CN1372568A

CN1372568A - 疫苗

Info

Publication number: CN1372568A
Application number: CN00809259A
Authority: CN
Inventors: A·霍尔德; B·比德萨尔; J·菲尼; W·莫甘; S·赛德; C·乌特海皮布尔
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1999-04-20
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2002-10-02
Also published as: WO2000063245A2; BR0009823A; WO2000063245A3; AU779662B2; MXPA01010701A; JP2002543774A; WO2000063245A9; EP1180120A2; AU4133000A

Abstract

提供了用于抗疟疾疫苗中的疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP－1)C－末端片段的非天然变体,该变体具有:(1)与天然的疟原虫MSP－1₁₉相比,具有降低的至少对第一种抗体的亲和性,第一种抗体能阻断第二种抗体的结合,而第二种抗体是抑制疟原虫MSP－1₄₂的蛋白酶解裂解的,以及(2)与该天然的疟原虫MSP－1₁₉相比,对至少一种第三种抗体基本上具有相同的亲和性,第三种抗体能抑制MSP－1₄₂蛋白酶解的裂解作用。

Description

疫苗

发明领域

本发明涉及到修饰了的疟原虫MSP-1蛋白变体以及他们在生产抗疟疾疫苗中的应用。本发明也涉及到合理设计适当变体的方法。

发明背景

疟疾是一种毁灭性的疾病，它能在许多地区引起广泛的发病和死亡，而这种疾病是是通过疟蚊来传播的。在疟疾的高传播区，幼儿和未免疫的游客最容易感染这种由疟原虫属原生动物引起的疾病的危险。在疟疾的低传播区或不稳定传播区，疟疾的流行困扰着各个年龄段的人。最危险的疟疾疾病形式可引起更多的发病了和绝大多数的死亡，这种形式的疟疾是由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的。据估计，每年有20亿人遭受疟疾的危险，有20到30亿病例和100万到200万人死亡。

这种寄生虫在他们的人和蚊子宿主中具有复杂的生活周期。在人体中，生活周期的阶段决定了发生在血液的疾病的临床症状。在这一时间，寄生虫主要是藏在宿主的红细胞中。在这里寄生虫开始生长和繁殖。例如，在红细胞中，在48小时的周期内，每一个恶性疟原虫分裂数次后产生了大约20个新的个体。这时红细胞破裂，寄生虫(在这个阶段称作裂殖子)释放到血液中。为了生存和进一步的继续在血液中的复制循环，裂殖子必须进入新的红细胞中。如果寄生虫不能进入红细胞，那么他们就不能存活太久，很快被破坏掉。疟疾的症状如发热与周期性的裂殖子释放及其重新侵入红细胞有关联。

因而急切需要能够抵抗疟疾的疫苗，但目前又没有有效的疫苗。此外，人们认为通过喷洒有残留的杀虫剂来控制蚊子已经是或者是没有效力，或者是不能接受，并且令人很担忧的是这些寄生虫抗药性的扩散。抗药性迅速扩散令人担忧，是因为在世界的许多地方，许多化合物如那些廉价而又曾经有效力的氯喹变的不再有效，如果有的话，也已经很少有既便宜又有效的新药物了。而抵抗微生物的疫苗虽然成本很低，但却是保护人们免受感染性疾病的一种有效方法。

由于这些寄生虫有复杂的寄生生活周期，因而它在人体内的许多生长时间点就可以成为保护性免疫反应的靶。我们知道，随着年龄增长和对这种疾病接触的增加，人们就会对疟疾具有免疫，这表明保护性免疫反应是随着时间进一步提高的。广义的讲，有三种疫苗策略：针对红血球前阶段，无性血液阶段，有性阶段。红血球前阶段是孢子体，这是在肝脏寄生的的起始发育阶段，这些孢子体是通过吸完血后的感染蚊子注射进入的。无性血液阶段是指孢子体感染红细胞，以及裂殖子从红细胞中释放，它是以循环方式进行的，这个阶段主要与临床症状有关。在蚊子从血液中摄取了配子进入其肠道之后就进入了有性阶段，这一步开始感染了昆虫来完成一个循环；抗有性阶段的疫苗不能保护个体，但能减少传播，从而降低疟疾在特定人群中的发病。

在血液中的无性阶段中，这些寄生虫只是短暂的直接暴露于人体免疫体系中，尤其是直接暴露于随着血液循环流动的抗体中：也即当裂殖子通过破裂一个细胞释放出来之后和进入另外一个细胞之前的这段时间。如果有特异的抗体能结合到这些寄生虫的表面，然后这些抗体就有可能干扰这些寄生虫侵入另一新的红细胞的能力。实际上，已经证明，几种能识别这些寄生虫表面蛋白的单个抗原决定簇的单克隆抗体能够抑制这些寄生虫，预防它们在红细胞中的复制循环。

在裂殖子的表面有一种鉴定的最充分的蛋白叫做裂殖子表面蛋白1(MSP-1)。MSP-1是一种大蛋白，它的大小和氨基酸序列在不同的寄生虫系中不同。它是由细胞内寄生虫以分子量大约为200kDa的前体分子形式而合成的，定位在寄生虫的体表。在裂殖子从红细胞中释放和重新侵入红血球中的过程中，这种蛋白遭受了至少两种蛋白水解修饰作用。第一种修饰可以叫做初级加工，前体被裂解为分子量分别为大约83、30、38和42kDa的四个片段。这四个片段仍然在裂殖子表面作为一个复合体一起存在。这个复合体也含有另外两种起源于其他基因的、分子量为22kDa和36kDa的蛋白。这个复合体是通过不同亚单位间的非共价相互作用来维持的。通过糖基磷脂酰肌醇锚定结合到分子量为42kDa的蛋白的C-末端，进而插入裂殖子的质膜中，这种方式使它固着到裂殖子的表面。当裂殖子侵入红血球时，C-末端42KDa片段是由叫做次级加工的第二次蛋白水解裂解来裂解的。次级裂解的结果是除了C-末端亚片段外的整个复合体从裂殖子的表面脱落，而C-末端亚片段仅仅由不到100个氨基酸组成，并且它在裂殖子的表面被带入了新侵入的红血球。

基于序列相似性，已经有人提出这个C-末端小片段(称作MSP-1₁₉)是由两种表皮生长因子(EGF)样结构域组成的(见图1的序列)(Blackman et al.，1991)。一种EGF样基序由一个含有45-50个氨基酸、并且含有一个特殊的二硫键结构的序列组成，这些结构域经常在动物细胞外模块蛋白中出现。在MSP-1的C-末端片段中，每一个基序含有用于形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基，并且每一个基序都含有与EGF共有序列部分匹配的序列(见图1)。然而，由于相似程度是有限的，并且二硫键结构也是未知的，所以设计含有EGF样结构的MSP-1的C-末端片段一直是一种设想。其他相关的多种可能的EGF样蛋白也在疟原虫蛋白中出现，但以前的结构确定局限于对那些从后生动物中得到的这种结构的研究(Campbell et al.，1998)。

许多研究暗示MSP-1是保护性免疫反应的靶。虽然我们所做工作的目标是寻找一种可用于人类的疟疾疫苗。出于必要性考虑，我们的实验工作多数是在模型动物体系或其体外完成的。这些实验包括对体外特定抗体对寄生虫侵入红血球的作用的研究、在实验室内对啮齿目疟疾模型动物小鼠的被动免疫研究，以及对啮齿目动物疟疾和哺乳动物疟疾的模型动物进行的直接免疫研究，这些免疫研究是利用天然蛋白(源于寄生虫本身)或异源生物体的部分MSP-1基因表达的重组蛋白来进行的。血清流行病学研究表明人抗体对部分MSP-1分子的反应和对临床疾病的防护之间有联系。我门所做工作的很大一部分，但并非全部工作，是集中到对C-末端MSP-1₁₉的免疫反应上的。例如，在体外培养时，许多能识别MSP-1_19D的单克隆抗体能够保护红血球免遭侵袭((Blackman et al..1990)。有趣的是，这些可抑制侵袭的抗体也抑制对42kDa片段的次级加工，这表明这些抗体的工作机制是通过负责次级加工的蛋白酶的空间位阻机制来作用的(Blackmanet al.，1994)。由于次级加工在成功侵袭的过程中完成，因此如果它不能发生就能阻断侵袭。

上面描述的所有工作表明MSP-I，尤其是基于42 kDa或MSP-1₁₉区的C-末端序列是开发疟疾疫苗的优选片段。然而，几项研究也显示抗体在MSP-1₁₉上的抗原决定簇或结合位点要求正确的多肽三级结构，但这些研究也表明那些假定为在MSP-1的半胱氨酸残基间的二硫键在处理的过程中被还原，从而破坏了其三级结构。这种局限性已经通过表达重组蛋白的方式解决了，这些重组蛋白能够以多种方式允许能识别天然寄生虫MSP-1的抗体与其结合。其他的研究人员也已经发现MSP-1的其他部分也具有可用在疫苗之中的潜力，然而MSP-1的C末端片段目前是开发抗血液阶段疟疾寄生虫的疫苗的首选(Diggs et al..1993；Stoute et al.，1998)。

正如上面所述，每隔大约48小时，恶性疟原虫裂殖子就从已经感染的红血球中释放出来，然后重新侵入新的红血球，在此期间，他们是暴露于宿主的免疫体系之中的。因此，问题就产生了，这些寄生虫是怎样进化为能够免遭潜在的致死作用，如中和抗体的作用。在其他的感染性微生物中，很明显在免疫体系和这些微生物之间进行着持续的战斗，这些微生物发展了复杂的机制来逃避免疫反应。例如，抗原变化和抗原多样性就是其中的两种机制，他们可以提供给免疫体系‘一个移动的靶’，这样即使作用某一种微生物变体的免疫反应能够杀死这种变体，仍然可以产生对这种免疫反应具有部分和全部抗性的新变体。对疟疾裂殖子，尤其是对MSP-1来讲，已经有另外一种机制提出，也就是某些抗体(阻断抗体)的结合能防止中和抗体的结合，从而即使在中和抗体存在下也允许寄生虫成功的侵入红细胞(Guevara Patino et al.，1997)。这些阻断蛋白可能有两种类型，一种是可以抗某些抗原决定簇的抗体，而这些抗原决定簇由在一级序列上与那些可作为中和抗体的靶的抗原决定簇较远的氨基酸组成；另外一种是抗与中和抗体的抗原决定簇重叠的抗原决定簇的抗体。这代表了一种新颖的机制，寄生虫可以通过它来逃避有效的免疫反应，与其他基于抗原多态性或抗原多样性的机制不同，这种机制不依赖于氨基序列多样性。

某些能结合到MSP-1₁₉上的单克隆抗体(mAbs)可抑制蛋白水解裂解和对红血球的侵袭，这表明裂解是侵袭的前提(Blackman et al.，1994)。其他可结合到MSP-1的C末端片段上的mAbs不抑制加工和侵袭，但却抑制抑制性中和抗体的结合。其它可结合到MSP-1₁₉上的抗体不抑制也不阻断抑制性中和抗体的结合。在有阻断性中和抗体存在下，抑制性抗体不发挥作用，侵袭可以继续。由免疫作用诱导的抑制性抗体和阻断性抗体之间的平衡是决定免疫反应在防止侵袭中是否发挥作用的关键因素(Guevara Patino et al..1997)。

发明概述

因此本发明的一个目的就是提供基于疟原虫(Plasmodium)MSP-1蛋白变体之上的、可以抗疟疾寄生虫的有效疫苗。在设计这样一种疫苗时，应该满足下列的标准：1.用于疫苗的多肽的氨基酸序列应该含有不仅可作为中和抗体的靶、而且又可诱导中和抗体的抗原决定簇。2.理想的多肽应该不包括仅仅形成阻断性抗体的抗原决定簇的氨基酸序列。3.如果多肽同时含有中和抗体和阻断性抗体的抗原决定簇，那么它应该在不影响中和抗体的前提下，经过修饰来去除阻断性抗体的抗原决定簇。

为了辅助设计，满足这三个标准候选疫苗的多肽，确定MSP-1C-末端片段的三维结构是很重要的，因为这将帮助确定抗体与这个片段作用的位点。因此，我们已经通过NMR技术确定了MSP-1C末端在溶液中的结构，包括二硫键的类型。

在不影响中和抗体的结合的前提下，我们已经对MSP-1₁₉，序列的氨基酸进行了替代，这样可防止单个的阻断性抗体之间的结合。通过确定MSP-1₁₉的三维结构，我们已经确定了这些抗体结合位点在三级结构上的位置，这样就允许了利用其他性质相似的氨基酸进行替代。我们已经证明，几种替代作用，他们每一种替代作用都影响一或多种阻断性抗体的结合，可以结合到一个分子上。这些经过修饰的分子继续结合到中和抗体上，但却不能与任何阻断性抗体结合。当利用疟疾疫苗免疫个体时，在诱导保护性中和抗体反应方面，这样的修饰分子的预期作用要比天然或野生型蛋白结构的作用要强的多。此外，我们已经在分子的一级结构方面做了另外的修饰，这些修饰并不影响中和抗体的结合，但却有助于增加分子的免疫原性。这些修饰过的MSP-1₁₉结构，在单独或与载体结合的条件下，将会是比没有经过这种方法修饰的相同结构更有效的疫苗，而所用到的载体可含有或不含MSP-1的其他部分以增加其免疫原性(例如修饰过的MSP-1₁₉与MSP-1₄₂kDa片段的剩余部分相结合)和提供额外的T细胞抗原决定簇。

因此，本发明提供了疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然变体，该变体具有：(1)与天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，具有降低了的至少对第一种抗体亲和性，第一种抗体能阻断第二种抗体的结合，而第二种抗体是抑制疟原虫MSP-1₄₂的蛋白酶解裂解(cleavage)的，以及(2)与天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，对该第二种抗体基本上具有相同的亲和性。

优选的，疟原虫MSP-1₁₉和MSP-1₄₂是恶性疟原虫的MSP-1₁₉和MSP-1₄₂。

第一种抗体优选的是选自mAbs IEI，2.2，7.5，9C8和111.4。第二种抗体优选的是选自mAbs 12.8，12.10和5B1。

本发明进一步提供了疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然变体，该变体含有对恶性疟原虫的MSP-1₁₉氨基酸序列的第14、15、27、31、34、43、48和53位氨基酸残基中的任一氨基酸残基修饰过的氨基酸，MSP-1₁₉的氨基酸序列在SEQ ID.NO.1中有描述，或者该变体含有对其他疟原虫MSP-l₁₉多肽的等价位置上的氨基酸修饰过的氨基酸。

该修饰作用优选的选自Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys及Asn53→Arg间的替代作用，以及选自其他MSP-1₁₉蛋白多肽上的等价氨基酸的替代作用。更加优选的替代是几种替代方式的结合，这些替代是选自[Glu27→Tyr，Leu31→Arg and Glu43→Leu]，[Glu27-Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及选自其他MSP-1₁₉蛋白多肽上的等价氨基酸替代作用。

在一个优选的实施方案中，本发明中MSP-1多肽的变体进一步包括在SEQ ID.NO.1中所示的恶性疟原虫MSP-1₁₉的氨基酸序列中的Cys12和Cys28发生突变的的变体。优选的修饰是选自Cys12→Ile、Cys28→Trp、Cys12→Ala和Cys28→.Phe的替代作用。

最优选的替代作用是几种替代作用的结合使用，这些替代作用选自[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及其他MSP-1₁₉蛋白多肽上的等价氨基酸的替代作用。

本发明也提供了生产疟原虫MSP-1变体以用于制备疫苗组合物的方法，这种方法包括对疟原虫MSP-1 C-末端片段的一个或多个氨基酸残基进行修饰，从而使产生的衍生物具有(1)与天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，具有降低了的对至少第一种抗体的亲和性，第一种抗体能阻断第二种抗体的结合，而第二种抗体是抑制疟原虫MSP-1₄₂的蛋白酶解裂解的，以及(2)与该天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，对该第二种抗体基本上具有相同的亲和性。尤其是本发明的方法优选的含有一个预备步骤，也即通过三维NMR模型结构来选择一种候选氨基酸残基，优选的是在表2中所列出的。更具体地讲，这种三维模型结构可用于选择暴露于表面的氨基酸残基。较为有利的是进一步的步骤包括利用计算机模拟这些变体的三维结构以排除错误折叠的多肽。

本发明也提供了利用本发明中的方法获得的非天然疟原虫MSP-1变体。

进一步，本发明提供了可编码本发明中的变体的多核苷酸，这些多核苷酸可操作地连接到能够指导该核苷在宿主细胞内表达的调节序列上。这种多核苷酸可能含有已经优化以在宿主细胞内进行表达的序列。宿主细胞可以是Pichia pastoris细胞。本发明也提供了含有本发明中的多核苷酸的载体，这些载体包括病毒载体，以及含有本发明中的核苷或载体的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了一种药用组合物，这种组合物含有本发明中的变体、本发明中的多核苷酸，或含有与药物上可接受的载体或稀释液结合的本发明中的载体。

优选的，这种组合物进一步包含有具有免疫原性的疟原虫多肽，或其片段，或其衍生物如MSP-1₃₃或其可共价结合到非天然的MSP-1₁₉上的衍生物。优选的是不选用野生型MSP-1₁₉序列。进一步的免疫原性肽段本身可以一种类似于上述的MSP-1₁₉的方式进行衍生。因此，在不影响中和抗体结合的情况下，可对肽段中的抗原决定簇进行鉴别和修饰以防止阻断性抗体的结合。这些抗原决定簇能够结合到与上文描述的第一个抗体具有相似性质，如结合的亲和性的抗体上。进一步免疫原性肽可包括在其氨基酸序列上进行若干上述修饰。

本发明也提供了制备抗MSP-1抗体的方法，这种方法包括给哺乳动物，典型的是非人类的哺乳动物服用本发明中的多肽变体，或本发明中的多核苷酸，或本发明中的载体。

在一种优选的实施方案中，本发明提供了一种生产多克隆抗MSP-1抗体的方法，这个方法包括给哺乳动物，典型的是非人类的哺乳动物服用本发明中的多肽变体，或本发明中的多核苷酸，或本发明中的载体，并且从该动物中收集血清。本发明还提供了应用这种制备方法得到的抗体。

本发明中的多肽、核苷酸和载体可用于治疗和/或预防由疟原虫，尤其是恶性疟原虫引起的疟疾的方法中。因此，本发明提供了诱导抗由恶性疟原虫引起的疟疾的免疫的方法，这种方法给需要这种免疫的人服用有效剂量的本发明中的变体、多核苷酸或载体。

本发明还提供了免疫哺乳动物的方法，该方法包括服用有效剂量的本发明中的变体、多核苷酸或载体。尤其是该哺乳动物进行的是抗疟疾的免疫。优选的哺乳动物是人。

本发明还提供了治疗病人疟疾感染的方法，这种方法包括给病人服用有效剂量的本发明中的药用组合物。

按本发明，我们进一步提供了一种可编码疟原虫MSP-1多肽的核酸，这种核酸已经进行了优化以便于在异源宿主细胞内表达。优选的异源宿主是Pischia pasforis细胞。MSP-1多肽可从一组多肽中选取，这组多肽包括含有图2C和2E中所示序列的MSP-1₄₂多肽、含有图2C中所示序列的MSP-1₁₉多肽、含有图2E中所示序列的MSP-1₃₃多肽。经过优化的核酸可包括选自图2A、2B、2D的序列。我们进一步提供了含有这种核酸的载体、含有这种核酸或载体以及药物上可接受的载体或稀释液的可以药用的组合物。这种药物上可接受的组合物可进一步含有免疫原性疟原虫多肽或其片段或其衍生物。发明详述

一般来讲，虽然此处所提到的技术是本领域中熟知的，但文献尤其是参考Sambrook等的‘分子克隆’、‘实验室操作手册’和Ausubel等编著、John Wiley & Sons.Inc出版的Current Protocols inMolecular Biology(1995)。A.MSP-1变体的多肽

在本发明中的变体MSP-1多肽方面，我们将结合恶性疟原虫MSP-I的氨基酸序列进行描述。然而，应该指出的是除非另有说明，所有涉及MSP-1多肽的包括其他疟原虫中内发现的MSP-1的同源物，例如感染人类的P.vivax、P.malariae和P.ovale；感染鼠的P.yoelii。

本发明中的MSP-1多肽变体是基于恶性疟原虫MSP-1₄₂的C-末端片段之上的，如SEQ ID.Nos.2或3中所示。这些变体包括所有的或部分MSP-1₁₉区(SEQ ID.No1)，优选的是至少基本上所有的MSP-1₁₉结构域1和/或结构域2的EGF样序列包括在内(大约是SEQ ID.No1中分别是第1到47个氨基酸和第48到96个氨基酸)。尤其优选的是选用在多数，更加优选的是选用在某一种的所有寄生虫中都是保守的区域来增加变体作为针对多种菌株的疫苗的效用。

本发明中的变体MSP-1多肽包括有对他们的氨基酸一级序列进行的修饰，这些修饰可降低阻断性抗体对MSP-1多肽的结合能力。此外，所做的任何修饰作用都要维持可被中和抗体识别的抗原决定簇，这样就可使得中和抗体对MSP-1变体的亲和性与对天然MSP-1的亲和性基本相同(例如具有SEQ ID.No.2或3中所示序列的MSP-1₄₂多肽)。某些中和抗体结合的减少是可以接受的，因为我们的主要目标是去抑制阻断性抗体的结合，并且很有可能阻断性抗体的有效减少可以弥补由小部分中和抗体结合减少引起的疫苗总体功效的损失。

本发明的上下文中提到的中和抗体，是指那些抑制疟疾寄生虫复制的抗体。许多中和抗体，包括单克隆和多克隆抗体在本领域中是已知的，他们包括实施例中提到的mAbs 12.8、12.10和5B1。中和抗体的活性可以通过多种方法确定，这些方法在本领域中有描述。例如，1994年Blackman等描述的一种方便的检测方法中包括利用裂殖子制剂(Blackman等，1993；Mrema等，1982)来测定由MSP-1₄₂到MSP-1₃₃和MSP-1₁₉的裂解。简单来讲，新分离的裂殖子要用冰冷的缓冲液冲洗两次，然后分为含有2×10⁹个裂殖子的等份。将待测抗体添加到每一等份中，然后此样品在37℃下培育1小时。然后，在非还原性条件下对样品进行聚丙烯酰氨凝胶浓度为2.5％的SDS-PAGE电泳、WESTERN印迹和对MSP-1₃₃进行抗血清印迹探针。在对照样品中，可以看到两条主要的条带---一条是对应于MSP-1₄₂，另一条小分子量的是对应于MSP-1₃₃。由于可抑制对MSP-1₄₂的次级蛋白酶加工，中和抗体会降低低分子量条带的数量。

在被认为是阻断性抗体的抗体存在下，这种方法是评估中和抗体效用的一种最优选的方法。为了检测候选多肽与阻断性抗体的竞争，就要按上述方法在与中和抗体的于37℃、培养1小时之前，对裂殖子样品和一种阻断性抗体在冰上进行15分钟的预培育。这样，利用这种检测方法，就能很容易的对阻断性抗体进行鉴别和/或性质鉴定。

其他的检测方法包括Blackman等在1990年提出的裂殖子侵入抑制检验。

正如上面所讨论的，在本发明中阻断性抗体被定义为抑制中和抗体与MSP-1结合、但他们本身又不抑制疟疾寄生虫对红血球的侵袭的抗体。这样他们就阻断了中和抗体的中和功能。在本领域中，已经对多种抗体进行了定性，这些抗体包括实施例中提到的mAbsIEl，2.2，7.5和111.4。正如上文讨论的，通过利用对中和抗体功能的影响进行检测的方法就能很方便的对阻断性抗体进行鉴别和/或定性。

可用于生产本发明中的MSP-1变体的修饰作用包括替代作用、缺失作用和插入作用。尤其优选的是利用替代作用来减少对多肽二级和三级机构的破坏。此外，尤其优选的替代是那些利用一类氨基酸来替代另一类氨基酸，例如利用带电极性残基来替代脂肪族的非极性残基。例如，二十种天然氨基酸可分为四个主要的类(脂肪族非极性)[G、A、P、I、L和V}；极性不带电荷[C、S、T、M、N和Q]；极性带电荷[D、E、K和R]以及芳香族氨基酸[H、F、W和Y])，优选的是利用一类氨基酸中的一种来替代另一类氨基酸的一种。

其他可能的替代包括用带负电荷的侧链替代带正电荷的侧链、用有小侧链或没有侧链的氨基酸(甘氨酸)来替代有大侧链的氨基酸、用带电荷的极性氨基酸代替极性氨基酸、用有小侧链的氨基酸替代芳香性大氨基酸、以及替代包含在二硫键内的半胱氨酸残基。

尤其优选的修饰是对SEQ ID NO.1的恶性疟原虫MSP-I₁₉氨基酸序列的第14、15、27、31、34、43、48和53位氨基酸残基的任一个氨基酸进行的修饰，或在其他MSP-1₁₉多肽的对应位置上进行的修饰。这些残基几乎全部在EGF样结构域1中。我们知道，某些抗体的抗原决定簇含有在EGF样结构域2中的氨基酸，因此，等价的修饰也可应用于EGF样结构域2。优选的修饰示例包括下述替代作用：Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys和/或Asn53→Arg，以及在其他疟原虫的MSP-1₁₉多肽的相同位置上进行的替代作用。

尤其优选的是进行多个修饰，也即多种修饰结合使用，例如对两种或三种或更多种修饰进行结合使用。在一种优选的实施方案中，本发明中的一种MSP-1变体含有对选自下列氨基酸替代作用的多种进行结合使用，这些氨基酸替代作用包括：[Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]，[Glu27→Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及在其他疟原虫MSP-1₁₉多肽上的等价位置进行的替代作用。

一种尤其优选的结合使用进一步包括对Cys12和或Cys28(和/或他们在EGF样结构域2中的等价残基)的修饰来破坏二硫键。优选的，这种修饰作用是选自Cys12→Ile、Cys28→Trp，、Cys12→Ala和Cys28→Phe的替代作用。

最优选的替代作用是多个替代的结合使用，这些替代作用是选自

[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu]，

[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，

Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tvr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，

Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及在其他疟原虫MSP-1₁₉多肽上的等价位置进行的替代作用。

替代作用并不局限于使用天然氨基酸，也可以使用非天然氨基酸类似物，尤其是在通过固相合成方法来化学合成变体，而不是通过重组技术来制备变体的时候。

对MSP-1氨基酸序列的修饰可以通过利用标准技术如利用多聚酶链式反应进行的定点诱变来完成。另外，也可通过固相合成技术来获得变体。

为了确定通过对其氨基酸一级序列进行修饰制得的MSP-1多肽是否符合上述标准，要对至少一种中和抗体和至少一种阻断性抗体对变体多肽的亲和性进行检测，这种检测是以这两种抗体对天然MSP-1序列的亲和性做对照的。较为理想的是应该使用每一种类型的多种抗体，例如两或三种。

为了确定抗体对变体和野生型多肽的结合能力，就要利用本领域中的多种方法中的一种来确定抗体-抗原决定簇的结合。在实施例中有所描述的这样的一种方法包括，利用以与诸如谷胱甘肽S转移酶(GST)的蛋白标记融合的融合蛋白形式表达的，MSP-1序列。这些GST融合蛋白一般是固定化到一种固相如谷胱肽等sepharose珠或BIAcore传感器芯片上的，可以通过标准的技术，如Western印迹和或通过对抗体进行放射性标记如¹²⁵I标记，来确定抗体如单克隆抗体与融合蛋白的结合。应用BIAcore技术可很容易的对结果进行定量。

优选的，相对于野生型MSP-1而言，对至少一种阻断性抗体的结合降低50％，更优选的是至少降低75％、80％或90％，这些一般来讲是通过固定化到BIAcore传感芯片上的重组表达的MSP-1来进行估算的。相反，对至少一种中和抗体，例如对至少两种或三种被检测的中和抗体的结合，更优选地至少对于一半的被检测中的和抗体的结合，更优选的是基本上对所有被检测的中和抗体的结合也降低了不到50％，更优选的是使结合降低小于25％。为了确定与检测标准是否一致而需要进行检测的中和抗体的数量一般不超过三到五种(示例中选用了三种)。在一种尤其优选的实施方案中，至少一种中和抗体的结合提高了至少10％。

实施例部分表2中给出的结果对熟练的技术人员提供了部分指导，以此来确定哪些残基可以进行修饰来制备本发明中的变体MSP-1。然而，本文第一次提供的在MSP-1₁₉三维溶液结构方面的信息，进一步提供给熟练技术人员在关于对哪些残基可以进行改变方面的详细指导。尤其是抗原决定簇是期望暴露于MSP-1₁₉片段外部的水相环境中。因此，本文所提供的精确结构信息讲授了暴露的氨基酸在表面的部位，这使得熟练技术人员能够靶定那些残基进行修饰。表A/B提供的数据已经提交给蛋白数据库(PDB序号为1CEJ)。这使得熟练技术人员能够确定单个氨基酸在三维结构中的精确定位。一般来讲，这些数据将会添加到本领域中熟知的合适软件中，例如Insight II.MOLSCRIPT GRAS P和RASMOL。

此外，知道了在三维结构中的那些影响阻断性抗体结合但不影响中和抗体结合的的修饰的位点，就可能确定在最初经过修饰的蛋白表面上和其附近的其他残基，这样易于进一步提高这些修饰过的蛋白的性能。这些残基可能在第一个EGF样基序或第二个EGF样基序上，或者二者中间。既然我们已知一个抗体结合位点包含了相应于大约5到8个氨基酸的体积，那很显然对这些相邻氨基酸残基的修饰也影响到该蛋白与阻断性抗体的结合能力。只要相邻氨基酸经过鉴定为可以按上述原则进行修饰，那么就能对这些修饰，单独或多种修饰方法结合使用，对整体抗原性和免疫原性的贡献作出评估。那些能够降低对阻断性蛋白的亲和能力，但又基本上不影响中和抗体结合的改变可以引用到已经进行过改进的蛋白中。这可以是一个反复的过程。

此外，3DNMR结构可帮助熟练技术人员对MSP-1₁₉变体的特定修饰进行模型研究，这样就例如可将那些不能正确折叠的变体抛弃。这将有助于减少需要进行检测的候选MSP-1₁₉变体的数量。

因此，本发明也提供了保存有MSP-1₁₉ NMR结构模型的计算机可读媒介。在一个优选的实施方案中，该模型是利用表A或B所示的全部或部分NMR数据来建立的。

本发明中的变体可以选择性的包括额外的MSP-1序列，尤其是MSP-1₄₂区中的MSP-1₃₃区中能提供给变体额外的免疫原性的区域。此外，那些已知含有和提高T细胞反应的额外序列是优先包括在内的(也即T细胞抗原决定簇)。也可通过进行其他的修饰方法来提高免疫原性如那些可改变抗原加工和表达途径的修饰方法。

本发明中的多肽变体一般是通过重组方法来制得的，例如下面所描述的。然而，也可以利用通过熟练技术人员熟知的技术，如固相合成，通过合成的方式来制备。本发明中的蛋白也可作为融合蛋白制备，例如，以便有利于提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽转移酶(GST)、6xHis、GAL-4(DNA结合或转录活化区域)及β-半乳糖苷酶。也可在融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白序列之间包括蛋白水解裂解位点，以便可以切除事蛋白序列。优选的融合蛋白是不会干扰MSP-1变体的免疫原性的。

本发明的多肽可以是基本上以分离形式存在。可以认为这些多肽可与不影响多肽既定功能的载体或溶剂混合，这种状态的多肽基本上也可认为是分离形式的。本发明中的多肽也可以基本纯化的状态存在，这种情况下，一般来讲，制剂中含有的多肽至少90％，如95％、98％或99％是本发明中的多肽。B.多核苷酸和载体

正如上述讨论的，本发明中的变体可以通过标准技术进行重组制备。因此，本发明也提供了编码本发明中的MSP-1变体的多核苷酸。本发明中的多核苷酸可包括DNA或RNA。他们也可以是包括合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。在本领域中，对寡核苷酸的多种修饰方法是已知的。这些修饰方法包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链、在分子的3′和/或5′末端添加吖啶或聚赖氨酸链。与本发明的目的相联系，我们可以认为此处描述的多核苷酸可以通过本领域中已有的技术来进行修饰。进行这些修饰的目的是为了提高本发明中的多核苷酸在体内的活性或延长其寿命。熟练技术人员都知道，由于遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸能编码同一种多肽。

本发明中的多核苷酸包括可以引入可复制的载体的多核苷酸。这些载体可用于在合适的宿主细胞中进行复制核酸。因此在进一步的优选实施方案中，本发明也提供了制备本发明中的多核苷酸的方法，这个方法将本发明中的多核苷酸引入可复制的载体中，将此载体引入合适的宿主细胞中，然后让宿主细胞在能进行载体复制的条件下生长。可以从该宿主中回收所述载体。合适的宿主细胞包括细菌如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系以及其他的真核细胞系，例如昆虫Sf9细胞。这种宿主也可以是甲基营养酵母如Pichta pasroris。

可对天然MSP-1多肽或MSP-1多肽变体(包括本发明的多肽)的编码序列进行修饰，以优化其在宿主细胞内的表达。例如，通过去除次级修饰必须的序列，就可以避免进行次级修饰，如N-糖基化。按照宿主细胞中的优化表达的密码子的用途，多肽序列可通过另外的方法或附加修饰来修饰。在本领域中，对序列进行诱变处理的方法是已知的，另外，利用重叠合成寡核苷酸进行PCR基因装配可得到经过修饰的编码序列(Stemmer et al.，1995；Withers-Martinez et al.，1999).。

优选的，通过宿主细胞可将包含在载体中的、本发明的多核苷酸可操作的连接到一个调节序列上，而此调节序列是能够让宿主表达该编码序列的，也即这个载体是表达载体。名词‘可操作的连接‘指的是并置(jutfaposition)，此处描述的这些元件间关系允许他们以既定的方式行使他们的功能。一种调节序列“可操作的连接”到编码序列上是指他们以这样的一种方法进行连接，这种方式是指在与控制序列相容的条件下编码序列能够表达。

利用上述的标准技术可将这些载体转化或转染入合适的宿主细胞中来提供本发明中的多肽的表达。这个过程包括在特定条件下培养上述利用表达载体转化了的宿主细胞，这种特定条件也是通过可编码多肽的编码序列的载体进行表达的条件，并且选择性地回收表达的载体。

这些载体可以是，如质粒或病毒载体，但这些载体必须含有复制起点、用于表达该多核苷酸的随意的启动子，以及该启动子的随意一个调节子。这些载体可含有一或多个可选择的标志基因，例如在细菌质粒中的氨苄青霉素抗性基因，或哺乳动物载体中的新霉素抗性基因。这些载体可用于体外，例如用于制备RNA，或用于转染或转化宿主细胞。也可对这些载体进行改造以用于体内，例如作为一种基因治疗的方法。

我们要选用与那些为之设计表达载体的宿主细胞相适合的启动子/增强子和其他表达调节信号。例如，可选用原核生物启动子，尤其是那些适用于大肠杆菌菌株的启动子(例如大肠杆菌HB101或DH5a)。

当本发明中的多肽是在体内或者体外的哺乳动物细胞中进行表达时，我们就可以选用哺乳动物启动子。可以选用组织特异性启动子。也可选用病毒启动子，例如Moloney murine白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)，鲁斯氏肉瘤病毒LTR启动子、SV40启动子、人细胞巨化病毒(CMV)IE启动子、疱疹单纯病毒启动子或腺病毒启动子。所有这些病毒在本领域中都很易于获得。C.给药

本发明中的MSP-1多肽变体和核酸分子可用于治疗或预防动物，尤其是人疟疾。

本发明中的多肽可利用直接注射的方式给药。优选的是多肽与药物上可接受的载体或溶剂结合以产生一种药物组合物。合适的载体和溶剂包括等渗的盐溶液，例如磷酸缓冲盐。这些组合物是制备来进行肠胃外、肌肉内、静脉内、皮下、眼内或经皮内给药的。一般来讲，每种多肽给药剂量是0.01-30μg/kg体重，优选0.1-10μg/kg体重，更优选的是0.1-1.0μg/kg体重。也有可能应用通过本发明中的多肽制备的抗体来治疗或预防疟原虫感染，这在下文中有描述。中和抗体或其保留有疟原虫抗原特异性的片段可以与本发明中的多肽类似的方式给药。

本发明中的多核苷酸可以裸露的核酸结构直接给药。当表达盒是以裸露的核酸给药时，核酸给药剂量一般是1μg-10mg，优选100μg-1mg。

通过几种已知的转染技术如那些技术包括利用转染剂，可提高哺乳动物细胞对裸露的核酸结构的吸收。这些转染剂包括阳离子剂(如磷酸钙和DEAE-右旋糖苷)和脂质转染试剂(如Lipofectam^TM和transfectam^TM)。一般来讲，核酸结构是与转染剂混合来生成一种组合物的。

另外，多核苷酸也可作为核酸载体的部分来给药的，这些载体包括质粒载体或病毒载体，例如牛痘病毒载体。当本发明中的多核昔酸通过本发明中的病毒载体转入细胞中时，给药的病毒载体数量是10³-10¹⁰pfu，优选10⁵-10⁸pfu，更优选10⁶-10⁷pfu。当采用注射给药时，一般给药以1-10μl的病毒，这些病毒是在药物上可接受的载体上或溶剂中的。

优选的，转运运载体(也即，例如含有多核苷酸的核酸结构或病毒载体)是与一种药物上可接受的载体或溶剂结合来产生一种药物组合物。合适的载体或溶剂包括等渗的盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。这些组合物是制备来进行肠胃外、肌肉内、静脉内、皮下、眼内或经皮内给药的。

此处所述的给药途径和剂量只是作为一种指导，因为有经验的医生可以很容易的对特定的病人和病情确定最适给药途径和剂量。D.疫苗的制备

可以从本发明中的一或多种多肽来制备疫苗。这些疫苗可包括本领域中已知的一或多种免疫原性疟原虫多肽。因此，本发明中的一种疫苗可包括本发明中的一或多种多肽，以及从，例如无性血液阶段的蛋白(asexual blood stage protein)顶点裂殖子(apical merozoite)抗原-1、红血球结合抗原175、红血球膜蛋白-1；肝阶段蛋白(hepaticstage protein)肝阶段抗原(lirer stage protein)-1和3；孢子体阶段蛋白：疟原虫环子孢子蛋白、与血小板反应素相关的粘附蛋白；以及有性阶段蛋白Pfs25和Pfs28多肽及其免疫原性片段中随意选出的一或多种多肽。优选的，其他这些本领域中已知的疟原虫免疫原性多肽是不含有野生型MSP-1₁₉序列的。

对本领域中的熟练技术人员来讲，含有免疫原性多肽作为活性成分的疫苗制剂是熟知的。一般来讲，这些疫苗是以溶液或悬浮液等可注射的形式来制备的。也可以制备适于溶解在或悬浮在注射前的液体中的固体形式。这些制剂可进行乳化，或者将蛋白包被在脂质体中。活性免疫原成分常常与赋形剂相混合，而这些赋形剂是药物上可接受的，但是与活性功能成分相适合的。合适的赋形剂有，如水、盐、右旋糖、甘油、乙醇等等以及他们的结合使用。此外，如果需要，疫苗可含有少量的辅助物质，如润湿因子或乳化因子、pH缓冲物质、和/或可提高疫苗效用的助剂。有效助剂的例子包括但并不局限于：氢氧化铝、N-乙酰—胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酸盐(thr-NfDP)、N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为norWIDP)，N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油酰-3-羟磷酰氧)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)、以及含有从细菌中提取得到的三种成分的RIBI，这三种成分为在2％鲨烯/吐温80乳状液中的单磷酰脂A、海藻糖dimycolate和细胞壁骨架(NIPL+TDM+CWS)。助剂的有效性可以通过测定直接抗免疫原性多肽的抗体的数量来确定，这些免疫原性多肽是含有MSP-1抗原序列的，这些序列的抗原性又是从对也含有多种助剂的疫苗的多肽给药过程中获得的。

这些疫苗传统上是以肠胃外、注射如皮下注射或肌肉内注射的方式来给药的。适合于其他方式给药的额外制剂包括栓剂，有些情况下是口服制剂。对栓剂来讲，传统上的结合物和载体包括多亚甲基乙二醇或甘油三酸酯；这些制剂可以从含有0.5％-1.0％活性成分、优选1％-2％活性成分的混合物制备得到。口服制剂包括这些正常使用的赋形剂如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式存在，并且其中含有10％-95％的活性成分，优选的是25％-70％。如果疫苗组合物经过低压冷冻干燥，那么干燥后的组合物可在给药前进行再造，例如再造为悬浮液。优选的再造是在缓冲液中进行的。

用于对病人进行口服的胶囊、片剂和丸剂可以包被有肠衣，这些肠衣可含有，例如Eudragit″S″、Eudragit″L″、醋酸纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸盐或羟丙基甲基纤维素。

本发明中的多肽可以中性形式或盐形式制备如疫苗中。药物上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的自由氨基结合形成)，其中它可与无机酸如盐酸、磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸结合形成。与自由羧基结合形成的盐可以是从无机碱如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁以及有机碱如异丙氨、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和脯氨酸衍生而来的。E.疫苗剂量和给药

疫苗是以一种与制剂剂量相适应的方式给药的，在这样的剂量条件下才具有有效的预防和治疗效果。虽然给药量一般是5-250μg抗原/剂，但这要依赖于治疗对象、治疗对象免疫系统合成抗体的能力、以及需要达到的保护的程度。必须的活性成分的精确量要依赖于医生的判断，对不同对象可以不同。

疫苗可以是以单剂量时间表给药，也可以是按照复合剂量时间表给药。多剂量时间表是指疫苗的一个初级疗程可以包括1-10个单独的剂量，然后在特定要求的时间段里按照其他剂量给药来维持或加强免疫反应，例如，在1-4月给药以第二种剂量，并且如果需要几个月后再给药以随后的剂量。至少在部分程度上，这种剂量方法是由对象个体的需要和医生的判断来决定的。

此外，含有免疫原性MSP-1抗原的疫苗可与其他免疫调节药物如免疫球蛋白联合给药。F.制备抗本发明中的多肽的抗体

按上述方法制备的MSP-1多肽变体可适用于制备抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。如果需要单克隆抗体，那就要对所选动物(如小鼠、兔子、马等)进行含有MSP-1抗原决定簇的免疫原性多肽的免疫。收集从免疫动物采集的血清，并且利用已知的方法进行处理。如果含有抗MSP-1抗原决定簇的多克隆抗体的血清也含有抗其他抗原的抗体，那该多克隆抗体就可以通过免疫吸附色谱进行纯化。制备和处理多克隆抗血清的方法在本领域中是已知的。

本领域中的熟练技术人员可以很容易的制备得到直接抗本发明中的多肽所含的MSP-1抗原决定簇的单克隆抗体。通过杂交瘤细胞来制备单克隆抗体的一般方法在本领域中是熟知的。无限增殖抗体产生细胞系可以通过细胞融合来获得，也可以通过其他技术如利用瘤原性DNA来转化B淋巴细胞或转染Epstein-Barr病毒。制备得到的系列单克隆抗体可以根据多种特性进行筛选，即：同种型和抗原决定簇亲和性。

利用克隆在噬菌体展示库内的免疫球蛋白重链和轻链的可变区，优选的是选自曾经经受疟疾感染的人中的免疫球蛋白，可通过本发明中的多肽来筛选人单克隆抗体。

直接抗MSP-1抗原决定簇的单克隆抗体和多克隆抗体在诊断上尤其有用，并且其中的中和抗体在被动免疫治疗中是有用的。尤其是单克隆抗体可用于诱导抗个体基因型抗体的出现。抗个体基因型抗体是一类免疫球蛋白，它携带有感染性物质的‘内部影象’，这种保护是我们非常想要的。

诱导抗个体基因型抗体的技术在本领域中是已知的。这些抗个体基因型抗体在治疗疟原虫的感染中是有效的，并且对阐述MSP-1抗原的免疫原性区也是有用的。也有可能对上述的抗体片段，如F(ab’)₂，、Fab、Facb和scFv片段进行利用。

我们应该明白上述的本发明的各个部分、方面和实施方案的特征有也同样适用于适当修改以后的其他部分、方面和实施方案。

现在本发明将会进一步的通过示例进行描述，我们并不是想让它们来限制本发明的范围，只是利用它们来帮助本领域中的一般技术人员来完成本发明的操作。这些示例中提到一些附图。在这些图中：

附图详述

图1-按照EGF样基序的共有序列对MSP-1序列进行排序。顶端序列：P.falciparum(SWISS-PROT MSP1 PLAFW).第二个序列：P.Vivax Belem菌株(PIR A45604).第三个序列：人EGF(PDB legf).第四个序列：EGF样的结构域的共有序列(Prosite EGF 1).底端序列：EGF核心区的14个残基，在6中用于结构排比。加黑的部分表明EGF样结构域的保守残基。黑影表示在P.falciparum的EGF组件对接触面上的疏水残基，以及在P.vivax序列上的相应保守残基。

图2-多维异核核糖核酸NOESY实验的样品表明含有与MSP-1 C-末端片段Lys35 NH质子的NOE连接的平面。上部：从4D-[¹³C]-HMQC-NOESY-[¹⁵N]-HSQC实验得到的¹³C(D4)和¹H(D3)平面，这个实验是在¹⁵N(D2)和¹H(D1)的Lys35 NH的化学漂移值下进行的。.底部：从在Lys35 NH的¹H化学漂移值(垂直轴.D1)下进行的3D[¹⁵N)-NOESY-HSQC实验得到条带，而这个化学漂移值是在它的¹⁵N(D3)值下得到的。这个水平的¹H轴是与顶部的光谱对齐的。没有在4D光谱上相应出现在3D光谱的3.72和3.01ppm处的弱交联峰，这是因为后者有更低的信噪比。现在已经将这些峰定为在Lys35 NH和Asn44H_β2(2.72ppm)、及Cys30 H_β3和/或Cys41 H_β2(3.01PPm)之间的交联峰。

图3-立体图表明在最后的系综中的32精确结构的C、N、C_a主链。结构域1在左面(红色)，而结构域2在右面(绿色)，C-末端和N-末端都接近底部。

图4-系综中最具代表性的模型的MOLSCRIPT图，它表明C_α痕迹主链(backbone C_α frace)反平行β-折叠片以及二硫桥(黄色的S_γ原子)。结构域-1，红色；结构域-2，绿色。

图5-利用14个氨基酸的‘简化核‘共有序列(Bersch et al.，1998)(见图1)，通过fitpdb程序对典型的EGF样家族成员进行排列。在每个结构中经过排列的主链片段是白色的。这些结构是与最具代表性的基团结构(因子Xa)相对比进行排列的。从左到右序列差异百分比逐渐增加。数字表明进行过排列的C、N、C_a原子的rmsd值。PDB鉴定代码：因子Xa(晶体结构)，1hcg；互补Clr元件，lapq(14th模型)；人EGF，legf(11^th模型)；原纤蛋白-1，结构域-32和-33_lemn(最小化的一般结构)；转化生长因子-α，2tgf(最小化的一般结构)；MSP-1结构域-1和-2，本研究。

图6-原纤蛋白-1相对于MSP-1的EGF样组件对的排序观察。原纤蛋白-1(lemn)青色(结构域-32)和红紫色(结构域-33)(Downing et al..1996)：MSP-t结构域-1(黄色)和结构域-2(绿色).利用每个组件对的结构域的N-末端的核心共有序列对这些结构进行排序，如图6中所示。原纤蛋白-1中的Ca²⁺结构的范围是用红紫色的球形表示的。

图7-对MSP-1组件对的静电势面的观察，a和b(绕y轴旋转大约180°)，利用GRASP进行计算。红色代表负电荷，兰色代表正电荷，白色代表中性。视图方向在邻近的小图表中有示。

图8-MSP-1 C-末端的CPK模型，它表明影响单克隆抗体结合的一些突变的位点。结构域-1是朝向右上方，而结构域-2是朝向左下方。

图9-通过Western印迹检测的MSP-1与单克隆抗体结合的示例。每种单克隆抗体与蛋白的结合是基于野生型序列之上的，并且也对单克隆抗体与含有修饰序列的蛋白进行了示例。单克隆抗体如上部所示。左面示例的是蛋白：WT，野生型序列；22，Leu22→Arg；26，Glu26→Ile；15，Asn15→Arg；27，Glu27→Tyr；31，Leu31→Arg；43，Glu43→Leu；27+31+43，Glu27→Tyr及Leu.31→Arg以及Glu43→Leu；15+27+31+43，Asn15→Arg及Glu27→Tyr及Leu31→Arg以及GIu43→Leu。

图10-利用BIAcore分析方法进行检测的单克隆抗体与GST-MSP-1₁₉的结合，它是通过BIAcore分析方法进行检测分析的。在野生型序列的基础之上，将每个单克隆抗体与的结合都规范化为100％，然后单克隆抗体与含有修饰序列的蛋白的结合是以他们的百分比来表示的。WT，野生型序列；15，Asn15→Arg；26，Glu26→Ile；27，Glu27→Tyr；31，Leu31→Arg；34，Tyr34→Ser；43 Glu43→Leu。

图11-利用BIAcore分析方法进行检测的单克隆抗体与含有多重修饰的GST-MSP-1₁₉的结合。在野生型序列的基础之上，将每个单克隆抗体与的结合都规范化为100％，然后单克隆抗体与含有修饰序列的蛋白的结合是以他们的百分比来表示的。WT，野生型序列；在每一位点上含有3种突变[27+31+43)、或4种突变[27+31+34+43]和[15+27+31+43)的结合，这些改变是如图10中所示。

图12-通过竞争性结合检测法和固定化野生型GST-MSP-1₁₉来对阻断性抗体进行检测。通过BIAcore分析方法来检测抗体与mAbs12.8和12.10竞争结合到GST-MSP-1₁₉上的能力。单独的抗体(X-轴)结合到抗原之上，然后就可对mAbs 12.8和12.10(抑制性mAb)随后的结合进行定量。所有的结合数量是以其与12.8或12.10在没有与另外一种抗体进行预培育时的结合总量的百分比来表示的。

图13-检测经修饰过的重组MSP-1₁9的免疫作用诱导的抗体抑制次级加工的能力。对冲洗过的3D7裂殖子在不经培育(0h)的情况下直接进行检测，或在以1mM PMSF作为整个抑制过程的对照但没有血清(无血清)、正常兔血清(正常血清)、或经15+27+31+43修饰过的蛋白免疫的兔血清(免疫血清)存在条件下37℃培育1小时，所有这些血清都是在反应缓冲液中按照1∶10的比例进行稀释。MSP-1₃₃释放到上清液中的水平作为次级加工的结果，这可通过ELISA方法进行检测，其值以在492nm波长的吸收来表示。

图14-用于输入CODOP程序的Pichia pasroris密码子优选表。

图15-优化的合成MSP-142基因的DNA或蛋白质序列。A：设计来最优化密码子用途和其在Pichia pasroris中表达的完整序列。B：在表达载体pPIC9K-Hxa中的的合成MSP-1₁₉结构的序列。大写字母：载体序列，包括H₁₃₆标记和因子X_a裂解位点(IEGR)。小写字母：合成MSP-1₁₉的编码序列。定位于pPIC9K序列的SnaBI限制性位点的克隆序列。C：合成MSP-1₁₉结构表达的蛋白序列。所示序列是紧随在kex2/STE13加工位点之后的，它是以pPIC9Kα-因子分泌信号的融合蛋白的形式来制备的。合成的MSP-1₁₉是用粗体来表示的。D：MSP-133结构序列。这个克隆序列位于pUCll8载体的SmaI位点。E：合成MSP-1₃₃结构翻译后产物的预测蛋白序列。

图16-适合于MSP-133序列和MSP-119序列的基因装配PCR反应。反应1：10μl等份的装配反应。反应2：20μl等份的放大反应。随后将N-末端和中间片段剪接到一起形成MSP-133合成结构。C-末端片段合成反应产生了最优化的MSP-119结构。

图17.合成MSP-1₁₉蛋白在Pichia pasroris中的表达。1-6道；经三氯乙酸沉淀的、培养上清液中的分泌蛋白，但没有对它进行进一步的纯化(5μl/道)。三种独立的转化体的相同培养物样品。8、9道：从最初的恶性疟原虫序列制备的纯化的、脱糖基化的MSP-119。7、10道：NOVEX分子量标准物。

图18.A：最优化的合成MSP-1₁₉基因表达的蛋白(3.5mM)的{¹H/¹⁵N}-HSQC光谱。B：由最初恶性疟原虫序列表达的、脱糖基化蛋白(2.2mM)的对照{¹H/¹⁵N}-HSQC光谱(morgan et al.，1999)。

实施例材料和方法

蛋白表达和稳定同位素标记NMR

通过Vent多聚酶(New England Biolabs)进行的PCR反应，从含有恶性疟原虫菌株T9/94片段的质粒(Blackman et al.，1991)克隆到了MSP-1 C-末端底片段的编码序列。PCR反应使用的引物包括6个N-末端His标记的密码子(CACCATCATCATCATCAC)，然后将此引物插入到pPIC9K载体(Invitrogen)的SnaBI限制性位点。这个序列相应于SWISS-PROT目录MSP1 PLAFW(accession number P04933)的第1526-1621号残基。这样就制得了一个含有序列…KR/EA/EA/YHHHHHHNlSQ....SSSN的α-因子融合蛋白，此处的省略号代表kex2和STEl3加工位点。通过对高G418抗性筛选，我们就分离到了高拷贝数甲基营养酵母Komagataella(Pichia)pastoris蛋白酶缺陷型菌株SD1168(his4 pep4)(Clare et al.，1995)。

Mut^-转化体在29.4℃下、在含有缓冲过的基础介质(100mM磷酸钾，pH6.0，酵母碱基氮(034w/vol)(DIFCO：YNB不含氨基酸、不含硫酸铵，但含有生物素(4×10^-5％ w/vol)、Sigma抗泡沫剂289(0.01％ vol/vol)以及下述的碳源和氮源的振动培养器中生长。未标记的样品开始是在含有1％ w/vol硫酸铵和1％ w/vol甘油的培养基中生长，通过将其转移到含有0.5％的CH₃OH作为碳源的培养基进行诱导。标记的样品开始是在含有0.2％ w/vol[¹⁵N]-(NH₄)₂SO₄(Isotech)和0.5％ w/vol葡萄糖或[¹³C6]-葡萄糖(Isotech)的培养基中生长，通过将其转移到含有0.5％w/vol CH₃OH或[¹³C]-CH₃OH(Isotech)作为碳源的培养基中生长来进行诱导。起始培养物从150ml生长至密度大约为10 OD₆₀₀，然后进行收获，并且重新悬浮在甲醇中，体积为1.5L，密度为1 OD₆₀₀。甲醇诱导的培养物培养时间为4天，每天添加7.5ml CH₃OH或[¹³C]-CH₃OH，直至最终浓度为大约18OD₆₀₀.通过这种方法在最后阶段制备得到了24mg/L纯化的、¹³C/¹⁴N均匀标记的蛋白(见下文).对于生产MSP-1 C-末端片段来讲，基于YNB的培养基的产量要比FM22培养基的产量高大约3倍(Laroche etal.，1994)。

通过低速离心将细胞去除，然后添加蛋白酶抑制剂(COMPLETE^TM片剂、Boehringer-Mannheim：1片/500ml上清液)，并且对上清液进行过滤灭菌。在4℃下，在搅拌小室中通过超滤将上清液浓缩大约20倍(Amicon.YM3膜)。利用KOH将pH调节为7.25，并且在37℃下利用5000U的PNGaseF(New England Biolabs)对N-糖基化的MSP-1片段进行72小时的部分去糖基化。将碳水化合物全部去除掉(通过电泳和质谱来进行检验)，估计在这个过程中Asn 1残基也被转化为了Asp。通过低速离心将上清液澄清，将5M的NaCI添加到其中使其终浓度变为3M，然后将样品通过2ml的Ni-NTA亲和层析柱(QIAGEN)。冲洗，在使用手册指导下用250ml咪唑来洗脱。洗脱液分别用50mM磷酸钠(pH6.6)、50mM NaCI透析，然后将其通过1ml的Hi-Trap Q阴离子交换树脂(Pharmacia)来去除错误折叠的MSP-I，这些错误折叠的MSP-I能够结合到柱子上。通过Westem印迹和电喷射质谱(数据没有展示出)来对MSP-1片段进行定性。相应于所期望的片段，我们观察到两个主要的分子量11067和11807Da，也观察到含有额外的N-末端Glu-Ala二肽的片段，这个二肽是由于对α-因子分泌信号的不完全STE13加工造成的。

用于NMR实验的样品是在含有0.01％ W/vol NaN₃的90％ H₂O/10％D₂O中或100％ D₂O、50mM磷酸钠、100mM NaCI、pH6.5(由于氘同位素影响，pH没有校正)的溶液中，浓度为2.1-2.6mM，体积为0.6ml。蛋白浓度通过在280nm的UV吸收进行测定，计算出的摩尔消光系数为5220Lmol^-1 cm^-1。通过在293K对0.12mM样品进行平衡超速离心证明其是单体，他们在平衡超速离心时是在缓冲液上部。

NMR实验和数据处理

绝大多数实验是在298K下进行的，使用的是Varian Unity和Unity-Plus分光光度计，分别在600MHZ和500MHZ下进行。表A/B给出了用于共振排布和结构确定的详细的获得参数和多维实验(Clore & Gronenbom，1998)，并且已经将他们提交给了蛋白数据库(PDB Accession No lCEJ)。

所有光谱都经过Felix 95.0或97.0(Biosym/MSI)的90度或72度漂移sinebell-squared视窗功能。维数、zero-filling以及线性预测的细节都总结在表A/B和对BioMagResBank的提交物中。四维的和交叉存取的光谱是在Felix中利用macros written in-house进行处理的。

信号排布：主要基于通过在均一的13C/15N标记的蛋白上进行的CBCA(CO)NH和CBCANH实验建立的连续性，我们进行了连续排布。侧链旋转体系排布是在从与¹⁵N/¹H-TOCSY-HSQC和¹⁵N/¹H-NOESY-HSQC.以及HNHA和HNHB实验信息相关的¹³C/’¹H-HCCH-TOCSY实验所得数据基础上极性排布的。能够得到对98％的侧链和96％主链氨基化合物基团的¹H、¹⁶N和脂肪族¹³C的排布。排布列表在表A/B和对蛋白数据库的提交物(PDB Accession No lCEJ)中已经给出。按照前面所述进行¹⁵N{¹H}异核核糖核酸NOE实验(kay et al..1989；Polshakovet al..1997)。

距离限制：主要从3D ¹⁵N-NOESY-HSQC、¹⁵N-ROESY-HSQC和4D¹³C-HMQC-NOESY-¹⁵N-HSQC实验获得了在主链和侧链氨基化合物质子间的NOE和ROE衍生的距离限制。脂肪族和脂肪族质子间的距离限制是从4D¹³C-HMQC-NOESY-¹³CHSQC实验获得的。在D₂O中进行的3D¹³C-HMQC-NOESY实验用于确定脂肪族和芳香族质子的NOE，而在其中的2D NOESY实验可用于确定芳香族质子和芳香族质子之间的NOE。通过适合于2D和3D实验和4D¹³C-HMQC-NOESY-¹⁵N-HSQC实验的Felix中进行体积积分，以及从4D¹³C-HMQC-NOESY-¹⁵N-HSQC光谱上测量得到的峰高就可对交联峰进行量化。交联峰分为强、中等和弱三种类型，他们的距离限制(distance restraints)分别为0-2.8、0-3.6和0-5.5。从主链氨基化合物信号产生的限制最初是用这种方法进行处理的，随后通过将3D¹⁵N-HMQC-NOESY数据分为最大距离为2.6、3.1、3.6和4.1的四类进行更加精确的重新计算。等价位基团或非立体构象质子的限制是通过r^-6求和来处理的。绝大多数的残基内距离(HN-H_β和H_α-H_β)都转化为下述的χ1角距离限制，这些限制没有包括在最终的表中。

二面角限制：利用格栅搜寻(grid-search)程序AngleSearch，与偶联常数和残基内ROE距离限制信息(Polshakov et al.，1995)结合获得了χ1角和β-亚甲基质子的立体特异排布。偶联常数信息是通过³J(HN-H_β)和³J(CO-H_β)的HNHB和HN(CO)HB光谱强度获得的，而残基内距离(HN-H_β，H_α-H_β)是从3D¹⁵N-ROESY-HSQC和2D ROESY(D₂O)实验获得的。.³J(CO-H_α)偶联常数是从HNHA实验获得的。具有正的φ角(ca.-60度)是通过在HN(CO)HB实验中的大的内残基H_α交联峰的强度来确定的，y角与HNNB实验中的强H_α(1-1)交联峰相距接近-60度。Ile和Leu的χ2角以及Leuδ的立体排布是从LRCH实验获得的。40度(χ1，χ2)和50度(φ，φ)的最小范围可用来说明其偏差和对偶联常数的局部动力学效用。

二硫键模式：选用了大约550个明确的NOE衍生的距离限制、36个x1和φ二面角限制，但没有选用氢键和二硫键限制来模拟退火，以这种方式计算了最初一组20个结构。在这些结构中，检验了Cys-Cys S_γ距离，目的是来确定一个有可能的键模式。在进行计算之前，通过观察这些二硫键残基对间的H_β-H_βNOE在很大程度上确定了四个4Cys残基(Cys12-Cys28，Cys78-Cys92)间二硫桥的构成。对起始结构的检验确定了这些二硫桥并且也表明在残基Cys30和Cys41之间有另外一个二硫桥存在。虽然NMR数据还不能很好的确定其N-末端结构，但已经默认了在结构域-1中的第三个二硫桥(Cys7-Cys18)的存在。在总X-PLOR能量和违背方面最好的6个结构表明：在每个结构域中的二硫键模式[1-3，2-4，5-6]的Cys-Cys S_γ距离是最小的，并且只有这样的结合才允许所有的Cys残基与其配偶体在小于3.5的距离内构成联系。因此，对两个结构域来讲，这种二硫键模式是与实验数据最接近的，并且在随后的计算(开始是以NOE型距离限制来计算的)中证明其有极大可能。[1-3，2-4，5-6]模式是EGF样结构域所期望的那种。

氢键：通过在100％的D₂O溶液中检测的样品的光谱，确定了包含在稳定氢键中的非交换氨基化合物基团。利用Insight II and HBPIus(MeDonald et al..1994)程序，通过对最初构件系综的检测确定了相应的氢键受体，而氢键距离限制是包括在随后的计算之内的。通过相似的方法利用重复计算确定了其他的氢键。在反平行β折叠片中只有10个主链氢键是用于进行限制的。两个距离限制用于一个氢键，从质子到受体是1.7-2.3，从供体氮原子到受体是3.0-3.6。

结构计算

在一台Graphics Origin 200计算机上利用X-PLOR的3.843版本，按照从一条扩展链进行ab initio模拟退火的方法来计算所有的结构。最初的计算所用起始温度为1000K，在限制性的分子动力学阶段就进行了9000步5fs。在距离限制中使用了soft-squarepotential。在分子动力学阶段中使用了SHAKE(Ryckaert et al.，1977)运算法则来维持正确的键长。利用a square well potential对这些限制进行进一步精确化，然后从2000K开始进行了每步4fs的30000步缓慢冷却。在对Arg和Pro以及氢键的参数进行修饰时使用了已经做过修改的″parallhdg.pro″力场参数集(Polshakov etal.，1997)。包括氢键在内的所有距离限制的力常数为50kcal mol^-1A^-2，二面角限制的力常数是200 kcal mol^-1 rad^-2。包括载体编码残基和(His)₆标记在内的N-末端序列是排除在结构计算之外的。所有的肽键都是反式的。5个Pro残基的NOE数据表明强H_α(i-1)-ProHα交联峰与反式肽段构型相一致。

如上所述的最初结构计算确定了二硫键的模式。随后的计算完全重复NOE衍生的距离和二面角限制，只是添加了6个代表二硫桥的距离限制(1.92-3.12)。获得了50个新的结构，从中又选出了20个最好的结构。用于进行选择的标准是这些结构低于总X-PLOR能量和rms NOE差值的中值，并且与二面角没有任何违背。最终的结构具有很好的几何形状，并且在0和两个＞0.5 的NOE违背之间。这些结构可用于对前述的不确定的NOE赋值，也可用来确定上述的氢键。

最终的结构计算和精确化是通过应用包括氢键、额外的二面角限制、β-亚甲基的立体排布和Leuδ信号，以及更加精确校正ROE数据(见表1)在内的扩展的限制表。利用这个表获得了含有100个结构的组，其中0-2NOE违背＞0.5 和二面角违背＞5°的38个结构是可以接受的。通过上述的缓慢冷却方法对这38个结构进行了精确化，获得了最后的32个可接受的结构，他们没有NOE违背＞0.5 ，也没有二面角违背＞5°。通过这些选择标准获得了一组结构，这些结构一直延伸到总势能连续的末端，这样做是为了能够将具有大规模相关运动的结构包括在内(Abseher et al.，1998)。对最终系综进行的统计在表1中列出。这32个精确化结构的坐标已经保存在Brookhaven Protein Data Bank(坐标ID编码1cej；NMR限制ID编码r1cejmr)。

在计算过程中利用X-PLOR 3.8(Nilges et al.，1991)、PROCHEK-NMR/AQUA_{(Laskowski et al.，1996)}，以及Insight II对包括实验数据、精度、几何形状和能量在内的吻合性质进行了分析。模型是与InsightII和fitpdb.相结合的，并且通过Insight II，MOLSCRIPT来展示_{(Nicholls et al.，1991)}及GRASP(Nicholls et al.，1991)。

表1

A：限制摘要计算的构象体数目：100 接受的构象体数目：32接受标准：没有距离违背：＞0.5 没有二面角违背：＞5°NOE/ROE距离限制：内部残基：73 序列；222中程(2-4)：90 长程(＞4)：185总共：570二面角限制：phi：25 psi：33 chi-1：22 chi-2：5 总共：85氢键：10 二硫键：6B：结构性质

平均 +/-s.d总X-YPLOR能量(kcal mol^-1) 168 20NOE X-YPLOR能(kcal mol^-1) 21 8rmsd NOE 0.026 0.005rmsd 面角 0.236 0.095rmsd 键长 0.0029 0.0002rmsd 键角 0.357 0.023rmsd 不正确的 0.266 0.018构建区主链rmsd：(69残基)总体上： 1.05 0.28结构域-1： 0.81 0.32结构域-2： 0.83 0.35Ramacbandran结构性质(pbi/psi角)：最想要的49.5％额外允许的 42.1％一般允许的 5.6％不允许的 2.7％

单克隆抗体(mAbs)

在本发明中选用的抗MSP-1₁₉单克隆抗体有：鼠IgG mAbs 1E1，1E8，2F10，111.2，111.4 2.2，5.2，7.5，9C8，12.8，12.10，12D11，117.2，8A12(Holder et al..1985；McBride & Heidrich，1987；Blackman etal..1987；Guevara Patino et al..1997)；和鼠IgM mAb 5B1(Pirson & Perkins，1985)。在这些抗体中，mAbs 12.8、12.10和5B1是中和、抑制性抗体，1E1、2.2、7.5、9C8和111.4是阻断性抗体。一些抗体如111.2既不是抑制性也不是阻断性抗体。构建修饰的MSP-1₁₉克隆

已经将编码恶性疟原虫(T9-94/Wellcome菌株)MSP-1的野生型MSP-1₁₉结构域的DNA克隆到表达载体pGEX-3X中，通过它来制备融合到存在于大肠杆菌中Schisrosoma japonicum谷胱甘肽(GST)的羧基末端的MSP-1₁₉(Burghaus & Holder，1994)。MSP-1₁₉ DNA序列的定点诱变是通过两种途径实现的。

第一种方法是Perrin & Gilliland(1990)方法的改进方法，这种方法是进行多聚酶链式反应(PCR)介导的位点特异性诱变。以质粒为模板，利用一段寡核苷酸从外部的MSP-1₁₉序列引入点突变和5′引物，这样对DNA进行扩增。扩增产物通过琼脂糖电泳进行纯化，随后利用质粒模板和从外部的MSP-119序列引入3′引物进行第二次扩增。第二次扩增产物通过限制性内切酶EcoRl和BamHl来消化，然后将由修饰MSP-1₁₉编码序列组成的产物插回到pGEX-3X中，这是的产物才用于转化DH5a细胞。

第二种方法使用的是Stratagene的QuikChange^TM定点诱变试剂盒。简单的讲，利用质粒pGEX-MSP-1₁₉作为模板，设计了两个含有所需要的定点突变的互补合成寡核苷酸引物，然后在酶Pfu DNA聚合酶存在下，利用温度循环使其在模板上延伸。通过这样引入寡核苷酸的方法就产生了在DNA修列上含有交错缺口的突变质粒。随着温度循环，将产物用DpnI核酸内切酶处理，这种酶将甲基化的DNA母链消化掉，但却不影响含有突变的新合成的DNA链。然后将结合有所需要的突变的DNA转化到大肠杆菌菌株DH5a感受态细胞中，在那里缺口被修复。

通过对限制性酶消化进行分析来筛选克隆，通过PCR筛选插入基因。按照使用指导，利用PerkinElmer Applied Biosystems ABI 377全自动测序仪来所确定特定突变体克隆的DNA序列。GST-MSP-1₁₉融合蛋白的表达

在大肠杆菌菌株TOPP 1(Stratagene)中，通过1mM异丙基-(β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；Melford Laboratories)对GST-MSP-1₁₉的表达进行1小时的诱变。然后通过离心来回收这些细胞，将细胞沉淀重新悬浮在细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl/1mM含有0.2％(v/v)Nonidet P40(NP40；BDH)的EDTA pH8.0)中。将溶解在异丙醇中的苯甲磺酰氯(PMSF；Sigma)添加到其中使其最终浓度为1mM。利用VibraCell超声波发生器(Sonics & Materials)，在50％的额定功率下对细胞悬浮物进行3分钟的超声波降解(6个30秒，每2个30秒之间由30秒的的间隔)。细胞裂解物在4℃下、65000xg离心1小时。含有可溶性GST-融合蛋白的上清液过谷胱甘肽-琼脂糖柱(Sigma)，用5mM的还原性谷胱甘肽洗提GST-融合蛋白。洗提出的谷胱甘肽-融合蛋白在4℃下的磷酸缓冲液(PBS)中进行充分的透析。SDS-PAGE和Western印迹

通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分析。在没有还原性物质的条件下，将样品溶解在SDS-PAGE缓冲液中，然后在12.5％的连续聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。标记物是Bio-Rad的、预先经过染色的低分子量标记物(24-102kDa)。如果需要，经SDS-PAGE分离的多肽可用考马斯亮蓝250(CBB；Sigma)进行染色，或者将其电泳转移到Optitran BA-S 83强化硝酸纤维素(Schleicher &；Schull，0.2um孔径)上来进行Western印迹分析。在室温下，利用在溶解在PBS(PBS-T)中的5％BSA和0.5％的 Tween20处理2小时以阻断印迹，然后用PBS-T冲洗。以第一个抗体为探针，在室温下与印迹杂交2小时，PBS-T冲洗3次，然后在室温下，在与绵羊抗鼠IgG(H+L)(ICN immunobiologicals)或山羊抗鼠IgM(u链)(Sigma)共轭的辣根过氧化物酶(HRP)的1/1000稀释液中培育1小时。然后用PBS-T将印迹冲洗3次，并且以Super SignalSubstrate(Pierce)作为HRP底物显色1分钟。随后将印迹放置在塑料包装纸中，对X-光胶片(XB-200.X-ograph影相体系)进行曝光。然后利用Agfa Gevamatic60胶片处理器(Aegfa)对此胶片进行处理。利用BIAcore分析仪对抗体-抗原相互作用进行分析

按照下述的方法，将含有野生型序列或多种修饰序列的GST-MSP-1₁₉包被到一个羧甲基右旋糖酐氢感受器芯片上。GST-MSP-1₁₉的结合是利用EDC/NHS化学法、经由氨基基团来完成的。利用氨基化合物偶连试剂盒(Pharmacia BlAcore)来进行固定化。利用50μl 200mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和5mM N-羟基琥珀酰胺(NHS)来活化10分钟。然后利用溶解在包被缓冲液(0.01M醋酸钠缓冲液，pH3.5)中的50μl浓度为100 ug ml^-1的溶液固定10分钟，使其偶连到BIAcore感受器表面。没有反应的羧基通过添加pH8.5的50μl 1M乙醇胺来阻断，时间为10分钟。用20μl pH2.8的10mM的甘氨酸-盐酸冲洗两次，总共8分钟，来去除没有共价结合的蛋白。整个固定化过程中的流速是5μl min^-1。抗原-抗体作用的测定是在BIAcore 2000分析仪上进行的。结果例1-共振排布，NMR限制和结构确定

对利用¹³C/¹⁶N均一标记的的蛋白进行了一系列的多维异核核糖核酸实验，从中得到了这些共振排布和NMR限制，这在材料与方法中已经有描述。3D和4D实验展示了与Lys35主链氨基化合物NH质子的NOE连接，其光谱解决的问题和明确赋予的值在图2中有示。用于最终结构集计算的距离限制、二面角限制和氢键限制在表1中总结。总共有570个明确赋值的距离限制，85个二面角限制，和10个氢键限制在最终组中选用。表A所示的排布和赋值已经提交给BioMagResBank数据库。在材料与方法描述的对NMR数据进行的初步计算基础之上，通过实验确定了每个结构域中的具有[1-3.2--4.5-6]模式的3个二硫键。他们也包括在经过精确化后的最终结果之中。利用强加在代表构件S_rep的主链上这些限制对最终的32个模型进行了计算和精确化。表1表明所有的这32个模型都具有良好的几何形状，并且与实验数据中的没有NOE违背＞0.5和也没有二面角违背＞5°很好的吻合。良好构建区的(残基15-64，74-92)主链原子的原子rmsd值是1.05(见表1)。在N-末端(直到Cys12)、在Glu65-Lys73环，以及随后的C-末端Cys92的局部主链的rmsd值最高。Ramachandran样方性质对于其他EGE结构来讲也是典型的。结构描述EGF结构域

通过PROCHECK-NMR对最终系综进行分析的结果表明正如对一个类似EGF折叠期望的那样，每个结构域中都含有主要为反平行β-折叠片的片段，这段片段含有每个结构域中的第3和第4个Cys残基。这与我们对一个类似EGF的折叠所期望的一样，另外在结构域-1的C-末端也含有额外的小反平行折叠片，这与一些(并非全部)EGF家族的成员相似。在图4中列出了这些次级结构的特征和二硫键模式。每个结构域中也含有一个已经确定的二型紧密转角，它含有一个在Tyr 34NH质子与Leu.31的羧基氧形成的氢键。在结构域-1中，在紧密转角处的正常保守EGF共有序列的Gly残基由具有正φ二面角的的残基(Asn33)取代，虽然这种情况下有保守的芳香族残基存在(Tyr34)。在Leu 3lNH质子和Asn15羧基氧之间估计有一个氢键存在。在主要的β-折叠之前，在结构域-2中含有两个转角(Asn53-Cys56，Asp57-Ala60)，从Leu86-Phe91开始有一个最后的弯曲，并且在Asp57 NH质子与Ile90或Gly89.羰基氧之间有一个氢键。虽然这个芳香族残基不是保守的，但暴露在表面的、从Pro81到Pro85之间的环替代了这个紧密转角。在主要的β-折叠末端的大环(Glu65-Lys73)相对无序，并且经过主链氨基化合物¹⁵N{¹H}异核NOE测定确定了Gly68-Gly71片段具有高活动性(Barbato et al.，1992)。对于在这些区域的残基，其异核NOE值显著降低。在N-末端：与其他的蛋白相比，具有相应于高活动性的低NOE强度。Pro45到Pro47的结构域间连接区与其他类似EGF的组件对是不同的。结构域-1中Cys30-Cys41间的二硫桥的构象，以及结构域-2中的三个Cys-Cys键都是右手螺旋的(Richardson，1981)。在Cys30-Cys41、Cys56-Cys76及Cys78-Cys92处的二硫桥尤其与血液凝集因子Xa结构(1hcg)中的同等区域接近。还没有对结构域-1相对无序的N-末端片段中的最开始的两个二硫桥进行确定。

通过fitpdb程序，与几种蛋白中EGF样结构域的典型示例相对照，图5展示了两种MSP-1 C-末端片段结构域主链的C、N、C_α等原子的排列。成对排序表明MSP-1的两个主要结构域更接近于因子Xa的结构，其与Clr的紧密关系比与检测过的其他结构的关系都要紧密。相对于因子Xa，MSP-1结构域的rsmd值可与那些有较远关系的结构原纤蛋白-1和转化生长因子-a相当。

虽然存在二者的EGF共有序列(C(5)xxGα)，其中此处的α是一个Phe或Tyr残基，之间有分歧，但在第五个Cys残基之后的转角基本相同，因此MSP结构域的整体折叠与一典型的EGF族成员是相似。就象非交换主链酰氨显示的，虽然一些外部环是无序的，但其骨架还是相当稳定的(细节见上文和Protein Data Bank/BioMagResBank提交的材料)。

与许多EGF结构域如原纤蛋白-1不同，MSP-1 C-末端片段缺少保守EGF Ca²⁺结合序列，现在也没有任何MSP-1 C-末端片段与Ca²⁺结合的证据。在有和没有20mM CaCI₂存在的情况下，2D¹H-NOESY光谱其实是完全相同的，这表明任何可能的结合对整体结构最多只有很小的影响。结构域接触面和表面

MSP-1 C-末端片段结构中最显著的特征是结构域间的接触面，它是由几个通过疏水相互作用连接在一起的非极性氨基酸(phe19，Leu31，Leu32，Leu86，phe87，Ile90和phe91)组成的。这些残基通过结构域-2中86-91个残基处的最后弯曲与结构域-1中的主要β-折叠和紧密转角的碱基相连接。与观察到的其他EGF结构域对的结构不同，结构域间的这种相互作用使得两个结构域形成了一种U形结构(Downing et al.，1996：Brandstetter et al.，1995)。例如，在原纤蛋白-1中，EGF结构域32和33之间的接触面在很大程度上通过一个共有的Ca²⁺连接位点形成的，整体结构象一个坚硬的杆，其C-末端和N-末端间隔很远。这与MSP-1形成了对比，后者的EGF样结构域相互紧密折叠，从而他们的末端相对较为靠近。原纤蛋白-1和MSP-1 EGF组件对之间的比较在图6中有示。虽然MSP-1的两个C-末端界际有些杂乱，但却观察到在两个末端的核之间有NOE接触。C-末端和N-末端位置的接近可能具有显著意义，因为这表明C-末端96个氨基酸片段组成的蛋白水解加工位点与在或接近96个残基的GPI膜结合位点是很接近的。这种接近性与膜结合疟原虫蛋白酶负责次级加工的观点相一致。

MSP-1 C-末端的静电势面在图7中的两个视图中有示。图7a中的表面是高度带电的，尤其是在突出环区23-27、35-40和64-66。图7b中的表面含有更多的中性、亲水残基和接近表面中心的Pro85-Phe87处的小疏水块。将来，这样的信息将有助于理解不同的面是怎样与其他MSP-1前体、进行加工的蛋白酶、在裂殖子表面的其他蛋白或红血球表面的其他靶、或液泡膜表面寄生虫进行相互作用的。一级保守序列

图1显示了包含在恶性疟原虫疏水结构域接触面上的氨基酸残基，也显示了在较弱毒的人疟疾寄生虫P.Vivax的MSP-1上的相应氨基酸残基(Del Portillo et al.，1991：Gibson et al..1992)。接触面残基的广泛保守性(具有保守替代)表明P.Vivax和其他疟原虫中可能相似的U形EGF组件对排列。P.Vivax的另外一个特征就是在第一个EGF样结构域中单个的二硫键缺乏，这种现象也可在其他疟原虫种中见到，这是由缺乏与恶性疟原虫Cys12和Cys28等价的的半胱氨酸残基。P.falciparum的二态位点

已经从不同P.falciparum分离物的MSP-1₁₉ C-末端片段中观察到5个二态位点(Qari et al.，1998)。关于这些位点在MSP-1结构上的位置已经做了多次观察。两个位点Gln14/Glu14和Lys61/Thr61在暴露于表面的亲水或带电侧链上，它涉及到构建相对良好的区的残基。一对含有变体序列Asn70-Gly71/Ser70-Arg71的相邻位点出现在结构域-2的无序环区，已经证明它所在的片段(残基68-71)具有高度的活动性。从Glu65到Lys73这个区似乎是不同疟原虫种的最可变区(Daly et al.，1992；Holder et al.，1992)。最后，第五个位点在疏水残基间有替代作用(Leu86/Phe86)。这个部分暴露的侧链位于疏水结构域接触面上，这个保守替代与其在这种相互作用中的任务相一致。例2-突变和单克隆抗体结合研究

作为迈向理解抗体与MSP-1C-末端相互作用的第一步，我们研究了工程点突变(在结构域-1中)对抗体结合的影响。进行了由基团改变组成的氨基酸替代作用。这些集团改变包括，例如，一种带电极性残基替代了脂肪族残基、一种负电荷侧链替代了正电荷侧链、带有小的或没有侧链的氨基酸(甘氨酸)替代了带有大侧链的氨基酸、、带电极性氨基酸替代了极性氨基酸、芳香族氨基酸替代了极性氨基酸、带有小侧链的氨基酸替代了大的芳香族氨基酸、以及替代二硫键中的半胱氨酸残基。

图8中显示了8个单独氨基酸的替代作用，每种替代作用完全破坏了一或多种mAbs与突变体片段的结合，这是通过Western印迹检测到的。用青色表示的Glu26突变与在Asnl的N-末端蛋白水解加工位点(红紫色)最接近，也是这组便突变里面唯一的一个可影响加工抑制抗体结合的突变，也即一个能够防止对体外红血球入侵和对MSP-1前体蛋白水解加工的突变。其他三种突变能破坏阻断性抗体与原始C-末端片段的结合，并且干扰加工抑制性抗体的结合。

在免疫化学分析和分子三级结构基础之上进行了额外的诱变，通过Western印迹和BIAcore分析来估定mAbs的结合。在表2中有结果总结。通过Western印迹检测选出的mAbs与修饰蛋白的结合，结果自如图9所示，通过BIAcore进行分析的结果如图10所示。有的单个氨基酸改变对任何检测的mAbs的结合没有影响(例如Leu22用Arg替代)。其他的替代作用影响了一或多个mAbs的结合。

尤其有趣的是那些可防止阻断性抗体的结合、但又不影响抑制性抗体的结合的改变。例如，利用Arg替代了Asn15防止了mAb 7.5的结合，利用Tyr替代Glu27防止了mAb 2.2的结合，利用Arg替代Leu31防止了mAb IEl的结合，利用Ser替代Tyr34防止了mAb 7.5的结合，利用Leu替代Glu43防止了mAb 111.4的结合。

在单独的蛋白中可进行几种替代作用的结合，这些组合可防止阻断性抗体的结合但又不影响抑制性抗体的结合(见图2和图11)。首先是GIu27→Tyr.Leu31→Arg及Glu43→Leu之间结合使用，其次是GIu27→Tyr.Leu31→Arg.Tyr34→Ser及Glu43→Leu之间结合使用，第三是Asn15→Arg，GIu27→Tyr，Leu31→Arg及Glu43→Leu结合使用。这些修饰蛋白中没有一种与一种阻断性抗体结合，但继续与抑制性抗体进行结合，我们认为突变体蛋白诱导了一种多克隆反应，这种多克隆反应比野生型蛋白诱导的多克隆反应更具抑制性。

修饰的重组蛋白也可用于利用亲和力从收集的血清中来选择抗体，这些血清是从遭受疟疾的人身上取得的。我们推测修饰蛋白会比野生型蛋白选择较少的阻断性抗体，因此这些选出的抗体在体外抑制寄生虫侵入和次级加工方面更有效。

在啮齿目动物、灵长目动物以及P.Vivax的疟疾寄生虫MSP-1第一个EGF样结构域中没有半胱氨酸2和4。我们已经将恶性疟原虫蛋白中的半胱氨酸对(Cys12 and Cys28)替代掉了。这看来对抑制性抗体的结合没有任何影响，但它确实破坏了阻断性抗体mAb 2.2的结合。我们认为其他疟疾寄生虫的蛋白具有更高的免疫原性的一个原因是T细胞识别更有效，或者通过抗原加工细胞进行的加工是利用了另外一种不同的降解途径，使得抗体反应良好的特异性朝向一个更加高产的方向(见示例，Egan et al.，1997)。去除半胱氨酸对可提高修饰蛋白的免疫原性，这要通过检测在没有这两个半胱氨酸存在下的恶性疟原虫蛋白诱导的抗体的水平和检测野生型蛋白诱导的抗体的水平来进行评估。

表2-氨基酸序列改变的定位以及它们对单克隆抗体结合的影响

位置	氨基酸		单克隆抗体结合
位置	氨基酸		单克隆抗体结合																野生型	变体	12.8	12.10	5B1	1E1	2.2	7.5	111.4	111.2	9C8	2F10	12D11	117.2	5.2	1E8	8A12
6	Glu	Ile	++	++	++	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++	++		野生型	变体	12.8	12.10	5B1	1E1	2.2	7.5	111.4	111.2	9C8	2F10	12D11	117.2	5.2	1E8	8A12
6	Glu	Ile	++	++	++	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++	++	14	Glu	Gly	++	++	++	++	++	+	+	++	++	++	++	+	++	++	++
14	Glu	Arg	++	++	++	++	++	+	+	++	+	++	++	+	++	++	++	14	Glu	Gly	++	++	++	++	++	+	+	++	++	++	++	+	++	++	++
14	Glu	Arg	++	++	++	++	++	+	+	++	+	++	++	+	++	++	++	15	Asn	Arg	++	++	++	++	++	-	+	++	++	++	++	++	++	++	++
20	Arg	Glu	+	++	+	++	++	+	++	+	+	++	+	+	++	+	++	15	Asn	Arg	++	++	++	++	++	-	+	++	++	++	++	++	++	++	++
20	Arg	Glu	+	++	+	++	++	+	++	+	+	++	+	+	++	+	++	22	Leu	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++
24	Glu	Lys	+	++	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	+	++	22	Leu	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++
24	Glu	Lys	+	++	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	+	++	25	Asg	Gly	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++	++	+	++
26	Glu	Ile	-	++	+	++	-	++	++	++	++	++	++	++	+	+	+	25	Asg	Gly	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++	++	+	++
26	Glu	Ile	-	++	+	++	-	++	++	++	++	++	++	++	+	+	+	27	Glu	Tyr	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	++	++	++	++	+
29	Lys	Ser	+	++	++	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++	++	27	Glu	Tyr	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	++	++	++	++	+
29	Lys	Ser	+	++	++	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++	++	31	Leu	Arg	+	++	++	-	++	++	++	-	-	++	++	++	++	++	+
32	Leu	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	31	Leu	Arg	+	++	++	-	++	++	++	-	-	++	++	++	++	++	+
32	Leu	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	33	Asn	Ile	++	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++
34	Tyr	Ser	++	++	++	+	+	+	+	++	+	++	+	+	++	++	++	33	Asn	Ile	++	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++
34	Tyr	Ser	++	++	++	+	+	+	+	++	+	++	+	+	++	++	++	34	Tyr	Ile	++	++	++	+	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++
35	Lys	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	34	Tyr	Ile	++	++	++	+	++	+	+	++	++	++	++	++	++	++	++
35	Lys	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	36	Glu	Gly	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++
37	Glu	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	36	Glu	Gly	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++
37	Glu	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	39	Asp	Thr	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++	++
40	Lys	Ile	+	++	+	+	++	++	+	+	+	+	+	+	++	+	++	39	Asp	Thr	++	++	++	++	++	++	+	++	++	++	++	++	++	++	++
40	Lys	Ile	+	++	+	+	++	++	+	+	+	+	+	+	++	+	++	43	Glu	Leu	++	++	++	+	++	+	-	++	+	++	+	+	++	++	+
48	Thr	Lys	++	++	++	++	++	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	43	Glu	Leu	++	++	++	+	++	+	-	++	+	++	+	+	++	++	+
48	Thr	Lys	++	++	++	++	++	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	53	Asn	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	-	-	+	++	++	++
80	Lys	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	53	Asn	Arg	++	++	++	++	++	++	++	++	++	-	-	+	++	++	++
80	Lys	Ile	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	Wild type			++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++	++

++＝强结合，+＝结合，-＝不结合

表2(续)

位置	氨基酸		单克隆抗体结合
位置	氨基酸		单克隆抗体结合															Combimatloms	野生型	变体	12.8	12.10	5B1	1E1	2.2	7.5	111.4	111.2	9C8	2F10	12D11	117.2	5.2	1E8	8A12
12+28	CysCys	IleTrp	++	++	++	++	-	++	++	+	+	++	++	+	-	++	++	Combimatloms	野生型	变体	12.8	12.10	5B1	1E1	2.2	7.5	111.4	111.2	9C8	2F10	12D11	117.2	5.2	1E8	8A12
12+28	CysCys	IleTrp	++	++	++	++	-	++	++	+	+	++	++	+	-	++	++	12+28	CysCys	AlaPhe	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	++	++	-	++	++
14+18	GlnCys	GlyTyr	-	+	-	-	-	-	-		-	+	+					12+28	CysCys	AlaPhe	++	++	++	++	-	++	++	++	++	++	++	++	-	++	++
14+18	GlnCys	GlyTyr	-	+	-	-	-	-	-		-	+	+					14+18	GlnCys	ArgTyr	-	-	-	-	-	-	-		-	+	+
34+39	TyrAsp	SerAsn	++	++	++	+	+	+	+	++	++	++	++	++	+	++	++	14+18	GlnCys	ArgTyr	-	-	-	-	-	-	-		-	+	+
34+39	TyrAsp	SerAsn	++	++	++	+	+	+	+	++	++	++	++	++	+	++	++	43+48	GluThr	LeuIlu	++	++	++	+	+	+	-	-	+	-	+	+	++	++	+
43+48	GluThr	LeuAsn	++	++	++	++	++	+	-	++	++	+	++	++	++	++	++	43+48	GluThr	LeuIlu	++	++	++	+	+	+	-	-	+	-	+	+	++	++	+
43+48	GluThr	LeuAsn	++	++	++	++	++	+	-	++	++	+	++	++	++	++	++	47+48	ProThr	SerLys	+	+	+	+	+	+	+		+	-	+
27+31+43	GluLeuGlu	TyrArgLeu	++	++	++	-	-	+	-	-	-	++	++	+	++	+	+	47+48	ProThr	SerLys	+	+	+	+	+	+	+		+	-	+
27+31+43	GluLeuGlu	TyrArgLeu	++	++	++	-	-	+	-	-	-	++	++	+	++	+	+	27+31+34+43	GluLeuTyrGlu	TyrArgSerLeu	++	++	++	-	-	-	-	-	-	++	++	+	++	+	++
15+27+31+43	AsnGluLeuGlu	ArgTyrArgLeu	++	++	++	-	-	-	-	-	-	++	++	+	++	+	++	27+31+34+43	GluLeuTyrGlu	TyrArgSerLeu	++	++	++	-	-	-	-	-	-	++	++	+	++	+	++
15+27+31+43	AsnGluLeuGlu	ArgTyrArgLeu	++	++	++	-	-	-	-	-	-	++	++	+	++	+	++	12+15+27+31+43	CysAsnGluLeuGlu	IleArgTyrArgLeu	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	++	-	-	-	++

++＝强结合，+＝结合，-＝不结合

表A##13-10-98#裂殖子表面蛋白-1(MSP-1) Plasmodium falciparum(C-末端片段)#参考： ¹H：DSS＝0.000 二氧六环＝3.755(内部)# ¹⁵N：间接# ¹³C：间接#25C pH6.5 50mM NaPO4 100mM NaCl 90％H2O/10％D2O#--FORMAT--#输入的最初序列是：##The original sequence entered was：#NISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSSSN##在NMR-STAR中表达后，这个序列为：_Mol_residue_sequence；NISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSSSN；环-

_Residue_seq_code

_Residue_author_seq_code

_Residue_label1 @ ASN 2 @ ILE 3 @ SER 4 @ GLN 5 @ HIS6 @ GLN 7 @ CYS 8 @ VAL 9 @ LYS 10 @ LYS11 @ GLN 12 @ CYS 13 @ PRO 14 @ GLN 15 @ ASN16 @ SER 17 @ GLY 18 @ CYS 19 @ PHE 20 @ ARG21 @ HIS 22 @ LEU 23 @ ASP 24 @ GLU 25 @ ARG26 @ GLU 27 @ GLU 28 @ CYS 29 @ LYS 30 @ CYS31 @ LEU 32 @ LEU 33 @ ASN 34 @ TYR 35 @ LYS36 @ GLN 37 @ GLU 38 @ GLY 39 @ ASP 40 @ LYS41 @ CYS 42 @ VAL 43 @ GLU 44 @ ASN 45 @ PRO46 @ ASN 47 @ PRO 48 @ THR 49 @ CYS 50 @ ASN51 @ GLU 52 @ ASN 53 @ ASN 54 @ GLY 55 @ GLY56 @ CYS 57 @ ASP 58 @ ALA 59 @ ASP 60 @ ALA61 @ LYS 62 @ CYS 63 @ THR 64 @ GLU 65 @ GLU66 @ ASP 67 @ SER 68 @ GLY 69 @ SER 70 @ ASN71 @ GLY 72 @ LYS 73 @ LYS 74 @ ILE 75 @ THR76 @ CYS 77 @ GLU 78 @ CYS 79 @ THR 80 @ LYS81 @ PRO 82 @ ASP 83 @ SER 84 @ TYR 85 @ PRO86 @ LEU 87 @ PHE 88 @ ASP 89 @ GLY 90 @ ILE91 @ PHE 92 @ CYS 93 @ SER 94 @ SER 95 @ SER96 @ ASNstop_

##########################################################

# 化学漂移下明确编码定义 #

# #

# 编码定义 #

# #

# 1 唯一 #

# 2 偕原子不明确或偕甲基质子基团不明确 #

# #

# 3 环对应端的芳香族原子(如Tyr HE1和HE2质子)

# #

# 4 残基内不明确，(e.g.Lys HG和HD质子) #

# #

# 5 残基内不明确，(Lys 12vs.Lsy27) #

# 9 模糊的，特异的不明确未指出 #

# #

###########################################################使用说明#1)用适当的值替代@符号#2)在文章中有对这些排布的文字说明#3)如果需要可任意在此表中添加或删除行#行序号(-原子-漂移-排布-ID值)将由BMRB来重新赋值##本序列选取的原子表如下：

环_

_Atom_shift_assign_ID

_Residue_seq_code

_Residue_labet

_Atom_name

_Atom_type

_Chem_shift_value

_Chem_shift_value_error

_Chem_shift_ambiguity_code#表A1.增补表：MSP-1 C-末端片段的1H，13C和15N化学漂移排布原子漂移残基序号残基名称原子名称原子类型漂移/ 误差/ 不明确编号排布 ppm ppm1 1 ASN H H 8.29 0.02 12 1 ASN HA H 4.60 0.02 13 1 ASN HB2 H 2.86 0.02 24 1 ASN HB3 H 2.75 0.02 25 1 ASN HD21 H ？？？6 1 ASN HD22 H ？？？7 1 ASN C C ？？？8 1 ASN CA C 55.5 0.6 19 1 ASN CB C 40.9 0.6 111 1 ASN N N 125.8 0.3 112 1 ASN ND2 N ？？？13 1 ILE H H 8.29 0.02 114 2 ILE HA H 4.25 0.02 115 2 ILE HB H 1.97 0.02 116 2 ILE HG12 H 1.39 0.02 217 2. ILE HG13 H 1.19 0.02 218 2 ILE HG2 H 0.92 0.02 119 2 ILE HD1 H 0.81 0.02 120 2 ILE C C 173.8 0.6 121 2 ILE CA C 62.2 0.6 122 2 ILE CB C 38.7 0.6 123 2 ILE CG1 C 27.5 0.6 124 2 ILE CG2 C 18.2 0.6 125 2 ILE CD1 C 13.7 0.6 126 2 ILE N N 121.1 0.3 127 3 SER H H 8.47 0.02 128 3 SER HA H 4.20 0.02 129 3 SER HB2 H 3.90 0.02 130 3 SER HB3 H 3.90 0.02 132 3 SER C C ？？？33 3 SER CA C 60.9 0.6 134 3 SER CB C 63.3 0.6 135 3 SER N N 119.3 0.3 136 4 GLN H H 8.32 0.02 137 4 GLN HA H 4.02 0.02 138 4 GLN HB2 H 1.88 0.02 139 4 GLN HB3 H 1.88 0.02 140 4 GLN HG2 H 1.75 0.02 141 4 GLN HG3 H 1.75 0.02 142 4 GLN HE21 H ？？？43 4 GLN HE22 H ？？？44 4 GLN C C ？？？45 4 GLN CA C 57.7 0.6 146 4 GLN CB C 27.9 0.6 147 4 GLN CG C 32.7 0.6 149 4 GLN N N 121.6 0.3 150 4 GLN NE2 N ？？？51 5 HIS H H 7.76 0.02 952 5 HIS HA H 5.09 0.02 153 5 HIS HB2 H 2.70 0.02 154 5 HIS HB3 H 2.70 0.02 156 5 HIS HD2 H 6.87 0.02 157 5 HIS HE1 H 7.92 0.02 159 5 HIS C C 175.7 0.6 160 5 HIS CA C 54.8 0.6 161 5 HIS CB C 29.2 0.6 165 5 HIS N N 113.6 0.3 968 6 GLN H H 7.42 0.02 969 6 GLN HA H 4.43 0.02 170 6 GLN HB2 H 2.05 0.02 171 6 GLN HB3 H 2.05 0.02 172 6 GLN HG2 H 2.42 0.02 173 6 GLN HG3 H 2.42 0.02 174 6 GLN HE21 H 7.59 0.02 575 6 GLN HE22 H 6.92 0.02 576 6 GLN C C 175.7 0.6 177 6 GLN CA C 55.1 0.6 178 6 GLN CB C 28.8 0.6 179 6 GLN CG C 33.8 0.6 181 6 GLN N N 122.5 0.3 982 6 GLN NE2 N 112.6 0.3 583 7 CYS H H 9.18 0.02 184 7 CYS HA H 4.09 0.02 185 7 CYS HB2 H 3.31 0.02 286 7 CYS HB3 H 3.11 0.02 288 7 CYS C C 174.4 0.6 189 7 CYS CA C 56.6 0.6 190 7 CYS CB C 42.3 0.6 191 7 CYS N N 124.5 0.3 192 8 VAL H H 10.42 0.02 193 8 VAL HA H 4.33 0.02 194 8 VAL HB H 2.15 0.02 195 8 VAL HG1 H 0.84 0.02 296 8 VAL HG2 H 0.82 0.02 297 8 VAL C C 176.6 0.6 198 8 VAL CA C 62.5 0.6 199 8 VAL CB C 34.4 0.6 1100 8 VAL CG1 C 21.5 0.6 2101 8 VAL CG2 C 19.7 0.6 2102 8 VAL N N 119.1 0.3 1103 9 LYS H H 9.42 0.02 1104 9 LYS HA H 4.51 0.02 1105 9 LYS HB2 H 1.81 0.02 4106 9 LYS HB3 H 1.81 0.02 4107 9 LYS HG2 H 1.41 0.02 4108 9 LYS HG3 H 1.41 0.02 4109 9 LYS 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HE2 H 6.69 0.02 11022 84 TYR C C ？？？1023 84 TYR CA C 54.6 0.6 11024 84 TYR CB C 39.7 0.6 11031 84 TYR N N 122.2 0.3 11032 85 PRO HA H 5.09 0.02 11033 85 PRO HB2 H 2.25 0.02 21034 85 PRO HB3 H 1.72 0.02 21035 85 PRO HG2 H 2.22 0.02 11036 85 PRO HG3 H 2.22 0.02 11037 85 PRO HD2 H 3.85 0.02 11038 85 PRO HD3 H 3.85 0.02 11039 85 PRO C C 176.9 0.6 11040 85 PRO CA C 62.9 0.6 11041 85 PRO CB C 32.8 0.6 11042 85 PRO CG C 27.3 0.6 11043 85 PRO CD C 50.6 0.6 11045 86 LEU H H 8.51 0.02 11046 86 LEU HA H 4.77 0.02 11047 86 LEU HB2 H 1.76 0.02 11048 86 LEU HB3 H 1.76 0.02 11049 86 LEU HG H 1.85 0.02 11050 86 LEU HD1 H 1.00 0.02 11051 86 LEU HD2 H 1.00 0.02 11052 86 LEU C C 177.9 0.6 11053 86 LEU CA C 54.5 0.6 11054 86 LEU CB C 44.8 0.6 11055 86 LEU CG C 29.0 0.6 11056 86 LEU CD1 C 25.7 0.6 11057 86 LEU CD2 C 25.7 0.6 11058 86 LEU N N 120.2 0.3 11059 87 PHE H H 9.29 0.02 11060 87 PHE HA H 4.16 0.02 11061 87 PHE HB2 H 3.26 0.02 21062 87 PHE HB3 H 3.19 0.02 21063 87 PHE HD1 H 7.31 0.02 11064 87 PHE HD2 H 7.31 0.02 11065 87 PHE HE1 H 7.70 0.02 11066 87 PHE HE2 H 7.70 0.02 11067 87 PHE HZ H 7.67 0.02 11068 87 PHE C C 176.4 0.6 11069 87 PHE CA C 59.3 0.6 11070 87 PHE CB C 36.9 0.6 11077 87 PHE N N 122.6 0.3 11078 88 ASP H H 8.93 0.02 11079 88 ASP HA H 4.33 0.02 11080 88 ASP HB2 H 3.11 0.02 21081 88 ASP HB3 H 3.02 0.02 21082 88 ASP C C 175.2 0.6 11083 88 ASP CA C 56.3 0.6 11084 88 ASP CB C 39.9 0.6 11086 88 ASP N N 111.3 0.3 11087 89 GLY H H 7.87 0.02 11088 89 GLY HA2 H 3.48 0.02 11089 89 GLY HA3 H 4.08 0.02 11090 89 GLY C C 174.7 0.6 11091 89 GLY CA C 46.0 0.6 11092 89 GLY N N 102.0 0.3 11093 90 ILE H H 7.17 0.02 11094 90 ILE HA H 4.39 0.02 11095 90 ILE HB H 1.52 0.02 11096 90 ILE HG12 H 0.65 0.02 21097 90 ILE HG13 H 0.65 0.02 21098 90 ILE HG2 H 1.05 0.02 11099 90 ILE HD1 H 0.51 0.02 11100 90 ILE C C 175.1 0.6 11101 90 ILE CA C 64.2 0.6 11102 90 ILE CB C 35.9 0.6 11103 90 ILE CG1 C 25.5 0.6 11104 90 ILE CG2 C 16.9 0.6 11105 90 ILE CD1 C 14.9 0.6 11106 90 ILE N N 113.3 0.3 11107 91 PHE H H 7.43 0.02 11108 91 PHE HA H 5.15 0.02 11109 91 PHE HB2 H 2.40 0.02 11110 91 PHE HB3 H 2.40 0.02 11111 91 PHE HD1 H 7.00 0.02 11112 91 PHE HD2 H 7.00 0.02 11113 91 PHE HE1 H 6.95 0.02 11114 91 PHE HE2 H 6.95 0.02 11115 91 PHE HZ H 7.06 0.02 11116 91 PHE C C 175.1 0.6 11117 91 PHE CA C 56.5 0.6 11118 91 PHE CB C 44.3 0.6 11125 91 PHE N N 114.0 0.3 11126 92 CYS H H 7.86 0.02 11127 92 CYS HA H 5.18 0.02 11128 92 CYS HB2 H 2.57 0.02 11129 92 CYS HB3 H 3.08 0.02 11131 92 CYS C C 174.1 0.6 11132 92 CYS CA C 54.1 0.6 11133 92 CYS CB C 44.7 0.6 11134 92 CYS N N 119.0 0.3 11135 93 SER H H 9.26 0.02 11136 93 SER HA H 4.23 0.02 11137 93 SER HB2 H 3.90 0.02 11138 93 SER HB3 H 3.90 0.02 11140 93 SER C C ？？？1141 93 SER CA C 60.4 0.6 11142 93 SER CB C 63.7 0.6 11143 93 SER N N 118.3 0.3 11144 94 SER H H 8.04 0.02 11145 94 SER HA H 4.59 0.02 11146 94 SER HB2 H 3.91 0.02 11147 94 SER HB3 H 3.91 0.02 11149 94 SER C C ？？？1150 94 SER CA C 58.7 0.6 11151 94 SER CB C 64.0 0.6 11152 94 SER N N 114.2 0.3 11153 95 SER H H ？？？1154 95 SER HA H 4.71 0.02 11155 95 SER HB2 H 402 0.02 21156 95 SER HB3 H 3.94 0.02 21158 95 SER C C ？？？1159 95 SER CA C 58.4 0.6 11160 95 SER CB C 64.5 0.6 11161 95 SER N N ？？？1162 96 ASN H H ？？？1163 96 ASN HA H 4.61 0.02 11164 96 ASN HB2 H 2.75 0.02 21165 96 ASN HB3 H 2.60 0.02 21166 96 ASN HD21 H ？？？1167 96 ASN HD22 H ？？？1168 96 ASN C C ？？？1169 96 ASN CA C 54.3 0.6 11170 96 ASN CB C 41.8 0.6 11172 96 ASN N N ？？？1173 96 ASN ND2 N ？？？stop_

#下列环是用来定义原子漂移排布组ID的，而这些ID代表了与取自上述化学漂移赋值表有关的不明确排布，。此组中的每个组分应该用逗号来隔开，就象下面示例中所示的那样，并且每个化学漂移排布都有一个排布ID，这些ID已经被赋予了不明确编号4或5。每组排布表明观察到的化学漂移与定义的原子相关，但没有对组中的特定原子赋予明确的值。

loop_

_Atom_shift_assign_ID_ambiguity

#

# Sets of Atom-shift Assignment Ambiguities

#

# -------------------------------

#Example：5，4，7

#

@

stop_################################################################################### ---- 备注 ---- #################################################################################### # # # # # # # ### 保护的主链酰胺基团# (SLOWLY EXCHANGING IN D2O)FOR RESIDUES：# GLY17，PHE19，GLU27，LYS29，LEU31，# TYR34，LYS35，VAL42，CYS56，ASP57，# ALA60，LYS61，THR63，THR75，GLU77，# LEU86，GLY89，ILE90，PHE91## BROAD HN SIGNALS IN[15-N]-HSQC OBSERVED FOR RESIDUES：# VAL8，LYS9，LYS10，CYS18，ARG20## TWO BACKBONE HN CROSSPEAKS OBSERVED FOR RESIDUES：# HIS 5：7.78，113.8/7.74，113.5# GLN 6：7.44，122.6/7.40，122.4##TWO AVERAGED NH^*/HH^*SIGNALS OBSERVED FOR RESIDUES：# ARG20，ARG25：NOT SPECIFICALLY ASSIGNED# TO INDIVIDUAL ARGININES## LYS29 NZ/HZ^*SIGNAL：TENTATIVELY ASSIGNED TO# LYS29(BURIED LYSINE SIDE CHAIN)# BASED ON GREATER PROTECTION FROM H2O EXCHANGE# THAN OTHER LYSINE NZ/HZ^*SIGNALS## 天门冬酰胺侧链酰胺基团信号：# PROBABLE OVERLAPPING CROSSPEAKS～112PPM[¹⁵N]# FOR ASN1，ASN70，ASN96#################################################################################### ##################################################################################表A2.增补表：NMR实验详述实验维核 Complex 光谱宽获得时间载体频率仪器¹H频率溶剂温度大小数字区分混合时间总时间

Points 最终数据辨率

[after LP]

(points) (Hz) (ms) (ppm) (MHz) (C) (points) (Hz/ (ms) (hr)

point)2D NOESY

t1 ¹H 400 8000 50 4.74 600 D2O 25 1024 7.8 75-150 22

t2 ¹H 2048 8000 256 4.74 2048 3.92D NOESY

t1 ¹H 360 8000 45 4.74 600 H2O 25 1024 7.8 75 23

t2 ¹H 2048 8000 256 4.74 2048 3.92D ROESY

t1 ¹H 260 6000 43 4.74 500 D2O 25 1024 5.9 60 16

t2 ¹H 2048 6000 341 4.74 2048 2.92D ROESY

t1 ¹H 360 7000 54 4.74 500 H2O 25 1024 6.8 60 62

t2 ¹H 2048 7000 293 4.74 2048 3.43D[¹⁵N]-NOESY-HSQ

t1 ¹⁵N 36[64] 2500 14.4 121.5 500 H2O 25 128 19.5 125 64

t2 ¹H 180 7000 26 4.74 512 13.7

t3 ¹H 512 7000 73 4.74 512 13.73D[¹⁵N]-ROESY-HSQC

t1 ¹⁵N 32 2500 12.8 121.5 500 H2O 25 128 19.5 60 87

t2 ¹H 180 7000 26 4.74 512 13.7

t3 ¹H 512 7000 73 4.74 512 13.73D[¹³C]-HMQC-NOESY

t1 ¹H 160 7200 22 4.74 600 D2O 25 512 14.1 125 89

t2 ¹³C 96 10000 9.6 41.0 256 39.1

t3 ¹H 384 7200 53 4.74 1024 7.04D[13C]-HMQC-NOESY-[13C]-HSQC

t1 ¹³C 18[24] 3360 5.4 40.2 600 D2O 25 64 52.5 125 105

t2 ¹H 74 3600 21 3.00 256 14.1

t3 ¹³C 18[24] 3360 5.4 40.2 64 52.5

t4 ¹H 256 4500 57 3.00 256 17.6 实验维核 Complex 光谱宽获得时间载体频率仪器¹H频率溶剂温度大小数字区分混合时间总时间{Reference} Points 最终数据辨率

[after LP]

(points) (Hz) (ms) (ppm) (MHz) (℃) (points) (Hz/point) (ms) (hr)4D[¹³C]-HMQC-NOESY-[¹⁵N]-HSQC

t1 ¹³C 14[24] 3360 4.2 40.2 600 H₂O 25 64 52.5 125 96

t2 ¹H 56 3600 15.6 3.00 128 28.1

t3 ¹⁵N 14[24] 1800 7.8 118.9 64 28.1

t4 ¹H 256 7400 34.6 4.74 256 29.02D DQF-COSY

t1 ¹H 1000 6000 167 4.74 500 D₂O 25 4096 1.5 31

t2 ¹H 2048 6000 341 4.74 8192 0.73D HNHA

t1 ¹⁵N 35 2500 14 121.5 500 H₂O 25 128 19.5 41

t2 ¹H 80 3500 23 4.74 256 13.7

t3 ¹H 512 7000 73 4.74 512 13.73D HNHB

t1 ¹⁵N 24[48] 2500 9.6 119.1 600 H₂O 25 128 19.5 60

t2 ¹H 90 8000 11.3 4.74 256 31.3

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 1024 7.83D HN(CO)HB

t1 ¹⁵N 28[48] 1800 156 118.9 600 H₂O 25 128 14.1 108

t2 ¹H 128 8000 16 4.74 512 15.6

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 512 15.62D[¹⁵N]-[¹³Cγ] Spin-echo HSQC

t1 ¹⁵N 80 1800 44.4 118.9 600 H₂O 25 256 7.0 13

t2 ¹H 1312 8000 149 4.74 2048 3.92D[¹³C]-[¹³Cγ]Spin-echo HSQC

t1 ¹⁵N 78 1800 43.3 118.9 600 H₂O 25 256 7.0 26

t2 ¹H 1216 8000 152 4.74 2048 3.93D LRCH

t1 ¹³C 34 3017 11.3 17.9 600 D₂O 25 256 11.8 84

t2 ¹H 57 4800 11.9 2.25 256 18.8

13 ¹H 384 4000 96 2.25 1024 3.9实验维核 Complex 光谱宽获得时间载体频率仪器¹H频率溶剂温度大小数字区分混合时间总时间{Reference} Points 最终数据辨率

[after LP]

(points) (Hz) (ms) (ppm) (MHz) (℃) (points)(Hz/point) (ms) (hr)2D TOCSY

t1 ¹H 360 8000 45 4.74 600 H₂O 25 1024 7.8 66 18

t2 ¹H 2048 8000 256 4.74 2048 3.92D[¹⁵N]-HSQC

t1 ¹⁵N 360 4400 82 119.6 600 H₂O 25 2048 2.1 14

t2 ¹H 1216 8000 152 4.74 4096 2.02D[¹³C]-HSQC

t1 ¹³C 400 12000 33.3 41.3 600 H₂O 25 1024 11.7 2.7

t2 ¹H 1216 8000 152 4.74 4096 203D[¹⁵N]-TOCSY-HSQ

t1 ¹⁵N 38[64] 2500 15.2 119.0 600 H₂O 25 128 19.5 56 43

t2 ¹H 180 8000 22.5 4.74 512 15.6

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 512 15.63D HCCH-TOCSY

t1 ¹H 134 5500 24.4 4.74 500 D₂O 25 512 10.7 17 65

t2 ¹³C 128 8049 15.9 41.9 512 15.7

t3 ¹H 416 5500 76 4.74 512 10.73D CBCA(CO)NH

t1 ¹³C 38[64] 10000 3.8 41.3 600 H₂O 25 128 78.1 21

t2 ¹⁵N 26[36] 1800 14.4 118.9 128 14.1

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 512 15.63D CBCANH

t1 ¹³C 63[128] 10000 6.3 41.3 600 H₂O 25 512 19.5 5

t2 ¹⁵N 26[52] 1800 14.4 118.9 128 14.1

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 256 31.33D HNCO

t1 ¹⁵N 32[48] 1800 17.8 118.9 600 H₂O 25 128 14.1 43

t2 ¹³C 64 1811 35.3 176.0 256 7.1

t3 ¹H 512 8000 64 4.74 512 15.6

表B！裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)P.falclparum C-末端片段！X-PLOR format！09-11-98！---noes+roes--approximate--570 total！发程 135！中程 30！序列 222！残基内 73！氢效率 10(20 restraints)！pseudoatom corrections not used--for R-6 averaging/summation！AVERAGING：！class rt6s SUM！class nsam SUM！class sing！class hbnd！types：！ arom_ aromatic pair！ meth_ methyl！ dgnm_ degenerate methylene！ nsam_ non-stereospecifically-assigned methylene！ sing_ single proton！ _l long-range (j-i＞4)！ _m medium-range (j-i＝2-4)！ _s sequential (j-i＝1)！ _i intraresidue！ hbnd hydrogen_bonds！ <residue-atom 1> <residue-atom 2> <dist-minus-plus><type>class rt6sassign(resid 5 and name hb#) (resid 19 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 5 and name hb#) (resid 19 and name he#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 15 and name ha) (resid 34 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 15 and name ha) (resid 34 and name he#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 17 and name ha#) (resid 87 and name hd#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 17 and name ha#) (resid 87 and name he#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name hd#) (resid 20 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！arom_sassign(resid 19 and name hd#) (resid 21 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！arom_sassign(resid 19 and name hd#) (resid 21 and name hd2) 3.6 3.6 0.0 ！arom_massign(resid 19 and name hd#) (resid 22 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_massign(resid 19 and name hd#) (resid 86 and name hg) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name hd#) (resid 91 and name hb#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name hd#) (resid 91 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name hd#) (resid 91 and name he#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name he#) (resid 21 and name hd2) 5.5 5.5 0.0 ！arom_massign(resid 19 and name he#) (resid 22 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_massign(resid 19 and namehe#) (resid 86 and name hg) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name he#) (resid 91 and name hb#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 19 and name he#) (resid 91 and name hd#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 31 and name hn) (resid 34 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_massign(resid 31 and name hg) (resid 34 and name hd#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_massign(resid 31 and name hd#) (resid 34 and name hd#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_massign(resid 31 and name hd1#) (resid 34 and name he#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_massign(resid 31 and name hd2#) (resid 87 and name hd#) 2.8 2.8 0.0 ！arom_lassign(resid 32 and name hn) (resid 34 and name hd#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_massign(resid 34 and name hn) (resid 34 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_iassign(resid 34 and name ha) (resid 34 and name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！arom_iassign(resid 34 and name hd#) (resid 35 and name hn) 3.6 3.6 0.0 ！arom_sassign(resid 34 and name hd#) (resid 42 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 34 and name hd#) (resid 42 and name ha) 3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 34 and name he#) (resid 43 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 34 and name hd#) (resid 43 and name hb#) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 34 and name he#) (resid 42 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 34 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(resid 76 and name cb) (resid 76 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 78 and name n (resid 78 and name ca)

(resid 78 and name cb) (resid 78 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 87 and name n) (resid 87 and name ca)

(resid 87 and name cb) (resid 87 and name cg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 92 and name n) (resid 92 and name ca)

(resid 92 and name cb) (resid 92 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2！phi restraintsassign(resid 14 and name c) (resid 15 and name n)

(resid 15 and name ca) (resid 15 and name c) 1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 18 and name c) (resid 19 and name n) -

(resid 19 and name ca) (resid 19 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.9 Hzassign(resid 27 and name c) (resid 28 and name n)

(resid 28 and name ca) (resid 28 and name c) 1.0 -120.0 70.0 2 ！HNHA 7.6 Hzassign(resid 29 and name c) (resid 30 and name n)

(resid 30 and name ca) (resid 30 and name c) 1.0 -78.0 50.0 2assign(resid 31 and name c) (resid 32 and name n)

(resid 32 and name ca) (resid 32 and name c) 1.0 -84.0 50.0 2assign(resid 32 and name c) (resid 33 and name n)

(resid 33 and name ca) (resid 33 and name c) 1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 33 and name c) (resid 34 and name n)

(resid 34 and name ca) (resid 34 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2 Hzassign(resid 34 and name c) (resid 35 and name n)

(resid 35 and name ca) (resid 35 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.45 Hzassign(resid 36 and name c) (resid 37 and name n)

(resid 37 and name ca) (resid 37.and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.6 Hzassign(resid 38 and name c) (resid 39 and name n)

(resid 39 and name ca) (resid 39 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.6 Hzassign(resid 39 and name c) (resid 40 and name n)

(resid 40 and name ca) (resid 40 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.3 Hzassign(resid 40 and name c) (resid 41 and name n)

(resid 41 and name ca) (resid 41 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.8Hzassign(resid 41 and name c) (resid 42 and name n)

(resid 42 and name ca) (resid 42 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.5Hzassign(resid 49 and name c) (resid 50 and name n)

(resid 50 and name ca) (resid 50 and name c) 1.0 -75.0 50.0 2assign(resid 50 and name c) (resid 51 and name n)

(resid 51 and name ca) (resid 51 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.5Hzassign(resid 52 and name c) (resid 53 and name n)

(resid 53 and name ca) (resid 53 and name c) 1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 55 and name c) (resid 56 and name n)

(resid 56 and name ca) (resid 56 and name c) 1.0 -60.0 50.0 2 ！HNHA 5.0Hzassign(resid 58 and name c) (resid 59 and name n)

(resid 59 and name ca) (resid 59 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.8Hzassign(resid 59 and name c) (resid 60 and name n)

(resid 60 and name ca) (resid 60 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2Hzassign(resid 60 and name c) (resid 61 and name n)

(resid 61 and name ca) (resid 61 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.1Hzassign(resid 61 and name c) (resid 62 and name n)

(resid 62 and name ca) (resid 62 and name c) 1.0 -150.0 70.0 2 ！HNHA 7.9Hzassign(resid 62 and name c) (resid 63 and name n)

(resid 63 and name ca) (resid 63 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.7Hzassign(resid 73 and name c) (resid 74 and name n)

(resid 74 and name ca) (resid 74 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2assign(resid 74 and name c) (resid 75 and name n)

(resid 75 and name ca) (resid 75 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 9.15Hzassign(resid 76 and name c) (resid 77 and name n)

(resid 77 and name ca) (resid 77 and name c) 1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2Hz！psi restraintsassign(resid 15 and name n) (resid 15 and name ca)

(resid 15 and name c) (resid 16 and name n) 1.0 50.0 50.0 2assign(resid 19 and name n) (resid 19 and name ca)

(resid 19 and name c) (resid 20 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 25 and name n) (resid 25 and name ca)

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(resid 27 and name c) (resid 28 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 28 and name n) (resid 28 and name ca)

(resid 28 and name c) (resid 29 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 29 and name n) (resid 29 and name ca)

(resid 29 and name c) (resid 30 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 30 and name n) (resid 30 and name ca)

(resid 30 and name c) (resid 31 and name n) 1.0 125.0 75.0 2assign(resid 31 and name n) (resid 31 and name ca)

(resid 31 and name c) (resid 32 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 32 and name n) (resid 32 and name ca)

(resid 32 and name c) (resid 33 and name n) 1.0 174.0 50.0 2assign(resid 33 and name n) (resid 33 and name ca)

(resid 33 and name c) (resid 34 and name n) 1.0 60.0 50.0 2assign(resid 34 and name n) (resid 34 and name ca)

(resid 34 and name c) (resid 35 and name n) 1.0 159.0 50.0 2assign(resid 35 and name n) (resid 35 and name ca)

(resid 35 and name c) (resid 36 and name n) 1.0 156.0 50.0 2assign(resid 36 and name n) (resid 36 and name ca)

(resid 36 and name c) (resid 37 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 37 and name n) (resid 37 and name ca)

(resid 37 and name c) (resid 38 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 40 and name n) (resid 40 and name ca)

(resid 40 and name c) (resid 41 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 41 and name n) (resid 41 and name ca)

(resid 41 and name c) (resid 42 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 42 and name n) (resid.42 and name ca)

(resid 42 and name c) (resid 43 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 43 and name n) (resid 43 and name ca)

(resid 43 and name c) (resid 44 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 45 and name n) (resid 45 and name ca)

(resid 45 and name c) (resid 46 and name n) 1.0 -60.0 50.0 2！HNHBassign(resid 51 and name n) (resid 51 and name ca)

(resid 51 and name c) (resid 52 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 53 and name n) (resid 53 and name ca)

(resid 53 and name c) (resid 54 and name n) 1.0 50.0 50.0 2assign(resid 58 and name n) (resid 58 and name ca)

(resid 58 and name c) (resid 59 and name n) 1.0 -60.0 50.0 2！HNHBassign(resid 59 and name n) (resid 59 and name ca)

(resid 59 and name c) (resid 60 and name n) 1.0 33.0 50.0 2assign(resid 60 and name n) (resid 60 and name ca)

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(resid 62 and name c) (resid 63 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 63 and name n) (resid 63 and name ca)

(resid 63 and name c) (resid 64 and name n) 1.0 165.0 50.0 2assign(resid 74 and name n) (resid 74 and name ca)

(resid 74 and name c) (resid 75 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 75 and name n) (resid 75 and name ca)

(resid 75 and name c) (resid 76 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 76 and name n) (resid 76 and name ca)

(resid 76 and name c) (resid 77 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 78 and name n) (resid 78 and name ca)

(resid 78 and name c) (resid 79 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 83 and name n) (resid 83 and name ca)

(resid 83 and name c) (resid 84 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 92 and name n) (resid 92 and name ca)

(resid 92 and name c) (resid 93 and name n) 1.0 120.0 75.0 2！chi-2 restraintsassign(resid 2 and name ca) (resid 2 and name cb)

(resid 2 and name cg1)(resid 2 and name cd1) 1.0 -60.0 40.0 2！LRCHassign(resid 31 and name ca) (resid 31 and name cb)

(resid 31 and name cg) (resid 31 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCHassign(resid 32 and name ca) (resid 32 and name cb)

(resid 32 and name cg) (resid 32 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCHassign(resid 74 and name ca) (resid 74 and name cb)

(resid 74 and name cg1)(resid 74 and name cd1) 1.0 -60.0 40.0 2！LRCHassign(resid 90 and name ca) (resid 90 and name cb)

(resid 90 and name cg1)(resid 90 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCH

例3：利用竞争性结合检测法和固定化野生型GST-MSP-1₁₉来检测阻断性抗体

在前面的研究中，直接通过MSP-1₄₂加工检测法(Blackman et al.，1994)，或通过偶连的红血球侵入MSP-1₄₂过程加工检测(Guevara etal.，1997)，或以裂殖子蛋白最为抗原进行竞争性放射性免疫检测(Guevara et al.，1997)等方法已经详细说明了能够阻断中和抗体12.8和12.10的作用的抗体。这些研究也已经扩展到使用重组MSP-1和BIAcore分析方法。

将含有融合到GST上的野生型MSP-1₁₉的重组融合蛋白偶连到传感器芯片上，这是第一次允许竞争抗体结合到抗原上。然后mAbs12.8或12.10的溶液流过芯片，对第二种抗体的结合进行定量。如果第一种抗体干扰了第二种抗体的结合，那么着就反映在第二种抗体结合数量的减少上。方法

野生型GST-MSP-1₁₉偶连到CM5传感芯片上。结合检测温度为25℃，固定流速为5μl/min^-1。对于结合来讲，允许100ug/l纯化的mAbs1E1、8A12、及2F10溶解在HBS-EP缓冲液(含有150mM NaCl的10mM HEPES pH7.4，3mM EDTA和0.005％v/v山梨醇酯20)，在细胞培养物上清液中的mAbs1E8、9C8、12D11、111.2和111.4，在HBS-EP缓冲液中的1∶10稀释的腹水的mAbs2.2、7.5和89.1，以及在HBS-EP缓冲液中的1∶10稀释血清的鼠α-GST抗体与固定化的野生型GST-MSP-1₁₉相互作用，时间为10分钟。经过5分钟的解离低亲和力的相互作用之后，添加溶解在HBS-EP缓冲液中的浓度为100ug/l的mAbs12.18或12.10，结合10分钟。在冲洗芯片5分钟之后，对12.8或12.10的结合进行测定。利用pH2.4的150mM的甘氨酸-盐酸冲洗芯片5分钟，在需要的时候也可用pH1.8的100mM的甘氨酸-盐酸冲洗芯片3分钟，冲掉结合的抗体来再生芯片。

结果

结果在图12中有示。除了负对照mAb89.1之外，其他所有的竞争性抗体都结合到GST-MSP-1₁₉抗原上。正如我们所期望的，mAb12.10和12.8之间相互竞争(Guevara et al.，1997)。其他不抑制加工的抗体或多或少的干扰12.8和12.10的结合。正如我们从上文的研究所预期的，mAb 1E1和7.5都阻断12.8和12.10的结合，而2.2和111.4只阻断12.8的结合。在这项研究中发现的另一个尤其有效的阻断性抗体是mAb9C8。

例4：对小动物进行修饰GST-MSP-1₁₉免疫作用并分析其诱导的抗体

为了确定修饰蛋白是具有免疫原性的，使用了重组GST-MSP-1₁₉融合蛋白，通过免疫作用来诱导抗体的出现。

方法

用含有3[27+31+43]或4[15+27+31+43]替代的两种抗体分别免疫鼠和兔子。兔子是利用溶解在Freund完全助剂中的MSP-1₁₉蛋白皮下免疫，然后在21、42后3天后注射200ug溶解在Freund不完全助剂中的MSP-1₁₉蛋白以加强免疫，收集样品血清。

通过对寄生虫感染的红血球的丙酮固定化涂片的间接免疫荧光检测，确定了结合到寄生虫原始MSP-1蛋白上的出现及其水平。血清在磷酸缓冲液(PBS)中进行梯度稀释，室温下在载玻片上培育30分钟。冲洗，载玻片共轭到山羊抗兔或抗鼠IgG上的FITC共培育，冲洗，通过荧光显微镜进行检查。

这种血清也通过MSP-1次级加工检测法来分析。通过对前述方法做了修饰的方法来对在裂殖子制剂中的MSP-1次级加工进行定量和分析(Blackman et al.，1994)。将冲洗后的P.falciparum 3D7重新悬浮在冰冷的含有10mM CaCl₂和2mM MgCl₂的pH7.5的Tris-HCl缓冲液(反应缓冲液)中。将含有大约1×10⁹个裂殖子的等份重新悬浮在置于冰上的1.5毫升离心管中，将寄生虫沉淀在13000×g、4℃下离心2分钟。去除上清液，将每管的裂殖子沉淀重新悬浮在置于冰上的25μl反应缓冲液中，向其中进一步添加合适的蛋白酶抑制剂或抗体。维持裂殖子置于冰上的状态20分钟以利抗体结合，然后转移到37℃的水浴中1小时以便进行加工。这些检测一直包括下列对照：仅仅重新悬浮在反应缓冲液中的正加工裂殖子样品对照；重新悬浮在添加有1Mm PMSF的反应缓冲液中的负加工裂殖子样品对照；以及0时间(0h)对照，其中的加工在37℃水浴之前就已经停止。通过基于western印迹的方法和一种经过修饰的加工检测法来对加工进行检测。对检测后物质通过13000×g、4℃下离心30分钟去除不溶性物质，收集上清液。通过ELISA法确定上清液中MSP-1₃₃的数量。将50微升的稀释样品上清液添加到ELISA平板(NUNCF96 Cert.Maxisotp)的孔中，而在此之前此平板已经用溶解在PBS中的4ug ml^-1人mAb X509包被了，用量为100μl/孔。将平板在37℃下培育4小时，然后用0.01％PBS-Tween(PBS-T)冲洗3次。添加100μl做1∶4000稀释的鼠mAb G13，在37℃下培育1小时，随后冲洗，然后添加100μl做1∶1000稀释的绵羊IgG(H+L)HRP共轭抗体来检测已经结合MSP-1₃₃蛋白。在37℃下培育1小时后，再一次冲洗平板，然后通过添加100μl新鲜配制的底物溶液(添加在0.05M磷酸缓冲液中的400mg l^-1邻苯二胺二氢氯化物，0.024M的柠檬酸和0.012％H₂O₂)，室温下反应20分钟。通过添加10μl 1M的硫酸来停止反应，测定每个样品在492nm处的吸收。结果

结果在图13中有示。这两种修饰蛋白产生的抗体可与感染寄生虫的红血球中的MSP-1反应，与其血清的反应效价为1∶10000，这与通过同样的方法，利用含有野生型MSP-1序列的重组蛋白的免疫作用产生的血清的反应效价相同。这表明修饰蛋白能够诱导产生可与原始蛋白反应的抗体。在预实验中的浓度条件下，虽然在对照中没有抗体抑制加工，但免疫作用诱导的抗体是能够部分抑制加工的。

例5：设计和合成优化用于Pichia Pastoris异源表达的Plasmodium Falciparum裂殖子表面蛋白基因片段

已经对Plasmodium Falciparum裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)41.1kDa编码片段的编码序列进行了重新设计来优化其在PichiaPastoris中的异源表达。优化的DNA片段是经过PCR基因装配来合成的，以两个片段MSP-133和MSP-119的形式存在。利用按优化的MSP-119构建物的表达载体来转化Pichia βastoris细胞。重组菌株显示出能够表达高水平的非糖基化的、正确折叠的MSP-119蛋白。

人疟疾寄生虫Plasmodium Falciparum的富含AT的基因组编码的蛋白很少能够在异源体系中表达(Withers-Martinez et al.，1999)。甲基营养酵母Pichia(Komagataella)pasroris是二硫桥蛋白如恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)C-末端片段表达的合适体系(White et al.，1994；Morgan et al.，1999)。在P.Pastoris表达体系中，避免由于富含AT片段引起的过早转录终止是很重要的(Romanos et al.，1991)。已经确定了P.Pastoris的高表达基因的密码子(Sreekrishna et al.，EP 0 586 892 AI)。因此，利用新颖的计算机软件，设计了含有优化在P.Pastoris中表达的密码子用途的MSP-1₄₂片段(Withers-Martinez et al.，1999)。上文已经表明在P.Pastoris中表达时MSP-1₁₉片段上部分糖基化的，并且在纯化过程中碳水化合物要用酶法去除(Morgan et al.，1999)。因此，在合成MSP-1₄₂蛋白序列中引入了两个特异点突变来防止在NxS/T位点(在MSP-133内的一个潜在位点，也是在MSP-119序列Asn 1的一个已知位点)的N-糖基化。

通过基因组装聚合酶链式反应合成的MSP-142多肽序列(Stemmer et al..1995.Withers-Martinez et al..1999)是以单独的MSP-133和MSP-119片段存在的。将优化的MSP-119片段亚克隆到一个新颖的修饰Pichia表达载体中，然后将其转化到P.pasroris宿主菌株SMD1168中，并且分离到几株单独的转化株。已经证明其中的三株转化株可有效的表达非糖基化的、正确折叠的MSP-119。在低拷贝数的转化株中也观察到了优化基因的强表达。一株具有中等水平G418抗性的多拷贝转化株表达了纯化的MSP-119，其表达水平与前述含有原始P.falciparum DNA的高效表达菌株相同。因此，很有可能从合成优化基因的高水平G418抗性转化株得到更高水平的产量。方法：基因装配

第一次对P.falciparum MSP-142(41.1kDa)片段蛋白序列做两个氨基酸替代来除去N-糖基化信号，该序列的SWISS-PROT编号为P04933：位置1264-1621。序列NYT(在N-末端部分，位置1445)和序列NIS(在C-末端片段的开始；位置1526)分别替代为QYT和NIA。然后利用S.Cerevisiae密码子通过DNA-STAR将此蛋白序列进行反转录。这个序列已经被CODOP程序引用(Withers-Martinez etal.，1999)。利用这个程序，应用得自高效表达的P.Pastoris基因(Sreekrishna et al..EP 0 586 892 A1)的密码子用途的额外密码子表(图14)，获得了10个随机序列。因此，这个密码表应该是能够反映其在高效表达菌株中的应用。选出了含有最少的不适宜密码子(6)的随机序列，并且将这些密码子人工替换为优选的密码子。然后将这些序列通过DNA-STAR来分析，以检查出可引起转录终止的富含AT的序列，并对他们进行直接的或反向复制。然后又产生了一组50个编码最终序列的重叠寡核苷酸。他们是由42nt长的49个寡核苷酸组成，一个长为42nt，另一个长为48nt。每个寡核苷酸与其相邻寡核苷酸有21bp的重叠，但没有缺口。估计其Tm在60℃到77℃。通过Oswel合成的寡核苷酸只有40nmol的规模，不经纯化就放入去离子水中。也合成了用于扩增步骤的不同长度的多种外部引物，其Tm在62℃到64℃，并且含有在随后的扩增步骤中用于连接的5′-末端磷酸基团。反向引物也包括一个翻译终止密码子(UAA在互补链上)。在使用前将所有的寡核苷酸在ddH₂O稀释到10μM。

利用一个Biometra cycler，在200μL的薄壁管中，在下列条件下，按照所描述的(Stemmer et al.，1995；Withers-Martinez et al.，1999)，进行PCR介导的基因装配和扩增。

基因装配反应(反应1)：50μL的体积

2单位Vent多聚酶(New England Biolabs)

0.4mM dNTPs

1 x Vent多聚酶缓冲液

所包含的每种寡核苷酸浓度为200nM的寡核苷酸混合物循环：

32个循环(2h 33m)

变性94℃ 30s

退火52℃ 30s

延伸72℃ 3m

利用不同的外部引物和50个寡核苷酸组的亚组分别合成了MSP-142(41.1kDa)区的三个片段：

N-末端片段(bp1-423)21个寡核苷酸

中间片段(bp337-786)22个寡核苷酸

C-末端片段(bp787-1074)14个寡核苷酸

C-末端片段产生了一个10.6kDa的片段(MSP-119).N-末端和中间片段有337bp和423bp之间部分的重叠，将他们在BgIII位点(371-376)进行剪接，生成了一个786bp的片段，它能编码30.5kDa的MSP-133蛋白。扩增反应(反应2)

100uL的体积

10uL等份的基因组装反应

4单位Vent多聚酶(New England Biolabs)

0.4mM dNTPs

1 x Vent多聚酶缓冲液

1uM外部引物循环：

32个循环(2h 55m)

变性94℃ 45s

退火52℃ 45s

延伸72℃ 3m

最后延伸72℃ 5m

然后将PCR产物通过Centricon-100装置(Amicon)过滤纯化，在T4DNA连接酶的作用下，16℃下通过钝头末端连接过夜从而将其直接克隆到载体中。

将合成的MSP-1₁₉基因直接克隆到P.pastoris表达载体中去。利用Pml来消化修饰pPIC9KHXa载体，并且用小牛碱性磷酸酶来处理，而这个修饰载体含有His₆标记和插入到pPIC9K SnaB I位点的因子Xa裂解位点(见图15)。通过一个含有His₆标记、因子Xa裂解位点、在pPIC9K载体的SnaBI位点中的PmII限制性位点的36bp的合成寡核苷酸就造就了一个Hxa载体。

将PCR产物的N-末端和中间片段克隆到去磷酸化的pUC118载体的SmaI位点之上。然后对含有插入序列的质粒克隆进行排序。随后将含有正确的合成序列的克隆进行消化，得到的两个片段通过凝胶来纯化。N-末端片段克隆是利用EcoRI和BglII来进行消化的，而中间片段克隆是利用HindIII和BglII.来进行消化的。重组片段是在琼脂糖凝胶上进行纯化的，并且利用QLAGEN提取试剂盒来洗提。然后将纯化的N-末端和中间片段通过连接作用剪接到pUC118载体中，而这个pUC118载体是先经过HindIII和EcoRI消化，然后又利用小牛碱性磷酸酶处理的。这样就产生了完整的合成MSP-1₃₃编码序列。将PCR产物的N-末端片段和中间片段克隆入去磷酸化的pUC118载体的SmaI位点。对含有插入物的质粒克隆进行排序。随后将含有正确合成序列的消化，得到的两个片段通过凝胶进行纯化。N-末端片段克隆是利用EcoRI和BglII来进行消化的，而中间片段克隆是利用HindIII和BglII.来进行消化的。重组片段是在琼脂糖凝胶上进行纯化的，并且利用QLAGEN提取试剂盒来洗提。然后将纯化的N-末端和中间片段通过连接作用剪接到pUC118载体中，而这个pUC118载体是先经过HindIII和EcoRI消化，然后又利用小牛碱性磷酸酶处理的。这样就产生了完整的合成MSP-133编码序列。方法：表达和纯化

通过以前公开的电穿孔技术对甲基营养酵母Pichia(Komagataella)pastoris菌株SMD116进行转化(Morgan et al.，1999).此外，利用Hybond-N+膜分离到一些G-418抗性菌株(Fairlieet al..1999).。

通过在基础缓冲葡萄糖培养基中生长的10ml培养物来进行转化株表达筛选。收集细胞，然后将其重新悬浮在10ml基础缓冲乙醇培养基中至在OD₆₀₀时的吸光度为1.0，并且生长过夜至浓度为在OD₆₀₀时的2.5-3.0。通过离心去除细胞，在冰上，利用15％三氯乙酸沉淀1.2ml上清液，时间为30分钟。样品在4℃的MICROFUGE中14000rpm离心30分钟，蛋白沉淀用冷丙酮冲洗2次。样品重新悬浮在12μlddH₂O中，在用DTT还原之后，按照使用手册，预先灌注NOVEX丙烯酰氨凝胶，取5μl悬浮液进行电泳。凝胶使用的是NOVEX 4-12％丙烯酰氨梯度或10％的丙烯酰氨，以及在MES缓冲液中的Bis/Tris凝胶。蛋白凝胶用考马斯亮蓝染色(Sigma)

除了忽略了对合成基因产物进行的酶法去糖基化作用之外，按照以前所述操作，得到了均一纯化的MSP-119(Morgan et al.，1999)。方法：NMR

正如以前所述，在25℃下，在样品浓度为1.1-2.5mM时得到了1维¹H和二维{¹H/⁵N}-HSQC光谱(Morgan et al.，1999)。结果

图15中展示了合成DNA片段的序列及预想的蛋白。表3是对序列所进行的所有提高的总结。

表3 密码子使用

总密码优选的苯优选％AT

子数密码的密码子含量P.falciparum MSP1 358 140 28 7441.1KDa片段合成41.1KDa片段 358 276 0 58

表3.密码子应用(用途)

图16在琼脂糖凝胶上展示了对MSP-1₃₃(两个部分)和MSP-1₁₉合成片段进行的PCR基因装配反应。它证明在每种情况下都得到了单独的、大小正确的主要产物。按照在方法部分所描述的对PCR产物进行亚克隆、筛选以及测序。

利用包含在修饰的pPIC9K载体(pPIC9K-Hxa，图15)中用合成MSP-1₁₉构建物来转化P.Pastoris。合成MSP-1₁₉产物在三株独立的转化株中的表达在图17中的蛋白凝胶上有示。如上文方法部分中所描述的那样，通过对培养上清液进行三氯乙酸沉淀来制备样品。它证明在每个样品中都得到了单一的主要产品，这与所期望的MSP-1₁₉蛋白的迁移相对应。样品迁移的较对照稍微较慢，而对照样品有一个短的C-末端标记序列，这在以前的文献中有描述(Morgan etal.，1999)。没有由于糖基化作用而导致的异源的、缓慢迁移的重组蛋白的迹象。因此，非糖基化的合成MSP-1₁₉可通过转化酵母进行有效的表达。对低拷贝转化株(对0.25mg/ml G418有抗性)来讲，纯化的MSP-119的产量(通过UV吸收来测定)是16mg/ml，而对于中等G418抗性转化株(对1.0mg/ml G418有抗性)来讲产量就上升增加到24mg/ml。这可与分离高G-418抗性菌株之前、含有原始恶性疟原虫编码序列的低拷贝P.Pastoris转化株的1-2mg/l的产量相对比(Morgan et al.，1999)。这表明合成的MSP-1₁₉构建物有利于重组蛋白的表达，进一步分离具有更高拷贝的转化株可对其做进一步的提高。

一维质子NMR实验证明合成的MSP-119蛋白的光谱与前文研究的蛋白的光谱很相似(Morgan et al.，1999)，它代表了一种正确折叠的蛋白(数据没有给出)。这通过{¹H/¹⁵N}-HSQC光谱(图18)得到进一步的确定，这个光谱也显示合成产物结构与前文研究的蛋白是相同的，仅仅是在N-末端有些微的差别，这与独特的N-末端标记序列和糖基化位点的S3->A突变相一致。前文也已经给出了原始恶性疟原虫序列产物的主链NH质子和¹⁵N化学漂移数据(Morgan et al.，1999)。在除N-末端区之外的两个光谱的相似性是这两个蛋白形式是结构相似、折叠正确的有力的证据。

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Claims

1.疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然变体，其中，该变体具有：(1)与天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，具有降低的对至少第一种抗体的亲和性，第一种抗体能阻断第二种抗体的结合，而第二种抗体是抑制疟原虫MSP-1₄₂的蛋白酶解裂解的，以及(2)与该天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，对至少一种第三种抗体基本上具有相同的亲和性，第三种抗体能抑制MSP-1₄₂蛋白酶解裂解。

2.权利要求1中的变体，其中该疟原虫MSP-1₁₉和疟原虫MSP-1₄₂是恶性疟原虫MSP-1₁₉和MSP-1₄₂。

3.权利要求1或2中的变体，其中第一个抗体是选自mAbs 1E1、2.2，7.5，9C8和111.4。

4.权利要求1或2中的变体，其中第二和/或三个抗体是选自mAbs12.8，12.10和5B1。

5.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)C-末端非天然变体，含有在SEQ ID No.1中所示的恶性疟原虫裂殖子MSP-1₁₉的第14、15、27、31、34、43、48和53位的任一氨基酸处进行的修饰，或在其他恶性疟原虫MSP-1₁₉多肽的等价位置上的氨基酸的修饰。

6.权利要求5中的变体，其中该修饰是选自Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys及Asn53→Arg，以及其他恶性疟原虫MSP-1₁₉多肽的等价位置上的氨基酸的修饰。

7.权利要求6中的变体，其中该替代是选自[Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]，[Glu27→Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及在其他疟原虫MSP-1₁₉多肽上的等价位置进行的替代作用。

8.权利要求5-7中的任一权利要求中的变体，进一步包括在在SEQ ID No.1中所示的恶性疟原虫裂殖子MSP-1₁₉氨基酸序列的Cys12和/或Cys28处的突变。

9.权利要求8中的变体，其中的突变是选自Cys12→Ile、Cys28→Trp，、Cys12→Ala和Cys28→Phe的替代作用。

10.权利要求9中的变体，其中的替代是选自[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及在其他疟原虫MSP-1₁₉多肽上的等价位置进行的替代作用。

11.一种生产用于疫苗组合物制备的疟原虫MSP-1变体的方法，这种方法包括修饰疟原虫MSP-1 C-末端片段的一或多个氨基酸残基，产生的衍生物具有：(1)与天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，具有降低的对至少第一种抗体的亲和性，第一种抗体能阻断第二种抗体的结合，而第二种抗体是抑制疟原虫MSP-1₄₂的蛋白酶解裂解的，以及(2)与该天然的疟原虫MSP-1₁₉相比，对至少一种第三种抗体基本上具有相同的亲和性，而该第三种抗体可抑制MSP-1₄₂的蛋白酶解裂解。

12.利用权利要求11的方法获得的非天然疟原虫MSP-1变体。

13.编码权利要求1-10或12中的变体的多核苷酸，它被可操作的连接到能够指导该核苷在一个宿主细胞中表达的调节序列上。

14.权利要求13中的多核苷酸，它含有在该宿主细胞中最优化表达的序列。

15.权利要求13或14中的多核苷酸，其中的宿主细胞是Pichiapasroris。

16.包含权利要求13、14或15中的多核苷酸的核酸载体.

17.含有权利要求16中的载体的宿主细胞。

18.一种药物组合物，它包含有权利要求1-10或12中的任一变体，权利要求13-15中的任一多核苷酸，或包含权利要求16中的载体以及一种药物上可接受的载体或稀释剂。

19.权利要求18中的组合物，其进一步包含一种免疫原性疟原虫多肽或片段或其衍生物。

20.制备抗-MSP-1抗体的方法，其包括对权利要求1-10或12中的任一多肽给药、对权利要求13-15中的任一多核苷酸给药或对权利要求16中的载体给药于哺乳动物。

21.制备多克隆抗-MSP-1抗体的方法，其包括对权利要求1-10或12中的任一多肽给药、对权利要求13-15中的任一多核苷酸给药或对权利要求16中的载体给药于哺乳动物，并且从该哺乳动物中抽取血清。

22.利用权利要求20或21制备的抗体。

23.诱导抗由恶性疟原虫诱导的疟疾的免疫的方法，该方法包括对权利要求1中的多肽、权利要求13中多核苷酸或权利要求16中的载体以有效剂量给药于需要这种免疫的人。

24.免疫哺乳动物的方法，该方法包括对权利要求1中的多肽、权利要求13中多核苷酸或权利要求16中的载体以有效剂量给药。

25.权利要求24中的方法，其中该哺乳动物是已经进行抗疟疾免疫的哺乳动物。

26.治疗发生在人类病人身上的疟疾感染的方法，其包括对病人给药以有效剂量的权利要求18或19中的药物组合物。

27.用于治疗的权利要求1-10或12中的任一变体、 13-15中的任一多核苷酸或权利要求16中的载体。

24.已经在其中贮存有MSP-1₁₉ NMR模型的计算机可读媒介。

25.编码疟原虫MSP-1多肽的核酸，其中的核酸是经优化用来在异源宿主细胞中进行表达的。

26.权利要求25中的核酸，其中的异源宿主是Pichia pasroris细胞。

27.权利要求25或26中的核酸，其中的多肽是选自一包含有图2E和2C中所示序列的MSP-1₄₂多肽、包含有图2C中所示序列的MSP-1₁₉多肽、以及包含有图2E中所示序列的MSP-1₃₃多肽。

28.权利要求25-27中的任一核酸，其中的核酸包含的序列是选自图2A、2B和2D所示的序列。

29.包含有权利要求25-28中的任一核酸的核酸载体。

30.包含有权利要求29中的载体的宿主细胞。

31.一种药物组合物，其包含有权利要求25-27中的任一核酸、权利要求29中的载体以及药物上可接受的载体或稀释剂。

32.权利要求31中的组合物，其进一步包含有一种免疫原性疟原虫多肽或片段或其衍生物。