PL175900B1 - Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną,lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków lub pochodzące z nich części antygenowe wektor ekspresyjny i prokariotyczna lub enkariotyczna komórka - Google Patents

Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną,lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków lub pochodzące z nich części antygenowe wektor ekspresyjny i prokariotyczna lub enkariotyczna komórka

Info

Publication number
PL175900B1
PL175900B1 PL93306028A PL30602893A PL175900B1 PL 175900 B1 PL175900 B1 PL 175900B1 PL 93306028 A PL93306028 A PL 93306028A PL 30602893 A PL30602893 A PL 30602893A PL 175900 B1 PL175900 B1 PL 175900B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequences
seq
leu
glu
lys
Prior art date
Application number
PL93306028A
Other languages
English (en)
Inventor
Margaret Graham
Trevor S. Smith
Edward A. Munn
David P. Knox
Joanna J. Oliver
Susan E. Newton
Original Assignee
Biotech & Biolog Scien Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotech & Biolog Scien Res filed Critical Biotech & Biolog Scien Res
Publication of PL175900B1 publication Critical patent/PL175900B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4354—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Czasteczki kwasów nukleinowych zawierajace jedna lub wiecej sekwencji nukleo- tydowych kodujacych aminopeptydazy robaków, lub pochodzace z nich czesci antygenowe, odpowiadajacych calym lub czesciom sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 2, 3, 4 lub 5 (SEK NR ID: 1 do 21) lub sekwencji kodujacych aminopeptydazy robaków, które wykazuja identycznosc z wymienionymi sekwencjami w 50% lub wiecej lub które hybrydy- zuja z dowolna z wymienionych sekwencji w warunkach 2 x SCC w temperaturze pokojowej (SCC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,2). P L 175800 B 1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zrekombinowane cząsteczki DNA kodujące aminopeptydazy, wektor ekspresyjny lub wektor do klonowania oraz prokariotyczna, lub eukariotyczna komórka lub organizm transgeniczny zawierające wymienione cząsteczki DNA.
Wynalazek umożliwia wytwarzanie ochronnych antygenów przy wykorzystaniu technologii rekombinowanego DNA, w celu zastosowania ichjako czynniki przeciwrobacze i ochronne immunogeny w kontroli chorób wywołanych przez robaki pasożytujące w jelicie.
Robaki pasożytujące w jelicie są odpowiedzialne za szeroki zakres chorób i inwazji pasożytów u zwierząt domowych, prowadząc do spadku produkcji a nawet śmierci zwierząt, co ma istotne znaczenie ekonomiczne. Tak na przykład, nicień Haemonchus żywiący się krwią zakaża wyściółkę przewodu żołądkowo-jelitowego przeżuwaczy, powodując anemię i utratę wagi, a nie zwalczany często prowadzi do śmierci. Zwierzęta zakażone pokrewnym nicieniem Osteratagia, nie żywiącym się krwią, podobnie przestają dobrze się rozwijać i nie leczone mogą zdechnąć. Do innych rodzajów robaków pasożytniczych o znaczeniu ekonomicznym należą Triochoostrongylus i Nematodirus, powodujące zapaleniejelit u różnych zwierząt, oraz płazińce.
Problem mogą również stanowić nicienie takie jak tęgoryjce (np. Necator, Ancylostoma, Uncinaria i Bunostomum spp) oraz przywry (np. Fasciola, Paramphistomum i Dicrocoelium) i im pokrewne, które poza przeżuwaczami i zwierzętami domowymi zakażają również ludzi, często z fatalnym skutkiem.
Zwalczanie robaków pasożytujących w jelicie opiera się obecnie na użyciu przeciwrobaczych środków w połączeniu z umiejętnym postępowaniem z paszą. Tego rodzaju techniki jednakże mają szereg wad - często podawanie leków i odpowiednie przygotowania paszy są często niepraktyczne, a ponadto następuje szerokie rozprzestrzenianie się odmian robaków odpornych na leki.
Istnieje zatem zapotrzebowanie na skuteczną szczepionkę przeciwrobaczą i na przestrzeni ostatnich lat wzmogły się wysiłki na tym kierunku, jednakże nie ma dotychczas dostępnych handlowo molekularnych lub jednostkowych szczepionek przeciw głównym gatunkom robaków, a w szczególności żołądkowo-jelitowym nicieniom przeżuwaczy, takim jak Haemonchus i Ostertagia.
Dotychczas najbardziej zachęcające wyniki otrzymano dla oryginalnych białek izolowanych z Haemonchus, będących potencjalnym zabezpieczającym antygenem nie tylko przeciw Haemonchus, ale również przeciw szeregowi innych robaków. W szczególności dublet białkowy H110D znaleziony na wewnętrznej powierzchni jelita H. contortus nadaje odporność na zakażenia tym robakiem u owiec.
H110D z H. contortus ma masę cząsteczkową około 110 kilodaltonów (kD) w warunkach redukujących i nie redukujących, określoną poprzez SDS-PAGE i jest opisane w W088/00835 oraz WO90/11086. Termin H110D stosowany w niniejszym zgłoszeniu dotyczy dubletu białkowego H110D zdefiniowanego w WO88/00835 i WO90/11086. Ostatnio wykazano obecność jego odpowiedników białkowych w innych gatunkach robaków np. Nectator americanus.
W W088/00835 opisano wiele metod oczyszczania H110D wystarczających dla scharakteryzowania białka i możliwych do wykonania na większą skalę, co pozwala na produkowanie białka w ilościach wystarczających dla celów eksperymentalnych i handlowych. Istnieje jednakże zapotrzebowanie na udoskonalone i wygodne źródło, z którego można by otrzymywać nie tylko H110D, ale również pokrewne białka antygenowe, a w szczególności na metodę opierającą się o technologię zrekombinowanego DNA i ekspresję białek w odpowiednio stransformowanych prokariotycznych lub eukariotycznych organizmach.
Niniejszy wynalazek próbuje dostarczyć tego rodzaju udoskonaloną procedurę. Określono sekwencję cDNA dla H11 ()D z Haemonchus contortus i stwierdzono, że przewidziana sekwencja aminokwasów wykazuje homologię z rodziną aminopeptydaz błonowych (nazwa systematyczna: hydroliza a-aminoacylopeptydowa(mikrosomalna)).
Błonowe ssacze aminopeptydazy znajdują się w różnych tkankach np. mikrokosmkowym rąbku szczoteczkowym jelit oraz w nerce. Ich rola w nerce jest niejasna, natomiast w jelicie ich funkcja polega na cięciu małych peptydów będących końcowym produktem trawienia (patrz Kenny i Maroux, 1982; Kenny i Turner 1987; Noren i wsp., 1986; Semenza, 1986).
Przedmiotem wynalazku są cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących enzymy z grupy aminopeptydaz z robaków lub ich części antygenowe, odpowiadających zasadniczo całym lub częściom sekwencji nukleotydów przedstawionych na figurach 2,3,4, lub 5 (SEK NR ID: 1do 21) lub sekwencji kodujących aminopeptydazy robaków, które wykazują identyczność z wymienionymi sekwencjami w 50% lub więcej lub które hybrydyzują z dowolną z wymienionych sekwencji w warunkach 2 x SCC w temperaturze pokojowej (SCC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,2).
Kwas nukleinowy, którego dotyczy niniejszy wynalazek, może więc być jedno lub dwuniciowym DNA, cDNa lub RNA.
Różnice w sekwencjach kodujących aminopeptydazę mogą wystąpić pomiędzy różnymi szczepami robaków w obrębie gatunku, pomiędzy różnymi stadiami cyklu życiowego robaków (np. pomiędzy stadium larwalnym i dojrzałym), pomiędzy podobnymi szczepami różnego pochodzenia geograficznego, jak również w obrębie tego samego robaka. Tego typu różnice wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.
175 900
Jako w istotny sposób homologiczne określa się w niniejszym wynalazku sekwencje mające procent identyczności 50 lub więcej np. 60% lub więcej, jak również funkcjonalnie równoważne odmiany . alleliczne i pokrewne sekwencje, zmodyfikowane poprzez pojedyncze lub wielokrotne podstawienia zasad, wstawienia i/lub delecje. Określenie funkcjonalnie równoważne oznacza sekwencje kwasów nukleinowych kodujące polipeptydy o aktywności aminopeptydazy, które wykazują podobną immunoreaktyność, to znaczy prowadzą do powstawania u gospodarza ochronnych przeciwciał przeciw robakom. Sposoby wytwarzania takich sekwencji pochodnych, na przykład poprzez ukierunkowaną mutagenezę, losową mutagenezę lub enzymatyczne cięcie i/lub ligację kwasów nukleinowych są dobrze znanymi umiejętnościami, podobnie jak metody określania czy zmodyfikowany w taki sposób kwas nukleinowy ma znaczącą homologię do danej sekwencji np. poprzez hybrydyzację.
Dostarczenie cząsteczek kwasów nukleinowych będących przedmiotem niniejszego wynalazku umożliwia więc otrzymanie zrekombinowanych aminopeptydaz lub ich immunogennych fragmentów w ilościach dotychczas niedostępnych, otwierają w ten sposób możliwości wytwarzania szczepionek przeciwrobaczych.
Innym aspektem niniejszego wynalazkujest więc dostarczenie cząsteczek kwasów nukleinowych, obejmującychjedną lub więcej sekwencji nukleotydowych kodującychjeden lub więcej polipeptydów zdolnych do indukowania ochronnych przeciwciał przeciw robakom pasożytniczym, które to sekwencje zawierają jeden lub więcej regionów kodujących determinantę antygenową z sekwencji kodujących aminopeptydazę, jak pokazano na figurach 2, 3, 4 lub 5 (złożonych z SEK NR: 1 do 21).
Wynalazek obejmuje też cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych, które odpowiadają lub które są komplementarne do jednej lub większej liczby sekwencji, wybranych z sekwencji klonów M1, B1A, B1A-3', B2, M1AUS, AustBl, 014-014 (2.5PCR), 041-872 (3.5PCR klon 2), A-648 (koniec 5 B1), A-650 (koniec 5' 2.5 PCR), A-649 (koniec 5 3.5PCR), 014-178 (koniec 3' AustB1 klon 2), 014-178 (koniec 3' AustB’1 klony 3 i 6), 014-872 (3.5PCR klon 10) i 014-872 (3.5PCR klon 19), H11-1, H11-2 i H11-3, SEK NR ID: 1do 15 i 19 do 21, odpowiednio, jak pokazane na fig. 2, 3,4 i 5 lub jedną lub więcej sekwencji, które wykazują identyczność z wymienionymi sekwencjami w 50% lub więcej lub które hybrydyzują z dowolną z wymienionych sekwencji w warunkach 2 x SCC, w temperaturze pokojowej (SCC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,2).
Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku umożliwiają wytworzenie syntetycznych polipeptydów zawierających jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych stanowiących aminopeptydazę lub jej część antygenową, zasadniczo odpowiadających wszystkim lub części sekwencji nukleotydowych, jak pokazano na figurach 2 3, 4 lub 5 (SEK NR ID: 1 do 21). Ich funkcjonalnie równoważnych odmian innych niż syntetyczne polipeptydy odpowiadające dubletowi białkowemu H110D, bądź też syntetycznych polipeptydów odpowiadających dowolnej z sekwencji polipeptydowych zawartych w WO90/11086.
W celu wykorzystania cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku do wytwarzania powyższych kodowanych przez nie peptydów, cząsteczki należy włączyć do wektorów, które z kolei wprowadza się do komórek gospodarza lub organizmu transgenicznego. Stransformowane komórki zawierające cząsteczki według wynalazku hoduje się w warunkach uniemożliwiających ekspresję wprowadzonych cząsteczek kwasów nukleinowych i wyprodukowanie określonego powyżej polipeptydu.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny lub wektor do klonowania zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku oraz prokariotyczna lub eukariotyczna komórka lub organizm transgeniczny zawierające cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. ,
Takie ekspresyjne wektory zawierają odpowiednie sekwencje kontrolne, takie jak np. sygnały dla translacji (np. kodony inicjacyjne i terminacyjne) i elementy kontrolujące transkrypcję (np. region promotorowo-operatorowy, miejsca wiązania rybosomów, sekwencje terminacyjne) połączone w odpowiedniej ramce odczytu z cząsteczkami kwasów nukleinowych według wynalazku.
175 900
Zgodnie z wynalazkiem wektorami mogą być plazmidy i wirusy (zarówno bakteriofagi jak i wirusy eukariotyczne) zastosowane zgodnie z dobrze znanymi i udokumentowanymi metodami z tej dziedziny i mogą być wyrażone w wielu różnych systemach ekspresyjnych również dobrze w tej dziedzinie znanych i udokumentowanych.
Znane są różnorodne metody, które mogą być użyte do wprowadzania takich wektorów do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek dla uzyskania ekspresji, lub do linii zarodkowej lub komórek somatycznych w celu utworzenia zwierząt transgenicznych. Odpowiednie metody transformacji lub transfekcji są dobrze opisane w literaturze.
Eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza poddane transformacji lub transfekcji, lub transgeniczne organizmy zawierające cząsteczkę kwasów nukleinowych według wynalazku, zdefiniowaną powyżej stanowią dalszy przedmiot wynalazku.
Eukariotyczny system ekspresyjny w ogólności, a system ekspresyjny nicieni w szczególności, mają taką przewagę, że może tam zachodzić podsttranslacyjna obróbka, a zwłaszcza glikozylacja - w przypadku systemu transgenicznego nicienia można oczekiwać glikozylacji zgodnej z tą, którą znajduje się w natywnym białku. Jest to bardzo istotne, ponieważ w wielu przypadkach posttranslacyjna obróbka wymagana jest dla osiągnięcia optymalnej biologicznej aktywności przez zrekombinowane białko.
Systemy ekspresyjne oparte na komórkach ssaków również mają szereg zalet. W ssaczych komórkach gospodarza dobrze odtwarzana jest natywna forma i ochronne epitopy antygenu, ponieważ eukariotyczny system ekspresji daje wzory glikozylacji, połączenia mostkami dwusiarczkowymi i inne posttranslacyjne modyfikacje bardziej podobne niż komórki E. coli, które mogą wytwarzać nierozpuszczalne białko, wymagające ponownego pofałdowania i w małym stopniu odtwarzające formę natywną. Dodatkowo, istnieje małe prawdopodobieństwo aby glikozylacja ssacza wywoływała reakcję immunologiczną przeszkadzającą w ochronnej odpowiedzi antybiałkowej. Dla ochrony człowieka i zwierząt domowych preforowane jest więc użycie ludzkich lub zwierzęcych fibroblastów lub linii komórkowych szpiczaka, takich jak Hela - linia komórkowa ludzka; BHK - komórki nerki chomika; VERO - linia komórkowa małpiej nerki; FR3T3 - fibroblasty szczura Fishera; NIH3T3 - linia komórkowa fibroblastów mysich; C1271 - linia komórkowa raka sutka myszy; CV -1 - fibroblasty nerki zielonej małpy afrykańskiej; 3T6 fibroblasty embrionalne myszy; komórki L - linia komórkowa myszy; CHO - linia komórkowa jajników chomika chińskiego, NSO NSI, SP2 i linie komórkowe szpiczaka myszy i linie komórkowe szpiczaka szczura, takie jak YB2/0 i Y3.
Wektory odpowiednie dla różnych klas linii komórkowych ssaczych są dobrze znane w tej dziedzinie. Ogólnie, zawierają one promotor i/lub wzmacniacz (ang. enhancer) funkcjonalnie połączony z sekwencją nukleotydową kodującą antygen lub jego fragment. Odpowiednimi promotorami mogą być: wczesny lub późny promotor SV40, np. w wektorze PSVL, promotor cytomegalowirusa (CMV), promotor mysiej metalotioneiny I i długie końcowe powtórzenie (LTR) wirusa mysiego raka sutka. Wektory przeważnie zawierają odpowiedni marker, taki jak gen dla reduktazy dehydrofolanu lub syntetazy glutaminianowej. Wektory tego typu są opisane w WO86/05807, WO87/04462, WO89/01036 i WO89/10404.
Transfekcję komórek gospodarza można uzyskać stosując standardowe techniki np. używając fosforanu wapnia, DEAE dekstranu, polibrenu, stosując fuzję protoplastów, liposomy, bezpośrednie mikrowstrzyknięcie, wstrzelenie genu lub elektroporację. Ostatnia technika jest preferowana, a metody transfekcji komórek ssaczych przy zastosowaniu elektroporacji opisane są przez Andreason i wsp., 1980. Ogólnie, liniowe DNA można wprowadzić łatwiej niż koliste DNA.
W przypadki białka H110D, stwierdzono unikalny i niezwykły wzór glikozylacji, który jest uważany na przyczyniający się do immunoaktywności, ponieważ wiele monoklonalnych przeciwciał otrzymanych dotychczas dla H110D z Haemonchus rozpoznaje epitopy węglowodanowe, co może być ważne przy wytwarzaniu przydatnych szczepionek.
W szczególności stwierdzono następujący wzór glikozylacji dla H110D z Haemonchus.
i. około 65% oligosacharydówjest połączonych poprzez wiązanie N-glikozydowe, pozostałe poprzez wiązanie O-glikozydowe;
ii. większa część (około 48% oligosacharydów połączonych wiązaniem N-glikozydowym należy do klasy oligasacharydów złożonych;
175 900 iii. prawie wszystkie (więcej niż 95%) oligosacharydy są nienaładowane;
iv. względna molarna zawartość składników monosacharydowych przedstawia się następująco: N-acetylogalaktozamina 1,0, fuko:za3,6, galaktoza4,1, glukoza 4,4, mannoza
6,2 i N-acetyloglukozamina 5,2;
v. oligosacharydy inne niż główny oligosacharyd (oznaczony jako oligosacharyd D) (są w dużym stopniu odpornie na degradację przez szerokie spektrum egzoglukozydaz (np. a-D-mannozydazy, β-D-mannozydazy, β-D-glukozydazy, β-D-galaktozydazy, α-Dgalaktozydazy, α-L-fukozydazy, β-D-ksylozydazy, β-D-N-acetyloglukozaminidazy).
Oligosacharyd D z glikoproteiny H1 DD Haemonhus jest połączony wiązaniem N-glikozydowym i ma nową strukturę złożoną z dwóch reszt fukozy połączonych wiązaniami α-1,3 i α-1,2 do rdzenia mannoza (N-acetyloglukozamina). Oligosacharyd ten ma następującą strukturę:
Man a 1
Man β-1,4 Gic ΝΑοβΙ, 4Glc Nac i_i (Fucal)2
Man α 1 a dokładniej strukturę:
Man α 1
Fuc al
I —> 4 Gic ΝΑοβΙ---> 4Glc Nac ctl
Fuc szczególnie wtedy, gdy jest przyłączony do białka np. białka zrekombinowanego, takiego jak białko aminopeptydazy robaków lub jego fragmentu antygenowego lub wtedy, gdy jest zastosowany do wytwarzania antydiotypowych antygenów, a w szczególności do immunizacji bardzo młodych zwierząt.
Glikoproteiny zwierzęce zwykle zawierają wiązanie α-1,6 fukoza, a wiązanie α-1,3 fukoza w oligosacharydzie przedstawionym w niniejszym wynalazku jest zjawiskiem rzadko spotykanym.
WO90/11086 zawiera zbiór sekwencji polipeptydów lub ich części otrzymanych w wyniku trawieniaproteolitycznego lub cięcia chemicznego białkowego dubletu H110D, przedstawiający
się następująco:
(a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu
Phe
(Ł>) tet yiy Phe Oro Val Ueu rhr Val Glu Ser
(c) Met Gly/Phe Asn Phe Lys Ile Glu/Val Thr/Glu
Ala Gly
(d) Mee Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/Lys
Leu - Ile Thr
175 900
(e) Met Leu TAL a Leu Asp Tyr His Ser t phe val
(f) Met Leu Ala Glu/Tyr AA3p Gln/Ala Glu Asp Val
(g) Met Phe Gly Phe Pro Leu Val Thr Val G1 u Ala Tyr
(h) Met Ala Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gln Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro
(i) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly
(j) Lys - Thr Ser Vv1 Ala Glu Ala Phe Asn
(k) Lys Ile Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - t - t Lyt Gly
(1) Lys Asp Ala Val Glu Va//Pot Ala Glu Ma Phe Asp Ile Thr?? Tyr t t Gly Pro Ser
(m) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile hht Asn Met
(n) Lys Leu - - - Pro Phe ysn/yst Ile Glu AALa
(o) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys
(p) Met Phe Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu t Ala Thr AALa Lee
(g) Met Ser Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu - Tyr? - Hir
(r) Met Ala Glu/Phe Asn Phe Leu Ile G1u/ViU Thr/Glu GGy - 11e Thr
(s) Met Tyr Gly Phe Leu Vaa Thr Vaa Glu AAL a Phe - Thr Ser
(t) Met Ala Lys TTir Pro lit het Ala Ίινί^βη Gln Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro
(u) Met Leu Lys Ppo/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/Lys - Ile Thr - Gly
(v) Met Gly? Leu AALa Leu Asp Tpr His Ser t Piet Val
(w) Met Leu AlLa Glu/Tyr Asp Gln/AHa Glu Asp Val
(X) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pito Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly
(y) Lys - Thir Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn
(z) Lys Ile Ala AALa Glu Vat AlLa Glu AHa Phe AAsp - - - - Lys Gly
175 900
(aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro All Gil Ala Phe
Asp Asp Ile Thr? Tyr - - Gil Pro Sse
(bb) Lys - Glu Gln Thr Glu Ile Phe Asn Met
(cc) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp 1le Glu
Ala Leu
(dd) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys
W przypadku wątpliwości zastosowano zapis Phe/Gly, gdzie pierwszy znak trzyliterowego kodu reprezentuje prawdopodobnie poprawny aminokwas, sądząc na podstawie siły sygnału, bądź też znak zapytania; znakoznacza aminokwas nieznany.
Termin polipeptyd użyty w niniejszym wynalazku obejmuje zarówno pełnej długości białko, jak i krótsze sekwencje peptydowe.
Określenie funkcjonalnie równoważny użyte powyżej w stosunku do sekwencji aminokwasowych polipeptydów oznacza polipeptydy spokrewnione z lub pochodzące od wspomnianych wyżej sekwencji polipeptydowych, w których sekwencja aminokwasowa została zmodyfikowana przez pojedyncze lub wielokrotne podstawienie aminokwasu, wstawienie lub delecję, a także sekwencję w których aminokwasy zostały chemiczne zmodyfikowane, włączając w to glikozylację i deglikozylację, a które mimo to zachowały antygenową (immunogenną) ochronną aktywność. Takie funkcjonalnie równoważne warianty występują jako naturalne, biologiczne odmiany lub mogą być wytworzone przy użyciu znanych technik, np. funkcjonalnie równoważne zrekombinowane polipeptydy mogą być wytworzone przy zastosowaniu znanych technik ukierunkowanej mutegenezy, losowej mutegenezy lub enzymatycznego cięcia i/lub łączenia aminokwasów.
Ogólnie syntetyczne polipeptydy uzyskane w wyniku ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku reprezentują ochronne sekwencje antygenowe. Termin antygen ochronny użyty w niniejszym zgłoszeniu definiuje takie antygeny zdolne do wytwarzania ochronnej reakcji immunologicznej (immunogennej) gospodarza, to jest odpowiedzi u gospodarza, która prowadzi do wytwarzania cząsteczek immunoefektora, przeciwciał lub komórek, które zapobiegają rozmnażaniu, uszkadzają, hamują rozwój albo zabijają pasożyty i tym sposobem chronią gospodarza przed stanem klinicznym lub podklinicznym choroby i utratą produktywności. Tego rodzaju ochronna odpowiedź immunologiczna może być często wyrażana poprzez wytwarzanie przeciwciał, które są zdolne do hamowania funkcji metabolicznej pasożyta, prowadząc do zahamowania rozwoju, braku wytwarzania jaj i/lub śmierci.
Syntetyczne polipetydy mogą być wytwarzane poprzez ekspresję w komórkach gospodarza zawierających sekwencję nukleotydową, obszerniej opisana powyżej, połączoną z sekwencją kontrolująca ekspresję lub zrekombinowany wektor do klonowaniaDNA lub wektor zawierający taką zrekombinowaną cząsteczkę DNA. Alternatywnie polipeptydy mogą być wyrażane poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do komórki gospodarza cząsteczek czystego DNA, którego dotyczy niniejszy wynalazek.
Syntetyczny polipetyd w taki sposób wyrażony może być fuzją polipeptydów, zawierającą część immunogenną pochodzącą z całej lub fragmentu aminopeptydazy i przyłączony do niej dodatkowy polipeptyd kodowany przez DNA zrekombinowanej cząsteczki. Przykładowo, pożądane może być produkowanie fuzji białkowej zawierającej syntetyczną aminopeptydazę lub inny polipeptyd, przyłączone do białka takiegojak β-galokozydaza, fosfataza, transfreaza-S-glutationu, ureaza, antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (Francis i wsp. 1989) i temu podobne. Większość fuzji białkowych wytwarzanych jest poprzez ekspresję zrekombinowanego genu, w którym dwie kodujące sekwencje zostały połączone razem przy zachowaniu ramki odczytu. Alternatywnie, polipeptydy mogą być połączone in vitro na drodze chemicznej.
Odpowiednie techniki rekombinowania DNA i ekspresji polipeptydów opisane są na przykład w Sambrook i wsp., 1989. Alternatywnie, syntetyczne polipeptydy mogą być otrzymane metodami chemicznymi, takimi jak dobrze znana procedura syntezy w fazie stałej Merrfielda.
175 900
Wynalazek dostarczając cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących aminopeptydazę umożliwia wytworzenie szczepionek do pobudzenia odpowiedzi immunologicznej przeciw infekcjom pasożytów przewodu pokarmowego u ludzi i innych organizmów, głównie ssaków.
Szczepionka może być wypwarzana metodami dobrze znanymi w dziedzinie produkcji szczepionek. W skład tradycyjnej szczepionki może wchodzić jeden lub więcej syntetycznych polipeptydów kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku łącznie, o ile to konieczne, zjednym lub więcej odpowiednimi adiuwantami, na przykład wodorotlenkiem glinu, saponiną, Qui1A lub ich bardziej oczyszczonymi formami, dipeptydem muramylu, olejami mineralnymi lub Novasomami, w obecności jednego lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub rozpuszczalników. Stosowane nośniki obejmują płynne podłoża, takie jak roztwory soli, odpowiednie do zastosowania jako przenośniki wprowadzające peptydy lub polipeptydy do organizmu pacjenta. Mogą tam być obecne dodatkowe składniki, takie jak środki konserwujące.
W skład innego rodzaju szczepionki może wchodzić wirus lub komórka gospodarza np. mikroorganizm (np. wirus krowianki, adenowirus, Salmonella), zawierające włączoną cząsteczkę kwasu nukleinowego (np. cząsteczkę DNA), według wynalazku, dla pobudzenia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw polipeptydom, kodowanym przez włączoną cząsteczkę kwasu nukleinowego. Podawanie szczepionki może odbywać się dowolną z konwencjonalnych dróg np. doustnie lub pozajelitowo, to jest poprzez zastrzyk domięśniowy, ewentualnie zastrzyki rozdzielone w czasie, np. dwa zastrzyki w odstępie 7-28 dni.
Jak wspomniano powyżej, aminokwasowy produkt translacji sekwencji nukleotydowej przedstawionej na figurach 2,3,4 lub 5 wykazuje homologię sekwencji z rodziną błonowych aminopeptydaz. Zostało to wykazane poprzez przeszukanie różnych baz danych dostępnych w pakiecie oprogramowania do analizy sekwencji, Genetics Computer Groupe, wersja 7.01 Listopad 1991 (Devereux i wsp., 1984), przy użyciu produktów translacji pokazanych na figurach 2,
3,4 lub 5. Dwa z takich porównań są przedstawione na figurze 6.
Ekspresja sekwencji kodujących aminopeptydazę, według wynalazku może być, jak wspomniano wyżej, osiągnięta przy zastosowaniu szeregu innych technik i systemów ekspresyjnych, włączając w to ekspresję w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli, i w komórkach eukariotycznych, takichjak drożdże, lub w systemie bakulowirus - komórki owadów lub w strasformowanych komórkach ssaczych i w transgenicznych zwierzętach i roślinach. Szczególnie korzystny jest fakt, że sekwencje nukleotydowe mogą być wyrażone przy zastosowaniu systemu transgenicznych nicieni, takiego jak system dla nicienia Caenorhabditis opisanego np. w Fire, (1986); Fire i wsp., (1989); Spieth i wsp., (1988); Han i wsp., (1990).
Wynalazek ten będzie teraz opisany dokładnej, ze szczególnym odniesieniem do białka H110D z Haemonchus contortus. Jednakże poprzez zastosowanie różnych technik takich, jak histochemia i hybrydyzacja DNA, ekwiwalenty H110D obserwowano też u innych gatunków pasożytów. Uważa się, że białko H110Djest wielogenowym kompleksem i dodatkowo, kodujące je sekwencje nukleotydowe mogą wykazywać warianty sekwencji w różnych szczepach i etapach cyklu życiowego robaków. Co więcej, mogą istnieć liczne formy enzymu (izoenzymy), różnicowo wyrażane w różnych stadiach lub różnych szczepach. W przedstawionym opracowaniu sekwencje DNA, a zatem przewidzialne sekwencje aminokwasów zostały określone na podstawie klonów cDNA i produktów PCR otrzymanych przy zastosowaniu metod rekombinowania DNA z mRNA odpowiadającego genowi H110D z różnych źródeł i różnych stadiów cyklu życiowego pasożyta H. contortus.
Sekwencjonowanie cDNA i produktów PCR umożliwiało zidentyfikowanie trzech ściśle spokrewnionych sekwencji H110D, które są tutaj oznaczone jako H11-1 (SEK NR ID: 19), H11-2 (SEK NR ID: 20) i H11-3 (SEK NR ID: 21). H11-1 obejmuje trzy ciągłe i nakładające się sekwencje, klon cDNA AustB1 (SEK NR ID: 6), produkt PCR A-648 (SEK NR ID: 9) i koniec 3' produktu PCR z 014-178 (SEK NR ID: 12); H11-2 obejmuje produkty PCR A-650 i 2.5kb (odpowiednio SEK NR ID: 10 i 7); H11-3 obejmuje produkty PCR 3.5kb i A-649 (odpowiednio SEK NR ID: 8 i 11). Specyficzne pokrewieństwo pomiędzy poszczególnymi sekwencjami cDNA i produktami PCR oraz H11-1, - 2 i -3 są zabrane na figurze 1 i pokazane szczegółowo na figurach 3,4 i 5.
175 900
Zaobserwowano różnice i warianty sekwencji otrzymanych dla klonów cDNA i produktów PCR, co widać szczegółowo na figurach 2, 3,4 i 5 (złożonych z SEK NR ID: 1 do 15 i 19 do 21) i co jest zebrane w tabeli 1.
Tabela 1
Homologia wydedukowanej sekwencji aminokwasowej otrzymanej w wyniku translacji sekwencji nukleotydowych pokazanych na figurze 2
% Podobieństwa % Identyczności
H1.1-1: H11-2 77 63
H11-1: H11-3 79 65
H11-2: H11-3 82 69
Różnice można przypisywać różnym mRNA (z rodziny wielogenowej). Dodatkowo różnice mogą być związane, przynajmniej w części, z różnymi wariantami sekwencji kodującej H110D lub mRNA obecnymi w różnych stadiach cyklu życiowego lub w szczepach różniących się pochodzeniem geograficznym.
Tabela 2 dodatkowo pokazuje poziomy identyczności lub podobieństwa pomiędzy odpowiednimi przewidzianymi sekwencjami aminokwasów i dwiema opublikowanymi sekwencjami ssaczej aminopeptydazy.
Tabela 2
Homologia aminokwasów H110D z aminopeptydazy M (ApM) szczura i aminopeptydazy A (ApA) myszy
% Podobieństwa % Identyczności
H11-1: ApM 55 32
H11-1 :ApA 55 31
H11-2: ApM 52 31
H11-2: ApA 54 31
H11-3: ApM 53 32
H11-3: ApA 52 30
Figura 1 pokazuje mapę zsekwencjonowanych klonów cDNA i produktów PCR dla H110D z H. contortus oraz ich związki i wzajemne położenie na H110D mRNA;
Figura 2 pokazuje sekwencję nukleotydową H110D oznaczoną H11-3, (SEK NR ID: 21, pochodzącą ze sklonowanych produktów PCR sEk NR ID: 8 i 11 i klon cDNA M1AUS, SEK NR ID: 5), H11-2 (SEKNR ID: 20, pochodzącą ze sklonowanych produktów PCR SEK NR ID: 7 i 10) oraz H11-1 (SEK NR ID: 19, pochodzącą ze sklonowanych produktów PCR SEK NR ID: 9 i 12 oraz klonu cDNA AustB1 SEK NR ID: 6);
Figura 3 pokazuje sekwencję H11-3 (SEK NR ID: 21) (pokazaną na figurze 2) z zaznaczonym położeniem klonów cDNA M1 i M1AUS (SEK NR ID: 1 i 5);
Figura 4 pokazuje sekwencję H11-2 (SEK NR ID: 20, pokazaną na figurze 2) i położenie klonu cDNA B2 (SEK NR ID: 4);
Figura 5 pokazuje sekwencję oznaczoną H11-1 (SEK NR ID: 19) i położenie cDNA B1A i AustBł (SEK NR ID: 2 i 6, odpowiednio);
Figura 6 pokazuje a) przewidziane sekwencje aminokwasów (SEK NR ID: 22, 23 i 24) pochodzące z sekwencji DNA H11-1, H11-2 i H11-3 pokazanymi na figurze 2; bi) i ii) pokazują przewidzianą sekwencję aminokwasów H11-3 porównaną odpowiednio z opublikowaną sekwencją aminokwasów mikrosomalnej aminopeptydazy M szczura (Watt i wsp., 1989) i mikrosomalnej aminopeptydazy A myszy (Wu i wsp., 1990); zaznaczone są reszty identyczne, kreski oznaczają odstępy wprowadzone dla uzyskania największego stopnia homologii pomiędzy porównywanymi sekwencjami. Użyty jest ogólnie przyjęty jednoliterowy kod dla aminokwasów. Horyzontalna linia powyżej sekwencji oznacza pozycję regionu wewnątrzbłonowego, a
175 900 gwiazdki pokazują pozycję motywu wiążącego cynk. Stopnie podobieństwa pokazanego są w tabelach 1 i 2;
Figura 7 pokazuje wzajemne położenie sekwencji aminokwasowych (oznaczonych Pep A, Pep B, Pep C, Pep D i Pep E) otrzymanych poprzez CNBr oraz fragmentów Lys C H110D opisanych poprzednio (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe WO90/11086 i jak wymieniono wcześniej, sekwencje polipeptydowe odpowiednio (a), (b), (e), (k) i (aa)) i trzech nowych sekwencji (SEKNRID: 16,17 i 18) otrzymanych z H1WD po trawieniu elastazą lub termolizyną, względem produktów translacji a) H11-1, b) H11-2 i c) H11-3.
Dalsza część niniejszego wynalazku dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych obejmujących jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych, które w sposób istotny odpowiadają lub są w sposób istotny komplementarne do jednej lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji klonów Ml, B1A, B1A-3', B2, M1AUS, AustB1, 014-15 (2.5PCR), 014-872 (3.5PCR klon 2), A-648 (koniec 5' 2.5PCR), A-649 (koniec 5' 3.5PCR), 014-178 (koniec 3' klonu 2 AustB1), 014-178 (koniec 3' klonów 3 i 6 AustBł), 014-872 (3.5PCR klonu 10) i 014-872 (3.5PCR klonu 19), H11-1, H11-2 i H11-3, SEKNRID: 1do 15 i 19 do 21, jak pokazano na figurach 2 3,4 i 5, lub sekwencji, które są w sposób zasadniczy homologiczne z lub, które hybrydyzują z dowolną z wymienionych sekwencji.
Jak wspomniano powyżej, porównanie wymienionych wyżej różnych sekwencji ze znanymi sekwencjami w komputerowej bazie danych wykazuje istotną homologię z rodziną mikrosomalnych aminopeptydaz (EC. 3.4.11.-). Badania aktywności enzymatycznej inhibitorów, wykonane dla białka H110D i jego subfrakcji potwierdzają, że białko to jest rzeczywiście mikrosomalną aminopeptydazą (hydrolaza α- amino-acylopeptydowa (mikrosomalna)). Badania takie wykazały ponadto obecność aktywności aminopeptydazy zarówno typu A, jak i M oraz, że każda z części składowych dubletu H110D oddzielnie wykazuje aktywność enzymatyczną.
Prowadzono również badania z zastosowaniem proteolitycznego trawienia H1 DD. Stosując enzym elastazę stwierdzono, że H110D może być trawiony częściowo, tworząc dwie frakcje, frakcję rozpuszczalną w detergencie (która pozostaje z błonami) oraz frakcję rozpuszczalną w wodzie (oznaczoną H11S).H11S występuje w formie dimeru białkowego, który można podzielić na dwie części składowe. Interesujące jest, że w rozpuszczalnej w wodzie frakcji H11S stwierdzono tylko aktywność typu aminopeptydazy M, natomiast aktywność typu aminopeptydazy A była związana z frakcją rozpuszczalną w detergencie.
Przedstawiony poniżej przykład przedstawia opis badań, prowadzących do określenia sekwencji, pokazanych na figurach 1 do 7, które mają odniesienie do następujących dodatkowych figur, w których:
Figura 8 pokazuje wynik analizy białek błonowych obecnych w ekstraktach detergentowych dojrzałych osobników Haemonchus contortus, wykonanej techniką Western stosując oczyszczone poprzez powinowactwo przeciwciała izolowane z potencjalnych klonów H110D; a) w ekstrak^e Haemonchus rozpoznawane przez antysurowicę przeciw ekstraktowi; b) przeciwciała wymyte z paska filtru z podpunktu a), potwierdzające powodzenie etapu wymywania poprzez ponowy test z użyciem filtru z ekstraktem detergentowym; c) przeciwciała z b) wiążące się do białek wyrażanych w klonie M1, silnie rozpoznające region 110 kD (i stosunkowo ostre pasmo około 205 kD; d) brak wiązania przeciwciała, gdy do zaadsorbowanła surowicy używanajest forma niezrekombinowana;
Figura 9 pokazuje wyniki analizy MRNA oczyszczonego z 11,15 i 23-dniowego Haemonchus contortus wykonane techniką Northern z zastosowaniem sond a) klon cDNA M1 (SEK NR ID: 1); b) klon cDNA M1 AUS (SEK NR ID: 5); c) klon cDNABłA (SEK NR ID: 2 i 3); d) klon cDNA AustB1 (SEKNRID: 6);e)sklonowanyprrduktPCR014-()15 (SEKNRID: 7). Numery 11, 15 i 23 oznaczają wiek Haemonchus, z którego otrzymano mRNA;
Figura 10 pokazuje wyniki analizy genomowego DNA Haemonchus contortus wykonanej techniką Southern z użyciem jako sondy klonów cDNA M1AUS (SEK NR ID: 5), B1A (SEK NR ID: 2 i 3) i AustB1 (SEK NR ID: 6) oraz produkty PCR 014-872 (3.5-2, SEK NR ID: 8) i 014-015 (SEK NR ID: 7); a) filtry były płukane w warunkach łagodnych, b) filtry były płukane w warunkach ostrych; dla każdej sondy ścieżka pierwsza zawierała produkty trawienia DNA
175 900 faga λ jako standard wielkości lub była pozostawiona pusta, ścieżka 2 i 3 zawierały produkty trawienia geneomowego DNA Haemonchus enzymami odpowiednio EcoRI i HindIII;
Figura 11 pokazuje wyniki analizy zrekombinowanych fuzji białkowych GST-M1 i GST-B1A metodą Western z użyciem oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa przeciwciał przeciw elektroforetycznie oczyszczonego H110D (H110DE);
Figura 12 pokazuje wyniki badania antygenu ConA H110D metodą Western z użyciem przeciwciał przeciw ConA H110D oraz przeciw zrekombinowanym fuzjom białkowym GSTM1 i GST-B1A;
Figura 13 pokazuje a) wyniki analizy białka H110D i aktywności aminopeptydazy we frakcji otrzymanej poprzez chromatografię jonowymienną ConA H110D na kolumnie MonoQ; b) SDS-PAGE frakcji pokazanych na figurze 13a);
Figura 14 pokazuje a) wartości pH przy których otrzymano frakcje w eksperymencie ogniskowania izoelektrycznego w wolnym przepływie; b) SDS-PAGE frakcji z punktu 14a) w warunkach redukujących, gdzie niższe pasmo dubletu H110D jest znajdowane we frakcji 6, a wyższe pasmo we frakcji 16, z różnym poziomem zawartości każdego z nich w frakcjach pośrednich; c) badanie frakcji pokazanych na figurze 14b) metodą Western z użyciem i) monoklonalnych przeciwciał oznaczonych TS 3/19.7 i ii) poliklonalnych przeciwciał anty-M1 oczyszczonych poprzez chromatografię powinowactwa; przeciwciała kontrolne nie dają wykrywalnej reakcji;
Figura 15 pokazuje a) wartości pH, przy których otrzymano frakcje w innym eksperymencie ogniskowania izoelektrycznego w wolnym przepływie; b) SDS-PAGE w warunkach redukujących frakcji z punktu 15a) użytych w testach enzymatycznych, gdzie niższe pasmo dubletu H110D jest znajdowane we frakcjach 4-6, a wyższe pasmo we frakcjach 16-18, z różnymi ilościami każdego z pasm we frakcjach pośrednich; c) specyficzne aktywności mikrosomalnej aminopeptydazy we frakcjach pokazanych na figurze 15b);
Figura 16 pokazuje ochronę owiec poprzez zaszczepienie rozdzielonymi pasmami H110D: wyższym (U), niższym (L) połączonymi (U+L) i dubletu pośredniego (D); a) produkcja jaj pasożytów wyrażana jako ilość jaj na gram kału, b) liczba robaków określona pośmiertnie w odniesieniu do kontroli;
Figura 17 pokazuje zabezpieczenie owiec poprzez zaszczepienie rozpuszczalnym w wodzie fragmentem (H11S) otrzymanym z H110D w wyniku trawienia elastazą oraz H11A, pozostałą część H110D rozpuszczalna w detergencie, a) produkcjajaj pasożytów wyrażanajako ilość jaj na gram kału, b) liczba robaków określona pośmiertnie w odniesieniu do kontroli (C);
Figura 18 pokazuje przykłady zależności między hamowaniem Ai), Bi) aktywności typu aminopeptydazy M i Aii), Bii) aktywności typu aminopeptydazy A H110D przez antysurowice poszczególnych owiec zaszczepionych H110D, a poziomem zabezpieczenia mierzonym jako Ai, ii) % obniżenia liczby robaków określonej pośmiertnie i Bi, ii) % obniżenia liczby jaj w kale;
□ anty-H110D, E3 kontro] aanty-ferrytynakoma;
Figura 19 pokazuje histochemiczną lokalizację aktywności aminopeptydazy u dojrzałego Haemonchu. contortus - obraz zamrożonych skrawków dojrzałego osobnika żeńskiego Haemonchus contortus w mikroskopie świetlnym pokazuje aktywność aminopeptndozn (czerwony produkt reakcji pojawia się jako czarne pasmo (zaznaczone strzałką) na zamieszczonych czarno-białych fotografiach) związanej jedynie z miafoaosmaomi (mv) jelita (i). W żadnej innej tkance (np. nabłonku (c), hypodermie (h) przewodach rozrodczych (gt), mięśniach osłony (wm) nie wymywa się aktywności. W a) substratem był 4 metoksy-P-naftyloamid L-leucyny, w b) substratem był α-(4-m-toksy-β-noftyloamid) kwasu L-glutaminowego;
Figura 20 pokazuje mapę produktu PCR 3.5 (klon 2) (SEK NR ID: 8) przeklonowanego na bokulowirusown wektor ekspresyjny pBlueBacIIR
Figura 21 pokazuje wyniki badania metodą Western z użyciem przeciwciał anty H110DN ekstraktu z komórek owada Spodoptera frugiperda (Sf)9 infekowanych bakulowirusem. W dwóch otrzymanych po klonowaniu łysinkach, P3A i P4A, uzyskano ekspresję pełnej długości immunododatniego H110D (zaznaczonego strzałką), kontrole nie wykazywały ekspresji.
175 900
Przykład
METODY
Konstrukcja biblioteki U. K. XGT11
Izolacja mRNA
Dojrzałego osobnika Haemonchus contortus (0,5 g) pochodzącego z Wielkiej Brytanii (U. K.) szybko zamrożonego w ciekłym azocie roztarto w ciekłym azocie używając schłodzonego moździeża i tłuczka. RNA ekstrachowano z roztartego materiału stosując 10 objętości 4M wodorotlenku guanidyny w 25 mM cytrynianie sodu zawierającym 0,5% w/v sarkozyl i 0,7% w/v 2-merkaptoetanol, po czym ekstrachowano fenolem i chloroformem stosując metodę wg. Chomczynski i Sacchi (1987). Matrycowy RNA (mRNA) izolowano poprzez chromatografię powinowactwa na oligo dT celulozie (dwukrotnie), jak opisano w Maniatis i wsp., (1982) i jego jakość określano poprzez in vitro translację przy użyciu lizatu z retikulocytów królika i 35S-metioniny z firmy Amersham International, zgodnie z instrukcjami producenta. Wykrywano polipeptydy ó wielkości do 120 kD.
Przygotowanie komplementarnego DNA
Pierwszą nić komplementarnego DNA (cDNA) syntetyzowano z Dg mRNA stosując losowe startery i ptasią odwrotną transkryptazę, a drugą nić syntetyzowano stosując reakcję wymiany z RNAzą H i E. coli Polimerazą I DNA, po czym wypełniano wystające końce 3' używając Polimerazy DNA T4 metodą wg. Gulber i Hoffman (1983). Wydajność otrzymywania dwuniciowego (ds) cDNA była około 400 ng z 1 μg mRNA. ds cDNA nadano poprzez elektroforezę w 1% żelu agarozowym, a następnie autoradiografię. Wielkość ds cDNA mieściła się w granicach 0,2-9,4 tysięcy par zasad (kb), przy czym większość zawierała się w zakresie 0.5 do 2.3 kb.
Klonowanie cDNA na Xgt11 cDNA nie rozdzielone pod względem wielkości użyto do skonstruowania biblioteki na Xgt11 stosując system klonowania cDNA firmy Amersham (zestaw nr RPN 1280, Amersham International) i ekstrakt do pakowania in vitro (zestaw nr N334, Amersham International), jako opisano w instrukcjach producentów, oraz łączniki oligonukleotydowe EcoRI (5' GGAATTCC). Otrzymaną biblioteką infekowano szczep E. coli Y1090 w obecności izopropylo-β-D-galaktozydu (IPTG) i 5-bromo,4-chloro,3-indylo β-D-galaktozydu (X-gal), w których to warunkach zrekombinowane Xgt11 pojawiają się jako przejrzyste (białe) łysinki, a niezrekombinowane Agtll typu dzikiego jako niebieskie łysinki. Biblioteka zawierała 90% białych łysinek, a wydajność klonowania obliczono jako 4x107 jednostek tworzących łysinki (pfu)/pg cDNA i miano biblioteki jako 2x106 jednostek tworzących łysiki na ml. Analiza DNA z 20 zrekombinowanych, losowo pobranych łysinek wykazała, że średnia wielkość wstawkijest 0.51 kb, jednakże to oznaczenie było zaburzone przez jeden klon z wstawką 3.5 kb. Większość wstawek była > 300 zasad (bp). Taka niezamplifikowana biblioteka pochodząca z mRNA robaka z U. K. była następnie przeszukiwania metodami immunologicznymi.
PRZYGOTOWYWANIE PRZECIWCIAŁ DO UŻYCIA JAKO SONDY
Antysurowica przeciw białkom błonowym
Z dojrzałego osobnika Haemonchus contortus (pochodzącego z Wielkiej Brytanii) wycięto jelita i poddano je homogenizacji w schłodzonym w lodzie roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,4, zawierającym 1 mM kwas etylenodwuaminoczterooctowy (EDTA) i 1 mM fenylometylosulfofluorek (PMSF). Homogenat wirowano przez 10 minut w mikrowirówce, osad zawieszano w tym samym buforze zawierającym 0,1 % v/v Tritonu X-100 i poddawano ekstrakcji przez dwie godziny w temp. 4°C. Otrzymany ekstrakt wirowano jak wyżej w celu otrzymania supernatantu zawierającego białka błonowe (IMP).
Owcę immunizowano IMP w kompletnym adiuwancie Freunda (FCA) poprzez domięśniowe wstrzyknięcie 50,50,120 i 130 gg IMP w 0,7,11 i 15 tygodniu. Sześć tygodni po ostatnim zastrzyku pobierano surowicę, oznaczając ją jako surowicę EE-068. Otrzymywanie białek błonowych poprzez ekstrakcję Haemonchus contortus detergentem.
175 900
Ekstrakt przygotowywano poprzez homogenizację robaków w 5-10 objętościach PBS zawierającego 1 mM EDTA i 1 mM PMSF. Zawiesinę wirowano przy 10000 x g przez 20 minut w temp. 4°C i osad przemywano tym samym buforem zawierającym 0,1% v/v Tween 20, a następnie ekstrachowano 5 objętościami 2% v/v Tritonu Χ-100 tak, jak opisano powyżej. Supematant ponownie wirowano przy 100000 x g przez 1 godzinę i otrzymany supematant, wzbogacony w H110D, ale zawierający inne IMP, użyto w eksperymentach Western oraz do otrzymywania niezdenaturowanego H110D (patrz niżej).
Otrzymywanie H110D i Anty-Hi 10DN oczyszczone przez chromatografię powinowactwa.
Ekstrakt wzbogacony w H110D poddano chromatografii powinowactwa na ConA-agarozie, a następnie chromatografii jonowymiennej na MonoQ (tak jak opisano w WO88/00835 i WO90/11086). Oczyszczone H110D w FCA wstrzyknięto domięśniowo jagniętom. Trzy dawki i po 100 gg podawano w odstępach 3 tygodni. Surowicę pobieraną z jagniąt 4 tygodnie po ostatnim zastrzyku oczyszczano poprzez chromatografię powinowactwa na kolumnie zawierającej oczyszczone H110D związane ze złożem Sepharose (Pharmacia) aktywowanym bromocyjanem. Sprzęganie H110D ze złożem Sepharose, wiązanie antysurowicy i wypłukiwanie przeciwciał anty-H110D wykonywano zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez firmę Pharmacia. W taki sposób oczyszczone przeciwciała oznaczono jako anty-H110DN. Litera N odróżnia te przeciwciała od przeciwciał zdenaturowanemu i oczyszczonemu elektroforetycznie H110D, oznaczonych jako anty-H11.0DE.
Technika Western
Technikę Western stosowano przy użyciu standardowych protokołów (Johnstone i wsp., 1982).
IZOLACJA I CHARAKTERYZOWANIE KLONÓW
Przeszukiwanie biblioteki U. K. Tgtii metodami immunologicznymi
Do przeszukiwania biblioteki użyto metody immunologicznej zasadniczo tak, jak opisano w Bowtell i wsp. (1986). Z surowicy (EE-068) przed użyciem usunięto poprzez absorbcję przeciwciała anty-E. coli stosując lizat lub całe komórki E. coli Y1090. Bibliotekę wysiano na szczep E. coli Y1090 przy gęstości 103 pfu na płytkę o średnicy 90 mm. Na płytki położono filtry nitrocelulozowe nasączone IPTG i inkubowano przez noc. Następnie filtry płukano TBST (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Tween 20), a następnie blokowano 5% v/v surowicą końską w TBST przez 2 godziny. Dodawano surowicę EE-068 rozcieńczoną 1 do 200 w TBST zawierającym 5% surowicę końską i filtry inkubowano przez 4 godziny z łagodnym kołysaniem. Filtry przepłukiwano ponownie TBST, a następnie inkubowano przez 2 godziny z końskimi antyowczymi IgG sprzęgniętymi z peroksydazą z chrzanu (HRP), rozcieńczonymi 1 do 500 w TBST zawierającym 5% surowicę końską. (Antysurowicę przeciw owczej IgG otrzymano z konia, anty-owcze IgG oczyszczano poprzez chromatografię powinowactwa na kolumnie ze złożem: Sefaroza-owcze IgG, a przeciwciała sprzęgnięto z HRP stosują metodę Nakane i Kawaoi, 1974.). Filtry płukano następnie w TBST i pozytywne łysinki wykrywano stosując 0,6 mg/ml, 3,3' -dwuaminobenzydyny (DAB) i 0,1% v/v nadtlenku wodoru. Dwadzieścia pięć potencjalnych pozytywnych łysinek pobrano i ponownie przetestowano z oczyszczonymi poprzez chromatografię powinowactwa anty-H110DN tak, jak opisano powyżej. Po tym teście 5 zerkombinowanych klonów pozostawało pozytywnymi, wśród nich klon oznaczony jako M1 dawał najmocniejszy sygnał.
Oczyszczanie przeciwciał ze zrekombinowanego faga poprzez chromatografię powinowactwa
Przygotowano płytki z murawą E. coli Y1090, na które wysiano 103 pfu każdego z pozytywnych klonów X lub niezrekombinowany Agt11 jako kontrolę negatywną. Płytki inkubowano 4 godziny w 42°C, a następnie nakładano na nie filtry nasączono IPTG i dalej inkubowano przez noc w temp. 37°C. Filtry zdejmowano z płytek i płukano w TBST, po czym blokowano w 5% v/v końskiej surowicy przez 1 godzinę. Filtry były następnie inkubowane z antysurowicą EE-068 rozcieńczoną 1 do 100 przez 6 godzin, po czym starannie płukane TBST. Związane przeciwciała wymywano z filtrów stosując dwukrotnie przez 2 do 3 minut 2 ml buforu do wymywania (5 mM glicyna, 500 mM NaCl, 0,2% Tween 20, pH 2,3), zobojętniano przez dodanie 200 gl 1 M Tris-HCl, pH 7,4, rozcieńczano 1 do 200 i używano do analizy filtrów z ekstraktami wzbogaconymi w H110D stosując technikę Western.
175 900
SEKWENCJONOWANIE DNA KLONU M1
DNA faga lambda izolowano z klonu Ml zgodnie z metodą opisaną w Maniatis i wsp. (1982). 2.38 kb fragment KpnI-SstI zawierający 300 bp fragment Ml izolowano poprzez elektroforezę w żelu, oczyszczano stosując zestaw GENECLEAN (Stratagene) (GENECLEAN jest zastrzeżonym znakiem firmowym BI0101) i subklonowano w wektorze pBluescript IISK+ (Stratagene). Fragment EcoRI oczyszczano stosując tą samą metodę i powtórnie subklonowano w tym samym wektorze.
Sekwencję nukleotydową wstawki M1 określono używając zestawu T7 Sequencing kit (Pharmacia, U. K.), stosując dwa startety dla M13, przed i za miejscem klonowania (forward i reverse).
PRZYGOTOWANIE BIBLIOTEK AUSTRALIJSKICH NA AGT11 i AZAP.
Izolowanie mRNA g dojrzałego Haemonchus contortus (wrażliwy szczep McMaster z Australii) szybko zamrożono w ciekłym azocie, roztarto w ciekłym azocie i RNA ekstrachowano stosując gorący fenol zgodnie z metodą Cordingley i wsp. (1983). Uzyskano 10,35 mg całkowitego RNA.
1,3 mg tego RNA użyto do otrzymania mRNA poprzez chromatografię powinowactwa na ollgo dT celulozie (oczyszczanie wykonane dwukrotnie) stosując metodę opisaną w Maniatis i wsp. (1982). Uzyskano 21,6 gg mRNA. Jakość mRNA sprawdzano poprzez translację in vitro w lizacie retikulocytów z królika w obecności 35S-metioniny (Amersham) zgodnie z instrukcją producenta. Otrzymane produkty translacji dawały wyraźne prążki, włączając w to prążki o wielkości >200 co wykazano poprzez elektroforezę w żelach poliakrylamidowych z SDS i fluorografię.
Synteza cDNA i otrzymanie biblioteki cDNA zrobiono przy użyciu 1 gg mRNA, stosując jako startery oligo dT lub startery losowe i zestaw do syntezy cDNA z firmy Amersham International plc i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskano 115 ng dwuniciowego (ds) cDNA. Jakość cDŃA sprawdzano poprzez elektroforezę wyznakowanego 32p DNA w alkalicznym żelu agarozowym tak, jak opisano w instrukcjach do zestawów cDNA firmy Amersham. Wielkość cDNA (przez porównanie ze standardami wielkości λ-HindIII, New England Biolabs) wynosiła od 150 bp do >10 kb, przy czym większość produktów miała wielkość pozostającą w zakresie 0,6-5 kb, ds cDNA otrzymane poprzez użycie oligo dT i losowych starterów połączono i poddano ligacji z nadmiarem 8-metrowych łączników EcoRI (5' GGAATTCC 3' New England Biolabs, nr katalogowy 1018) wyznakowanych γ-P-ATP przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4. cDNA połączony z łącznikami trawiono EcoRI, a nadmiar łączników usuwano wykonując chromatografię na złożu Sepharose 4B (Pharmacja), zgodnie z metodami opisanymi w Maniatis i wsp. (1982). Frakcje z kolumny łączono tworząc dwie oddzielne pule, jedna zawierająca cDNA większe niż 2 kb i druga z cDNA mniejszymi niż 2kb. Każda z pul była następnie oddzielnie poddawana ligacji z 1 gg strawionych EcoRI i fosfatazowanych ramion AZapII (Stratagene) i zapakowana osobno przy użyciu Gigapack Gold (Stratagene, znak zastrzeżony). cDNA o większej masie cząsteczkowej dało 1,3 x 105 rekombinantów natomiast cDNA o mniejszej masie cząsteczkowej 1,4 x 10S rekombinantów; rekombinanty połączono razem uzyskując bibliotekę złożoną z 2,7 x 105 klonów. Bibliotekę na AZap namnożono poprzez wysiew na komórki XL 1-Blue (Stratagene) przy gęstości 2 x 104 pfu na płytkę o średnicy 135 mm. Miano namnożonej biblioteki było 7 x 10 pfu/ml.
Dalsze 2 gg mRNA użyto do zrobienia cDNA, tak jak opisano powyżej, ale stosując jako starter tylko oligo dT. Uzyskano 740 ng ds cDNA. Przed dodaniem łączników EcoRI, w tym przypadku łączników 12-merowych (5' CCGGAATTCCGG 3' New England Biolabs, nr katalogowy 1019) cDNA poddano działaniu metylazy EcoRI, jak opisano w Maniatis i wsp. (1982). Po trawieniu cDNA połączonego z łącznikami enzymem EcoRI, wszystkie frakcje z kolumny ze złożem Sepharose 4B zawierające cDNA połączono i poddano ligacji z 2 gg strawionych EcoRI i fosfatazowych ramion Agt11 (Stratagene). Mieszanina ligacyjna została podzielona na dwie części i zapakowana z dwoma porcjami Gigapack Gold (Stratagene), które po połączeniu dały bibliotekę Agt11 7 x 106 pfu. Bibliotekę namnożono poprzez wysianie na komórki ST9 przy
175 900 gęstości 5 x 105 pfu na płytkę o średnicy 135 mm. Miano namnożonej biblioteki Xgt11 było
4.5 x 1011 pfu/ml.
Przeszukiwanie Australijskiej Biblioteki Kgtll antysurowicą przeciw H110D
Antysurowicę wytworzono poprzez wstrzyknięcie owcy białka H110D (pochodzenia angielskiego), które uprzednio odzyskano w wyniku elektroelucji z żelu akrylamidowego po elektroforezie w SDS zgodnie z następującą metodą: ConA H110D przygotowany tak, jak opisano w WO 88/00835 i W0 00/10086 ooddanoelektrofoezzie avpoliabyyImnidavych eelcch z SDS (Laemmli, 1970) w celu otrzymania po elektroelucji H110D. Po elektroforezie, kawałek żelu zawierający H110D został wycięty, umieszczony w aparacie do elektroelucji (Atto) i poddany elucji przez 3 godziny przez 10W. Odzyskane poprzez elektroelucję H110D (oznaczone H1.10DE) zatężono na Centiprep 10 (Amicon), bufor zamieniono na kolumnie PD 10 (Pharmacia) na 50 mM wodorowęglan amnnu00,07% SDS, zmieszano z adiuwantem, a następnie wstrzyknięto owcy. Immunngeo0uliny wytrącono z surowicy siarczanem amonu (Johnstom i Thorpe, 1982). Wytrącone przeciwciała zawieszano w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym tak, aby uzyskać 60 mg/ml, dializowano wobec soli fizjologicznej z 0uforemfosforaanwym i rozcieńczano 1:10 w soli fizjologicznej buforowanej Trisem (TBS) zawierającej 5% w/v odtłuszczonego mleka. Do 10 mg.ConA H110 dodano SDS do stężenia 0,5%, podgrzano do 100°C przez 3 min i wysuszono na filtrze nitrocelulozowym. Po przepłukaniu TBS zawierającym 0,2% v/v Tween 20 i 0,5% Triton Χ-100 (TBSTT) filtr iakubowdan z przeciwciałami przeciw H110D przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Po płukaniu filtrów przez 2 godziny w TBSI, związane przeciwciała wymywano 3 ml roztworu 0,1M glicyna, 0,15 M NaCl pH 2,6 przez 2 minuty i natychmiast doprowadzano do pH obojętnego poprzez dodanie 75 pl i
1.5 M Tris pH 8,0. Takie oczyszczone poprzez powinowactwo przeciwciała, oznaczone antyH110DE, użyto do przeszukania 5 x 10^pfu z australijskiej biblioteki cDNA na fagu Xgt11, tak jak opisano powyżej.
5x105 rekombina^^ów z biblioteki na Xgt11, pochodzącej od australijskiego Haemonchus contortus przeszukano stosując przeciwciała i znaleziono trzy klony pozytywne. Po dalszej analizie dwa z tych reknm0indatów pozostały pozytywne i oznaczono je B1A i B2.
Sekwencjonowanie klonów B1A i B2
Dwa klony poddano trawieniu EcoRI, uzyskując pojedynczą wstawkę o wielkości około 500 bp dla B1A i trzy fragmenty dla B2, B2A (około 400 bp), B2B (około 100 bp) i B2C (około 100 bp). Fragmenty te su0klnaowdan w wektorze pBluscript SK+ (Stratagene^ sekweacjonnwano używając zestawu Seąuenase 2,0 (United States Binchemicals).
EKSPRESJA KLONÓW M1 i B1A
Uzyskano ekspresję w E. coli wstawki M1 (SEK NR ID: 1) i B1A (SEK NR ID: 2 i 3), stosując wektor pGEx (Smith i Johnson, 1988). W wektorze tym białko wytwarzane jest na końcu C transferazy S^^tat^mu (GST) z Schistosoma japonicum. Wstawki EcoRI M1 i B1A poddawano ligacji z przeciętnym EcoRI, fosfatdznwdnym wektorem pGEXl i transformowano szczep E. coli JM 101 zgodnie z metodą opisaną w Maniatis i wsp. (1982). Z każdej transformacji pobrano osiem klonów i hodowano w 2 ml przez 6 godzin w 37°C. Dodano IPTG dla zabukowania syntezy fuzji białkowej i kontynuowano inkubację przez noc. Komórki zbierano poprzez wirowanie, rozbijano gotując w buforze do nanoszenia (Laemmli, 1974) i ekstrakty aaaliznwdan przez SDS-PAGE i technikę Western stosując oczyszczone przez powinowactwo owcze przeciwciała specyficzne w stosunku do dubletu H110D z deaaturowdaegn przy użyciu SDS (a^ty-H110DE - patrz wyżej). Związane przeciwciała wykrywano stosując królicze antyowcze IgG sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Jackson ImmuaoresedbcC) i wywołując kolor
5-0romo,4-cClnro,3-in0oeilnfosfnranem (BCIP) i błękitem tetraznlowym (NBT). Hodowle klonów immunopozytywaycC hodowano i indukowano jak wyżej i rozbijano przez sonikację. Otrzymany ekstrakt rozdzielano na frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne poprzez wirowanie (wirówka Somali RC-28, rotor HS4, 7000 rpm, 30 minut, 4°C). Nierozpuszczalne osady zawieszono w 8 M moczniku poddając je sonika^i i próbki frakcji analizowano poprzez SDS-PAGE. Stwierdzono obecność fuzji białkowych w nierozpuszczalnej frakcji ciałek inkluzyjnych. Każdy z tych preparatów użyto do trzykrotnego zaszczepienia dwóch owiec dawkami
175 900 po 150 (ig fuzji białkowych w adjuwancie Freunda. Owce będące kontrolą pozytywną immunizowano natywnym białkiem ConA H110D, a owce będące kontrolą negatywną immunizowano upłynnionymi białkami z E. coli, zawierającej wektor pGEX bez wstawki Haemonchus. Surowice z zaszczepionych owiec analizowano techniką Western używając H110D.
PRZESZUKIWANIE AUSTRALIJSKIEJ BIBLIOTEKI NA XZAP POPRZEZ HYBRYDYZACJĘ DNA ZE WSTAWKAMI M1 I B1A
DNA plazmidów M1 i BI A (sklonowanych w pBiuescript) strawiono EcoRI i wstawki izolowano poprzez elekroforezę w buforze TBE (Tris-boran-EDTA; 89 mM Tris-boran, 89 mM kwas bomy, 2 mM EDTA pH około 8,3) w 1% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano przy zastosowaniu zestawu GENECLEAN. Izolację i oczyszczanie powtórzono w celu uniknięcia zanieczyszczenia sondy sekwencjami plazmidowego DNA, powodującymi niedopuszczalny poziom tła. Oczyszczone wstawki DNA znakowano a-32P-dCTP stosując zestaw Nick Translation z firmy Promega Biotech, zgodnie z instrukcjami producenta. Wyznakowany DNA oddzielano od niewłączonego znaku chromatograficznie przez wirowanie na kolumnie (Maniatis i wsp., 1982). Bibliotekę XZap wysiano na osiem płytek o średnicy 135 mm przy gęstości 105 pfu/płytkę i łysinki przeniesiono na filtry nitrocelulozowe (Maniatis i wsp., 1982). Po zapieczeniu w piecu próżniowym przez 2 godziny w 80°C, filtry prehydrydyzowano dwie godziny, a następnie hybrydyzowano w temp. 42°C przez noc (tak, jak opisano poniżej w rozdziale dotyczącym analizy techniką Southern). Cztery filtry przeszukano sondą M1 i cztery sondą B1A. Filtry płukano dwukrotnie 2 x SSC zawierającym 0,5% SDS, raz w 1 x SSC zawierającym 0,5% SDS i raz 0,5 x SSC zawierającym 0,5% SDS, wszystko w temperaturze 50°C, i poddano autoradiografii. Pobrano łysinki będące potencjalnie pozytywnymi i ponownie przeszukano sondami. Z potwierdzonych pozytywnych klonów (oznaczonych M1AUS dla klonu hybrydyzującego z M1 i AustB 1 dla klonu hybrydyzującego z B1 A) przygotowano zawiesiny fagów o wysokim miernie i klony przeniesiono na pBLUESCRIPT, zgodnie z instrukcją producentów AZAP (Stratagene), stosując BB4 jako szczep biorcy E. coli. Z otrzymanych klonów przygotowywano preparaty plazmidowego DNA poprzez lizę alkaliczną (Maniatis i wsp. 1982) i trawiono EcoRI. Produkty trawiania analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym.
Sekwencjonowanie wstawki M1AUS
Sekwencjonowanie DNA prowadzono na oczyszczonym DNA plazmid pBLUESCRIPT stosując Version 2.0 Sequenase Kit z firmy Unitited State Biochemicals, zgodnie z instrukcjami producenta. Do zapoczątkowania pierwszych reakcji sekwencjonowania użyto startery z końców sekwencji wektora. Dane o sekwencji otrzymane z tych reakcji użyto do zaprojektowania drugiej pary starterów, a na podstawie danych otrzymanych z drugą parą starterów zaprojektowano trzecią parę. W ten sposób DNA zostało zsekwencjonowane poprzez kroczenie od końców 3' i 5'.
Sekwencjonowanie wstawki AustB1
Zostało ono wykonane stosując polimerazę Sequenase 2,0 T7 (USB Biochemicals) tak, jak opisano dla sekwencjonowania wstawki M1AUS
REAKCJE ŁAŃCUCHOWE Z UŻYCIEM POLIMERAZY
Przygotowanie cDNA mRNA (1 μg) z 11 dniowego H. contortus U. K., przygotowane tak, jak opisano dla dojrzałych robaków z Wielkiej Brytanii, zmieszano z łącznikiem-starterem T17 (5'GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3' w wodzie traktowanej dwuetylopirowęglanem (DEPC), a następnie podgrzano do temperatury 65°C przez 5 minut i natychmiast umieszczono w lodzie. Dodano wodorotlenek metylortęciowy do końcowego stężenia 28,6 mM i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Dodano 2-merkaptoetanol do końcowego stężenia 14,2 mM i mieszaninę umieszczano w lodzie. W celu zsyntetyzowania cDNA dodano RNase Guard (Pharmacia) w ilości jednostka/gl, bufor do odwrotnej transkryptazy (Life Sciences) do stężenia 1x, dATP, dGTP, dCTP i dTTP, każdego do stężenia 1 mM oraz odwrotną transkryptazę AMV (Life Sciences) w ilości 2 jednostki/gl (wszystkie wartości podane jako stężenia końcowe). Reakcję inkubowano w 41 °C przez 75 minut, a następnie ekstrahowano
175 900 fenolem i chloroformem i oczyszano chromatograficznie, wirując w kolumnach (Maniatis i wsp., 1982). Oczyszczoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczano 2,5 razy i przechowywano w 4°C.
Amplifikacja cDNA techniką PCR przy zastosowaniu starterów M1AUS - specyficznych
Reikcje PCR prowadzono w amplifikatorze (M. J. Reserch Inc.). Mieszanina reakcyjna zawierała, w końcowej objętości 100 μΐ, 1gl z 250 gl rozcieńczonego preparatu cDNA, przygotowanego jak opisano wyżej, 25 pmol łącznika-startera-T17 dla pierwszej nici, 25 pmol startera do amplifikacji dla drugiej nici (takiego, który powstał w oparciu o pozycje 865-884 (5'ACGGGTGTTCGGTTCCGTAT 3') lub takiego, który powstał w oparciu o pozycje 30-49 (5'GCTGAATCTAACTCCAATCC 3') sekwencji M1AUS (SEK NR ID: 5)), jeden raz bufor Taq (Northumbria Biologicals Ltd) i 0,5 mM każdego: dATp, dTTP, dGTp, dCTP i została pokryta 40 gl oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu. Mieszaninę następnie podgrzewano w amplifikatorze do temperatury 95°C przez 2 minuty, a następnie trzymano w 72°C. Gdy znajdowała się w 72°C, dodano 2 jednostki polimerazy Taq (Northumbria Biologicals Ltd) i zmieszano delikatnie z pozostałymi składnikami. Następnie realizowano w amplifikatorze przedstawiony poniżej program:
Etap 1 Przyłączenie w 50°C przez 5 minut
Etap 2 Wydłużanie w 72°C przez 40 minut
Etap 3 Denaturacja w 94°C przez 40 sekund
Etap 4 Przyłączenie w 50°C przez 2 minuty
Etap 5 Wydłużanie w 72°C przez 3 minuty
Etap 6 39 cykli obejmujących etapy 3 do 5
Etap 7 Końcowe wydłużanie w 72°C przez 15 minut
Etap 8 Schłodzenie do 4°C
Powyższe warunki zostały ustalone na podstawie Frohman i wsp. (1988).
Klonowanie produktów PCR
Produkty PCR z powyższych reakcji rozdzielano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym. Prążki DNA o wielkości około 2.5 i 3.5 kb poddawano elektroelucji na bibułę z włókna szklanego (Whatman), ekstrachowano fenolem i oczyszczano chromatograficznie na G50 (Pharmacia) (Sambrook i wsp., 1989). Oczyszczony DNA poddawano ligacji z wektorem pT7Blue T (Novagene) zgodnie z instrukcjami producenta.
Sekwencjonowanie produktów PCR 2.5 kb i 3.5 kb
Sekwencjonowanie prowadzono przy użyciu zestawu Sequenase 2,0 (US Biochemicals), stosując metodę kroczenia oligonukleotydów opisaną w rozdziale dotyczącym sekwencjonowaniaM1AUS.
REAKCJE ŁAŃCUCHOWE Z UŻYCIEM POLIMERAZY DLA KOŃCÓW 5'
Przygotowanie pierwszej nici cDNA gg mRNA z 11 dniowego Haemonchus contortus U. K., przygotowanego tak, jak opisano dla dojrzałych robaków z Wielkiej Brytanii zmieszano ze stałym starterem (5'AAIGAAAGCGGATGGCTTGAIGC 3') zaprojektowanym na podstawie konserwowanego regionu AustBł i produktów PCR 2.5 kb oraz 3.5 kb (odpowiednio, SEK NR ID: 6,7 i 8). Mieszaninę podgrzewano do75°C przez 5 minut, umieszczano w lodzie i dodawano wodorotlenek metylortęciowy do stężenia końcowego 28,6 mM. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie dodawano 2-merkaptoetanol do końcowego stężenia 14,2 mM i mieszaninę umieszczano w lodzie. DNA pierwszej nici przygotowywano, stosując odczynniki z zestawu 5'RACE system (Gibco/BRL) przy stężeniu końcowym 20 mM Tris/HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCh, 100 gg/ml BSA, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Dodawano 200 jednostek odwrotnej transkryptazy Superscript i reakcję inkubowano w 42°C przez 30 min., a następnie ogrzewano w 55°C przez 10 min. Dodawano RNazę H do końcowego stężenia 100 jednostek/ml i reakcję inkubowano przez 10 min. w 55°C, a następnie umieszczano w lodzie. cDNA oczyszczano wirując przez kolumnę Glassmax (Gibco/BRL) i przechowywano w -20°C.
Dodawanie ogonów C do cDNA
1/5 pierwszej nici cDNA ogrzewano do 70°C przez 5 min., a następnie schładzano w lodzie przez 1 min.. Dodawano odczynniki z zestawu 5'RACE system (Gibco/BRL) do stężenia końcowego 10 mM Tris/HCl pH 8,4, 25 mM KCl, 1,25 mM MgCE 50 gg/ml BSA, 0,2 mM dCTP. Dodawano 500jednostek/ml terminalnej transferazy i reakcję inkubowano w 37°C przez 10 minut., a następnie ogrzewano w 70°C przez 15 min. i przechowywano w lodzie.
Amplifikacja PCR przy użyciu starterów specyficznych dla AustBl, 2.5 kb PCR i 3.5 kb PCR
Reakcję PCR prowadzono w amplifikatorze (M. J. Research Inc.). Dla końca 3' użyto jeden z trzech starterów.
1. Starter specyficzny dla produktu PCR 2.5 kb powstały w oparciu o pozycje 374 do 394 (5'TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA 3').
2. Starter specyficzny dla produktu 3.5 kb powstały w oparciu o pozycje 1210 do 1229 (5'CATCTTIAGTTATCTGACCAG 31').
3. Starter specyficzny dla klonu cDNA AustB1 powstały w oparciu o pozycje 357 do 377 (5'GACCATCGCtGaTGAAGTCGG 3'). Dla końca (5' użyto wspólnego startera kotwiczącego (5'CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGUGGGIIG 3'). Każda mieszanina reakcyjna zawierała 4 gl z 50 gl cDNA z ogonem C, 25 pmol odpowiednich 2 starterów, 1x bufor do polimerazy Taq (Boehringer/Mannheim) i 0,5 mM każdego: dATP, dCTP, dGTP i dTTP w końcowej objętości 100 gl. Mieszaninę pokryto 50 gl oleju mineralnego i ogrzewano w amplifikatorze 95°C przez 2 min.. Mieszaninę reakcyjną trzymano w 80°C w trakcie czego dodawano 0,6 jednostki polimerazy Taq i realizowano następujący program:
1. Przyłączanie w 50°C przez 5 min.
2. Wydłużanie w 72°C przez 10 min.
3. Denaturacja w 94°C przez 45 sek.
4. Przyłączanie w 50°C przez 1 min.
5. Wydłużanie w 72°C przez 2,5 min.
6. 39 cykli obejmujących etapy 3 do 5.
7. Wydłużanie w 72°C przez 15 min.
8. Schłodzenie do 4°C.
Klonowanie produktów PCR 5'
Produkty PCR rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym i prążki o oczekiwanej wielkości, około 1.3 kb, wycinano, a następnie DNA oczyszczano stosując zestaw GENECLEAN i poddawano ligacji z wektorem PT/Blue T-Vector (Novagene), zgodnie z instrukcjami producenta.
REAKCJA ŁAŃCUCHA Z UŻYCIEM POLIMERAZY CELEM OTRZYMYWANIA KOŃCA
3'KLONU AUSTB
Pierwsza nić cDNA, którą użyto, została opisana przy otrzymywaniu cDNA z zastosowaniem starterów M1AUS. Stosowano starter specyficzny dla AustB 1 (SEK NR ID) . 6) od pozycji 1414 do 1435 (5TCTTGAAGAAATGAaAaAGCTT 3') łącznie z łącznikiem-starterem T17 użyciem dla produktu PCR M1AUS i reakcję prowadzono w amplifikatorze (M. J. Research Inc). Mieszanina reakcyjna składa się z 25 pmol każdego ze starterów, 2 gl cDNA, 1x buforu dla polimerazy Taq (Boehringer/Manheim), 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP w objętości 100 gl. Na mieszaninę nałożono 50 gl oleju mineralnego i ogrzano do 95°C przez 2 min.. Dodano 0,6 gl polimerazy Taq i cykle zaprogramowano w taki sam sposób, jak opisano powyżej dla produktów PCR z końca 5'.
Klonowanie i sekwencjonowanie produktów z końca 3'
Produkty PCR rozdzielano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym i prążek o oczekiwanej wielkości, 1.3 kb, wycinano z żelu i DNA oczyszczano stosując zestaw GENECLEAN, po czym poddawano ligacji z PCR-Script (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta.
Sekwencjonowanie sklonowanych produktów PCR
DNA klonów PCR sekwencjonowano stosując zestaw Sequenase 2,0 (United States Biochemical) tak, jak zalecał producent. Zastosowano startery oligonukleotydowego kroczenia po DNA klonów zarówno od końca 5', jak i 3'.
ANALIZA WSZYSTKICH SEKWENCJI DNA
Sekwencje analizowano stosując pakiet oprogramowania do analizy sekwencji GCG (Genetics Computer Group), Devereux i wsp., 1984.
175 900
ANALIZA METODĄ NORTHERN I SOUTHERN
Przygotowanie filtrów w metodzie Northern
Filtry w metodzie Northern przygotowywano stosując żele formaldehydowe zasadniczo tak, jak opisano w Maniatis i wsp. (1982). Próbki mRNA (z 11-, 15- i 23-dniowych dojrzałych H. contortus) traktowano 17,5% v/v formaldehydem i 50% formamidem w buforze MOPS (20 mM kwas 3-(N-morfolino)proponosulfonown, pH 7,0. 8 mM octan sodu, 1 mM EDTA) w 65°C przez 15 minut i przenoszono na filtry Duralon metodą podsysania (copillory transfer) tak, jak opisano w Sambrook i wsp., (1989).
Przygotowanie filtrów w metodzie Southern
Dwa gramy dojrzałego Haemonchus contortus, który został uprzednio szybko zamrożony w ciekłym azocie, ucierano na miałki proszek w ciekłym azocie. Proszek dodawano powoli do 25 ml buforu do lizy (0,05 M Tris-HCl, pH 8, 0,1 M EDTA, 1% Sarkosyl, 0,05% mg/ml pfoteinozy K (Boehringer Mannheim) i inkubowano przez 2 godziny w 65°C. Następnie zawiesinę ekstrahowano dwarazyjedną objętością fenolu z chloroformem i wytrącano etanolem. Wytrącony genomowy DNA zawieszano przez noc w 4°C w 20 ml bufom Tris, EDTA (TE, pH 8) z kołysaniem, a następnie dializowano wobec dwóch zmian jednego litra TE. RNA usuwano poprzez inkubację z RNAzą A Typl wolną od DNazy (Sigma) w stężeniu końcowym 20 (ig/ml, w 37°C przez 1 godzinę, po czym przeprowadzano jedną ekstrakcję mieszaniną fenol-chloroform, jedną ekstrakcję chloroformem i wytrącano etanolem jak wyżej. Osad wytrąconego genomowego DNA przepłukiwano dwukrotnie 70% v/v etanolem i zawieszano w 1 ml TE, tak jak wyżej.
Genomowy DNA trawiono enzymami EcoRI i HindIII (25 gg DNA w każdym trawieniu) przez noc w 37°, a następnie poddawano elektoforezie w 1% w/v żelu agarozowym w buforze Tris-octan, nanosząc 5 gg na ścieżkę. Transfer z żelu na filtr Hybond-N (Amersham Internationa!) wykonano metodą kapilarną tak, jak opisano w Maniatis i wsp., (1982). DNA wiązano z filtrem stosując światło ultrafioletowe zgodnie z zaleceniami producenta.
Przygotowanie sond
Plazmidy pBLUESCRIPT zawierające wstawki M1AUS, B1A lub AustB1 trawiono EcoRI. Plazmidy pT7Blue zawierające wstawione produkty PCR 3.5 kb trawiono BamHI, a te, które zawierały wstawione produkty PCR 2.5 kb trawiono BamHI i Xbal. Produkty trawienia poddawano elektroforezie, izolowano wstawki i znakowanoje a-32P-dCTP metodą przesuwania nacięć (nick translation) tak, jak opisano powyżej przy opisie przeszukiwania biblioteki AZAP.
Warunki hybrydyzacji
W metodzie Southern
Filtry krojono na paski i poddawano pre-hybrydyzacji w buforze do hybrydyzacji tak, jak opisano wcześniej, przez 3 godziny w 28°C. Filtry z genomowym DNA hybrydyzowano z każdą z powyższych sond przez noc w 28°, płukano dwukrotnie w temperaturze pokojowej (24°C), a następnie dwukrotnie w 42°C, w 2 x SSC zawierającym 0,1% W/v SDS (warunki łagodne) i poddawano outOfadiogrofli. Po wywołaniu autoradiogramów, paski były powtórnie płukane w ostrych warunkach (0,1 x SSC, 0,1% w/v SDS w 65°C) i ponownie poddane autofadiogrofϊi.
W metodzie Northern
Dla sond M1, M1AUS i B1A (SEK NR ID: 1, 5 i 2, odpowiednio)
Filtry Northern z mRNA pochodzącego z 11, 15 i 23 dniowego Haemonchus contortus najpierw hybrydyzowano ze wstawką M1. Filtr pfehybfydyzowono przez 2 godziny w 42°C w 2 x SSC (gdzie 20 x SSC = 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,2) zawierający roztwór Donba^ta 5 x (0,1% w/v Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% poliwinylopyrolidon, 0,1% Frakcji V albuminy z surowicy bydlęcej (Sigma Chemical Corp)), 0,5% SDS (siarczan sodowy dodecylu), 10% siarczan dekstranu, 0,1% mg/ml DNA z jąder łososia i 50% dejonizowany formamid. Hybrydyzację do sondy prowadzono w tym samym buforze przez noc w 42°C. Filtry płukano dwukrotnie przez 30 min w 2 x SSC zawierającym 0,5% SDS i 50% formamid, dwukrotnie przez 30 minut w 2 x SSC zawierającym 0,5% SDS i dwukrotnie przez 30 minut w 2 x SSC. Pierwsze płukanie prowadzono w 42°C, a wszystkie następne płukania w 37°c. Po autofadiogfafH sondę usuwano poprzez przepłukanie we wrzącym roztworze 0,1% SDS i ponownie poddano autora175 900 diografii dla upewnienia się, że sonda została usunięta. Ten sam filtr był następnie hybrydyzowany z wstawką M1AUS, płukany i poddany autoradiografii. Z filtru znowu usuwano sondę, filtr badano i po stwierdzeniu braku zaciemnienia hybrydyzowano ze wstawką B1 A· Po ponownym odpłukaniu sondy filtr hybrydyzowano tak, jak opisano poniżej.
Dla sond AustBi, produktów PCR 2.5 kb i 3.5 kb (SEKNR ID: 6, 7 i 8).
Filtry Northern hybrydyzowano ze wstawką AustB1 stosując łagodne warunki tak, jak opisano dla hybrydyzacji metodą Southern. Po autoradiografii z filtru usuwano sondę poprzez gotowanie w 0,1% SDS, zgodnie z instrukcjami producenta filtrów (Amersham), a następnie hybrydyzowano ze wstawką PCR 2.5 kb (klon 2), ponownie odpłukiwano sondę i hybrydyzowano ze wstawką PCR 3.5 kb (klon 2).
TRAWIENIE H110D I BADANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ
Przygotowanie H110D
Natywny H110D (H110DN) przygotowano zgodnie z metodami opisanymi w W0088/00835 i W090/11086.
Przygotowanie fragmentu H110D (H11S) poprzez działanie elastazą
Dojrzałego Haemonchus poddano homogenizacji w 10 objętościach schłodzonego w lodzie PBS/0,02% azydek sodu, a następnie odwirowano przez 20 minut przy 13000 rpn. Osad zawieszono w 10 objętościach PBS/azydek, ponownie homogenizowano i odwirowano. Po zawieszeniu w 10 mM buforze MOPS pH 7,4 (objętość zawiesiny wynosiła 1 ml na każde 0,17 g robaków) i podgrzewaniu do temperatury 37°C przez 20 minut, materiał w osadzie trawiono elastazą (800 gl/20 ml zawiesiny, 1 mg/ml świeżego roztworu 1 mM HCl/2 mM Ca2+) przez jedną godzinę. Trawienie zatrzymywano przez dodanie 3,4-dwuchlorokumaryny (300 gl 10 mM roztworu w DMSO/20 ml mieszaniny trawiennej). Mieszaninę odwirowano przy 13000 rpm przez 20 min, i osadzony materiał zachowywano. Supernatant poddawano ultrawirowaniu przy 100000 g przez 1 godz. i 20 minut. Otrzymany płynny supernatant nanoszono na kolumnę ConA otrzymano wiążące się frakcje. W celu analizy frakcje te poddano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z SDS i przeniesiono elektroforetycznie na filtr z polifluorku winylidenu (Immobilon-P, Millipore), lekko wybarwiono błękitem Coomassie, wycięto pasmo 150 kD i analizowano w aparacie do sekwencjonowania aminokwasów w fazie gazowej. Do badań ze szczepieniami, frakcje wiążące się do ConA oczyszczano dalej poprzez zatężenie i nałożenie na kolumnę ze złożem Superose 12 (Pharmacia) i zbieranie frakcji zawierających aktywność aminopeptydazy.
Trawienie H110D termolizyną
Dublet H110D oczyszczano poprzez elektroelucję na skalę preparatywną z 8% żelu polakrylamidowego z SDS, otrzymując H110DE tak, jak opisano w W090/11086 i przez elektroelucję formy dimerycznej, migrującej tuż powyżej 200 kD (dającą charakterystyczny dublet na poziomie 110 kD po rozdziale na SDS-PAGE) uzyskuj ąc H110DE. Roztwory H11 0dE zatężano do 200 μ l, dodawano chlorek wapnia do 5 mM i mieszaninę podgrzewano do 37°C. Dodawano świeżo przygotowanego roztworu Termolizyny o stężeniu 1 mg/ml (w 1 mM HCl, mM CaCk), w proporcji 0,1 mg Termolizyny nagg H110DE. Mieszaninę inkubowano w 37°C przez 120 min., a następnie reakcję zatrzymywano przez dodanie 5 μ! 0,5 M EDTA.
Fragmenty białka rozdzielano poprzez elektroforezę w 15% żelu poliakrylamidowym z SDS i przenoszono elektroforetycznie na filtr z polifluorku winylidenu (Immobilon-P, Millipore). Po zabarwieniu błękitem Coomasie, najbardziej intensywne osobne pasma wycinano i analizowano w urządzeniu do sekwencjonowania aminokwasów w fazie gazowej.
Przygotowanie frakcji H110D (H11A) wzbogaconej w aktywność aminopeptydazy A
Osadzony materiał otrzymany po działaniu elastazy przez wirowanie przy 17000 g przez 20 min. (patirz wyżej) zawieszmno w TBS w 4°C i ponownie osadzano pirzeez wirowanie, a następnie zawieszano w roztworze 1% Tweenu w PBS/azydek i pozostawiano (z mieszaniem) przez 1 godzinę. Zawiesinę odwirowywano przy 17000 g przez 20 minut i supematant odrzucano. Osad był dwukrotnie ekstrachowany roztworem 1% Thesit w PBS/azydek. Po wirowaniu przy 17000 g przez 20 minut supematanty były łączone i ultrawirowane przez 1 godzinę 20 minut przy 100000 g. Supematant nakładano na kolumnę powinowactwa ConA (Affigel, Biorad) i
175 900 związany materiał wymywano i dalej frakcjonowano poprzez chromatografię jonowymienną na kolumnie MonoQ.
Badanie aktywności enzymatycznych
Aktywność hydrolazy a-aminoacylopeptydowej (mikrosomalna aminopeptydaza) w preparatach H110D charakteryzowano poprzez testy w roztworze, stosując p-nitroanilidy (pNA) L-leucyny, metioniny fenyloalaniny, kwas α-glutaminowego i lizyny. Wszystkie p-nitroanilidy aminokwasów (z wyjątkiem kwasu α-glutaminowego) otrzymano z Sigmy, Poole, Dorset UK, kwas α-glutaminowym otrzymano z Fluka, Dorset UK. Poszczególne pNA aminokwasów hydrofobowych (leucyny lub fenyloalaniny) i naładowanych (kwasu α-glutaminowego) o których wiadomo, że są substratami dla ssaczej aminopeptydazy M (ApM) i A (ApA) wybrano do mierzenia efektu inhibitorów enzymu i hamowania aktywności aminopeptydazy H110D przez surowicę.
(a) Test na płytkach do mikromiareczkowania
Kieszonki płytek Micro-ELISA (Dynatech Immulon 1, Virginia, USA) wypełniono 250 μΐ 50 mM HEPES lub MOPS pH 7 z dodatkiem 1-10 μΐ frakcji do badania. Płytki następnie preinkubowano w 37°C przez 10 minut przed dodaniem 10 μΐ 25 mM substratu - p-nitroanilidu aminokwasu do każdej kieszonki. W czasie zero mierzono gęstość optyczną (OD) przy 405 nm stosując czytnik płytek ELISA, a następnie płytki inkubowano w 37°C przez 15-30 minut. Następnie wykonano końcowy odczyt OD tak, jak poprzednio i przeliczano zmiany OD na minutę na miligram białka.
(b) Wrażliwość na działanie inhibitora
Metoda stosowana do oznaczenia enzymu została opisana powyżej w punkcie (a) z tą różnicą, że do 250 μΐ buforu z 10 μΐ 1 mg/ml ConA H110D dodawano inhibitory i wstępnie inkubowano przez 10 minut w 37°C przed dodaniem substratów (pNA leucyny lub kwasu α-glutaminowego). Procent inhibicji obliczano, jak następuje:
χ — y —x 100 = procent inhibicji gdzie x = AOD/min. enzym bez dodanego inhibitora, a y = AOD/min. enzym plus inhibitor.
Testowano niezależnie dziewięć związków, będących inhibitorami różnych klas enzymów: Amastatynę, Bestatynę (metaloproteaza, aminopeptydaza), 1,10 fenatrolinę, EDTA (metalopreteaza), fosforamidon (metaloproteaza, termolizyna, kolageneza), Aprotininę (proteaza serynowa), Pepstatynę (proteaza kwasu asparaginowego), PMSF (proteaza serynowa i cysternowa) i E-64 (proteaza cysternowa). Amastatynę, Bestatynę, 1,10 fenatrolinę, PMSF i Pepstatynę otrzymano firmy Sigma, Dorset, UK. Wszystkie inne inhibitory otrzymano z firmy BoehringerMannheim. Każdy z inhibitorów stosowano w w dwóch stężeniach: równym oraz większym niż maksymalne stężenia zalecane przez Boehrringer-Mannheim.
(c) Test hamowania aktywności enzymu przez anty-surowicę
Test wykonano tak, jak opisano w punkcie (a) z tą różnicą, że przygotowano dwie płytki Micro-ELISA. Na jednej płytce 10 μΐ ConA H110D (1 mg/ml) z dodatkiem 10 μΐ anty-surowicy z każdej owcy na pojedynczą kieszonkę inkubowano wstępnie w 37°C przez 15 minut. Drugą płytkę, z 250 μΐ buforu HEPES/dwuwęglan z dodatkiem 10 μΐ substratu: pNA fenyloalaniny lub kwasu α-glutaminowego na każdą kieszonkę również inkubowano wstępnie w 37°C przez 15 minut. Następnie na drugiej płytce do mieszaniny bufor-substrat dodawano mieszaninę ConA HI 1.0D-surowica zapomocą multi-pipety. Oznaczano AOD/min.. Dla celów korelacji, procent inhibicji obliczano stosując wzór jak wyżej w punkcie (b), gdzie x przedstawia wartości AOD/min. dla kieszonek zawierających enzym plus surowicę z owiec stanowiących kontrolę negatywną (zaszczepionych ferrytyną z końskiej śledziony), a y = AOD/min. dla kieszonek zawierających enzym plus surowicę z poszczególnych owiec zaszczepionych H110D. Dla celów korelacji (figura 18), procent ochrony obliczono stosując wzór z punktu (b) gdzie x = średnia liczba wydalonych z kałem jaj na gram lub średnia zawartość robaków w kontroli, ay = jaja
175 900 wydalone z kałem na gram w czasie eksperymentu lub obciążenie robakami poszczególnych owiec zaszczepionych H110D.
Lokalizacja aktywności enzymatycznej metodami histochemicznymi
Obecność aktywności aminopeptydazy wykazano w 10 gm skrawkach zamrożonego dojrzałego Haemonchus contortus, stosującjako substrat 4-metoksy-P-naftylamid L-leucyny lub a-4-metoksy-e-naftylamid kwasu L-glutaminowego zgodnie z metodą Nachlas i wsp. (1957), Nakane i wsp. (1974) i Lojada i wsp. (1980).
EKSPRESJA ZREKOMBINOWANEGO H110D W SYSTEMIE EUKARIOTYCZNYM BAKULOWIRUSKOMÓRKI OWADÓW
Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych
Fragmenty PCR 3.5 kb opisane powyżej otrzymano poprzez amplifikację odcinka pomiędzy adaptorem oligo dT (zawierającym miejsce SalI i oligo 872, który odpowiada nukleotydom 39 do 49 w sekwencji M1AUS i sklonowano w wektorze pT7Blue. Klon pT73.5-2 ma wstawkę wbudowaną w taki sposób, że miejsce BamIII wektora znajduje się po stronie końca 5', a miejsca HindIII, XbaI i SalI po stronie końca 3'. Sekwencja na końcu 5' przedstawia się następująco:
BamHI *!-----oligo 872-----------3.5K---5’ GG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC C .......3’
Leu Asn Leu Thr Pro He .........
Gwiazdka oznacza jednoniciowy odcinek dT/dA na końcu 3' użyty do klonowania w wektorze pT7 Blue.
PCR 3,5 klon 2 strawiono enzymem HindIII (pojedyncze miejsce w sekwencji odcinka do klonowania w wektorze od strony końca 3' genu 3,5 K) i końce wypełniono dezoksyrybonukleotydami, stosując polimerazę I DNA (fragment Klenowa), zgodnie z Maniatis i wsp. (1982). Łącznik BamHI (5'CGGATCCG 3', New England Biolabs, nr katalogowy 1021) przyłączono poprzez ligację do tępych końców i wybrano klony z dodatkowym miejscem BamHI, umożliwiającym wycięcie sekwencji genu H110D o pełnej długości jako fragmentu BamHI. Fragment BamHI izolowano poprzez elektroforezę w 0,6% w/v żelu agarozowym w buforze Tris-octan, a następnie oczyszczono stosując GNECLEAN (BI0101); powyższą procedurę wykonywano dwukrotnie. Oczyszczony fragment dołączano poprzez ligację do przeciętnego BamHI, fosfatazowanego pBlueBac II (Invitogen Corp.) i klony niosące fragment we właściwej orientacji (to znaczy z końcem 5' 3.5 PCR klon 2 umieszczonym pod kontrolą polihedryny bakulowirusa) określonej poprzez trawienie enzymami Nhel i Xbal. Otrzymany plazmid przecięto częściowo BamHI i końce wypełniono tak, jak opisano powyżej. Dodano łącznik Ncol zawierający ATG (5'CCCATGGG 3': New England Biolabs nr 1040) i mieszaninę poddano ligacji. Klony, które miały łącznik przyłączony w miejscu BamHI na końcu 5' 3.5 PCR klon 2, a nie w miejscu od strony 3', określono poprzez trawienie Ncol. Otrzymany plazmid, oznaczony jako pBB3,5-2(N) jest przedstawiony schematycznie na figurze 19.
W rezultacie otrzymano wstawienie ATG w odpowiedniej fazie odczytu na końcu 5' wstawki 3.5 PCR klon 2 dla inicjacji translacji. Sekwencja wokół tego kodonu inicjacyjnego ATG przedstawia się następująco:
BamHI—Ncol 1 ink-BrmHI----*’-----oligo 872-----------1 —
5' CGGACCCC ATG GGG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA AAC C,.
Met Gli Ile Arg Leu Leu Asn Leu Tre Pro IIe ...
175 900
W uzyskanym w wyniku ekspresji białku będzie brakować aminokwasów 2 do 9 z odpowiedniej sekwencji H110D i pojawią się trzy aminokwasy z sekwencji łącznika bezpośrednio za ATG.
Utworzenie zrekombinowanego bakulowirusa zawierającego sekwencje H110D
Plazmid pBB3.5-2(N) wprowadzono poprzez transfekcję do komórek Spodoptera frugiperda (Sf9) (dostępne w firmie Invitrogen Corp), stosując liniowy DNA jądrowego wirusa polihedrozy Autographica califomica ACNPV) i kationowe liposomy (cząsteczka transfekcyjna Invitrogen Corp.), zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki hodowano w podłożu TC-100 (Sigma) z dodatkiem surowicy z płodów cielęcych (CSL Ltd; inaktywowanych termicznie w 56°C przez 45 minut) i antybiotyki (penicylina/streptomycyna, gentamycyna; CSL Ltd). Przeprowadzono również transfekcję kontrolną, stosując plazmid pBB.5-2 (N) z ATG wstawionym na końcu 3' sekwencji 3.5 PCR klon 2. Zrekombinowane łysinki wybrano opierając się na tym, że wektor pBlueBac II koduje również β-galaktozydazę (β-gal) E. coli i dodając do agarozy zalecane ilości X-gal. Wybrano grupę niebieskich łysinek i poddano je dwóm dalszym rundom oczyszczania łysinek, po których zainfekowana pojedyncza warstwa komórek nie wykazywała zanieczyszczenia wirusem dzikiego typu (które przejawiałoby się występowaniem jądrowych wielościanów). Przed użyciem, oczyszczone wirusy, oznaczone jako 3.5-2-P2A, -P3A i -P4A namnożono poprzez dwie następujące po sobie infekcje komórek Sf9. Łysinkę oczyszczoną z transfekcji kontrolnej oznaczono jako 3.5-2-rev.
Oszacowanie ekspresji H110D w zainfekowanych zrekombinowanym bakulowirusem komórkach owadzich
Pojedynczą warstwę komórek Sf9 (1x10 komórek w naczyniach o powierzchni 25 cm ) infekowano wirusami 3,5-2, formą dziką (wt), wirusem kontrolnym wyrażającym β-gal lub pozostawiono niezainfekowaną. Po czterech dniach wzrostu w 26°C pojedyncze warstwy oddzielano od ściany naczynia stosując łagodne wytrząsanie, komórki odzyskiwano przez wirowanie (2000 rpm. 10 minut) i osad komórkowy rozbijano przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Lizaty zawieszano w 500 gl PBS i 25 gl próbki testowano na aktywność ApM w teście na płytkach do mikromiareczkowania.
gl próbki (odpowiednik 3 x 104 komórek) powyższych lizatów poddano elektroforezie w 7,5% denaturujących żelach poliakrylamidowych z SDS. Jeden żel barwiono następnie błękitem Coomasie dla oszacowania poziomu ekspresji. Białka rozdzielone w drugim żelu przeniesiono na filtr, który następnie badano z użyciem przeciwciał anty-H110DN (jak opisano wcześniej).
WYNIKI
ANALIZA KLONÓW IMMUNOPOZYTYWNYCH
Analiza przeciwciał oczyszczonych poprzez powinowactwo do klonu Ml
Przygotowano oczyszczone poprzez powinowactwo przeciwciała specyficzne dla każdego z pięciu klonów pozytywnych w stosunku do przeciwciała i użyto je do przebadania filtrów Western z ekstraktem wzbogaconym w H110D. Jako pokazano na figurze 8, w przypadku każdego z pięciu klonów rozpoznawany jest dublet H110D. Jednakże reakcja z klonem Ml dawała najsilniejszy sygnał (figura 8d) w porównaniu z filtrem zawierającym negatywną kontrolę Xgt11 (figura 8e). Ten klon był zatem dalej badany.
Analiza klonu Ml techniką Northern
Wyniki analizy mRNA Haemonchus contortus metodą Northern z użyciem jako sondy wstawki Ml przedstawiono na figurze 9. Obserwuje się pojedyncze pasmo mRNA około 3.5 kb. Jest to wystarczająca wielkość do zakodowania białka około 110 kD.
Analiza sekwencji klonu Ml
Analiza produktów trawienia DNA enzymem EcoRI pokazała, że wstawka Ml ma wielkość w przybliżeniu 300 bp. Określono sekwencję DNA fragmentu M1 (SEK NR ID: 1) i pokazano na figurze 3. Fragment składa się z 295 bp z otwartą ramką odczytu rozpoczynającą się od nukleotydu nr 3.
175 900
Analiza klonu B1A techniką Northern
Wyniki analizy mRNA Haemonchus contortus metodą No^hem z użyciem jako sondy wstawki B1A przedstawiono na figurze 9c. Tak, jak w przypadku M1, obserwuje się pojedynczy prążek mRNA o wielkości około 3.5 kb.
Sekwencjonowanie klonów B1A i B2
Ustalono sekwencję klonów B1A (SEK NR ID: 2 i 3) i na figurze 5 przedstawiono pełną sekwencję (SEK NR ID: 2) z odniesieniem do H11-1 (SEKNR ID: 19) i AustB'1 (SEK NR ID: 6). Wstawka o wielkości 484 bp zawierała otwartą ramkę odczytu (ORF) od pierwszego aukeentydu. Ustalono sekwencję trzech fragmentów B2 powstających w wyniku trawienia EcoRI i uzyskano pełną sekwencję 581 bp dla B2 (SEK NR ID: 4). Jest to pokazane na figurze 4 z odniesieniem do H11-2. Sekwencja zawiera ORF od pozycji 3 do 213, kodon stop i region nie podlegający translacji odpowiadający sekwencji produktu PCR 2.5 kb (SEK NR ID: 7).
Ekspresja M1 i B1A w E. coli
Po szkicowaniu w wektorze ekspresyjnym GST otrzymano klony, w których wyrażane były białka o wielkości 38-40 kD dldM1i 45 kD dla B1 A. Pozostaje to w zgodzie z przewidzianą wielkością wstawek, biorąc pod uwagę masę cząsteczkową transferazy S-geutdtinau. Obie fuzje białkowe reagowały bardzo silnie na filtrach Western z oczyszczonymi przez powinowactwo przeciwciałami dla H110DE (figura 11). Te fuzje białkowe były wyrażane j ako nierozpuszczalne ciała inkluzyjne.
Wytwarzanie przeciwciał u owiec zaszczepionychfuzjami białkowymi M1-GST i B1A-GST.
Anty-surowice z owiec, którym wstrzyknięto fuzje białkowe testowano metodą Western przy użyciu preparatów H110D. Zarówno GST-M1, jak i GST-B1A powodowały wytwarzanie przeciwciał, które specyficznie rozpoznawały dublet H110D (figura 12). Surowice z owiec będących kontrolą negatywną nie rozpoznawały dubeltu H110D.
IZOLACJA I CHARAKTERYZACJA KLONÓW WYBRANYCH POPRZEZ HYBRYDYZACJĘ ZE WSTAWKAMI DNA M1 LUB B1A
Potwierdzone klony pozytywne Cybbydyzujące do sondy MEzostały oznaczone jako M1AUS (SEK NR ID: 5), a klon hybrydyzujący do B1A oznaczono jako AustB1 (SEK NR ID: 6). Trawienie DNA oczyszczonych plazmidów enzymem EcoRI wykazało obecność wstawki o wielkości około 900 bp dla M1AUS i około 1.6 kb dla AustB1. Jako pokazano na figurze9b) i 9d) przedstawiającej filtry Northern, M1AUS i AustB 1 hybrydyzują do t^ej samej wielkości mRNA (około 3.5 kb), tak samo jak m1 i B1 A.
Analiza sekwencji M1AUS
Pełną sekwencję fragmentu M1AUS ustalono stosując syntetyczne nligoaukleot:ydy do kroczenia po DNA od obu końców. Analiza otrzymanej sekwencji wykazała, że wstawka M1AUS miała wielkość 948 bp, co pokazano na figurze 3. Sekwencja (SEK NR ID: 5) rozpoczyna się od kodonu ATG- (który koduje metioninę) i zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) na całej długości. Sekwencja jest o 19 par zasad dłuższa niż sekwencja M1na końcu 5' i o 634 bp dłuższa na końcu 3'. Sekwencje wspólne dla dwóch klonów (zasady 20 do 314) były identyczne z wyjątkiem różnicy dwóch aukeenty0ów w trzeciej pozycji kodcu. Porównanie wszystkich możliwych ramek odczytu z różnymi bazami danych pokazało, że ramka odczytu rozpoczynająca się od ATG w pozycji nukeentyOowej nr 1 wykazuje homologię z białkami należącymi do rodziny mikbosnmalaycC amianpepty0dz.
Sekwencja AustB1
Pełną sekwencję fragmentu AustB! ustalono stosując syntetyczne nligoaukleotyOy do kroczenia po DNA od obu końców. Sekwencja DNA (SEK NR ID: 6) jest przedstawiona na figurze 5. Klon ma długość 1689 bp i ORF od reszty nr 2. Sekwencja ta stanowi część H11-1, co pokazano na figurze 1. Zakodowana sekwencja aminokwasów wykazuje motyw miejsca wiążącego cynk charakterystycznego dla aminopeptydaz.
AMPLIFIKACJA cDNA POCHODZĄCEGO OD H110D mRNA METODĄ PCR
PCR przy zastosowaniu starterów M1AUS cDNA zsyatetyznwaao z mRNA Haemonchus contortus stosując jako starter oUgo-dT zawierający sekwencję adapterową dla ułatwienia dalszego klonowania i manipulowania DNA.
175 900
Ten cDNA użyto następnie do namnożenia sekwencji M1AUS techniką PCR, stosując jako starter na końcu 5' syntetyczny oligonukleotyd powstały w oparciu o pozycje 865-885. Namnożono fragment PCR o wielkości około2,5 kb. Jest to w przybliżeniu oczekiwana wielkość fragmentu, opierając się na znanej wielkości mRNA i sekwencjach cDNA ssaczych aminopeptydaz.
Drugi zestaw reakcji PCR wykonano stosując starter znajdujący się blisko końca 5' M1AUS (zasady 30-49). W żelu agarozowym wykryto cztery prążki. Największy z nich, o wielkości 3.5 kb odpowiada przewidzianej wielkości produktowi PCR.
Klonowanie i sekwencjonowanie produktów PCR 2.5 kb i 3.5 kb z starterów M1AUS
Produkty PCR 2.5 kb i 3.5 kb sklonowano i oznaczono 2.5PCR (SEK NR ID: 7) i 3.5PCR (SEK NR ID: 8, 14 i 15 dla klonów o numerach odpowiednio 2,10 i 19). Na filtrach Northern 2.5PCR i 3.5PCR (klon 2, 3.5PCR-2) hybrydyzowały z mRNA o wielkości około 3.5 kb (figura 9 e, f) w taki sam sposób (w odniesieniu do wieku Haemonchus użytego do otrzymywania mRNA), jak M1, B1A, M1AUS i AustB1.
Ustalenie pełnej sekwencji uzyskano poprzez oligonukleotydowe kroczenie. Jak pokazano na figurze 1, sekwencja produktu 2.5 kb (SEK NR ID: 7) jest częścią H11-2 (SEK NR ID: 20), a sekwencja produktu 3.5 kb (SEK NR ID: 8) stanowi główną część H11-3 (SeK NR ID: 21). Zakodowana sekwencja aminokwasów wykazuje w obu przypadkach obecność motywu wiążącego cynk His Glu Xaa His Xaa Trp (HExxHXW) charakterystycznego dla mikrosomalnych aminopeptydaz.
Sekwencjonowanie końca 5'klonów PCR
Stosując starter odpowiadający konserwowanej sekwencji w cDNA klonu AustB1, 2.5PCR i 3.5PCR (SEKNR ID: 6,7 i 8) wykonano syntezę cDNA, który hybrydyzuje do mRNA dla tych sekwencji w odległości około 1.3 kb od końca 5'. Do cDNA dosyntetyzowano ogon-C na końcu 5', a następnie przeprowadzono reakcje PCR z uniwersalnym starterem kotwiczącym (Anchor (A)) dla końca 5' i trzema starterami specyficznymi dla każdej z sekwencji AUSTb, 2.5PCR i 3.5PCR-klon 2 (SEQ NR ID: 6, 7, 8) dla końca 3'. Każda z reakcji dała produkt o spodziewanej wielkości, tuż poniżej 1.3 kb, odpowiednio, 1301 bp (SEK NR ID: 9), 1280 bp (SEKNRID: 10) i 1280 (SEKNRID: 11). Wszystkie trzy sekwencje zawierały nie podlegający translacji region na końcu 5' (figura 2). Wszystkie rozpoczynały się od takiej samej sekwencji o długości 22 bp (5'GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG 3'), znanej jako Spliced Leader Sequence 1 (SL1) i występującej w nie podlegającym translacji regionie 5'różnorodnych nicieni Huang iwsp., 1990. W sEq NR ID: 9 i 10, sekwencjaSL1 znajduje się bezpośrednio przed kodonem inicjacyjnym ATG. W SEQ NR ID: 11 pomiędzy SL1 i kodonem inicjacyjnym ATG znajduje się 13 bp. Wszystkie trzy sekwencje mają pełne ORF.
Sekwencjonowanie AustBl i klonu PCR
Stosując specyficzny starter odpowiadający pozycjom 1414-1438 w AustB 1 (SEK ID NR. 6)1. otrzymano produkt PCR o przewidzianej wielkości 1.3 kb. W wyniku sekwencjonowania sklonowanego prążka uzyskani sekwencje (SEK ID NR: 12 i 13). Dały one ORF od 1-615 bp i spory region nie podlegający translacji.
Analiza sekwencji sklonowanych produktów PCR
Elementy składowe sekwencji, oznaczone H11-1, H11-2 i H11-3, opisano powyżej i przestawiono na figurze 2. Na figurze 6a przedstawiono kodowaną przez nie przewidywaną sekwencję aminokwasów. Słuszność przewidywanej sekwencji produktu białkowego, zakodowanego w przedstawionym DNA, jest w sposób istotny potwierdzona poprzez zgodność z sekwencją aminokwasów, określoną metodą degradacji Edmana dla fragmentów uzyskanych po działaniu CNBr lub przez proteolityczne trawienie (figura 7). W ten sposób 27 aminokwasów z 29 reszt N-końcowej sekwencji H11S (SEK NR ID: 16) odpowiada fragmentowi H11-2 od reszty 61 do 90 (figura 7b). Występowanie odpowiadających sobie waliny (V) w pozycji 78 i glicyny (G) w pozycji 90 jest charakterystyczne dla H11-2, ponieważ H11-3 ma asparginę (N) w pozycji 90 a H11-1 leucynę (L) w pozycji 86 (odpowiadającej pozycji 78 w H11-2). Dwie reszty aminokwasowe w N-końcowej sekwencji aminokwasów H11S (SEK NR ID: 16) nie odpowiada żadnej z przedstawionych tu sekwencji H110D. Warto podkreślić obecność pełnej zgodności między bardzo podobnymi, ale odrębnymi sekwencjami Pep A i Pep B (opisanymi wcześniej w W090/11086) a H11-2 i H11-1 szczególnie na obszarze od aminokwasu 540 do 555.
175 900
Podobnie, na odcinku od 450 do 470 reszty aminokwasowej. Pep D jest dokładnym odpowiednikiem H11-2, podczas gdy podobny, ale odrębny Pep E bardziej odpowiada H11-3.
Dla przykładu, na figurze 6b porównano odczytaną sekwencję aminokwasów jednej z pełnej długości sekwencji (H11 -3) z dwiema sekwencjami ssaczych mikrosomalnych aminopeptydaz. Homologię odczytanej sekwencji H110D z tymi aminopeptydazami zaznaczono ujmując w ramki identyczne aminokwasy. Charakterystycznym dla mikrosomalnych aminopeptydaz motywem jest sekwencja HEXXHXW, która funkcjonuje jako miejsce wiązania cynku (Jongeneel i wsp., 1989; Vallee i wsp., 1990); jest ona zaznaczona gwiazdkami na figurze 6. Sekwencja ta, której obecność wykazano w odczytanej sekwencji H11-1, H11-2 i H11-3, jest zachowana we wszystkich mikrosomalnych aminopeptydazach. Innymi wspólnymi cechami mikrosomalnych aminopeptydaz ssączych i Haemonchus są; obecność stosunkowo krótkiego regionu wewnątrzkomórkowego, pojedyncza sekwencja wewnątrzbłonowa przylegająca o końca N i kilka potencjalnych miejsc glikozylacji. Poziomy homologii H11-1, -2 i -3 do ssaczych mikrosomalnych aminopeptydaz (podobieństwo 52-55% i identyczność 30-32%) przedstawiono w tabeli 2.
Analiza Southern
Wyniki analizy hybrydyzacji genomowego DNA H. contortus z różnymi klonami cDNA H110D i produktami PCR metodą Southema przedstawiono na figurze 10. Dla wszystkich sond uzyskano wiele hybrydyzujących pasm; jest to typowe dla rodziny wielogenowej. Zgodnie z oczekiwaniami, B1A i AustB 1 wykazywały podobny do siebie wzór hybrydyzacji, tak samo jak M1AUS i 3.5 kb PCR. Jednakże wzory to różniły się istotnie od siebie i wzoru otrzymanego dla sondy 2.5 kb PCR, nawet przy hybrydyzacji w warunkach łagodnych (figura 10A), co odzwierciedla różne stopnie homologii pomiędzy tymi trzema cDNA.
Wykazanie aktywności aminopeptydazy związanej z H110D
Stwierdzono, że aktywność mikrosomalnej aminopeptydazy jest związana z tymi frakcjami zawierającymi H110D, które pozostają w supematancie po ultrawirowaniu ekstraktu uzyskanego po zastosowaniu Thesit, z frakcjami wiążącymi ConA (ConA i H110D) i frakcjami zawierającymi H110D otrzymanymi przez chromatografię jonowymienną na kolumnie MonQ (tabela 3). Aktywności specyficzne dla wszystkich badanych substratów zwiększały się jednocześnie ze zwiększaniem się czystości H1 10d.
Tabela 3
Aktywność enzymatyczna we frakcjach z typowej izolacji H110D
Frakcje Specyficzna aktywność enzymatyczna (O. D./minutę/mg białka)
pNA fenyloalaniny pNA leucyny pNA lizyny pNA kwasu αglutaminowego pNA metioniny
sól fizjologiczna z buforem fosforanowym 0.20 0.08 0.12 0.01 0.16
1% Tween 20/PBS 0.15 0.15 0.09 0.01 0.09
1% 1.94 1.25 0.57 0.54 1.91
ConAH110D · 4.08 3.01 1.43 2.09 3.84
CamQH110D 6.55 5.01 3.01 3.90 6.41
Efekt działania inhibitorów ssaczej aminopeptydazy na aktywność aminopeptydazy H110D Dodano do ConA H110D inhibitora bestatyny (która hamuje ssaczą mikrosomalną aminopeptydazę) w stężeniu zalecanym przez dostawcę (Boehringer Mannheim) obniża aktywność wobec p-nitroanilidu leucyny o około 70%. Przeprowadzono serię doświadczeń dla zbadania aktywności szerokiego spektrum inhibitorów proteaz. Te inhibitory, które nie były specyficzne dla metaloproteaz lub aminopeptydaz, nie wykazywały efektów hamowania szybkości reakcji. Inhibitory, o których wiadomo, że działają na metaloproteazy i aminopeptydazy wpływały na szybkość reakcji, jak pokazano w tabeli 4. Najbardziej efektywnym inhibitorem była 5 mM fenantrolina.
175 900
Tabela 4
Hamowanie aktywności aminopeptydaz H110D przy zastosowaniu różnych inhibitorów proteaz
Inhibitor Stężenie Procent inhibicji
substrat p-nitroanilid kwasu α glutaminowego1 substrat p-nitfOonilid leucyny2
Amastatyna 10 μΜ 0 61
50 pM 0 66
Bestatyna 50 pM 23 63
100 pM 35 68
EDTA 1 mM 17 8
10 mM 21 16
1,10 fenantrolina 1 mM 78 78
10 mM 85 87
fosforamidon 10 μΜ 1 0.8
50 pM 1 7
Substrat ssaczej aminopeptydazy M
Subfrakcjonowanie H110D
Rozkład aktywności związanej z frakcjami otrzymanymi w wyniku chromatografii jonowymiennej ConA H110D na kolumnie MonoQ przedstawiono na figurze 13a, a obraz frakcji po SDS-PAGE na figurze 13b.
Następnie, aktywność enzymatyczną przypisywano subfrakcjom H110D rozdzielonym poprzez cykliczne ogniskowanie izoelektfyczne w wolnym przepływie (figury 14 i 15). Przy niższych wartościach pI (pH 4,5) subfrakcje te zawierały tylko wyższe z pasm tworzących dublet H110D widocznych na SDS-PAGE, a przy wyższych wartościach (pH 6,5) zawierały one tylko mniejsze z pasm tworzących dublet H110D. Frakcje pośrednie zawierały oba pasma. Mniejsze pasmo można było również otrzymać jako osobną frakcję poprzez chromatografię jonowymienną na MonoQ, stosując aparat SMARTK firmy Pbafmacia. Wszystkie te suŁfrakcje wiążą owcze pfzeciwciało dla H11 OD oczyszczone poprzez powinowactwo do białek wyrażonych przez klon λ^11 Ml, podczas gdy przeciwciała wymyte z λβί11 bez wstawki i nie wykazują wiązania (figura 14c). Wszystkie subfrakcje wiążą mysie monoklonalne przeciwciała oznaczone TS 3/19.7 (figura 14c), które wiążą się również do zrekombinowanego białka wyrażonego przez klon M1. Wszystkie te subfrakcje wykazują aktywność mlkfosomolnej ominopeptydozn (figura 15c), jakkolwiek aktywność ta jest stosunkowo niska we frakcjach otrzymanych przy najwyższych i najniższych wartościach pI. Tę niższą aktywność można przypisywać niższym stężeniom białka, efektom ekstremalnych wartości pH w czasie subfrakcjonowonio lub wymaganiom obecności obu, większego i mniejszego pasma dla maksymalnej aktywności.
Szczepienie oddzielnymi składnikami H110D
Rozdzielone, niższe i wyższe, pasma otrzymane poprzez ogniskowanie izoelektryczne w wolnym przepływie lub chromatografię jonowymienną indukują tworzenie ochronnych przeciwciał po wstrzyknięciu owcom, co ilustruje poniższe doświadczenie. Trzydzieści owiec w wieku około 6 miesięcy podzielono na pięć grup po 6 tak, żeby każda grupa odpowiadała sobie rozkładem wagi owiec. Każde zwierzę zaszczepiono w sumie 150 gg białka podawanego w trzech różnych dawkach tak, jak opisano w Munn i wsp. (1992) i Tavemof i wsp. (1992a, b) na przestrzeni 54 dni. Zwierzętom z grupy L wstrzyknięto niższe (mniejsze) pasmo Dubletu H110, z grupy U wyższe pasmo, z U+L połączone niższe i wyższe pasmo, z D dwa (nie rozdzielone) pasma otrzymane poprzez ogniskowanie lzoel-ktryczne w wolnym przepływie przy pośrednich wartościach pH i jako kontrola (grupa C) ferrytynę ze śledziony konia (białko nie spokrewnione antygenowo). Trzy tygodnie po trzecim zastrzyku owcom podawano 10000 larw w stadium infekcyjnym i eksperyment kończono 29-31 dni po infekcji. Wyniki eksperymentu zebrano na
175 900 figurze 16. Zastrzyk którejkolwiek subfrakcji obniżał ilość wydalanych w czasie testu jaj pasożyta o około 90% i obniżał liczbę robaków 63-84%, wykazując wyraźną różnicę (p < 0,05) w stosunku do kontroli, obliczoną przez nieparametryczną analizę statystyczną. Redukcja (70-88%) liczby robaków płci żeńskiej była większa niż redukcja osobników płci męskiej i (z wyjątkiem redukcji liczby robaków płci męskiej w owcach, którym wstrzyknięto połączone wyższe i niższe pasmo, gdzie p < 0,07) dla obu płci redukcja ta była znaczna (p < 0,05).
Szczepienie H11S i H11A
Okrojoną, rozpuszczalną w wodzie formę H110D (H11S; która zachowuje swoją aktywność enzymatyczną) można otrzymać z natywnej cząsteczki przez traktowanie elastazą. Stwierdzono, że forma ta zawiera głownie aktywność enzymatyczną typu ApM, a ekstrakt z zastosowaniem Thesit osadu poddanego trawieniu elastazą (H11 A) jest wzbogacony w aktywność typu ApA (patrz tabela 5).
Tabela 5 Stosunek
Aminopeptydaza M (pNA leucyna) Aminopeptydaza A (pNA kwas a glutaminowy)
H110D 1,-44: 1
H11S 26,0: 1
H11A 0,48 : 1
Następujące doświadczenie pokazuje, że zaszczepienie owiec H11S lub H11A daje ochronę przeciw podaniu lub zakażeniu Haemonchus. Osiemnaście owiec w wieku około ośmiu miesięcy podzielono na trzy grupy po 6 tak, żeby każda grupa odpowiadała sobie rozkładem wagi owiec. Każde zwierzę zaszczepiono w sumie 100 gg białka podawanego w 2 różnych dawkach tak, jak opisano w Munn i wsp. (1992) i Tavemor i wsp. (1992a, b) na przestrzeni 54 dni. Zwierzętom z grupy A wstrzyknięto H11 A, tym z grupy S H11S i tym z grupy C ferrytynę ze śledziony konia (białko nie spokrewnione antygenowo) jako kontrolę negatywną. 25 dni po drugim zastrzyku owcom podawano 10000 larw w stadium infekcyjnym i eksperyment kończono 34-36 dni po infekcji. Wyniki eksperymentu zebrano na figurze 17. Zastrzyk H11S obniżał ilość wydalanych w czasie testu jaj pasożyta o około 89% i obniżał liczbę robaków o 76%. Stanowiło to wyraźną różnicę (p < 0,05) w stosunku do kontroli, obliczoną przez nieparametryczną analizę statystyczną.
Hamowanie aktywności aminopeptydazy H110D przez przeciwciała
Roztwory zawierające H110D inkubowano z surowicami z poszczególnych owiec, którym wstrzyknięto frakcje zawierające 110D lub z owiec kontrolnych. Roztwory testowano następnie na aktywność aminopeptydazy, stosując pNA fenyloalaniny i kwasu glutaminowego jako substraty. Stopień hamowania aktywności (maksymalnie 89%) korelował z poziomem ochrony wykazywanym u poszczególnych owiec, od których pobierano surowicę (patrz figura 18).
Lokalizacja aktywności enzymatycznej
Aktywność aminopeptydazy badano w zamrożonych skrawkach dojrzałego Haemonchus contortus. Jak pokazano na figurze 19, aktywności aminopeptydazy zlokalizowane są na wewnętrznej powierzchni jelita. Białko H110D jest również specyficznie znajdowane w tym miejscu.
EKSPRESJA H110D (KLON 2 3.5 PCR) PRZY ZASTOSOWANIU SYSTEMU AUKARIOTYCZNEGO BAKULOWIRUS - KOMÓRKI OWADÓW
Ekspresja aktywności aminopeptydazy w komórkach owadów
Zainfekowane komórki zbierano i testowano na aktywność aminopeptydazy stosując jako substraty pNA-phe, -leu, -met i -lys. Test komplikowała zaobserwowana w komórkach owadów aktywność aminopeptydazy z widoczną preferencją dla wiązań amidowych obejmujących lizynę. Jednakże ekstrakty komórkowe zawierające wyrażone H110D dodatkowo trawiły pNAleu, -met i -phe wykazując preferencję zgodną z powyższą kolejnością.
175 900
Ciężar cząsteczkowy i immunoreaktywność wyrażonego białka H110D (klon 2 3.5 PCR)
Próbki ekstraktów z komórek zainfekowanych lub kontrolnych poddawano elektroforezie w 1% żelu poliakrylamidowym z SDS, barwionym następnie błękitem Coomasie. Lizaty zainfekowanych komórek zarówno 3.5-2-P3A jak i 3.5-2-P4A dawały pasma o tej samej wielkości jak H110D, 110 kD, które migrująbezpośrednio poniżej wyrażanej równolegle β-gal, mającej ciężar cząsteczkowy 120 kD. To pasmo nie występowało w lizatach będących kontrolą negatywną. (Było również nieobecne w lizacie PAA, który nie wykazywał aktywności enzymatycznej).
Białka rozdzielone w dwóch równoległych żelach przenoszono na filtry i badano techniką Western z anty-H110DN (figura 21). Bardzo mocną specyficzną pozytywną reakcję immunologiczną otrzymano dla pasma 110 kD obecnego w 3.5-2-P3A i 3.5-2-P4A oraz do natywnego dubletu H110D w ścieżce kontrolnej zawierającej ConA H110D, podczas gdy nie obserwowano reakcji w żadnej ze ścieżek kontroli negatywnej.
1715900
Literatura
Anderson, G. L. & Evans, G. A. (1980) Biotechniques 6,650.
Blin, N., & Stafford, D. W. (1976). Nucleic Acids Research 3,2303-2308.
Bowtell, D. D. L., Saint, R. B., Rickard, M. D. & Mitchell, G. F. (1986). Parasitology 93,599-610. Chomczynski, P & Sacchi, N. (1987). Analytical Biochemistry 162, 156-159 Cordingley, J. S., Taylor, D. W., Dunne, D. W. & Butterworth, A. E. (1983) Gene 26,25-39. Devereux, J., Haerberli, S. & Smithies, O. (1984), Nucleic Acids Research 12, 387-395 Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1983). Analytical Biochemistry 132,6-13.
Fire, A. (1986) EMBO Journal 5,2673-2680.
Fire, A. & Waterston, R. H. (1989) EMBO Journal 8,3419-3428.
Francis, M. J. & Clarke, B. E. (1989) Methods in Enzymology 178,659.
Frohman, M. A., Dush, M. K. and Martin, G. R. (1988). Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington 85, 8998-9002.
Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983). gene 25,263-265.
Han. M. & Sternberg. P. W. (1990) Cell 63,921-931.
Huang, X.-Y. & Hirsch, D. (1990) Proceedings od the National Academy of Sciences Washington 86, 8640-8644.
Johnstone, A. and Thorpe, R. (1982) Immunochemistry in Practive. Blackwell Scientific. London.
Jongeneel, C. V., Bovier, J. & Bairoch, A. (1989). FEBS Letters 242,211-214.
Kenny, A. J. & Maroux, S. (1982), Physiological Reviews, 62,91-128.
Kenny, A. J. & Turner, A. J. (1987). Mammalian Ectoenzymes. Elasevier Press, Amsterdam. V olume 14 of Research Monographs in Cell and Tissue Biology, (editors J. T. Dingle & J. L. Gordon).
175 900
Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685.
Lojda, Z. & Gossrau, R. (1980) Histochemistry 67,267-290.
Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Publication.
Merrifield, R. B. (1964) Biochemistry 3,1385-1390.
Munn, E. A., Smith T. S., Graham, M., Greenwood, C. A., Tavemor, A. S. & Coetzee, G. (1992) Parasitology 106,63-66.
Nachlas, M. M., Crawford, D. T. and Seligman, A. M. (1957). J. Histochem & Cytochem. 5, 264-278.
Nakane, P. K. & Kawoi, A. K. (1974). Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22, 1084-1091.
Noren, O., Sjostrom, H., Danielsen, E. M., Cowell, G. M. & Skovbjerg, H. (1986). The Enzymes of the Enterocyte Plasma Membrane. In Molecular and Cellular Basis of Digestion. Elsevier Press, Amsterdam, (editors P. Desnuelle, H. Sjostrom & O. Noren).
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Semenza, G. (1986). Annual Review of Cell Biology, 2,255-313.
Smith, D. B. & Johnson, K. S. (1988) Gene 67,31-40.
Spieth, J. MacMorris, M., Broverman, S., Greenspoon, S. & Blumenthal, T. (1988) Dev. Biol. 130,285-293.
Tavemor, A. S., Smith, T. S. Langford, C. F., Graham, M. & Munn, E. A.(1992a) Parasite Immunol. 14,671-675.
Tavemor, A. S. Smith, T. S., Langford, C. F., Munn, E. A. & Graham, M. (1992b) Parasite Immunol 14,645-655.
Vallee, B. L. & Auld, D. S. (1990) Biochemistry 29,5647-5659.
Watt, V. M. & Yip, C. C. (1989) Journal of Biological Chemistry 264,5480-5487.
Woodward, MP, Young, WW Jr and Bloodgood, RA (1985).
Detection of Monoclonal Antibodies specific for carbohydrate epitopes using periodate oxidation. J.Immunol. Meth. 78,143-153.
Wu, Q., Lahti, J, M., Air, G. M., Burrows, P. D. & Cooper, M. D. (1990) Procedings of the National Academy of Sciences, Washington 87,993-997.
INFORMACJE OGÓLNE
ZGŁASZAJĄCY: NAZWA: ULICA: MIASTO: STAN LUB PROWINCJA: PAŃSTWO: KOD POCZTOWY: TELEFON: TELEFAX: Agricuttural rnd Food Reeerrch Councll Babrhamn Hall Babahamn Cambridgeshire Wedka Byytania CB24AT 223 1837952 223 1837522
TYTUŁ WYNALAZKU: Zrekombinnwaae ccąsseccki DNA kkddtąccaminnpeptyyazy i ich zastosowanie w wytwarzaniu szczepionek przeciwko robaczycom
LICZBA SEKWENCJI: 24
DANE KOMPUTEROWE: TYP DYSKU: KOMPUTER: SYSTEM OPERACYJNY: OPROGRAMOWANIE: Dyokjtkaa 10bmptyabilyy z IBM PC PC-DOS/MS-DOS
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 1:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 295 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 1:
CGCGGACATT GCTGAATCTA ACTCCAATCC GTCTTATTGT CGGATTATT7 CTAGTAGCTG 6 0
CTGCAGTCGG CCTCTCTATT CGTCTCACCT ATTACTTTAC TCCGAAAGGG 120
GACAAAACCC GGGCGGGGGC GATACCCGCG GCAAGCACGA AACGAAACCT CCGGCGGCGC L10
GCCAACCGCC TCCTCCAACT AATATAAAAC CGCTGCCCTA CGAAGCGAGG ATCGAAAGGT 24 0
ATCCGGCCCG CCGCGTGGAC CCCCCACCGG GCGGGAAGCC CACA77CGAA GGGOG 295
INFORMACJE O SEK NR ID: 2:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 484 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: limowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 2:
OGAACACGAG CACCGAATGC AATCCCOCAG TTTTTCCOGG GCGAACCCGA AGCGCAA7CO 6 0
OGCTCGCAGT GCGCGGCGAA GCCCACCAGC CGAGTCTACG AC/C^t^^^/^C^Ti^G CGGCGGGTTT 110
ACACCGOAGA GCTACGAAAA GCATCCGGCC CCGTCCGAGG A7AATCTCCA AAGCAGGTCC 110
ACTGAGACGT GGCGTGCTCC TCCAOCGGGG GGGCGCCCCC AAC^A^^ AAAAGGTCTC 22 0
OACGAGCAGC TCGCGGGATG TGAAGGCOGT CGGCAAGGOG CCGACTGCGT AAGAGOCAGG 3 00
CCTCCCGCGC GGAAAACCCT CCAGCGCCGC GOCCCCGAOC AAGGCCC5TGA TTCGGGGACT 360
CAGGAGOCGA TGGAAGTATA TAACOGGOAA CAAGCCCGOT TGGAGGOGAGA CGAOCGCACC 420
OGAGCGCTGC GACGGCGTAA ACAGCCCACG GGTGCGAGCC CA^nOT-TAT G GGCGCGTCT 4 20 GATC 202
INFORMACJE O SEK NR ID: 6: CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJII:
DŁUGOŚĆ: 210 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: limowa
OZNACZENIE SEKWENJJI: SEK NR ID: 6:
ACCCGCTCGG CAAGCGGGCG GCCCGCCAAA GCCAGCTGGC CC7C7GTGG\A CGCCTCCAGC 6 0
GTATGGGOCC CACGAACCCG CTGACOGCCC GCCCGGCAAO CTC^TCJ/GAC TTGCGCAGCG 122
OGGGCGGCTG CGGCCCCGCG GGCACGCCCC GCCCGAGGGG 77GGGA7GCC AGTGGGOACC 110
CGGGGGTCCG AGCGGGCTCC TCATCGCGGC CTTGCG 210
INFORMACJE O SEK NR ID: 2:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI!:
DŁUGOŚĆ: 501 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: linowa
OZNACZENIE SEKWENJII: SEK NR ID: 2:
175 900
GGGAGGAAAT CACIGCGAGC TTGGAAACAG MGACAGAGC AGTTGATAAA TTGATCGGCG 6 0
CT^I-GTTGCAC , AGGAATTCGC TCCCAACAAC AAATTGATCA GCrGA.AGAAG AATCTACAGA 120
AGAACAATGC ' GCAGGCTAAG AACTTCCAGA AArr-TTGCrG TΛTCΛΛGCCC CATTTTCACA 100
GATTATCGGA Α'ΠΌΓΙΆΑΑΑ AGAGCAAGAl’ CCCGCGGGΓr CACGtCrGAGC TCCTT·TTG^’C 2-10
CCTGCTGCCC CCr'CTTCT,CC TG'GGl”rGG'ΓG, lUWAGTTCAT GrCΛrΛ’GΓTG α'-ΧηΤΤΟΑΛΤ 300
GcrATC-CA-n· CGCCTCCCCC CCCCCCCCGG GCCTGCCCGΓ TCCGT'ΓCCCΛ G'GTTGGTG'TG 360
AATTTCGAAT A rATTATGAA GCGGGGAGC· GGAACGTPAT T A TGCCTCAC TT ]'GAA'GGrA Λ 30
TATAGCTcIAC TCrGGGG”ΠΓ' CrrAGCrGTGA GGACGGGCAT GrAAGAGGGA CCCGGGTCCΛ 4 80
GCr-rAGM]’ G G-rGGCCCΛAG ACATTTTAAA TTCCGAGTAC CTTCCCCGCG GACTTTGCCC 54 6
AGAOTrGTrr CTmjTCTGC GAGGGAGCGΓΛ ACGGT1GCGA T 581
INFORMACJE O SEK HR 1D: 5:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
di ugość: 948 par zasad
TYP: kwas nukleinowy rodztj NITU podwójna
TOPOLOCIT: liniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 5:
ATTACTTCTC AGTTG^AAC GCGOACA'IA'G CrOAATCTAA CTGCΛCCGCG TTTGTTTTTG 6 0
TCTG'GGGGGC GCGGTTCG'TC TGCAGTCGGC CTCTCTATrG GTGTCΛTCCA TTGGTGGΛCT 120
CTCTATTCTT TCGCTCCCTC AG/WTGCCA GGGTTGGATG TTACTGGTGG CAAGGACAAA 120
GACTWITCTC CCTCTTCTTC GG7TCTACTC CTTCCACCrT ATATAAAACC ATTGTCTTAC 20 0
GACTTGACGA GCGAATGTGT TCTACeTCCT TATGTGGACT TCCCACCGGA GAAAAACCTC 300
AGTGGCTTTT TTCGTTGTTG ΛΛTCTCΛΛ'ΓG GTTOTMArG TGCCAACAAA GAGTATCGTA 300
CTCCGCGCTC TGTTATACCC CΛΛGCΛTCTT TACTGGTATC GGCCGATyWA 400 CCCΊTCTACA GGGCCCTGTG ΛΛCGGΛGCGC CCΛΛCCGTGT GAMGCTTGA σΤΤΤΤΛΤΟ 480
ACCATCCCCC TGTGT' .AATA TrCACA/WrC TΓGTTCTAAT TCGCTYACAT CGGTCTCATC 54 8
CTCCCCCTCC TGTTTTTCCG CTATCAGACC ACCCGGATGG CACCCCT,GCG 600
CTCTCGTCCT GGGCCCCCCC TCTCCCCTCΛ CGTGCTGGCC CCGTGGCACC GGGCTT<TTGT 600
GCCCCGCCCG CCCCCTCCCC GΓGCCCGGΓΓ ΛΌΤ^ΤΟ CCCCCCTGCC 770
TTCGCGCCTT TCCGCTCCTG CCΛTTCTCGT GΓTGTCGGΓG 7 80
CCGG'rcrTTA CTACTCCACT GGTTGCG'ΓGC TΛCTTTΊTGG CGGTCGTTTT TΊ'CΛGCGTΠ' 80 0
CCCGCCCGCT CCTGGTCCCC CCTCΛTGTGT GGGTTTGGCC GCGCGTTGTC CTGCCCΛCTG 900
TCACATCCTC GTCCCCCCGC TTCGCGTCCC GCTTTGCGCC CGTTCCGC 00 0
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 6:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENJJI:
DŁUGOŚĆ: 1689 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
OZNACZENIE SEKWENJJI: SEK NR ID: 6:
AATTCCGGCT CGTCCGGAAG CTATGAAGAT ATGTTTGGAT TACTATGAGG ACTTCTTCGG GGTTGCTCTT CCTGACTTCT CATCTGGTGC GGAGGGTTCC GTGCTCTACG AT(^TGAA^CtCT AGAAGTGATC GCGCACGAAC TGGCACATCA GTGGGATAAC CTATGGCTGA ACGAAGGATT CTTCATCAGC GATGGTCTAT GGG/GAATGTG TGGTATTACG GCTGATGCAG GAGCTGCAAG TGCAGATGTA TCAGAAGCGT TCGATGATAT AATGCTATTG AATTTAGTTG GGGACG/GWA GAAGTTTTCA TATGATAATG CCGCTGCTGA CCAAGGTATA ACCGGACCTA ATGGTGGACC GACAACTCAG ATGGGGTTCC CTCTG^(T1C^/^C AGTCACCCAA AAACGATACA GGCAGAACdA TCCAACTTAT GGGTTCAAAT GGGATGTTCC GAAAAGAACT TGGTTAAAAA GAGMA&GACC GTCAGTTGTG GTGAATGCCG AACGTCGTGC TTGGAGGAAC ATTATGAGAA GACTCTCAGCA AAACGCTCTC ATAAGTGATG CTITTGCAGC CGTATTTGAA ATGCTCAAAT ACACCCGTGTGA AATATCAGGA TTCAATACAA TTTTGGACTC’ TTCGGAATAC ATGCGAAAAC TGATG/GAGCC AGCGGAGAAC TACAAAAAAG ATrt^t^C^GmT TGACACATAC TGTGGTCTTG GAGGCACAAGA CAAGGAGGTC ATGAAATGTC AACCTGGTCA TCCTCTCCGA AAAACTGTTT ACTGCTATGG CAAGGTGATG GAACTATATA ATGCGGGGACA AGCATTGGGA TGCCATAAAG ACGTTACAGC TCGGAATTC
GGAAAAATTG GCCATGAGAG CT«3AATCĆAA GGTrA.CTC’TC CCACTTCCAA AACAAGATAT T/ATGGAAAAC TGGGGTCTCA TCACATACAG CTACCGGCCCA ATGAATAAGG AGCGGGTTGC GAGG'<'TCGGT AATTTGGTCA CGATGAAGTG
GTGGAATACA TCGGAGCCGA AGAATTCCrrC CTGCTGGCAC CGTACACAAG CCATrCCCTT TCCTTCAGAA TAGAT7AAGGC (caaaaccgt aaaggagcat cccttcttca TTTrCTCCAG TCTGTTTCGC GTTACCTCAA ΑσΑΊΓΓΑΤΟσ GCAGCATTCG ACG<CTCCCGT ATrGATTTTG TCCGAGTTTG CGCCACAATG
GTTAACGCAA CGA(CΓΓΓG<CA CAATGC1AT'lG GAACCAGAGA AGTACCGTCA
CAGGAAGATG AACAGCAAGT GCTCTAAnTC CATGTAAGCA ATTCTGATTC ΊΤΐη·’'!^ TCAAACTATG ACGCTAACGG GATTrCCTT\G GTCTATGGTC CACGAACAAG AGCT'rCACAT GAGGAAATGA ACTACGAGAC ΆCAT\CAGGAT TACTTACCAT GGAAGGAGGC rT'TCCAAAGC GAACCCGAAT CTĆAATGGGC CrATTATGAC .TTATATTGCA TCAAG1TTAT C][TCCCAATCΓ AATCTCCAAA TAGCTGTTAT ATGACTTGAA( GAAATGAAAA AGCTmTGA GCCAGCGACC GACTGCGTAA AGGTAACTGC ¢AJTC<CT;AACT GGCGGTGATG AGGCACTCGA AATGCAGTTG GAGAAAGACA GTCTACGTGA TCTrTTGGGA CTTCTTATGC TGGCTTTGGA
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114 0 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1689
INFORMACJE O SEK NR ID: 7:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 2472 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: Umowa
OZNACZENIE SEKW^l^l^CI^: SEK NR ID: 7:
ACGGGTGTTC GGTTCCGTAT ATGGTCTCGA TTGGATGCTG GCATCAGATG CCTGGAGTTC CTGGAAAAAC AAGATATGAT TGCTCTTCCT GGCCTTATCA CTTATAGAGA GGATTCTCTC AATAAACAGC GGGTTGCTCT CGTAGTTGCT CTGGTCACAC TGAAGTGGTG GGATCATACG GAGTATCTTG GAATGGACGA AATTAGCCAC CTCGATGGAA TGGATCGCGG AATGAGAGCT TTTAGGATTG ACAAAGCGGC AGAAGTTGCC GGAGCGTCAG TTCTCACTAT GCTACGCGCT GTTGTGCAAT ACCTCAAGAA GTICTCCTAC GTCTTCAATG AAGTTGTCAA AGGTGTGAAG CAATTTACCG ATCAGTGGAC GTATCAGATG AATGCGACCG CCCTAAAGGT TACACAGAGC
CCAGACACGΆ cAACGAATGAC GGCATACGC’’ TrTrACAATA’ TCTTTGACAT CTTTCTTCCCT GGTTTTACCG CTGGTGCCAT GG7TTATCTGG CTTATACATG CTAATCA'rTΓA TGCACCGGAIG rCCGACCTTG CTCATCAGTG GTTCGGC1TΎI' TGAAr'rAΛCG AzAGCTI^TTGC ^ΟΓΙΤΤσ'ΙΤ 1TCCATTTrA G/TCCGCcTCGA tttcttcttg GGTTrGACAG CATCGAGCCA TCCGCTTTCG CATCCCTrTG ACGATATITC ATACGCCAAG TTGGTTGA>AG AGGACCCTfTA CAAGAATGCT ACAAATrAAC CAAGCAGCCGA TCTCTGGACTC AAArCTrACG GGAACGTCAG G?TTTC^^C(37(C GAA'r·rτrCCG ^GGrr^3^CTCGΎ ACA·T^(Ά'TTrr' CCGTΛCΛAGΛ CAAATAAAGA CGCCCTGGAA (50 120 100 2 4 0 300 360 420 4180 540 600 660 720 730 840
175.900
TCACAGAAAC ATCGTAATCC AAAATACGGG Gaaccccaca GCAAAGAGGT GCAAGCCAACA CATCCCAACA CTCGGGACAC CTCCCTTGTG CAAAACTATG CTGCCCACGC 'TCGGAAAAAG gtcttcggtc CAAGGACAAG GAACGCTATC GACCTACTCG ACCATCAAAT TTCTATTCGAA TTCTTGCCTT GGAAGGAAGC TCTGTCCGGC GAGCCGGAGA CAAAACCAGC TAGAGCTCAC ACCACCCGCA TTGATTACAT CGTCTAAaAAC AATACTCAAA AGGATATCAT TGATGCATAT TAATATAAGA ATATCTTCTA CGATGACGTT ACCAAATGCG TCAAGGTCCT CCCTCGCTCCTr GAAGGTGGTG AAGAAGTTCT TGAAAAACGTG CTGGAGAAGG GTATCTTGTT CAAAGCCTTG GAACTTCTTT TGCGCCCTCC GGACCGTTAAA ATTCCTCTCC GCGTTGCACC TGCCAAACCCT ATGGAGAGAT GGGAGGAAAT CAATTGCGAGC GTCCTCGCCC TTTGTCGCAT AGGCACCTCGC TTACACCACA ACAATGCGCA GGCTTCAGTAAG GGACAACATA CAATTGCCCG GATCCCAGACA AGACAACGAT CATACTTCCT (CACACTGAGC AGTCTTGTCC CAAACTTCCT TTCACCCmT TAATAATACG ATCTCAACCA CCTTCTCACTC GAACCCCGCA TTTCGAACCC TAACGATCGCCT TCTCCAGCTG TGATGATTCC CTACCTTAAGAC CACATATTCC CAACCCCGAC CAAZCCCCACC TGTTACCCAT TTAACTGCCC CGAGTCCGGCGC: TGACGTTGGT GT
TTCAACCTGGG ATGTTCCCCT- ATGGTATCAG TGGCTTAAAAA- GAGATGAACC GCTGTACTTG GTGAACGCCC ACCCCCATGG ATCTTATTCA ATAACTCAAGC AGCTCLACGAA- AGCTCACAAC ATAAGCGATG CATTTGCTGC AGCTACGATT CTACTTG/TTC ATTATGACAA AATAGAGAGG ATGTTCGCAG actttttaaa TTCCGGTAAA ATGATGAGCA TATTCTTCGC GATGTATAAT cacttcglatg ATACGTTATT CCCAACAATT - TGTCCCTTTC GATCAAAGGA TTGTCTACAC ATGCCCCAGT GTCCCGGCCGG GGAAGCAGCA CGAGCCLATTG TTTTACTGTrA TGCTGTACAC ATGGGGCTCT ATCTAGCAGA AGATCCTGAA GCATGCCACA AACGATGTTCCC AGTTCTAAAA TCCTTCACCCG tgcgtcftca ggatgtcact (CGGGCGAAG AATCCCATGTT CAATTTCCTA ttggcaacaa aaaacagagc agttgataaa tccctaccaaac actatagatca gctg/ccg/aat ttcggtcccat tcacccagga aatcgcaaaaa CaTTCTCCAAA- GATTCTTCGGA ATTCTTCAAG TCCAATTTTA ACATTCTTCAA- ACTACGAGAC ccgtcgttta GTTAAAATAA CGATCCAaCAAC ACAGTGATTA CTGAACCCCCG AATATATCAT caccttctctt -atatagagct cactctccat CCACCATTTA CCAGCCTAGA ATCTTTCCCC GCTGAOGATG CCCAGATTTG TTACTCTTGTC TTGTTTGTCA ATTGCTTATC TGAT7CAATAT
000
900
1020
0800
1100
1200
1900
3100
3300
1110
5000
5900
1100
1600
1740
1800
1160
1920
1900
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2471
INFORMACJE O SEK NR ID: 8:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DLUGOSC: 3305 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: Uniiiwa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 8:
GCTCAATTTA ACTCCAATCC GTCTTATTGT CCTTTGTATT GCTTTTACTT ATTACTTTAC AGGGAAGGAT GATACCGCCC GGAAGGATAA CTTTTTAACC AATATAAAAC CATTGTCTTA TTATGTGGAC TTCCCACCGG CCAAAAATCT GGTTGTAATT GAGCCAATAA AGAGTATCGT CCAACCATCC GAATTGGTAT CGGGCGATAA CTCAACACCG CAAAAGGTCC AGTCCTTCAT TTTGCCCAAC GCCGGTTACA TCGCCCCCAT CACTTATACC ACCCCGGATG GCACCCCTAA AGATCGTCGC CGAATGGTAC CATGTATCGA TATTGTCATT TATCCAAAAC GCATTACAGC TGGAGAGATC AGTGGTGATT GGATCACATC TCACTTCTCG CCCGTTATGC TCCCAGAATC TGTTCGGCTT CGTATATGGT CACGCCCAGA ACCTCGTATC AAGTGCATAG CATCCTACGA GAAACAAGAT ATGATCGCCT TTCCTGATTT CCTCACTCAC AGGCCAAACC TTTCCTTGTC CCAGCGCATT GCTCGGATCC TTCCCCATGA TACGATGAAG TGGTGGGATA CTTTCTGGTT TATTGGAGTT GGTCAGATAA CTCAAGATGA TGTAGTTGCA CGTGCTTTGA CAGCTCCTTC AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTGAAGAAGC TCTTCTTCTC CCTCTGTTGA GAGCTTTGCT GTCGTCCCTC CCACAGTTTT CGTATAGCAA TGATGAAGTT GTTACCGCCG TCGAAGGTCC
CGCATTATTT ATAGTAGATC CTGCAGTCGG ttcgaaaagc -ttagacaca taagaaaaga AAGACAATTA CTCATATCTA tcggaaataa ccaccctcct tataaaaaaa tatacctata cccgcttcaa tacccatctc taaacataaa AATTAAATTA TACrAArACA tacgcaacac AAAACCTTAA TACCGAACrT TTAACCACCA CACAACGCCA CATAAAAAAA TATCACAAAA ctcgtacccgttttgataga TCATCCAcrc ggctcgctca cgtttacaaa tatacgccaa TTACCCCGCA TTCAAAAGCA TCATGCCCCC CCGTTTCGAA CCAAATTAAA CTCACGrCCC GGACCTTCTT CAGCCGTCGA CCCCTCTAAT TCCCCTCATC CCAAGCTGAC CAAAALCCGGC GGGACAACCG TaCcCGATCA TATCGTATCA AGGCTTTCCT GCACaTgACA TTCCTCCGCA CTCTGGCGGT GCCGCTGCCC TATTGGGCCA CGATGACAGA TTTATATCAA TCCAGAATCA GGTTGCTTAT cagctccctc tgccagttcc GAATGAAGGT TCCTGAACCA TTGCCGACAT CGCCAGAATG CGGAAAACCT TTCGTATCTA GGTAGCGTCA AGGGGATCAC TTTTCTTCAG CTTTGATGAT ATTACCATCC CCAAAGGAGC TGGAGAAGAGC AAACATAAGC ATCGGTGTATC TGCAGAAGCG ACTGATTTAT GGGCAGTTTT AGACGGGTCC CCTATGAAAA CCACAGAGTT
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1000
1000
1114
1110
1111
1121
1133
1144
1150
1151
175 900
CACAAGGAAG TGGACGACTC TACTCCTTTG AAACCACAGA GAAGTACCGT CACAAGCAAT CGATAAGAAG GAGCCACAGA TAATGAGGCC GGCGCTCCCT TCATGACGCT AATGGTTGGA AAGCCCAAGG ACAAGGAATG AATTGCGCAC GCGAGTGGAC ACCATTAGAA ATCGCAATGT AGAGGCAAAG CCAGCCGACA CAGTATCGAC TTCATTGCCA CCAAAAAGAT GTCATTGATA TACAACAGTT TTCGATGACG AGTCGCAAAA ATCGCCGCTC CAGAGAGTAC GCTTCCGACA AAAAGACTTC CCACGCACAA TCTCTTGCGG GCTCTGGACA CTTCAAAGAT GTAGCAGCAA GAGATGGCCA GATATCATTG ACCAGCGAGC ACTTCAGGAA GAAAAATGGC ATGAACGCTC AAATAGGGTG AACAGGATTA CACCTTGTAA TTCGCATCAG AACAGGAGAC TGACTGTCTG AACTTCTATA GTTATATTTG AAAGCTCAGT ATTGGCAACC CCCTATACCC CCTACCTAAG CTCAGAACAC TTCCTACAGA TATAACACTA TACAAAGAAT AAAAA
AGATGGGCAA CCGCAGTAAAA AAAGTCGATA TGAGGCGAAA ACGGAT'CrAA ATGGGATATT GAACAAGCTG’’ GAGAAGAGAT TTGTGCTGAA CGCAGAGCGG AAAAGATAAT CAAGCAGTATG TCATCATTAG CGATGCCTAGT TAGAACTTCT GTAATATGCC CCGGGATCTC TTCGATTTCG CATACATGAT GGA.tATATTT ATAACTACAG TGKAAGACAaAT •pGTTCTGCGC GCTGGGAACG AAGTCATGAA (CAAATGCAGG CACACCGAAC CCACTGTTTAT AGGTGATGGA GCACTATACG CATTGGGATG T(GT(AA(GAT GGAATACGTC (TGCCGTACGT ATCCTATTGG CGTCAGTACGrC A/ACCTAAAGG TAACGTCAGTAAC TCCGCTCACA ACAGCAGAAA GTCAATTCGG ttcaatcgat AAAAACATATr CCCAAAACCrA ATGAGCCAGAA ATCCAGTTCT TTGGTCACTG TTCCG.CTGTCA CCTTCCGTGA (ΑΑΓΤΓΑΑΑΤΌ GTAGAACAAT AGCAAGITTCG tgaatacgga aagatcttca atagcctctt cagg^ctaatta ΎΎΑΑΐΑΤΑΐΑΑΑΑ GATTGTGTTG
TCCGTAGCAG AGTTAAACTC (AAAGACGCTG TGGAGAAAGA CCACTGTGGT ATCAGGAAGG gaaccgcaat acttgcatgt ΑΛΑΟΟΛ'ΤΆΑ ATCGACAAAA AAGGATAATC ATGAGGTTTA GCTGCGGCA(G CAAtCTGACGC GAAAAAGTAAA CGGAATATCT AAATACTATCC CTACCGAGCC (CAACCGATGT ATGTAAAACAG (CjGGTCTrrCC (AAATCAAACCT CAAGACTGCA (ATAAGATAATA GATGGTCAAG CAGCAACCGA TGTAATGGTG TGAAGGTAAGG GCCGAAACAC TCGCCCTAGA GTTACTGCTT TGTAAG3GACT ATGCAGGATA TCCCAAGTGC ATTCACACATr TC(GT'A7T’GA AGATATGTTG AGAAAGTGAT GACCAGCTGA AGTAATCTGCA (CAAGCAATCG AACGAGCACA GCGGCTrTCT TCGCAGAA^GC T(AA\GTTCAT GTAGTTTAATAT tggaa(cttt· tacctacgaac 'ΤΑΤΑΑΑΑΤΤΤ CGATAGTCAAAC CTTCATCCCAA TrCTTAT(GG( TATrcGTrrG ταατγογαατατ TITrrGATrG TZ^TT^i^T^A^CiG'^ GTATAAAAAAA (AAAAAAAAAA
1620 16 00 1740 1800 186 0 1920 19 80 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3340 3300 3305
INFORMACJE O SEK NR ID: 9:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 1301 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: Uniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 9:
AATTTAAGTA CCCAAGTTTG AGATGACAGC ACCACGAAAA AATACAGTGC TACGGCTCAC GGTAGCTGCT GCCGTCGGCC TCTCTATCGG TGATACTACT AACGGACAGA GTTAACAGGGA AGCTGAAGAA TTACGTCTCC C/GCCAACCAT AACGTATCTG CCAAACTATG TAAACTATCC TGTGGTGATT GCTATGGAAG TTGTGGAGCC TATCCGAGCA ATTGCAGACC AGTGCGGACT AAAGGTTGTG GAGAAAAAAA GGCTGGAGATC GAAGAATCAG AAAATCACGC TC(G\GATAGT ATGAGTCTAC CGAACAACCT ACACGGATAA TAACATGGAA CCGACGGACG CCCGTCTTAT GGCAAACTGG ACTGTGACTG TGATGTCCCTCC AGAAAAGGGA GAAGGAGAAG TCTCTGGCGA GCGAATGCCT TCGTATTTGA TTGCTCTTGT TACGAAAAGC GGTGTTCGAT TCCGCCATATG ATATGCCATG GTAGCTGGAA TCAAATGCTT ATTCCCTCTT CCAAAACAAG ATATGGTTGC GAACTGGGGT CTCATCACAT ACAGGGAGGG ACCAATGAAT AAGGAGCGGG TTGCAGCGAGT CGAGCACGCG GTCACGATGA AGTGGTGGGA ATTCGTAGAA TACATTGGAG CCGACTTCAT
AGAAGAATGT CACATGCGAA AGACGGACAG CACAAACGCiG TCTCTCTTTG CCTTGCTCAT TGACGAATTT ttcgtttcaa GGTAAGCAAT TGGACACAGA’ GTCGTAGGAA AATCCCCAAC AACACCATTG AGGATACGACT TCGTCATCAA GCCTGTATAA GTTTTCGGAC TTGGAGGATC GACAAACTCT ggtttgcgcg ccagccaaaa gcatccctac cacagcaaaa ccagcatgaa AGTGGTgGACC gctctggaat gacagcggtt ccgaaacggg cgaaagaaga gcccggctgg AGAAGAATGG GGAAACAGGC CGGGACGCGA aa>gcacctga ttgctcatgt caacatataa AACAGACACC GATGTCCGGT CATAAGGTAA ttgagacgca cagggaatga aacagacacc gacttgcaaa ccacacatag ctggaaaaac tacccgtccg cgacaaccga ccatggcgaa ggaatggatt gtaggcagga ACCGGGACGA acttgctcac gacacagcac gtgcatagaa ttaagaacta tgccaagtca ggcagagacg gaacggcccc caagctGgaa atgccttatc tgcccactgg cgcaaaagaa gggcgccatg aagagagggg a
121
181
240
303
363
424
484
545
606
666
727
787
840
909
969
1100
1100
1114
1100
1106
1301
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 10:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 1280 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: lniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR 1D: 10:
GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACGGC GGAGTGGCAG GAAGCGTCGAA T<TTΊAGC^T' 60
CTCACCTATC AGCCTACTTT GTACATTATT TCTATTAGCr GCTGCCGTTG GACTCTCCAT 120
TGGTCTTACC TATTACTTCA CTCGTAAAGC ATTCGATACC ACACJAAAAAG AACAGAAGGA 180
TGACAGTGGT GGTAAAGAAA AGGATAATTC TCCTTCTGCA TTCTTCCAAC 24 0
GAACATAAAA CCAGTCTCGT ACGACTTGAA CATCTGCA\CA TATCTACCGG GTTACGTGAA 300
CTTTCCACCA GAAAAGAATC TCACATTTGA TGCCCATGTC GAGATTGCTA TGGTTGTGCT 3(5 0
TGAGCCTACA AATAGTATTG TGCTGAACTC GAAGAGAAYrC ACTTTGGCAC AAGGAGGATG 4120
CGAACTGTTC TCAGGTAATC AGAAACTTGA CATCGAHACAT CTTAAAGATGC JMG^AAAG^A^CT 4 80
TGACAAGCTT GAGATTACCC TCAAAAATCA GCTGCACAAA GATCTGTWA TCCTGCTCAA 540
GATCACTTAC ACCGGCCTTA TTAGCGACAC TCTCGGTCTG CTCTACCAGT CCATCTACAC 600
TGATAAGGAC GGAAAAACTA AGATCGTTGC 'IGirTrCACCA AATGAACCAT CAGACGCTCG 660
TCGTATAGCG CCATGCTTTG ACGAACCGJAA GTACzATGCA ACATGGACTG TCACCCTCGT 720
TCATCCCAAA GGTACAAAGG CTGaATCGGAA CCGGCATTG/A GGAŻAATGGAA AAGGGGAGCGT 7T0
CAAGGGTGAT TGGATAACGT CT^JAA^TT^iAA AACTACCCCA CCGATGTCCT CCTATTTATT 84 0
GGCTATTATT GTTTGTGAAT (2C^rT ΤΟΚΤΟΑΤΙΤ A(CAAAA^(C^G CTGTAC<TAΓC 900
CCGTATATGG TCTCGACCAG AGGCGATGGC OWTGACGCGA TATGCCCTGG ATGCTGGCAT 96 0
CAGATGTCTG GAGTTCTATG AGAGATTCTT TCACCaTCCAA. ITCCCTCTGG OcAAAACAAGA 102 0
TATGATTGCT CTACCTGATT TOACCGCTGG TCCTATCmA AACTGGGCTC TTATCACTTA 100 0
CAGAGAGGAT TCTCTTCTAT ACGATGAGAA OATTTATGCG CCGATGTV\TA AGCAGCGGGT 114 0
TGCTCTCGTA GTTGCACACG AGCTTTCTCA TTCićGrGGTTC GGCCAATCTGG TCACATTGAA 1200
GTGGTGGGAT GATACGTGGT 'IYACC<CAC\GG TITTGCGACA TrΓ<AT·GCCAr ATCTTCTTCAT 126 0
GGACGAAATT AGCCACAACA 1280
INFORMACJE O SEK NR 1D: 11:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 1233 par zasad TYP: kwas nukleinowy RODZAJ N1C1: podwójna TOPOLOGU: linówa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR 1D: 11:
GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AG1ATCTCCA TCTAGATGAC GTCGCAGGGG AGAACGCGGA 60
CATTGCTGAA TCTAACTCCA ATCCGTCTTA 0TGTCGCA'IY ATTTCTAGTA GCTGCTGCAG 120
TCGGCCTCTC TATTGGTCTC ACCTAATACT OTTCTCGCCA AGCGTTCGAT ACCTCAGCCTC 180
AGCCAGGGAA GGATGATACT GGTGGCCAGG AOAAGACCA 0TCTCCCTCT GCGGCGGCAC 240
TACTCCTTCC AAGTAATATA TAACCATTGT CTTACGAOTT GACGATCCAA ACATATCTAC 3 00
CTGGTTATGT o GGACTTCCCA CCGGAGCACCC ACCTCACATT CGATGGGCCT GTGGAAATAT 360
CAATGGTTGT AATTGAGCCA ACCAAGAGTA 01(317:7060A OTC/AA''!?!! ATCTCTGTCT 420
TACCCCAAGA ATGTGAACTG CTATCGGGCG AT^TmAA^CCT CGACAVΓTGlc\ AGTGTTWTG 480
AGCACGGAAG ACTGGAAAAG GKGAGTTTC OTATTCWAG CCCCCCTGGCA\. AAAGATCAAC 540
AAATCTTGGT CAAGGTCGGC TACCTeGGCC TCATTCGCCA CGGCCTTGiA OGAATCTACC <3(C0
AGACCACTTA TAGCACGGCG GATGGCACCC CTTAGATCGC TGCAGTTTCA CAAAATCAGC (5^0
GCATAGATGG TCGTGGAATG σΤΑΟΟΤΟίΟ roGATCKCC G1CCCTACGCA GGAAAGTGAA 720
GCGTTACTGT GATTCATGGA 7CCCGGCGCCGG GAATGGAATC GA.AGT’GAAGG 780
GAGATGGAGA GATCAGTGGT GAATGGATCA 0OTCGAC\.CAT CTTGACTACT CCACGGACACr 84 0
CATCCTACTT GTTGGCAGTT ATGCTTTCAG OCCC^TGCAVΓA CGTCGAAGGT GAAACAAAGA 9 00
GAGATATTGG GTTGCATATA TGGTCACCCC OCGGGGCTAA GKiGATGACA CAATATGCTC 96 0
TAGAATGTAA TATGAAATAG ATAG1CAT’CT ACCGAGATIT OCriTGATATC AGATTCCCTC 1020
TAAAAAAAGA AGATATGATT GCCCTTCCTG ATTTCTCTGC CGGTGCĆATG GAGAATTGGG 1080
ACCTGATGAC TTAGAGAAAA AACTCTTTGT TGTACGATGA CCGATT(TΛT GCACCGATAΛ 1140
ATAAAGAAGG AATTACTGAG Λ'!TGΊTGCTC 00000471(1 TCATCAGTCG T71AGCAACT 1200
TAATTAGAAT AAAATGATAA G/YrOTITCT GGTTGAATGoΆ AGG^TTT,TGrC\ AGATTCACAG 126? 0
AATTCAGTAA ΛACTAGTCAA ATAAGTGAAA ATG 1293
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 12:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
I*Ł.U<50SC: 746 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 12:
CTTGAAGAAA TGAAAAAGCT TrfTTAC/V\G GAGGTCATGA AATGTCTCCC TGCTCAGCGC\ 60
GCGACCGACT GCGCGAAGGT AACTGCTCCT CTCCGTGAAAA CTGTITTCTG CTATGGCG3TC 120
CAGGAAGGCG GTGATGAGGC ATACTACAAG GTGATGGGGC TATATATTAC GGGGACAAGTC 180
CAGTTGGAGA ATGTCAGTCT ACATGAAGCA TTGGGATGTC AT/TrGACGT TACTGCTCTA 240
ATGGGTCTTC TTATGCTGGC GKTTATCGG AATTCGTCAT TTGTGCGTCT TCAAGATGGT 300
CATGATGTGT TTAACATTGT ATCCAG/WAT CCCGTTGGAA ACG7V\CTGCT GTTCTWITTC 360
CTCACAGAGC GATAGA^GA GATAC^TGGG\ AhTTfGTCTC ATCACTTGAT 420
CGAGTGTTCT ATGCCGGGTC TCTAGGACTA εθΑΤΟΟΚΙΟΟ AACACkCTACA 480
ATGCGTGACA ATATGGACTT GCCTGCTCGC GKTACGGTG CATTTGGTGG GGCTCTAGAG 54 0
TGTTCGGATC TCTGAGTCTT ATGGATTGAG AlA\CArnTCC GlG'TACTACC AG(TATCGA’C 600
ATTTTTTCGA TGGCTTATGG CTGTMATGGC TAT(GTTC\GC AlA^iArC^G^T^A GlTGTCTCGA 660
ATCTTCCTTT ATGTTGATGG AT<GΓTCGGTGC ACTAGATATAT ATGGAGAGAT 'CΊGΓGGGGΠT 720
GGGCAGCGTG GAATGGGGCT GGTTGG 746
INFORMACJE O SEK NR ID: 13:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCH:
Dl.UGOSt 1274 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICH: podwójna
TOPOLOGIA: linńowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 13:
GΑGGGTTGTT TGGTTTTTGC TTCGGGΑGAΑ ΑhTGΑTCGΑA ArTTTA,ΓC;TA ArCCTAGTCG 60 GCTTGCGTCC GTCTGAGGTT AGATATCTAG ThCrCTCTCA ArTTAACGTG GCTACTAGAG 120 GGGAATGGTT GGAGGGGTGG AGACATTCGA AlAATTGGTA GhAATATATT TlΆGGAAAAT 180 TGGCCATGGG GTGTTAGTCT GTCGAGTTGG AhAAATGGGA AhTCGAAGTA ACCTTGCTAG 240 GCGAATGGGA CGGCGGTGGC TGGCGA'GTGA AhTCAATTCG ThGTAGGGGG Al’CGACGAAT 300 GGCGATGGAG GGGGGGATCT TTGTAGAGAA 7\lTAAGA’ATT TrAGTAAAAA AhTTAGTCGA 360 GGGCCGCTCT GAGCGATGCG AAATGTTTGT GhGATAATGT GhGAAATAAC A CTCTTAGGT 420 GGAGAGTGGG TGCTATGAAG GTACTAGAGT AhTATAATAT AhAGGATAAT TAGTAATAAT 4E^0 GATGTTGAGA GTCATATTTG ACTAAAGAGC ThGAGAATTG ArTGGAATTG Gl’GGGGCΆAT 540 TGTATGTGCG GATATATGAG TCTATTTTAT ThGGTAAAAA ThGTCAGATA AATAAACTAG 660 AGGAATATTT GΑGΑTGGΑΑG AAATCTAGAT AhGGTAGAGA ΑhGAΑΑΑΑTΑ GlTTGTTGGC 660 GAGATGATGC ATATTAGTGG AAAAGTAGTG GTTGGCTAGA ArGAATTGAG AΊ’TTTCTAGA 720 ATGGGGGATG AGAGGATTGG GTCTAGAGTG GhAACAATAA G<lAAATCTAG AlAGGTTGAG 7 80 GTTGGGGGGA GGGATGGTGG TTCTATAATA ArTTTTCTCA GhATGAGAGT AhGAAATGGT 844 AAAATGAGGG GTGAGATTTA TTGGGTAATT ArGAAAAGAA GhAGCAATGG AlCTAGCTCG 900 GGGCTTGATG GGTTGGGGTG TACTAGATGA ThAGCAAAGT GhTAAAAAAG AlAAATGGCG 960 GGGAGGGACG AGAGGTTGTG TATACTACTA AhTAGTAATG GhCATTATGT GlTTGATAGT 1020 AGACGGGGTA GCTAATCGGG TTGTGAGCCA GhTAGCGATG GhTATCGGGA AlCTACTATG 1040 GGGAGGATCG GTCAGGTTGG TGTGGTTTGG GhAAATATAT AhGATATTGG GlAAAGATAG 1140 GAGGCAGGCA TTGGGGAGGG GGACTTGCTA AhAGTAGGAA TlTGAGAGTT GhTGGCAATT 1200 ATTGGATTGC GATGGGGCGG TTGGTAGTTA GlTATAAGAA GhTTGGCTCG ThTATTTTAA 1260 ATTTTTTATT ATAT 1274
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 14:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENJII:
DŁUGOŚĆ: 6290 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
OZNACZENIE SEKWENJII: SEK NR ID: 12:
CGCCAATCCA ACCCGGATCC GTGTGCGTCT TCGCGTΛΠC· CTAGTAGCTG CTGCAGTCGG 00
CCCCCGCTCC GGTCCCTCCC Λ'ΓrTCτ'Π'CC TCGCGGAGCG TTCGATACCCI· CTGGTGAGCC 1.20
TGCGAAGCTT GGTGCCGGCG GCCAAGGCCG AGCCCAAC'CGI CCCTCTGCGG CGGGACCTGC 1.80
TCCCCCTAGC GTCGTAATGC CΆCTGTCTTC CGΛΊTTGΛA'G ATCAAAACAT GCCCGCGCGC 240
CCATGCCTTG CCCGCGCCGO GGAGGGGCCT CACATTCGAT GGGC(0CGTGG ATGGCATGGT 300
GGCCCCGATC GGCCGAGCGT TGTGCTCGGT GCTCGGCTGG AAGAAGATCT CGCCCCTTAG 00 0
CCATOAATCT GTACCGGCTT CGGGCCACGT TGAGCACGTT ATΓGcGGΛGTG TCAAGOCGCG 400
CGCTTCTCCG GAATTCOTCG GGCTCCCTCC CGGGTACCAA CTGGOOGTAGG AGCGGGGGTG 800
CCCCGCGTTG GTCGCCCGCG TCGGCCCCGT CGGCAGGAGC COŁGGAGGAA TCGCGCGACA 20 0
CTGCCAGTGC GCGCCCGGCC GCGGCCCCGG GTCGCGTGGT G'CCΓCACACAG AGCOGCGCGT 600
TCTCGGCGCC CGAGTCGCGG CGCCCGCGGG COAGGGGATG TACGCAGGCCCG A GGCCOACGO 00 0
CTGCCCGTCC GTTCGTTGTC CCTGCTGGGG CCTCCCGAGC GGOGGTCGGCGG TCGAACCOGO 720
TGCGCTCACC GGCOGCCGCC GGATCGCGCC GGGGTTGCCC ACTACTCCAC GCCGCCCGGT 780
CCTGTCGCCG GGTGTCTTGC CTCCGGGGCC TCAGCGCGTC G7OGGGTGACAG CCAGOOGGCC 84 0
TGCCGCCTCG CGGTCACGGC CGCOCCCAGA GOCCGGGAGC ATGA<AGTGGC TCCGGTCTCC 900
CCTTCCTACC TTTTCGTCTC GCCCCCGCGA ACGCCTGCCC GATΆT(TGAGT TTCCGCGCOA 960
TAAAGAGOAT ATCACGCCCG CCCGTGGCTT CCCGCCGGOG GCCATGGAGA AAGCCGCOTG 1020
CTCGTCCCAG TGCOTTTGCC GTTCCCCGCA COGCOGCAGG TΓ(CGGC2A3CCGC CGOGTOTTCT 1080
TGTOGCTACC CCCGCCGCCG CCGCCCGCGG GGCTGGCGTT CAGTG¢O[CT·G GGGOAGCTOO 114 0
TTGTTCCTTC CGCCGGCGTG GTCTGTCCTT GGTCGTGCCC TTΓGCCGGAT TCAAGGAATT 1200
CTCCCCTCGC GGCGGCTCTT GTGTAGTTGG CCCCGGAGCG AGGCCAAGCT TTCTGATTGA 126 0
TGCTGCTCTT GGCGCTCCGA GAGGTCGCTG GOTTGGGTCG AGCCATCCAC GCCCCGCTGG 1320
GTCCCTGATT GCCGGTGTGG TTGGTCTGGC CTTTGGCGGT ATCACATACG CGGAAGGAGC 1380
CCGCCTCGTC TCCACGCCGT CGGCCCCGGC CGCTCAGCTT A/AGCATGC\GG_· ATGCAGTATC 144 0
CGTGCTGGCG TGCTTGCTGC GGCTCGGCAT CCCGOGAOGG ACTGATCTAT TGGCAGTTTT 1500
GGTCCTAOCC CTCTCCGGCO TCGTGCGCCG GCTCGGCTTG CCTATACGAT ACACGGAATT 1560
CCGTACTGTC CGOTCCTCCG GGTCGCGCCC CGCAGCCTCC GCGCAOCACC OTCCTACCGC 1620
CTGCTGCCCC GATCCTTCGG GTTGTCGGCG CTTGGGCGTC GTOGGGGCOC GOTOGGACGC 1680
GTAGTTCGGC CTTGCCGGTC TCCCTCCCAT ATGGCTCTTT GACTOCCGTC TGGOGATCCC 1740
GGTCTTCGAC CTGTTTTGGG GAACATGGCT GAGAAGAGAG’ GAAGGGCTTC TGCTGCACCC 8000
TTCCTTTGGC GOCCCCGCTT TTCTGGTGAA (IG;CAGΛCCGC TATGGATTTT TTCGTCGAAA 8000
TGTTCTCCGC TTCCGCCGCT ΑΛΑ^ΑΤΑΊ CCAGCAGCTC AAGGACAATC GCOTCOC’CCT 1200
TTOTGCCCOC TCGTCOGTTG TCATCATTAG CGATGCGm’ GCTGCAGCCG CGACTGTGGC 1800
TTCCCTCCTC GTGACCCCCC TTGAACTTCT GCAGAΓATGCC GAAAAAGAAA CGCGTCTGCC 2C0 0
TCCCCCGCTT TCGOGGTCGC CCGCGATCTC TΓCGAGTTTG AAGTACTTCG CCTCCCTOCG 2000
GCTACGTTTC CCTCGTGAGC TGTACATGAT GCA\CATAGTG AAGCCGATGT TTGATTTTTC 2100
GGCCACGGTC CCCTCCTCCT ATHAC-rACAC CATCGOGGAG σΐ'ΟΤΓΠΤΟΟ ATTTCGACCC 2200
CCTTTTGCTT GCCCCCGGTT TCTCCTGCGC CCCTCGΛACG CAAGACTGCA GCGAGGTATT 2200
CAATAGACCC CCCCTCCGCC AACTCCTAGC COATGΓCCGGG GATGGTCTAr CTOGATGCCG 234 0
TCCCCCGTCT GTCOCCCCTG CiCTCCGArA GAATCCTT’CA TGTTATGGTG TCTTGCGTGC 2400
CGGCGTTCAC GCCTCGGACT AGGTGATGCG GG0CCIAACC GCCGCGGTGGC CCGCCCCTGT 2460
ATTTCTGCCC CCGGGCGTGC CAGG’ΛGGΛTG TCA(CTTACG CTTACTGCTT TGGTGGCTCT 2520
TGCGCCGGCC GCCGCGGGCT GGCGT'ί'CGTC AACCGCCAGO ATGCAGGATA TCCCGTCTGC 2500
CCCGTTGCTT GTACCTCCTG ATCCGATTCG CCOTGΛAGTC ATITTCAATT TCCCCTCCGG 2640
GGCTCGGCGT GTCATCTCCC AAAGTATAGA CTCGGAGCΛA ACATATCdTG TGTTGCTGTT 27 00
TCGTGCCCOC GCTCGGGOAT TCCGOG’CTC.G ACΛGCCGGGT GACCAGCTGA TCAATCCGGT 2760
GTTTAGCCCG ATATTTCCCC GTCCG'm’CC TGCG'GC,CGCTI CGGAC(GGGTCG GTGCGGCGGT 22^200
TAATTGCCCC GACCGGTCTT AAGG\GCAΊA’T CCCTATAATC GCGGCTnTT TCAGGATGGC 22^^0
CGGCTCCTTC CCCCATCCAC GTCGCCGTΓC GA'CCCGCTCT TTAArGCTCGC TAGGOATCTT 294 0
GTCGCAACCG GGCOCGCGCC GCOTACTG'ΓΓ CGG<OCCAAT GOA.GTHTCΆ CCCGCATGTT 3000
CCCCCACGTC CCGGCCCGCG TGAGGGGTCC GTG'ΓrGTCCC TTGAAG’ΛGTΛ AACAGACCCC 3060
AGCACCGOOT GCCAGTOACG AAGACACCACI TTGCGTCΛAT ΛGAGTTCΓί'ΛC CTCCTGTTTT 3120
CCCTCTCCCT AGCTGGTCTC ΛGAΛATTCGT TCGG’ΛTTCGT CTGTAGTCTG TTGCTCAGAA 6180
CAGCCTCCCG TGCTTGGCCC TTTGTTrGTT ΊCTCTΓΠ'CG TCCTΛGTGCT CGTTTTACAA 324 0
CCCTGCAGTC CAGTCATCCC ATACGGTACG’G GACGCTCGAA /ATGGTATGT CAAAAA 3296
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 15:
CHCRCKGERYSGYKC SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 3321 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ NJCJ: podwójna
TOPOLOGU: liniowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR JD: 24:
GΓGGCCGΓGC CCGCCCCTCC GTCTAATTTT TGCACGrTT'Γ CTAGTAGCCG CTGTACTGGG 0 0
ΓΓGΓTΓTCGG GGGΓGCCTΓG ATTACTTTAC TCCCΓCTGCG TTCGATACCT CΆCTCCΛGGC 020
CTTGCCCGCT TCGCCTTTGG GTAAAGACAA ACGCGAG~ΓCT CCCTCTGCGG CCGTCCTGCT 0 00
GΓGGΓCCCΓC CCCCTCCCCC ΟΛΆΙΠΤΟΤΤΑ CGT.TTTGACA ΑΤαΓΓΑΟΓΓ ATmCCTOG 00 0
GTCGGTTCCC GGTCTCCCTG AGAAGAATCT CACΛΊGTGAT GGCTCCTKTTCO 5GTCrTCTTC 0 00
TTGGTTCCGG TCTCCCCCCC AGAGTATCGT GTΓΓCTCTΓTCA 5T^GTTC:'Jί\'GTΓ CCCTTCTGCC 000
CΓΓGTCCGGG TCCΓGTTTCG CGGGCGITTAA ?TCACTCG7CC ATCGϊCCTATG TrCC\GGΛTGT 0 00
ΓΓΓCCGCΓGG TCCCCTTTGT ΑσΤΠσίΤΟΤ TrTGTTCC/T CTITTTTCC’T\G ATGΓC\CACTT 0 00
ΓGGGΓTCCCT TTGTCΓGCCC TCGGCCTCAT ΟνΟΤΛΟΑσΟ 5TίTGGCGGTC\ TGTTCCTCGC 00 0
ΓCΓGGCCCΓC CTTCCTGCTG GCACCCCCAA GAACCCTACA GTGTCA(:TGG\ ATGTCGCCTT 0 00
CGCTGCTCGG ΓTTCTTTTGΓ CATGCATGGA ^GTTCGCCGTGCC ΎΛΟΤ^^^σΑ ATG’GTACCTT 00 0
GCΓGTTΓCGG ΓCGCΓTCCCG GTACAAAAGC ΟΟΤΟΤΤΟΑΤ GGCATCGTA\A Cr^^A^r^C^T^^;^ 0 00
TGGCTCTCGC CGGGTGGCGG GGATTACGTC ΟΟΛΟΤηΤ ACTACTCCGA GGTTGTGΓCC 700
ΓΆΓηΤηΤ GΓCTTGCGGT TATCAGAATT TGTC,TGTGTC GT^GG(:T^rTTTG CTCCCTCTCT 00 0
TGGGΓGTTGC ΓTGCTCTTGG CACGCCCAGA COCΓCCGTC\G ATGACΓCGG\C ΤΊΊΤΤΠΊΤΛ 0 00
TTCTGTGCGC CCCTGΓCGCT AGTTCTACGA AGATTGΊTGGΓ GϊCl^rC]^<ΓPC^TT TGCCCTTGCC 000
TCCCΓCCTCT CGTCTCGTCT ΤΤΟσΤΟΑΤΊΤ CTCAATTAGA GCCATGGAGA A^GGGTTrT' 0000
GCGΓCΓGGCC CGTGCCCCCΤ σΤΠαΤΓσϊΑ CGATGAiTGA TTCTATGCAC CCTGTTCG'GA 0000
CCCGΓGCCTG GΓGTTCCTGT TTGCTCATGA G<TTGT:ΓTTCr CAGTGGTTTG GGΓTCTTTGT 200 0
GCCGCTGCCG GTTGTTTCGC ATCTGTTTTT GϊT'ΓGTTCGT TrrtTTArGAT TTTCTCTCCG 0000
ΓCGGTGCTΓG TTGCCGCTCC CTGAAGATGA CTTCTATATG AGGAACTACr TCCCrTCGTA 0200
GGTCΤrTGCC CTCTCGGGTC AAGCTGATTC CTT'TGTΓTCΛ Af^C^CT^T^I^IT^C TTTGCTGGTC 3300
CCTCGCΓCCC GTGTTCGCCT TTGAAGAAGC GϊGGGTTGAT ATCACTiTACG CTTCCCTTCG 3000
GGΓGTGGTGG CTTCGTTGGC GAGCGTTGAT CCT^T^^T^^T^ 5CCCC7CKGTGC ACTGTTTGCT 0400
GΓCTGCTTGT CCTCCTGGΓG CGTATAGCAA TGCTCϊTCCG ACTGATCTAT GTGGTCϊGΓr' 4000
TGCGTCCGTG GTTCΓGTCTT TCGAGGGTCC T^C^T^t^C^T^T^T^ CCTATGTCTCC CΓTCTTTCCT 400 0
TGTCCTTTCG TTTCCCCCTC AGATGGGCTT TGCTCTGCCT TCTCTGGCAG ACϊTGGCCTG 0000
GCΓGCΓGCTT CCTCGCCTGT AAAGTCGATA TGTCTGCTTT 5r\GGACG<:TG ^G’TACTCCCT 0000
TCCCGCTTTT ΓCGCCGCCCT ACGGATTCAA CTGGGTTACT CCTdTGTGGT ACrTCTTCCT 8000
CGCGCCGCCT GCTTTCCCGT GAGCATGGTT AACϊC\CTCGT GTT.CCGCΓΓTT ACCTTTTCGT 0000
TCGTGCTCΓG TTTTCGCTCT TTGTGGTGO TC^T^T^^T^^C^T^C TATGGATTrr ACTTTCTCCC 0000
CCCΓGCCCΓT CCTGGGGTTC AAAAGATAAT (TU^^^^TT^C 5’C^GGATAATC AGGTCTϊTGG 1020
ΓCTTΓΓCCGG CTCCGGCCGT CCATCATTAG CCTCGGTTT·r CTCTGCGGCTG CTCCTGTCΓG 1000
TCGTTCGGCC TCTCCGGGCG TCGAACTTCT GTGTTGTGCC GϊCCCCGϊCCC CTTGCCTCΓT 200 0
CΓCGTTTTCC CGCTCCCGTG CTGGAATCTC TGGΓTTGGGG 5CTGTACT“ΓCG GTTCCCGCTT 2000
CGCGTΓCCCG CTCTΓGΓTCC CATACATGAT GTACTTGTGG ,Γ^ΟσΑΤΟΤ AGGTCACCAC 2000
ΓTCTCGΓTCΓ AAAACTACAA GTTCCTCTTC 5ΤΓΤΤ 5\CCCGTCCCT 2000
ΓΓCCCCCGCT GTTCGGGCGC TGTTCTGCGC CΓΓTGTTCGG CΓTGACΓΓGCA GTGCCTCCCG 2200
TCCCCCCΓGG GGTGTGGCTC AAGTCATGGC GTCCCGTTCT GATGGC<TCC3 CTCTTCCΓCA 2.30 0
CTTΓGGGCCC CTCTCGGATC ACGTGTGG'GT ΤσϊΆΤΟίΤΌ TGTCCTTCCT 24 00
CGGTTCTGCG TCTGGCTCCC AGGTGATGGA GGTGGTTGCG GCCGϊCC\CTC TGCTCCTTCT 7140 0
CCCCTCΓGGΓ ΓGCTGCΓGCT CATTACGATG TTTCTCCCTC GTTACCGCTT TGTCCCTTCT 71500
GΓGΓΓGTCGT GΓGΓGTTCΓC ΟΟΛΑΠΟσΤΑ CTTGGTG.CTTι GACCACC-IATA TGΓΓCCCGGT 02500
GTTΓCCCTCG TGCTΓCTTCC ATCCTATTGG CCTCCΛTT^GC ATΓrTCΓTTT TGCTGGCTGT 264 0
GCTCGTGCCC GCGCTCTGGG AAAGTATAGG ACCΓTCCCTC ACTTATGTTA ACCCCCTGTC 2700
CCΓCTΓGGGΓ CCGGΓCGGCC TCCGCTCAGA ACTACTCTTG’ GACCAGCTGA ACTCCGTTGT 2760
TCCCCCTGTΓ CTCCCCTΓGT G'ϊC/CGTlTGG TTGTTGGCT'C ACC\CCGATCG 5\ACCTCTTCT 2820
CCCGCTGTTG GCGGTTCTGC AAAAACATTC CCTACCCΊTG GCGGCTTTCT TGTCCTCCCG 708 00
ΓCCΓGGTTCC GGTTTCTGCC ATGACCATGA A'ΓGCTCTTCT TTCCACTCAC TGCCTTCCGT 294 0
TTTTTCCΓGG CCTTTΓGTTG GCTTACTCn’ CCTC'ΓGTCCG GΛCG'ΓIGTTT CCCCCGCCCC 3000
GGTGGCCCCG TCTCTTCCTG TGAGGGGTCA TrGACTrC;ΓG ACCCCCCGCG 3060
CGGCrGGGCC ΓTCGTGCTCC ATATTACTTT CΓGTTCTTCC 551ATTGϊT·GCC TTGTGCGCGC 33100
ΓΓGΓTTΓΓGC CCGGCCGGCC CACATTTGTT CTCGCTGTϊG TG7ACTIT'Gϊ' TGGCGTCGCC 33100
CGCTCGΓTGG TCGTCTGTTC TTCTrTTCAT TCTATTATTC GTGTTGCTCC 3 24 0
GTTCGCGCGG CGTTCTCTGC TAAATATTGA 7GTC7ΛCCGΛ ΛAACTC\Cτ''Cc\ 3CCCCCCCCC 33 00 CCCCCCCCCC CCCCCCCCC 33 21
175 900
INFORMACJE O- SEK NR ID: 16:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCII:
DŁ UGOŚĆ: 30 aminokwasów
TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENCII: SEK NR ID: 16:
Asp 1 Acn Ser Spo SeP 5 ola Alu Glu uru Geu 10 Leu ure TPr Asn ol e 15
Lys Pro Val Ser Tyr Asp Leu Lys Ile Ala Thr Tyr Leu Pro Gly
20 25 30
INFORMACIE O SEK NR ID: 17:
CHARAKTERYSTYKA SEJWmi:
DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów
TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENCII: SEK NR ID: 17:
Leu Tyr Leu Ala Glu Asp Val Gin Leu Xaa Lys Gly Ile Leu Phe 15 10 15
INFORMACIE O SEK NR ID: 14:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCII:
DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów
TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 14:
Leu Ala Tyr Asp Glu Lys Sps Tyr Ala Pro Asp Asn Lys Gin Tyr 15 H 15
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 19:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 3044 pas zasad TYP: kwas nukleinowy RODZC NICI: podwójna TOPOLOGIA: Hoiowu
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 10:
GGGGGAAGGA ΑCΑTAGGGTG AGATGACAGC AGAGGAGAGT CAGGAGCAGG AGACGCAGCA 6 0
TAAACGAATA ATGAAAGTUA TACGGCTCAC CCCCATCCAG TCTCTA'CG'GU CTTTGTTAGT 120
GGGAUCGUCG GACGTAGUAC TCTCAATCGG TCTCACCTAT TΛOΓC'TΛCAA ΟΟΑΑΑσΟΓΤΤ 180
GGTTACTACT UGCGGATTTG GAAAGGGGA TCCACCTATT GTCGA7GATA ATTCCCCATC 2.4 0
TGAGGATGAT TGAΑGGΑGCΑ CAACAACCAT AAAACCTTTG AAATAAGTC'G TAGTAATCAA 300
AAAUGTGAGU ACATTAGATG TTAACTATCC ACCTCAG/AA GΛT'GGCGCΊΆ T7GATGGGAC 36 O
GGGUGGGAGG GAGTGGGAAG TrGTGGAGCC rACCAAGTCT ATTGTGCTCA ACTCGAAAAA 420
GTGGCCGGGA ATGGATGACA AGTGCGAACT ΊUGGG^<CΓCA^C ΑΑΑCTΑ.A.ATC TCGACATCGO 4 40
AAAUUTGUGU UATAAGACAT GGCTGGAGaAA AGTCGGACITC GGGGTGATGT AAAAGCTGGA 54 0
GAAGAAGCTU ΑTTTGΑTΑUΑ TCAAGATTGT fAmCAeGGC CTTATCAACG ACATGCTTGG 600
TGGACGGGAT AGATATTAAG ACACGGATiAA AGATGGTACA ACCAAGATTG CTGCATGCAC 660
GCTGAGUUAT ACUTCGGAAG CCCGTCTTAT lXGrCCCCT(Gr TTCGACGAGC CGAC¢UGΓTAA 720
GGAAATCGGG ACTGGGACTG TGATTCATCC GAAGGGCACC AGTGCCGTGT CGAATGGAAT 7 40
TGATAAUGGA GAAGGAGAAG TCTCTGGCGA TTGGGTCACA ACCAGATTCG ATCCAACCCC 440
GAGATGGAAT TAUGTTGGGT TrGCTCTTGT GATrTCCG/A TTTAAGTACA TTGAAAATTA 000
GTAGAATTUC UGGGGGΑGΑG TCCGArATTCC GGCTCCTCCG GAAGCTATGA AGJA^Gj^t^AGA 06 0
TGTTGACTGG AGAGAGGGTT TCATAArG’GGΓ «UA'jGΓACTAT GAGGACTTCT TCGGGATCAA 1020
TTGCCAACGG CCTATAAATG ATATGGTIGC TCTTCCTGAC TTCTCATCTG GTGCTATGGA 1040
GAACTGGUGT AGAAGATATG ACAGGGAGGG ITCCGTGCTC TACGATGAA ACCTCTACGG 1.14 0
AAAAAGGAAT ΑTGGTGΑGUG 'T.rGCAGAAGT GATCGCGCAC GAACTTGCAC ATCΛGTGG,Gr 1200
AGGGATTGGU GGAAAGTGGA AGTGGTGGGA TAACCTATGG CTGAACGAAG GA^CGCGTC 126 0
TTGCUGUUAA GTAAGAGGAG CCGACTTCAT CAGCGATGGT CTATGGGAAA TG/AA\GAT’Tr 1320
AGGCAGGCGG GAAACGGTAA CAAGTGGTAT TACGGCTGAT GCAGTAGCTT CAAGCGATCC 13 80
GAGGGAATGC TGAAGTGTTT AGGCT^GICAGA ΤυΤΑΤΟ^/Λ GCGTTCGATG ArlTrCACjACT 144 0
AAGGAATUUA GAAGACGGTA TrGAAATGCT ATTGAATTTA GTTGGGGACG AAAATTrCAA 1500
GATGGAGUTG TAUAGGGTCA TCATAUT\<GGΓ TTCA7ATGAT AATGCGGCTG 156 0
TGUGUAAUAA GGCGTAGTTA CCGTCCAAGG TATAACCGGA CCTTC\TGGTG «ΑΟΟΑΤΤαΛΑ 1620
AAGUGCAGAU GGGGCUAAAA /A\T<UUA<CA\C TCAGATGGGG TTCCCTGTTC TrACTGTCGA 1640
GGAUUTGATA UAAAAGTAGG TGAŻAAGTCAC CCAATAA\CGA 7ACAGGCAGA ACAAGGATGC 174 0
TTAUGAACAT UTGATGGACA GTCATCCAAC TrATGGOlTC AAATGGGATG TTCCTCTGTG 1400
GGTGAAGUAT GTGGTTCTGA 1A\GTGUTAA\G ΊT\\CΓΓCUνΓΓA AAAAGAGAGG lAACCGCTCTA .146 0
GGGCATGGTA AGAATTGAGG ATTCGTCAGT TGTGUuΓGUA\T GCCGAACGTC GTGCTTTrTG 1020
AAGTTAAATC GTTGTAGAGT ACGOrTGGAG GUA\(CΆTATG AGAAGACTGA AGCAGAATCA 1340
GAAUGTAGAT UGGAAAAGAA CAA\G<AA\CGC TCTCATt^AGT GATGCGTGTG CAGCAGCTGC 204 0
TGGGUAGUAA ATUATTGTCG AGACCGTATT TGAAATCCTC ΑΆΑΤΛΓΑ€θα TGAAAGAAGA 21(^0
GGTGGACTGA CAAGGGTTUG AGGCAA7ATC AGGATTCAAT ACCAAIT^T(GC ΛCT·GG^’CGG 2160
ATGCGATACA UATGCGATTT GGGCTTCGGA ATACATGCGA AAACTGATGA AGCCAATTTG 2220
GGTCTAGAGG AUAAGAAAGT TTATAGCGGA GAλCTACACA AAAGATPCGC ΤΤΤΠΤΓΤΌΆ 2280
ATATATGCGC CATAGTGAGU TTATTGACAC ATACTGAOGT CTTGGAGGCA ·A\G\G\TGTCT 234 0
GGATGTATGU ATATTGΑGGG TTGACAAGGA GGTCATGAAA TGTCAACCTG GTCΑGCUΑΑC 24 00
GTCΑGΑCGUΑ UGTAAGUGAA CCΓC^(A1GAT^<AI’ CCGUAA.\U\CT GTTrACTGCT ATGGGGTCCA 2460
GGAAGGAUUT UATUAGGAAT TCGACCAAGGT GATGGAACTA TATCATGCGG IWCAAGTGCA 2520
GGTUGAUAAT UACAGGAGAA GTGAAGCATT hGGATGCGAT AAAGACGTTA CAGCTCTCTA 2540
GGGACGGATG ATGCTGGCTT TGGATCGG7A TrTGTCAT.rT GTGCGTCTTC lA\OA\'GC·ΓeΛ 2640
GGAGGTGGGT ATCTTGGGAG CCAGAzAArCC TGΊGGGUAAC ΙΟΑΛΟΤΟσΓΟΤ TCAATTΓCCT 27 00
CACAGAGCGA GGGUATUTUA TΛCΊG’GUA\ΛG 771070«'™ CGACACAGAT CAGTTGATCG 2270
TGTUAGAAAT UCAGUGAAGC GAGGACTACG ATCCAGaSAG C/ACTAC/AC AGTΓGCAG\A 242.0
GCGAGAAATA AAGUAAAAUC GTGCTCGCGA ATACGG7GCA TTTGGTGGCG CAATAGAAAG 2^14^0
TTCUGATCAC AUAGGΑATΑT GGATTGAGAA ACATTTCCGA AAACTAGCAG C'ΓΓΓCTΓCGA’\ 2.94 0
AAAATCTAAT GCATATTGCT GAAATGGCTA TAACTAGCAC AGTGGATAG7 TGTCrCG/AT 3300
AATCAATATA UAGTAATGAG σlGGTGGGG^C ΊΆΟΑΤΑΤΑΤ GGΛGΛΎΑTI'C TCTUGA7\G'G 3 30 0
GAATAGAGTA AAUTUGAGUT AT^’G 3044
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 20:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCH:
DLUTOŚĆ: 3350 par zasad
CYF: kwas nukleinowy
RODZAJ NICI: podwójna
TOPOLOGIA: Umowa
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 00:
GGTTTAATTA AGAAAATTTA AGATGACGGC CTTGTGGCAG AAGCGTCGAA TCATGGGCTT 6 0
CCCAACCAGA AACAAACTTT GTACATTGTT TGTAATAGTCr GCTGCCGTTG GACTCTCCAT 120
CGAACATACA TTTAACATCA CTCGTTTAGC AATCGATACC ACACAAAAAG AACAGAAGGA 180
GAAAAAAGAA GTAAACTAAA AGGATATAAT TCCGATTGCA GAAGAACTAC TTCTTCCAAC 24 0
GCAGATAAAA GCAATCACAT ACGATTATTT ACACCAACCA TiGlAGry^CGGCGCT GTTACGTGAA 3 00
GGTAACACCA AAAAAAAATA TCACAGATGA TGCCGGCGTG GAGATTCTATA TGTCTTGTGGA 360
GAAAAATACA AACATAACTA TGTTGAACTC GTAATAAAAC ACTTTGGCAC (AAATAGGATG 420
CGAAAAACCC AAAATTAACA ACCTTATAGA CATGGTTTGT’ CACAAAGATGC ACTTATCGACT 4 80
GAAGAAGCCA AAAATTACCA TCTCTgATGCA GCTTCGGAAC GATCTGTAATC TCCTGCTCCAC 540
GACATCTTAG AACATCATTT TTACCGACAC TCTCCGTTGGG (ATCTACCAGT CCATCTACAC 6 00
GAATAAGACG AAAAATAGTA AGATCGTGGC TGTGCTACCA cAGTGAACCAT CAGACGCTCG 660
GGGAACAAGA AAACTAACTA ACGAACCGGT ATTCCTC1ACA ACGATGGACTG TCTCCGTCGT 720
GAAAAGCAAA GAAAGAAAGT CTGCTTCGGA CAGCGGTCCA GCCTACTGGTAA (AATGGGAGCT 7 80
CACAGATAAA CATAACAAGA CTCTATCCAT TT.CTACCCCG CCGATCCTCGT CA^ITMTAATT 840
CACAATTAGA ATTTTCAAAT TTGTTTATTT TCGACTTATT AACAAAAACGG GCTTTCGGTT 9 00
GAAAATATCA TATACAAAAT AGGCGGTAAA CTAGAAACAA TACGTGTTrGG ATGCTGGCAT 960
CAAATACCGT GATTACAACA AGACATTTTT TTTCAATCAT TACCCTCTGG (AATTACCCATA 10^^0
GACAACTAGA ATAAAAGAGA TCCGTGGTAC CCGCAAGACA CTCTGGGGCC TTATTGTCTA 1180
TAGATAAAAT TAAAACCAAC ACTATCTATA CCCCTATCAG CCGAACAACA GACAGCAAGT 1110
TACTATCATA AAAGAAGACA AGCAATCTGT ’rTCCT'CATTG ACCCTTCTGG TCGCACTTTT 1100
GTGAAGAGAT AAATGATATT TGTACGATCC TATTTAGACG TTTT3TTGACT AACGTGCCAA 11.00
GAACTAAACA ATAAAAAACA ATACTTCATC CACCCTAATG TTCCTGCTCG ATGGTAACGA 1120
CAAAAAAACA TATAAAGTCC CGGCTCCTAA ATAGCGAGCA CAATCCTTCAT GGATTGACCA 1130
AGATTCAAAA ATAGGAGAAG CCGGTTCCCG ATCTTCGACA ACCcTGGGGG CGTGGACTCT 1110
GACATTACTA AATACTTAGA TATTAGAGCG ACACCTCGAT TAATGCTGTCT· TGCGTTACCC 1100
CAATAAACAA TCCAAAAGCA ATCCTCAACC ACCCCCATAC 'CGGTCCCGTTC TCATAGCTAC’ 1100
CATAAAAGGT TTAAATTTCC CTGGGTCCCC CAGGGACAAA ATCGACCAAA AAACAATACG 1120
GCGAACGAAT AACATCATTA ATGGTGTGGT TTAATCTAGAA GAATATAATG CAAAAAAGGT 1080
AACATCAAGA CAAAAACTTT ACAAGACAAA TTAATTACGCC TTGGAACCAG AAAAATATAA 7700
GAATACAAAA TAAATACACA AGTGGGATGT TCCCCTATGG TATCAGGTTG AAAATATCAA 0000
AAAAGTAAAG CGTACATTTT AAAAAAGAGA TGTT3CCGCTG TACTTGTAACG TGCAAAACCA 0600
GGATAAATCA CGACTGCTGA AGGCTGATCG ACATGGATT TATCGACCAAA ACTACAACTC 1000
GAAATACCAT AAAAA AT ATA TCAAGCAGCT CCATTCTAGAT CACAAGCTCT CGATTAAAAA 90 00
GACAAAAAAA GTCTACCTAA GCGATGOCTT 'ATCTGCCCGCT ACGAITGACG CAATAAACAA 070 0
TAAAACTGTA TTCCTACCAC TTGAATATGC (AACAACTGTCC GAGGTACTTCT CAAACAAAAA 1000
TGAAACTCTG TGACACGACT TGGGAGTTTT (CACTTCTTC GGTTCCTGAGC CGTAAAAAAA H00
ACCAAATAAA GAGTTCCATG TGAGCATATT AGTCCCCGATG TATTCCTTTCTA AGAGAATTGA 0000
TCACACCATC AAATAATATT TGGATGAAAC (TTATTCACA TATATTATCTA CTCAAAAGAA 2200
GAGGACAGAT GGGATTTGTC CCCTTGGATC (CACGGACTGT ATTATCGOCCT ATAAGGATAT 230 0
GTTATACGAT GACAAACCCG CCiACCTGTJTA (TTCCGGTATTTA GCAGCCAACCA AATGAGTTAT 24 00
GACATACGCA CCTCTACGTC CCCAATCTAITA CTGTTATGGT GTACAGGAAG ACATCGAAAA 246 0
AGCTATAAAA AAACAATACG' GGCTGTATCT AGCAGTAAIAT (ΤΑΑΑΑΑΑΑΤΤ AAAAGGGTAT 2520
CCTTATAAAA GGCCTCAGAT GCCAOGAAGA TGTTACAGCT CTTAAAAAAC CTCACTTGCT 2500
AGCAATGGAC CGTTTATTAA CCTTTTGTGCG TCTTCGAGAT GACCCTACCG CTTTCCGTGA 2610
TACACCTGAA AACCGACATG GCGTTAGTTTTi’ CGAGTTCGGAT TTCCTTCTGG AGAGATGGGA 27 00
GGAAACAAGA GCGCCCCTCG (CAAACAGTTGCA CAGAGAAGTT GATAAAGTGG TAGGCGCTTG 276 0
CCGCACCGAA ATACCATCAG AACAACCGAAT AGATCAGCTG AAGTCCTCTTC AGAA(.ATG<CAG 2820
TGCAAAAGCT AACCAATTCC GGTCATTCAC CCAGGTATATC GTATAGaGGAG AACATAAAAT 2880
TGCCTAGACC AAACAAGCTT TTCACAGATT AACGAGAATC TrCACTATAG AAAGATCATA 294 0
GCTATACACA CAGTGCATAA ATGTT/CCCGT CTCCGAACTA GGAGACAAAT ttgctgaaaa 300 0 gggagcctca ccagttccgt 'tcg^.a'aciggzc tccattccta tctgaccaac AATACCATTT 306 0
CAAGTACCCT TCAATCATCT TGATTACTGA ATATCGTAAT TCTGATGCTT CCTGTATCTT 3120
GCACACAACG ATTGGTGACT TTC''''''''-!''.’’ AGGGCTCACT CAGGATCGTT TAGCTGTCAT .'3.180
GCGATGAAGG TTAATCCCGC CAATTACCAG CGGTTGGATCT TGCCCCCAArT CATTGCAAAC 324 0
TGGGACGCGC TTCACCGCTG AfCAATTGTGOCAA GAATTTTTAT TTTGTCTGCT ATCCAAGAAA 33 00
GGGTGTCGAT CCGGGGTTGA TTGTCCTATTG CCGTYCCGTCT.T AAATGTCTGC (TAAGGTGT 3 3 ii 8
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 21:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 3369 par zasad
TYP: kwas nukleinowy
RODZAJ N1C1: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
OZNACZENIE SEKWENeil: SEK NR 1D: 21:
GGTTTAATTA CCGAAATTTA ACGGTCTCCA TCTAGTTAGG GTCGCACGGC GGGACGCAAA 60
GATTGGTAAA TGTAACTGCA ATCCGTCTTA rΓTATGACTCT ATTTCTAGTA ACTACT’GCGG 110
TGAACGTCTG TATTAATGTC ACfT^;V.rTT^^C'r TTACTCGCAA AGCGTTCGAT GCCTCTGGGG 110
AGGGAAAAAA AAGCAGTGCT AGTGGGAAAA ACAAAGACAA TTCTCCCTCT GCGGCGGATC 24 0
CTGTGCTCGG AGACGTCGTG GAGGCTCTAT CTTACGACTT GACGATCAAA ACATATCTAC 0 00
CTAATTATGT AAACTTCGGA CGAAAAAAAA ACCTCACATT CGATGGGCGT GTGG1GA\TCT 600
GAATGGTTAT GACCATAGCG ACAAAGAGTA TCCTACTCAA ΓCΓ(GTG^GAAG ATCTCTGTTA 2 00
TACGGGAAAA ACACAGAGCA ATATCGAGGA ATAAAAOCT CGCGCΛ'TΓGAA AATGT7GTGA 8 00
AACACCCAAA AGCA1GTTAA ATTGAGTTTC TTAT(TGGAGG CCOCTGGAA AAAGA'ΓCGAC 20 0
ATACCTTAGC CGTAACCAGG TAGATGGGTC TCT^'T<TJYGC.i^ CAGCTTTGGT GA1TTCTCGC 600
AGACCACTTA TAGGGCCGCA GATGAGAGGC CTAAGATCGC TGCAGTTTCA CGAATGTAGC 600
GCATAAATAG TGATGAAATA ATAGCATACA ΊΌΟΑΤσΟΟΑ GCCGCTACCGAC GAGAACCTAA 700
CCATTACTAT GATTGATGCA AAAGAGAGGA AAGCCGTCTC GcTTΓGGCTCTC GAAGAGGACG 700
AAGATGAAAA AGCGGATAAC AATTGAATGA σΑ^ΟΛΑ^ (CTTGACTACT CGGCGAATTT 20 0
CATCCTACTT ATTAAGAATT ATGATTTCAA ΑΑΤΠΌΟΤΑ CATCGCTCGGT GGATGGAATA 0 00
GGAGTATTGA GCCGGATGTT TAATCAGAGC GAGACCGO/A σΑΑσΑΤσΑ<^ CGATCTCGTT 900
TACAATCTGG CTCGGGACAG ATAGAATTCT ACGAAGATTr CTTTGATATC AGGTTCCCTC 0200
CATAGTATGA TAGCGTAATT GCGGTCGGCA ATΊ'Γ<CI’CCΓGC CGGTGCCATG GATATTCCAG 0800
GCCCCTTCTC TTGGGAAATA ATCCCCCCAT TGTACGATGA ΟΑΑΤΤΟΓΑΤ GCGGCCATTA 1200
TCTTTCAGGA TACCACTGGC TCCACCAGCG ATGAGCTTGC TCATCAGTGG TCCCAAGACG 2000
CAGCCTGAAT AGTACAATGA GTTGTCC’CAT ΟΟΤ^\^ΑΑΤ<3Α ΑΟΟΤΓΤίΆΟΑ AGAGTCATGT 2600
AGTCCTCCAA AAGCAGTGTA ATGTGCCGTA ATGACGCCAG CACTGAGGCACC TTTGTCGTGA 3200
CCGTTACTGC CAGAGAGACC CCGTAAAGCA ATTCGdTAGC ΟΤΟΤΆσΟΛΤ CGGGCCCCCT 38 00
CGAAGTCGGT GGTTACCACA GGTGTTATTA AAGCCTTrGA TGATATCCACA TCTGACGTGT 2200
ATGCCCGCGT CGTTGCTGCG CCGGAGACGC TGATTGGAGA AGCTGTTCAT AATGGTTAGT 1000
CGTGACAATA GCTCGTGGAA TTGCCGCTCT σΰΟΤΟΟΑσΑ AGCGACTGAT CTCATAAAGT 1600
CCCCCATCAA GGCTACGGCC AAGACGAATA GTCCAGACGG CGGTCCCTATG OTTTGGGGGA 6200
TGCT,CGCGTA CGTACAATCA ACCGAGGCAA GOTCCCAGT TATTTCCGTA GAGTGTACC’C 68 00
AGCGATCCAC CTCAGATCCA ACAGGATGTG GATATGAGGC GCACTCGAT3AC GCTCGCGATA 7700
TAAAGTTGCA CGATGTGCGA GATCAGAAAT TTTCGCTGGGA TATrCCACTl TCGACTTGAA 860O
TAAACGACGG GTGAAAAGTA GTGGATTGTC GGTrGAGAAG AGATGOCCG CGCTCGGCTA 8600
GCGTCTACGA CACCA1GAGC CCGTCCATAA τGACGAGA CCGCTATGGA TTTCCTTGAC 1200
GAAATCTTAA CAGCGTCAAT TAAGTAATAT ΤΟΤΑΟΟΑΑ GCTCOGGAT ATTCGTTAGG 99 00
TCTAGGATGG CGA1GGAAAG GGTGTGTTGT 'TTAGCGATGC GTTTGCTGCG GCTCAGACTT 2200
AGGGGTTTAA GTTCATAGGC ACACTTATGC TTCrGOTrA TGC'CGCTAAAC GATAGCGATT 2000
GCGCACCACC TAGGACCAGT ACATCGAAAA ' TCTCTTCGAT ^TC'G1TGGΓAC TCCGGGCGGC 2600
TACCAGAAAG AGTAGCTAGC GTTGGACAGA TGATGAACAT ATΓGCGTAGCG AGCACTCGGA 2200
GAAACTATAT CAGGCCGGCC AGCTACGAGT ACAGCACCTGA CAAGCTGTTr TCCGGTGTCG 2200
TGGCGCGATG TAACACCTTT ATCTCGCCGC GCGCCCTCGG ATCGCCAGAC TCAGGGATTG 2340
ATTTTAAAGG TCCCCCGAGC ATCGGTACGA TG7ATCGTGCG CAGGGATCGT CGTGGGTGGA 24 00
GGAGGCGGAT ATAGACGAGC ACCCCCCCCG GATCAAGT<3Tr ΊC,ACTGTΓΛT GAATGCAAGA 2460
TAAACGGCAT TTGCAGTCGC ATCATGATAG TGGAGCTTTA TACOUCGO AGGCTCGAGC 2520
CAAAAGATGT CTTGGCTGAC GCAGGTCCAA GATGTCΛTTTC AGATGTΊ'C.GG OAGCCCGTTG 2500
ATCCCCCGCC AGAAAGCGCA AACTAGTTCC CGTCGTTCGT ACGTATGCAG GAGCTCCCGT 264 0
ATAGTTTGTG GATCACTAGT ACGATCGGCG TTGGCGAAGA ATTCATITTC O\AGTCTCTCC 2700
CCATGTATTG ACGTAGCTCG GTCGTATGCG TAGOMCGM GCGGGCΛTTC’ GGCTAGAGTG 276 0
CGTCTGCTAG GCAGGGTTCA AAGTCCCAGC CACOCAGCA GATTGACCAG CTTAGGAGTC 2820
CACTGGAATG TAAGGCGATG AGCCACCTAT TCGCTGCATT CGAGCATGCA ATCGAAGGGG 2880
CAGGAAGCAA AATAAGTTGG TCCGAATAGG ATrΓC<3GGGTC ArΓCGCGGCT OTCGCCGTTG 294 0
TTAGGTCGTT ACGACCGAGA CCTCGTCAGG AGTOTCCAG ATCTT7TCGT TCGTTAGTGA 3000
TTTTATCGGA AGTGCATGCG CCCATCAACG ACTGTTCCAC TGAGTGC1TG TCCTCCGCGT 306 0
GGAAATCCCC CGCGACTGCG TTTAGCTC,CC GTGC,GGGGTC G''JT·CTTCTCG 0GCCGTTTGG 31120
TTTCATTAGC CGACGTTAAC GGGCATGAGG CAΛTGTTTCT CC'CGCG7CΛ'Γ CGTGGTCTTC 3180
CGCCGCGCTC GGGGCGTCGG CTTCCAAACC 1GGΛA.AΊT7'G TTCΛTΛTTCG TTCCGCGGCC 324 0
GCCAGCCGGT TGGGCCCGCG GTGTATAACT ΤσοσΤΠΌΤ TTTCTTC,ΓΓG AGCTACGCCA 3300
CCACTTTGGG TCTACGCGAG CCTATTTTGC TATAAATATT GATGGTTΛGA OKTTAATTAAT 336 0
GAGGGAAAT 333^9
175 900
INFORMACJE O SEK NR ID: 22:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 977 aminokwasów TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 11:
Met Thr Ala Glu Glu Ser Gln Glu Gln Glu T1p Gln Gin Pro Arg
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Leu Arg Leu TTii Pro Ile Lys Ser Leu Phe Ala
20 25 30
Leu Leu Val Val Ala Ala Alu Val Gly Leu Ser Ile Gly Leu Thr
35 40 48!
Tyr Tyr Phe ΤΤιγ Arg Lys Ala Phe Asp Thr Thr Gly Gly Asn Gly
50 55 60
Lys Cly Acp Gln Pro Ile Val Asp Asp Asn Ser Pro Ser Ala Glu
65 70 75
Clu Leu Arg Leu Pro Thr Thr Ile Ly s Pro Leu Thr Tyr Asp Leu
80 85 90
Vv1 Ile Lys Thr Tyr Leu Pro Asn TTr Val Asn Tyr Pro Pro Glu
95 100 105
Lys Asp Phe Ala Ile Asp Gly Thr Vv1 Val Jlh Ala Met Glu Val
110 115 120
Vv1 Clu Pro TTi Le s See Ile Val Leu Asn Stp Les Asn IIa-; Pro
125 130 U5
Vv1 Ile Ala Asp Gln CTs Glu Leu PPe See Asn Asn Gln Lls Leu
140 114 150
Asp Ile Glu Lys Val Val Asp Gln Pro Arg Leu (Ulu Lys Val Glu
155 160 115
Phe Val Leu Lys Lys Lys Leu Glu Lys Asn Gln Lys Ile Thr Leu
17 0 165 180
Lys Ile Val Typ Ile Gly Leu Ile Asn Asp Met Leu Gly Gly Leu
185 DO 195
Typ Arg Thr TCn Tyr Thi Asp Lys Asp Cly Thr Thr Lys IIe Ala
200 505 210
Ala Cys Thh His Met Glu Pro Thr Asp Ala Arg Leu Met Vv1 Pro
215 020 225
Tys Phe Asp> Glu Pro Thi Phe Lys Ala Asn Tpp Thr Val Thr Vv1
23 0 535 240
Ile His Pro Lys Gly Thr Ser Ala Val Ser Asn Gly Ile Glu Lls
24 5 060 225
Cly Glu Gly Glu Va 1 Ser Gly Asp Trp Val Thr Thr Apg Phe Asp
26 0 565 22 0
Pro The P/o Apg Met Pro Sei Tyr Leu Jlh Ala Leu Val IIu: S(^^
27 5 080 22^
Clu Phe Le £5 Typ Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Ser Cly Val Acg Phe
29 0 265 300
Apg Ile P/o Ala Arg Pro Glu Ala Mht Lys Mht Thr Glu Ttl Ala
305 :060 331
Met Ile Alu Gly Ile Lys Cys Leu Asp Typ Typ Glu Asp PPh PPe
320 325 330
Cly Hi Lll Phe Pro Leu Pro Lys Gln Asp Met Val Ala Len P/P
335 340 334
Asp Phe eee Ser Gly Ala Mht Glu Asn Trp Gly Lnu Jlh TTi T<l
350 365 330
Apg Glu GCu Ser Val Leu Ty i Asp Glu Asn Leu Tyr Cly Per Cet
365 37 0 335
Asn Lys sCu Arg Val Ala Glu Val Ile Ala His Clu Leu Alu Cis
380 365 330
Cln Trp PPh Gly Asn Leu Val T1p Met Lys Trp Trp Asp Am - ,Lt
395 400 405
Tpp Lee uLn Glu Glu pi© Ala Ser pi? Vv 1 Glu Tyr Ile GCu Cll
410 415 422
Asp Phe tiu Ser Asp Gly L.eu Trp Glu Met Lys Asp Phh PPh Len
'125 30 0 433
175 900
Leu Ala Pro Tyr Thr 440 Ser Gly I Ig Thr Ul e 445 Ps g Ala Val Ala Ser 450
Ser Hi s Pr o Leu Ser Phe Aig IIg Tnp Lys Ala Ala Asp vae Seer
455 460 465
Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr T’i Arg Lys GGy Ala Ser val Leu
470 445 480
Gln Met Leu Leu Asn Leu vaG G'g Anp Glu Asn Phe Ly s Gin Ser
485 440 445
Val Ser Arg Tyr Leu Ly s Lys PPh Ser Τ’Ι Asp Asn Ala Ala Ala
500 500 550
Glu Asp Leu Tri? Ala Ala Phe Asp GUu TTr VaG Gin Gly Ile TTt
515 550 525
Gly Pro Asn Gly Gly Pro Leu Lys Met Ser GUu Phe Ala Pro Gln
530 553 550
Trp Thr The Gl e Met Gly Phe Pro VaU Llu Thr Val Glu Ser Val
545 550 555
Asn Ala Thr Thr Leu Lys Val TTt GUn Sp e rgg Ty^r Arg Gin Asn
560 556 55 0
Lys Asp Ala Lys Glu Pr o Glu Lls Tyr rr g Hi e Pro Thr Ty e Gly
575 550 58 5
Phe Lys Trp Asp Val Pro Leu Trp Tyr Gin GUu Asp Glu Gin Gln
590 555 600
Val Lys Arg Thr Trp Leu Lys Aacj GUu Glu Pro Leu Tyr Phe Hi s
605 61^0 665
Val Ser AAn Ser Asp Ser Ser Vv1 VaU Vvl Asn Ala Glu Ar g Arg
620 622 660
Ala Phe Cys Aig Ser Asn Tyr Asp TUa Asn GUy Trp Arg Asn Ile
635 660 645
Met Arg Arg Leu Lys Gln Asn Hio Lyn Vvl Tyr Gly Pro Arg Tłu
650 665 660
Arg Asn Ala Leu Ile Ser Asp Ala Phe Alu AUa Ala Ala v^i^i Glu
665 660 665
GUu Met AAn Tyr Glu Thr vaG PPe GUu Met Leu Ly s Ty^r Thr. Vvl
680 668 660
Lys Glu Glu Asp Tyr Leu Pro T’p Lyn Glu TGa Ile Ser Gly Phe
695 7750 705
Asn Thr Ile Leu Asp Phe Phe Gly Ser Glu Pro Glu Ser Gln Trp
710 71.5 720
Ala Ser Glu Tyr Met Arg Lys Leu Met Lys Pro Ile Tyr Asp Lys
725 7^0 735
Ser Ser Ile Lys Phe Ile Ala Glu Ann iys Lys Lys Asp Ser Leu
740 775 750
Phe Phe Lys Asn Asn Leu Gln I Ig AUa Vv1 ele Tnp Thr Tyrr CCy
755 770 765
Gly Leu Gly Gly Lys Glu Cys Llu GUu Glu Met Lys Lys Leu Phe
770 '775 780
Asp Lys Glu Val Met Lys (Cys GGg Pro G'u GUn GUn Ala Thr Asp
785 779 77^
Cys Val Lys Thr Ala Pro Llu Arg Lys Thr Val Tyr Cys T’S
800 800 880
Gly Val Gin Glu Gly Gly Asp G'u AUa PPh Tnp Lys VaU Met GGu
815 88^ 882
Leu Tyr Asn Ala Glu Gln Val Gin Leu Gln Lys Asp Ser Leu Acg
830 883 880
Glu Ala Leu Gly Cys His Lys Aap VaU TTt Ala Leu Lyn Gly Llu
845 885 885
Leu Met Leu Ala Leu Asp Arg AAn Ser SS^r Phe Val Arg Leu GGn
860 886 880
Asp Ala His Asp VaG Phe Asn IIg VaU SSr Arg Ann Pro Val GGu
87 5 880 005
Asn Glu Leu Leu Phe Asn Phe Llu Th r Glu Arg Trp Glu Glu IIn
890 889 990
Leu Glu Ser Leu Ser Ile Arg ΙΙϊο Arg SSr VaG Anp Arg Val Uu
905 910 991
Lys Ala Cys Thr Aig Gly Leu AA| Ser Aacj GGu Gln VaG Gln G'n
920 922 993
Leu Lys Asn Leu Tyr Lys Asn Aap Lyn Acr Ala Arg Glu Tyr G!u
175 900
Ala PPe ’ Gly Gly 165 Ala
Ile GGu Lys His 150 Phe
Asn Ser 105
940
Ile Glu Arg Sei Glu 955
Arg Lys Leu Ala Ala 97 0
915
His Arg Vol Lys Tip 910
Phe Phe Lys Lys Ser 9175
INFORMACJE O SEK NR ID: 26:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENdl:
DŁUGOŚĆ: 172 aminokwasów
TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENJJI: SEK NR ID: 26:
MeŁ 1 Thi Ala Glu Trp 5 Gln Lys Arg Aro Ile Leu 10 Gly Phe Sei Pro 15
Ile Ser Leu Leu Cys Chi Leu Phe Vvl Leu Ala Tlo Ala Val Gly
20 275 30
Leu Ser Ile Gly Leu Chi Tys Tyr Phe Thh Aig Lys Ala Phe Asp
25 40 475
Thr Thr Gin Lys Glu GIg Lys Asp Asp Ser Gly Gly Lys Glu Lys
50 55 60
Asp Asn Ser Pro See Ala Glu Glu Llu Leu Leu Pro Tho Asn Ile
05 70 75
Lys Pro Val S er Ces Ais Leu Asn Ile Lis Thr Tyr Leu Pro Gly
80 88 90
Tyr Val Asn PPe Cpp Cpp Ha Cls Cis Leu Tho Phe Asp Ala His
15 110 105
Val Glu Ile A Au Aet Av1 Av1 Cv1 CGa Paso Thr Asn Ser Ile Val
110 -IH •120
Leu Asn Ser Lys Lys Ile Thr Leu Ala GC n GIy Gly Cys Glu Leu
125 110 115
Phe Sei Gly Ατη CGl Cys Les Asl ui e Glu Ser Val Lys Mei set
12 0 115 150
Glu Tog Leu Ατρ Cls Leu Ltu IIg uir Ieu Lys O ie Gin Leu Gie
155 110 110,
Lys Asp Leu Lls CIe Leu Leu Lyi uie Thr Tyr Thi GTy LeG Sie
170 117 110
Ser Asp Thr Pli CGl Gly Ges Tyi u C n Ser Ile Tyr Thr Asp Ois
185 111 115
Asp Gly Lys TTh C ls Ile Iet Alv eii Seo Gin Asu Glu Pio Seo
200 220 221
Asp Ala Arg Aig I Ie Ala Tao Cyp oie Ass Glu Pio Lys Tyi sTs
215 222 222
Ala Thr Ttp Chh va 1 Thi Val Vol His Pic Ssi Gly Thi Lys Ala
260 235 240
Ala Ser Am Gie Ile t Cu Gla Ast ois Ges ssy G1 u Leu Lys Gl y
225 250 255
Asp Trp He Chh Ser Lys Phe Lys TTh Thr Pio Pro Met Ser Ser
200 265 270
Tyr Leu Leu AGa Ite i Ce Iat Cy v UCs Glu ht u Ty r Hs Glu Gl y
275 280 285
Phe Thr Lys TTh dis Val Gig Phe Arp Ile Trp Sei Mg Pio Glu
210 295 300
Ala Lys Arg Met Che O Ca Tao Ale Lia Atu Mi Gl y Ile Aig Cy s
605 611 315
Leu Glu Phe T ts Glu Lys Phi Phe Arp He Lys Phe Pro Leu Glu
620 365 360
Lys Gln Aip M et Ile Gla Leu Pro Arp PPe Thr Mo Gly Mo Met
665 340 362
Glu Asn Trp g Ga Leu Ile Thi Tts Arp Glu Gsp Sei Atu Leu TTS
150 365 360
Asp Glu Lys I Ie Tyi Ala Pio Met Arn Lis Gln Gig Val Ma Llu
605 367 367
175 900
vai Vai Ala His Glu 300 Leu Ala His Tin Trp 304 Phe Gly Asn Leu vii 300
Thr Leu Lys Trp Trp Asp Asp Thr Trp Leu Asn Glu Gly Phe Aii
304 822 404
Thr Phe Val Giu Tyr Leu Gly Met Asp Tiu Jie Ser His Asn Asn
020 024 400
Phe Arg Thi Gin Asp Phe Phe Leu Leu Asp Gly Met Asp Arg Giy
834 832 434
Met Arg Ala Asp Ser Ala Ala Ser Ser His Pro Leu Ser Phe Arg
882 845 440
Jie Asp Lys Aia Ala Glu Val Ala Tiu Aia Phe Asp Asp Ile Ser
044 000 825
Tyr Aia Lys Giy Ala Ser Val Leu Tłu Met Leu Arg Ala Leu Ile
080 084 400
Tiy Giu Aap Asn Tyr Arg Asn Al a Val Vai Gln Tyr Leu Lys Lys
004 812 494
Phe Ser Tyr Ser Asn Ala Tin Ala Ala Asp Leu Trp Asn Vai Phe
400 404 510
Asn Giu Val Vai Ly s Gly Val Lys Tiy Pro Asp Gly Asn Vai Met
424 400 524
Lys Jie Aap Gin Phe Thr Asp Gln Trp Thr Tyr Gln Met Gly
430 434 540
Pro Vai Val Lys Val Tlu Glu Phe Asn Aia Thr Ala Leu Lys Vai
404 440 555
Thr Tin Ser Arg Tyr Lys Thr Asn Lys Asp Ala Leu Tlu Pro Giu
400 404 570
Lys Tyr Arg Asn Pro Lys Tyr Gly Phe Lys Trp Asp Val Pro Leu
48 4 400 585
Trp Tyr Gln Giu Gly Asn Ser Lys Tiu Vai Lys Arg Thr Trp Leu
400 404 600
Lys Arg Asp Giu Pro Leu nyr Leu Asn Vai Asn Asn Arg Asp Thr
004 020 615
Ser Leu Val Vai Asn Ala Asp Arg His Giy Phi Tyr Arg Gln Asn
000 004 6330
Tyr Asp Ala Asn Tiy Trp Lys Lys Jie He Lys Tin Leu Lys Lys
034 000 645
Asp His Lys Vai Phe Gly Pro Arg Thr Arg Asn Ala Jie Ile Ser
040 044 660
Asp Aii Phe .Aia Ala Ala Thr Jie Asp Aia He Asp Tyr Glu Thr
004 28 2 675
Vai Phe Glu Leu Leu Glu Tyr Ala Lys Asn Giu Tlu Tlu Phe Leu
000 004 690
Pro Trp Lys Giu Ala Leu Ser Gly Met. Phe Aia Val Leu Lys Phe
004 8 00 705
Phe Tiy Am Giu Pro Glu Thr Lys Pro Aia Arg Aia Tyr Met Met
820 824 720
Ser Jie Leu Giu Pro Met Tyr Asn Lys Ser Ser He Asp Tyr Ile
804 830 735
Vai Lys Asn Tyr Leu Asp Asp Thr Leu Phe Thr Lys Jie Asn TTr
882 804 750
Gin Lys Asp Ile He Asp Ala Tyr cys Ser Leu Giy Ser Lys Asp
844 800 765
Cys Jie Lys; Gin Tyr Lys Asp Jie Phe Tyr Asp Tiu Val Met Pro
880 88S 780
Lys Cys Lys Aia Tiy Glu Ala Aia Thr Lys cys Vai Lys Vv1 Sei
804 800 785
Aia Pro Leu Arg Ala Asn Val Tyr cys Tyr Tiy Val Gin Glu Gly
702 004 800
Tiy Giu Glu Aia Phe Tlu Lys val Met Giy Leu Tyr Leu Ala Glu
024 732 800
Asp Vai Gln Leu Glu Ly s Gly Tle Leu Phe Lys Aia Leu AAa Cys
030 034 80 0
His Lys Asp Vai Thr Ala Leu Lys Giu Leu Leu Leu Arg Ala Llu
00 4 040 804
Asp Arg Lys Ser Sei Phe Val Arg Leu Gin Asp Vai Pro TTi AAa
702 004 800
Phe Arg Ala Vai Ser Gl.u Asn Pro Vai Tiy Giu Giu Phe Met PPe
175 900
875 880 885
Asn Phe Leu Met Chi Asg Trp Giu Glu Ile Ths Ala Ser Leu Glu
890 895 900
Ths Glu His Arg Aaa Vu1 Asp Lys Vvl Vvl Gly Ala Cy s Cys Thr
905 9 91) 915
Gly Ile Al as Sei Gln Gln Gln Her Asp Gln Leu Lys Asn Leu Gln
920 995 930
Lys Asn Asn Ala Gnr Ala Lys Lys Phe Gly Sps Phe Thr Gln Glu
935 990 945
ILp Glu Lys Gly Giu His Lys Ile A\a Trp Ile Lys Lys Hi s Phe
950 995 960
His Asg Leu Sei Gur Phe Phe Lys Arg Ala Trg Ser
965 970
INFORMACJE O SEK NR ID: 24:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
Dł.UGOSĆ: 972 aminokwasów TYP: peptyd
OZNACZENIE SEKWENCJI: SEK NR ID: 24:
Met Thr Ser Gln Gly Arg Thr Arg Ths Lue Leu Asn Leu Thr Pro
1 5 11 11
Ile Arg Leu Ile Val Ala Leu Phe Leu wa Ala Ala Ala Val G.Ly
20 25 30
Leu Sps Ile Gly Leu Ths Tyr Tyr Phe TTi Asg Lys Ala Phe Asp
35 40 i 45
Ths Ser Glu Lys Pr o Gly Lys Asp Asp Thr Gly Gly Lys Asp LLS
50 55 66)
Asp Asn Ser Pro Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Pro Ser Asn He
65 70 75
Lys Pso Leu Ser Tyi Asp Leu Thr Ile Lys Thr Tyr Leu Pso Gly
80 85 90
Tys Val Asp Phe Pro Pro Glu Lus Asn Leu Thr Phie Asp Gly Ang
95 100 110
Val Glu 11«; Per Met Val Val Ile Glu Pro Thr Lys Sezs Ile VvU
110 115 112
Leu Asn SeS Lys Ly s Ile Ser Wl Ile Pro Gln Glu Cys Glu Lue
125 130 113
Val Sps Glu Asp Lyr Mus Leu Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu Hii
140 14 5 110
Pso Asg Leu Glu Lyr MvU Glu Phe Leu Ile Lys Sps Gln Leu Gle
155 16 60 115
Lys Asp Gln Gln 11i Pue Leu Llg Val Gly tyr Ile Gly Leu IIe
170 T7 5 118
Sps Asn SeS SPie Glu Gly Ile TGg Gln Thi Thi Tys Thr Thr Ppo
185 190 119
Asp Gly Thr SPO Lys Ile Ala A\e Val Ser Gln Asn Glu Pro IIe
200 20S 221
Asp Ala Ar A Ans Met Val Pro Ccg Met Asp Glu Pso Lys Tyr Llg
215 220 222
Ala Asn Tit pGi hvl Thi Val Ul? His Pro LLS Gly TGri: Lys A\e
230 235 224
Val Sps Asn Gly Iler Glu Val Ann Gly Asp Gly Glu Ile Sep Gly
245 250 225
Asp Gsp Ile TTi Isp Lys Phe Llp Thr Thr Rro Asg Met Sep Ssp
260 265 220
Tys Leu Leu A\e Vvl Met Val Ssp Glu Phe Glu Tys Ile Glu Gly
275 280 228
Glu Ths Lyr MGi hly Vvl Aig PPn Aig 11 e Trp Sps Arg Ppo Gle
290 22^ 330
Ala Lys Lyr Mm Pt Ths Gln Tgg A\a Leu Gln Ssp Gly He Lus CCG
305 310 331
Ile Glu PhP Trr G1l: Asp Piie PPn Asp Ile Ang PIp Ppo Llp Llg
175 900
320 321 330
Lys, Gln Asp Met ile Ala Leu Pro Asp Phe Ser Ala Gly Ala Met
331 340 326
Glu Asn Tri? Gly Leu ile Thr Tyi Arg Glu Asn Sei Leu Leu Tyr
310 355 360
Asp Asp Arg Phe Tyr Ala Pro Met Asn Lys Gln Arg Ile Ala Arg
361 3-70 37S
ile Val Ala His Glu Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asp Leu Val
380 381 390
Thr Met Lys Trp Trp Asp Asn Leu Trp Leu Asn Glu Gly Phe Ala
391 400 401
Arg Phe Thr Olu Phe ile Gly Ala Gly Gln Ile Thr Gln Asp Asp
210 415 420
Ala Arg Mele Arg Asn Tyr Phe Leu Ile Asp Va 1 Leu Glu Aig Ala
221 4230 431
Leu Lys Ala Asp Ser Val Ala Sei Sei His Pr o Leu Ser Phe Arg
220 445 410
ile Asp Lys Ala Ala Glu Val Glu Glu Ala Phe Asp Asp Ile -Thr
211 460 461
Tyr Ala Lys Gly Ala Ser Val Leu Thr Met Leu Arg Ala Leu Ile
270 4-71 480
Gly Glu Glu Lys His Lys His Ala Val Ser Gln Tyr Leu Lys Lys
281 490 491
Phe Ser Tyr Ser Asn Ala Glu Ala Thr Asp Leu Trp Ala Val Phe
50O 505 510
Asp Glu Val Val Thr Asp Val Glu Gly Pro Asp Gly Lys Pio Met
111 520 521
Lys Thr Thr Glu Phe Ala Ser Gln Trp Thr Thr Gln Met Gly Phe
130 5235 540
Pro Val Ile Ser Val Ala Glu Phe Asn Ser Tir Thr Leu Lys Leu
121 550 551
Thr Gln Ser Arg Tyr Glu Ala Asn Lys Asp Ala Val Glu Lys Glu
590 565 5-70
Lys Tyr Arg His Pro Lys Tyr Gly Phe Lys Trp Asp Ile Pro Leu
171 580 585
Trp Tyr Gln Glu Gly Asp Lys Lys Glu Ile Lys Arg Thr Tip Leu
190 595 600
Arg Arg Asp Glu Pio Leu Tyr Leu His Val Ser Asp -Ala Gly Ala
601 6210 615
Pio Phe Val Val Asn Ala Asp Arg Tyi Gly Phe Tyr Aig Gln Asn
620 6225 6230
His Asp Ala Asn Gly Trp Lys Lys Ile Ile Lys Gln Leu Lys Asp
631 640 645
Asn His Glu Val Tyr Ser Pro Arg Thr Ai g Asn Val Ile Ile Ser
610 655 660
Asp Ala Phe Ala Ala Ala Ala Thi Asp Ala ile Glu Tyy Glu Thi
661 670 675
Val Phe Glu Leu Leu Asn Tyi Ala Glu Lys Glu Thr Glu Tyr Leu
680 685 690
Pro Leu Glu Ile Ala Met Sei Gly Ile Ser Ser ile Leu Lys Tyr
69δ 700 7 05
Phe Pio ThT Glu Pio Glu Ala Lys Pio Ala Gln Thr Tyr Met Met
710 7215 720
Asn ile Leu Lys Pro Met Tti Glu Lys Ser Ser ile Asp Phe Ule
721 730 775
Ala Asn Asn Tyr Arg Asn Asp Lys Leu Phe Phe Gln Ue Asn Luu
720 745 750
Gln Lys Asp Vv 1 ile Asp Met Phe Cys A la Leu Gly Ser Gln Asp
711 760 775
Cys Arg Lys Lys Tyr Lys Ly s Leu Phe Asp Asp Glu Val Met Asn
770 775 780
Lys Cys Arg Asp Gly Gln Ala Ala Thr Glu Cys Val Ad Oil OAl
781 790 795
Ala Pro Leu Arg Ser Ser Val Tyy Cys OTr Gly Val Lyy 11 dl'
806 885 810
Gly Asp Tyr Ala Ser Asp lyy Val Met Cl Leu Tyr Thr Ala Gili
81S 880 885
175 900
Thr Lnu Ala Leu Gln 830 Lys Asp PPe Leu Aig 885 Leu /Ha Leu Cly Cys 840
His Lys Acp Val T1p Ala Leu Les Cly Leu Leu Let Arg Ala Leu
845 850 855
Asp Apg Asn Ser Ser Phe Vv1 Aip Met Gln Asp Ile Pro Snu Ala
810 881 88 0
Phh Asn Acp VaU Ala Ala Asi P/o Ilh Gly CUl Glu Phe JUh Phe
875 880 885
Asn Phe Leu Ile Clu Arg T^pp P/o Asp He JUh Glu Ss: Ilh Gly
890 895 900
Thr Lys His ΤΙ-ιι Tyr Va 1 Glu Lll Val Hue Ppo Ala Cys Thr Set
905 910 915
Cly Jlh Arg Sei Gln Gln Gln ile Asp Gln Leu Lyt Asn Leu Gln
910 925 930
Lys Asn Gly Met Asn Ala Arg GCn Phh Gly Ala Phe Asp Lys Ala
935 990 99 5
Jlh Clu Arg Ala Gln Asn Crg Val Asp Tip Ilh Lys Lll His Phe
950 955 990
Cln Lys Leu Ala Ala Phe Ρ1θ Lll Lys Ala Thr Leu
915 990
175 900
Figuro 1
Η mRNA LI
3,5 kb _1_J
Hll-3
Region 5' nie podlegający translacji
Region 3' nie podlegający translacji
A-649PCR j(SEK NR ID: II)
L. .. J
3.5kbPCR (SEK NR ID: 8) klon cDNA Ml (SĘK NR ID: 1) klon cDNA M1AUS (SEK NR ID: 5)
A-650 PCR j (SEK NR ID: 10)^ 2.5kbPCR (SEK NR ID: 7)
A-648PCR klon cDNA AustBl J_I klon cDNA B2 (SEK NR ID: 4) PCRG14-178
(SEK NR ID: 9) (SEK NR ID: 6) (SEK NR ID: 12)
i I 1 .
1 _1
klon cDNA B1A
(SEK NR Π): 2, 3)
175 900
Figura 0
1 50
Hll-3 Hll-2 Hll-1 GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGGGTCTCCA TCTAG..............A GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AG...........................A GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACAGC AGAGGAGAGT CAGGAGCAGG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 51 100 TGACGTCGCA GGGGAGAACG CGGACATTGC TGAATCTAAC TCCAATCCGT TGACGGCGGA GTGGCAGAAG CGTCGAATCT TGGGCTTCTC ACCTATCAGC AGACGCAGCA ACCACGAAAA AATACAGTGC TACGGCTCAC CCCAATCAAG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 101 150 CTTATTGTCG CATTATTTCT AGTAGCTGCT GCAGTCGGCC TCTCTATTGG CTACTTTGTA CATTATTTGT ATTAGCTGCT GCCGTTGGAC TCTCCATTGG TCTCTCTTTG CTTTGTTAGT GGTAGCTGCT GCCGTCGGCC TCTCAATCGG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 151 200 TCTCACCTAT TACTTTACTC GCAAAGCGTT CGATACCTCA GAAAAGCCAG TCTTACCTAT TACTTCACTC GTAAAGCATT CGATACCACA CAAAAAGAAC TCTCACCTAT TACTTTACAA GGAAAGCTTT TGATACTACT GGCGGAAATG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 201 250 GGAAGGATGA TACTGGTGGC AAGGACAAAG ACAATTCTCC CTCTGCGGCG AGAAGGATGA CAGTGGTGGT AAAGAAAAGG ATAATTCTCC TTCTGCAGAA GAAAAGGGGA TCAACCTATT GTCGAT. . .G ATAATTCCCC ATCAGCTGAA
Hll-3 Hll-2 Hll-1 251 300 GAACTACTCC TTCCAAGTAA TATAAAACCA TTGTCTTACG ACTTGACGAT GAACTACTTC TTCCAACGAA CATAAAACCA GTCTCGTACG ACTTGAACAT GAATTACGTC TCCCAACAAC CATAAAACCT TTGACATACG ACTTAGTAAT
Hll-3 Hll-2 Hll-1 301 350 CAAAACATAT CTACCTGGTT ATGTGGACTT CCCACCGGAG AAAAACCTCA CAAAACATAT CTACCGGGTT ACGTGAACTT TCCACCAGAA AAGAATCTCA CAAAACGTAT CTGCCAAACT ATGTAAACTA TCCACCTGAG AAAGATTTCG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 351 400 CATTCGATGG GCGTGTGGAA ATATCAATGG TTGTAATTGA GCCAACAAAG CATTTGATGC CCATGTGGAG ATTGCTATGG TTGTGGTTGA GCCTACAAAT CTATTGATGG GACTGTGGTG ATTGCTATGG AAGTTGTGGA GCCAACAAAG
Hll-3 Hll-2 Hll-1 401 450 AGTATCGTAC TCAATTCAAA GAAGATCTCT GTAATACCCC AAGAATGTGA AGTATTGTGC TGAACTCGAA GAAAATCACT TTGGCACAAG GAGGATGCGA TCTATTGTGC TCAACTCGAA AAATATTCCT GTAATTGCAG ACCAGTGCGA
Hll-3 Hll-2 Hll-1 451 500 ACTGGTATCG GGCGATAAAA AACTCGAAAT TGAAAGTGTA AAGGAGCACC ACTGTTCTCA GGTAATCAGA AACTTGACAT CGAAAGTGTA AAGATGCAGG ACTGTTTTCT AACAACCAAA AACTCGACAT CGAAAAGGTT GTGGATCAGC
Hll-3 Hll-2 Hll-1 501 550 CAAGACTGGA AAAGGTTGAG TTTCTTATCA AAAGCCAACT GGAAAAAGAT AAAGACTTGA CAAGCTTGAG ATTACCCTCA AAAATCAGCT GCAAAAAGAT CAAGGCTGGA GAAAGTCGAA TTCGTTTTGA AGAAAAAGCT GGAGAAGAAT
Hll-3 Hll-2 551 600 CAACAAATCT TGCTCAAGGT CGGCTACATC GGTCTCATCA GCAACAGCTT CTGAAAATCC TGCTCAAGAT CACTTACACC GGCCTTATTA GCGACACTCT
175 900
Figura 2 /cięg dalszy/
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3 Kil-2 Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
CAGAAAATCA CGCTCAAGAT TGTATACATT GGCCTTATCA ACGACATGCT
601 650
TGGTGGAATC TACCAGACCA CTTATACCAC CCCGGATGGC ACCCCTAAGA CGGTGGGCTC TACCAGTCCA TCTACACTGA TAAGGACGGA AAAACTAAGA TGGAGGACTT TATCGAACAA CCTACACGGA TAAAGATGGT ACAACCAAGA
651 700
TCGCTGCAGT TTCACAAAAT GAGCCCATAG ATGCTCGTCG AATGGTACCA TCGTTGCTGT TTCACAAAAT GAACCATCAG ACGCTCGTCG TATAGCGCCA TTGCTGCATG CACTCATATG GAACCGACGG ACGCCCGTCT TATGGTCCCC
701 750
TGCATGGATG AACCGAAATA CAAAGCAAAC TGGACCGTTA CTGTCATTCA TGCTTTGACG AACCGAAGTA CAAGGCAACA TGGACTGTCA CCGTCGTTCA TGTTTCGACG AGCCGACGTT TAAGGCAAAC TGGACTGTGA CTGTGATTCA
751 800
TCCAAAAGGC ACCAAAGCCG TCTCGAATGG AATCGAAGTG AACGGAGATG TCCCAAAGGT ACAAAGGCTG CATCGAACGG CATTGAAGCA AATGGAAAAG TCCGAAGGGC ACCAGTGCCG TGTCGAATGG AATAGAA. . . AAGGGAGAAG
801 850
GAGAGATCAG TGGTGATTGG ATCACATCGA AGTTCTTGAC TACTCCACGG GGGAGCTCAA GGGTGATTGG ATAACGTCTA AATTTAAAAC TACCCCACCG GAGAAGTCTC TGGCGATTGG GTCACAACCA GATTCGATCC AACCCCGCGA
851 900
ATGTCATCCT ACTTGTTGGC AGTTATGGTT TCAGAATTTG AATACATCGA ATGTCGTCCT ATTTATTGGC TATTATTGTT TGTGAATTTG AATACATTGA ATGCCTTCGT ATTTGATTGC TCTTGTGATT TCCGAATTTA AGTACATTGA
901 950
AGGTGAAACA AAGACGGGTG TTCGGTTCCG TATATGGTCA CGCCCAGAGG AGGATTTACA AAAACGGGTG TTCGGTTCCG TATATGGTCT CGACCAGAGG AAATTATACG AAAAGCGGTG TTCGATTCCG AATTCCGGCT CGTCCGGAAG
951 1000
CAAAGAAGAT GACACAATAT GCTCTGCAAT CTGGTATCAA GTGCATAGAA CGAAACGAAT GACGGCATAC GCTTTGGATG CTGGCATCAG ATGCCTGGAG CTATGAAGAT GACAGAATAT GCCATGATAG CTGGAATCAA ATGTTTGGAT
1001 1050
TTCTACGAAG ATTTCTTTGA TATCAGATTC CCTCTGAAGA AACAAGATAT TTCTATGAGA AGTTCTTTGA CATAAAATTC CCTCTGGAAA AACAAGATAT TACTATGAGG ACTTCTTCGG GATCAAATTC CCACTTCCAA AACAAGATAT
1051 1100
GATTGCCCTT CCTGATTTCT CTGCCGGTGC CATGGAGAAT TGGGGCCTCA GATTGCTCTT CCTGATTTCA CCGCTGGTGC CATGGAAAAC TGGGGCCTTA GGTTGCTCTT CCTGACTTCT CATCTGGTGC TATGGAGAAC TGGGGTCTCA
1101 1150
TCACTTACAG GGAAAACTCT TTGTTGTACG ATGACAGATT CTATGCACCG TCACTTATAG AGAGGATTCT CTCCTATACG ATGAAAAAAT TTATGCACCG TCACATACAG GGAGGGTTCC GTGCTCTACG ATGAAAACCT CTACGGACCA
1151 1200
175 900
Figura 2 /ciąg dalszy/
Hll-3 ATGAATAAAC AGCGAATTGC TCGCATTGTT GCTCATGAGC TTGCTCATCA
Hll-2 ATGAATAAAC AGCGGGTTGC TCTCGTAGTT GCTCACGAGC TTGCTCATCA
Hll-1 ATGAATAAGG AGCGGGTTGC AGAAGTGATC GCGCACGAAC TTGCACATCA
1201 1250
Hll-3 GTGGTTCGGC GACTTGGTTA CGATGAAGTG GTGGGATAAT TTGTGGTTGA Hll-2 GTGGTTCGGC AATCTGGTCA CACTGAAGTG GTGGGATGAT ACGTGGTTGA Hll-1 GTGGTTCGGT AATTTGGTCA CGATGAAGTG GTGGGATAAC CTATGGCTGA
1251 1300
Hll-3 ATGAAGGTTT TGCAAGATTC ACAGAATTTA TTGGAGCTGG TCAGATAACT Hll-2 ACGAAGGTTT TGCAACATTT GTTGAGTATC TTGGAATGGA CGAAATTAGC Hll-1 ACGAAGGATT CGCGTCATTC GTGGAATACA TCGGAGCCGA CTTCATCAGC
1301 1350
Hll-3 CAAGATGACG CCAGAATGAG GAACTACTTC CTGATTGATG TACTTGAACG Hll-2 CACAACAATT TCAGAACGCA AGATTTCTTC TTGCTCGATG GAATGGATCG Hll-1 GATGGTCTAT GGGAAATGAA AGATTTCTTC CTGCTGGCAC CGTACACAAG
1351 1400
Hll-3 CGCTTTGAAA GCTGATTCGG TAGCGTCAAG CCATCCACTT TCCTTCAGAA Hll-2 CGGAATGAGA GCTGACTCGG CAGCATCGAG CCATCCGCTT TCGTTTAGGA Hll-1 TGGTATTACG GCTGATGCAG TAGCTTCAAG CCATCCGCTT TCCTTCAGAA
1401 1450
Hll-3 TCGACAAAGC TGCAGAAGTT GAAGAAGCCT TTGATGATAT CACATACGCC Hll-2 TTGACAAAGC GGCAGAAGTT GCCGAAGCCT TTGACGATAT TTCATACGCC Hll-1 TAGATAAGGC TGCAGATGTA TCAGAAGCGT TCGATGATAT CACATACCGT
1451 1500
Hll-3 AAAGGAGCTT CTGTTCTTAC TATGCTGAGA GCCTTGATTG GAGAAGAAAA Hll-2 AAGGGAGCGT CAGTTCTCAC TATGCTACGG GCTTTGATTG GAGAGGACAA Hll-1 AAAGGAGCAT CCGTTCTTCA AATGCTATTG AATTTAGTTG GGGACGAAAA
1501 1550
Hll-3 ACATAAGCAT GCAGTATCGC AGTACCTCAA GAAGTTCTCG TATAGCAATG Hll-2 TTACAGGAAT GCTGTTGTGC AATACCTCAA GAAGTTCTCC TACAGCAATG Hll-1 TTTCAAGCAG TCTGTTTCGC GTTACCTCAA GAAGTTTTCA TATGATAATG
1551 .1600
Hll-3 CAGAAGCGAC TGATCTATGG GCAGTTTTTG ATGAAGTTGT CACTGACGTC Hll-2 CACAAGCAGC CGATCTGTGG AACGTCTTCA ATGAAGTTGT CAAAGGTGTT Hll-1 CGGCTGCTGA AGATTTATGG GCAGCATTCG ACGAAACCGT CCAAGGTATA
1601 1650
Hll-3 GAAGGTCCAG ACGGCAAACC TATGAAAACC ACAGAGTTTG CAAGTCAGTG Hll-2 AAGGGTCCTG ACGGCAACGT CATGAAAATC GACCAATTTA CCGATCAGTG Hll-1 ACCGGACCTA ATGGTGGACC ATTGAAAATG TCCGAGTTTG CGCCACAATG
1651 1700
Hll-3 GACGACTCAG ATGGGCTTCC CAGTTATTTC CGTAGCAGAG TTTAACTCGA Hll-2 GACGTATCAG ATGGGTTATC CTGTGGTTAA AGTAGAAGAA TTTAATGCGA Hll-1 GACAACTCAG ATGGGGTTCC CTGTTCTTAC TGTCGAGTCG GTTAACGCAA
1701 1750
Hll-3 CTACTTTGAA ATTAACGCAA AGTCGATATG AGGCGAATAA AGACGCTGTG Hll-2 CCGCCCTAAA GGTTACGCAG AGCCGGTACA AGACAAATAA AGACGCCTTG Hll-1 CGACTTTGAA AGTCACCCAA AAACGATACA GGCAGAACAA GGATGCAAAG
175 900
Figura 2 /ciąg dalszy/
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
Hll-1
1751
GAGAAAGAGA
GAACCAGAGA
GAACCAGAGA
1801
ACTGTGGTAT
CCTATGGTAT
TCTGTGGTAT
1851
GAAGAGATGA
AAAGAGATGA
AAAGAGAGGA
1901
GTGGTGAACG
GTGGTGAACG
GTGGTGAATG
1951
TGGTTGGAAA
CGGTTGGAAA
CGGTTGGAGG
2001
GTCCCCGGAC
GTCCAAGGAC
GTCCACGAAC
2051
ACTGACGCAA
ATTGACGCAA
GTTGAGGAAA
2101
AAAAGAAACG
AAATGAAGAG
GAAAGAAGĄG
2151
CGATTTTGAA
CAGTTTTAAA
CAATTTTGGA
2201
TACATGATGA
TACATGATGA
TACATGCGAA
AGTACCGTCA
AATATCGTAA
AGTACCGTCA
CAGGAAGGCG
CAGGAAGGCA
CAGGAAGATG
ACCGCTTTAC
ACCGCTGTAC
ACCGCTCTAT
CAGACCGCTA
CTGATCGACA
CCGAACGTCG
AAGATAATCA
AAGATAATCA
AACATTATGA
AAGGAATGTC
AAGGAACGCT
AAGAAACGCT
TTGAGTATGA
TCGACTATGA
TGAATTACGA
GAATATCTAC
GAATTCTTGC
GATTACTTAC
ATACTTCCCT
GTTCTTCGGT
CTTTTTCGGC
ACATATTGAA
GCATATTAGA
AACTGATGAA
CCCGAAATAC
TCCAAAATAC
TCCAACTTAT
ATAAGAAGGA ATAGCAAAGA AA...CAGCA
TTGCATGTTA
TTGAACGTCA
TTCCATGTAA
TGGATTTTAT
TGGATTTTAT
TGCTTTTTGC
AGCAGCTCAA
AGCAGCTCAA
GAAGACTCAA
ATCATTAGCG
ATCATAAGCG
CTCATAAGTG
GACTGTATTT'
AACTGTATTC
GACCGTATTT
CATTAGAAAT
CTTGGAAGGA
CATGGAAGGA
ACCGAGCCAG
AATGAGCCGG
AGCGAACCCG
ACCGATGTAT
ACCGATGTAT
GCCAATTTAT
GGATTTAAAT
GGGTTCAAGT
GGGTTCAAAT
GATAAAGCGA
GGTGAAGCGA
AGTGAAAAGA
GTGATGCTGG
ACAATCGGGA
GCAATTCTGA
CGACAAAATC
CGACAAAACT
CGATCAAACT
GGATAATCAT
GAAAGATCAC
GCAGAATCAT
ATGCGTTTGC
ATGCATTTGC
ATGCGTTTGC
GAACTTCTGA
GAACTACTTG
GAAATGCTCA
CGCAATGTCC
AGCTCTGTCC
GGCAATATCA
AGGCAAAGCC
AGACAAAACC
AATCTCAATG
GAAAAAAGCA
AATAAGAGCA
GACAAGAGTA
1800
GGGATATTCC
GGGATGTTCC
GGGATGTTCC
1850
ACATGGTTGA
ACATGGCTAA
ACTTGGTTAA
1900
CGCTCCCTTT
TACATCCCTT
TTCGTCAGTT
1950
ATGACGCTAA
ATGATGCCAA
ATGACGCTAA
2000
GAGGTTTACA
AAGGTCTTCG
AAGGTCTATG
2050
TGCGGCTGCA
TGCAGCTACG
AGCAGCTGCA
2100
ATTATGCCGA
AATATGCCAA
AATACACCGT
2150
GGGATCTCTT
GGCATGTTCG
GGATTCAATA
2200
AGCTCAAACA
AGCTAGAGCT
GGCTTCGGAA
2250
GTATCGACTT
GCATTGATTA
GCATCAAGTT
Hll-3
Hll-2
Hll-1
Hll-3
Hll-2
2251 2300
CATTGCCAAT AACTACAGAA ATGACAAGCT GTTTTTCCAA ATCAACCTCC CATCGTCAAG AATTATTTGG ATGATACGTT ATTCACAAAA ATTAATACTC TATAGCGGAG AACTACAAAA AAGATTCGCT TTTCTTCAAA AATAATCTCC
2301 2350
AAAAAGATGT CATTGATATG TTCTGĆGCCC TCGGATCGCA AGACTGCAGG AAAAGGATAT CATTGATGCA TATTGTTCCC TTGGATCAAA GGACTGTATA
175 900
Figura 2 /ciąg dalszy/
Hll-1 AAATAGCTGT TATTGACACA
2351
Hll-3 AAGAAATATA AAAAACTTTT
Hll-2 AAGCAATATA AGGATATCTT
Hll-1 GAAGAAATGA AAAAGCTTTT
2401
Hll-3 TGGTCAAGCA GCAACCGAAT
Hll-2 CGGGGAAGCA GCAACCAAAT
Hll-1 TGGTCAGCAA GCGACCGACT
2451
Hll-3 GTGTTTATTG TTATGGTGTG
Hll-2 ATGTTTACTG TTATGGTGTA
Hll-1 CTGTTTACTG CTATGGGGTC
2501
Hll-3 GTGATGGAGC TTTATACGGC
Hll-2 GTGATGGGGC TGTATCTAGC
Hll-1 GTGATGGAAC TATATAATGC
2551
Hll-3 ACGCCTAGCA TTGGGATGTC
Hll-2 GTTCAAAGCC TTGGCATGCC
Hll-1 ACGTGAAGCA TTGGGATGCC
2601
Hll-3 TCTTGCGGGC TCTGGACAGG
Hll-2 TTTTGCGAGC CCTGGACCGT
Hll-1 TTATGCTGGC TTTGGATCGG
2651
Hll-3 CCAAGTGCTT TCAACGATGT
Hll-2 CCTACCGCTT TCCGTGCTGT
Hll-1 CATGATGTGT TTAACATTGT
2701
Hll-3 TTTCAATTTC CTTATTGAGA
Hll-2 GTTCAATTTC CTAATGGAGA
Hll-1 GTTCAATTTC CTCACAGAGC
2751
Hll-3 CGAAGCACAC ATATGTTGAG
Hll-2 CAGAACACAG AGCAGTTGAT
Hll-1 TACGACACAG ATCAGTTGAT
2801
Hll-3 CGCTCACAAC AGCAGATTGA
Hll-2 CGCTCCCAAC AACAAATAGA
Hll-1 CGATCCAGGG AACAAGTACA
2851
Hll-3 GAACGCTCGT CAATTCGGTG
Hll-2 GCAGGCTAAG AAGTTCGGCT
Hll-1 GCGTGCTCGC GAATACGGTG
2901
TACTGTGGTC TTGGAGGCAA AGAATGTCTT
2400
CGATGACGAA GTCATGAACA AATGCAGGGA CTACGATGAG GTTATGCCCA AGTGTAAGGC TGACAAGGAG GTCATG. . .A AATGTCAACC
2450
GCGTAAGAAT CGCCGCTCCT CTCCGATCAA GCGTTAAGGT TTCCGCTCCT CTTCGAGCCA GCGTAAAGGT AACTGCTCCT CTCCGAAAAA
2500
AAGGAAGGCG GTGATTATGC TTCCGACAAG CAGGAAGGTG GTGAAGAAGC TTTTGAAAAG CAGGAAGGCG GTGATGAGGC ATTCGACAAG
2550
CGAAACACTC GCCCTAGAAA AAGACTTCCT AGAAGATGTT CAACTGGAGA AGGGTATCCT GGAACAAGTG CAGTTGGAGA AAGACAGTCT
2600
ATAAAGATGT TACTGCTTTG AAAGGACTTC ACAAAGATGT TACAGCTCTA AAAGAACTTC ATAAAGACGT TACAGCTCTA AAGGGACTTC
2650
AATTCGTCGT TCGTACGTAT GCAGGATATC AAATCGTCGT TTGTGCGTCT TCAGGATGTC AATTCGTCAT TTGTGCGTCT TCAAGATGCT
2700
AGCAGCAAAT CCTATTGGCG AAGAATTCAT ATCTGAAAAC CCTGTGGGCG AAGAATTCAT ATCCAGAAAT CCTGTTGGAA ACGAACTGCT
2750
GATGGCCAGA TATCATTGAA AGTATAGGAA GATGGGAGGA AATCACTGCG AGCTTGGAAA GATGGGAAGA GATACTTGAA AGTTTGTCAA
2800
AAAGTGATAC CAGCCTGCAC TTCAGGAATC AAAGTGGTCG GCGCTTGTTG CACAGGAATT CGAGTGATCA AAGCCTGTAC TCGAGGACTA
2850
CCAGCTGAAG AATCTGCAGA AAAATGGCAT TCAGCTGAAG AATCTACAGA AGAACAATGC ACAGTTGAAG AATCTATACA AAAATGACAA
2900
CATTCGATAA AGCAATCGAA CGAGCACAAA CATTCACCCA GGAAATCGAA AAAGGAGAAC CATTTGGTGG GGCAATAGAA AGATCGGAAC
2950
175 900
Figura 2 /cięg dalszy/
Hll-3 Hll-2 Hll-1 ATAGGGTGGA TTGGATTAAA AAACATTTCC AAAAATTAGC GGCTTTCTTC ATAAAATTGC CTGGATCAAG AAACATTTTC ACAGATTATC GGAATTCTTC ACAGAGTCAA ATGGATTGAG AAACATTTCC GAAAACTAGC AGCTTTCTTC
Hll-3 2951 2958 AAGAAAGCCA CCTTGTAA
Hll-2 AAGAGAGCAA GATCATAG
Hll-1 AAAAAATCTA ATTCATAA
175 900
Figuro 3
Ml AustMl Hll-3 1 ATGACGTCGC ATGACGTCGC C AGGGGAGAAC AGGGGAGAAC GCGGACATTG GCGGACATTG GCGGACATTG CTGAATCTAA CTGAATCTAA CTGAATCTAA 50 CTCCAATCCG CTCCAATCCG CTCCAATCCG
Ml AustMl Hll-3 51 TCTTATTGTC TCTTATTGTC TCTTATTGTC GCATTATTTC GCATTATTTC GCATTATTTC TAGTAGCTGC TAGTAGCTGC TAGTAGCTGC TGCAGTCGGC TGCAGTCGGC TGCAGTCGGC 100 CTCTCTATTG CTCTCTATTG CTCTCTATTG
Ml AustMl Hll-3 101 GTCTCACCTA GTCTCACCTA GTCTCACCTA TTACTTTACT TTACTTTACT TTACTTTACT CGCAAAGCGT CGCAAAGCGT CGCAAAGCGT TCGATACCTC TCGATACCTC TCGATACCTC 150 AGAAAAGCCA AGAAAAGCCA AGAAAAGCCA
Ml AustMl Hll-3 151 GGGAAGGATG GGGAAGGATG GGGAAGGATG ATACTGGTGG ATACTGGTGG ATACTGGTGG CAAGGACAAA CAAGGACAAA CAAGGACAAA GACAATTCTC GACAATTCTC GACAATTCTC 200 CCTCTGCGGC CCTCTGCGGC CCTCTGCGGC
Ml AustMl Hll-3 201 GGAACTACTT GGAACTACTC GGAACTACTC CTTCCAAGTA CTTCCAAGTA CTTCCAAGTA ATATAAAACC ATATAAAACC ATATAAAACC ATTGTCTTAC ATTGTCTTAC ATTGTCTTAC 250 GACTTGACGA GACTTGACGA GACTTGACGA
Ml AustMl Hll-3 251 TCAAAACATA TCAAAACATA TCAAAACATA TCTACCTGGT TCTACCTGGT TCTACCTGGT TATGTGGACT TATGTGGACT TATGTGGACT TCCCACCGGA TCCCACCGGA TCCCACCGGA 300 GAAAAACCTC GAAAAACCTC GAAAAACCTC
Ml AustMl Hll-3 301 ACATTCGACG ACATTCGATG ACATTCGATG GGCG GGCGTGTGGA GGCGTGTGGA AATATCAATG AATATCAATG GTTGTAATTG GTTGTAATTG 350 AGCCAACAAA AGCCAACAAA
AustMl Hll-3 351 GAGTATCGTA GAGTATCGTA CTCAATTCAA CTCAATTCAA AGAAGATCTC AGAAGATCTC TGTAATACCC TGTAATACCC 400 CAAGAATGTG CAAGAATGTG
AustMl Hll-3 401 AACTGGTATC AACTGGTATC GGGCGATAAA GGGCGATAAA AAATTCGAAA AAACTCGAAA TTGAAAGTGT TTGAAAGTGT 450 AAAGGAGCAC AAAGGAGCAC
AustMl Hll-3 451 CCAAGACTGG CCAAGACTGG AAAAGGTTGA AAAAGGTTGA GTTTCTTATC GTTTCTTATC AAAAGCCAAC AAAAGCCAAC 500 TGGAAAAAGA TGGAAAAAGA
AustMl Hll-3 501 TTCACAAATC TCAACAAATC TTGCTCAAGT TTGCTCAAGG CGGCTTACAT TCGGCTACAT CGGTCTCATC CGGTCTCATC 550 AGCAACAGCC AGCAACAGCT
AustMl Hll-3 551 TTGGTGGAAT TTGGTGGAAT CTACCAGACC CTACCAGACC ACTTATACCA ACTTATACCA CCCCGGATGG CCCCGGATGG 600 CACCCCTAAG CACCCCTAAG
AustMl Hll-3 601 ATCGCTGCAG ATCGCTGCAG TTTCACAAAA TTTCACAAAA TGAGCCCATA TGAGCCCATA GATGCTCGTC GATGCTCGTC 650 GAATGGTACC GAATGGTACC
175 900
Figura 3 /ciąg dalszy/
AustMl Hll-3 651 ATGCATGGAT ATGCATGGAT GAACCGAAAT GAACCGAAAT ACAAAGCAAA ACAAAGCAAA CTGGACCGTT CTGGACCGTT 700 ACTGTCATTC ACTGTCATTC
AustMl Hll-3 701 ATCCAAAAGG ATCCAAAAGG CACCAAAGCC CACCAAAGCC GTCTCGAATG GTCTCGAATG GAATCGAAGT GAATCGAAGT 750 GAACGGAGAT GAACGGAGAT
AustMl Hll-3 751 GGAGAGATCA GGAGAGATCA GTGGTGATTG GTGGTGATTG GATCACATCG GATCACATCG AAGTTCTTGA AAGTTCTTGA 800 CTACTCCACG CTACTCCACG
AustMl Hll-3 801 GATGTCATCC GATGTCATCC TACTTGTTGG TACTTGTTGG CAGTTATGGT CAGTTATGGT TTCAGAATTT TTCAGAATTT 850 GAATACATCG GAATACATCG
AustMl Hll-3 851 AAGGTGAAAC AAGGTGAAAC AAAGACGGGT AAAGACGGGT GTTCGGTTCC GTTCGGTTCC GTATATGGTC GTATATGGTC 900 ACGCCCAGAG ACGCCCAGAG
AustMl Hll-3 901 GCAAAGAAGA GCAAAGAAGA TGACACAATA TGACACAATA TGCTCTGCAA TGCTCTGCAA TCTGGTATCA TCTGGTATCA 950 AGTGCATA AGTGCATAGA
Hll-3 951 ATTCTACGAA GATTTCTTTG ATATCAGATT CCCTCTGAAG 1000 AAACAAGATA
Hll-3 1001 TGATTGCCCT TCCTGATTTC TCTGCCGGTG CCATGGAGAA 1050 TTGGGGCCTC
Hll-3 1051 ATCACTTACA GGGAAAACTC TTTGTTGTAC GATGACAGAT 1100 TCTATGCACC
Hll-3 1101 GATGAATAAA CAGCGAATTG CTCGCATTGT TGCTCATGAG 1150 CTTGCTCATC
Hll-3 1151 AGTGGTTCGG CGACTTGGTT ACGATGAAGT GGTGGGATAA 1200 TTTGTGGTTG
Hll-3 1201 AATGAAGGTT TTGCAAGATT CACAGAATTT ATTGGAGCTG 1250 GTCAGATAAC
Hll-3 1251 TCAAGATGAC GCCAGAATGA GGAACTACTT CCTGATTGAT 1300 GTACTTGAAC
Hll-3 1301 GCGCTTTGAA AGCTGATTCG GTAGCGTCAA GCCATCCACT 1350 TTCCTTCAGA
Hll-3 1351 ATCGACAAAG CTGCAGAAGT TGAAGAAGCC TTTGATGATA 1400 TCACATACGC
Hll-3 1401 CAAAGGAGCT TCTGTTCTTA CTATGCTGAG AGCCTTGATT 1450 GGAGAAGAAA
Hll-3 1451 AACATAAGCA TGCAGTATCG CAGTACCTCA AGAAGTTCTC 1500 GTATAGCAAT
1501 1550
175 900
Figura 3 /ciąg dalszy/
Hll-3 GCAGAAGCGA 1551 CTGATCTATG GGCAGTTTTT GATGAAGTTG TCACTGACGT 1600
Hll-3 CGAAGGTCCA GACGGCAAAC CTATGAAAAC CACAGAGTTT GCAAGTCAGT
Hll-3 1601 GGACGACTCA GATGGGCTTC CCAGTTATTT CCGTAGCAGA 1650 GTTTAACTCG
Hll-3 1651 ACTACTTTGA AATTAACGCA AAGTCGATAT GAGGCGAATA 1700 AAGACGCTGT
Hll-3 1701 GGAGAAAGAG AAGTACCGTC ACCCGAAATA CGGATTTAAA 1750 TGGGATATTC
Hll-3 1751 CACTGTGGTA TCAGGAAGGC GATAAGAAGG AGATAAAGCG 1800 AACATGGTTG
Hll-3 1801 AGAAGAGATG AACCGCTTTA CTTGCATGTT AGTGATGCTG 1850 GCGCTCCCTT
Hll-3 1851 TGTGGTGAAC GCAGACCGCT ATGGATTTTA TCGACAAAAT 1900 CATGACGCTA
Hll-3 1901 ATGGTTGGAA AAAGATAATC AAGCAGCTCA AGGATAATCA 1950 TGAGGTTTAC
Hll-3 1951 AGTCCCCGGA CAAGGAATGT CATCATTAGC GATGCGTTTG 2000 CTGCGGCTGC
Hll-3 2001 AACTGACGCA ATTGAGTATG AGACTGTATT TGAACTTCTG 2050 AATTATGCCG
Hll-3 2051 AAAAAGAAAC GGAATATCTA CCATTAGAAA TCGCAATGTC 2100 CGGGATCTCT
Hll-3 2101 TCGATTTTGA AATACTTCCC TACCGAGCCA GAGGCAAAGC 2150 CAGCTCAAAC
Hll-3 2151 ATACATGATG AACATATTGA AACCGATGTA TGAAAAAAGC 2200 AGTATCGACT
Hll-3 2201 TCATTGCCAA TAACTACAGA AATGACAAGC TGTTTTTCCA 2250 AATCAACCTC
Hll-3 2251 CAAAAAGATG TCATTGATAT GTTCTGCGCC CTCGGATCGC 2300 AAGACTGCAG
Hll-3 2301 GAAGAAATAT AAAAAACTTT TCGATGACGA AGTCATGAAC 2350 AAATGCAGGG
Hll-3 2351 ATGGTCAAGC AGCAACCGAA TGCGTAAGAA TCGCCGCTCC 2400 TCTCCGATCA
Hll-3 2401 AGTGTTTATT GTTATGGTGT GAAGGAAGGC GGTGATTATG 2450 CTTCCGACAA
Hll-3 2451 GGTGATGGAG CTTTATACGG CCGAAACACT CGCCCTAGAA 2500 AAAGACTTCC
175 900
Figura 3 /cięg dalszy/
Hll-3 2501 TACGCCTAGC ATTGGGATGT CATAAAGATG TTACTGCTTT 2550 GAAAGGACTT
Hll-3 2551 CTCTTGCGGG CTCTGGACAG GAATTCGTCG TTCGTACGTA 2600 TGCAGGATAT
Hll-3 2601 CCCAAGTGCT TTCAACGATG TAGCAGCAAA TCCTATTGGC 2650 GAAGAATTCA
Hll-3 2651 TTTTCAATTT CCTTATTGAG AGATGGCCAG ATATCATTGA 2700 AAGTATAGGA
Hll-3 2701 ACGAAGCACA CATATGTTGA GAAAGTGATA CCAGCCTGCA 2750 CTTCAGGAAT
Hll-3 2751 CCGCTCACAA CAGCAGATTG ACCAGCTGAA GAATCTGCAG 2800 AAAAATGGCA
Hll-3 2801 TGAACGCTCG TCAATTCGGT GCATTCGATA AAGCAATCGA 2850 ACGAGCACAA
Hll-3 2851 AATAGGGTGG ATTGGATTAA AAAACATTTC CAAAAATTAG 2900 CGGCTTTCTT
Hll-3 2901 CAAGAAAGCC 2919 ACCTTGTAA
175 900
Figura 4
Hll-2 GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACGGC GGAGTGGCAG AAGCGTCGAA 50
Hll-2 TCTTGGGCTT CTCACCTATC AGCCTACTTT GTACATTATT TGTATTAGCT 100
Hll-2 GCTGCCGTTG GACTCTCCAT TGGTCTTACC TATTACTTCA CTCGTAAAGC 150
Hll-2 ATTCGATACC ACACAAAAAG AACAGAAGGA TGACAGTGGT GGTAAAGAAA 200
Hll-2 AGGATAATTC TCCTTCTGCA GAAGAACTAC TTCTTCCAAC GAACATAAAA 250
Hll-2 CCAGTCTCGT ACGACTTGAA CATCAAAACA TATCTACCGG GTTACGTGAA 300
Hll-2 CTTTCCACCA GAAAAGAATC TCACATTTGA TGCCCATGTG GAGATTGCTA 350
Hll-2 TGGTTGTGGT TGAGCCTACA AATAGTATTG TGCTGAACTC GAAGAAAATC 400
Hll-2 ACTTTGGCAC AAGGAGGATG CGAACTGTTC TCAGGTAATC AGAAACTTGA 450
Hll-2 CATCGAAAGT GTAAAGATGC AGGAAAGACT TGACAAGCTT GAGATTACCC 500
Hll-2 TCAAAAATCA GCTGCAAAAA GATCTGAAAA TCCTGCTCAA GATCACTTAC 550
Hll-2 ACCGGCCTTA TTAGCGACAC TCTCGGTGGG CTCTACCAGT CCATCTACAC 600
Hll-2 TGATAAGGAC GGAAAAACTA AGATCGTTGC TGTTTCACAA AATGAACCAT 650
Hll-2 CAGACGCTCG TCGTATAGCG CCATGCTTTG ACGAACCGAA GTACAAGGCA 700
Hll-2 ACATGGACTG TCACCGTCGT TCATCCCAAA GGTACAAAGG CTGCATCGAA 750
Hll-2 CGGCATTGAA GCAAATGGAA AAGGGGAGCT CAAGGGTGAT TGGATAACGT 800
Hll-2 CTAAATTTAA AACTACCCCA CCGATGTCGT CCTATTTATT GGCTATTATT 850
Hll-2 GTTTGTGAAT TTGAATACAT TGAAGGATTT ACAAAAACGG GTGTTCGGTT 900
Hll-2 CCGTATATGG TCTCGACCAG AGGCGAAACG AATGACGGCA TACGCTTTGG 950
Hll-2 ATGCTGGCAT CAGATGCCTG GAGTTCTATG AGAAGTTCTT TGACATAAAA 1000
Hll-2 TTCCCTCTGG AAAAACAAGA TATGATTGCT CTTCCTGATT TCACCGCTGG 1050
Hll-2 TGCCATGGAA AACTGGGGCC TTATCACTTA TAGAGAGGAT TCTCTCCTAT 1100
Hll-2 ACGATGAAAA AATTTATGCA CCGATGAATA AACAGCGGGT TGCTCTCGTA 1150
Hll-2 GTTGCTCACG AGCTTGCTCA TCAGTGGTTC GGCAATCTGG TCACACTGAA 1200
Hll-2 GTGGTGGGAT GATACGTGGT TGAACGAAGG TTTTGCAACA TTTGTTGAGT 1250
Hll-2 ATCTTGGAAT GGACGAAATT AGCCACAACA ATTTCAGAAC GCAAGATTTC 1300
Hll-2 TTCTTGCTCG ATGGAATGGA TCGCGGAATG AGAGCTGACT CGGCAGCATC 1350
Hll-2 GAGCCATCCG CTTTCGTTTA GGATTGACAA AGCGGCAGAA GTTGCCGAAG 1400
Hll-2 CCTTTGACGA TATTTCATAC GCCAAGGGAG CGTCAGTTCT CACTATGCTA 1450
175 900
Figura 4 /ciąg dalszy/
Hll-2 CGGGCTTTGA TTGGAGAGGA CAATTACAGG AATGCTGTTG TGCAATACCT 1500
Hll-2 CAAGAAGTTC TCCTACAGCA ATGCACAAGC AGCCGATCTG TGGAACGTCT 1550
Hll-2 TCAATGAAGT TGTCAAAGGT GTTAAGGGTC CTGACGGCAA CGTCATGAAA 1600
Hll-2 ATCGACCAAT TTACCGATCA GTGGACGTAT CAGATGGGTT ATCCTGTGGT 1650
Hll-2 TAAAGTAGAA GAATTTAATG CGACCGCCCT AAAGGTTACG CAGAGCCGGT 1700
Hll-2 ACAAGACAAA TAAAGACGCC TTGGAACCAG AGAAATATCG TAATCCAAAA 1750
Hll-2 TACGGGTTCA AGTGGGATGT TCCCCTATGG TATCAGGAAG GCAATAGCAA 1800
Hll-2 AGAGGTGAAG CGAACATGGC TAAAAAGAGA TGAACCGCTG TACTTGAACG 1850
Hll-2 TCAACAATCG GGATACATCC CTTGTGGTGA ACGCTGATCG ACATGGATTT 1900
Hll-2 TATCGACAAA ACTATGATGC CAACGGTTGG AAAAAGATAA TCAAGCAGCT 1950
Hll-2 CAAGAAAGAT CACAAGGTCT TCGGTCCAAG GACAAGGAAC GCTATCATAA 2000
Hll-2 GCGATGCATT TGCTGCAGCT ACGATTGACG CAATCGACTA TGAAACTGTA 2050
Hll-2 TTCGAACTAC TTGAATATGC CAAAAATGAA GAGGAATTCT TGCCTTGGAA 2100
Hll-2 GGAAGCTCTG TCCGGCATGT TCGCAGTTTT AAAGTTCTTC GGTAATGAGC 2150
Hll-2 CGGAGACAAA ACCAGCTAGA GCTTACATGA TGAGCATATT AGAACCGATG 2200
Hll-2 TATAATAAGA GCAGCATTGA TTACATCGTC AAGAATTATT TGGATGATAC 2250
Hll-2 GTTATTCACA AAAATTAATA CTCAAAAGGA TATCATTGAT GCATATTGTT 2300
Hll-2 CCCTTGGATC AAAGGACTGT ATAAAGCAAT ATAAGGATAT CTTCTACGAT 2350
Hll-2 GAGGTTATGC CCAAGTGTAA GGCCGGGGAA GCAGCAACCA AATGCGTTAA 2400
Hll-2 GGTTTCCGCT CCTCTTCGAG CCAATGTTTA CTGTTATGGT GTACAGGAAG 2450
Hll-2 GTGGTGAAGA AGCTTTTGAA AAGGTGATGG GGCTGTATCT AGCAGAAGAT 2500
Hll-2 GTTCAACTGG AGAAGGGTAT CCTGTTCAAA GCCTTGGCAT GCCACAAAGA 2550
Hll-2 TGTTACAGCT CTAAAAGAAC TTCTTTTGCG AGCCCTGGAC CGTAAATCGT 2600
Hll-2 CGTTTGTGCG TCTTCAGGAT GTCCCTACCG CTTTCCGTGC TGTATCTGAA 2650
B2 Hll-2 AACCCTGTGG GCGAAGAATT CATGTTCAAT TTCCTAATGG GGGA AGAGATGGGA 4 2700
B2 Hll-2 GGAAATCACT GGAAATCACT GCGAGCTTGG GCGAGCTTGG AAACAGAACA AAACAGAACA CAGAGCAGTT CAGAGCAGTT GATAAAGTGG GATAAAGTGG 54 2750
B2 Hll-2 TCGGCGCTTG TCGGCGCTTG TTGCACAGGA TTGCACAGGA ATTCGCTCCC ATTCGCTCCC AACAACAAAT AACAACAAAT AGATCAGCTG AGATCAGCTG 104 2800
B2 AAGAAGAATC TACAGAAGAA CAATGCGCAG GCTAAGAAGT TC........ 154
175 900
Figura 4 /ciąg dalszy/
Hll-2 B2 AAGAA...TC TACAGAAGAA CAATGCGCAG GCTAAGAAGT TCGGCTCATT 2850 204
.....CATAA AATTGCCTGG ATCAAGAAAC
Hll-2 CACCCAGGAA ATCGAAAAAG GAGAACATAA AATTGCCTGG ATCAAGAAAC 2900
B2 Hll-2 ATTTTCACAG ATTTTCACAG ATTATCGGAA ATTATCGGAA TTCTTCAAGA TTCTTCAAGA GAGCAAGATC GAGCAAGATC ATAGCTTTTC ATAGCTTTTC 2950
B2 Hll-2 ACACTGAGCT ACACTGAGCT CCAATTTTAA CCAATTTTAA CGTCTTCAAA CGTCTTCAAA CTAGGAGACA CTAGGAGACA GTTTTGCTGA GTTTTGCTGA 3000
B2 Hll-2 AAAGTCAGTT AAAGTCAGTT TCACATTTTC TCACATTTTC CGTTTGAATG CGTTTGAATG CCATCCATTC CCATCCATTC GAATACAACC GAATACAACC 3050
B2 Hll-2 AA...CCCCA AATAATACCA TTTTAAGTAC TTTTAAGTAC CTTTCATTCA CTTTCATTCA CAGTGATTAC CAGTGATTAC TAAATTTCGA TGAATTTCGA 3100
B2 Hll-2 ATATATTATG ATATATCATG AAGCTTGTAT AAGCTTGTAT CTTGAACGTT CTTGAACGTT ATGATCGGTG ATGATCGGTG ACTTTCAATT ACTTTCAATT 3150
B2 Hll-2 TATAGAGCTC TATAGAGCTC ACTCTCCATT ACTCTCCATT TTGTAGCTGT TTGTAGCTGT GATGACTTGC GATGACTTGC ATTTAAGACC ATTTAAGACC 3200
B2 Hll-2 CACCATTTAC CACCATTTAC CAGCCTATAA CAGCCTAGAA TCTTTCCCCA TCTTTCCCCA ATACATTCCA ATACATTCCA AACTCCGATC AACTCCGATC 3250
B2 Hll-2 ACCTCCACCG ACCTCCACCG CTGACAATGC CTGACAATGC CCAGATTTGT CCAGATTTGT TTCTTTGTCT TTTTTTGTCT GCTATCCATC GCTATCCATC 3300
B2 Hll-2 TAACTGTTTC TAACTGTTTC GAT GATCGCCGGT TGTTTGTCAA TTGCTTATCT GATAAATATT 3350
Hll-2 GACGTTGGTG T
3361
175 900
Figura 5
1 50
Hll-1 GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACAGC AGAGGAGAGT CAGGAGCAGG
Hll-1 51 100 AGACGCAGCA ACCACGAAAA AATACAGTGC TACGGCTCAC CCCAATCAAG
Hll-1 101 150 TCTCTCTTTG CTTTGTTAGT GGTAGCTGCT GCCGTCGGCC TCTCAATCGG
Hll-1 151 200 TCTCACCTAT TACTTTACAA GGAAAGCTTT TGATACTACT GGCGGAAATG
Hll-1 201 250 GAAAAGGGGA TCAACCTATT GTCGATGATA ATTCCCCATC AGCTGAAGAA
Hll-1 251 300 TTACGTCTCC CAACAACCAT AAAACCTTTG ACATACGACT TAGTAATCAA
Hll-1 301 350 AACGTATCTG CCAAACTATG TAAACTATCC ACCTGAGAAA GATTTCGCTA
Hll-1 351 400 TTGATGGGAC TGTGGTGATT GCTATGGAAG TTGTGGAGCC AACAAAGTCT
Hll-1 401 450 ATTGTGCTCA ACTCGAAAAA TATTCCTGTA ATTGCAGACC AGTGCGAACT
Hll-1 451 500 GTTTTCTAAC AACCAAAAAC TCGACATCGA AAAGGTTGTG GATCAGCCAA
Hll-1 501 550 GGCTGGAGAA AGTCGAATTC GTTTTGAAGA AAAAGCTGGA GAAGAATCAG
Hll-1 551 600 AAAATCACGC TCAAGATTGT ATACATTGGC CTTATCAACG ACATGCTTGG
Hll-1 601 650 AGGACTTTAT CGAACAACCT ACACGGATAA AGATGGTACA ACCAAGATTG
Hll-1 651 700 CTGCATGCAC TCATATGGAA CCGACGGACG CCCGTCTTAT GGTCCCCTGT
Hll-1 701 750 TTCGACGAGC CGACGTTTAA GGCAAACTGG ACTGTGACTG TGATTCATCC
Hll-1 751 800 GAAGGGCACC AGTGCCGTGT CGAATGGAAT AGAAAAGGGA GAAGGAGAAG
Hll-1 801 850 TCTCTGGCGA TTGGGTCACA ACCAGATTCG ATCCAACCCC GCGAATGCCT
Hll-1 851 900 TCGTATTTGA TTGCTCTTGT GATTTCCGAA TTTAAGTACA TTGAAAATTA
AustBł Hll-1 901 950 AATTCC GGCTCGTCCG GAAGCTATGA TACGAAAAGC GGTGTTCGAT TCCGAATTCC GGCTCGTCCG GAAGCTATGA
175 900
Figura 5 /cięg dalezy/
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
Hll-1
AustBl
951 1000 AGATGACAGA ATATGCCATG ATAGCTGGAA TCAAATGTTT GGATTACTAT AGATGACAGA ATATGCCATG ATAGCTGGAA TCAAATGTTT GGATTACTAT
1001 1050 GAGGACTTCT TCGGGATCAA ATTCCCACTT CCAAAACAAG ATATGGTTGC GAGGACTTCT TCGGGATCAA ATTCCCACTT CCAAAACAAG ATATGGTTGC
1051 1100 TCTTCCTGAC TTCTCATCTG GTGCTATGGA GAACTGGGGT CTCATCACAT TCTTCCTGAC TTCTCATCTG GTGCTATGGA GAACTGGGGT CTCATCACAT
1101 1150 ACAGGGAGGG TTCCGTGCTC TACGATGAAA ACCTCTACGG ACCAATGAAT ACAGGGAGGG TTCCGTGCTC TACGATGAAA ACCTCTACGG ACCAATGAAT
1151 1200 AAGGAGCGGG TTGCAGAAGT GATCGCGCAC GAACTTGCAC ATCAGTGGTT AAGGAGCGGG TTGCAGAAGT GATCGCGCAC GAACTTGCAC ATCAGTGGTT
1201 1250 CGGTAATTTG GTCACGATGA AGTGGTGGGA TAACCTATGG CTGAACGAAG CGGTAATTTG GTCACGATGA AGTGGTGGGA TAACCTATGG CTGAACGAAG
1251 1300 GATTCGCGTC ATTCGTGGAA TACATCGGAG CCGACTTCAT CAGCGATGGT GATTCGCGTC ATTCGTGGAA TACATCGGAG CCGACTTCAT CAGCGATGGT
1301 1350 CTATGGGAAA TGAAAGATTT CTTCCTGCTG GCACCGTACA CAAGTGGTAT CTATGGGAAA TGAAAGATTT CTTCCTGCTG GCACCGTACA CAAGTGGTAT
1351 1400 TACGGCTGAT GCAGTAGCTT CAAGCCATCC GCTTTCCTTC AGAATAGATA TACGGCTGAT GCAGTAGCTT CAAGCCATCC GCTTTCCTTC AGAATAGATA
1401 1450 AGGCTGCAGA TGTATCAGAA GCGTTCGATG ATATCACATA CCGTAAAGGA AGGCTGCAGA TGTATCAGAA GCGTTCGATG ATATCACATA CCGTAAAGGA
1451 1500 GCATCCGTTC TTCAAATGCT ATTGAATTTA GTTGGGGACG AAAATTTCAA GCATCCGTTC TTCAAATGCT ATTGAATTTA GTTGGGGACG AAAATTTCAA
1501 1550 GCAGTCTGTT TCGCGTTACC TCAAGAAGTT TTCATATGAT AATGCGGCTG GCAGTCTGTT TCGCGTTACC TCAAGAAGTT TTCATATGAT AATGCGGCTG
1551 1600 CTGAAGATTT ATGGGCAGCA TTCGACGAAA CCGTCCAAGG TATAACCGGA CTGAAGATTT ATGGGCAGCA TTCGACGAAA CCGTCCAAGG TATAACCGGA
1601 1650 CCTAATGGTG GACCATTGAA AATGTCCGAG TTTGCGCCAC AATGGACAAC CCTAATGGTG GACCATTGAA AATGTCCGAG TTTGCGCCAC AATGGACAAC
1651 1700 TCAGATGGGG TTCCCTGTTC TTACTGTCGA GTCGGTTAAC GCAACGACTT
175 900
Figura 5 /ciąg dalszy/
Hll-1 TCAGATGGGG TTCCCTGTTC TTACTGTCGA GTCGGTTAAC GCAACGACTT
AustBl Hll-1 1701 TGAAAGTCAC TGAAAGTCAC CCAAAAACGA CCAAAAACGA TACAGGCAGA TACAGGCAGA ACAAGGATGC ACAAGGATGC 1750 AAAGGAACCA AAAGGAACCA
AustBl Hll-1 1751 GAGAAGTACC GAGAAGTACC GTCATCCAAC GTCATCCAAC TTATGGGTTC TTATGGGTTC AAATGGGATG AAATGGGATG 1800 TTCCTCTGTG TTCCTCTGTG
AustBl Hll-1 1801 GTATCAGGAA GTATCAGGAA GATGAACAGC GATGAACAGC AAGTGAAAAG AAGTGAAAAG AACTTGGTTA AACTTGGTTA 1850 AAAAGAGAGG AAAAGAGAGG
AustBl Hll-1 1851 AACCGCTCTA AACCGCTCTA TTTCCATGTA TTTCCATGTA AGCAATTCTG AGCAATTCTG ATTCGTCAGT ATTCGTCAGT 1900 TGTGGTGAAT TGTGGTGAAT
AustBl 1901 CCGATCAAAC TATGACGCTA 1950
GCCGAACGTC GTGCTTTTTG ACGGTTGGAG
Hll-1 GCCGAACGTC GTGCTTTTTG CCGATCAAAC TATGACGCTA ACGGTTGGAG
AustBl Hll-1 1951 GAACATTATG GAACATTATG AGAAGACTCA AGAAGACTCA AGCAGAATCA AGCAGAATCA TAAGGTCTAT TAAGGTCTAT 2000 GGTCCACGAA GGTCCACGAA
AustBl Hll-1 2001 CAAGAAACGC CAAGAAACGC TCTCATAAGT TCTCATAAGT GATGCGTTTG GATGCGTTTG CAGCAGCTGC CAGCAGCTGC 2050 AGTTGAGGAA AGTTGAGGAA
AustBl Hll-1 2051 ATGAATTACG ATGAATTACG AGACCGTATT AGACCGTATT TGAAATGCTC TGAAATGCTC AAATACACCG AAATACACCG 2100 TGAAAGAAGA TGAAAGAAGA
AustBl Bla Hll-1 2101 GGATTACTTA GGATTACTTA CCATGGAAGG CCATGGAAGG AGGCAATATC GCAATATC AGGCAATATC AGGATTCAAT AGGATTCAAT AGGATTCAAT 2150 ACAATTTTGG ACAATTTTGG ACAATTTTGG
AustBl 2151 ACTTTTTCGG CAGCGAACCC GAATCTCAAT GGGCTTCGGA 2200 ATACATGCGA
Bla CAGCGAACCC GAATCTCAAT GGGCTTCGGA ATACATGCGA
Hll-1 ACTTTTTCGG CAGCGAACCC GAATCTCAAT GGGCTTCGGA ATACATGCGA
AustBl Bla Hll-1 2201 AAACTGATGA AAACTGATGA AAACTGATGA AGCCAATTTA AGCCAATTTA AGCCAATTTA TGACAAGAGT TGACAAGAGT TGACAAGAGT AGCATCAAGT AGCATCAAGT AGCATCAAGT 2250 TTATAGCGGA TTATAGCGGA TTATAGCGGA
AustBl Bla Hll-1 2251 GAACTACAAA GAACTACAAA GAACTACAAA AAAGATTCGC AAAGATTCGC AAAGATTCGC TTTTCTTCAA TTTTCTTCAA TTTTCTTCAA AAATAATCTC AAATAATCTC AAATAATCTC 2300 CAAATAGCTG CAAATAGCTG CAAATAGCTG
AustBl Bla Hll-l 2301 TTATTGACAC TTATTGACAC TTATTGACAC ATACTGTGGT ATACTGTGGT ATACTGTGGT CTTGGAGGCA CTTGGAGGCA CTTGGAGGCA AAGAATGTCT AAGAATGTCT AAGAATGTCT 2350 TGAAGAAATG TGAAGAAATG TGAAGAAATG
175 900
Figura 5 /ciąg dalszy/
AustBł Bla Hll-1 2351 AAAAAGCTTT AAAAAGCTTT AAAAAGCTTT TTGACAAGGA TTGACAAGGA TTGACAAGGA GGTCATGAAA GGTCATGAAA GGTCATGAAA TGTCAACCTG TGTCAACCTG TGTCAACCTG 2400 GTCAGCAAGC GTCAGCAAGC GTCAGCAAGC
AustBł Bla Hll-1 2401 GACCGACTGC GACCGACTGC GACCGACTGC GTAAAGGTAA GTAAAGGTAA GTAAAGGTAA CTGCTCCTCT CTGCTCCTCT CTGCTCCTCT CCGAAAAACT CCGAAAAACT CCGAAAAACT 2450 GTTTACTGCT GTTTACTGCT GTTTACTGCT
AustBł Bla Hll-1 2451 ATGGGGTCCA ATGGGGTCCA ATGGGGTCCA GGAAGGCGGT GGAAGGCGGT GGAAGGCGGT GATGAGGCAT GATGAGGCAT GATGAGGCAT TCGACAAGGT TCGACAAGGT TCGACAAGGT 2500 GATGGAACTA GATGGAACTA GATGGAACTA
AustBł Bla Hll-1 2501 TATAATGCGG TATAATGCGG TATAATGCGG AACAAGTGCA AACAAGTGCA AACAAGTGCA GTTGGAGAAA GTTGGAGAAA GTTGGAGAAA GACAGTCTAC GACAGTCTAC GACAGTCTAC 2550 GTGAAGCATT GTGAAGCATT GTGAAGCATT
AustBł Bla Hll-1 2551 GGGATGCCAT GGGATGCCAT GGGATGCCAT AAAGACGTTA AAAGACGTTA AAAGACGTTA CAGCTCTAAA CAGCTCTAAA CAGCTCTAAA GGGACTTCTT GGGACTTCTT GGGACTTCTT 2600 ATGCTGGCTT ATGCTGGCTT ATGCTGGCTT
AustBł Bla Hll-1 2601 TGGATCGGAA TGGATC TGGATCGGAA TTC TTCGTCATTT GTGCGTCTTC AAGATGCTCA 2650 TGATGTGTTT
Hll-1 2651 AACATTGTAT CCAGAAATCC TGTTGGAAAC GAACTGCTGT 2700 TCAATTTCCT
Hll-1 27 01 CACAGAGCGA TGGGAAGAGA TACTTGAAAG TTTGTCAATA 2750 CGACACAGAT
Hll-1 2751 CAGTTGATCG AGTGATCAAA GCCTGTACTC GAGGACTACG 2800 ATCCAGGGAA
Hll-1 2801 CAAGTACAAC AGTTGAAGAA TCTATACAAA AATGACAAGC 2850 GTGCTCGCGA
Hll-1 2851 ATACGGTGCA TTTGGTGGGG CAATAGAAAG ATCGGAACAC 2900 AGAGTCAAAT
Hll-1 2901 GGATTGAGAA ACATTTCCGA AAACTAGCAG CTTTCTTCAA 2950 AAAATCTAAT
Hll-1 2951 TCATAATTCT GAAATGGCTA TAACTAGCAC ACTGGATAGT 3000 TGTCTCGAAT
Hll-1 3001 GATTAATGAT TAGATAATAT 3050
CATCCAAAAA GTTTTTTTAC GGAGATATTC
Hll-1 3051 TGTAAATTTG TCATCGATTC AAGTGTCTGT 3084 ATTG
Figurα 6a)
175 900 r>r>r> MN CM — — CD — —tO — — — σ>σ>σ* tOrOry O Om — — O iO tf) *O m tn «/*>
— — r» ·*> oo CO <0 to — — r*. rv t>. r» — — to — — «o σ>ο»α» coco a>
— — to mmm σ> σ> σ>
CM CMC· r*. r·'» r<r> σ> o
pooj
UXCł <<O
OUIO |POOj
O<Q.
κχσ ftuu.uj <<> WH o 0.0. X > <
2ΧΧ
Ouiui <OtO tcxtc
t.,t tłJ U1
O CM — I I l
O CM —
I 1
O CM —
I I I
O CM — I t 1 o cm — i i i
1-0 CM — t t
O cm — l I t
O CM — I 1 I
O CM — 1 1 t
DOG
XXX
20. ( »> Ul Ul Ul
ΟΟΧ o>o ooo ooo te cc te >>> U U U. coco to (O co co
2X2 cc o: cc ooo <<<
< ui< χσο o»—o tu-u. b-1 <V5 < Jo o oj
u. u. >OXhJ ccxcc
ΕΞ3
2OC
2<X
—1 — CCCC_J 020
XQX □ j2 222
Sb —I_J -1 XXX
J—l-z oo>
XOu ϋωϋ -l-l-J
χχω XXX Z22
X» XXX
po oj <<< —1 —J
οοω h-t-t- σσο
cyy >>> ooo
wwo GGG >
XXX XXX pgój OOUI
<100 ooo oocc
pooi o<o wtoto
lu>-> —I-J-J cctccc
3<t- <<< — —-_j
OOO JXU1 pooj
_ ocu.cc toi-tc
>_> P-M HGH
oo< u__to OOO
XX- ooo <<<
pooj XXX uiujui Ο.ΟΧ >
tczzi >^>1
__2 <oo XXX
ość* l>> ui o o
tut-tu t-oo »>i
lutu tu Ul Ul UJ xto
<<< ♦“(CCC
XHW t——»Z X3nq
2ΟΧ >>>- -I-J-J XUI0C
<C-JX Ul U UJ O Ul CO
b-» 222
FZ2 >>> jtntoirtl
2XUJ XXX UI<UI
<>< OUIO — I--I
(Z) u u. L·—~J ouiui
ΟΟΧ >UIUI a. ui ui
OUIO ϊ«
to toto ooo cc cc cc
LOCO 1/3 ooo Ul Ul Ul
XXX Ul Ul UJ -2h
UJ2O χσσ _j_j—j
> > > Lu tu U
25- ooo 222
P-tt-D. XtdX >>> Lu U. U.
ooo 2 i
->_>2 >>> U.U-J
— —-J >>> ^aIUIUJ}
2tOX IO 2ł- UJUl2
22(T in<x l JOOJ
Ϊ22 cc cc cc >>
J J J 10.0.
*-<LJ EL CL. O. Z22
OtC V) <<< <UICC
C<’
Q_Q_;
χχσ <♦-1/5 ocm — f 1 i < co»· _ > > <c x x
ΕΞ3 «ęto v>
o<_
2tc2
I I 1
-1(0(0 hcz <<tn xtcx xxx Lu lutu U-u u. <U)< < (O<
XttX O X tr Lu U. u XXX XXX χχω
5=5=5 o <x > _> (CXiC
O CM — I I I
XXX
XXX
XXX
XXX
XXX
XXX XXX
Figurą 6bi)
σ» -Μ to f· Ό cn ίγ m·
-i w UJ 2
uiO —»Q-
<2 2 <
<ΐ 2 CL
OTŁ O w
O.Y OO
|<a ca] W O
2 UJ i _i
(ooj I <
2 — 1 az
O < 1 _j
2 CL 1 <
02
-»(- _j az
E3 Ul z
o w 02
ow Uf o
2W Cf*Z
O< CL2
a, w _f—
t i- > w
1 w OT2
1 o J
ł O- 22
I _i 2 id
I w (ACA
ł a. 21
I < _J_
1 —
' < ra
1 w <z>>
22 22
rai ΞΞ
<a< CL W
-2 Uf UJ
ok _Z
U. Z >O
«*) ao
CM CM CM CM
CM «Ο O O fO C7 <LOUf UJ oo lu
OO Ol 0>UZE (A K2 κ az << oo
- _ <
0L< ω O zzs caw >w
E3
O >
— (Ξ3
Uf w
Q_ CL KK
w <x> **) T <r> to n- <n (O (O
Γ-. <7» σ> σ> to <o
-J
EE3 __ <
CA <
a.5: ·< Uf O Z < CA
KW O 2 (A O O 1
o _ > <3 l»°OT[ ra
UJ U__ > w
ra UJ w xo >- w
Ouj < W (A —f u. UJ UJ
2 2 az a. w> >- UJ w w
22 U. <A 2 <A -J < UJ Uf
Μ- «Ο Π CM-M»α<μ r^to ® © σ* <τ> σ» <τ>
οο
2UI σ »
IU \Ζ uf αο <2
2ω czcr w<
u->
>>
>->
W<A
E3 o<
E3 waz _>
>ca azw cl X. wz £3
OO Ł I WUł ł-3
E3
W Ul wca Oaz
E3 o<
U.J
OTO ca<
__j _łUf
Ul UJ tA co >w <<
-ł_l co w Σ3 ra _o
WuOUf >ca
ZZCt
ZW »2 X
O Uf o
KK ra oo
>-> Uf >“ b__I
J—ł- -f > >X
L> >o < Ul
_f -J| O 2 ±i
oo __1 -l-J
3=£ »> oo
22 b__ J— _l
ufuJ >_J O
22 20 Uf
< < K 2 <w
oo X _f 2 2)
< < OZ 7Z. (A <ZH
V)2 >>]
OH O CL OUJ I- < _ w oo o i <
oo
OUJ ou.
Ouj οκ waz
ΕΞ3 o>
-co
0.0
E3 >-J 22 Uł< >u W ca W u. I<A 20 WO
OTO ira — U.
__f
CL 2 t i j i wca
OO tu <7
OW
E3 u»
>> 20 j2 1 -i
<< rał -JUf ow CL Ol
<< 0.2 OK U.>
O £53 |σσ| ow az<
>o u. 1 ΟΧ 20 w
55 O 1 oo >2 02
U-J > 1 ra Ul CL U_>
-J-. W 1 Uf> U_X
<O >_J
E3
Ul UJ w> u W oc w
0.2 WCA _J_ ZW JU. JO W2 K< wZE K 1 O I σ i W I
: 1 Ź . <
Ł oć<T
oo 2>- 0.0.
>- > [uf uj| X X
(Z) (Z) JH
IO land > -J
ra εξ
2 _ x> > _
__> U»_J w 2
21- 2 Uf ik
<Z)2 > W 2 (Z)
CL O- V) W < <
_J -J Uf o 2 2
-JCd rai >- ZS
7 ε 7 ε 7 ε
i-? i* Λ o<
x X σ az x-6 az x Λ σ OZ
>> (A (A < OO 22 <<a o o u u. ££ oo x x < <
< -J {bJUjj ?ε
Λ °·
ra -= 02 ΟΪ ra K2 2W
W2 u. w
K«. O 2 e>< UJ CA L-ί
a_> E3 UJUjj _<c <2
OTO. (A 2 2 Uf J>
CA U. « o rai
E3 1 CA 2 O 2>
Uf (A UJ < I < U-ί OO
X_J w U. >_ > U 2
20 ZE_f o< u._> X2
OW ira >2 UJ w 2 UJ
20 2 W OOj UJ <5 rai
-J-l J> ww rai >
oo — O >> —> ra
22 22 <AW CL> 02
— O 22 CA CA ra > —
—. «. 2-f KK <2 K2
22 E3 ^f J ra 2<
2K W oz 0.2 > — 02
E! 02 <Q. O CA <W
02 <5 <X 2> K2
ra rai E3 (ufUff
<UI 20 KCL <w __f
ra >2 jtotoj ra
IW Uf > 02 CL W 20
|22| Ol Uf Ul O __< O Uf
O> Uf (A W (A }oo( L__J
KO w az <2 |oo| rai
pCTl 0.0 <2 ZE 2
U. W I1--11-! O ZE ra 1 w
po] w x 05 > — i o
w w 2 _J OO u_W 1 w
K>
El >_J >_»
-IX — u. w w (A 2 rO c ii
Figur<Q/ 6bn>
175 900
iO — •n o *n σ»
u> tb M *O CM *•7 o o
CM CM
< 5 cn cc X Z xui
cn ui UJK 0. o. fZ3
o. o 1— —1 Ul UJ < σ
Θ Z Ul UJ O- _j> oo 2u ui Z E3
P°1 χθ od Cr
X Ul X ui o. cn >
O cn oo > U- 5>
X o o cn 3 cn — >
<?» to oo 0*0 < > _l —» UJ Ul XX < < > > _ > OC cn [<<]
*O co tO U> *· -«r »O Ο» *· »O tO «Ο ΓΜ *O (M — IO IO cm rn O o» w to — Ό co to r- r*.
O O — > |ooj E3 x i
O o > > < OL· tn >- z I
U- u. O. O- (ZZ) |tn cn] 2 r
< > u-W > — _ > >_»
tucn oo >x o cn uj 5
Ul»“ 22 u__» ]<n tń] o cn
> OO OL· U. 2 _ oo
LU UJ w cn E3 < > u. u.
< < Ił—»— OO — oc j j
o o > K OC £C U. _j > X w Ow otn j 5
w > -ICC < < ero. KK o tn tno cn _i X X
OZ Ul -J oo > X oo _ > <2 > Z _> _J
>-> Li_j) WW
h- ł- >
H· W tn w -l-J
OX oo
E3 (zzl 3=5
— U_ KOL zz
oo O-> UJ tu
wen 22
U. _J wx <<
«ncn[ _»> oo
|ujuj| _łZ tuO
W X W_J w Ul
w> -IW ΕΞ3
XX 0__ x cn
2_J uiO UIX
x'z oo < —1
xtn <cx E3
o< (CO Z 2
o ł |_J __d _iw
X I 5 cc Θ
o I WZ tuz
tu 1 1 >- U. —1
> 1 tc> ><
O I x w w __
w 1 E3 UIX
> 1 UJK E3
> 1 xtn tu Z
[tu tu] xz _ -J
oo l°Q| < u
U._ł oz oo
>tn UIO w <
<o o< <x
w 5 (<3
_IU_ 5 cc <-»
X O x cn >- < X z X o X —I o< O UJ OK cn o _j2 <x
U. < 2 u_ O o
o <Λ Ό
to < —
oo <o en <n
tnz U. <
en cl OO
Z o od <
ac x < o
O_J Z <
-i2 2 Z
< Ul ox
OC J z >-
_J 1 gra
E3 o<
-JU-
O£C 1 u.
X < z en
□3
< -1 _i2
wx [oc^
>>
oo — —>
XX
I >
otn O ui
O< en w
P75 0=2
<o — X
-J> ox
X -1 tn tu
w <
XX O —
O Ul < W
cm m ο» σ» <<
2x
O-J >>
>_ _i5 i- <
XX
E3 x< X> xtu — 2 O<
E3 oo
UJ UJ u->- —
<o tn5 — -1
o E3 o> 1
u. 3= >·< xo _J Ϊ
OO OtU F^l wx
— —» 1 2 xz <-l
tn l Po] tu-1 xtn
tn I Otn o x<
X_l tuz
tuO xo b.5 x5
X >2 <tu
2>
X X XX X X oo
57x| >-> — < -J —
lxx| o cc u-2 xcn
_/> w> tuw
o >> tux XX
ZO <n_i t°°l xz
20 V>~i -.w x>
2 u. XX xtn xz
w>- ΙξξΙ — _J
h- W X z <>·
O 1U o < tn O Ul
< — <x > __ > —
1 2 o> xz
xcn zx gzi
X >- X u__ Ox
> _ w tn > _ i— cn 5> Z W < cn >- X
Λ S.
z. <
i i ff>
oo U- u. 55 oo i O Λ x z <
τ 1
Λ Z Ξ < χ t δ
i o __ o. 33 < -r »
O 1 σο χσ
O 1 2H O Ul
o t XX u. cd
Cd 1 > _ <x
O 1 u. _ ox
*n
Λ 8 ZL < Λ8 z. <
δ
175 900
Figuro^ 7a)
MTAEESQEQETQQPRIQłTVIiRLTPIKSŁFALLWAAAVaŁSIGLTY!fFTRKXFDTTGGNGKGDQPIVDDNSPSAEBŁRIiPTTIKPLTYDLVIKTYLPNYV
o ’ >« O ’ fi* o • X o • Ω o - 0? o • W o • F-ł o • H
o fr· o X o 2 o >* o δ o o o W
ca fr· <o £ ^P η to X to tt t- s €0 δ ra ω
X O > 02 Q fil E> 5
P 01 >4 > tt A o X
Ω X X 0) σ P Ω »
3 O O >· Ω frj η
0 S| fi* X Ł tt i4
A Ję X fi* »4 tt o fi*
2 tt α X fil δ δ X
o • P o * w o • X o • w o ·> o * £ O • o o • X
σ* 5 ra >· ra 3 Ok o ra ra fr4 ra fil ra t4
w H ca E <o >4 Tp o IO 5 to >· Ι- 02 CD >4
>4 &· w > X δ U tt
O w a A fi* A bd X
H 02 3 2 O 2 2 p
H H •4 H H r >
£ > > A fr· fi. tt X
H A tt £ Ot > δ X
X 3 α JC fr* Ω X
o • Ω o • H o • > O • A o • 2 o • tt Ο • fi. o • ra
CD fr· GD α GD X CD > CD CD 5 CD A CD >
ri H Cl P tn u ra to Λ •0 jg t- δ CD W •D
X tt 3 W 2 B X ra
O »v fil M O fil Kt tt M ω fc X
§ fi! fil 2 M X tt 2
W fil O P 3 »4 5 2
fr»
H o
tfr·
X
o - Ω o • z O •o O • X Ο • 2 ο -β ο •α ο • 2
r- fi* Γ- u r- α Γ- σ Γ- fi. Γ* ο Γ- Α Γ— 2
c< X ΓΟ p ΙΟ X ΙΟ 4 Γ- σ ΟΟ X ra A
fr« << 5 Ω u > — !> δ
fr* w X ra σ fi· ~“ t· κ
£> n Ε Η υ ra δ fi.
y Dl > σ Α χ ra — ra X
Ω o A 3 6» X - ρ 2
O u 3 ρ» X Ο X Ρ Η
ra 2 Ε X Η Ω —Ω Η
Ο • X ο - > ο • >« ο • 2 ο - α ο - 6« ο
to X to Η to fr· to Ω to Η to X 1Ο
ri •α ce Ο ro Η Η to Ε* <ο X Γ-
» Ω X X ο
GO —W o
to w
o t-Q
O to
C3 o
*$?
ce
ο • ο o • O • A— A O • X o - Ω ° ·£ o
to ra to IO >—£ to A to ra to > to
to ra <e> > to fil —fi· «0 X 1- CD Ω ra
fi* A fi· fie X 2
o <n o
to
o · Z O • X O • W O
rt p tn w tn h tn
w Ϊ» ca Ω tn O <·
o tn
IO o —o g-a fr» .1 fi» δ
w «
§
Ω fi» »0 §
fil o
fr>
H i
o H 3
o • X o • fio O • X O
•c 3 τρ X *P Ω
to r* W CD ra ra
c ra Ω
ję ra 2
ra X w
X p Ω
O P OI
fi· H >
X 02
o to to o
to rO tn co o
tn
Λ fr· fi»
Ω o fi· δ ra
5 β Ω > ra
o · > o ♦ 3 O - H O • 3 O • H O • Ω o
ci ω ci Ω Ci <2 ci o ca U ci ra ca
H £ Ci fr· ro A •P H to Q to X r-
X H X h ra
£
X o
c« fi· >«
Ω fi·
K o o 2 o · O O . 2 o • H o • Ω
< ri H ri rt tt ri H tt H Ω
fi· ca X <n **p X IO «c to X Γ- H
P fr· H A X 2 fr·
2 t* X s p A X
H *1 A P 2 X
X Q 3 s ra t* σ
X 2 X X X ra
>· Ω K ę H
X t· X 2 > ·<
O t-ł
CD
O • fi· <
W
Ω
O
O «
σ >
o • X υ s
»4 s
o - X
Ci ra
ra o
0· CU
o Φ
X X
Figurą, 7Ł>)
KTAEWgKKRILGFSPISLLCTLFyLAAAYaLSIGLTYYFTRK^FDTTOKESKDDaaaKEKDNSPSAEELLLPTNIKFYSYDLNIKTYLPaYyNFPPEKNL
175 900
FigurO/ 7c)
MTSQaRTRTLŁNLTPIRLIVALFŁVAftAV0Ł3XaiiT'SnrFTRKAFDTSBKPGKDDTG0KDKDNSPSAAZI.LLPSNIKPŁSTOLTIKTYLPaYVDFPPEKNL
175 900
Figurd 8
175 900
Figura 9a/» b, c/
175 900
Figura 9d/„ e/, f/
Wzorce
RNA d)_________
RNA
Stds kb
e).
Start i
iOrigin
9.5
7.5
O o
2.4
1.4
15 23
Q
11^ 15 23
15 23
175 900
Figura 10a/
175 900
175 900
Figura 11
Wzorce ciężaru częsteczkowegp
Wstawka Ml w pGEXl
W81 insert in pGEX1
B1A insert Wstawka B1A w pGEXl in pGEX1
MW
Stds
175 900
Figura 12
175 900
Aktywność enzymatyczna/ OD ne minutę Enzyme Activiiics/O.D.per minutę
Figura 13
Objętość re,tencji/ml £θ
Έ c o h o
Σ
Ό
O
Phe-pNA
Glu-pNA
Leu-pNA
Lys-pNA
Met-pNA uv@280nm
NaCl Gradient
kc3
«fe 33.4 * —r ‘ -'-i - ; - ·<- 4
&&
45 das>3ES?aSS7 ' , 3~ X: j , , \ »>-A u£s , Ά - Ύ-Α^ F „ ' '7 -X>t >7- Λ* ' ' 2 ί·7; > - . fz
A3 - , - ’ · -
<?
A= Molecular Wyzttjaczn ik i Weight cięĄaru Markers CΣąsteςzkowego
B- ConA H110D starting materiał materiał wyjśtjiowy
AB 0.25.0.5.1.5 1.6 1.7 1.8-1.9-2.0X25233.0 A Retcntion volume (ml) at which fraction was taken Objętość retencji» przy której pobierano frakcje
175 900
Figura 14
Numer frakcji
M.W. (kDa)
205π& _ Sł.-}·.
U 9 10 11 12 13 14 15 16 Fraction Number Numer frakcji
A= Molecular
Weight
Markers
A=Wyznaczniki ciężaru cząsteczkowego
-Ί, o > ©O £E3 (23 CD G23C3 OS) ro •H
7 8 9 10 11 12 13 14 15 Fractioh Number Numer frakcji
175 900
A=MoIecuIar WyznaczniWeight ki ciężaru Markers cząsteczkowego B=ConAH110D starting materiał materiał wyjściowy c ·»'*· ρc A Β 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Fraction Number c)
<
Numer frakcji
Fenyloalanina
Lizyna
Leucyna «i =>kwas gluta= minowy
Metionina
175 900
Figura 16 \ 8000 r )
Oznaczenie jaj pasożytów na gram kału Mean parasśte eggs per gram tfaeces
6000
2000
D = RF3 Doublei Dublet RF3 L = Lower band Pasmo niższe U = Upper band Pasmo wyższe
G = ConiroEs Kontrolne i— κ_Γ ........»
D U „ .r—:i.
L U+L
C
Numbers of raaEe and femaie worms presenS aS posS-mortem
Liczba robaków płci męskiej i żeńskiej stwier dzanych pośmiertnie
<?
U+L
175 900
Figura 17 □aja na gram/dziań Eggs per gram/day
Average parasite eggs per gram of faeces
Figura 18 j:
c
% ochrony
Współczynnik korelacji
Correlation coefficieot 0.5dj&
i 30 Ή n Ό h ίί ’ 2° 5<
X t C i o 10 &ę
0«0
20 30 40 50 60 70 80 90 100 * Protection % ochrony
Współczynnik korelacji
Correlation coefficient 0.7649
20 30 40 50 60 70 80 90 100 * Protection % ochrony Współczynnik korelacji
Correlation coefficient O.S743
b)iż)
1-ł •o o
«Η
Ή
JZ
C t-8 as
Z0
20 30 40 50 60 70 80 90 100 \ Protection .
% ochrony
175 900
Figura 19
175 900
Figura 20
.5-2 Smseit
promotor polihedryny
Figuie 21
Wzorce ciężaru cząsteczkowego
200
175 900
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków, lub pochodzące z nich części antygenowe, odpowiadających całym lub częściom sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 2,3 4 lub 5 (SEK NR ID: 1do 21) lub sekwencji kodujących aminopeptydazy robaków, które wykazują identyczność z wymienionymi sekwencjami w 50% lub więcej lub które hybrydyzują z dowolną z wymienionych sekwencji w warunkach 2 x SCC w temperaturze pokojowej (SCC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,2).
  2. 2. Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptyd zdolny do wywoływania produkcji ochronnych przeciwciał przeciw robakom pasożytniczym, które to sekwencje obejmują jeden lub więcej regionów kodujących determinantę antygenową z sekwencji kodujących aminopeptydazę, jak pokazane na figurach 2 34 i 5 (złożonych z sEk NR ID: 1 DO 21).
  3. 3. Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych, które odpowiadają lub które są komplementarne do jednej lub większej liczby sekwencji, wybranych z sekwencji klonów Ml, B1A, B1A-3', B2, M1AUS, AustBł, 014-014 (2.5PCR), 041-872 (3.5PCR klon 2), A-648 (koniec 5 B1), A-650 (koniec 5' 2.5 PCR), A-649 (koniec 5' 3.5PCR), 014-178 (koniec 3' AustB 1 klon 2), 014-178 (koniec 3'AustB 1 klony 3 i 6), 014-872 (3.5PCR klon 10) i 014-872 (3.5PCR klon 19), H11-1, H11-2 i H11-3, SEK NR ID: 1do 15 i 19 do 21, odpowiedmo, jak pokazane na fig. 2, 3, 4 i 5 lub jedną lub więcej sekwencji, które wykazują identyczność z wymienionymi sekwencjami w 50% lub więcej lub które hybrydyzują z dowolną z wymienionych sekwencji w warunkach 2 x SCC, w temperaturze pokojowej (SCC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,2).
  4. 4. Wektor ekspresyjny lub wektor do klonowania zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego, zdefiniowaną w dowolnym z zastrz. 1 do 3.
  5. 5. Prokariotyczna lub eukariotyczna komórka lub organizm transgeniczny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego, zdefiniowaną w dowolnym z zastrz. 1do 3.
PL93306028A 1992-05-08 1993-05-07 Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną,lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków lub pochodzące z nich części antygenowe wektor ekspresyjny i prokariotyczna lub enkariotyczna komórka PL175900B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929209993A GB9209993D0 (en) 1992-05-08 1992-05-08 Vaccines
PCT/GB1993/000943 WO1993023542A1 (en) 1992-05-08 1993-05-07 Recombinant dna molecules encoding aminopeptidase enzymes and their use in the preparation of vaccines against helminth infections

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL175900B1 true PL175900B1 (pl) 1999-03-31

Family

ID=10715227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93306028A PL175900B1 (pl) 1992-05-08 1993-05-07 Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną,lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków lub pochodzące z nich części antygenowe wektor ekspresyjny i prokariotyczna lub enkariotyczna komórka

Country Status (25)

Country Link
US (4) US6066503A (pl)
EP (1) EP0640133B1 (pl)
JP (1) JPH07508879A (pl)
CN (1) CN1053699C (pl)
AT (1) ATE195346T1 (pl)
AU (1) AU677582B2 (pl)
BG (1) BG62700B1 (pl)
CA (1) CA2134326A1 (pl)
CZ (1) CZ274494A3 (pl)
DE (1) DE69329195T2 (pl)
DK (1) DK0640133T3 (pl)
ES (1) ES2151506T3 (pl)
FI (1) FI945221A (pl)
GB (1) GB9209993D0 (pl)
GR (1) GR3034766T3 (pl)
HU (1) HU218041B (pl)
NO (1) NO944245L (pl)
NZ (1) NZ252221A (pl)
PL (1) PL175900B1 (pl)
PT (1) PT640133E (pl)
RO (1) RO117709B1 (pl)
RU (1) RU2140986C1 (pl)
SK (1) SK132394A3 (pl)
WO (1) WO1993023542A1 (pl)
ZA (1) ZA933216B (pl)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6099843A (en) * 1991-02-12 2000-08-08 Heska Corporation Parasitic helminth PLA2 proteins
US6210920B1 (en) 1991-12-13 2001-04-03 Heska Corporation Flea protease proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
US6150125A (en) 1991-12-13 2000-11-21 Heska Corporation Flea protease proteins and uses thereof
US6121035A (en) * 1991-12-13 2000-09-19 Heska Corporation Flea aminopeptidase proteins and uses thereof
US6146870A (en) * 1991-12-13 2000-11-14 Heska Corporation Flea protease proteins
US6156556A (en) * 1991-12-13 2000-12-05 Heska Corporation Flea protease proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
US5972645A (en) * 1991-12-13 1999-10-26 Heska Corporation Flea serine protease nucleic acid molecules
GB9209993D0 (en) * 1992-05-08 1992-06-24 Munn Edward A Vaccines
GB9302302D0 (en) * 1993-02-05 1993-03-24 Pitman Moore Inc Process
GB9303681D0 (en) * 1993-02-24 1993-04-14 Pitman Moore Inc Vaccines
GB9322702D0 (en) 1993-11-03 1993-12-22 Agricultural & Food Res Vaccines
BR9305075A (pt) * 1993-12-16 1995-08-08 Fundacao Oswaldo Cruz Antígeno para conferir imunidade protetora contra infecções helmínticas em humanos e animais,e processo de vacinação para aplicação na imunoprofilaxia de doenças helmintológicas de interesse veterinário e médico
US6214579B1 (en) 1994-10-18 2001-04-10 Heska Corporation Flea leucine aminopeptidase nucleic acid molecules and uses thereof
US6204010B1 (en) 1995-06-07 2001-03-20 Heska Corporation Flea protease proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
US6139840A (en) * 1995-10-18 2000-10-31 Heska Corporation Methods of eliciting an antibody response using flea protease proteins and homologs thereof
IL120704A0 (en) * 1996-04-24 1998-04-05 Heska Corp Flea protease proteins nucleic acid molecules and uses thereof
US20040006204A1 (en) 2002-04-02 2004-01-08 Miriam Tendler Synthetic active peptide fragments
US7951557B2 (en) 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
EP2150608B1 (en) 2007-05-07 2017-11-29 Protalix Ltd. Large scale disposable bioreactor
US20080294361A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Popp Shane M Intelligent execution system for the monitoring and execution of vaccine manufacturing
ES2325243B1 (es) 2008-02-27 2011-05-04 Universidad De Granada Antigeno recombinante.
US9052304B2 (en) 2009-03-13 2015-06-09 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
CN112961848B (zh) * 2021-02-24 2022-09-09 中国海洋大学 一种新型氨肽酶及其可溶性表达方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8619293D0 (en) * 1986-08-07 1986-09-17 Munn E A Anthelmintic agents
US4879213A (en) * 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
WO1990003433A1 (en) * 1988-09-26 1990-04-05 Biotechnology Australia Pty. Ltd. Vaccine
GB8906156D0 (en) 1989-03-17 1989-05-04 Munn Edward A Production and use of anthelmintic agents and protective immunogens
NL9001832A (nl) * 1990-08-16 1992-03-16 Rijksuniversiteit Specifieke sequenties van dna van een nematode die toegepast kunnen worden bij de diagnostiek van infektie met de nematode.
US5795768A (en) * 1991-02-12 1998-08-18 Heska Corporation Filariid nematode cysteine protease proteins, nucleic acid molecules and uses thereof
GB9209993D0 (en) * 1992-05-08 1992-06-24 Munn Edward A Vaccines
GB9302302D0 (en) * 1993-02-05 1993-03-24 Pitman Moore Inc Process

Also Published As

Publication number Publication date
EP0640133B1 (en) 2000-08-09
US6534638B1 (en) 2003-03-18
BG99246A (bg) 1995-07-28
EP0640133A1 (en) 1995-03-01
JPH07508879A (ja) 1995-10-05
US20030078398A1 (en) 2003-04-24
CN1053699C (zh) 2000-06-21
WO1993023542A1 (en) 1993-11-25
HU218041B (hu) 2000-05-28
CA2134326A1 (en) 1993-11-25
DE69329195T2 (de) 2001-04-05
AU677582B2 (en) 1997-05-01
AU4077593A (en) 1993-12-13
GR3034766T3 (en) 2001-02-28
ZA933216B (en) 1994-06-14
RO117709B1 (ro) 2002-06-28
US6066503A (en) 2000-05-23
HUT71847A (en) 1996-02-28
SK132394A3 (en) 1995-07-11
PT640133E (pt) 2000-12-29
DK0640133T3 (da) 2000-12-18
FI945221A0 (fi) 1994-11-07
CN1084563A (zh) 1994-03-30
ATE195346T1 (de) 2000-08-15
ES2151506T3 (es) 2001-01-01
CZ274494A3 (en) 1995-08-16
US20080145379A1 (en) 2008-06-19
NZ252221A (en) 1996-12-20
BG62700B1 (bg) 2000-05-31
FI945221A (fi) 1994-11-07
NO944245D0 (no) 1994-11-07
GB9209993D0 (en) 1992-06-24
RU2140986C1 (ru) 1999-11-10
DE69329195D1 (de) 2000-09-14
RU94046017A (ru) 1997-03-20
NO944245L (no) 1995-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL175900B1 (pl) Cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające jedną,lub więcej sekwencji nukleotydowych kodujących aminopeptydazy robaków lub pochodzące z nich części antygenowe wektor ekspresyjny i prokariotyczna lub enkariotyczna komórka
AU720355B2 (en) Binding domains from plasmodium vivax and plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins
HUT67362A (en) Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells
Martin et al. Identification and characterization of myophilin, a muscle-specific antigen of Echinococcus granulosus
US6676944B2 (en) Vaccine containing a peroxiredoxin and/or a β-tubulin
CA2135547A1 (en) Coccidiosis poultry vaccine
Mishra et al. Immunogenicity and sequence analysis of recombinant p58: a neutralization-sensitive, antigenically conserved Babesia bigemina merozoite surface protein
JP5055522B2 (ja) 多包条虫由来の新規蛋白質
JPH08127593A (ja) 家禽コクシジウム症ワクチン
US7279167B2 (en) Infectious Salmon Anaemia virus vaccine
JP4887144B2 (ja) バベシアワクチン
US6777247B2 (en) Nervous necrosis virus protein
US6710166B1 (en) 41 kDa Cryptosporidium parvum oocyst wall protein
US20030104003A1 (en) Novel surface protein of the malaria parasite plasmodium falciparum
US6514697B1 (en) Methods for detection of Crytosporidium species and isolates and for diagnosis of Cryptosporidium infections
KR20020077028A (ko) 샤페론 기능을 수행하는 신규 스트레스 단백질
US20240141028A1 (en) ANTIBODIES TO PfGARP KILL PLASMODIUM FALCIPARUM MALARIA PARASITES AND PROTECT AGAINST INFECTION AND SEVERE DISEASE
US20030165872A1 (en) Babesia canis vaccine
JP3692396B2 (ja) 豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）感染幼虫の１４ｋＤａ抗原、それをコードする核酸分子及びそれらの利用
JP6041238B2 (ja) ブリ細菌性溶血性黄疸の病原体抗原ポリペプチド、及びこれを含む水産用ワクチン
JP2002272487A (ja) 新規ｐｃｒＡ
IL147888A (en) Vaccine for rabies in animals from the canine family and methods for its preparation
JP2003199576A (ja) 豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原、それをコードする核酸分子及びそれらの利用
JPH11225779A (ja) ＭｕｒＥ