WO2008059314A1 - Vacuna contra la malaria, basada en la subunidad 200l de la proteína msp1 de plasmodium vivax - Google Patents

Vacuna contra la malaria, basada en la subunidad 200l de la proteína msp1 de plasmodium vivax Download PDF

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malaria
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recombinant
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Augusto Elías VALDERRAMA AGUIRRE
Sócrates HERRERA VALENCIA
Myriam ARÉVALO RAMIREZ
David Narum
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Centro Internacional De Vacunas
Instituto De Inmunología. Universidad Del Valle
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention described below refers to vaccines against malaria based on the 200L subunit, comprised between amino acids 50 and 450 of the Merozoite Surface Protein 1 (MSPl) of P.vivax, and which are directed to control the development of the blood stages and the severity of the disease.
  • MSPl Merozoite Surface Protein 1
  • Malaria is one of the biggest global public health problems. It is estimated that 500 million clinical cases occur annually worldwide and that around 3 million children and pregnant women die from the disease, every year, in Africa alone.
  • Africa is the continent most affected by malaria, particularly Plasmodium falciparum, the most virulent species responsible for approximately 80% of global malaria.
  • the second species in abundance is P.vivax, which represents about 20% of cases worldwide and is transmitted significantly in the American and Asian continents. In these 2 continents most endemic regions have simultaneous transmission of P. falciparum and P.vivax. In many malarious regions the prevalence of P. vivax is greater, and despite not causing high mortality, it causes significant morbidity.
  • P.vivax is characterized by producing a debilitating disease that causes great disability and exhibits recurrent behavior, if the infection is not treated properly. This last characteristic represents a high risk for tourists and travelers who once are infected for the first time, can develop repeated infections without needing to be exposed again to the mosquito bite. Malaria has a negative impact on the social and economic development of endemic areas, to such an extent that it has been estimated that the accumulated Gross Domestic Product of the endemic countries for malaria has been reduced by 50% over the past 20 years compared with that of non-endemic countries.
  • Plasmodium determines what is common to the 4 species of this genus ⁇ Plasmodium spp) P.falciparum, P.vivax, P.malariae and P oval that affect the human, and establish which are the molecules involved in maintaining it.
  • the parasite is transmitted from one individual infected to another by mosquitoes of the genus Anopheles spp, which through a bite inject the parasite in the form of sporozoite into the bloodstream of the human.
  • the parasites travel through the blood to the liver where they enter the liver cells and develop a phase of mass multiplication (schizogonic cycle) that generates thousands of new parasites (merozoites) with the ability to invade the red blood cells, within which the parasite develops a succession of cycles of multiplication and reinvasion to new red blood cells, rapidly increasing their number in the body.
  • schizogonic cycle phase of mass multiplication
  • new parasites merozoites
  • This last series of events in the blood are responsible for the disease and can lead to the death of the patient.
  • Some of the parasites in the blood differ sexually in gametocytes (male and female) that when ingested by the mosquito during a new bite, perform a fertilization process and start a new cycle (sporogonic or sexual) in the intestine of the mosquito, to generate new infectious sporozoites.
  • the merozoite of hepatic origin invades a young red blood cell or reticulocyte and there it is multiplied by asexual mechanisms to generate a mature schizont that contains between 20-30 new merozoites (schizogonia). These escape the schizont and have the ability to invade new red blood cells in which they in turn reproduce quickly to generate new merozoites.
  • Some of the hepatic parasites can stop in their development and transform into hibernating forms or hypnozoites, which can be reactivated months or years later and develop the disease after a first episode, if the treatment is not adequate.
  • Asexual erythrocytic vaccines are based on the phenomenon of "premunition”, in which the inhabitants of endemic areas, exposed to successive infections, naturally acquire protective immunity against clinical manifestations but not against infection. As a result, adult individuals in these regions become “immune” and manage to develop a normal life. This immunity begins its development from very early ages and is sustained until adulthood at the expense of repeated infections that function as immune memory boosters. This type of non-sterile partial immunity is known as
  • CMV Major Histocompatibility Complex
  • Passive antibody transfer studies have shown to confer protective immunity and be able to control patent parasitemias in patients affected by P. falciparum. The mechanisms involved are: 1) Blockade of the invasion of the parasite to the red blood cell; 2) Opsonization and agglutination of the parasite with subsequent promotion of phagocytosis; 3) Antibody dependent cell inhibition; 4) Inhibition of sequestration in microcirculation; and 5) Neutralization of malarial toxins.
  • MSPl Merozoite Surface Protein 1
  • the MSPl is abundantly expressed on the surface of the merozoite during the maturity of the schizont, it is essential for the normal development of the schizont and for the initial interaction with the erythrocyte.
  • FCE Epidermal Growth Factor
  • the present invention focuses on the discovery, development and production of a white vaccine subunit, called PvIOOL, which, due to its immunogenic capabilities, is consolidated as a candidate for the production of vaccines against malaria caused by P. ⁇ ivax.
  • the subunit disclosed in this application is aimed at controlling parasitemia and the severity of the infectious process during the erythrocyte phase, in which the invasion of the parasite (merozoite) to the young red blood cells (reticulocytes) occurs by the interaction of molecules ( ligand) of the surface of the parasite and molecules (receptors) present on the surface of the reticulocyte.
  • Intracellular development and multiplication can also be blocked through the action of protein-induced cytokines, in particular interferon gamma (IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • the invention comprises the generation of vaccines, based on the Pv200L subunit, whose amino acid sequence and immunological importance was established by the requesting group (Valderrama-Aguirre, Quintero et al. 2005).
  • the invention also includes the generation of the subunit by recombinant technology, in addition to the design and establishment of an industrializable generation and purification process for large-scale production of the subunit.
  • the present invention constitutes a unique approach for the production of malaria vaccine candidates since it is based on the Pv200L subunit, which had not been previously described and less as a vaccine. Additionally, the invention is novel because it makes use of recombinant DNA technology and genetic engineering tools to modify the natural sequence of the gene fragment encoding the Pv200L subunit and thus increase the synthesis efficiency in E. coli and facilitate the subsequent purification process.
  • the 200L subunit is located towards the N-terminal end of the P.vivax MSP-I protein and was defined after bioinformatic analysis in which a region of more than 70% homology was determined with the 190L subunit of the MSP- I of P.falciparum (Guttinger, Romagnoli et al.
  • the subunit is composed of part of block 1, blocks 2-4 and part of block 5, according to the classification of blocks made by Putaporntip et al. (Putaporntip, Jongwutiwes et al. 2002), and is comprised between amino acids 50-450 of the majority of P.vivax MSP-I sequences described to date.
  • the subunit presents variations in the sequence and size of some of the blocks that compose it.
  • the unit of invention is defined as a consensus sequence ⁇ V200L (SEQ ID No. 1) active in protection against P. vivax and obtained from variations observed in nature and specific variations made by the applicant in order to improve the Expression of these proteins.
  • the claimed protein has the sequence (SEQ ID No. 2) or (SEQ ID No. 3).
  • the invention also covers the recombinant protein having the sequence defined above and whose coding fragment has been modified towards the 5 'end by the addition of the genetic code of the amino acid methionine (M) followed by the ITIFP polypeptide and 6 amino acid residues of histidine (H) .
  • M amino acid methionine
  • H histidine
  • the recombinant protein sequence claimed herein is the sequence SEQ ID No. 4.
  • Another alternative of the invention refers to the protein having the sequence defined above and whose coding fragment has been modified towards the 5 'end by the addition of a methionine (M) amino acid followed by the ITIFP polypeptide; and at its 3 'end, where 5 histidine amino acids (H) have been inserted.
  • M methionine
  • H histidine amino acids
  • the application refers to the sequence of the recombinant protein corresponding to the sequence SEQ ID N 0 5.
  • rPv200L SEQ ID N ° 4
  • EcPvIOOL SEQ ID N 0 5
  • M methionine
  • H histidines
  • Another invention claimed in the present application is the production process of the EcPv200L recombinant protein. Said production process involves 3 threads: cloning, fermentation, and purification. During cloning, the synthetic gene is inserted into the prokaryotic expression vector pET-24 (a) and subsequently E. coli bacteria are transformed
  • the recombinant strains adapt to growth in chemically defined culture medium and under controlled bioreactor conditions.
  • the resulting cell paste is lysed in a microfluidizer and after centrifugation the inclusion bodies are recovered. The latter are solubilized with 8M GuHCl in the presence of ⁇ -mercaptoethanol and subsequently subjected to purification by a series of chromatographs.
  • the chromatographs leading to purification and obtaining the final product are in their order: 1) Nickel Metallic Ion Affinity Chromatography (IMAC), 2) Superedex 300 Size Exclusion Chromatography (SEC-S300); 3) Hydrophobic Interaction Chromatography on Butyl Resin (HIC-Butyl); 4) Ion Exchange Chromatography on Q resin (IEX-Q); and 5) Size Exclusion chromatography (SEC-S75) in Superdex 75.
  • the final product is characterized to determine profile by analytical size exclusion chromatography (SEC-An) and reverse phase (RP-An) in HPLC, determine content of endotoxins and contaminants of E. coli and finally determine profile by mass spectrometry and N-terminal sequencing.
  • the process of obtaining the recombinant protein _E ⁇ Pv200L is novel since it is a process exclusively designed for this recombinant protein based on its biochemical characteristics and which had not been reported in the prior art.
  • the process as such does not work with any other recombinant protein and with the protein of the invention has the advantage of guaranteeing high productivity without affecting stability or other relevant characteristics so that the protein retains its antigenic properties, benefits that are not they reach if the stages or conditions of the process defined here are modified.
  • nucleic acid sequences encoded by the Pv200L fragment are also part of the invention.
  • the claimed invention encompasses the expression vectors that they comprise the DNA or cDNA defined in the previous paragraph and the cells transformed with said vectors.
  • plasmids, phage, baculovirus and YAC expressed in prokaryotic systems such as bacteria, and eukaryotic such as yeasts, plant cells, mammals and insects.
  • compositions especially vaccines for the prevention of malaria comprising the Pv200L subunit or subfragments thereof, either as synthetic peptide, recombinant protein, DNA or RNA are also part of the invention.
  • the invention relates to the pharmaceutical compositions specified above, and comprising one or more adjuvants for human use, the use of which is widely recognized in vaccine formulations to enhance the immune response either by inducing specific antibodies and / or stimulating lymphocytes.
  • T helpers and / or cytotoxic are widely recognized in vaccine formulations to enhance the immune response either by inducing specific antibodies and / or stimulating lymphocytes.
  • the formulation of the immunogenic molecules described above is object of the present invention.
  • These molecules can be formulated as pharmaceutical compositions in the form of recombinant proteins and / or synthetic peptides formulated in different adjuvants for use in humans and different proportions.
  • compositions comprising the immunogenic molecules defined above with one or more adjuvants selected from the group comprising Montanide ISA-720, Montanide ISA-51, ASO2 (SBAS2), AS2V, ASlB are object of the present invention , MF59, Alum, QS-21, MPL, CpG or microcapsules.
  • adjuvants have been used with different Plasmodium antigens and have proven safe and stimulate the humoral and / or cellular immune response.
  • compositions comprising defined immunogenic molecules are understood to be comprised within the claimed invention.
  • fragments derived from other Plasmodium stages or from microorganisms other than this and optionally, include different adjuvants for use in humans.
  • the subunit of the invention may be combined with antigens present in the different phases of the parasite's life cycle, whether the antigens are annexed to the sequence during synthesis or added to the pharmaceutical composition, such as the protein of circumesporozoite (CS), the thrombospondin-related adhesion protein
  • antigens present in the different phases of the parasite's life cycle whether the antigens are annexed to the sequence during synthesis or added to the pharmaceutical composition, such as the protein of circumesporozoite (CS), the thrombospondin-related adhesion protein
  • TRIP Duffy-binding protein
  • MSP-I merozoite surface protein
  • Pvs25 protein and Pvs48 / 45 protein from the sporogonic cycle among others.
  • These antigens may be used whole or fragments thereof produced as synthetic peptides, recombinant proteins or DNA.
  • Example 1 Production systems of Pv200L as a recombinant protein.
  • the Pv200L subunit has been produced as a recombinant protein.
  • two recombinant prototypes rPv200L and EcPvIOOL, were obtained.
  • RPv200L was obtained from a PCR amplifier that was inserted into the plasmid vector pRSET-B, which was subsequently cloned into E.coli BL21 (DE3) -RIL bacteria.
  • Purification of rPv200L was achieved by successive passes through a manual Nickel column chromatography (IMAC), a process facilitated by the addition of histidines to the N-terminal end.
  • IMAC manual Nickel column chromatography
  • Figure 1 shows: (i) Coomassie Blue stained electrophoresis stained with Coomassie Blue of rPv200L at 10, 1 and 0.5 ⁇ g. (ii): Profile Chromatographic by reverse phase HPLC demonstrating a homogeneity of more than 90% in the final product.
  • Table 1 The main changes in the expression systems are summarized in Table 1. These include the change of the expression vector, the production of a synthetic gene harmonized to the use of E. coli codon, the change of the selection marker, the cell paste production in bioreactor and chemically defined culture medium.
  • the process defined above has an overall purification efficiency of 20%, and is easily scalable and transferable.
  • the product obtained has levels of endotoxins below 100 EU / dose and almost imperceptible E. coli contaminants ( ⁇ 0.1%), resulting compatible with the regulations of agencies such as the FDA and the USP.
  • the process defined here ensures better protein expression, greater productivity and optimum protein quality for use in vaccine production.
  • the Pv200L subunit is highly recognized by individuals from endemic areas who have been infected and / or exposed to P. vivax infections.
  • Figure 3 shows the levels of IgG antibodies against rPv200L found during a seroepidemiological study conducted in the Colombian Pacific Coast.
  • Table 2 shows the level of recognition of the Pv200L subunit by individuals of an endemic area in terms of the percentage of responders with a positive IgG reaction against rPv200L and the strength of such reaction expressed as average optical density (OD).
  • the recombinant EcPv200L protein has also been analyzed by seroepidemiology assays with sera from individuals from endemic areas of Brazil obtaining a Positive recognition by IgG against the subunit in more than 90% of 4 different endemic areas evaluated.
  • BALB / c mice were immunized with 50 ⁇ g of rPv200L under a regimen of 3 intraperitoneal immunizations.
  • Levels of specific IgG antibodies against rPv200L after the third immunization with the emulsified protein in Freund's adjuvant are shown in Figure 4.
  • Titles of anti-rPv200L IgG antibodies after the last immunization reach levels above IxIO 7 dilutions (figure 4i).
  • Such antibodies are capable of recognizing the immunogen rPv200L (4ii, left) and its counterpart in P. falciparum rP / 190L (4ii, right).
  • antibodies induced by immunization with rPv200L in BALB / c mice manage to recognize the native protein on schizont of P. vivax (4iii).
  • Table 3 compiles the parameters determined in the pilot test of protective efficacy in Aotus primates, with which it is demonstrated that the accumulated parasitaemia (CP) and the area under the parasitemia curve (AUC) is reduced in the immunized group. The humoral immune response data is also shown. Only control animals had to be treated to control parasitemia before falling into severe anemia, which supports evidence of immune response against the severity of the disease. Table 3
  • ELISA IgG antibody titre against r / V200L before challenge
  • IFAT IgG antibody titre against P vivax schizont before challenge
  • CP Cumulative parasitemia ( ⁇ , parasitemia / 300 white blood cells each day)
  • pcl time of parasitemia clearance
  • Ptx time before the first treatment (for the whole group)
  • AUC Area under the curve ⁇ parasites / day ⁇

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Abstract

La presente invención se refiere a una subunidad candidato a vacuna contra la malaria causada por P. vivax, denominada como Pv200L, que esta basada en porciones del extremo N-terminal de la proteína MSP-1 de P. vivax. La subunidad esta diseñada para ser usada sola o en formulaciones combinadas con otras subunidades. La invención incluye la producción dos prototipos recombinantes de la subunidad y el diseño de un proceso de producción escalable para su producción en masa.

Description

VACUNA CONTRA LA MALARIA, BASADA EN LA SUBUNmAD 200L DE LA PROTEÍNA MSPl DE Plasmodium vivax
Campo de Ia invención
La invención descrita a continuación se refiere a vacunas contra la malaria basadas en la subunidad 200L, comprendida entre los aminoácidos 50 y 450 de la Proteína de Superficie del Merozoito 1 (MSPl) de P.vivax, y que están dirigidas a controlar el desarrollo de los estadios sanguíneos y la severidad de la enfermedad.
Antecedentes de Ia invención
La malaria es uno de los mayores problemas de salud pública mundial. Se estima que anualmente se producen 500 millones de casos clínicos en todo el mundo y que alrededor de 3 millones de niños y mujeres embarazadas fallecen por la enfermedad, cada año, en sólo África.
África es el continente más afectado por la malaria, particularmente por el Plasmodium falciparum, la especie más virulenta y responsable de aproximadamente el 80% de la malaria mundial. La segunda especie en abundancia es el P.vivax, que representa cerca de 20% de los casos de todo el mundo y se transmite de manera significativa en los continentes americano y asiático. En estos 2 continentes la mayoría de las regiones endémicas tienen transmisión simultánea de P. falciparum y P.vivax. En muchas regiones maláricas la preval encia de P.vivax es mayor, y a pesar de no causar gran mortalidad produce una significativa morbilidad.
El P.vivax se caracteriza por producir una enfermedad debilitante que causa gran incapacidad y presenta un comportamiento recidivante, si la infección no se trata adecuadamente. Esta última característica representa un alto riesgo para turistas y viajeros quienes una vez son infectados por primera vez, pueden desarrollar infecciones repetidas sin necesidad de exponerse de nuevo a la picadura del mosquito. La malaria tiene un impacto negativo sobre el desarrollo social y económico de las áreas endémicas, a tal punto, que se ha estimado que el Producto Interno Bruto acumulado de los países endémicos para malaria se ha reducido en un 50% durante los últimos 20 años comparado con el de los países no endémicos.
Actualmente los costos de control, manejo y tratamiento son excesivamente altos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que para el año 2007, el costo anual para prevenir la malaria solamente en África sería de alrededor de US$ 2.5 billones.
Los métodos clásicos de control recomendados desde hace varias décadas por la Organización Mundial de la Salud, han consistido en dos alternativas: 1. El control de los vectores a través de la eliminación de sus criaderos, el uso de repelentes y toldillos, y su eliminación a través del uso de insecticidas de acción residual. 2. El tratamiento preventivo y curativo de los individuos expuestos o infectados con malaria, a través del uso de medicamentos antimaláricos.
Se han evidenciado fallas en las medidas clásicas de control de la malaria, debido a la resistencia de los parásitos a la terapia antimalárica y a la resistencia del mosquito Anopheles a los insecticidas lo cual produce una creciente complejidad y un aumento en el costo del control de la malaria a nivel mundial. Los hechos anteriores sumados a factores como la deforestación, las migraciones y la inestabilidad política de las comunidades de áreas endémicas contribuyen a agravar el problema.
Durante las últimas 2 décadas, se han realizado importantes esfuerzos para el desarrollo de estrategias alternativas de control de su transmisión, dentro de las cuales, las vacunas han atraído mayor interés por su gran potencial costo-beneficio.
Para llevar a cabo el desarrollo de vacunas contra la malaria, es necesario conocer el ciclo de vida del Plasmodium, determinar qué es común a las 4 especies de este género {Plasmodium spp) P.falciparum, P.vivax, P.malariae y P. ovale que afectan al humano, y establecer cuales son las moléculas involucradas en el mantenimiento del mismo. En el ciclo de vida, el parásito es transmitido de un individuo infectado a otro por mosquitos del género Anopheles spp, los cuales a través de una picadura inyectan el parásito en la forma de esporozoito al torrente sanguíneo del humano. Los parásitos viajan por la sangre hasta el hígado donde se introducen en las células hepáticas y desarrollan una fase de multiplicación masiva (ciclo esquizogónico) que genera miles de nuevos parásitos (merozoitos) con capacidad de invadir los glóbulos rojos, dentro de los cuales el parásito desarrolla una sucesión de ciclos de multiplicación y reinvasión a nuevos glóbulos rojos, aumentando rápidamente su número en el organismo.
Esta última serie de eventos ocurridos en la sangre son los responsables de la enfermedad y pueden conducir a la muerte del paciente. Algunos de los parásitos en la sangre se diferencian sexualmente en gametocitos (masculinos y femeninos) que al ser ingeridos por el mosquito durante una nueva picadura, realizan un proceso de fertilización e inician un nuevo ciclo (esporogónico o sexual) en el intestino del mosquito, para generar nuevos esporozoitos infecciosos.
Durante la fase eritrocítica del P. vivax, el merozoito de origen hepático invade un glóbulo rojo joven o reticulocito y ahí se multiplica por mecanismos asexuales hasta generar un esquizonte maduro que contiene entre 20-30 nuevos merozoitos (esquizogonia). Estos escapan del esquizonte y tienen la capacidad de invadir nuevos glóbulos rojos en los que a su vez se reproducen rápidamente para generar nuevos merozoitos. Algunos de los parásitos hepáticos pueden detenerse en su desarrollo y transformarse en formas hibernantes o hipnozoitos, las cuales pueden reactivarse meses o años más tarde y desarrollar la enfermedad después de un primer episodio, si el tratamiento no es adecuado.
Dentro del complejo ciclo de vida del Plasmodium, se han identificado 3 sitios distintos en los cuales podría actuar una vacuna antimalárica: 1) En la fase pre-eritrocítica del ciclo, esto es, antes del ingreso del parásito al hígado o durante su desarrollo en el mismo; 2) En la fase eritrocítica asexual, es decir, antes o durante la invasión a los glóbulos rojos, o durante su desarrollo intra-eritrocítico y 3) durante su desarrollo sexual, fertilización y desarrollo en el intestino del mosquito. De los tres blancos mencionados solo la fase eritrocítica es la responsable de los síntomas y la severidad de la infección. La fase pre-eritrocítica transcurre sin sintomatología y la reproducción sexual ocurre en el mosquito.
Las vacunas eritrocíticas asexuales están fundamentadas en el fenómeno de "premunición", en el cual los habitantes de zonas endémicas, expuestos a infecciones sucesivas, adquieren naturalmente inmunidad protectora contra las manifestaciones clínicas pero no contra la infección. Como resultado, los individuos adultos de estas regiones se tornan "inmunes" y logran desarrollar una vida normal. Esta inmunidad inicia su desarrollo desde edades muy tempranas y se sostiene hasta la vida adulta a expensas de infecciones repetidas que funcionan como refuerzos de la memoria inmunológica. Este tipo de inmunidad parcial no estéril se conoce como
"Inmunidad Clínica" y se manifiesta inicialmente con una reducción en el riesgo de muerte, posteriormente una reducción en la intensidad o severidad de la sintomatología clínica, y finalmente, luego de muchas reinfecciones, con una disminución en la carga parasitaria.
Este fenómeno ha sido difícil de probar en P.vivax en áreas de baja transmisión, en donde los habitantes alcanzan niveles relativamente bajos de inmunidad clínica porque se pierde fácilmente dada la baja frecuencia de refuerzos naturales. En áreas donde existen niveles de transmisión moderados o altos, como Papua Nueva Guinea, se ha determinado que la sintomatología aguda puede reducir su intensidad después de varios episodios clínicos y que la prevalencia de infecciones declina significativamente después de los 5-10 años de edad, alcanzando niveles significativos de inmunidad clínica a la edad de 10-15 años.
En la fase eritrocítica la inmunidad esta mediada principalmente por anticuerpos y se considera que la inmunidad celular se encuentra limitada dado que los glóbulos rojos no expresan moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) que les permita presentar antigenos. Estudios de transferencia pasiva de anticuerpos han demostrado conferir inmunidad protectora y ser capaces de controlar parasitemias patentes en pacientes afectados de P. falciparum. Los mecanismos involucrados son: 1) Bloqueo de la invasión del parásito al glóbulo rojo; 2) Opsonización y aglutinación del parásito con posterior promoción de la fagocitosis; 3) Inhibición celular dependiente de anticuerpos; 4) Inhibición del secuestro en la microcirculación; y 5) Neutralización de toxinas maláricas. A pesar de ser la única evidencia de inmunidad protectora inducida por medios naturales, los habitantes de las áreas endémicas siguen siendo afectados por la enfermedad. Esto se debe en parte a que la memoria inmunológica en malaria, por razones desconocidas, es de muy corta duración. Estudios prospectivos han reportado que si existe un periodo mayor de 6 meses entre dos infecciones en un mismo individuo, la memoria inmunológica se pierde y el sistema inmune del individuo responde como si nunca hubiese estado en contacto con el parásito. La existencia de una vacuna que lograra generar memoria inmunológica de larga duración contra los estadios sanguíneos sería de gran utilidad, especialmente para los habitantes de las áreas endémicas.
La Proteína de Superficie del Merozoito 1 (MSPl) es un antígeno considerado el principal blanco de la respuesta inmune contra los estadios sanguíneos de Plasmodium spp. Este antígeno ha logrado inducir inmunidad protectora parcial o estéril en varios modelos animales. Experimentos de transferencia pasiva de anticuerpos contra los diferentes fragmentos de la proteína logran bloquear el proceso de invasión al glóbulo rojo e inducir inmunidad protectora parcial en modelos animales. Varias subunidades candidatas a vacuna contra la malaria causada por P.falciparum han sido desarrolladas a partir de este antígeno.
La MSPl se expresa abundantemente en la superficie del merozoito durante la maduración del esquizonte, es esencial para el normal desarrollo del esquizonte y para la interacción inicial con el eritrocito. Durante el rompimiento del esquizonte y la subsiguiente invasión al glóbulo rojo solo un fragmento de 19 KDa, localizado hacia el extremo C-terminal, permanece anclado a la membrana del merozoito. Este fragmento tiene dominios similares a los del Factor de Crecimiento Epidérmico (FCE) que han sido involucrados como ligandos en la interacción inicial con el eritrocito; no obstante, existen dominios de unión al glóbulo rojo en otras regiones de la molécula. Hacia el extremo N-terminal de la molécula, existe un fragmento altamente conservado con un número inusual de epítopes B y T que en P. falciparum ha sido denominado /yi90L. Este fragmento expresado como proteína recombinante logra inducir inmunidad parcialmente protectora contra reto infeccioso en primates (Herrera, Rosero et al. 1992), y ha sido incluido en una vacuna multivalente: "Combinación B", que ha demostrado inducir protección parcial en ensayos clínicos, siendo precisamente la subunidad 190L la más inmunogénica (Saúl, Lawrence et al. 1999). Estudios inmunoepidemiológicos en áreas endémicas de Brasil han demostrado la presencia de anticuerpos y células inmunes inducidos naturalmente contra diversas regiones de la MSPl de P.vivax. Al igual que en la MSPl de P.falciparum, la atención se ha centrado en el extremo C- terminal y existen ya subunidades bien definidas como los fragmentos 42 y 19 KDa. Aunque se ha demostrado que la región N-terminal es la de mayor inmunogenicidad en la molécula y que existe asociación con protección clínica inducida naturalmente, son pocos los estudios conducentes a definir una subunidad antigénica hacia este lado de la proteína.
Hasta la fecha no existen solicitudes de patente que se relacionen con una subunidad de vacuna a partir del extremo N-terminal de la MSP-I de P.vivax. Las patentes otorgadas y/o en proceso que se refieren al antígeno MSP-I usualmente se dirigen al extremo C-terminal de la proteína de P. falciparum, más específicamente a los dominios de 42 y 19 KDa (WO97/30150,
US2004/0063190A1, WO02/085947A1, US2002/0076403, US2005/0095256A1) y los dominios similares FCE (WO93/17107), ninguna de las secuencias mencionadas anteriormente tienen efectos probados en el control de la infección producida por P. vivax
Teniendo en cuenta la información anterior es claro que existe en el estado de la técnica la necesidad de obtener nuevos antígenos que por sus características inmunogénicas permitan el desarrollo de vacunas contra la malaria causada por P.vivax.
Descripción de las figuras
Figura 1. Producción de rPv200L
Figura 2. Proceso de producción de EcPv200L escalable a condiciones GMP
Figura 3. Seroepidemiología de rPv200L en la Costa Pacífica Colombiana Figura 4. Inmunogenicidad de rPv200L en ratones BALB/c
Figura 5. Inmunogenicidad y eficacia protectora de r?v200L en primates Aotus Descripción detallada de la invención
La presente invención se centra en el descubrimiento, desarrollo y producción de una subunidad blanco para vacuna, denominada PvIOOL, que por sus capacidades inmunogénicas se consolida como candidato para la elaboración de vacunas contra la malaria causada por P.γivax.
Específicamente, la subunidad divulgada en esta solicitud se dirige a controlar la parasitemia y la severidad del proceso infeccioso durante la fase eritrocítica, en la que la invasión del parásito (merozoito) a los glóbulos rojos jóvenes (reticulocitos) ocurre por la interacción de moléculas (ligando) de la superficie del parásito y moléculas (receptoras) presentes en la superficie del reticulocito. El desarrollo y multiplicación intracelular pueden además resultar bloqueados a través de la acción de citocinas inducidas por la proteína, en particular del interferón gamma (IFN-γ).
La invención comprende la generación de vacunas, basadas en la subunidad Pv200L, cuya secuencia de aminoácidos e importancia inmunológica fue establecida por el grupo solicitante (Valderrama-Aguirre, Quintero et al. 2005). La invención incluye también la generación de la subunidad por tecnología recombinante, sumado al diseño y establecimiento de un proceso de generación y purificación industrializable para la producción a gran escala de la subunidad.
La presente invención constituye una aproximación única para la producción de candidatos a vacuna contra la malaria dado que se basa en la subunidad Pv200L, que no había sido previamente descrita y menos como vacuna. Adicionalmente, la invención es novedosa porque hace uso de la tecnología del ADN recombinante y herramientas de ingeniería genética para modificar la secuencia natural del fragmento génico que codifica por la subunidad Pv200L y de esta manera aumentar la eficiencia de síntesis en E. coli y facilitar el posterior proceso de purificación.
La subunidad 200L se localiza hacia el extremo N-terminal de la proteína MSP-I de P.vivax y se definió luego de análisis bioinformáticos en los que se determinó una región de más del 70% de homología con la subunidad 190L de la MSP-I de P.falciparum (Guttinger, Romagnoli et al.
1991), candidato a vacuna bien definido y ya en evaluaciones clínicas avanzadas (Genton, Al- Yaman et al. 2000; Genton, Al-Yaman et al. 2003), seguida por una región de alta capacidad de unión a reticulocitos denominada como HBRI (Rodríguez, Urquiza et al. 2002). La subunidad esta compuesta por parte del bloque 1, los bloques 2-4 y parte del bloque 5, según la clasificación de bloques realizada por Putaporntip y colaboradores (Putaporntip, Jongwutiwes et al. 2002), y esta comprendida entre los aminoácidos 50-450 de la mayoría de secuencias de MSP-I de P.vivax descritas hasta la fecha.
En general la subunidad presenta variaciones en la secuencia y tamaño de algunos de los bloques que la componen. Por esta razón la unidad de invención se define como una secuencia consenso ÍV200L (SEQ ID N° 1) activa en la protección contra P .vivax y obtenida a partir variaciones observadas en la naturaleza y variaciones puntuales realizadas por el solicitante en procura de mejorar la expresión de estas proteínas. En una modalidad la proteína reivindicada presente la secuencia (SEQ ID N°2) o la (SEQ ID N°3).
SEQ ID N° 1
XIX2X3X4X5SVLTSKIRNFX6X7KX8LELQIPGHTDLLHLIRELAX9EPXIOGIKYLVESYEEFNQL MHVINFHYDLLRAKLHDMCAHDYCKIPEHLKI SDKELDMLKKVVLGYRKPLDNIKDDIGKLEX1I FITKNKX12TIX13NIXI 4Xi5LIXi6XnENXi8KRX19X2oX2iX22TX23TTNGX24GX25QX26X27X28X2 9X3oX3lX32X33X34GX35X36X37TGX38X3gX4θSX4iSSX42TX43SX44GX45GX46TX47X436X498X50 PA X5IAX52XS3SSTNX54X55YXSeX57KKX58IYQAX59YNXSOl FYTX6IQLX62EAQKLIX63VLEKRVKV
LKEHKX64IKX65LLEQVX66X67EKX68KLPX69DX7oX7iX72X73TX74LTX75X76X77X78KX79AX8oX8 !KIAXS2LEX83X84IX8SAX86AKTVNFDLDGLFTDAEELEYYLREKAKMAGTLII PESTKSAGTPG
KTVPTLKETYPH
En donde X significa:
Figure imgf000009_0001
N
X2, 23, 72, 73-' N θ T
X4I Q o F X5: V o P X6: V o L
X7, 19, 20, 32, 44'- G O S
X8: S o F X9: F o V X10: N o H
Xn, 24, 25: T o A Xi2: E o I
Figure imgf000010_0001
S O K
Xl4, 33, 35, 40, 42, 61 ^ Nθ S
Xi5: KoD
Xi7>52:DoA
Figure imgf000010_0002
X2U8: QoH
X22, so: SoP X26, 74: NoP
X27: NoA
X28: NGSIAAASSETTQI O no está presente.
X29: AoS
X30, 41 : A o G
Figure imgf000010_0003
X37: EoS
X39: T, R o S
X43: LoG X45: A, DoT
X47: VoG
X48: V o T
X49: T o Q
Figure imgf000010_0004
X54, 57, 63; 79: AoE
X55, 75: NoD
X56, 82: EoD
X58: 1 o K
X59: 1, V o M X60: GoT
Xe2, so'.EoQ
X64: GoD X65: A o V
Xδδ, 68'- K o E
X70: N o Y X7I= T o P X76: E o no está presente X77: Q o V X84: Q o K X85: V o E
La invención también cubre la proteína recombinante que tienen la secuencia definida anteriormente y cuyo fragmento codificante ha sido modificado hacia el extremo 5' mediante la adición del código genético del aminoácido metionina (M) seguido del polipéptido ITIFP y 6 residuos aminoácidos de histidina (H). Preferiblemente la secuencia de la proteína recombinante que aquí se reivindica es la secuencia SEQ ID N° 4.
Otra alternativa de la invención hace referencia a la proteína que tienen la secuencia definida anteriormente y cuyo fragmento codificante ha sido modificado hacia el extremo 5' mediante la adición de un aminoácido metionina (M) seguido del polipéptido ITIFP; y en su extremo 3', donde se han insertado 5 aminoácidos histidina (H). Preferiblemente la solicitud se refiere a la secuencia de la proteína recombinante que corresponde a la secuencia SEQ ID N0 5.
En este orden de ideas, durante el desarrollo de la invención se generaron dos proteínas recombinantes, rPv200L (SEQ ID N° 4) y EcPvIOOL (SEQ ID N0 5), originadas a partir de manipulaciones para lograr la producción transgénica en E. coli, mejorar las condiciones de hidrofobicidad y empaquetamiento en cuerpos de inclusión, y facilitar su posterior purificación. Específicamente, para elaborar el producto rPv200L se adicionaron los códigos genéticos para una metionina (M) como codón de inicio, una secuencia corta de ITIFP altamente hidrofóbica, seguida de 5 histidinas (H) hacia el extremo 5' del gen (SEQ ID N° 6). En el caso de EcPv200L, se uso un gen sintético (SEQ ID N° 7), con el código genético alterado para hacer compatible el gen salvaje con el uso de codón de E. coli y así facilitar la expresión transgénica. Adicionalmente, se mantuvo la secuencia ITIFP y se agregaron los códigos genéticos de 6 histidinas hacia el extremo 3' del gen, para facilitar el proceso de purificación, y finalmente se adicionó un codón de parada. Las modificaciones puntuales se muestran en la secuencia N° 7. Otra invención reivindicada en la presente solicitud es el proceso de producción de la proteína recombinante EcPv200L. Dicho proceso de producción involucra 3 subprocesos: clonación, fermentación, y purificación. Durante la clonación, el gen sintético es insertado en el vector de expresión procariótica pET-24(a) y posteriormente se transforman bacterias E. coli
BL21 (DE3). En el subproceso de fermentación, los ciónos recombinantes se adaptan a crecimiento en medio de cultivo químicamente definido y en condiciones controladas de bioreactor. Finalmente para la etapa de purificación, la pasta celular resultante se lisa en un microfluidizador y previa centrifugación se recuperan los cuerpos de inclusión. Estos últimos son solubilizados con GuHCl 8M en presencia de β-mercaptoetanol y posteriormente sometidos a purificación mediante una serie de cromatografías.
Las cromatografías conducentes a purificar y obtener el producto final son en su orden: 1) Cromatografía de Afinidad con Ion Metálico Níquel (IMAC), 2) Cromatografía de Exclusión por Tamaño en Superedex 300 (SEC-S300); 3) Cromatografía de Interacción Hidrofóbica en resina de Butilo (HIC-Butyl); 4) Cromatografía de Intercambio Iónico en resina Q (IEX-Q); y 5) cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC-S75) en Superdex 75. El producto final es caracterizado para determinar perfil por cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC- An) y fase reversa (RP-An) en HPLC, determinar contenido de endotoxinas y contaminantes de E. coli y finalmente determinar perfil por espectrometría de masas y secuenciación N-terminal. El proceso de obtención de la proteína recombinante _EαPv200L es novedoso toda vez que es un proceso exclusivamente diseñado para esta proteína recombinante basado en sus características bioquímicas y que no había sido reportado en el estado de la técnica. Además, el proceso como tal no funciona con ninguna otra proteína recombinante y con la proteína de la invención tiene la ventaja de garantizar una alta productividad sin afectar la estabilidad ni las otras características relevantes para que la proteína conserve sus propiedades antigénicas, beneficios que no se alcanzan si se modifican las etapas o las condiciones del proceso que aquí se define.
También es parte de la invención las secuencias de ácidos nucleicos que codifica por el fragmento Pv200L, así como las moléculas de ácido nucleico complementarias a ellas (ADNc) y las variaciones que pueden tener estas moléculas de ADN en virtud del la degeneración del código genético. Igualmente, la invención reclamada abarca los vectores de expresión que comprenden el ADN o el ADNc definidos en el párrafo anterior y las células transformadas con dichos vectores. Dentro de los vectores usados en esta invención se encuentran plásmidos, fagos, baculovirus y YAC, expresados en sistemas procarióticos como bacterias, y eucarióticos como levaduras, células de plantas, mamíferos e insectos.
Adicional a las invenciones descritas, también son parte de la invención las composiciones farmacéuticas, especialmente vacunas para la prevención de la malaria que comprendan la subunidad Pv200L o subfragmentos de esta, ya sea como péptido sintético, proteína recombinante, ADN o ARN.
Preferiblemente la invención se refiere a las composiciones farmacéuticas precisadas anteriormente, y que comprenden uno o más adyuvantes de uso humano, cuyo uso es ampliamente reconocido en formulaciones de vacunas para potenciar la respuesta inmune ya sea por la inducción de anticuerpos específicos y/o estimular linfocitos T ayudadores y/o citotóxicos.
De manera complementaria, es objeto de la presente invención la formulación de las moléculas inmunogénicas descritas anteriormente, ya sea individualmente, combinadas con adyuvantes o combinadas con otras moléculas inmunogénicas formuladas en composiciones farmacéuticas con el fin de ser administradas en pacientes con necesidad de prevenir infecciones maláricas; estas moléculas se pueden formular como composiciones farmacéuticas en forma de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos formulados en diferentes adyuvantes de uso en humanos y diferentes proporciones.
De acuerdo a lo mencionado, son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas inmunogénicas definidas anteriormente con uno o más adyuvantes seleccionados del grupo que comprende Montanide ISA-720, Montanide ISA- 51, ASO2 (SBAS2), AS2V, ASlB, MF59, Alum, QS-21, MPL, CpG o microcápsulas. Estos adyuvantes han sido utilizados con diferentes antígenos de Plasmodium y han demostrado ser seguros y estimular la respuesta inmune humoral y/o celular.
Adicionalmente, se entienden comprendidas dentro de la invención reivindicada las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas inmunogénicas definidas anteriormente y fragmentos derivados de otros estadios del Plasmodium o de microorganismos diferentes a este y opcionalmente, incluyen diferentes adyuvantes de uso en humanos.
Preferiblemente, la subunidad de la invención podrá ser combinada con antígenos presentes en las diferentes fases del ciclo de vida del parásito, ya sea que los antígenos se anexen a la secuencia durante la síntesis o sean adicionados a la composición farmacéutica, tales como la proteína de circumesporozoito (CS), la proteína de adhesión relacionada con la trombospondina
(TRAP), la proteína de unión a Duffy (DBP), la proteína de superficie del merozoito (MSP-I), la proteína Pvs25 y la proteína Pvs48/45 del ciclo esporogónico, entre otros. Estos antígenos podrán ser usados completos o fragmentos de los mismos producidos como péptidos sintéticos, proteínas recombinantes o ADN.
A manera ilustrativa a continuación se presentan ejemplos que describen de forma detallada la mejor manera para llevar a cabo para la caracterización de la subunidad JV200L de P. vivax y su producción como proteína recombinante de las diferentes moléculas de la invención. No obstante, la materia reivindicada no se limita a dichos ejemplos. Por el contrario, el objeto solicitado abarca la proteína de la presente invención o sus fragmentos independientemente del proceso que se emplee para producirlos.
Ejemplo 1. Sistemas de producción de Pv200L como proteína recombinante.
La subunidad Pv200L ha sido producida como proteína recombinante. Durante el proceso de desarrollo de la invención se obtuvieron dos prototipos recombinantes, rPv200L y EcPvIOOL. La rPv200L fue obtenida a partir de un amplificado de PCR que se insertó en el vector plasmídico pRSET-B, el cual fue posteriormente clonado en bacterias E.coli BL21(DE3)-RIL. La purificación de rPv200L se logró por pases sucesivos a través de una cromatografía manual en columna de Níquel (IMAC), proceso facilitado por la adición de histidinas hacia el extremo N- terminal.
El producto obtenido puede observarse en la figura 1 en la cual se muestra: (i) electroforesis en gel de acrilamida teñida con Azul de Coomassie de rPv200L a 10, 1 y 0.5 μg. (ii): Perfil cromatográfico por HPLC en fase reversa que demuestra una homogeneidad de más del 90% en el producto final.
Dados los resultados promisorios obtenidos con esta unidad decidimos establecer y mejorar el sistema de producción para dar lugar a la versión recombinante mejorada de /V200L, denominada como EcPv200L, compatible con estándares de calidad de material grado clínico.
Los principales cambios en los sistemas de expresión están resumidos en la tabla 1. Entre ellos se destacan el cambio del vector de expresión, la producción de un gen sintético armonizado al uso de codón de E. coli, el cambio del marcador de selección, la producción de pasta celular en biorreactor y en medio de cultivo químicamente definido.
Tabla 1
Figure imgf000015_0001
Finalmente, se estableció un sistema de purificación con un total de 5 pasos que incluyen cromatografías de afinidad (IMAC), de exclusión por tamaño (SEC-S300 y SEC-S75), de intercambio aniónico (IEX-Q) y de interacción hidrofóbica (HIC-Butyl). Este procedimiento y su secuencia correcta son detallados en la figura 2. El producto final fue caracterizado bioquímicamente en términos de: la secuencia del plásmido de expresión, perfil de fase reversa (RP) y exclusión por tamaño (SEC) por HPLC con análisis de radio hidrodinámico, secuenciación N-terminal, perfil por espectrometría de masas (MS), contenido de endotoxinas y contaminantes de E. coli.
El proceso definido anteriormente tiene una eficiencia global de purificación del 20%, y es fácilmente escalable y transferible. El producto obtenido, presenta niveles de endotoxinas inferiores a 100 UE/dosis y contaminantes de E. coli casi imperceptibles (< 0.1%), resultando compatible con las regulaciones de agencias como la FDA y la USP. Así las cosas, el proceso aquí definido asegura una mejor expresión de la proteína, una mayor productividad y de una calidad de la proteína óptima para ser usada en la producción de vacunas.
Ejemplo 2. Ensayos de Seroepidemiología de Ia subunidad PvIQOJu
La subunidad Pv200L es altamente reconocida por individuos de áreas endémicas que han estado infectados y/o expuestos a infecciones por P. vivax. La figura 3 muestra los niveles de anticuerpos IgG contra rPv200L encontrados durante un estudio seroepidemiológico realizado en la Costa Pacífica Colombiana.
El suero de individuos infectados con P. vivax reconoce específicamente la proteína recombinante rPv200L por inmunoblot (figura 3 i, izquierda), mientras que los individuos control, que nunca han visitado o han estado expuestos en áreas endémicas, no reconocen la r?v200L (figura 3i, derecha). La distribución de los valores de densidad óptica según la edad (figura 3Ii) muestra que existe una tendencia a desarrollar títulos más altos de anticuerpo hacia la 2 y 5 década de la vida, fenómeno mas notable entre los expuestos (•) que entre los infectados (+)•
Tabla 2
Figure imgf000016_0001
La tabla 2 muestra el nivel de reconocimiento de la subunidad Pv200L por individuos de un área endémica en términos del porcentaje de respondedores con reacción positiva por IgG contra rPv200L y la fortaleza de tal reacción expresada como promedio de densidad óptica (OD).
La proteína recombinante EcPv200L ha sido también analizada mediante ensayos de seroepidemiología con sueros de individuos de áreas endémicas de Brasil obteniendo un reconocimiento positivo por IgG contra la subunidad en más del 90% de 4 diferentes áreas endémicas evaluadas.
Ejemplo 3. Inmunogenicidad de rPv200L en ratones BALB/c
Ratones BALB/c fueron inmunizados con 50 μg de rPv200L bajo un régimen de 3 inmunizaciones vía intraperitoneal. Los niveles de anticuerpos IgG específicos contra rPv200L luego de la tercera inmunización con la proteína emulsiñcada en adyuvante de Freund se muestran en la figura 4. Los títulos de anticuerpos tipo IgG anti-rPv200L después de la última inmunización alcanzan niveles por encima de IxIO7 diluciones (figura 4i). Tales anticuerpos son capaces de reconocer el inmunógeno rPv200L (4ii, izquierda) y su homólogo en P. falciparum rP/190L (4ii, derecha). Finalmente, los anticuerpos inducidos por inmunización con rPv200L en ratones BALB/c logran reconocer la proteína nativa sobre esquizontes de P. vivax (4iii).
Ejemplo 4. Inmunogenicidad y Eficacia Protectora de rPv20QL en primates del género Aotus
La inmunización de primates Aotus lemurinus griseimembra con rPv200L con un esquema de 3 dosis vía subcutánea con 100 μg de rPv200L emulsificada en adyuvante de Freund, logra inducir una respuesta inmune fuerte en términos de anticuerpos IgG que protege contra la reto con formas sanguíneas de P. vivax (Salvador I). Los primates inmunizados con rPv200L se protegen parcialmente logrando controlar la parasitemia y el progreso hacia la anemia severa. La figura 5i muestra como las curvas de parasitemia (parasitos/300 WBCs) en el grupo control (izquierda) alcanzan picos de mayor nivel que en el grupo inmunizado (derecha).
La tabla 3 recopila los parámetros determinados en el ensayo piloto de eficacia protectora en primates Aotus, con los que se demuestra que la parasitemia acumulada (CP) y el área bajo la curva de parasitemia (AUC) es reducida en el grupo inmunizado. Igualmente se muestran los datos de respuesta inmune humoral. Solo los animales control tuvieron que ser tratados para controlar la parasitemia antes de caer en anemia severa, lo que apoya una evidencia de respuesta inmune contra la severidad de la enfermedad. Tabla 3
Figure imgf000018_0001
ELISA = titulo de anticuerpos IgG contra r/V200L antes del reto, IFAT = título de anticuerpos IgG contra esquizontes de P vivax antes del reto, CP = Parasitemia acumulada (∑, de parasitemia/300 glóbulos blancos cada día), pcl = tiempo de aclaramiento de la parasitemia, Ptx = tiempo antes del pπmer tratamiento (para todo el grupo), AUC = Área bajo la curva {parásitos/día}

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que se caracteriza porque comprende la secuencia:
X1X2X3X4XSSVLTSKIRNFX6X7KX8LELQIPGHTDLLHLIRELAX9EPXIOGIKYLVESYEEFNQL MHVINFHYDLLRAKLHDMCAHDYCKIPEHLKISDKELDMLKKVVLGYRKPLDNIKDDIGKLEX11
FITKNKXÍ2TIX3.3NIX3.4XÍ5LIXÍ6XÍ7ENXÍ8KRX3.9X20X21X22TX23TTNGX24GX25QX26X27X2BX2 9X3θX31X32X33X34GX35X36X37TGX38X39X4θSX41SSX42TX43SX44GX45GX4gTX47X48GX49SX5θPA
X51AX52X53SSTNX54X55YX56X57KKX58IYQAX59YNX6OIFYTX61QLX62EAQKLIX63VLEKRVKV
LKEHKX64IKX65LLEQVX65X67EKX68KLPX69DX7OX7^XT3TX74LTX75X76X77X78KX79AX8OX8 iKIAXsj.LEXssXEKiIXssAXseΑKTVNFDLDGLFTDAEELEYYLREKAKMAGTLIIPESTKSAGTPG
KTVPTLKETYPH
Donde X significa:
Xi, 3, se: I o N X2, 23, 72, 73'- NθT
X4: QoF
X5: VoP X6: VoL
Figure imgf000019_0001
G O S X8: S o F X9: F o V
Xi0: NoH Xi 1,24, 25: ToA X12: EoI
Figure imgf000019_0002
O K
Xl4, 33, 35, 40, 42, 61• ' N O S
X,5: KoD
Xi6: S oí
Xn, 52: DoA X18,67:AoK
Figure imgf000019_0003
X26, 74: NoP
X27: NoA X28: NGSIAAASSETTQI O no está presente.
X29: AoS
Figure imgf000020_0001
X3.: Qo S
Figure imgf000020_0002
T O S
X37: EoS X39: T, R o S X43: LoG X45: A, D o T X47: VoG X48: VoT X49: ToQ Xsi, 53: PoA
Xs4, 57, 63, 79: A O E
X55,75:NoD
X56, 82: EoD X58: Io K
X59: 1, V o M
X60: GoT
X62, so: E o Q
X64: G o D X65: A o V
Figure imgf000020_0003
X70: NoY
XvirToP
X76: E o no está presente X77: QoV
X84: QoK
X85: VoE
2. La proteína, según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID N°2 o SEQ ID N°3.
3. La proteína, según la reivindicación 1, caracterizada porque es una proteína recombinante o un péptido sintético.
4. La proteína recombinante, según la reivindicación 3, caracterizada porque adicionalmente tiene el aminoácido metionina (M) seguido de seis aminoácidos histidina y el péptido ITIFP hacia el extremo N-terminal.
5. La proteína recombinante según la reivindicación 4 caracterizada porque comprende la secuencia SEQ ID N°4.
6. La proteína recombinante, según la reivindicación 3, caracterizada porque adicionalmente tiene el aminoácido metionina (M) seguido de el péptido ITIFP hacia el extremo N-terminal, y cinco aminoácidos histidina hacia el extremo C-terminal.
7. La proteína recombinante, según la reivindicación 6, caracterizada porque comprende la secuencia SEQ ID N°5.
8. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. La molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 8, caracterizado porque es una molécula de ADN, ARN o cADN.
10. La molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende la secuencia de polinucleótidos identificada como secuencia SEQ ID N°6 o SEQ ID N°7.
11. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8. Preferiblemente la secuencia de polinucleótidos es la secuencia identificada como SEQ ID N°6 o la secuencia identificada como SEQ ID N°7.
12. El vector de expresión, según la reivindicación 11, caracterizado porque es un plásmido ó un fago.
13. Una célula recombinante caracterizada porque comprende el vector de expresión según la reivindicación 11.
14. Una composición farmacéutica para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende una proteína según las reivindicaciones 1 a 7.
15. Una composición farmacéutica para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 8 a 10.
16. Una composición farmacéutica para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende el vector según la reivindicación 11.
17. Una composición farmacéutica para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende la célula recombinante de la reivindicación 13.
18. Una vacuna para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende la proteína según las reivindicaciones 1 a 7.
19. Una vacuna para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 8 a 10.
20. Una vacuna para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende un vector según la reivindicación 11.
21. Una vacuna para la prevención de la malaria caracterizada porque comprende la célula recombinante de reivindicación 13.
22. La vacuna según las reivindicaciones 17 a 21 caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más adyuvantes de uso humano.
23. La vacuna según la reivindicación 22 caracterizada porque el adyuvante es seleccionado del grupo que consiste en Montanide ISA-720, Montanide ISA-51, ASO2 (SBAS2), AS2V, ASlB, MF59, Alum, QS-21, MPL, CpG o microcápsulas.
24. La vacuna, según la reivindicación 22, caracterizada porque comprende adicionalmente antígenos derivados de otros estadios del Plasmodium o de microorganismos diferentes a éste.
25. La vacuna según la reivindicación 24 caracterizada porque los antígenos derivados de Plasmodium o de otro microorganismo se seleccionan a partir del grupo que consiste en la proteína de adhesión relacionada con la trombospondina (TRAP), la proteína de unión a
Duffy (DBP), la proteína de superficie del merozoito (MSP-I), proteína Pvs25 y proteína
Pv48/45, entre otros.
26. La vacuna según la reivindicación 25 caracterizada porque los antígenos son proteínas completas o fragmentos de las mismas producidos como péptidos sintéticas, proteínas recombinantes o vacunas de ADN.
27. Un proceso para producir la proteína recombinante de la reivindicación 1 caracterizado porque comprende los siguientes pasos
1. Clonación del gen sintético que codifica la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID 1 en el vector de expresión procariótica pET-24(a) y transformación de bacterias E. coli BL21 (DE3) con dicho vector. 2. Fermentación de los ciónos recombinantes en un medio de de cultivo químicamente definido y en condiciones controladas de bioreactor.
3. Purificación de la pasta celular mediante lisis en un microfluidizador seguida de centrifugación para recuperar los cuerpos de inclusión, que son solubilizados con GuHCl 8M en presencia de β-mercaptoetanol y posteriormente sometidos a purificación mediante una serie de cromatografías.
8. El proceso, según la reivindicación 27, caracterizado porque preferiblemente la serie de cromatografías del paso 3 son en su orden:
1. Cromatografía de Afinidad con Ion Metálico Níquel (IMAC),
2. Cromatografía de Exclusión por Tamaño en Superedex 300 (SEC-S300);
3. Cromatografía de Interacción Hidrofóbica en resina de Butilo (HIC-Butyl);
4. Cromatografía de Intercambio Iónico en resina Q (IEX-Q); y
5. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC-S75) en Superdexj75.
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