 에스. 세레비시애에서 생성된 p19 단백질은 2마리의 에이. 난시마이 유형의 아오투스 원숭이에서 감염방어 효과를 나타내었다. 대조적으로, 2마리의 에이. 보시페란스 유형의 아오투스 원숭이에 대해서는 감염방어 효과를 나타내지 않았다.
또한, 일부 연구진(장 등)은 열대열 말라리아원충과 공통되는 하나의 아미노산 서열을 포함하고 바큘로비루스 계에서 생성되는 재조합 p42 단백질을 이용하여 토끼에서 수행한 면역화 시험을 보고하였다(18). 따라서, 이들 연구진들은 토끼에서 재조합 p42가 전체 재조합 MSP-1 단백질(gp195)과 거의 동일한 방식으로 작용한다는 것을 보고하였다. 이 프로인트 완전 보조액과 혼합한 p42 단백질은 열대열 말라리아원충에 의해 감염되기 쉬운 인간이 아닌 영장류, 즉 아오투스, 레무리너스 그리세멤브라(Aotus, lemurinus grisemembra)에서 백신 접종 시험의 대상이 되어왔다(40). 그 결과 3마리중 2마리가 완전한 감염방어 효과를 나타내었으며, 나머지 한 마리는 대조군과 유사한 기생충혈증을 보이면서 더 긴 잠복기를 갖는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 기생체 자체에 대해 유도되는 항체가 인체에도 감염방어특성이 있다고 결론짓는 것은 위험이다. 삼일열 말라리아원충 및 열대열 말라리아원충에 대한 영장류의 만족스러운 실험 모델은 현재 없다는 것을 기억해야 한다. 열대열 말라리아원충 및 삼일열 말라리아원충에 대해 개발된 사이미리(Saimiri) 모델과, 열대열 말라리아원충에 대해 개발된 아오투스 모델은 가공 계이며, 이 계는 기생체를 적응시킬 필요가 있고, 종종 현저한 기생충혈증을 얻기 위해 동물의 비장적출술을 필요로 한다. 결과적으로, 이 모델로부터 얻은 백신 접종 결과는 인간에게는 제한적인 예측치만을 제공할 수 있다.
임의의 경우에, 이러한 재조합 단백질로 얻을 수 있는 실제 백신화율이 어느 정도인 지의 여부외에도, 동종에 속하는 다른 균주에 의한 감염에 대하여 말라리아원충 균주 유래의 p42로 백신접종된 개체중에서 유도된 항체들의 면역보호 효능은 동종의 말라리아원충 유래의 p42, 특히 대응하는 p33내에 초가변 영역이 존재하면 (후술) 대부분의 경우에 불확실해진다(13).
기생충 유형에서 종종 관찰되는 p42의 N-말단 부의 높은 다형성은 면역 일탈에 중요한 역할을 하는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명의 목적은 이들 난점을 피할 수 있는 백신접종용 재조합 단백질을 제조하는 것이며, 이 감염방어 효과는 중요한 실험 모델 또는 인체에도 직접 증명가능하다.
본 발명은 포유 동물, 특히 인간을 감염시키는 말라리아원충(Plasmodium)의 말라리아유충제 형태에 존재하는 주 표면 단백질, 더욱 구체적으로는 MSP-1로 불리우는 단백질로부터 유도되는, 백신용 신규 유효 성분에 관한 것이다.
도 1a 는 합성 유전자(Bac19)와 "천연 유전자"(PF19)의 서열을 도시한 것이다.
도 1b는 PfMSP1p19A 작제물의 합성 서열을 도시한 것이다.
도 1c는 시그널 서열을 절단하기 전인 PfMSP1p19S 재조합 단백질 서열을 도시한 것이다.
도 1d는 시그널 서열을 절단한 후의 PfMSP1p19S 재조합 단백질 서열을 도시한 것이다.
도 2a는 면역친화성으로 정제한 가용성 재조합 PfMSP1p19항원을 β-머캅토에탄올 존재(환원) 또는 부재(비환원) 조건하에 SDS-PAGE를 사용하여 면역블롯한 분석결과를 도시한 것이다.
도 3a은 가용성 PvMSP1p42재조합 항원의 면역블롯 결과를 도시한 것이다.
도 4a1과 도 4a2는 사이노몰기 말라리아원충, 삼일열 말라리아원충(Belem) 및 삼일열 말라리아원충(Sal-1) 유래의 p42서열을 정렬하여 개시하고 있는 에스.론가크레인(S.Longacre)의 문헌(13)에 기재된 도 1의 사본이다.
도 4b는 삼일열 말라리아원충과 사이노몰기 말라리아원충에서 얻어진 2가지 분리물간의 동일성%를 도시한 것이다.
도 5는 감염후 경과 시간(일)의 함수로서 혈액 1μl당 감염된 적혈구 세포의 수로서 측정된 기생충혈증의 변화를 도시한 것이다.
도 6a 내지 도 6g는 감염후 시간의 함수로서 항원투여 동물에서 관찰되는 기생충혈증의 결과를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 다람쥐 원숭이에서 재조합 열대열 말라리아원충 p19를 이용한 백신 접종 시험의 결과를 도시한 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 사이노몰기 말라리아원충에 대하여 토크 머카크 원숭이의 백신 접종 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9a 내지 도 9e2는 사이노몰기 말라리아원충에 대하여 토크 머카크 원숭이계에 명반과 함께 p19를 사용하여 백신 접종 시험한 결과를 도시한 것이다.
도 10a 내지 도 10g는 다람쥐 원숭이에 대해 재조합 열대열 말라리아원충 p19를 이용한 백신접종 시험한 결과를 도시한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 유효성분으로서 글리코실화되거나 글리코실화될 수 없고, 필수 구성 폴리펩티드 서열이
· 인간에 대해 감염성이 있는 말라리아원충 기생충의 말라리아유충체형 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19 킬로달톤(p19) C-말단 단편이거나(이 C-말단 단편은 감염 사이클에서 인체 적혈구내로의 침입 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있음);
· 해당 기생충에 의한 생체내 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역 응답 반응을 유도할 수 있는 상기 단편의 일부이거나;
· 상기 p19 단편이나 이 단편의 일부와 면역학적 등가의 펩티드 서열중에서 선택되며, 또한 환원 배지중에서 불안정한 구조적 에피토프를 포함하고, 바람직하게는 이러한 에피토프들의 대부분이 해당 말라리아원충에 대하여 형성된 인간 항혈청에 의해 인식되는 재조합 단백질을 함유하는, 인간을 감염시키는 말라리아원충형 기생충에 대한 백신 조성물을 제공한다.
백신의 유효 성분중에 이러한 구조적 에피토프들의 존재는 예방 효능에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다. 이 에피토프들은 바큘로비루스 벡터 계에서 생성될 때 전술한 다른 특징을 나타내는 유효 성분중에서 특히 발견된다. 필요하다면, "바큘로비루스 벡터계"라는 표현은 바큘로비루스 형 벡터 자체와 세포 주, 구체적으로 이 세포주들로 전이될 서열에 의해 변형된 바큘로비루스에 의해 형질감염되어 전이된 서열을 발현할 수 있는 곤충 세포로 구성된 집합체를 의미하는 것으로 이하에 기재된다. 바큘로비루스 계에서 상기 2 파트너들의 바람직한 예는 론가크레 등의 문헌(19)에 기재되어 있다. 이와 동일한 계를 하기 실시예에 사용하였다. 물론, 선택된 계 대신에 바큘로비루스와 이 바큘로비루스에 의해 감염될 수 있는 세포들에 대하여 변형이 이루어질 수 있다는 당연한 것이다.
특히, 재조합 단백질은 환원되지 않은 상태나 가역적 상태로 환원된 경우에 해당 말라리아원충 또는 동종 말라리아원충에 대해 형성되는 항혈청에 의해 인식되지만, 비가역적으로 환원되는 경우에는 전혀 또는 단지 약간만 동일한 항혈청에 의해서 인식된다.
이러한 형태적 에피토프들의 환원 배지에서의 불안정한 성질은 하기 실시예에 기재된 시험에 의하여, 특히 β-머캅토에탄올의 존재하의 시험에서 관찰될 수 있다. 유사하게, 하기의 실시예는 본 발명의 단백질을 비가역적으로 환원시키는데 적용할 수 있는 실험적 조건을 개시하고 있다.
이러한 점에 비추어 볼 때, 론가크레 등(14)에 의해 생성된 재조합 단백질은 이러한 조성물에 사용될 수 있다. 에스. 론가크레 등은 삼일열 말라리아원충의 제조합 p19를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 바큘로비루스 벡터계에서 삼일열 말라리아원충의 MSP-1 유래의 재조합 p19를 생성하는데 성공하였고, 구체적으로, 하기 기재된 펩티드 단편을 암호하는 서열을 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 함유하는 바큘로비루스 벡터로 곤충 세포[스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9)주]의 배양물을 형질감염시켜 생성하였으며, 사용된 바큘로비루스 벡터내에 존재하는 서열들은 다음과 순서대로 위치한다:
-이 단백질의 발현을 개시시키기 위한 메티오닌 코돈을 변이(ATT로)시킨 폴리헤드린 시그널 서열의 35염기쌍 5' 말단 단편;
-MSP-1 시그널 펩티드를 비롯하여 MSP-1의 N-말단 부에 해당하는 32개 아미노산 펩티드를 암호하는 5'-말단 뉴클레오티드 단편;
-p19를 암호하는 뉴클레오티드 서열이나, 또는 삼일열 말라리아원충의 MSP-1 단백질의 p42를 암호하는 서열, 이 서열들은 경우에 따라서 C-말단 발현 생성물이 기생균 막에 최종 p19 단백질을 고착시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된, 상기 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 영역을 함유하거나("고착"형태) 또는 함유하지 않는(가용성 형태) 형태로 제공된다;
-2개의 TAA 종지 코돈.
p42의 경우, MSP-1의 C-말단 영역에서 유도된 서열들은 결과적으로 아미노산 Asp 1325 내지 아미노산 Leu 1726(고착 형태) 또는 아미노산 Asp 1325 내지 아미노산 Ser 1705(가용성 형태)로 전개될 것이며, p19의 경우에 그 서열들은 아미노산 Ile 1602 내지 아미노산 Leu 1726(고착 형태) 또는 아미노산 Ile 1602 내지 Ser1705(가용성 형태)로 전개되는 바, 초기 아미노산과 말단 아미노산이 전술한 바와 같은 p42와 p19의 완전한 아미노산 서열이 서열 분석된 바 있는 삼일열 말라리아원충의 Belem 분리물의 유전자(20)로부터 얻어진다는 것을 알 수 있을 것이다.
동일한 벡터계에서, 사이노몰기 말라리아원충의 p19와 p42를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 사용한 결과, 유사한 결과가 얻어졌다. 사이노몰기 말라리아원충에 대한 관심도는, 머카크 원숭이에 대한 감염성이 큰 삼일열 말라리아원충과 근연성이 높은 기생체 종이기 때문에 2배로 크다. 또한, 인간도 감염시킬 수 있다. 사이노몰기 말라리아원충의 천연 숙주인 리서스 원숭이와 토크 머카크 원숭이에 대한 접근으로 천연계에서 사이노몰기 말라리아원충에 대한 MSP-1의 예방 효능을 시험할 수 있게 되었다. 리서스 원숭이는 인간의 면역 반응을 가장 대표하는 종의 하나로 간주된다.
특히, 2가지 재조합 폴리펩티드, 즉 각각 바큘로비루스계내에서 생성되고 천연 MSP-1단백질의 해당 영역을 인식하는 모노클로널 항체들을 사용하여 친화성 칼럼으로 정제한 사이노몰기 말라리아원충 유래의 가용성 p42와 p19를 가지고 토크머카크 원숭이에 대하여 백신접종 시험을 실시한 결과 우수한 결과가 얻어졌다. 그 결과로서, p19 단독물(3마리 원숭이) 및 p19와 p42로 함께(3마리 원숭이) 면역화시킨 6마리 원숭이들은 모두 항원투여 감염후 실질적으로 무균 면역성을 나타냈다. p42로 면역화된 3마리의 원숭이에서 얻어진 결과는 보다 좋지 않은 결과를 나타냈다. 이 원숭이들중 2마리는 전술한 바와 같았으나, 3번째 원숭이는 프로인트 보조액의 존재하에 PBS 완충액으로 면역화하거나(3마리 원숭이) 또는 면역화하지 않은(3마리 원숭이) 대조군보다는 낮은 기생충혈증을 나타냈으므로, 완전하지 않았다.
제2항원투여 감염으로 p19를 단독으로 수용한 원숭이가 6개월 이상 감염에 대한 예방 효과를 나타내었다. 이 계(토크 마카크(toque macaque) 사이노몰기 말라리아원충)에서 명반과 함께 p19를 사용한 제2백신접종 시험은 3마리중 2마리의 원숭이에서 현저한 감염방어 효과를 나타내었다. MSP-1 또는 다른 재조합 항원이 명반의 존재하에 감염방어 효과를 나타낸 것은 처음이다(42).
사이노몰기 말라리아원충의 재조합 p19를 사용하여 바큘로비루스계에서 생성된 재조합 폴리펩티드를 가지고 머카크에 대하여 실험한 특히 효과적인 시험 결과, 다른 말라리아원충 유래의 재조합 p19를 각각 함유하는 재조합 폴리펩티드들도 동일한 방식으로 작용하는 것으로 나타났다. 이 시험은 "가공 숙주"에서 삼일열 말라리아원충이나 열대열 말라리아원충을 사용하여 실시한 시험 결과보다 인간에 존재하는 말라리아의 경우에 중요한 것이다.
C-말단 MSP-1부(p19)에서 유도된 바큘로비루스 재조합 단백질은 인간에 대한 MSP-1의 예방 효과를 평가하는데 가장 대표적인 모델을 구성하는 천연계에서 매우 현저한 항말라리아 예방 효과를 나타낸다.
또한, 이와 같이 얻어진 예방 효과는, 백신접종된 검체가 상당한 다형성에 직면하는 천연 상황에서 유해한 영향을 미칠 수 있는 p42의 N-말단 부의 초가변 영역이 결실된, 부분 결실된 p42형태를 사용한다면 더욱 향상될 수 있다. 또한, p19는 p42에 존재하지 않는 특이 에피토프를 포함하는 것으로 보인다.
백신의 유효 성분으로 존재하는 서열인 19kDa C-말단 단편은, 통상 해당 MSP-1단백질중 p19 서열의 상류에 있는 임의의 폴리펩티드 서열의 부재하에 p19서열 자체에 대한 서열로 한정될 수 있다. 이 단편의 존재가 백신 유효 성분의 면역적 특성을 변형시키지 않는다면, 후에 자연적으로 절단되기 전에 유효 성분의 필수 구성성분 폴리펩티드 서열은 해당 p42중 p19와 여전히 관련이 있는 33kDa(p33) N-말단 단편에 속하는 C-말단면에 대한 폴리펩티드 서열을 포함할 수도 있다. 특히 실시예에서 후술하는 바와 같이, 동일종의 말라리아원충의 각종 균주에서 p33의 C-말단 서열(도 4에 "영역 III" 펩티드 서열의 C-말단부 참고)은 또한 인간에 감염성이 있는 말라리아원충의 상이한 종류로 예를 들어 80% 이상의 서열 상동성 또는 실질적인 보존성을 가지므로, 유효 성분의 백신접종 특성을 기본적으로 변형시키지 않는다(도 4의 영역 IV에 해당하는 서열). 특히, 이 도면으로부터 하기와 같은 가설을 이용할 수 있다:p19와 p33의 영역 III 사이의 추정 분열이 특히 잘 보존된 영역(LNVQTQ)에서 루이신 잔기 및 아스파라긴 잔기사이에 위치한다.
일반적으로 p33의 C-말단 폴리펩티드 서열은, 존재하는 경우, 50미만의 아미노산 잔기, 심지어는 35미만의 잔기, 바람직하게는 10미만의 아미노산 잔기를 포함한다.
대조적으로, 백신의 유효성분이 필수 구성성분 폴리펩티드 서열이 p19를 암호하는 서열 모두를 포함할 필요는 없으며, 이는 나중에 자연적으로 기생충에 대해 감염방어하는 항체를 유발할 수 있는 능력을 보유하게 된다. 특히, "단편 부"의 분자량은 10kDa 내지 25kDa, 바람직하게는 10kDa 내지 15kDa이다. 이 폴리펩티드 단편은 2개의 EGF(표피 성장 인자) 영역중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
명백한 것은, 당업자라면 활성 단편과 이러한 단편이 되지 못하는 단편을 구별할 수 있는데, 구체적 방법으로서 상이한 기간동안 p19를 암호하는 단편을 적당한 제한 효소와 반응시키거나 또는 엑소뉴클레오분해성 효소를 접촉 유지시켜, 예컨대 p19를 암호하는 서열에서 얻은 단편으로 부터 각각 분리되고, 여러 길이의 p19부를 함유하는 삽입체를 포함하는 변형 벡터를 제조하는 단계; 대응하는 변형 벡터로 형질전환된 해당 진핵 세포, 특히 곤충 세포내에서 상기 삽입체 유래의 발현 생성물들이 나타내는 예방 효과를, 구체적으로 하기 실시예에 기재된 실험 조건하에서 시험하는 단계를 통해 실험적으로 구별할 수 있다. 특히, 이 삽입체들의 발현 생성물은 대응하는 전체 기생체에 의해 생체내에서 유도되는 개생충혈증을 억제할 수 있어야 한다.
따라서, 본 발명은 유효 성분의 필수 구성 폴리펩티드 서열이, 특정 아미노산의 서열을 첨가 또는 결실시키거나 다른 서열로 치환시켜 기생충혈증을 억제하는 변형된 펩티드(이하, "면역학적 등가 펩티드"라 부름)의 성질을 크게 변화시키지 않는다면, 전술한 바와 같은 p19 또는 단편에 의해 생성되는 면역 반응과 등가의 세포 면역 반응 및/또는 체액 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드로 구성되는, 모든 백신화 조성물을 포함한다.
또한, p19는 천연적으로 N-말단 측이나 C-말단 측에, 또는 백신화성을 가진 다른 플라스모이드성 단백질 단편[에컨대 삼일열 말라리아원충 유래의 더피(Duffy)결합 단백질(29)이나 열대열 말라리아원충 유래의 EBA-175(30)과 (31), 이 단백질의 1영역에는 시스테인이 특이적으로 풍부함]에 펩티드 결합을 통하여 결합시킬 수 있으며, 단 대응하는 기생체에 의해 정상적으로 생체내에 발생되는 기생충혈증을 억제하는 성질은 변화하지 않지만 증폭되어야 한다.
또한, p19의 N-말단 단부의 상류에 있는 p19나 이의 일부를 암호하는 단편은 또 다른 펩티드 서열을 포함할 수 있는데, 그 예로는 MSP-1 단백질의 시그널 펩티드의 C-말단 단편을 들 수 있다. 이 서열은 아미노산 50개 미만으로 구성되는 것이 바람직하고, 예컨대 10개 내지 40개의 아미노산을 함유한다.
이러한 관찰은 다른 말라리아원충, 구체적으로 가장 병원성이 큰 말라리아중충 하나로서 기생체들의 주요 종인 열대열 말라리아원충 유래의 부분 결실된 p19에서도 유사한 방식으로 관찰된다.
하지만, 바큘로비루스계에서 삼일열 말라리아원충이나 사이노몰기 말라리아원충 유래의 재조합 p19를 제조하는 전술한 기법들은 면역예방 시험을 실시할 수 있는 인지가능한 양으로 얻을 수 있다면 만족할만한 수율로 열대열 말라리아원충의 재조합 p19를 얻기 위해 변화시키지 않고 전용하는 것은 곤란하다.
또한, 본 발명은 이 문제를 대부분 극복하는 방법을 제공한다. 이 방법에 따르면, 바큘로비루스 계의 발현 벡터에서 열대열 말라리아원충의 p19를 암호하는 천연 뉴클레오티드 서열 대신에, 동일한 p19를 암호하나 GC 함량이 천연 뉴클레오티드 서열내의 존재량보다 더 높은 비율로 존재하는 것이 특징인 합성 뉴클레오티드서열을 사용하여 열대열 말라리아원충 p19( 및 전술한 문제점과 유사한 문제점을 갖고 있는 다른 말라리아원충)를 더 높은 수율로 얻을 수 있게 된다.
환언하면, 본 발명은 바큘로비루스계내에서 p19를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 발현이 이들 바큘로비루스에 정상적으로 함유된 천연 뉴클레오티드 서열에서 관찰되고 감염된 숙주 세포에서 발현되는 방식으로, 바큘로비루스에 의해 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 "세포 기구류"를 사용하여 발현하는 뉴클레오티드 서열내 연속 코돈의 개선된 화합성(compatibility)과 명백한 관련성이 있다는 발견에 따른 것이다; 그러므로, 천연 열대열 말라리아원충 뉴클레오티드 서열의 발현의 저효율이나, 완전한 부재와 대조적으로, 바큘로비루스 계에서 삼일열 말라리아원충의 p19에 대한 론가크레 등(14)에 의해 관찰된 보다 효과적인 발현과, 본 발명자에 의해 관찰된 바와 같은 상응하는 천연 p19 뉴클레오티드 서열로부터 사이노몰기 말라리아원충 서열의 보다 효과적인 발현에 대하여 가능한 설명은 이들의 뉴클레오티드내에 열대열 말라리아원충의 p19를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 GC 함량보다 비교적 다량의 GC 뉴클레오티드가 존재하기 때문이라는 것이다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 벡터내에 함유되어 이 벡터로 형질감염될 수 있는 세포가 인식할 수 있는 프로모터 조절하에 바큘로비루스 계에 의해 이용가능한 시그널 펩티드를 암호하는 제1뉴클레오티드 서열을 함유하며, 이 제1서열의 하류에 위치하며 상기 프로모터의 조절하에서 자신의 구성 서열중에 다음과 같은 서열을 포함하는 펩티드 서열을 암호하는 제2뉴클레오티드 서열을 특징으로 하는 재조합 바큘로비루스형 변형 벡터를 제공한다:
· 인간에 대해 감염성이 있는 삼일열 말라리아원충 이외의 다른 말라리아원충형 기생충의 말라리아유충제 형 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19킬로달톤(p19) C-말단 단편이거나(이 C-말단 단편은 감염 사이클에서 인체 적혈구내로의 침입 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있음);
· 바큘로비루스 계에서 제2서열 유래의 발현 생성물이, 대응하는 기생충에 의해 생체내에서 정상적으로 유도되는 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역 응답을 유도할 수 있는 경우의 펩티드 단편의 부분; 또는
· p19 펩티드 단편이나 상기 이 단편의 부분에 의해 생성되는 것과 유사한 세포 면역 응답 및/또는 체액 면역 응답 반응을 유도하는 면역학적 등가 펩티드의 능력에 큰 변화를 일으키지 않는 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의하여 상기 C-말단 펩티드 단편(p19)이나 이 펩티드 단편의 부분에서 유래된 면역학적 등가 펩티드.
또한, 상기 뉴클레오티드 서열은 경우에 따라 서열을 구성하는 총 뉴클레오티드의 40% 내지 60%범위, 바람직하게는 50% 이상의 GC뉴클레오티드 함량을 갖고 있다. 이러한 서열은 천연 코돈을 해독을 변화시키지 않는 범위에서(펩티드 서열은 유지됨) G/C가 풍부한 코돈으로 변화시킨 합성 유전자를 작제하여 얻을 수 있다.
합성 DNA가 제공하는 뉴클레오티드 서열은 천연의 해독 서열의 특성을 유지하면서, 즉 아미노산 서열을 유지하는 범위에서 천연 cDNA 유전자 서열에 대하여 적어도 10%의 코돈 변화를 가질 수 있다.
또한, 이러한 GC 뉴클레오티드 함량은, 생성된 재조합 펩티드 또는 면역학적 등가 펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 나타나는 변형이, 형성된 재조합 단백질의 면역학적 성질이나 예방성의 상실을, 특히 하기 기재되는 시험에서 나타내지 않는다면 더욱 증가시킬 수도 있다.
이러한 관찰 결과는 인간에게 감염성이고, 구체적으로 해당 p19를 암호하는 천연 뉴클레오티드 서열에 바큘로비루스계에서 효과적인 발현을 저해하는 TA 뉴클레오티드 함량을 함유한 다른 말라리아원충에도 적용된다.
사용된 시그널을 암호하는 서열은 관련된 말라리아원충의 천연 서열과 정상적으로 결합된 것일 수 있다. 그러나, 또한 바큘로비루스 계에서 시그널로서 인식될 수 있다면 삼일열 말라리아원충이나 사이노몰기 말라리아원충과 같은 다른 말라리아원충이나 다른 미생물로부터 얻을 수도 있다.
고려중인 벡터내에서 p19나 이의 부분을 암호하는 서열은 필요하다면 이 서열을 얻은 기생충에 대한 천연 단백질의 고착 서열을 결실시킬 수 있고, 이러한 경우에 발현된 단백질은 일반적으로 배양액으로 분비된다(가용성 형태). 본 발명의 조건하에서 생성된 가용성 형태와 고착된 형태의 재조합 단백질이, 특히 열대열 말라리아원충 또는 사이노몰기 말라리아원충 또는 삼일열 말라리아원충으로부터 형성되는 경우, 올리고머를 형성하는 경향이 있으며, 이 특성은 형성된 재조합 단백질의 증가된 면역원성에 기인하는 것이다.
또한, 본 발명은 숙주내에서 발현되어 그 숙주의 세포막에 대한 천연 단백질의 고착을 유도하는데 일반적으로 관련이 있는 p19의 소수성 C'-말단 단부 서열을 암호하는 말단 3' 단부 서열을 함유하는 암호 서열을 가진 벡터에 관한 것이다. 이 3'-말단 단부 영역은 대응하는 p19를 암호하는 서열에 대해 이종성일 수 있는데, 예컨대 생성된 재조합 단백질 전체를, 사용된 바큘로비루스 계의 숙주의 세포막에 고착시키는 서열을 암호하는 경우에는 삼일열 말라리아원충이나 다른 미생물 유래의 3'-말단 서열에 대응하는 것일 수 있다. 이러한 고착 서열의 예는 스포도프테라 프루기페르다(32)형 곤충의 세포내에서 발현될 수 있는 CD59 항원의 GPI이거나 CD14인체 단백질(33)의 GPI이다.
또한, 본 발명은 해당 말라리아원충에 대하여 형성된 인간 혈청에 의해 인식되는 구조적 에피토프를 함유하는 재조합 단백질에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명은 특히 환원 배지중에서 불안정한 바큘로비루스계내에서 생성되는 것과 같은 형태적 에피토프를 함유하기만 한다면 전술한 유형에 속하는 모든 재조합 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 특히 바큘로비루스계에 사용된 세포 숙주에 대해 가용성 형태이거나 고착 영역을 구비한 형태인 재조합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 통상적인 단백질 올리고머화 기술을 이용하여, 실험적으로 생성되거나 또는 사용한 바큘로비루스 계에서 자발적으로 생성된 올리고머를 포함한다. 가장 일반적으로 사용되는 기술은 글루타르알데히드를 포함한다. 그러나, 단백질내의 반응성 아민과 카르복실 작용기를 연결시키는 임의의 통상적인 계를 사용할 수 있다. 예로서, 유럽 특허 출원 EP-A-0 602 079에 개시된 임의의 기술을 사용할 수 있다.
"올리고머"는 2 내지 50개의 단량체 단위체를 포함하는 분자를 의미하며, 전술한 바와 같이 각 단량체 단위체는 p19 또는 이의 단편을 포함하고 집합체를 형성할 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 바와 같이 공유 결합 또는 기타 결합을 통해 백신 제조에 사용하기 위해서 p19 또는 p19 단편과 담체 분자-예를 들어 폴리리신-알라닌-사이에 임의의 접합 생성물을 포함한다.
본 발명은 또한 삼일열 말라리아원충 유래의 단백질을 비롯한 올리고머 단백질 또는 접합된 재조합 단백질을 사용한 백신 조성물에 관한 것이다. 관찰 결과 이들 재조합 단백질의 올리고머도 사용 가능하다.
본 발명은 전술한 재조합 단백질을 명반과 같은 보조제에 결합시킨 조성물에 관한 것이다. 재조합 단백질이 생성되는 세포의 막에 그 단백질을 고착시키는 역할을 하는 C-말단 단부 영역을 함유하는 재조합 단백질은 백신 제조에 적당한 리포좀을 형성할 수 있는 지질과 함께 사용하는 것이 유리하다. 이러한 지질의 예는 문헌["Les liposomes aspects technologique, biologique et pharmacologique"[리포좀:기술적, 생물학적 및 약리학적 측면) by J. Delattre et al., INSERM, 1993]에 기재 되어 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
적당한 백신화 부에 있어서 재조합 단백질내에 동종성이거나 이종성이거나의 여부에 관계없이 고착 영역이 존재하면 특히 높은 예방 활성을 나타낼 수 있는 세포친화성 항체, 특히 마우스에 존재하는 IgG2a와 IgG2b형의 항체 생성이 고무되고, 이와 같이 구성된 백신의 유효 성분을 리포좀 형태를 만들기 위해 사용된 지질 이외의 다른 보조제와 결합시켜 분산시킬 수 있다. 이러한 성질은 리포좀이 저온 저장수단의 연계를 필요로 함이 없이도 저장 및 수송될 수 있는 조건하에서 동결건조시킬 수 있으므로 주요 잇점을 제공한다.
본 발명의 기타 특징은 본 발명의 재조합 단백질의 실시예의 설명과 이 단백질이 제조될 수 있는 조건으로 부터 명백해질 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
PfMSP1p19S(가용성)작제물(열대열 말라리아원충의 가용성 p19)
재조합 작제물 PfMSP1p19S는 리더 서열의 8개 염기쌍, Met1에서 Asp32까지 전개되는 삼일열 말라리아원충의 MSP-1의 처음 32개 아미노산(Belem 분리물; Del Portillo et al., 1991, P.N.A.S., 88, 4030)과 그 다음에 상기 두 단편을 연결하는 EcoRI 부위에 의한 GluPhe에 상응하는 DNA를 포함한다. 이 다음에는 도 1에 기재된, Asn1613에서 Ser1705(Uganda-Palo Alto 분리물; Chang et al., 1988, Exp. Parasitol., 67, 1)까지 전개되는 열대열 말라리아원충 MSP1p19를 암호하는 합성 유전자를 배치한다. 이 작제물은 2개의 TAA 종지 코돈으로 종결시킨다. 이 작제물은 감염 세포에서 배양 상청액으로 분비되는 재조합 단백질을 생성하였다.
비교용으로서, 이와 동일한 방식으로 상기 p19를 생성하기 위해 사용된 것과 유사한 조건으로 재조합 작제물을 제조하였으나, 단 암호 서열에는 문헌[Chang et al., Exp. Parasit. 67, 1:1989]에 기재된 열대열 말라리아원충 균주(FUP)의 대응하는 DNA의 직접 복사체를 포함시켰다. 천연 유전자 복사체(Asn1613-Ser1705)는 천연 유전자로부터 PCR로 제조하였다.
도 1a는 합성 유전자(Bac19)와 "천연 유전자"(PF19)의 서열을 도시한 것이다.
이 서열을 살펴보면, 열대열 말라리아원충 유래의 p19를 암호하는 천연 서열의 93개 코돈중 57개 코돈이 변화되어 있다(이 57개 코돈중 55개의 코돈은 세 번째 뉴클레오티드가, 다른 2개의 코돈은 첫 번째와 세 번째 뉴클레오티드가 변화됨). 5' 단부에는 새로운 코돈들이 첨가되어 있어 전술한 바와 같은 조건하의 펩티드 시그널을 병입시키고 클로닝을 위한 EcoRI 부위를 도입시키며, 이와 유사하게 열대열 말라리아원충 p19에는 존재하지 않는 2개의 종지 코돈을 첨가하여 발현 종지 시그널을 형성시킨다. 연속 코돈들 상에 배치된 각각의 문서들은 각각의 연속 아미노산에 해당된다. 별표는 종지 코돈을 나타낸다. 수직선은 2개의 서열에서 동일한 뉴클레오티드를 나타낸다.
PfMSP1p19A 작제물(고착형 GPI)(열대열 말라리아원충의 고착형 p19)
PfMSP1p19A 작제물은 합성 서열(도 1B)이 Asn1613에서 Ile1726까지 전개되는 열대열 말라리아원충(Uganda-Palo Alto 분리물)의 MSP1p19를 암호하고 그 다음에 2개의 TAA 종지 코돈이 배치되는 것을 제외하고는 전술한 바와 같은 특징을 갖고 있다. 이 작제물은 글리코실 포스파티닐 이노시톨(GPI)형 구조에 의해 감염 세포의 혈장막에 고착되는 재조합 단백질을 생성하였다.
도 1c는 시그널 서열을 절단하기 전인 PfMSP1p19S 재조합 단백질 서열을 도시한 것이다.
도 1d는 시그널 서열을 절단한 후의 PfMSP1p19S 재조합 단백질 서열을 도시한 것이다.
도 1c와 1d에서 밑줄친 아미노산은 삼일열 말라리아원충의 MSP-1의 N-말단부(시그널 서열 가짐)와 열대열 말라리아원충의 MSP-1p19에서 유도된 뉴클레오티드 서열을 결합시키는데 사용된 EcoR1부위에서 유래된 것이다.
도 2는 면역친화성으로 정제한 가용성 재조합 PfMSP1p19항원을 β-머캅토에탄올 존재(환원) 또는 부재(비환원) 조건하에 SDS-PAGE를 사용하여 면역블롯한 분석결과를 도시한 것이다. 시료는 2% SDS 존재하에 95℃로 가열한 후 겔 위에 충전하였다. 이 조건하에서는, 단지 공유결합형 결합(디설파이드 가교)만이 분해되지 않을 수 있다. 좌측 블롯은 천연 p19의 선형 에피토프와 반응하는 모노클로널 항체로 밝힌 것이다. 우측 블롯은 열대열 말라리아원충에 의한 말라리아에 대해 획득 면역성을 가진 검체 유래의 13명의 인체 항혈청 혼합물로 밝힌 것이다. 이 결과는 재조합 바큘로비루스 분자가 인체 항혈청에 의해 대부분 인식되는 중합체 형태로 형태적 에피토프를 복제할 수 있음을 보여주고 있다.
도 2b:비환원 조건(NR), 장입 배지에서만 환원되는 조건(R) 및 비가역적인 환원 조건(IR)하에서 삼일열 말라리아원충 및 사이노몰기 말라리아원충 유래의 재조합 정제된 MSP-1 p19의 인간 항혈청을 이용한 면역블롯 분석.
이 연구는 바큘로비루스 발현 시스템이 생체내에서 다량의 MSP-1의 C-말단 부분상에 존재하는 구조적 에피토프를 정확하게 재생한다는 것에 착안하였다. 이 특성을 측정하는 가장 좋은 방법(p19에 해당하는 천연 정제된 단백질의 부재하에서만 가능한 방법일 수 있음)은 말라리아에 노출된 개개의 항혈청과 재조합 단백질의 반응성을 연구하는 것이며, 이는 인간 면역 시스템에 의해 "나타나는" 천연 단백질을 반영한 것이다.
따라서, 면역친화도에 의해 정제된 가용성 재조합 PvMSP-1 p19 및 PcMSP-1 p19항원을 DTT의 존재(환원) 또는 부재(비환원)하에 SDS-PAGE(15%)를 사용한 면역 블롯으로 분석하였다. 2% SDS의 존재하에 95℃로 가열한 후에 겔상에 시료를 장입시켰다. 비가역적 환원을 하기와 같이 수행하였다:단배질을 0.2M 트리스-HCl, pH 8.4, 100mM DTT, 1.0% SDS에 재현탁시키고 70℃에서 30분동안 가열하였다. 물로 희석한 후에, 아크릴아미드를 2M의 최종 농도에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 37℃, 암실에서 질소하에 항온처리하였다. 삼일열 말라리아원충에 기인하는 말라리아에 대해 획득한 면역을 사용하여 검체로부터 유래하는 25개의 인간 항혈청 혼합물로 면역블롯하였다. V 및 C는 각각 삼일열 말라리아원충과 사이노몰기 말라리아원충의 MSP-1에서 유도된 단백질을 명명하는 것이다. 비가역적으로 환원된 재조합 단백질은 인간 항혈청과 반응성을 나타내지 않지만 비가역적으로 환원되지 않은 단백질 또는 비환원된 단백질은 우수한 반응성을 나타낸다는 것에 주목해야 한다. (비 환원된 Pv MSP-1 p19는 글리코실화된 상태에서 니트로-셀룰로스 종이와 잘 결합하지 않기 때문에 다소 약하다). 이들 결과는 이 계에서 재생되는 환원에 감응성이 있는 구조적 에피토프에 완전히 의존하지 않는 경우 바큘로비루스 MSP-1 p19 분자가 주로 인간 항혈청에 의해 인식된다는 것을 보여준다.
도 3-가용성 PvMSP1p42재조합 항원(Longacre et al., 1994, 상기 문헌 참조)은 열대열 말라리아원충의 말라리아유충제에서 유래되는 단백질 분획의 존재하에서 37℃에서 5시간 동안 항온처리하고 등전기촛점법으로 분리하였다. 그 다음 시료를 β-머캅토에탄올의 존재(환원) 또는 부재(비환원)하에 면역블롯 분석하였다. 등전기촛점 분획 5 내지 12와, 세정제의 존재(Tex) 또는 부재(T)하에 얻어진 2개의 총 말라리아유충제 추출물은 분석하였다. 면역블롯은 삼일열 말라리아원충의 MSP1p42과 MSP1p19에 특이적인 모노클로널 항체로 규명하였다. 이 결과는 세정제로 추출될 수 있는 열대열 말라리아원충의 말라리아유충체내에 단백분해 활성이 있다는 것을 암시한다. 특정 분획에서 p42를 분해시킨 결과 분해 생성물(p19)의 다형성이 나타났다. 즉 이 다형성은 β-머캅토에탄올의 존재하에서 고분자량 형태가 사라지고 약 19kDa(Tex-R)의 분자가 형성되기 때문에 디설파이드 가교의 형성과 관련이 있는 것 같다. 따라서, 이 실험에서 관찰되는 p19의 다형성은 생체내 존재하는 이 분자의 고유 성질일 것이다.
도 3b:삼일열 말라리아원충 항-MSP-1 인체 응답에 대한 p42 및 p19 항원의 상이한 기여도
삼일열 말라리아원충에 대해 획득한 면역을 사용한 개체의 항혈청에 의한 삼일열 말라리아원충 PfMSP1p19S MSP-1 p42 및 p19항원의 인식을 하기와 같이 ELISA 억제 기술을 사용하여 비교하였다:삼일열 말라리아원충에 기인하는 말라리아에 대한 획득 면역을 사용하여 검체에서 유래된 25개의 인간 항혈청 혼합물을 1:5000으로 희석하고 상온에서 단독으로, 또는 1mM의 정제된 삼일열 말라리아원충 재조합 p42 또는 p19의 존재하에 4시간 동안 항온처리하였다. 이 혼합물을 500g/ml의 정제 흡착된 재조합 p42 또는 p19와 함께 4℃에서 18시간 동안 피복된 미세역가 웰로 이동시키고, 상온에서 30분 동안 항온처리하였다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척한 후에, 퍼록시다제와 접합된 염소 항-마우스 IgG 를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 492nm에서 광학 밀도를 판독하여 효소 활성을 측정하였다. 억제율(%)은 경쟁 항원의 부재하에서 미세역가 평판상에 피복된 항혈청을 사용하여 100%의 항혈청 활성 100%를 기준으로 계산하였다. 스타뷰(Statview) 프로그램을 사용하여 통계자료를 계산하였다. 각 막대기는 4 내지 12회 측정을 기준으로 한 경쟁/흡수 항원 쌍의 평균 억제율(%)을 나타낸다. 별표(*)는 투니카마이신의 존재하에 생성된 항원을 나타내며, 따라서 N-글리코실화되어 있지 않다. 이들 측정의 중요한 변수는 저 친화 에피토프에 의한 경쟁을 포함하는 1mM의 경쟁 항원 농도와 ELISA에 감응성이 있는 영역에 존재하는 1:5000으로 희석한 항혈청이다. 따라서 이들 자료는 2개의 비교 항원사이에 최대 유사점을 반영한 것이다. 이들 결과는 p19의 존재하에 p42에 대한 인간 항혈청의 반응성 때문에 인간 항혈청에 의해 인식되는 모든 p42 에피토프가 p19에 존재하지는 않더라도 대다수는 p42 항원자체에 의해 억제된다는 것을 보여준다. 그러나, 대조적으로, 인간 항혈청에 의해 인식되는 p19 에피토프의 약 20%는 p42상에 존재하지 않거나 접근하지 않으며, 이는 p19에 대한 인간 항혈청의 반응성이 p19자체보다 p42에 의해 훨씬 덜 억제되기 때문이다. p19의 이러한 특이 에피토프는 p42를 p19 및 p33내로 절단시킨 후에만 구성 또는 밝혀질 수 있다. 이들 결과는 글리코실화에 영향을 받지 않으며, 이 효과가 글리코실화의 차이에 기인한 것이 아니라 실제로 p19와 p42의 펩티드 성분 차이에서 기인한 것임을 보여주었다. 이들 결과는 p19가 p42에 대해 뚜렷한 면역학적 동질성을 갖는다는 것을 나타낸다.
PcMSP1p19S(가용성) 작제물(사이노몰기 말라리아원충의 가용성 p19)
이 작제물에 사용된 DNA는 사이노몰기 말라리아원충 세이로네시스(Plasmodium cynomolgi ceylonesis) 균주(22-23)에서 얻었다. 이 균주는 천연 숙주(마카카 시니카)를 통한 연속 계대화 모기를 통한 순환 전염에 의해 유지시켰다(27).
성숙한 번식체 단계의 혈액 기생균은 기생충혈증이 5% 정도인 감염 원숭이로 부터 얻었다. 그 다음 문헌(25)이 기재된 방법을 사용하여 정제하였다. DNA는 문헌(26)에 기재된 바와 같이 추출하였다.
1200개 염기쌍의 단편은 삼일열 말라리아원충에서 얻은 도 4에 밑줄친 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응으로 제조하였다. 5' 올리고뉴클레오티드는 EcoRI 제한 부위를 포함하고, 3' 올리고뉴클레오티드는 2개의 합성 TAA 종지 코돈과 그 다음에 BgIII 제한 부위를 포함한다. 이 단편은 삼일열 말라리아원충(19)의 MSP-1 단백질이 가진 시그널 서열을 함유하는 pVLSV200플라스미드에 상기 EcoRI과 BgIII 부위를 통해 결찰시켜 도입시켰다. 이와 같이 제조한 새로운 플라스미드(pVLSV200C42)를 사용하여 DNA 서열을 분석하였다.
사이노몰기 말라리아원충의 서열과 대응하는 삼일열 말라리아원충의 서열을 정렬시켰다. 검은색 화살표는 추정상의 제1절단 부위와 제2절단 부위를 나타낸다. 이 부위들은 공지된 열대열 말라리아원충의 부위와 유사한 것으로 측정되었다(27, 28). 수직선과 수평 화살표는 연구된 4영역들의 범위를 나타내는 것이다. 영역 4는 사이노몰기 말라리아원충 p19를 암호하는 서열에 상응한다. 글리코실화 부위에는 박스를 그리고, 보존성 시스테인에는 밑줄을 그었다. 도 4의 아래쪽에는 삼일열 말라리아원충과 사이노몰기 말라리아원충에서 얻어진 2가지 분리물간의 동일성%를 도시한 것이다.
재조합 작제물 PcMSP1p19S는 리더 서열의 8개 염기쌍과 Met1에서 Asp32까지 전개되는 삼일열 말라리아원충의 MSP-1의 처음 32개 아미노산(Belem 분리물; Del Portillo et al., 1991, P.N.A.S., 88, 4030)과 그 다음에 상기 두 단편을 연결하는 EcoRI 부위에 의한 GluPhe에 상응하는 DNA를 포함한다. 이 다음에는 Lys276에서 Ser380(Ceylon 균주)까지 전개되는 사이노몰기 말라리아원충 MSP1p19를 암호하는 서열이 배치된다. 이 작제물은 2개의 TAA 종지 코돈으로 종결된다. 이 작제물은 감염세포의 배양 상청액으로 분비되는 재조합 단백질을 생성하였다.
열대열 말라리아원충의 p19를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체와 면역친화성 크로마토그래피에 의한 재조합 PfMSP1p19 단백질의 정제
크로마토그래피용 수지는 파마시아에서 이용된 절차에 상세히 기재된 표준 방법을 사용하여 활성화된 CNBr-세파로즈 4B(파마시아) 3g에 모노클로널 항체[1997년 2월 14일에 기탁번호 I-1846으로 CNCM(국립 모식균 배양 수집소)(프랑스 파리 소재)에 기탁된 G17.12 하이브리도마에서 얻음; 이 G17. 12 하이브리도마는 열대열 말라리아원충 p19를 인식하는 IgG 2a/k를 생성하는 X63 Ag8 653 골수종을 사용하여 제조하였다]를 결합시켜 제조하였다. 가용성 PfMSP1p19를 함유하는 배양 상청액을 크로마토그래피용 수지와 4℃에서 16시간 동안 배치 항온처리하였다. 이 칼럼을 0.05% NP40, 0.5M NaCl, PBS 20 부피로 1회; PBS 5부피로 1회; 10mM 인산 나트륨(pH 6.8) 2부피로 1회 세척하였다. 용출은 0.2M 글리신(pH 2.2) 30ml를 사용하여 실시하였다. 용출물은 1M 인산 나트륨(pH 7.7)을 사용하여 중화시키고, 그 다음 한외여과로 농축시킨 후 PBS로 투석하였다. 고착된 PfMSP1p19를 정제하기 위한 모든 세척 용액과 용출 용액은 0.1%의 3-(디메틸-도데실암모니아)-프로판 설포네이트(플루카)의 보충물을 포함한다.
다람쥐 원숭이 사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus)에 대한 재조합 삼일열 말라리아원충(p42와 p19) MSP1 백신접종 시험
이 백신접종 시험은 비장절제하지 않은 2 내지 3년령의 수컷 사이미리 시우레우스 볼리비엔시스(Saimiri sciureus boliviensis) 원숭이에 대하여 실시하였다. 3마리의 원숭이에게 면역친화성으로 정제한 재조합 가용성 PvMSP1p42과 PvMSP1p19(19) 각각을 약 50 내지 100μg 함유하는 혼합물을 3주 간격으로 3회 근육내 주사하였다. 완전 프로인트 보조액과 불완전 프로인트 보조액은 다음과 같이 사용하였다:1차 주사, 1:1 FCA/FIA; 2차 주사, 1:4 FCA/FIA; 3차 주사, FIA. 이 보조액 조성물을 그 다음 PBS 중의 항원과 1:1로 혼합하였다. 5마리의 대조용 원숭이에게는 동일한 프로토콜에 따라 이. 콜리에서 생성된 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST) 항원을 투여했다. 최종 주사한 지 2.5주 후에 적응된 삼일열 말라리아원충 균주(Belem)로 감염된 2×106적혈구 세포를 주입하여 항원투여 감염을 실시하였다. 모든 동물내의 기생충혈증에 대한 예방 효과는 김자 염색된 표본 도말을 매일 조사하여 그 결과를 평가하였다.
도 5의 곡선은 감염후 경과 시간(일)의 함수로서 혈액 1μl당 감염된 적혈구 세포의 수로서 측정된 기생충혈증의 변화를 도시한 것이다. 곡선 A는 백신접종된 3마리의 원숭이에서 관찰된 평균 값에 상응한다. 곡선 B는 5마리의 대조용 원숭이에서 관찰된 평균 값에 상응한다.
이 도면의 결과로부터 백신 접종의 효과가 기생충혈증을 크게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
토크 머카크(toque macaque) 마카카 시니카(Macaca sinica)에서 재조합 사이노몰기 말라리아원충(p42 및 p19) MSP1 백신접종 시험
15마리의 포획한 원숭이를 하기와 같이 사용하였다:(1) 3마리의 동물에게는 100μg의 가용성 PcMSP1p42를 주사하였다; (2) 3마리의 동물에게는 35μg(1차 주사) 또는 50μg(2차 및 3차 주사)의 가용성 PcMSP1p42를 주사하였다; (3) 3마리의 동물에게는 PcMSP1p42및 PcMSP1p19의 혼합물을 주사하였다; (4) 3마리의 동물에게는 보조제와 PBS를 주사하였다; (5) 3마리의 동물에게는 주사하지 않았다. 완전 프로인트 보조액과 불완전 프로인트 보조액을 전술한 계획에 사용하였다. 4주 간격으로 근육내 주사하였다. 마지막으로 주사한지 4주후에 사이노몰기 말라리아원충에 감염된 2×105적혈구를 주사하여 항원투여 감염시켰다. 김자(Giemsa)로 기생충을 검사하여 모든 동물에서 매일 기생충혈증을 측정하므로써 감염방어 효과를 평가하였다. 기생충혈증은 400배의 도말 표본 현미경 시야에서 계수한 후에만 기생충혈증을 음성으로 분류하였다. 기생충혈증은 기생충감염된 적혈구의 백분율로 나타내었다.
도 6a 내지 6g는 얻은 결과를 보여준다. 이들 각각의 도면은 감염후에(횡좌표; 일수)시간의 함수로서 항원투여 동물에서 관찰되는 기생충혈증(대수 계산자에서 세로 좌표를 따라 기생충 감염된 적혈구의 백분율로 표시)을 나타낸다.
결과는 하기와 같다:
· 도 6a는 백신접종하지 않은 대조 동물에 관한 것이다.
·도 6b는 프로인트 보조액도 함유하는 염수 용액을 수용한 동물에 관한 것이다.
·도 6c는 동물에게 프로인트 보조액을 투여하여 발생하는 상대적인 결과를 강조할 목적으로 도 6a 및 도 6b를 겹쳐놓은 것이다(편차는 현저하지 않은 것이 명백하다).
· 도 6d는 p42로 백신접종한 후에 얻은 결과이다.
· 도 6e는 p19 단독으로 백신접종한 동물에 관한 것이다.
· 마지막으로 도 6f는 p19 및 p42의 혼합물로 백신접종한 동물에 관한 것이다.
p42는 확실히 어느 정도의 감염방어 효과를 유발하였다. 그러나, 도 6E 및 6F에서 보는 바와 같이, 본 발명의 재조합 p19에 의해 부여되는 감염방어 효과는 상당히 우수하다.
결과적으로 p42가 2차 분해하여 자유 시스테인을 노출시키고, 그 결과 분자간 가교를 형성하여, p19 당량체가 생성되며, 이 형태는 시험된 3종의 재조합 단백질에서 가장 큰 특성으로 나타난다는 가설이 명확하게 설명될 수 있다.
그래프(도 6a 내지 도 6f)를 만들기 위해서 사용한 수치는 도 6g에 나타나 있다.
사이노몰기 말라리아원충 토크 머카크 백신접종 시험; p19 단독으로 백신 접종된 원숭이와 대조군의 2차 항원투여 감염(도 8)
다른 백신접종 없이 6개월 후에, FCA/FIA로 p19 MSP-1을 단독 수용한 3마리의 원숭이(도 6E), 프로인트 보조액을 함유하는 염수 용액을 수용한 3마리의 원숭이(도 6B), 및 2마리의 감염되지 않고 백신접종하지 않은 새 원숭이에게 사이노몰기 말라리아원충으로 주사한 1×106적혈구를 주사하므로써 새로 항원투여 감염시켰다. 모든 동물에서 김자 표본 도말 검사하여 기생충혈증을 매일 측정하므로써 감염방어 효과를 평가하였다. 기생충혈증은 400배 표본 도말 현미경 시야에서 계수한 후 음성으로 분류하였다. 기생충혈층은 기생충 감염된 적혈구의 백분율로 나타내었다(도 8a 내지 도 8c를 제조하기 위해서 사용한 수치는 도 8d에 표시함). 6개월 전에 항원투여 감염시킨 6마리의 면역화된 동물에서는 1일 동안 0.008%의 기생충혈증을 나타낸 각 군에서 1마리의 동물을 제외하고는 기생충혈증이 검출되지 않았다(도 8a 및 도 8b). 2마리의 감염되지 않은 대조군은 21일 동안 최대 0.8%의 통상적인 기생충혈증을 나타내었다(도 8C). 따라서 MSP-1 p19로 백신접종한 3마리의 동물은, 제1항원투여 감염후에 기생충혈증이 존재하지 않거나 매우 약간 존재함에도 불구하고 제1차 항원투여 감염후에 완전한 통상적인 감염을 나타내는 3마리의 대조군보다 6개월 후에 감염방어 효과를 나타내었다. 이들 결과는 p19에 대한 감염방어 기간이 6개월 이상임을 제안하는 것이다.
사이노몰기 말라리아원충 토크 머카크 시스템에서 명반과 함께 p19를 사용한 백신접종 시험(도9)
전술한 양성 감염방어 결과는 완전 프로인트 보조액(FCA) 또는 불완전 프로인트 보조액(FIA)를 사용하여 얻었다. 그러나, 인체에서 현재 허용되는 유일한 보조제는 명반이다. 이 때문에, 보조제로서 명반의 존재하에 토크 머카크에서 사이노몰기 말라리아원충 MSP-1 p19로 백신접종 시험을 수행하였다. 6마리의 포획한 머카크 원숭이를 하기와 같이 사용하였다: (1) 3마리에게는 20mg의 명반과 함께 50mg의 재조합 사이노몰기 말라리아원충 MSP-1 p19를 4회 주사하였다; (2) 3마리에게는 생리식염수와 10mg의 명반을 함께 4회 주사하였다. 4주 간격으로 근육내 주사하였다. 최종 주사한지 4주 후에 사이노몰기 말라리아원충에 감염된 2×105적혈구를 주사하여 항원투여 감염시켰다. 모든 동물에서 김자 표본 도말 검사하여 기생충혈증을 매일 측정하므로써 감염방어 효과를 평가하였다. 기생충혈증은 400배 표본 도말 현미경 시야에서 계수한 후 음성으로 분류하였다. 기생충혈층은 기생충감염된 적혈구의 백분율로 나타내었다. 실험 결과는 하기와 같다. 항원투여 감염후에, 명반과 함께 재조합 p19로 면역화시킨 3마리중 2마리의 원숭이(도 9A 및 9B)는 감염 기간 동안 명반과 생리식염수로 면역시킨 3마리의 대조군 원숭이(도 9D)보다 약 30배 낮은 총 기생충혈증을 나타내었다. p19로 면역화시킨 3번째 원숭이(도 9C)는 대조군과 매우 다르지 않았다. 도 9에서 전술한 토크 머카크 마카카시니카중 사이노몰기 말라리아원충 p19를 사용한 백신접종 시험에서, 그래프(도 9A 내지 도 9D)를 만드는데 사용한 자료는 도 9E에 나타나있다. 이 결과는 전술한 결과(도 6, 도8)보다 다소 작은 감염방어 효과를 나타내지만, 상당한 감염방어 효과가 명반과 함께 사용한 재조합 MSP-1에 대해 관찰된 것은 처음이다.
도 10 : 다람쥐 원숭이에서 재조합 열대열 말라리아원충 p19를 이용한 백신접종시험
잡아서 기른 약 3세의 20마리의 사이미리 시우레우스 가이아넨시스(Saimirisciureus guyanensis)(다람쥐 원숭이)를 하기와 같이 사용하였다: (1) 4마리의 동물에게 하기와 같이 프로인트 보조액의 존재하에 가용성 Pf MSP-1 p19 50mg을 주사하였다: 1차 주사 : 1:1 FCA/FIA; 2차 주사 : 1:4 FCA/FIA: 3차 주사 : FIA. 이어서 이들 보조제 조성물을 PBS중 1:1로 항원과 혼합하였다; (2) 2마리의 대조군 동물에게는 PBS만을 사용하여 (1)에서 전술한 바와 같이 프로인트 보조액을 사용하였다; (3) 4마리의 동물에게는 10mg의 명반(Alu-Gel-S, Serva)의 존재하에 가용성 Pf MSP-1 p19를 주사하였다; (4) 2마리의 대조 동물에게는 10mg의 명반과 PBS만을 사용하였다; (5) 4마리의 동물에게는 하기와 같이 리포좀내로 재구성된 약 50mg 내지 100mg의 GPI 고착된 Pf MSP-1 p19를 주사하였다: 300mmol의 콜레스테롤과 300mmol의 포스파티딜 콜린을 진공 건조하고 1.4mg의 Pf MSP-1 p19, GPI와 함께 PBS중 330mM의 N-옥틸글루코시드에 재현탁시켰다. 이 용액을 흡착 바이오-비드 SM-2(,바이오-래드)로 PBS에 대해 투석하고 형성된 리포좀을 원심분리하여 농축시키고 PBS에 재현탁시켰다. 1차 주사는 4℃에서 유지한 새로운 리포좀으로 만들었고 2차 및 3차 주사는 보존을 위해 냉동한 리포좀으로 만들었다; (6) 2마리의 동물에게는 (5)에서 전술한 바와 같이 p19, GPI 항원의 부재하에 동일한 방법으로 제조한 대조군 리포좀을 주사하였다; (7) 2마리의 동물에게는 생리식염수를 주사하였다. 3회의 근육내 주사를 4주 간격으로 수행하였다. 열대열 말라리아원충으로 감염시킨 1×106적혈구를 주사하여 항원투여 감염시켰다. 모든 동물에서 김자 표본 도말 검사하여 기생충혈증을 매일 측정하므로써 감염방어 효과를 평가하였다. 기생충혈층은 기생충 감염된 적혈구의 백분율로 나타내었다. 백신접종 시험의 결과는 도 10A 내지 도 10G에 나타나 있다.
프로인트 보조액중의 p19 또는 리포좀으로 면역화시킨 군은 항원투여 감염후에 대조군에 유사한 기생충혈증을 나타내었다(프로인트 보조액중 p19로 백신접종한 한마리 동물(29 마리)은 백신접종과 무관한 이유로 항원투여 감염 몇일 후에 사망하였다(심장 정지)). 이들 두 군에 항원의 투여시 불규칙성으로 인하여 (불량한 프로인트 유화액, 응고된 리포좀) 이들 결과의 중요성을 완전하게 평가할 수 없다. 명반을 사용한 군에서, 2마리는 대조군 보다 약 4배 작은 감염 지속기간동안 기생충혈증을 나타내었으며, 1마리는 3배 적은 감염 지속기간동안 기생충혈증을 나타내었고, 1마리는 대조군과 유사하였다. 이 실험은 대조군의 다양성 때문에, 케이엔에서 최근 개발된 비장적출하지 않는 사이미리 모델에 잘 적응하지 못한 항원투여 감염에 사용할 기생충 균주 때문에 해석하기가 다소 어렵다. 그러나, 비록 불완전하지만 명반을 사용한 실제 효과는 항원이 현재 명반과 함께 특정 효과를 나타내는 재조합 열대열 말라리아원충 MSP-1 형태로만 되는 것 같다는 것을 제안한다.
다람쥐 원숭이에서 재조합 열대열 말라리아원충 p19를 이용한 백신접종 시험(도 10에 대한 실험과 동일)
잡아서 기른 원숭이를 하기와 같이 4주 간격으로 1㎖씩 2회 근육내 접종하였다: (1) 4마리의 동물에게는 하기와 같이 프로인트 보조액의 존재하에 50㎍의 가용성 Pf MSP1 p19를 주사하였다: 1차 주사: 1:1 FCA/FIA; 2차 주사: 1:4 FCA/FIA; 이어서 PBS중 항원과 1:1혼합. (2) 4마리의 동물에게는 10mg의 명반의 존재하에 50㎍의 가용성 Pf MSP-1 p19를 주사하였다; (3) 4마리의 동물에게는 1:1 몰 비율의 콜레스테롤 및 포스파티딜 콜린을 포함하는 리포좀내로 재구성된 약 50㎍의 GPI 고착된 PfMSP1 p19를 주사하였다. 동물은 2차 주사한지 17일 후에 방혈시켰다.
열대열 말라리아원충에 기인하는 30% 기생충혈증을 갖는 다람쥐 원숭이로부터의 적혈구(대부분 성숙형)를 PBS로 세척하고 잔여분을 2% SDS 및 2%디티오트레이톨의 존재하에 8회 희석하여 7.5%(분리 겔) 및 4%(적층 겔)으 폴리아크릴아미드겔상에 장입시키기 전에 95℃로 가열하였다. 니트로셀룰로스로 이동시킨 후에, 하기와 같이 항혈청으로 면역블롯 분석을 수행하였다:
(1) 프로인트 보조액중 가용성 PfMSP1p19로 백신접종한 4마리 원숭이의 항혈청 푸울(pool), 20배 희석액; (2) 명반 보조제중 가용성 PfMSP1p19로 백신접종한 4마리 원숭이의 항혈청 푸울(pool), 20배 희석액; (3) 리포좀중 고착된 PfMSP1p19로 백신접종한 4마리 원숭이의 항혈청 푸울(pool), 20배 희석액; (4) PfMSP1p19의 선형 에피토프와 반응하는 모노클로널 항체, 50mg/㎖; (5) 열대열 말라리아원충으로 반복적으로 감염시킨 약 20마리의 원숭이로부터 유래하는 SH190 항혈청 푸울, 이는 열대열 말라리아원충을 사용한 연속적인 감염에 영향받지 않음, 500배 희석액; (6) 감염되지 않은(열대열 말라리아원충에 노출되지 않은) 원숭이의 항혈청 푸울, 20배 희석액.
결과는 PfMSP1p19로 백신접종한 원숭이의 3개의 항혈청 푸울이 고분자량 복합체와 강하고 특이적으로 반응하며(적층 겔에서 확산), 더 성숙한 형태를 포함하는 기생충 추출물에 존재한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 에피토프를 포함하는 PfMSP1p19의 특정 집합체가 생체내에서 존재하고, 이 에피토프는 바큘로비루스시스템에서 합성되는 재조합 PfMSP1p19 분자, 특히 이의 올리고머 형태로 재생된다는 가설을 지지해준다.
도 7은 또한 이들 결과를 예시하고 있다. 이는 겔상에서 형성된 면역블롯을 보여준다. 첫 번째 3개의 겔 통로는 생체내에서 p19 주사 [(1) 프로인트 보조액과 함께, (2) 명반과 함께 및 (3) 리포좀의 형태]에 대한 원숭이의 응답과 특히 성숙기(p42를 p19 및 p33으로 절단되었을 때)에 특이적인 올리고머 형태로 생체내에서 p19의 집합체를 형성한다는 가설을 뒷받침해주는 고 분자량 복합체의 존재를 보여준다.
백신접종 시험은 또한 이전의 주사와 동일한 3차 주사를 포함한다. 프로인트 보조액을 사용한 주사는 단지 FIA만을 포함하였다.
각 군에 대한 2마리 동물의 대조군이 있다. 즉, PBS 및 프로인트 보조액으로 주사한 2마리의 대조 동물; PBS 및 명반을 주사한 2마리의 대조 동물; 단백질 없이 리포좀을 주사한 2마리의 대조 동물; 보조제 없이 PBS를 주사한 2마리의 대조 동물. 전술한 바와 같이 감염방어 효과를 평가하였다.
도 7B: 이 도면의 자료는 다람쥐 원숭이 열대열 말라리아원충 I 백신접종 시험(하기 도 10)으로 부터 얻은 것이다. 각각의 원숭이에 해당하는 수는 도 10에 나타나 있다. 이 도면을 위한 기술 및 방법은 도 7과 동일하게 하였으나, 단 각 원숭이에 대한 개개의 항혈청은 3회 주사후에 시험 주사한 날 시험하고 SHI 항혈청을 1:250으로 희석하였다. 결과는 p19 및 명반으로 백신접종한 4마리의 원숭이에 대한 항혈청이 고분자량 복합체와 강하고 특이적으로 반응하는 반면 p19 및 프로인트 보조제 또는 리포좀으로 백신접종한 기타 군의 원숭이는 이들 복합체와 거의 반응성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 군중에서 1마리의 원숭이가 대조군에 비해 감염방어 효과를 나타내지 않았고 다른 것은 단지 부분적인 감염 방어 효과를 나타내었음에도 불구하고, p19 및 명반으로 백신접종한 원숭이는 또한 감염방어 효과가 가장 우수하기 때문에, 고분자량 복합체와의 반응성이 감염방어 효과를 나타내는 것으로 보인다.
또한 본 발명은 기타의 용도, 예를 들어 일부 실시예에 대하여 하기에 기술된 것들에 관한 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료법
재조합 분자 PfMSP1p19를 사용하여, 치사 위험이 있는 경우 열대열 말라리아원충에 의한 중증 말라리아 치료용 수동 전달에 사용할 수 있는 특히 항체를 제조할 수 있다.
진단학
바큘로비루스 유래의 재조합 분자 PvMSP1p42, PvMSP1p19 및 PfMSPp19는 특정쥐 모노클로널 항체를 제조하는데 사용할 수 있고 또한 사용하여 왔다. 이들 항체는, 토끼나 염소와 같은 다른 종에서 유래한 폴리클론널 항-MSP1p19 항혈청과 함께 말라리아용 반-정량적 진단 시험의 기준을 형성할 수 있으며, 이 진단법은 치명적일 수 있는 열대열 말라리아원충에 의한 말라리아와 일반적으로 치명적이지 않은 삼일열 말라리아원충에 의한 말라리아를 구별할 수 있다. 이 시험의 원리는 혈액중 p19 부분을 포함하는 MSP-1 분자를 포집하여 정량하는 것이다.
이 상황에서, MSP1p19 분자의 장점은 하기와 같다:
(i) 동일한 종에서는 극도의 보존성을 나타내며 상이한 종에서는 충분한 분산성을 나타내어 특정 종 반응물을 제조할 수 있다. PfMSP1p19와 PvMSP1p19에서 유래된 항체 사이에는 교차 반응이 관찰되지 않았다.
(ii) 정확하게 알려지지는 않았지만 MSP1p19의 작용은 분자가 현저하게 다양하지 않거나 또는 기생충에 대한 치사 효과가 결여되어 있어 상당히 중요한 것 같다.
(iii) 상기 분자는 모든 분열 소체에서 발견되는 주 항원이며 따라서 대체로 낮은 기생충혈증에서 그리고 기생충혈증에 비례하여 검출된다.
(iv) 바큘로비루스로부터 유도된 재조합 MSP1p19 분자는 더욱 천연 구조인 MSP1p19를 재생하는 것으로 보이기 때문에, 이들 단백질에 대해 생성된 항체는 진단용에 사용하기 적합한 것이다.
하기에 동정된 미생물을 하기의 수탁번호로 1996년 2월 1일의 부다페스트 조약 규칙 6.1에 따라 기탁하였다:
동정된 미생물 수탁 번호
PvMSP1p19A 1-1659
PvMSP1p19S 1-1660
PfMSP1p19A 1-1661
PfMSP1p19S 1-1662
PcMSP1p19S 1-1663
본 발명은 이들 항체, 바람직하게는 혼합물에 초기에 함유된 p19 펩티드 유형의 정제를 위해 고체 지지체(예를 들어 친화 크로마토그래피)에 고정된 항체의 용도에 관한 것이다.
혼합물을 항체와 접촉시키는 단계, 항원-항체 복합체를 해리시키는 단계 및 정제된 p19 유형의 펩티드를 회수하는 단계를 포함하여 정제한다.
본 발명은 또한 단백질 또는 단편의 혼합물, 특히 하기의 유형의 혼합물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
·열대열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p19;
·열대열 말라리아원충 p19 및 열대열 말라리아원충 p42, 이중 열대열 말라리아원충 p42는 필요에 따라 최대 초가변부를 결실시킴;
·삼일열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p42, 이중 삼일열 말라리아원충 p42는 필요에 따라 최대 초가변부를 결실시킴;
·열대열 말라리아원충 p19 및 열대열 말라리아원충 p42과, 삼일열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p42, 이중 열대열 말라리아원충 p42와 삼일열 말라리아원충 p42는 필요에 따라 최대 초가변부를 결실시킴.
본 발명에서, 최대 초가변부는 영역 I 또는 영역 II 및 영역 III의 전부 또는 일부로 정의하며, 바람직하게는 결실되어 있는 영역 III의 일부는 영역 II에 병치되어 있다. 영역 II 및 영역 III은 도 4에 예시되어 있다(보존부는 p19에 근접하여 있는 p33의 C-말단의 측면에 위치함).
본 발명은 인체 백신 제조에 한정되는 것은 아니다. 포유동물에 대해 감염성이 있고 동일한 조건하에 생성되는 기생충에서 유래된 해당 단백질 또는 항원을 사용하여 수의용 백신을 제조하는데에도 이용할 수 있다. 동일한 유형의 감염증인, 바베시아증이 소, 개 및 말에서도 나타난다는 것이 알려져 있다. 바베시아(Babesia) 종의 항원중 하나는 MSP-1의 단백질부와 높은 구조적 상동성(특히 2개의 EGF-유사 도메인과 시스테인-풍부 도메인) 및 작용 상동성을 갖는다[(36), (37) 및 (38)].
기생충에 대한 가용성 항원을 사용한 수의용 백신의 예가 문헌에 개시되어 있다(39).
또한 이 혼합물에 사용된 p19는 분리시 전술한 바와 같이 변형시킬 수 있다.
또한 본 발명은 삼일열 말라리아원충외에 인간에 감염성이 있고 삼일열 말라리아원충을 인식하지 않는 말라리아원충형 기생충의 말라리아유충체 형태에 존재하는 MSP-1 단백질의 p19를 선택적으로 인식하는 특이 항체를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다.
특히, 이들 하이브리도마는 삼일열 말라리아원충을 인식하지 않고 열대열 말라리아원충 p19를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체를 분비한다.
또한 본 발명은 삼일열 말라리아원충의 p19 및 사이노몰기 말라리아원충의 p19를 특이적으로 인식하는 특이 항체를 생성하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마에 관한 것이다. F10-3 하이브리도마는 삼일열 말라리아원충의 p42 당단백질을 인식하는 IgG2b/k를 형성하는 X63 Ag8 653 미엘로마로부터 작제된다.
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Claims (45)
- -포유 동물, 특히 인간에게 감염성인, 삼일열 말라리아원충(Plasmodiumvivax)외에 말라리아원충(Plasmodium)형 기생충의 말라리아유충체 형태에 존재하는 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19 킬로달톤(p19) C-말단 단편이나(이 C-말단 단편은 감염 사이클중 인체 적혈구내로의 침입기 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있다);-해당 기생충에 의한 생체내 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역응답을 유도할 수 있는 상기 단편의 일부나;-상기 p19 단편이나 이 단편의 일부에 의해 생성되는 응답 반응과 동등한 세포 면역 및/또는 체액 면역 응답 반응을 유도할 수 있는 펩티드가 필수 구성 폴리펩티드 서열이고, 환원 배지중에서 불안정하고 해당 말라리아원충에 대하여 형성된 인간 항혈청에 의해 인식되는 대부분의 에피토프로 구성되는 구조적 에피토프를 더 포함하는 것이 특징인 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서, 비환원 상태 또는 비가역적이지 않은 환원 상태에 있는 경우 해당 말라리아원충이나 동종 말라리아원충에 대해 형성된 인간 항혈청에 의해 인식되나, 비가역적으로 환원된 경우 동일한 항혈청에 의해 약간 인식되거나 인식되지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 동일한 조건하에서 생성된 해당 p42와 면역 인간 항혈청의 반응성, 또한 p42 자체의 반응성을 억제하며, p42가 p19에 대한 인간항혈청의 반응성을 부분적으로 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, p42가 자연 절단되기 전에 해당 p42중 p19와 일반적으로 관련된 측면상에 p33(33kDa의 N-말단 단편)의 C-말단 폴리펩티드의 상류에 일반적으로 위치하는 임의의 폴리펩티드가 주로 결실되어 있고, 상기 p33의 최종 C-말단 폴리펩티드 서열이 존재하는 경우 50 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, p42가 자연 절단되기 전에 해당 p42중 p19와 일반적으로 관련된 측면상에 p33(33kDa의 N-말단 단편)의 C-말단 폴리펩티드의 상류에 일반적으로 위치하는 임의의 폴리펩티드가 주로 결실되어 있고, 상기 p33의 최종 C-말단 폴리펩티드 서열이 존재하는 경우 10 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, p42가 자연 절단되기 전에 해당 p42중 p19와 일반적으로 관련된 측면상에 p33(33kDa의 N-말단 단편)의 C-말단 폴리펩티드의 상류에 일반적으로 위치하는 임의의 폴리펩티드가 주로 결실되어 있고, 상기 p33의 최종 C-말단 폴리펩티드 서열이 존재하는 경우 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum) 또는 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)과 같이 인간에 대해 감염성이 있는 말라리아원충에서 실질적인 정도의 보존성을 보유하도록 한정되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, p19단편의 일부가 이 p19에 일반적으로 포함된 2개의 EGF 영역중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, p19 단편 또는 p19 단편의 일부분의 분자량이 10 kDa 내지 25kDa , 특히 10kDa 내지 15kDa의 범위내에 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, p19 단편을 숙주 세포, 특히 진핵세포, 바람직하게는 바큘로비루스에 의해 감염될 수 있는 곤충 세포에 고착시킬 수 있는 형태의 클리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 기를 포함하고, 이 세포내에서 발현성인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 발현되는 숙주, 특히 진핵 세포, 바람직하게는 바큘로비루스에 의해 감염될 수 있는 곤충 세포의 세포막에 상기 재조합 단백질의 고착을 유도할 때 개재하는 극소수성 C-말단 부분이 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제10항에 있어서, 수용성인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)의 MSP-1 단백질의 p19 서열 또는 해당 단편의 상기 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 사이노몰기 말라리아원충의 MSP-1 단백질의 p19 서열 또는 해당 단편의 상기 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 기재된 재조합 단백질의 올리고머.
- 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 단백질의 폴리펩티드 서열의 2개 내지 50개의 단량체 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
- 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 백신의 제조에 사용하기 위해 담체 분자에 접합시킨 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- -인간에게 감염성인 말라리아원충(Plasmodium)형 기생충의 말라리아유충체 형태의 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19 킬로달톤(p19) C-말단 단편이거나(상기 C-말단 단편은 감염 사이클중 인체 적혈구내로의 침입기 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있다);-해당 기생충에 의해 생체내 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역응답을 유도할 수 있는 상기 단편의 일부이거나;-상기 p19 단편이나 이 단편의 일부에 의해 생성되는 응답 반응과 동등한 세포 면역 및/또는 체액 면역 응답 반응을 유도할 수 있는 펩티드인 필수 구성 폴리펩티드 서열을 유효 성분으로 함유하며, 환원 배지중에서 불안정하고 해당 말라리아원충에 대하여 형성된 인간 항혈청에 의해 인식되는 대부분의 에피토프로 구성되는 구조적 에피토프를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간에게 감염성인 말라리아원충형 기생충에 대한 백신 조성물.
- 제17항에 있어서, 유효 성분이 제2항 내지 제13항중 어느 한 항 또는 제16항에 기재된 재조합 단백질, 또는 제14항 또는 제15항에 기재된 올리고머로 구성되는 백신 조성물.
- 제17항 또는 제18항에 기재된 재조합 단백질의 올리고머를 유효 성분으로 포함하는, 인간에 감염성이 있는 말라리아원충형의 기생충에 대한 백신 조성물.
- 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)외에 인간에 대해 감염성이 있고 삼일열 말라리아원충을 인식하지 않는 말라리아원충형 기생충의 말라리아유충체 형태의 MSP-1 단백질의 p19를 특이적으로 인식하는 항체.
- 제20항에 있어서, 모노클로널 항체인 것을 특징을 하는 항체.
- 제20항에 있어서, 모노클로널 항체이며, 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)의 p19를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제20항에 있어서, 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)의 p19를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 모노클로널 항체.
- 말라리아원충으로 감염된 생물학적 시료를 제23항에 기재된 항체 및 제21항 또는 제22항에 기재된 항체와 접촉시키는 단계, 경우에 따라 생성되는 면역 반응이나 생성되지 않는 면역 반응을 검출하는 단계를 특징으로 하는, 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)에 의한 기생충 감염과 또 다른 말라리아원충에 의한 기생충 감염을 구별하는 감별 진단 방법.
- 벡터내에 함유되고, 이 벡터에 의해 형질감염될 수 있는 세포가 인식할 수 있는 프로모터의 조절하에서, 바큘로비루스계에서 발현시킬 수 있는 시그널 펩티드를 암호하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 프로모터의 조절하에 상기 제1 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한 제2 서열이 있고, 이 제2 서열이-인간에게 감염성인 말라리아원충(Plasmodium)형 기생충의 말라리아유충체 형태의 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19 킬로달톤(p19) C-말단 단편이거나(상기 C-말단 단편은 감염 사이클중 인체 적혈구내로의 침입기 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있다);-바큘로비루스 계내에서 생성되는 제2서열 유래의 발현 생성물이 해당 기생충에 의해 생체내 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역응답을 유도할 수 있는 경우 상기 펩티드 단편의 일부이거나;-상기 p19 펩티드 단편이나 이 펩티드 단편의 일부에 의해 생성되는 응답 반응과 동등한 세포 면역 및/또는 체액 면역 응답 반응을 유도할 수 있는 펩티드인 펩티드 서열을 암호하며, 이 뉴클레오티드 서열의 GC 함량이 이 서열을 구성하고 있는 전체 뉴클레오티드의 40% 내지 60% 범위, 바람직하게는 50% 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 바큘로비루스형 변형 벡터.
- 제25항에 있어서, 제2폴리펩티드 서열이 제2항 내지 제13항중 어느 항에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 변형 벡터.
- 제25항에 있어서, 제2뉴클레오티드 서열이 합성 서열인 것을 특징으로 하는 변형 벡터.
- 제25항 내지 제27항중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax) 유래의 시그널 펩티드를 암호하고 말라리아원충 MSP-1 단백질과 일반적으로 관련있는 것을 특징으로 하는 변형 벡터.
- 제25항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이, 재조합 단백질이 발현되는 숙주, 특히 바큘로비루스에 의해 감염성이 있는 곤충의 세포의 세포막에 재조합 단백질의 고착을 유도할 때 관련되는 소수성 C-말단 서열의 3' 말단이 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변형 벡터.
- 제25항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서, 변형 바큘로비루스를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 벡터.
- 제25항 내지 제29항중 어느 한 항에 기재된 변형 벡터에 의해 형질감염될 수 있고 형질감염된 유기체, 특히 Sf9 형의 곤충 세포.
- -열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)형 기생충의 말라리아유충체 형태의 표면 단백질 1(MSP-1 단백질)의 19 킬로달톤(p19) C-말단 단편이거나(상기 C-말단 단편은 감염 사이클중 인체 적혈구내로의 침입기 말기에 기생충 표면에 정상적으로 고착되어 있다);-바큘로비루스 계내에서 생성되는 DNA의 발현 생성물이 해당 기생충에 의해 생체내 기생충혈증을 억제할 수 있는 면역응답을 유도할 수 있는 경우 상기 펩티드 단편의 일부이거나;-상기 p19 펩티드 단편이나 이 펩티드 단편의 일부에 의해 생성되는 응답반응과 동등한 세포 면역 및/또는 체액 면역 응답 반응을 유도할 수 있는 펩티드인 펩티드 서열을 암호하며, 이 뉴클레오티드 서열의 GC 함량이 이 서열을 구성하는 전체 뉴클레오티드의 40% 내지 60% 범위, 바람직하게는 50% 이상인 것을 특징으로 하는 서열을 적어도 일부분을 함유하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 DNA.
- 제32항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이, p19 단백질이 발현되는 숙주, 특히 바큘로비루스에 의해 감염될 수 있는 곤충 세포의 세포막에 이 단백질의 고착을 유도할 때 정상적으로 관련되는 소수성 C-말단 영역을 암호하는 서열의 3'말단이 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 합성 DNA 서열.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 제1뉴클레오티드 서열 다음에, 주 서열에 대해 동종 또는 이종인 말라리아원충 MSP-1 단백질과 일반적으로 관련된 시그널 펩티드를 암호하는 시그널 뉴클레오티드 서열이 위치하는 것을 특징으로 하는 합성 DNA서열.
- 제34항에 있어서, 시그널 서열이 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 합성 DNA.
- 제32항 내지 제35항중 어느 한 항에 있어서, 제1뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드 세포막 고착 영역을 암호하는 3'말단 서열을 포함하고, 상기 고착 영역이, 발현된 재조합 단백질을, 합성 DNA를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포의 막 표면에 고정시키고, 상기 3' 서열이 주 뉴클레오티드 서열의 3' 서열과 동종이거나 또는 특히 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax) 유래의 3' 서열과 이종인 것을 특징으로 하는 합성 DNA.
- 제36항에 있어서 3' 말단 서열이 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)에서 유래한 것을 특징으로 하는 합성 DNA.
- 제32항 내지 제36항중 어느 한 항에 있어서, 3'-말단 서열이 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 합성 DNA 서열.
- 제25항에 있어서,·CNCM[국립 모식균 배양소]에 수탁 번호 1-1659로 기탁된 비루스;·CNCM에 수탁 번호 I-1660로 기탁된 비루스;·CNCM에 수탁 번호 I-1661로 기탁된 비루스;·CNCM에 수탁 번호 I-1662로 기탁된 비루스;·CNCM에 수탁 번호 I-1663로 기탁된 미생물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바큘로비루스형 벡터.
- 제21항 내지 제23항중 어느 한 항에 기재된 항체의 특성을 갖는 모노클로널항체를 분비하는 하이브리도마.
- 제20항 내지 제23항중 어느 한 항에 기재된 해당 항체를, 바람직하게는 불용성 지지체에 미리 고정시킨 상태에서 펩티드 혼합물과 접촉시키는 단계, 형성된 항원-항체 화합물을 연속적으로 해리시키는 단계 및 정제된 p19 펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 펩티드 혼합물로부터 소정의 특이성을 갖는 p19 펩티드를 분리하는 방법.
- 말라리아원충 감염에 대해 면역응답을 유도할 수 있는 면역원 조성물을 제조하는데 있어서 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 기재된 단백질 또는 제15항 또는 제16항에 기재된 올리고머의 용도.
- 유효 성분으로서 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 기재된 단백질 혼합물과, 상기 단백질을 얻은 기생충과 기생충으로 부터 유래된, 필요에 따라 보존성이 가장 적은 부분이 결실된 해당 p42, 또는 또 다른 재조합 p19 또는 p42형 단백질을 함유하는 백신 조성물.
- 제23항에 있어서, 유효 성분의 혼합물이·열대열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p19;·열대열 말라리아원충 p19 및 열대열 말라리아원충 p42;·열대열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p42(이중 삼일열 말라리아원충 p42는 필요에 따라 최대 초가변부를 결실시킴);·열대열 말라리아원충 p19 및 열대열 말라리아원충 p42와, 삼일열 말라리아원충 p19 및 삼일열 말라리아원충 p42(이중 열대열 말라리아원충 p42와 삼일열 말라리아원충 p42는 필요에 따라 최대 초가변부를 결실시킴)의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제40항에 있어서, 1997년 2월 14일자로 수탁번호 I-1846으로 CNCM(프랑스, 파리)에 기탁된 것을 특징으로 하는 하이브리도마.
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