PT880588E - Proteina recombinante contendo umfragmento c-terminal de msp-1 de plasmodium - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO PROTEÍNA recombinante contendo umfragmento c-terminal de

MSP-1 DE PLASMODIUM A invenção refere-se a novos princípios activos de vacinas derivados da proteína major de superfície de formas merozoítas de um Plasmodium infeccioso para os mamíferos, nomeadamente para o homem, mais vulgarmente conhecido pela designação de MSP-1.

Esta proteína foi já objecto de numerosos estudos. É sintetizada no estágio esquizonte dos parasitas do tipo Plasmodium, nomeadamente do Plasmodium falciparum, e é expressa sob a forma de um dos constituintes major da superfície dos merozoítos, tanto durante o estádio hepático, como durante o estádio eritrocitário do paludismo (1, 2, 3, 4). Dado o carácter predominante e a conservação desta proteína em todas as espécies de Plasmodium conhecidas, sugeriu-se que ela pudesse representar um candidato para a constituição de vacinas anti-palúdicas (5, 6). 0 mesmo aconteceu com os fragmentos dessa proteína, em particular dos produtos naturais de clivagem cuja formação se observa, por exemplo, no decurso da invasão do hospedeiro infectado por parte do parasita dos eritrócitos. De entre estes produtos de clivagem, destacaremos o fragmento C-terminal com um peso molecular de 42 kDa (7, 8), que por sua vez é novamente clivado num fragmento N-terminal com um peso molecular aparente convencional de 33 kDa e num fragmento C-terminal com um peso molecular aparente convencional de 19 kDa (9), que permanece normalmente fixado à membrana do 1 parasita no final das modificações de que é, ele próprio, objecto, por intermédio de grupos do tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI) (10, 11).

Encontramo-lo ainda no estádio de anel precoce do ciclo de desenvolvimento intraeritrocitário (15, 16), dai ter-se afirmado que este fragmento de 19 kDa poderia desempenhar um papel ainda desconhecido, mas sem dúvida essencial, nos processos re-invasivos. Dai derivam as hipóteses já formuladas no passado de que esta proteína pudesse constituir um alvo particularmente eficaz para eventuais vacinas.

As frequentes referências relativas a proteínas p42 e pl9 resultantes de um certo tipo de Plasmodium consideram-se aqui como dizendo respeito aos produtos de clivagem C-terminais correspondentes da proteína MSP-1 desse Plasmodium, ou, por extensão, a produtos que contenham sensivelmente as mesmas sequências em aminoácidos, obtidas por recombinação genética ou por síntese química segundo as técnicas clássicas, por exemplo, por sintetizador de tipo «Applied System» ou por síntese em fase sólida de tipo «Merrifield». Para maior comodidade de linguagem, as referências a «p42 recombinantes» e a «pl9 recombinantes» dizem respeito às «p42» e «pl9» obtidas através de técnicas que comportam, pelo menos, uma etapa de engenharia genética.

Perante a dificuldade em obter quantidades significativas de parasitas de P. falciparum e a impossibilidade de cultivar P. vlvax in vitro, tornou-se evidente que a única forma de produzir uma vacina anti-palúdica requer um recurso às técnicas que permitem a utilização dos péptidos ou proteínas recombinantes. Mas o MSP-1 é muito difícil de produzir na 2 totalidade devido à sua grande dimensão de cerca de 200 kDa, um facto que levou os investigadores a interessarem-se pela parte C-terminal, cuja função, ainda desconhecida, é aparentemente a mais importante.

Relativamente às proteínas recombinantes referentes à parte C-terminal de MSP-1 de P. falciparum, que foram produzidas e testadas no macaco (12, 40, 41), mencionaremos: uma pl9 fundida com uma glutationa-S-transferase produzida em E. coli (40), uma p42 fundida com uma glutationa-S-transferase produzida em E. coli (12), uma pl9 fundida com um polipéptido resultante de uma anatoxina tetânica e portador de epítopos de células T auxiliares produzidas em S. cerevisiae (12), uma p42 produzida num sistema baculovírus (41).

Uma composição contendo a proteína de fusão pl9 com uma glutationa-S-transferase produzida em E. coli, em associação com alúmen ou lipossomas, não exerceu efeito protector sobre qualquer dos seis macacos Aotus nancymai vacinados (40).

Uma composição contendo a proteína de fusão p42 com uma glutationa-S-transferase produzida em E. coli, em associação com um adjuvante completo de Freund, não exerceu efeito protector sobre os dois tipos de macacos Aotus {A. nancymai e vociferans) aos quais havia sido administrada. A proteína pl9 produzida em S. cerevisiae exerceu um efeito protector sobre dois macacos Aotus do género A. nancymai (12). Pelo contrário, não exerceu efeito protector sobre os dois macacos Aotus do género A. vociferans. 3

Alguns investigadores (Chang et ai.) relataram igualmente ensaios de imunização realizados no coelho com uma proteína recombinante p42 produzida num sistema baculovírus e contendo uma sequência de aminoácidos em comum com o P. falciparum (18). Estes últimos autores indicam assim que esta p42 recombinante se comporta no coelho sensivelmente da mesma maneira que a proteína MSP-1 recombinante inteira (gpl95) . Esta proteína p42, associada a um adjuvante completo de Freund, foi objecto de ensaio de vacinação num primata não humano susceptível à infecção por P. falciparum, o Aotus, lemurinus grisemembra (40). Os resultados mostram que 2 em 3 animais foram completamente protegidos e que o terceiro, ainda que exibindo uma parasitemia semelhante aos controlos, tinha um período latente mais longo. Não obstante, é arriscado concluir o carácter protector no homem dos anticorpos assim induzidos contra os próprios parasitas. Com efeito, recordemos que não existem actualmente modelos experimentais muito satisfatórios no primata para o P. vivax e o P. falciparum. 0 modelo Saimiri, que foi desenvolvido para o P. falciparum e o P. vivax, e o modelo Aotus, para o P. falciparum, são sistemas artificiais, que necessitam da adaptação de estirpes de parasitas e com frequência da esplenectomia dos animais para obter parasitemias significativas. Por consequência, os resultados da vacinação obtidos através destes modelos não podem senão ter um valor preditivo limitado para o homem.

De qualquer maneira, podemos também interrogar-nos sobre o que seria uma taxa real de vacinação susceptível de ser eventualmente obtida com estas proteínas recombinantes, tendo em conta a constatação - relatada mais adiante - da presença nas p42 resultantes de Plasmodiums da mesma espécie, e mais 4 particularmente nas p33 correspondentes, de regiões hipervariáveis que tornariam aleatória em numerosos casos a eficácia imunoprotectora dos anticorpos induzidos em pessoas vacinadas por uma p42 derivada de uma estirpe de Plasmodium, contra uma infecção por outras estirpes da mesma espécie (13) .

Podemos mesmo admitir que o polimorfismo importante da parte N-terminal da p42 desempenha um papel significativo no escape imunológico, observado com frequência neste género de parasitas. A presente invenção tem por objecto a produção de proteínas recombinantes vacinantes que escapem a estas dificuldades, cujo efeito protector seja verificável em modelos experimentais realmente significativos, ou mesmo directamente no homem. A presente divulgação refere-se mais particularmente a composições vacinantes contra um parasita do tipo Plasmodium infeccioso para o homem, contendo a titulo de principio activo uma proteína recombinante glicosilada ou não, cuja sequência polipeptídica constitutiva essencial é a seguinte: quer de um fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (pl9) da proteína 1 de superfície (proteína MSP-1) da forma merozoíta de um parasita do tipo Plasmodium, infeccioso para o homem, sendo que este fragmento C-terminal se mantém normalmente ancorado à superfície do parasita no final da sua fase de penetração em eritrócitos humanos, por ocasião de um ciclo infeccioso; 5 quer de uma parte deste fragmento, assim que esteja também apta a induzir uma resposta imune capaz de inibir uma parasitemia in vivo devida ao parasita correspondente; quer de um péptido imunologicamente equivalente a este fragmento pl9 ou à parte acima mencionada deste fragmento, e comportando esta proteína recombinante, além disso, epítopos conformacionais instáveis em meio redutor, e constituindo, de preferência, a maioria dos epítopos reconhecidos por anti-soros humanos, formados contra o Plasmodium correspondente. A presença destes epítopos conformacionais poderia desempenhar um papel importante na eficácia protectora do princípio activo das vacinas. Encontramo-los em particular nos princípios activos que apresentam, por outro lado, as outras características acima definidas, quando foram produzidos num sistema vector baculovírus. Se necessário for, é referido a seguir que pela expressão «sistema de vector baculovírus» se entende o conjunto constituído pelo vector tipo baculovírus em si e pelas linhagens celulares, em particular células de insectos transfectáveis por um baculovírus modificado, por uma sequência a transferir nestas linhagens celulares, tendo como resultado a expressão desta sequência transferida. Alguns exemplos preferidos destes dois parceiros do sistema baculovírus foram descritos no artigo de Longacre et ai. (19). 0 mesmo sistema foi utilizado nos exemplos que se seguem. Bem entendido que algumas variantes, tanto do baculovírus, como das células infectáveis por este baculovírus, podem ser utilizadas em vez do que foi escolhido.

Em particular, a referida proteína recombinante é reconhecida por anti-soros humanos formados contra o Plasmodium 6 correspondente ou contra um Plasmodium homólogo, quando se encontra no estado não reduzido ou num estado reduzido não irreversível, mas não reconhecido ou pouco reconhecido por esses mesmos anti-soros quando está irreversivelmente reduzida.

Pode salientar-se o carácter instável em ambiente redutor destes epítopos conformacionais, nomeadamente no teste descrito mais adiante, nos exemplos, especialmente em presença de beta-mercaptoetanol. Do mesmo modo, são indicadas em exemplos apresentados mais adiante condições experimentais aplicáveis à obtenção de uma redução irreversível das proteínas de acordo com a invenção.

Deste ponto de vista, a proteína recombinante produzida por S. Longacre et al. (14) pode ser utilizada nessas composições. Recorde-se que S. Longacre et al. conseguiram produzir uma pl9 recombinante derivada da MSP-1 de P. vivax, num sistema vector de baculovírus que continha uma sequência nucleotídica codificante para a pl9 de Plasmodium vivax, em particular por transfecção de culturas de células de insectos [linhagem de Spodoptera frugiperda (S f 9)] com baculovírus vectores contendo, sob o controlo do promotor da poliedrina, uma sequência codificante para os fragmentos peptídicos definidos mais adiante, cujas sequências estavam colocadas pela seguinte ordem no vector baculovírus utilizado: fragmento 5'-terminal de 35 pares de bases da sequência sinal da poliedrina, da qual havia sido modificado (em ATT) o codão metionina de iniciação da expressão desta proteína; 7 um fragmento 5'-terminal nucleotídico codificante para um péptido de 32 aminoácidos, correspondente à parte N-terminal de MSP-1, incluindo o péptido de sinal de MSP-1. quer uma sequência nucleótida codificante para a pl9, quer uma sequência codificante para a p42 da proteína MSP-1 de Plasmodium vivax, sendo estas sequências também, consoante o caso, quer providas (formas «ancoradas»), quer desprovidas (formas solúveis) das regiões de extremidade 3' destas sequências de nucleótidos, cujos produtos de expressão C-terminais extremos se afirma desempenharem um papel essencial na ancoragem da proteína final pl9 sobre a membrana do parasita; 2 codões stop TAA.

Para a p42, as sequências derivadas da região C-terminal de MSP-1 estendiam-se, consequentemente, do aminoácido Asp 1325 ao aminoácido Leu 1726 (forma ancorada) ou ao aminoácido Ser 1705 (forma solúvel), e, para a pl9, as sequências estendiam-se do aminoácido Ile 1602 ao aminoácido Leu 1726 (forma ancorada) ou ao aminoácido Ser 1705 (forma solúvel), tendo como pressuposto que as sequências de aminoácidos completas de p42 e pl9, cujos aminoácidos iniciais e terminais foram indicados anteriormente, derivam do gene do isolado Belem de P. vivax que foi sequenciado (20) .

Resultados semelhantes foram obtidos empregando, nos mesmos sistemas de vectores, sequências nucleotídicas codificantes para a p42 e a pl9 de Plasmodium cynomolgi. A P. cynomolgi apresenta um duplo interesse: é uma espécie parasitária muito próxima do P. vivax, que é infecciosa para o macaco. Pode também infectar o homem. Temos igualmente acesso a hospedeiros naturais da P. cynomolgi, os macacos rhesus e os macacos toque Macaca sinica, para testar a eficácia de protecção do MSP-1 de P. cynomolgi em sistemas naturais. 0 macaco rhesus é considerado como uma das espécies mais representativas das reacções imunitárias do homem.

Em particular, obtivemos excelentes resultados nos testes de vacinação realizados com o macaco toque com dois polipéptidos recombinantes: a p42 e, sobretudo, a pl9 solúveis, derivadas de P. cynomolgi, produzidas respectivamente num sistema baculovirus e purificadas em coluna de afinidade com anticorpos monoclonais que reconheciam as regiões correspondentes da proteina MSP-1 nativa. Foram realizadas as seguintes observações: os seis macacos imunizados com a pl9 isolada (três macacos) e com a combinação de pl9 e p42 (três macacos) manifestaram uma imunidade quase estéril após infecção experimental. Os resultados obtidos com os três macacos imunizados com o p42 foram menos significativos. Dois deles comportaram-se como os precedentes, mas ainda que o terceiro tenha manifestado uma parasitemia menos importante do que os controlos imunizados com um tampão PBS em presença do adjuvante de Freund (3 macacos) ou não imunizados (3 macacos), esta não foi menos evidente.

Uma segunda infecção experimental demonstrou que os macacos que haviam recebido a pl9 isolada estavam protegidos, pelo menos, durante seis meses. Um segundo teste de vacinação com a pl9 associada a alúmen neste sistema (P. cynomolgi/macaco toque) demonstrou uma protecção significativa para 2 dos 3 macacos. Foi a primeira vez que a MSP-1 ou um outro antigénio recombinante demonstraram um efeito protector em presença de alúmen (42). 9

Os resultados dos testes particularmente eficazes realizados no macaco com polipéptidos recombinantes produzidos num sistema baculovírus, empregando uma pl9 recombinante de P. cynomolgi, estabelecem que polipéptidos recombinantes contendo respectivamente pl9 recombinantes derivados de outros Plasmodiums devem comportar-se da mesma maneira. São «mais eloquentes» do paludismo no homem do que os resultados de testes realizados com P. vivax ou P. falciparum nos seus «hospedeiros artificiais».

As proteínas recombinantes de baculovírus, derivadas de uma parte C-terminal de MSP-l(pl9), têm um efeito protector anti-palúdico muito significativo num sistema natural, que constitui o modelo de avaliação do efeito protector de MSP-1 mais representativo para o homem. 0 efeito protector obtido poderia ser ainda melhor uma vez que a forma pl9 é desprovida da região hipervariável da parte N-terminal da p42, cujo efeito pode ser deletério em situações naturais, nas quais o sujeito vacinado é confrontado com um polimorfismo importante. A pl9 parece também possuir epítopos específicos que não estão presentes na p42. 0 fragmento C-terminal de 19 kDa, cuja sequência está presente no princípio activo da vacina, pode ser limitado à sequência da própria pl9, na ausência de qualquer sequência polipeptídica, normalmente a montante da sequência de pl9 na proteína MSP-1 correspondente. Não obstante, é evidente que a sequência polipeptídica constitutiva essencial do princípio activo pode ainda comportar uma sequência polipeptídica do lado C-terminal pertencente ao fragmento N-terminal de 33 kDa 10 (ρ33) ainda associada à pl9 na p42 correspondente, antes da clivagem natural desta última, e isto de cada vez que a presença deste fragmento não seja de molde a modificar as propriedades imunológicas do principio activo da vacina. Como se verá mais adiante, particularmente a propósito da descrição dos exemplos, as sequências C-terminais da p33 de estirpes diferentes de uma mesma espécie de Plasmodium (ver a parte C-terminal das sequências peptidicas da «região III» da figura 4), apresentam também ainda um grau de homologia ou de conservação substancial da sequência, por exemplo, da ordem dos 80%, pelo menos, em diferentes variedades de Plasmodiums infecciosos para o homem, de maneira que elas não são de molde a modificar de forma fundamental as propriedades vacinantes do principio activo (cuja sequência corresponde à região IV) da figura 4, em particular na hipótese, que decorre desta figura, de o local de clivagem pressuposto entre a pl9 e a região III da p33 se situar entre os resíduos leucina e asparagina numa região particularmente bem conservada (LNVQTQ).

Normalmente, a sequência polipeptídica C-terminal da p33, quando está presente, contém menos de 50 resíduos de aminoácidos, por vezes até menos de 35, ou até menos de 10 resíduos de aminoácidos.

Pelo contrário, a sequência polipeptídica constitutiva essencial do princípio activo da vacina pode não conter a totalidade da sequência codificante para a pl9, desde que, naturalmente, esta última conserve a capacidade de induzir anticorpos protectores contra o parasita. Em particular, a parte de fragmento acima mencionada, tem um peso molecular de 10 a 25 kDa, especialmente de 10 a 15 kDa. Essa parte de 11 fragmento polipeptídico contém, de preferência, pelo menos uma das duas regiões EGF (abreviatura da expressão inglesa «Epidermal Growth Factor»). É evidente que o perito deve distinguir os fragmentos activos e aqueles que deixaram de o ser, especialmente de forma experimental, produzindo vectores modificados contendo sequências inseridas resultantes da pl9, de comprimentos diferentes, respectivamente isoladas a partir dos fragmentos obtidos a partir da sequência codificante para a pl9, por reacção com enzimas de restrição apropriadas, ou ainda por enzimas exonucleoliticas que teriam sido mantidas em contacto com o fragmento codificante para a pl9 durante períodos variáveis; a capacidade dos produtos de expressão dessas sequências inseridas em células eucarióticas correspondentes, particularmente células de insectos transformadas pelos vectores modificados correspondentes, de exercer um efeito protector, podendo então ser testada, especialmente nas condições experimentais que serão descritas mais adiante, a propósito dos exemplos. Em particular, os produtos de expressão destas sequências inseridas devem estar aptos a inibir uma parasitemia induzida in vivo pelo parasita correspondente inteiro.

Do mesmo modo, a presente divulgação inclui todas as composições vacinantes nas quais a sequência polipeptídica constitutiva essencial do princípio activo seria constituída por um péptido capaz de induzir uma resposta imunológica de tipo celular e/ou humoral equivalente à produzida pela pl9 ou ao fragmento tal como acaba de ser definido, uma vez que a adição, a deleção ou a substituição na sua sequência de certos aminoácidos por outros não acarretaria uma modificação 12 importante da capacidade do péptido assim modificado - mais adiante designado por «péptido imunologicamente equivalente» - em inibir também a parasitemia acima mencionada. 0 fragmento da pl9 pode naturalmente também ser associado, quer do lado N-terminal quer do lado C-terminal, ou por intermédio de uma ligação peptidica a um outro fragmento de proteina plasmodial que possua um potencial vacinante, como, por exemplo, uma proteina («Duffy Binding Protein» de P. vivax (29) ou EBA-175 de P. falciparum (30) e (31), em que uma região é especificamente rica em cisteina), desde que não seja alterada, mas, pelo contrário, amplificada, a sua capacidade de inibir uma parasitemia normalmente introduzida in vivo pelo parasita correspondente. 0 fragmento codificante para a pl9 ou uma parte desta, pode igualmente conter, a montante da extremidade N-terminal da pl9, uma outra sequência peptidica diferente, por exemplo, um fragmento C-terminal do péptido de sinal utilizado, tal como o da proteina MSP-1. Esta sequência contém, de preferência, menos de 50 aminoácidos, por exemplo, de 10 a 40 aminoácidos.

Estas observações estendem-se da mesma maneira a pl9 derivadas de outros Plasmodíums, em particular a P. falciparum, a espécie dominante dos parasitas, responsável por uma das formas mais graves de paludismo.

Mas as técnicas acima referidas para a produção, num sistema de baculovirus, de uma pl9 recombinante derivada de P. vivax ou de P. cynomolgi, dificilmente se podem transpor tal e qual para a produção de uma pl9 recombinante de P. falciparum com um rendimento satisfatório, nem que fosse para obter 13 quantidades apreciáveis que autorizassem a realização de testes de imunoprotecção. A presente divulgação fornece igualmente um processo que corrige em grande parte essa dificuldade. Torna-se também possível obter rendimentos muito mais importantes em pl9 de P. falciparum - e de outros Plasmodiums, quando se encontram dificuldades semelhantes - realizando uma sequência nucleotídica sintética para substituir a sequência nucleotídica natural codificante para a pl9 de Plasmodium falciparum num vector de expressão de um sistema baculovírus, codificando esta sequência nucleotídica sintética para a mesma pl9, mas sendo caracterizada por uma proporção de nucleótidos G e C mais elevada do que na sequência nucleotídica natural.

Por outras palavras, a invenção resulta da descoberta de que a expressão num sistema baculovírus de uma sequência nucleotídica codificante para uma pl9, estava aparentemente ligada a uma compatibilidade melhorada dos codões sucessivos da sequência nucleotídica, a exprimir, com a «maquinaria celular», células hospedeiras transformáveis por baculovírus, à semelhança do que é observado nas sequências nucleotídicas naturais normalmente contidas nesses baculovírus e expressas nas células hospedeiras infectadas; daí a expressão deficiente, ou por vezes a ausência total de expressão, de uma sequência nucleotídica nativa de P. falciparum-, daí também uma explicação possível para a expressão mais eficaz observada da pl9 de P. vivax num sistema baculovírus de Longacre et al. (14) e, como os inventores também o constataram, da sequência de P. cynomolgi a partir das sequências nucleotídicas pl9 nativas correspondentes, devido 14 aos seus teores relativos de nucleótidos G e C, muito mais elevados do que os das sequências nucleotídicas nativas codificantes para as pl9 de P. falciparum. A presente divulgação refere-se assim também, de uma forma mais geral, a um vector modificado do tipo baculovirus recombinante contendo, sob o controlo de um promotor contido nesse vector e susceptivel de ser reconhecido por células transfectáveis por esse vector, uma primeira sequência nucleotidica codificante para um péptido de sinal explorável por um sistema baculovirus, caracterizado por uma segunda sequência nucleotidica a jusante da primeira, igualmente sob o controlo desse promotor e q eu codifica para a sequência peptidica: quer de um fragmento peptidico C-terminal de 19 kilodaltons (pl9) da proteina 1 de superfície (proteína MSP-1) da forma merozoíta de um parasita do tipo Plasmodium, que não o Plasmodium vivax, e infeccioso para o homem, permanecendo este fragmento C-terminal normalmente ancorado à superfície do parasita no final da sua penetração em eritrócitos humanos, por ocasião de um ciclo infeccioso; quer de uma parte deste fragmento peptidico, assim que o produto de expressão da segunda sequência num sistema de baculovirus esteja também apto a induzir uma resposta imunitária capaz de inibir uma parasitemia in vivo devida ao parasita correspondente; que de um péptido imunologicamente equivalente, derivado do fragmento peptidico C-terminal (pl9) acima mencionado ou da acima mencionada parte de fragmento peptidico por adição, deleção ou substituição de aminoácidos que não acarrete uma modificação importante da capacidade deste péptido 15 imunologicamente equivalente induzir uma resposta imunológica de tipo celular e/ou humoral semelhante à produzida por este fragmento peptidico pl9 ou à parte deste fragmento acima mencionada, e possuindo a dita sequência nucleotidica, no caso vertente, um teor de nucleótidos G e C compreendido entre 40 e 60%, de preferência de, no mínimo, 50% da totalidade dos nucleótidos de que é constituída. Esta sequência pode ser obtida por construção de um gene sintético em que os codões naturais tenham sido modificados por codões ricos em G/C, sem que a sua tradução seja modificada (manutenção da sequência peptídica).

Neste caso, a dita sequência nucleotidica, fornecida por um ADN sintético, pode apresentar, pelo menos, 10% de codões modificados em relação à sequência do gene ou do cDNA natural, conservando sempre as características da sequência natural traduzida, ou seja, a manutenção da sequência em aminoácidos.

Sendo assim, não excluímos que esse teor de nucleótidos G e C possa ser ainda mais aumentado, desde que as modificações daí resultantes, relativamente à sequência em aminoácidos do péptido recombinante - ou péptido imunologicamente equivalente - produzido não acarretassem uma perda das propriedades imunológicas, e mesmo protectoras, das proteínas recombinantes formadas, especialmente nos testes que serão ilustrados mais adiante.

Estas observações aplicam-se naturalmente a outros Plasmodiums infecciosos para o homem, em particular assim que sequências nucleotídicas nativas codificantes para as pl9 correspondentes possuam teores de nucleótidos T e A 16 dificilmente compatíveis com uma expressão eficaz num sistema baculovirus. A sequência codificante para o sinal utilizado pode ser a normalmente associada à sequência nativa do Plasmodium a que diz respeito. Mas pode igualmente resultar de um outro Plasmodium, por exemplo, P. vivax ou P. cynomolgi, ou de outro organismo, caso seja susceptivel de ser reconhecido como sinal num sistema baculovirus. A sequência codificante para a pl9 ou um fragmento desta no seio do vector considerado é, no caso vertente, desprovida da sequência de ancoragem da proteína nativa ao parasita da qual resultou, caso esse em que a proteína expressa é em geral excretada no meio de cultura (forma solúvel). A este respeito, é, aliás, de assinalar que nas condições descritas pela presente divulgação, as formas solúveis e ancoradas de proteínas recombinantes produzidas, em particular quando resultam de P. falciparum, de P. cynomolgi ou de P. vivax, têm tendência a formar oligómeros, podendo esta propriedade estar na origem das imunogenecidades aumentadas das proteínas recombinantes formadas. A presente divulgação também diz respeito aos vectores nos quais a sequência codificante contém a sequência de extremidade 3' terminal codificante para a sequência de extremidade C'-terminal hidrófoba da pl9, e que está normalmente implicada na indução da ancoragem da proteína nativa à membrana celular do hospedeiro em que é expressa. Esta região de extremidade 3'-terminal pode, aliás, ser heteróloga relativamente à sequência codificante para a parte solúvel de p!9, como por exemplo, corresponder à sequência 17 3'-terminal resultante de P. vivax ou de um outro organismo, desde que ela codifique para uma sequência de ancoragem do conjunto da proteína recombinante produzida na membrana do hospedeiro celular do sistema baculovírus utilizado. A título de exemplo deste género de sequências de ancoragem, citamos a GPI do antigénio CD59, exprimível em células de insectos do tipo Spodoptera frugiperda (32) ou a GPI de uma proteína humana CD14 (33) . A presente divulgação refere-se também, como é natural, às proteínas recombinantes, proteínas que comportam epítopos conformacionais reconhecidos por soros humanos formados contra o Plasmodium correspondente.

De uma maneira geral, a presente divulgação refere-se a qualquer proteína recombinante do tipo acima indicado, desde que ela comporte epítopos conformacionais tais como os produzidos num sistema baculovírus, especialmente aqueles que se verifique serem instáveis em meio redutor. A presente divulgação refere-se naturalmente às referidas proteínas recombinantes, quer sob a chamada forma solúvel quer sob a forma provida de uma região de ancoragem, em particular aos hospedeiros celulares utilizados num sistema baculovírus.

No campo da presente divulgação entram igualmente os oligómeros produzidos espontaneamente nos sistemas baculovírus, utilizados ou produzidos a posteriori, recorrendo a técnicas clássicas de oligomerização de proteínas. A técnica correntemente utilizada emprega o glutaraldeído. Mas qualquer sistema clássico de ligação 18 cruzada entre funções respectivamente amina e carboxilo, como as que são encontradas nas proteínas, poderá ser igualmente utilizado. A título de exemplo, podemos empregar qualquer uma das técnicas descritas no pedido de patente europeia 0602079. Por «oligómero» entendemos uma molécula que contém de 2 a 50 unidades monómeras, cada uma delas contendo a pl9 ou um fragmento dela, como definido acima, capaz de formar um agregado. A presente divulgação refere-se igualmente a qualquer produto de conjugação entre uma pl9 ou fragmento de pl9 tal como definido acima, por um lado, e uma molécula portadora - por exemplo, uma polilisina-alanina - utilizável para a produção das vacinas, por outro, por intermédio de ligações covalentes ou não. As composições vacinantes que as utilizam fazem igualmente parte da presente divulgação. A presente divulgação refere-se igualmente às composições de vacinas que empregam estas proteínas recombinantes oligómeras ou conjugadas, incluindo, aliás, as proteínas resultantes de Plasmodium vivax, estendendo-se também estas observações aos oligómeros destas proteínas recombinantes.

Fazem igualmente parte da presente divulgação as composições em que as proteínas recombinantes acima mencionadas estão associadas a um adjuvante, por exemplo, um alúmen. As proteínas recombinantes que comportam a região extrema C-terminal e que permitem a sua ancoragem à membrana das células onde são produzidas, são utilizadas de forma vantajosa em combinação com lípidos aptos a formar lipossomas e apropriados para a produção de vacinas. Sem que tenhamos tido a intenção de nos limitarmos a isso, podemos recorrer aos lípidos descritos para este fim, por exemplo, na obra 19 intitulada «Les liposomes aspects technologique, biologique e pharmacologique», de J. Delattre et al.r edição INSERM, 1993. A presença da região de ancoragem na proteína recombinante, quer se trate de uma região de ancoragem homóloga ou heteróloga, relativamente à parte vacinante propriamente dita, é de molde a favorecer a produção de anticorpos citófilos, nomeadamente do tipo IgG2a e IgG2b, no rato que poderiam ter uma actividade protectora particularmente elevada, ao ponto de podermos dispensar-nos de associar os princípios activos de vacinas assim constituídas com outros adjuvantes que não os lipidos utilizados para a constituição das formas lipossómicas. Tratar-se-ia de uma vantagem importante, uma vez que os lipossomas podem ser liofilizados em condições que permitam o seu armazenamento e transporte, sem que sejam então indispensáveis cadeias de frio.

Outras caracteristicas da invenção surgirão ainda no decurso da descrição que acompanha exemplos de proteínas recombinantes e condições em que elas podem ser produzidas, sem que estes exemplos limitem o alcance da invenção.

Descrição da construção PfMSPlpi9S (solúvel) (pl9 solúvel resultante de P. falciparum) A construção recombinante PfMSPlpi9S contém o ADN correspondente aos 8 pares de base da sequência líder e os 32 primeiros aminoácidos da MSP1 de Plasmodium vivax de Meti a Asp32 (isolado Belem; Del Portillo et al. 1991. P.N.A.S. 88, 4030) seguidos por um GluPhe, devido ao sítio EcoRl que faz a ligação dos dois fragmentos. O conjunto é seguido pelo gene sintético, descrito na Figura 1, codificante do Plasmodium falciparum MSP1pi9 de Asni6i3 a Sermos (isolado Uganda-Palo 20

Alto; Chang et ai., 1988. Exp. Parasitol. 67,1). A construção é terminada por dois codões stop de TAA. Esta construção dá lugar a uma proteína recombinante, que é segregada no sobrenadante de cultura das células infectadas.

Da mesma maneira, e com propósitos comparativos, produzimos uma construção recombinante em condições semelhantes às utilizadas para a produção da pl9 acima mencionada, mas trabalhando com uma sequência codificante que consistia numa cópia directa do ADN correspondente da estirpe P. falciparum (FUP) descrita por Chang et al., Exp. Parasit. 67, 1. 1989. A cópia deste gene natural (que se estende da asparagina 1613 à serina 1705) foi formada por PCR a partir do gene nativo. Representámos na Figura IA as sequências do gene sintético (Bacl9) e do "gene nativo" (PF19).

Verifica-se que 57 codões dos 93 codões da sequência codificante nativa para a pl9 resultante de P. falciparum foram modificados (no que respeita ao terceiro nucleótido em 55 deles, e ao primeiro e terceiro nucleótido nos dois codões restantes). À extremidade 5' foram acrescentados codões novos, para introduzir o péptido de sinal nas condições acima indicadas, e para introduzir um sítio EcoRI para a clonagem, e do mesmo modo foram acrescentados dois codões stop não presentes na pl9 de P. falciparum, com a finalidade de obter sinais de terminação da expressão. As letras individualizadas colocadas respectivamente por cima dos codões sucessivos correspondem aos aminoácidos respectivos sucessivos. Os asteriscos (*) referem-se aos codões stop. As linhas verticais assinalam os nucleótidos que são iguais nas duas sequências. 21

Descrição da construção PfMSPlpigA (ancorado GPI) (pl9 ancorada de P. falciparum) A construção PfMSPlpi9A possui as características da precedente, exceptuando o facto de que a sequência sintética (Figura 1B) codifica para o MSPlpi9 de Plasmodium falciparum (isolado Uganda-Palo Alto) de Asni6i3 a Ilei726, seguida por dois codões stop de TAA. Esta construção dá lugar a uma proteína recombinante que está ancorada na membrana plásmica das células infectadas por uma estrutura do tipo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). A Figura 1C é representativa da sequência da proteína recombinante PfMSPlpi9S, antes de corte da sequência sinal. A Figura 1D é representativa da sequência da proteína recombinante PfMSPlpi9S após corte da sequência sinal.

Os aminoácidos assinalados nas figuras 1C e 1D provêm do sítio EcoRl utilizado para unir as sequências nucleótidas derivadas da parte N-terminal de MSP1 de P. vivax (com sequência sinal) e de MSPlpi9 de P. falciparum.

Figura 2 - o antigénio recombinante PfMSPlpi9 solúvel purificado por imunoafinidade foi analisado por imunoblot após SDS-PAGE em presença (reduzido) ou ausência (não reduzido) de beta-mercaptoetanol. As amostras são carregadas sobre gel após aquecimento a 95°C em presença de 2% SDS. Nestas condições, apenas as ligações do tipo covalente (pontes dissulfureto) conseguem resistir à desagregação. 0 blot da esquerda foi revelado com um anticorpo monoclonal que reage com um epítopo linear da pl9 natural. 0 blot da direita 22 foi revelado com uma mistura de 13 anti-soros humanos provenientes dos sujeitos com uma imunidade adquirida ao paludismo devido ao Plasmodium falciparum. Estes resultados mostram que a molécula recombinante de baculovirus reproduz bem os epitopos conformacionais em forma de polimero que são, na sua maioria, reconhecidos pelo anti-soro humano.

Figura 2B Análise por imunoblot com anti-soro humano do MSP-1 pl9 purificado de P. vivax e P. cynomolgi recombinante em condições não reduzidas (NR), reduzida somente no meio de carregamento (R) e reduzida irreversivelmente (IR).

Este trabalho baseia-se na ideia de que o sistema de expressão baculovirus reproduz correctamente e em grande proporção os epitopos conformacionais presentes in vivo na parte C-terminal de MSP-1. A melhor maneira de medir esta propriedade (e talvez a única maneira possível, na ausência das proteínas nativas purificadas que correspondam ao pl9) é estudar a reactividade das proteínas recombinantes com o anti-soro dos indivíduos expostos ao paludismo, sendo isto um reflexo das proteínas nativas, tal como são «vistas» pelo sistema imunitário humano.

Desta forma, os antigénios recombinantes PvMSP-1 pl9 e PcMSP-1 pl9 solúveis purificados por imunoafinidade foram analisados por imunoblot após SDS-PAGE (15%) em presença (reduzido) ou ausência (não reduzido) de DTT. As amostras são carregadas sobre gel após aquecimento a 95°C, em presença de 2% SDS. A redução irreversível foi feita da seguinte maneira: a proteína é posta de novo em suspensão em 0,2 M Tris-HCl, pH 8,4, 100 mM DTT, 1,0% SDS e aquecida 30 minutos a 70°C. Após diluição com água, é acrescentada acrilamida a uma 23 concentração final de 2 M, e a mistura é incubada em azoto sem luz, durante 1 hora, a 37°C. 0 imunoblot foi revelado com uma mistura de 25 anti-soros humanos, provenientes dos sujeitos com uma imunidade adquirida ao paludismo devido ao Plâsmodium vivax. V e C designam respectivamente as proteínas derivadas de MSP-1 de P. vivax e P. cynomolgi. É de assinalar que as proteínas recombinantes reduzidas de forma irreversível não mostram qualquer reactividade com o anti-soro humano, ao passo que as proteínas reduzidas de forma não irreversível, ou não reduzidas, mostram uma boa reactividade. (0 Pv MSP-1 pl9 não reduzido é um pouco fraco, porque no seu estado glicosilado não se liga muito bem ao papel de nitrocelulose.) Estes resultados mostram que o reconhecimento das moléculas MSP-1 pl9 de baculovírus pelo anti-soro humano é em grande parte, se não totalmente, dependente dos epítopos conformacionais sensíveis à redução, que são reproduzidos neste sistema.

Figura 3-0 antigénio recombinante PvMSPlP42 solúvel (Longacre et al. 1994, op. cit.) foi incubado durante 5 horas a 37°C, em presença de fracções de proteínas derivadas dos merozoítos de P. falciparum e separadas por isoelectrofocalização. As amostras foram, em seguida, analisadas por imunoblot em presença (reduzido) ou ausência (não reduzido) de beta-mercaptoetanol. Foram analisadas as fracções 5 a 12 de isoelectrof ocalização, bem como dois extractos totais de merozoítos feitos em presença (Tex) ou ausência (T) de detergente. 0 imunoblot foi revelado com anticorpos monoclonais específicos para o MSPlp42 e pig de P. vivax. Os resultados sugerem que há uma actividade proteolítica nos merozoítos de P. falciparum, que pode ser extraída em detergente. A digestão do p42 em certas fracções 24 parece provocar uma polimerização dos produtos de digestão (pl9); esta polimerização está provavelmente ligada à formação de pontes dissulfureto, uma vez que em presença de beta-mercaptoetanol, as formas de elevado peso molecular desaparecem dando lugar a uma molécula de cerca de 19 kDa (Tex-R). A polimerização do pl9 observada nestas experiências poderia assim ser uma propriedade intrínseca desta molécula in vivo.

Figura 3B: A contribuição diferencial dos antigénios p42 e pl9 para a resposta humana anti-MSP-1 de P. vivax. 0 reconhecimento dos antigénios MSP-1 p42 e pl9 de P. vivax pelo anti-soro dos indivíduos portadores de uma imunidade adquirida a P. vivax foi comparado pela técnica de inibição de ELISA da seguinte forma: uma mistura de 25 anti-soros humanos provenientes dos sujeitos com uma imunidade adquirida ao paludismo devido a P. vivax foi diluída a 1:5000 e incubada 4 horas à temperatura ambiente quer isolada, quer em presença de uma solução de 1 mM p42 ou pl9 recombinante purificado de P. vivax. Esta mistura foi transferida para um poço de microtítulo previamente revestido durante 18 horas a 4°C por 500 ng ml-1 p42 ou pl9 recombinante purificado absorvido, e incubada 30 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo 0.1% Tween 20, um anti-rato IgG de cabra conjugado com peroxidase foi acrescentado e a mistura foi incubada 1 hora a 37°C e a actividade enzimática foi revelada por leitura da densidade óptica a 492 nm. A percentagem de inibição foi calculada com base nos valores de 100% de reactividade de anti-soro com o antigénio revestido em placa de microtítulo na ausência de um antigénio competidor. Os dados estatísticos foram calculados utilizando 25 o programa Statview. Cada barra representa a inibição média em percentagem de um par de antigénios competidor/absorvido com base em 4 a 12 determinações e as linhas verticais correspondem a um intervalo de 95% de confiança. As estrelas (*) designam os antigénios produzidos em presença de tunicamicina, por conseguinte sem N-glicosilação. Os parâmetros importantes destas medidas são a diluição de anti-soro a 1:5000 que se situa na região sensível das curvas de ELISA e as concentrações de antigénios competidores a 1 mM que incluem a competição pelos epítopos de baixa afinidade. Deste modo, os dados reflectem a semelhança máxima entre os dois antigénios comparados. Os resultados mostram que a maioria, se não todos os epítopos do p42 reconhecidos pelo anti-soro humano estão presentes no pl9 pois em presença deste último, a reactividade do anti-soro humano contra o p42 é inibida tanto quanto pelo próprio antigénio p42. Mas, pelo contrário, cerca de 20% dos epítopos do pl9 reconhecidos pelo anti-soro humano não o são, ou não são acessíveis no p42, uma vez que a reactividade do anti-soro humano contra o pl9 é bastante menos inibida pelo p42 do que pelo próprio pl9. Tais epítopos específicos do pl9 só podem ser constituídos ou revelados depois do corte do p42 em pl9 e p33. Estes resultados não são afectados pela glicosilação, o que mostra que o efeito se deve a uma diferença entre os componentes peptidicos do pl9 e do p42 e não a uma diferença de glicosilação. Estes resultados sublinham o facto de o pl9 ter uma identidade imunológica distinta do p42.

Descrição da construção PcMSPlpl9S (solúvel) (pl9 solúvel de P.cynomolgi) 26 0 ADN utilizado para a construção acima referida foi obtido a partir de um clone da estirpe de Plasmodium cynomolgi ceylonesis (22-23). Esta estirpe foi mantida por meio de passagens sucessivas no seu hospedeiro natural (Macaca sinica) e transmissões cíclicas por intermédio de mosquitos (27) .

Parasitas sanguíneos foram obtidos a partir dos macacos infectados no estádio esquizonte maduro quando as parasitemias atingiram um nível de 5%. Foram então purificados segundo os métodos descritos em (25) . 0 ADN foi em seguida extraído como foi descrito em (26).

Um fragmento de 1200 pares de base foi em seguida produzido recorrendo à reacção PCR utilizando os oligonucleótidos sublinhados na Figura 4 e resultantes de P.vivax. O oligonucleótido 5' compreendia um sítio de restrição EcoRI e o oligonucleótido 3' dois codões sintéticos stop TAA seguidos de um sítio de restrição BglII. Este fragmento foi introduzido por ligação e por intermédio destes sítios EcoRI e BglII no plasmídeo pVLSV200 contendo já a sequência sinal da proteína MSP-1 de P.vivax (19). O novo plasmídeo (pVLSV200C42) foi utilizado para a análise de sequências de ADN.

As sequências de P.cynomolgi e sequências correspondentes de P.vivax foram colocadas em alinhamento. As setas negras designam os presumíveis sítios de clivagem primária e secundária. Estes foram determinados por analogia com os sítios conhecidos em P.falciparum {21, 28). Linhas verticais e setas horizontais localizam os limites das quatro regiões que foram estudadas. A região 4 corresponde à sequência 27 codificante para a pl9 de P.cynomolgi. Os sítios de glicosilação estão enquadrados e as cisteínas conservadas estão sublinhadas. Na parte inferior da Figura 4 estão indicadas as percentagens de identidade entre os dois isolados de P.vivax e P. cynomolgi. A construção recombinante PcMSPlpi9S contém ADN correspondente aos 8 pares de bases da sequência «líder» e os 32 primeiros aminoácidos de MSP1 de Plasmodium vivax de Meti a Asp32 (isolado Belem ; Del Portillo et al. 1991. P.N.A.S. 88, 4030.) seguidos por um GluPhe, devido ao sítio EcoRl a fazer a ligação dos dois fragmentos. O todo é seguido pela sequência codificante para o MSPlpi9 de Plasmodium cynomolgi (estirpe Ceilão) de Lys276 a Ser38o· A construção termina com dois codões stop de TAA. Esta construção dá origem a uma proteína recombinante que é segregada no sobrenadante de cultura das células infectadas.

Purificação da proteína recombinante PfMSPlpl9 por cromatografia de imunoafinidade com um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a pl9 de Plasmodium falciparum. A resina de cromatografia foi preparada ligando 70 mg de um anticorpo monoclonal (obtido a partir de um hibridoma G17.12 registado na CNCM (Paris, França) a 14 de Fevereiro de 1997 sob o n°l-1846; este hibridoma G17.12 foi construído a partir do mieloma X63 Ag8 653 produzindo IgG 2a/k reconhecendo a pl9 de P.falciparum) a 3g de CNBr-Sepharose 4B activado (Pharmacia) por métodos padrão pormenorizados no modo de utilização fornecido por Pharmacia. Os sobrenadantes de cultura que contêm o PfMSPlpl9 solúvel foram incubados em «batch» com a resina de cromatografia durante 16 horas a 4°C. 28 A coluna foi lavada uma vez com 20 volumes de 0.05% NP40, 0.5M NaCl, PBS ; uma vez com 5 volumes de PBS e uma vez com 2 volumes de 10 mM fosfato de sódio, pH 6.8. A elução foi efectuada com 30 ml de 0.2 M glicina, pH 2.2. O eluato foi neutralizado com 1 M fosfato de sódio, pH 7.7, a seguir concentrado por ultrafiltração e dialisado contra PBS. Para a purificação do PfMSPlpl9 ancorado, todas as soluções de lavagem e elução continham como suplemento 0.1% 3-(Dimetil-dodecilamónio)-propano sulfonato (Fluka).

Ensaio de vacinação de MSPl recombinante Plasmodiim vivax (p42 e pl9) no macaco esquilo Saimiri sciureus.

Este ensaio de vacinação foi feito nos Saimiri sciureus boliviensis machos de 2 a 3 anos, não esplenectomizados. Três macacos foram injectados 3 vezes por via intramuscular com 3 semanas de intervalo com uma mistura de cerca de 50 a 100yg cada um, de PvMSPlp42 e pi9 solúvel recombinante (19), purificado por imunoafinidade. 0 adjuvante de Freund completo e incompleto era utilizado da seguinte maneira: Ia injecção: 1:1 FCA/FIA; 2a injecção 1:4 FCA/FIA; 3a injecção: FIA. Estas composições de adjuvante eram misturadas subsequentemente 1:1 com o antigénio em PBS. Os cinco macacos controlados recebiam o antigénio glutationa-S-transferase (GST) produzido em E.coli segundo o mesmo protocolo. A infecção experimental foi efectuada injectando 2.106 hemácias infectadas com uma estirpe adaptada de Plasmodium vivax (Belem) 2.5 semanas depois da última injecção. Avaliou-se a protecção determinando as parasitemias diárias em todos os animais através de exame dos esfregaços corados com giemsa. 29

As curvas da Figure 5 são representativas da variação da parasitemia medida em número de hemácias parasitadas por microlitro de sangue (sobre o eixo das ordenadas à escala logaritmica) em função do tempo decorrido depois da infecção (em dias). A curva A corresponde aos valores médios observados nos três macacos vacinados, a curva B aos valores médios nos cinco macacos testemunha.

Da análise da figura decorre uma redução muito forte da parasitemia sob o efeito da vacinação.

Ensaio de vacinação de MSPl recombinante de Plasmodium cynomolgi (p42 e pl9) no macaco toque, Macaca sinica.

Quinze macacos capturados foram utilizados da seguinte maneira: (1) 3 animais injectados com 100 pg PcMSP1P42 solúvel; 3 animais injectados com 35 pg (Ia injecção) ou 50 pg (2a e 3a injecções) PcMSP1pi9 solúvel; (3) 3 animais injectados com uma mistura de PcMSPlP42 ^ pi9^ (4) 3 animais injectados com o adjuvante mais PBS; (5) 3 animais não injectados. O adjuvante de Freund completo e incompleto foi utilizado segundo o protocolo acima descrito. As injecções foram feitas por via intramuscular com 4 semanas de intervalo. A infecção experimental foi feita injectando 2.105 hemácias infectadas com Plasmodium cynomolgi 4 semanas depois da última injecção. Avaliou-se a protecção determinando as parasitemias diárias em todos os animais examinando as parasitemias com giemsa. As parasitemias foram classificadas como negativas unicamente após contagem de 400 campos de esfregaços. As parasitemias são expressas em percentagem de hemácias parasitadas. 30

As Figures 6A-6G são ilustrativas dos resultados obtidos. Em cada uma delas aparecem as parasitemias (expressas em percentagens de hemácias parasitadas sobre o eixo das ordenadas à escala logarítmica) observadas nos animais experimentais em função dos tempos após a infecção (em dias sobre os eixos das abcissas).

Os resultados dizem respeito a: - na Figura 6A ; animais de controlo não vacinados; - a Figura 6B refere-se a animais que tinham recebido uma solução salina contendo além disso o adjuvante de Freund; - a Figura 6C é uma sobreposição das figuras 6A e 6B, com o objectivo de fazer aparecer os resultados relativos derivados da administração do adjuvante de Freund aos animais (como é evidente, as variações não são significativas); - a Figura 6D fornece os resultados obtidos na sequência de uma vacinação com a p42; - a Figura 6E diz respeito a animais vacinados unicamente com a pl9; - finalmente, a Figura 6F refere-se aos animais vacinados com uma mistura de pl9 e p42.

Sem dúvida que a p42 induz um certo nível de protecção. Mas como demonstram as figuras 6E e 6F, a protecção conferida pela pl9 recombinante de acordo com a invenção melhorou consideravelmente.

Pode formular-se a hipótese de que o melhoramento da protecção resulta de uma clivagem secundária da p42 que é acompanhada pela revelação de cisteína livre que forma, subsequentemente, pontes dissulfureto intermoleculares dando origem a multímeros 31 do pl9 muito característicos desta forma nas proteínas recombinantes das três espécies testadas.

Os números utilizados para elaborar os gráficos (6A-6F) são apresentados com mais exactidão na Figura 6G.

Ensaio de vacinação P.cynomolgi/macaco toque; segunda infecção experimental em macacos vacinados unicamente com pl9 e controlos (Figuras 8)

Seis meses mais tarde, sem outra imunização, os 3 macacos que receberam unicamente a MSP-1 pl9 com FCA/FIA (Figura 6E) e os 3 macacos que receberam uma solução salina contendo o adjuvante de Freund (Figura 6B) bem como 2 novos macacos «naifs» não vacinados sofreram uma nova infecção experimental por injecção de 1.106 hemácias infectadas com Plasmodium cynomolgi. Avaliou-se a protecção determinando as parasitemias diárias em todos os animais examinando os esfregaços com giemsa. As parasitemias foram classificadas como negativas unicamente após contagem de 400 campos de esfregaços. As parasitemias são expressas em percentagem de hemácias parasitadas (os números utilizados para elaborar os gráficos 8A-C são apresentados com mais exactidão na Figura 8D) . Os seis animais imunizados que tinham sofrido uma infecção experimental seis meses antes não tinham parasitemia detectável excepto para 1 animal em cada grupo que apresentou uma parasitemia de 0.008% durante 1 dia (Figuras 8A e 8B). Os dois controlos «naifs» revelam uma parasitemia clássica com um máximo de 0.8% e durante 21 dias (Figura 8C) . Por conseguinte, os 3 animais vacinados com o MSP-1 pl9 ficaram também protegidos seis meses mais tarde do que os 3 controlos que apresentavam uma infecção completa clássica depois da primeira infecção experimental, apesar de uma ausência ou de 32 uma muito fraca parasitemia após a primeira infecção experimental. Estes resultados sugerem que a duração de protecção do pl9 é pelo menos de seis meses.

Ensaio de vacinação com pl9 em associação com alúmen no sistema P.cynomolgi/macaco toque (Figuras 9)

Os resultados positivos de protecção precedentes foram obtidos utilizando o adjuvante completo (FCA) ou incompleto (FIA) de Freund. Todavia, o único adjuvante actualmente admitido no homem é o alúmen. Por esta razão, fizemos um ensaio de vacinação com o MSP-1 pl9 de P. cynomolgi no macaco toque em presença de alúmen como adjuvante.Seis macacos capturados foram utilizados da seguinte maneira: (1) 3 animais injectados com 4 doses de 50 mg MSP-1 pl9 recombinante de P. cynomolgi com 20 mg de alúmen (2) 3 animais injectados 4 vezes com soro fisiológico e 10 mg de alúmen. As injecções foram feitas por via intramuscular com 4 semanas de intervalo. A infecção experimental foi feita injectando 2.105 hemácias infectadas com P. cynomolgi 4 semanas depois da última injecção. Avaliou-se a protecção determinando as parasitemias diárias em todos os animais examinando os esfregaços com o giemsa. As parasitemias só foram classificadas como negativas após contagem de 400 campos de esfregaços. As parasitemias são expressas em percentagem de hemácias parasitadas. Os resultados desta experiência são os seguintes: 2 dos 3 macacos imunizados com o pl9 recombinante em alúmen tinham cerca de 30 vezes menos de parasitemia total durante o periodo da infecção (Figuras 9A e 9B) do que os 3 macacos de controlo imunizados com o soro fisiológico e o alúmen (Figura 9D) após a infecção experimental. O terceiro macaco imunizado com pl9 (Figura 9C) não era muito diferente dos controlos. Para o ensaio de 33 vacinação de Plasmodium cynomolgí pl9 no macaco toque, Macaca sinica, descrito na Figura 9, os números utilizados para elaborar os gráficos (9A-9D) são especificados (Figure 9E) . Embora estes resultados sejam um pouco menos espectaculares do que os precedentes (Figuras 6, 8), é a primeira vez que se observa uma protecção significativa para MSP-1 recombinante em alúmen.

Figura 10: Ensaio de vacinação com uma pl9 recombinante de Plasmodium falciparum no macaco esquilo. Vinte macacos Saimlrl sciureus guyanensis (macaco-esquilo) de cerca de 3 anos criados em cativeiro foram utilizados da seguinte maneira: (1) 4 animais injectados com 50 mg de Pf MSP-1 pl9 solúvel em presença de adjuvante de Freund da seguinte maneira: Ia injecção: : 1:1 FCA/FIA; 2a injecção: 1:4 FCA/FIA; 3a injecção: FIA Em seguida estas composições de adjuvante foram misturadas com o antigénio em PBS 1:1. (2) 2 animais de controlo recebiam o adjuvante de Freund como foi descrito para (1) unicamente com PBS; (3) 4 animais injectados com 50 mg de Pf MSP-1 pl9 solúvel em presença de 10 mg de alúmen (Alu-Gel-S, Serva); (4) 2 animais de controlo recebiam 10 mg de alúmen unicamente com PBS; (5) 4 animais injectados com cerca de 50-100 mg Pf MSP-1 pl9 ancorado GPI reconstituídos em lipossomas da seguinte maneira: 300 mmoles de colesterol e 300 mmoles de fosfatidilcolina eram secos sob o vácuo e colocados novamente em suspensão em 330 mM N-octilglicosídeo em PBS com 1.4 mg de Pf MSP-1 pl9,GPI. Esta solução tinha sido dialisada contra PBS com Bio-Beads SM-2 adsorvente (Bio-Rad) e os lipossomas assim formados eram concentrados por centrifugação e colocados novamente em suspensão em PBS. A Ia injecção era feita com lipossomas frescos mantidos a 4°C e as 2a e 3a injecções eram feitas com lipossomas que tinham sido congelados para 34 conservação; (6) 2 animais injectados com lipossomas de controlo feitos da mesma maneira na ausência do antigénio pl9, GPI, como descrito para (5); (7) 2 animais injectados com soro fisiológico. Ministraram-se três injecções por via intramuscular com 4 semanas de intervalo. A infecção experimental era feita injectando 1.106 hemácias infectadas com Plasmodium falciparum. Avaliou-se a protecção determinando as parasitemias diárias em todos os animais examinando os esfregaços com giemsa. As parasitemias são expressas em percentagem de hemácias parasitadas. Os resultados deste ensaio de vacinação são mostrados nas Figuras 10, A-G.

Os grupos imunizados com o pl9 em adjuvante de Freund ou em lipossoma demonstraram parasitemias semelhantes aos grupos de controlo depois de uma infecção experimental (um animal (número 29) vacinado com pl9 em adjuvante de Freund morreu alguns dias depois da infecção experimental por razões independentes da vacinação (ataque cardíaco)). Irregularidades na administração do antigénio nestes 2 grupos (má emulsão de Freund, lipossomas congelados) não permitem avaliar de forma completa o significado destes resultados. No grupo alúmen 2 animais revelaram parasitemias totais durante a infecção cerca de 4 vezes menos importantes do que os controlos, 1 animal cerca de 3 vezes menos importante e 1 animal era semelhante aos controlos. Esta experiência é um pouco difícil de interpretar devido à variabilidade nos controlos, provavelmente devida à estirpe de parasita utilizada para a infecção experimental que não teria sido suficientemente adaptada ao modelo Saimiri não esplenectomizado criado recentemente na Caiena. No entanto, o efeito real, embora imperfeito, com o alúmen é encorajador na medida em que os nossos antigénios parecem ser as únicas 35 versões recombinantes MSP-1 de P. falciparum que, de momento, demonstraram uma certa eficácia em associação com o alúmen.

Ensaio de vacinação com uma pl9 recombinante de Plasmodium falciparum no macaco esquilo (mesmo ensaio que nas Figuras 10)

Macacos criados em cativeiro foram injectados com 1 ml de inoculo por via intramuscular 2 vezes com 4 semanas de intervalo da seguinte maneira: (1) 4 animais injectados com 50 yg de PfMSPlpl9 solúvel em presença de adjuvante de Freund da seguinte maneira: Ia injecção 1:1 FCA/FIA; 2a injecção 1:4 FCA/FIA; e subsequentemente misturados 1:1 com o antigénio em PBS; (2) 4 animais injectados com 50 yg de PfMSPlpl9 solúvel em presença de 10 mg de alúmen; (3) 4 animais injectados com cerca de 50 yg de PfMSPlpl9 ancorado GPI reconstituídos em lipossomas compostos 1:1 em molaridade de colesterol e fosfatidilcolina. Os animais foram sangrados 17 dias após a segunda injecção.

Os glóbulos vermelhos provenientes de um macaco esquilo com 30% de parasitemia devida a P. falciparum (com formas maduras na sua maioria) foram lavados em PBS e o sedimento foi diluído 8 vezes em presença de 2% SDS e 2% ditiotreitol e aquecido a 95° antes de ser carregado sobre um gel de poliacrilamida de 7.5% (gel de separação) e 4% (gel de stacking) (parte de cima do gel). Após transferência para nitrocelulose a análise por «immunoblot» (imuno-impressão)foi feita com anti-soros da seguinte maneira: (1) «pool» de anti-soros dos 4 macacos vacinados com PfMSPlpl9 solúvel em adjuvante de Freund diluído 1:20; (2) «pool» de anti-soros dos 4 macacos vacinados com PfMSPlpl9 solúvel em adjuvante alúmen diluído 1:20; (3) «pool» de anti-soro dos 4 macacos vacinados com PfMSPlpl9 ancorado em lipossomas diluído 1:20; (4) o anticorpo monoclonal, que reage 36 com um epítopo linear de PfMSPlpl9, a 50 yg/ml; (5) «pool» de anti-soros SHI90 proveniente de duas dezenas de macacos infectados repetidamente por P. falciparum e que se tornaram refractários a qualquer infecção ulterior de P. falciparum, diluído a cinco por cento; (6) «pool» de anti-soros dos macacos «naifs» (que nunca foram expostos a P. falciparum) diluído 1:20.

Os resultados mostram que os 3 «pools» de anti-soros dos macacos vacinados com o PfMSPlpl9 reagem de forma importante e específica com complexos de peso molecular muito elevado (que se encontra de forma difusa no gel de stacking) e presentes em extractos de parasita contendo mais formas maduras. Estes resultados confirmam a hipótese da presença de uma agregação específica do MSPlpl9 in vivo comportando epítopos que se reproduziram nas moléculas recombinantes PfMSPlpl9 sintetizadas no sistema baculovírus, em particular as que se apresentam em forma de oligómero. A Figura 7 ilustra igualmente estes resultados. Ela refere-se às imuno-impressões produzidas sobre gel. As três primeiras colunas de gel ilustram a resposta in vivo de macacos a injecções de pl9 [(1) com o adjuvante de Freund, (2) com alúmen, (3) sob a forma de lipossoma] e nomeadamente a existência de complexos de elevado peso molecular confirmando a hipótese da agregação in vivo de pl9 sob a forma de oligómero, específica do estádio de maturação (quando p42 é cortado em pl9 e p33).

Este ensaio de vacinação compreende igualmente uma terceira injecção idêntica às precedentes. A injecção com o adjuvante de Freund compreende unicamente FIA. 37 Há dois animais de controlo para cada grupo, a saber: 2 animais de controlo injectados com PBS e adjuvante de Freund; 2 animais de controlo injectados com PBS e alúmen; 2 animais de controlo injectados com lipossomas sem proteina; e dois animais injectados com PBS sem adjuvante. A protecção é avaliada como descrito acima.

Figura 7B: Os dados para esta figura derivaram do ensaio de vacinação de P. falciparum / macaco esquilo (Figura 10 abaixo). Os números correspondem aos macacos individuais assinalados na Figura 10. As técnicas e métodos para esta figura são os mesmos que para a Figura 7 à excepção do facto de o anti-soro individual de cada macaco assinalado ter sido testado após três injecções no dia da infecção experimental e o anti-soro SHI ter sido diluido 1:250. Os resultados mostram que o anti-soro dos 4 macacos vacinados com p pl9 e alúmen reagem de uma forma importante e especifica com complexos de peso molecular muito elevado enquanto os macacos dos outros grupos vacinados com o pl9 e o adjuvante de Freund ou lipossomas só revelam uma fraca reactividade com estes complexos. Uma vez que os macacos vacinados com pl9 e alúmen também foram os que ficaram mais bem protegidos, esta reactividade com os complexos de elevado peso molecular parece indicar um efeito protector, e isto apesar de um macaco no grupo de alúmen não estar protegido em relação aos de controlo e de um outro só o estar parcialmente. A invenção diz naturalmente respeito a outras aplicações, por exemplo as expostas abaixo em relação com determinados exemplos, os quais não apresentam nenhum carácter limitativo. 38

Terapêutica A molécula recombinante PfMSPlpl9 pode ser utilizada para produzir anticorpos específicos eventualmente utilizáveis por transferência passiva com um desígnio terapêutico adaptado ao paludismo severo devido a P. falciparum com risco de mortalidade.

Diagnóstico

As moléculas recombinantes PvMSPl p42 e PvMSPlpl9 e PfMSPlpl9 derivadas de baculovírus podem ser e foram utilizadas para produzir anticorpos monoclonais específicos murinos. Estes anticorpos, em associação com anti-soros policlonais anti MSPlpl9 provenientes de uma outra espécie como o coelho ou a cabra, podem estar na base de um teste de diagnóstico semi-quantitativo para o paludismo e capaz de distinguir entre um paludismo devido à P. falciparum, que pode ser mortal, e um paludismo devido à P. vivax, que em geral não é mortal. 0 princípio deste teste seria armadilhar e quantificar qualquer molécula de MSP1 que contivesse a parte pl9 no sangue.

Neste quadro, as vantagens da molécula MSPlpl9 são as seguintes: (i) ela é ao mesmo tempo extremamente bem conservada no seio de uma mesma espécie e suficientemente divergente entre espécies diferentes para permitir produzir facilmente reactivos específicos de espécie. Não se observou nenhuma reacção cruzada entre os anticorpos derivados de PfMSPlpl9 e PvMSPlpl9: 39 (ii) a função do MSPlpl9, embora não sendo conhecida com exactidão, parece ser suficientemente importante para que esta molécula não varie de forma significativa ou seja deletada sem efeito letal para o parasita; (iii) é um antigénio major que se encontra em todos os merozoitos e, por conseguinte, deve ser, em principio, detectável mesmo com baixa parasitemia e proporcionalmente à parasitemia; (iv) uma vez que as moléculas recombinantes de MSPlpl9 derivadas de baculovírus parecem reproduzir mais a estrutura nativa de MSPlpl9, os anticorpos produzidos contra estas proteínas seriam bem adaptados a uma utilização diagnóstica.

Os microrganismos abaixo identificados foram registados de acordo com a regra 6.1. do Tratado de Budapeste na data de 1 de Fevereiro de 1996, sob os números seguintes: Números de registo I - 1659 I - 1660 I - 1661 I - 1662 I - 1663

Referências de identificação PvMSPlpl9A PvMSPlpl9S PfMSPlpl9A PfMSPlpl9S PcMSPlpl9S A presente divulgação refere-se igualmente à utilização destes anticorpos, então de preferência previamente fixados sobre um suporte sólido (por exemplo para cromatografia de afinidade), para a purificação de péptidos do tipo pl9 inicialmente contidos numa mistura. 40 A purificação faz então intervir um contacto desta mistura com o anticorpo, a dissociação do complexo antigénio-anticorpo e a recuperação do péptido de tipo pl9 purificado. A presente divulgação diz respeito igualmente às composições de vacina, compreendendo também misturas de proteínas ou de fragmentos, nomeadamente misturas do tipo: pl9 de P. falciparum e pl9 de P.vivax, pl9 de P. falciparum e p42 de P.falciparum, sendo esta no caso presente desprovida das suas regiões mais hipervariáveis, pl9 de P. vivax e p42 de P.vivax, sendo esta no caso presente desprovida das suas regiões mais hipervariáveis, pl9 de P. falciparum e p42 de P.falciparum, sendo esta no caso presente desprovida das suas regiões mais hipervariáveis, e_ pl9 de P.vivax e p42 de P.vivax, sendo esta no caso presente desprovida das suas regiões mais hipervariáveis.

Entendemos no caso presente definir as regiões mais hipervariáveis como a região II ou a região II e a região III

em parte ou na sua totalidade, sendo a parte da região III preferencialmente deletada a que está justaposta à região II (situando-se a parte conservada do lado C-terminal da p33, próxima da pl9). As regiões II e III são ilustradas na figura 4 . A presente divulgação não está limitada à produção de vacina humana. Ela aplica-se tanto à produção de composições de vacina veterinária utilizando as proteínas ou antigénios correspondentes derivados de parasitas infecciosos para mamíferos e produzidos nas mesmas condições. Com efeito, sabe-se que infecções do mesmo tipo da babesiose aparecem 41 também nos bovinos, nos canídeos e nos equídeos. Um dos antigénios das espécies Babesia apresenta uma forte homologia conformacional (nomeadamente os dois domínios «EFG-like» e riqueza em cisteína)e funcional com uma parte proteica de MSP-1 [ (36), (37) e (38)] .

Foram descritos exemplos de vacinas veterinárias utilizando um antigénio solúvel contra tais parasitas (39).

Desnecessário será dizer que as pl9 utilizadas nestas misturas podem igualmente dar lugar a todas as modificações que anteriormente referimos, quando ela era tomada em consideração de forma isolada.

REFERÊNCIAS (D Holder, J.A. et ai. (1982) «Biosynthesis and processing of a Plasmodium falciparum schizont antigen recognized by immune serum and a monoclonal antibody». J. Exp. Med. 156 : 1528-1538 . (2) Howard, R. et ai. (1984) «Localization of the major

Plasmodium falciparum glycoprotein on the surface of mature intracellular trophozoites and schizonts». Mol. Biochem. Parasitol. 11 : 349-362. (3) Pirson, P. et ai. (1985) «Characterization with monoclonal antibodies of a surface antigen of Plasmodium falciparum merozoites », J. Immunol. 134 : 1946-1951. (4) Aley, S.B. et ai. (1987) «Plasmodium vivax:

Exoerythrocytic schizonts recognized by monoclonal antibodies against blood-stage schizonts». Exp. Parasitol. 64 : 188-194. 42 (5) Holder, A.A. (1988) «The precursor to major merozoite surface antigen: structure and role in immunity». Prog. Allergy 41 : 72-97. (6) Cooper, J.A. (1993) «Merozoite surface antigen-1 of Plasmodium». Parasitol. Today 9 : 50-54. (7) Holder, A.A., et al. (1987) «Processing of the precursor to the major merozoite antigens of Plasmodium falciparum » Parasitology 94 : 199-208. (8) Lyon, J.A. et al. (1986) «Epitope map and processing scheme for the 195 000-dalton surface glycoprotein of Plasmodium falciparum merozoites deduced from cloned overlapping segments of the gene». Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 : 2989-2993. (9) Blackman, M.J. et ai. (1992) «Secondary processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 (MSPl) by calcium-dependent membrane-bound serine protease: shedding of MSP133 as a noncovalently associated complex with other fragments of the MSOP1 ». Mol. Biochem. Parasitol. 50 : 307— 316 . (10) Haldar, K., et ai. (1985) «Acylation of a Plasmodium falciparum merozoite surface antigen via sn-1,2-diacyl glycerol.». J. Biol. Chem. 260 : 4969-4974. (11) Braun Breton, C. et al. (1990) «Glycolipid anchorage of Plasmodium falciparum surface antigens». Res. Immunol. 141 : 743-755. (12) Kumar, S. et al. (1995) «Immunogenicity and in vivo Efficacy of Recombinant Plasmodium falciparum Merozoite surface protein-1 in Aotus Monkeys». Molecular Medicine, Vol. 1, 3 : 325-332. (14) Longacre, S. et al. (1994) «Plasmodium vivax merozoite surface protein 1 C-terminal recombinant proteins in baculovirus». Mol. Biochem. Parasitol. 64 : 191-205. 43 (15) McBride, J.S. et al. (1987) «Fragments of the polymorphic Mr 185 000 glycoprotein from the surface of isolated Plasmodium falciparum merozoites form an antigenic complex». Mol. Biochem. Parasitol. 23 : 71-84. (16) Blackman, M.J. et al. (1990) «A single fragment of a malaria merozoite surface protein remains on the parasite during red cell invasion and is the target of invasion-inhibiting antibodies». J. Exp. Med. 172 : 379-382. (17) Kaslow, D.C. et al. (1994) «Expression and antigenicity of Plasmodium falciparum major merozoite surface protein (MSP119) variants secreted from Saccharomyces cerevisiae». Mol. biochem. Parasitol. 63 ; 283-289. (18) Chang, S.P., et al. (1992) «A carboxyl-terminal fragment of Plasmodium falciparum gpl95 expressed by a recombinant baculovirus induces antibodies that completely inhibit parasita growth ». J. Immunol. 149 : 548-555 (19) Longacre, S. (1995) «The Plasmodium cynomolgi merozoite surface protein 1 C-terminal sequence and its homologies with other Plasmodium species». Mol. Biochem. Parasitol. 74 :_105-111. (20) Del Portillo, H.A., et al. (1990) «Primary structure of the merozoite surface antigen 1 of Plasmodium vivax reveals sequences conserved between different Plasmodium species». Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 : 4030-4034. (21) Gibson, H.L., et al. (1992) « Structure and expression of the gene for Pv200, a major blood-stage surface antigen of Plasmodium vivax». Mol. biochem. Parasitol. 50 : 325-334. (22) Dissanaike, A.S., et al. (1965) «Two new malaria parasitas, Plasmodium cynomolgi ceylonensis sub sp. nov. and Plasmodium fragile sp. nov. from monkeys in Ceylon ». Ceylon Journal of Medicai Science 14 : 1-9. 44 (23) Cochrane, A.H., et al. (1986) «Further studies on the antigenic diversity of the circumsporozoite proteins of the Plasmodium cynomolgi complex.». Am. J. Trop. Med. Hyg. 35 : 479-487. (24) Naotunne, T. de S., et al. (1990) «Plasmodium cynomolgi: serum-mediated blocking and enhancement of infectivity to mosquitos during infections in the natural host, Macaca sinica». Exp. Parasitol. 71, 305-313. 25) Ihalamulla, R.L. et al. (1987) «Plasmodium vivax: isolation of mature asexual stages and gametocytes from infected human blood by colloidal silica (Percoll) gradient centrifugation». Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 81 : 25-28. (26) Kimura, E., et al. (1990) «Genetic diversity in the major merozoite surface antigen of Plasmodium falciparum: high prevalence of a third polymorphic form detected in strains derived in strains derived from malaria patients». Gene 91 : 57-62. (27) Heidrich, H.-G., et al. (1989) «The N-terminal amino acid sequences of the Plasmodium falciparum (FCBI) merozoite surface antigen of 42 and 36 kilodalton, both derived from the 185-195 kilodalton precursor ». Mol. Biochem. Parasitol. 34 : 147-154. (28) Blackman, M.J., et al. (1991) «Proteolytic Processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 produces a membrane-bound fragment containing two epidermal growth factor-like domains». Mol. Biochem. Parasitol. 49 : 29-34. (29) Adams, J.M. et al. (1992) «A family of erythrocyte binding proteins of malaria parasitas». Proc. Natl. Acad. Sei, 89:7085-7089. 45 (30) Sim B.K.L. (1995) «EBA-175: An erythrocyte-binding ligand of Plasmodium falciparum». Parasitology Today, vol. II, n°6:213-217. (31) Sim B.K.L. (1994) «Receptor and ligand domains for invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum». Science, 264:1941-1944. (32) Davies, A. et ai. (1993), Biochem J. 295 (Pt3): 889-896. «Expression of the glycosylphosphatidylinositol-linked complement-inhibiting protein CD59 antigen in insect cells using a baculovirus vector». (33) Haziot A. et ai., (1994) J. Immunol. 152:5868. «Recombinant soluble CD14 Inhibits LPS-Induced Tumor Necrosis Factor & Production by Cells in Whole Blood». 34) Chang, S.P. et ai. (1988) «Plasmodium falciparum : gene structure and hydropathy profile of the major merozoite surface antigen (gpl95) of the Uganda-Palo Alto isolate. Exp. Parasitol. 67 : 1-11. (35) Holder, A.S. et ai. (1985) «Primary structure of the precursor to the three major surface antigens of Plasmodium falciparum merozoites, Nature 317 : 270-273. 36) G. Bourdoiseau et ai. (Maio de 1995) « Les babésioses bovines», Le point vétérinaire, vol. 27, n°168. (37) P. Bourdeau et ai. (Maio de 1995) «La babésiose canine à Babesia canis», Le point vétérinaire, vol.27, n°168. (38) C. Soulé (mai 1995) «Les babésioses équines», Le point vétérinaire, vol.27, n°168 (39) T.P.M. Schetters et ai. (1995) «Vacinaes against Babesiosis using Soluble Parasita Antigens», Parasitology Today, vol.11, n°12. (40) P.A. Burghaus et ai. (1996) «Immunization of Aotus nancymai with Recombinant C Terminus of Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein 1 in Liposomes and Alun Adjuvant 46

Does Not Induce Protection against a Challenge Infection», Infection and Immunity, 64:3614-3619. (41) S.P. Chang, et al. (1996) «A Recombinant Baculovirus 42-Kilodaiton C-Terminal Fragment of Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein 1 Protects Aotus Monkeys against Malaria», Infection and Immunity, 64: 253-261. (42) L.H. Miller et al. (1997) «The Need for Assays Predictive of Protection in Development of Malaria Bloodstage Vacinaes», Parasitology Today, vol.13, n°2:46-47. A invenção diz respeito igualmente aos hibridomas secretores de anticorpos específicos reconhecendo selectivamente a pl9 de uma proteína MSP-1 da forma merozoíto de um parasita do tipo Plasmodium infeccioso para o homem que não o Plasmodium vlvax e não reconhecendo o Plasmodium vivax.

Em particular, estes hibridomas segregam anticorpos monoclonais que não reconhecem a pl9 de Plasmodium vivax e que reconhecem especificamente a pl9 de Plasmodium falciparum. A invenção diz respeito igualmente a um hibridoma caracterizado pelo facto de produzir um anticorpo específico que reconhece especif icamente a pl9 de P.vivax e a pl9 de P.cynomolgi. Um hibridoma F10-3 foi construído a partir do mieloma X63 Ag8 653 produzindo igG 2b/k reconhecendo a glicoproteína p42 de Plasmodium vivax. 15-03-2010 47

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. ADN codificando um fragmento polipeptidico ou uma parte de fragmento polipeptidico, em que este fragmento ou parte está apto a induzir uma resposta imune capaz de inibir uma parasitemia devida a um parasita Plasmodium falciparum, caracterizado pelo facto de o referido ADN conter uma sequência nucleotídica sintética que codifica: - um fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (pl9) da proteína 1 de superfície (MSP—1) da forma merozoito de um Plasmodium falciparum, permanecendo normalmente este fragmento C-terminal ancorado na superfície do parasita no final da sua penetração em eritrócitos humanos, por ocasião de um ciclo infeccioso, ou - uma parte do fragmento pl9 que contém pelo menos uma das duas regiões EGF contidas no fragmento pl9 selvagem da MSP-1 da forma merozoito de um Plasmodium falciparum, tendo, por outro lado, a referida sequência nucleotídica sintética um teor em G e C compreendido entre 40 e 60% da totalidade dos nucléotidos que a constituem.
2. 2. ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência nucleotídica sintética ser desprovida da sequência correspondente à sequência de ancoragem da proteína nativa. 1
3. 3. ADN de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a referida sequência nucleotidica sintética codificar para uma forma solúvel de fragmento pl9 ou parte de fragmento pl9.
4. 4. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de a referida sequência nucleotidica sintética ter um teor em G e C de pelo menos 50% da totalidade dos nucleótidos que a constituem.
5. 5. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de compreender também, a montante da referida sequência nucleotidica sintética, uma sequência nucleotidica que codifica uma sequência polipeptidica contendo menos de 50 resíduos da parte C-terminal do fragmento de 33 kilodaltons (p33) de MPS-1.
6. 6. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de compreender também uma sequência nucleotidica codificando um péptido de sinal, a montante da extremidade 5'-terminal da referida sequência nucleotidica sintética, sendo este péptido de sinal susceptivel de ser reconhecido enquanto sinal num sistema baculovirus.
7. 7. ADN de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido péptido de sinal ser um péptido de sinal de MSP-1 de Plasmodium.
8. 8. ADN de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido péptido de sinal ser um péptido de sinal de MSP-1 de Plasmodium falciparum. 2
9. 9. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 7, caracterizado pelo facto de: a referida sequência nucleotidica sintética codificar um fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (pl9) da proteina 1 de superfície (MSP-1) da forma merozoito de um Plasmodium falciparum de Asnl613 a Serl705, e de, a montante da extremidade 5'-terminal desta sequência nucleotidica sintética, o ADN compreender: - os 8 pares de bases da sequência lider da proteína 1 de superfície de Plasmodium vivax, e - uma sequência codificando os trinta e dois aminoácidos da proteína 1 de superfície de Plasmodium vivax de Meti a Asp32, e de, a jusante da extremidade 3'-terminal desta sequência nucleotidica sintética, o ADN compreender dois codões stop TAA.
10. 10. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 6, 7, caracterizado pelo facto de: a referida sequência nucleotidica sintética codificar um fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (pl9) da proteína 1 de superfície (MSP-1) da forma merozoito de um Plasmodium falciparum de Asnl613 a Ilel726, e de, a montante da extremidade 5'-terminal desta sequência nucleotidica sintética, o ADN compreender: - os 8 pares de bases da sequência líder da proteína 1 de superfície de Plasmodium vivax, e 3 - uma sequência codificando os trinta e dois aminoácidos da proteína 1 de superfície de Plasmodium vivax de Meti a Asp32, e de, a jusante da extremidade 3'-terminal desta sequência nucleotídica sintética, o ADN compreender dois codões stop TAA.
11. 11. Vector baculovírus recombinante contendo, sob o controlo de um promotor contido neste vector e susceptível de ser reconhecido por células transfectáveis para este vector: - um ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, e uma sequência nucleotídica codificando um péptido de sinal, a montante da extremidade 5'-terminal deste ADN, sendo este péptido de sinal susceptível de ser reconhecido enquanto sinal num sistema baculovírus, ou - um ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 10.
12. 12. Vector baculovírus de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser escolhido entre o vírus registado na CNCM com o número 1-1661 e o vírus registado na CNCM com o número 1-1662.
13. 13. Célula de insecto transfectada por um vector baculovírus de acordo com as reivindicações 11 ou 12.
14. 14. Fragmento polipeptídico, ou parte de fragmento polipeptídico, em que este fragmento ou parte está apto a induzir uma resposta imune capaz de inibir uma parasitemia devida a um parasita Plasmodium falciparum, caracterizado 4 pelo facto de o referido fragmento ou parte de fragmento ser susceptível de ser: - expresso por um vector baculovírus de acordo com as reivindicações 11 ou 12, ou - produzido por uma célula de acordo com a reivindicação 13, e de o referido fragmento ou parte de fragmento - comportar épitopos conformacionais instáveis em meio redutor e constituindo a maioria dos épitopos reconhecidos por anti-soros humanos formados contra o Plasmodium falciparum, e - ser reconhecido por anti-soros humanos formados contra o Plasmodium falciparum quando está no estado não reduzido ou num estado reduzido não irreversível, mas não reconhecido ou pouco reconhecido por estes mesmos anti-soros, quando está irreversivelmente reduzido.
15. 15. Oligómero de fragmentos polipeptídicos ou de partes de fragmentos polipeptídicos de acordo com a reivindicação 14.
16. 16. Proteína contendo um fragmento polipeptídico ou parte de fragmento polipeptídico de acordo com a reivindicação 14.
17. 17. Composição adaptada à vacinação contra um parasita Plasmodium falciparum, caracterizada pelo facto de compreender: - um fragmento polipeptídico ou parte de fragmento polipeptídico de acordo com a reivindicação 14, ou um 5 oligómero de acordo com a reivindicação 15, ou uma proteína de acordo com a reivindicação 16.
18. 18. Processo para a produção de um fragmento polipeptídico ou de uma parte de fragmento polipeptídico, em que este fragmento ou esta parte estão aptos a induzir uma resposta imune capaz de inibir uma parasitemia devida a um parasita Plâsmodium falciparum, caracterizado por compreender o facto de: inserir um ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10 num vector baculovírus, de modo a que este vector possa expressar o fragmento polipeptídico codificado para este ADN, transfectar uma célula de insecto por este vector, recolher o fragmento polipeptídico ou parte de fragmento polipeptídico produzido por esta célula. 15-03-2010 6