CZ274494A3 - Molecules of nucleic acids, vector for expression or cloning, synthetic polypeptides, process of their preparation, vaccine, use of the nucleic acid for the preparation of the vaccine and oligosaccharides - Google Patents

Description

Vynález se týká rekombinantních molekul DNA, které jsou kódovými molekulami pro aminopeptidázy, vektorů pro expresi nebo klonování s obsahem těchto nukleových kyselin a použití těchto nukleových kyselin při výrobě vakcín proti infekci parazity, zejména hlísty.

Dosavadní stav techniky

Parazitární infekce jsou zodpovědné za celou řadu onemocnění domácích zvířat, vedoucích ke ztrátě reprodukce a často k uhynutí zvířat a mají tedy velký ekonomický význam. Například parazit Haemonchus, který se živí krví, infikuje vazivovou tkáň žaludečního a střevního traktu přežvýkavců, způsobuje anemii a ztrátu hmotnosti a bez léčení často vede k uhynutí zvířete. Zvířata, infikovaná příbuzným parazitem Ostertagia rovněž neprospívají a v případě, že infekce není léčena, mohou uhynout. Také další paraziti mají ekonomický význam, jde například o Trichostrongylus a Nematodirus, způsobující záněty střevní sliznice u různých živočichů a také paraziti ze skupiny trematodů.

Značné problémy také vznikají při infekci různými nematody, jako jsou například měchovci, jako Necator, Ancylostoma, Uncinaria a čeleď Bunostomum a další podobné čeledi parazitů, jako Fasciola, Paramphistomum a Dicrocoelium, které kromě přežvýkavců a domácích zvířat mohou infikovat také člověka, často se smrtelným výsledkem.

- 2 Potlačení parazitů tohoto typu spočívá především v použití anthelmintik a také v různých opatřeních, která se týkají způsobu pastvy. Tyto postupy však mají řadu nevýhod. Jde především o nutnost častého podávání léčiv a také opatření, týkající se pastvy se často velmi nesnadno provádějí mimoto se objevuje řada kmenů, které již jsou odolné proti podávaným léčivům.

Bylo by proto zapotřebí nalézt účinnou vakcinaci pro ti těmto chorobám, v tomto směru již byly v posledních letech vyvíjeny intensivní snahy. Až dosud však nebyla připra véna žádná molekulární nebo podobná vakcína pro hlavní čele di, zvláště pro gastrointestinální nematody u přežvýkavců, jako jsou Haemonchus a Ostertagia.

Nejslibnější výsledky byly až dosud získány při použití nových bílkovin, izolovaných z Haemonchus, které jsou považovány za potenciální ochranné antigeny nejen proti Haemonchus, avšak také proti řadě dalších parazitů. Bylo prokázáno, že zvláště proteinový dublet H110D, který se nachází na povrchu vnitřního prostoru střev H. contortus, může vyvolat imunitu proti heamonchose u ovcí.

H11OD z H. contortus má přibližnou molekulovou hmotnost 110 000 za redukčních a neredukčních podmínek, jek bylo prokázáno elektroforézou na SDS-PAGZ a byl popsán v mezinárodních patentových přihláškách, zveřejněných pod Čísly W088/00835 a W090/11086. Pojem H110D je užíván k označení proteinového dubletu H110D, tak jak byl definován ve svrchu uvedených patentových přihláškách. V poslední době byly pro kázány odpovídající bílkoviny také v jiných čeledích, napři klad v čeledi Necator americanus.

V mezinárodní patentové přihlášce 7/058,/00635 je popsána řada metod pro čištění K110D, které jsou dostatečné pro zjištění vlastností této bílkoviny a je možr.c je pouzí“ k výrobě této bílkoviny v množství, dostatečném pro pokusné i komerční účely. Bylo by však zapotřebí nalézt dostatečný zdroj, z nějž by bylo možno získat nejen H110D ale saké příbuzné antigenní bílkoviny, zejména by bylo zapotřebí nalézt postup na bázi rekombinantni technologie DNA, kterým by bylo možno dosáhnout exprese těchto bílkovin v prokaryooických a/nebo eukaryotických organismech, vhodným způsobem transformovaných .

Vynález si klade za úkol navrhnout takový zlepšený postup. Byla provedena analýza řetězce cDNA pro H110D z Haemonchus contortus a bylo prokázáno, že zjištěný řetězec aminokyselin je homologní se skupinou aminopeptidáz, integrálních v různých membránách a systematickým názvem uváděných jako mikrosomální hydrolázy alfa-aminoacylpeptidů.

Aminopeptidázy, integrální v membránách ssavců jsou uloženy v řadě tkání, například v řasinkovém epitolu malých klků ve střevech a také v ledvinách. Jejich úloha v ledvinách není zcela jasná, avšak jejich funkcí ve střevech je štěpení malých peptidu, které jsou konečnými produkty v průběhu trávení, jak je zřejmé například ze souhrnných publikací Kenny a Maroux, 1982, Kenny a Turner, 1987, Nořen a další, 1986 a Semenza, 1986.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří molekuly nukleových kyselin, obsahující jeden nebo větší počet nukleotidových řetězců, které jsou kódovými řetězci pro aminopeptidázy hlístů nebo jejich antigenní části, v podstatě odpovídající celým nukleotidovým řetězcům nebo jejich částem, znázorněným na obr. 2, 3, 4 nebo 5 (řetězce č. 1 až 15) nebo může jít o řetězce, které jsou kódovými řetězci pro aminopeptidázy hlístů a jsou v podstatě homologní nebo hybridizují s kterýmkoliv -ze svrchu uvedených řetězců.

V případě nukleových kyselin podle vynálezu může tedy jít o DMA, cDNA nebo RMA s jednoduchým nebo s dvojitým řetězcem .

Variace v nukleotidových řetězcích, které jsou kódovými řetězci pro aminopeptidázy se mohou objevit mezi různými kmeny hlístů v rámci jedné čeledi, v různých stádiích životního cyklu hlístů, například mezi stadiem larvy a stadiem dospělého jedince, mezi podobnými kmeny různého zeměpisného původu a někdy také u stejných hlístů. Také tyto variace jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu.

V podstatě homologní jsou ty řetězce, které mají totožný řetězec na 50 a více procent, například na 50 % nebo více a také může jít o funkčně ekvivalentní allelové varianty a příbuzné řetězce, modifikované výměnou jedné nebo většího počtu baží nebo přidáním a/nebo vypuštěním některých baží. Pod pojmem funkčně ekvivalentní se rozumí řetězce nukleových kyselin, které jsou kódovými řetězci pro látky s účinností aminopeptidázy, přičemž tyto enzymy jsou podobným způsobem imunoreaktivní, to znamená, že vyvolávají u hostitele tvorbu ochranných protilátek proti hlístům.

Molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s řetězci na obr. 2, 3, 4 nebo 5 (jde o řetězce č. 1 až 15) nebo jakékoliv v podstatě homologní nebo funkčně ekvivalentní řetězce ve svrchu uvedeném významu jsou rovněž zahrnuty do rozsahu vynálezu. Pojem hybridizace definuje ty řetězce,

SSC/5C% formza málo cmeti nebo s výcmezuj íc í ch které se mohou za neomezujících podmínek (6 x amid při teplotě místnosti) vázat a být vymyty zujících podmínek (2 x SSC při teplotě místnos hodcu 2 x SSC při teplotě 42 °C) nebo za více podmínek, například 2 x SSC při 65 °C, kde SSC a 0,01511 cizrátu sodného o pH 7,2.

Způsoby pro výrobu takových derivátů uvedených řetězců, například cílená produkce mutací, szatistická produkce mutací nebo enzymatické štěpení a/nebo vazba nukleových kyselin jsou dobře známé stejně jako způsoby, jimiž je možno stanovit, zda takto modifikovaná nukleová kyselina má podstatnější homologii s určitým řetězcem, například může jít o hybridizaci.

Při použití nukleové kyseliny podle vynálezu je tedy možno připravit rekombinantní aminopeptidázy nebo imunogenní fragmenty těchto enzymů v množství, které až dosud nebylo dostupné, čímž je možno usnadnit vývoj vakcíny proti hlístům.

Podstatu vynálezu tedy tvoří molekuly nukleových kyselin, které obsahují jeden nebo větší počet nukleotidových řetězců, které jsou kódovými řetězci pro jeden nebo větší počet polypeptidů, schopných vyvolat tvorbu ochranných protilátek proti hlístům, přičemž tyto řetězce obsahují jednu nebo větší počet oblastí, určujících antigenní vlastnosti v kódových řetězcích pro aminopeptidázy z obr. 2, 3, 4 nebo 5 (řetězce č. 1 až 15).

Podstatu vynálezu tvoří také syntetické polypeptidy, obsahující jeden nebo větší počet řetězců aminokyselin, tvořících enzym aminopeptidázu nebo antigenní část tohoto enzymu, v podstatě odpovídající celému řetězci nebo dového řetězce z obr. 2, 3, 4 nebo 5 (řetěz nebo funkčně ekvivalentní variantě těchto ř od syntetického polypeptidu, odpovídají čího dubletu H110D nebo od syntetického poiypept jícího jakémukoliv jednotlivému polypeptido popsanému v přihlášce W090/11086.

část ce č .

ve mu i nukleot 1 až 15) ů, odlišn :coovica*-O i

Vynález se tedy týká také syntetických polypeptidu, které obsahují řetězce aminokyselin, tvořících .enzym aminopeptidázy nebo její antigenní část, v podstatě odpovídající celému řetězci nebo části nukleotidcvého řetězce z obr. 2, 3, 4 nebo 5 (řetězce č. 1 až 15) nebo může jít o funkčně ekvivalentní variantu takového řetězce, v podstatě prostou jiných složek Haemonchus contortus.

Vynález se dále týká vakcíny pro stimulaci imunologické odpovědi proti hlístům u člověka nebo u jiného živočicha, vakcína obsahuje alespoň jeden svrchu definovaný syn tetický pol-ypeptid spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska.

V mezinárodní patentové přihlášce W090/11086 se popisuje celá řada polypeptidů nebo částí polypeptidových řetězců, získaných proteolytickým rozštěpením nebo chemickým štěpením proteinového dubletu H110D, může jít o následující řetězce:

(a)	Met	Gly	Tyr Pro	Val	Val	Lys	Val Glu Glu
	Phe
(b)	Met	Gly	Phe Pro	Val	Leu	Thr	Val Glu Ser
(c)	Met	Gly/Phe Asn	Phe	Lys	Ile	Glu/Val Thr/Glu
	Ala	Gly
(d)	Met	Lys	Pro./Glu	Thr/Val	Lys	Asp/Ala Thr/Lvs
	Leu	- Ile	Thr				-

(e)	Met	Leu	Ala	Leu	Asp	Tyr	His	Ser - Phe	: Val
(f)	Met	Leu	Ala	Glu/Tyr	Asp	Gln/Ala Glu Asp Val
(g)	Met	Gly	Phe	Pro	Leu	Val	Thr	Val Glu	Ala
	Phe	Tyr
(h)	Met	Lys	Thr	Pro	Glu	Phe	Ala	Val/Leu	Gin
	Ala	Phe/Thr	Ala	Thr	Ser/Gly Phe Pro
(i)	Lys	His/Tyr	Asn/Val Ser Pro Ala Ala Glu
	Asn/Leu Leu	Asn/Gly
(j)	Lys	- Thr	Ser Val	Ala	i Glu	Ala	l Phe Asn
(k)	Lys	Ala	Ala	Glu	Val	Ala	Glu	Ala Phe	Asp -
	Ile	-	-	-	Lys	Gly
(1)	Lys	Ala	Val	Glu	Val/Pro	Ala	Glu Ala	Phe
	Asp	Asp	lle	Thr?	Tyr	-	-	Gly Pro	Ser
(m)	Lys	-	Glu	Glu	Thr	Glu	Ile	Phe Asn	Met
(n)	Lys	-	-	-	Pro	Phe	Asn/Asp Ile Glu Ala
	Leu
(°)	Asp	Gin	Ala	Phe	Ser	Thr	Asp	Ala Lys
(P)	Met	Gly	Tyr	Pro	Val	Val	Lys	Val Glu	Glu
	Phe	-Ala	Thr	Ala	Leu
Cg)	Met	Gly	Phe	Pro	Val	Leu	Thr	Val Glu	Ser -
	Tyr?	-	Thr
(r)	Met	Glu/Phe	Asn	Phe	Leu	Ile	Glu/Val	Thr/Glu
	Ala	Gly	-	lle	Thr
(s)	Met	Gly	Phe	Leu	Val	Thr	Val	Glu Ala	Phe
	Tyr	- Thr	Ser
(t)	Met	Lys	Thr	Pro	Glu	Phe	Ala	Val/Leu	Gin
	Ala	Phe/Thr	Ala Thr Ser/Gly Phe Pro
(u)	Met	Lys	Pro/Glu	Thr/Val	Leu	Asp/Ala Thr/Lys
	Leu	- Ile	Thr ·	Gly
(V)	Met	Leu	Ala	Leu	Asp	Tyr	His	Ser -	Phe Val
	Gly?
(w)	Met	Leu	Ala	Glu/Tyr	Asp	Gln/Ala Glu	Asp Val
(X)	Lys	His/Tyr	Asn/Val	Ser	Pro	Ala Ala	Glu
	Asn/Leu	Leu	Asn/Gly
(y)	Lys	- Thr	Ser Val	Ala	Glu	Ala Phe	Asn
(z)	Lys	Ala	Ala	Glu	Val	Ala	Glu	Ala Phs	> Asp
	lle	-	-	-	Lys	Gly			-

(aa)	Lys Asp	Ala Asp	Val Ile	Glu Thr'	Va1/Pro ? Tyr	Ala Glu Gly	Ala Pro	Phe Ser
(bb)	Lys		Glu	Gin	Thr Glu	Ile Phe	Asn	Ket
(cc)	Lys	-	-	-	Pro Phe	Asn/Asp	Ile	Glu
	Ala	Leu
(dd)	Asp	Gin	Ala	Phe	Ser Thr	Asp Ala	Lys
	Tam, kde nebylo	dosaženo j	istoty, je	tato	skutečnost
vy já	dřena	například	ve	formě Phe/Gly , kde	první	k o d ze tři

pišme znamená pravděpodobně správný zbytek aminokyseliny podle sily signálu, nebo byla nejistota znázorněna uvedením otazníku, popřípadě je formou naznačena, že běží o zbytek, jehož povaha dosud není známa.

Vynález se týká svrchu uvedených typů řetězců s výjimkou těch, které byly uvedeny v mezinárodní patentové přihlášce č. W090/11086.

Pod pojmem polypeptid jsou zahrnuty jak bílkoviny s plnou délkou, tak kratší řetězce peptidů.

Funkční ekvivalent se ve vztahu k polypeptidovému řetězci aminokyselin rozumí jako polypeptidový řetězec, příbuzný nebo odvozený od svrchu uvedených polypeptidových řetězců, přičemž řetězec aminokyselin byl modifikován substitucí jedné nebo většího počtu aminokyselin, jejich adicí nebo vypuštěním, může také jít o řetězce, v nichž byly aminokyseliny chemicky modifikovány včetně glykosylace nebo deglykosylace, avšak které si nicméně uchovávají protektivní antigenní nebo imunogenní účinnost. Takové funkčně ekvivalentní varianty se mohou vyskytovat jako přirozené biologické variace nebo je možno je připravit při použití známých postupů, je například možno připravit funkčně ekvivalentní rekcnbinantní polypeptidy při použití známých postupů pro cílenou produkci mutací, pro statistickou tvorbu mutací nebo enzymatickým štěpením a/nebo vazbou aminokyselin.

Syntetické polypeptióy podle vynálezu je možno obecně označit jako řetězce s ochranným antigenním účinkem.

Poč pojmem ochranný antigen, tak jak se v průběhu přihlášky používá, se rozumí antigeny, které jsou schopné u hostitele vyvdat ochrannou imunologickou odpověď, to znamená takovou odpověď, která vede ke vzniku imunologických efektorových buněk, molekul nebo protilátek, které poškozují, inhibují nebo usmrcují parazity a tím chrání hostitele od klinických nebo subklinických projevů onemocnění a od zhoršení celkového stavu. Taková ochranná imunologická odpověď se může za běžných okolností projevit tvorbou protilátek, schopných způsobit inhibici metabolických funkcí parazita, což vede ke zpomalení jeho růstu, vymizení produkce vajíček a/nebo uhynutí.

Syntetické polypeptidy podle vynálezu je možno připravit expresí v hostitelské buňce, která obsahuje rekombinantní molekulu DNA s nukleotidovým řetězcem ve svrchu uvedeném širokém významu, operativně vázaným na řetězec pro řízení exprese, nebo může jít o vektor pro klonování rekombinantní DNA s obsahem takové molekuly DNA. Exprese polypeptidů je možno dosáhnout také přímým vstřiknutím molekuly DNA podle vynálezu do hostitelské buňky.

Syntetické polypeptidy, k jejichž expresi tímto způsobem došlo, mohou být polypeptidy, získané fúzí a obsahující část, která je imunogenní a zahrnuje celou aminopeptidázu nebo její část a další polypeptid, pro nějž je kódem, uvedená DNA nebo rekombinantní molekula, s ní spojená. Může být například žádoucí získat složenou bílkovinu, která obsahuje syntetickou aminopeptidázu nebo jiný polypeptid podle vynálezu. _r vázaný na bílkovinu, například beta-galaktosidázu, fosfatázu, glutathion-S-transferázu, ureázu, antigen jádra hepatitidy B (Francis a další, 1989) a podobně. Většina složených bílkovin je získána expresí rekombinantního genu, v němž jsou spojeny dva kódové řetězce ve fázi ve čtecím rámci. Je však možno polypeptidy navázat také chemickým způsobem in vitro. Všechny takové deriváty molekuly nukleové kyseliny, která je kódem pro aminopeptidázu a její řetězce aminokyselin jsou do vynálezu zahrnuty. Technika pro expresi pro rekombinantní DNA a polypeptidu je popsána například v publikaci Sambrook a další, 1989. Syntetické polypeptidy je možno získat také chemickým způsobem, například známou Merrifieldovou syntézou na pevné fázi.

Vynález se rovněž týká použití svrchu definovaných molekul nukleových kyselin nebo syntetických peptidů nebo polypeptidu pro výrobu vakcíny pro stimulaci imunologické odpovědi u člověka a jiných živočichů, s výhodou u ssavců proti infekci hlísty.

Uvedené řetězce podle vynálezu je tedy možno využít ke stimulaci imunologické odpovědi u člověka nebo u jiných živočichů, s výhodou u ssavců proti infekci hlísty, k tomuto účelu se těmto živočichům podává vakcína, která obsahuje jeden nebo větší počet polypeptidu, pro něž jsou kódovými řetězci svrchu definované nukleotidové řetězce.

Vakcíny je možno připravit při použití postupů, které jsou pro výrobu vakcín obecně známé. Vakcína může obsahovat jeden nebo větší počet syntetických polypeptidu podle vynálezu a popřípadě jeden nebo větší počet vhodných pomocných prostředků, jako jsou například hydroxid hlinitý, saponin, QuilA nebo jeho vysoce čištěné formy, muramyldipeptid, minerální oleje nebo Novasomy a jeden nebo větší počet z farmaceutického hlediska přijatelných nosičů nebo ředidel. Vhodnými nosiči mohou být kapalná prostředí, například roztoky chloridu sodného, vhodné pro podání peptidů nebo polypeptidů nemocným. Prostředky mohou obsahovat ještě další složky, například konzervační činidla.

Vakcína může obsahovat virus nebo hostitelskou buňku, například mikroorganismus, může jít o virus vaccinis, o adenovirus nebo o Salmonelly, tyto organismy pak obsahují molekulu nukleové kyseliny, například molekulu DnA podle vynálezu pro stimulaci imunologické odpovědi proti polypeptidu, pro nějž je kódem uložená molekula nukleové kyseliny.

Vakcinu je možno podávat jakýmkoliv běžným způsobem, například perorálně nebo parenterálně, s výhodou nitrosvalovou injekcí, popřípadě v určitých intervalech, je například možno použít dvou injekcí, podaných v intervalech 7 až 28 dnů.

Jak již bylo uvedeno, řetězec aminokyselin, získaný z nukleotidového řetězce, znázorněného na obr. 2, 3, 4 nebo 5, má homologii řetězce se skupinou aminopeptidáz, které jsou integrovány v membránách. Tato skutečnost byla prokázána analýzou různých databazí, které jsou k dispozici v softwaru Genetics Comupter Group Sequence, verze 7.01, z listopadu 1991, jak je také uvedeno v publikaci Devereux a další, 1984, bylo použito translace řetězců z obr. 2, 3, nebo 5. Dvojí srovnání uvedeného typu je například znázor něno na obr. 6.

Exprese kódových řetězců pro aminopeptidázy podle vynálezu je možno dosáhnout při použití známých postupů a známých systémů pro expresi včetně použití prokaryotických buněk, například buněk E. coli a eukaryotických buněk, například kvasinek nebo systému hmyzích buněk, infikovaných

I

- 12 baculovirem nebo transformovaných buněk ssavců, použít je možno také transgenních živočichů a rostlin. Zvláště výhodné je dosáhnout exprese nukleotidových řetězců s použitím transgenických systémů nematodů, například systému pro nematoda Caenorhabditis, systém byl popsán například v publikacích Fire, 1986, Fire a další, 1989, Spieth a další, 1983, Han a další, 1990.

Vynález se týká také způsobu výroby syntetického polypeptidu, tak jak byl svrchu definován, postupuje se tak, že se pěstuje euxaryotická nebo prokaryotická buňka s obsahem svrchu definované molekuly nukleové kyseliny za podmínek, při nichž dochází k expresi a polypeptid, získaný tímto způsobem se izoluje.

Podstatu vynálezu tvoří také vektory pro klonování a expresi, které obsahují nukleotidové řetězce podle vynálezu. Takové vektory pro expresi zahrnují příslušné řídící řetězce, například řetězce pro translaci, jako kodony pro počátek a konec a také řídící prvky pro transkripci, například oblasti promotor-operátor, místa pro vazbu ribosomu, stop řetězce pro ukončení transkripce, tyto prvky jsou zařazeny ve čtecím rámci s molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu.

Vektory podle vynálezu zahrnují plasmidy a viry včetně bakteriofágů a eukaryotických virů, je možno je získat známým způsobem a dosáhnout exprese v celé řadě systémů pro expresi, jak je v oboru všeobecně známo. Vhodným virovým vektorem ve svrchu uvedeném smyslu je například baculovirus a také adenovirus a viry vaccinia. Je popsána ještě celá řada jiných virových vektorů.

Jsou známy různé postupy, které je možno použít pro uložení takových vektorů do prokaryotických nebo eukaryotických buněk k dosažení exprese nebo je možno tyco vektory uložit do zárodečné linie nebo do somatických buněk za vzniku transgenických živočichů. Vhodné postupy pro transformaci nebo transfekci jsou dostatečně popsány v literatuře.

Transformované eukaryotické nebo prokaryotioké hostitelské buňky, buňky po transfekci nebo transgenické organismy s obsahem nukleové kyseliny podle vynálezu, tak jak byla svrchu definována, tvoří rovněž součást podstaty vynálezu.

Obecně je možno uvést, že eukaryotické systémy pro expresi a zvláště systémy pro expresi z nematodů mají výhodu, která spočívá v tom, že může docházet k post-translačnímu zpracování a zvláště může dojít ke glykosylaci, přičemž v případě transgenického systému z nematodů tato glykosylace odpovídá zpracování, k němuž dochází v případě nativní bílkoviny. Tato skutečnost je velmi důležitým znakem způsobu pode vynálezu vzhledem k tomu, že v celé řadě případů je zapotřebí rekombinantní bílkovinu dále zpracovávat pro dosažení optimálního biologického účinku.

Exprese v systémech buněk ssavcu má také celou řadu výhod. Buněčný materiál ze ssavce může zajistit dobrou reprodukci nativní formy a protektivních epitopů antigenu vzhledem k tomu, že v eukaryotickém systému pro expresi bude docházet k příbuznějším způsobům glykosylace, ke vzniku disulfidových vazeb a dalších post-translačních modifikací nez v případě E. coli, kde může dojít k produkci nerozpustné bílkoviny, vyžadující další zpracování a vykazující nedostatečnou reprodukci v nativní formě. Mimoto při glykosylaci v buněčném materiálu ssavců patrně nebude docházet k vyvolání imunologické odpovědi, která snižuje protektivní odpověď proti bílkovině. V případě, že má být chráněn člověk nebo hospodářská zvířata, je tedy výhodné použít buněčné linie fibroblastů nebo myelomových buněk člověka nebo hospodářských zvířat, jako jsou linie HeLa-lidská buněčná linie, BHK-buněčná linie ledvin zárodku křečka, VĚRO, ledvinová buněčná linie opic, FR3T3-linie Fusherových fibroblastů krysy, NIH3T3-buněčná linie fibroblastů myši, C127I-buněčná linie nádoru mléčné žlázy myši, CV-l-buněČná linie ledvinových fibroblastů afriských zelených opic, 3T6-linie fibroblastů myších embryí, L-buňky-myší buněčná linie, CHO buněčná linie vaječníků čínského křečka, NSO, NS1, SP2 a další buněčné linie myšího myelomu a také buněčné linie krysího myelomu, jako YB2/0 a Y3.

Vektory, vhodné pro různé typy buněčných linií ssavců jsou známé. Obecně budou tyto vektory obsahovat promotor a/nebo zesilovač transkripce, operativně spojený s kódovým nukleotidovým řetězcem pro antigen nebo jeho fragment. Vhodnými promotory jsou například promotory typu SV40, například vektor PSVL, promotor z cytomegaloviru CMV, promotor myšího metallothioneinu I a dlouhý opakující se terminální řetězec viru nádoru myší mléčné žlázy. Vektor s výhodou obsahuje vhodné označení, například gen pro reduktázu dihydrofolátu nebo pro glutaminsyntetázu. Vektory těchto typů byly popsány ve zveřejněných mezinárodních přihláškách W086/05807, WO87/O4462, W089/01036 a W0/89/10404.

Transfekci hostitelských buněk je možno uskutečnit při použití standardních postupů, například při použití fosforečnanu vápenatého, DEAE dextranu, polybrenu, při použití fúze protoplastů, liposomů, přímé injekce, nebo otevření pórů působením elektrického proudu. Poslední z uvedených postupů je výhodný, způsoby transfekce buněčných linií ssavců při použití otevření pórů působením elektrického proudu bylo popsáno v publikaci Andreason a další, 1980. Obecně se lineární DNA do buněk ukládá snadněji než cirkulární DTiA.

Bylo prokázáno, že bílkovina H119D je jedinečným a neobvyklým způsobem glykcsylována, což patrně přispívá k imunologickému účinku vzhledem k tomu, že celá řada až dosud získaných monoklonálních protilátek proti H110D z Haemonchus rozpoznává uhlohydrátové epitopy, které mohou být velmi důležité při vývoji vhodné vakcíny.

Zvláště hyly prokázány následující zvláštnosti glykcsylace H110B z Heamonchus:

i) přibližně 65 % oligosacharidů je vázáno na atom dusíku, zbytek na atom kyslíku, ii) převážná část, například 48 % oligosacharidů, vázaného na atom dusíku je komplexního typu, iii) v podstatě veškterý oligosacharid, například více než 95 % této látky je prosté- náboje, iv) relativní molární obsah pro monosacharidy je N-acetylgalaktosamin 1,0, fukosa 3,6, galaktosa 4,1, glukosa 4,4, mannosa 6,2 a N-acetylglukosamin 5,2,

v) oligosacharidy, odlišné od hlavního oligosacharidů (označovaného jako oligosacharid D) jsou v podstatě odolné proti degradaci různými exoglykosidázami, jako jsou alfa-D-amnnosidáza, beta-D-mannosidáza, beta-D-glukosidáza, beta-D-galaktosidáza, alfa-D-galaktosidáza, alfa-L-fukosidáza, beta-D-xylosidáza a beta-D-N-acetylglukosaminidáza.

Oligosacharidy a glykoproteiny tohoto něž tvoří podstatu vynálezu.

Oligosacharid D glykoprcteinu HILU vázán přes atom dusíku a má novou szrukou: řer.a dvěma zbytky fukosy, spojenými vazbo; -1,2 s jádrem, tvořeným mannoso (N-aoezyl· ypu pak rov

Podstatu vynálezu tedy tvoří rovněž oligosacharid, který je možno vyjádřit vzorcem

Man a i

Man a i

Man 0-1,4 Glc NAc01,4 Glc Nac (Pucal)₂ a zvláště vzorcem:

Puc al

Man a l / \³ '

Man β i----> 4 GlcNAcHl---> 4 Glc Nac /6

Man α i al

Fuc a to zvláště v případě vazby na bílkovinu, například na rekombinantní bílkovinu, jako bílkovinu typu aminopeptidázy z hlístů nebo její antigenní fragment nebo v případě použití ke tvorbě antiidiotypických antigenů, zvláště pro imunizaci velmi mladých živočichů.

Živočišné glykoproteiny mají obvykle oligcsacnarid s vazbou fukosa-alfa-1,6, takže vazba fukosa-alfa-3 v oligosacharidu podle vynálezu je neobvyklá.

Vynález bude dále podrobněji popsán se zvláštním ohledem na bílkovinu H110D z Haemonchus contortus. Je nutno zdůraznit, že různými postupy, například histochemickými postupy a hybridisací DNA bylo možno prokázat ekvivalenty bílkoviny D11OD také v jiných čeledích parazitů. Je pravděpodobné, že bílkovina H110D je komplex, jehož tvorby se účastní větší počet genů a že mimoto může kódový nukleotidový řetězec jevit různé variace řetězce mezi různými kmeny a také v různých stádiích životního cyklu hlístů. Mimoto mohou existovat vícečetné formy enzymu, tak zvané isoenzymy, k jejichž expresi může docházet odlišným způsobem v různých stupních nebo v různých kmenech. Při těchto postupech byly řetězce DNA a tím také následné řetězce aminokyselin stanovovány z klonů cDNA a produktů PCR, získaných z mRNA, odpovídající genu pro H110D rekombinantní technologií s použitím DNA z různých zdrojů a v různých životních stádiích parasita H. contortus.

Analýza řetězce cDNA a produktů PCR umožnila identifikovat tři blízce příbuzné řetězce pro H110D, které byly označeny Hll-1 (řetězec č. 19), Hll-2 (řetězec č. 20) a Hll-3 (řetězec č. 21). Hll-1 je tvořen třemi překrývajícími se řetězci, klonem cDNA AustBl (řetězec č. 6), PCR-produktem A-648 (řetězec č. 9) a 3'-zakončením PCR-produktu 014-178 (řetězec č. 12). Řetězec Hll-2 obsahuje PCR-produkty A-650 a produkt o velikosti 2,5 kb (řetězce č. 10 a 7) .

Hll-3 obsahuje PCr-produkty o velikosti 3,5 kb a A-649 (řetězce č. 8 a 11). Specifické vztahy mezi jednotlivými analyzovanými typy cDNA a klony PCR-produktů a mezi Hll-1,

Hll-2 a Hll-3 jsou shrnuty na obr. 1 a podrobněji znázorněny na obr. 3, 4 a 5.

Rozdíly a variace v řetězcích, které byly získány z klonů cDNA a z PCR-produktů jsou zřejmé zejména z obr.

2, 3, 4 a 5 (řetězce č. 1 až také shrnuty v tabulce 1.	15 a 19 až 21)	) , výsledky	jsou
T a b	u 1 k a 1
Homologie odvozených řetězců	aminokyselin,	získaných	trans
lácí nukleotidových řetězců z	obr. 2
% podobnosti % totožnosti
Hll-1 : Hll-2	77	63
Hll-1 ·: Hll-3	79	65
Hll-2 : Hll-3	82	69

Rozdíly jsou patrně způsobeny odlišnými mRNA (ve skupině genů). Mimoto mohou být variace alespoň z části způsobeny různými variantami kódového řetězce pro H110D nebo mRNA, přítomné v různých stádiích životního cyklu nebo ve kmenech, lišících se zeměpisným původem.

V následující tabulce 2 jsou dále uvedeny stupně totožnosti a podobnosti mezi odpovídajícím odvozeným řetězcem aminokyselin a dvěma známými řetězci pro aminopeptidázy ssavců.

Tabulka 2

Homologie řetězce aminokyselin H110D, aminopeptidázv M (ApM; krysy a amir.cpeptidázy A (ApA) myši % podobnosti % totožnosti

Hll-1	: ApM	55	32
Hll-1	: ApA	55	31
Hll-2	: ApM	52	31
Hll-2	: ApA	54	31
Hll-3	: ApM	53	32
Hll-3	: ApA	52	30

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna mapa analyzované cDNA pro H110D z H. contortus a klonů PCR-pnoduktů a jejich vztahy a relativní .polohy v mRNA pro H110D.

Na obr. 2 je znázorněn nukleotidový řetězec H110D označený Hll-3 (řetězec č. 21, odvozený od klonovaných PCR produktů s řetězci č. 8 a 11 a klon cDNA M1AUS s řetězcem č. 5), dále Hll-2 (řetězec č. 20, odvozený od klonovaných PCR-produktů s řetězci 7 a 10) a Hll-1 (řetězec č. 19, odvozený od klonovaných PCR produktů s řetězci č. 9 a 12 a klon cDNA AustBl s řetězcem č. 6).

Na obr. 3 je znázorněn řetězec Hll-3 (řetězec č. 21 z obr. 2) spolu s klony cDNA Ml a M1AUS (řetězce č. 1 a 5)

Na obr. 4 je znázorněn řetězec Hll-2 (řetězece č.

z obr. 2) a klon cDNA B2 (řetězec č. 4).

- 20 Na obr. 5 je znázorněn řetězec Hll-1 (řetězec č. 19) a jeho srovnání s cDNA BIA a Aust B1 (řetězce č. 2 a 6).

Na obr. 6 jsou znázorněny a) odvezené řetězce aminokyselin (řetězce č. 22, 23 a 24) od řetězců DNA Hll-1, Hll-2 a Hll-3 z obr. 2, dále bi) a ii) jsou odvozené řetězce aminokyselin z Hll-3 ve srovnání se známým řetězcem aminokyselin pro aminopeptidázu M z krysích mikrosomů (Watt a další, 1989) a s řetězcem pro aminopeptidázu A z myších mikrosomů (Wu a další, 1990). Totožné úseky jsou v rámečcích, .pomlčky označují prostory, které byly zavedeny tak, aby bylo možno vyznačit homologii mezi srovnávanými řetězci. Je použít kód pro aminokyseliny s využitím jediného písmene pro každou aminokyselinu. Horizontální čára nad řetězcem označuje polohu transmembránové oblasti, hvězdičkami je znázorněna poloha části řetězce pro vazbu zinku. Stupně podobnosti jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

Na obr. 7 jsou srovnávány řetězce aminokyselin (označené Pep A, Pep B, Pep C, Pep D a Pep E), získané z CNBr a Lys-C-fragmentů bílkoviny H110D svrchu popsaným způsobem (podle mezinárodní patentové přihlášky W090/11086, polypeptidové řetězce a), b), e), k) a aa)), uvedeny jsou také tři nové řetězce (řetězce č. 16, 17 a 18) získané z bílkoviny H110D štěpením, elastázou nebo termolysinem při translaci

a) Hll-1, b) Hll-2 a c) Hll-3.

Na obr. 8 je znázorněn Western blot integrálních bílkovin membrány, které se nacházejí v extraktu dospělých jedinců Haemonchus sontortus po použití afinitních čištěných protilátek z potenciálních klonů H110D a) antigeny v extraktu Haemonchus s použitím smáčedla, rozpoznávané antiserem proti extraktu, b) protilátky, vymývané z téhož proužku jako v případě a) po opakované zkoušce proti blotu uvedeného extraktu, potvrzena je úspěšná eluce, c) protilátky stejné v případě b), schopná se vázat na klon Ml bílkoviny po expresi silně rozpoznávají oblast s velikostí 110 000 (a poměrně ostře ohraničený pás s molekulovou hmotností 205 000) a d) nedochází k vazbě protilátky v případě, že se spolu se sérem užije nerekcmbinantní bílkovina.

Na obr. 9 je znázorněn Northern blot pro čištěnou mRNA z Haemonchus contortus ve stáří 11, 15 a 23 dnů pc použití a) cDNA, klenu Ml (řetězec č. 1), b) cDNA, klon Ml AUS (řetězec č. 5), c) cDNA, klon BIA (řetězce č. 2 a 3), d) cDNA, klon AustBl (řetězec ě. 6), e) klonovaný PCR-produk 01^-372 (3,5 - 2, řetězec č. 8), a f) klonovaný PCR-produkt 014-015 (řetězec č. 7). Čísla 11, 15 a 23 označují stáří Haemonchus, z něhož byla získána mRNA.

Na obr. 10 je znázorněn Southern blot DNA-genomu Haemonchus contortus při použití cDNAm klonu M1AUS (řetězec č. 5), 31A (řetězce č. 2 a 3) a AustBl (řetězec č. 6) a PCR-produktů 014-872 (3,5 - 2, řetězec č. 8) a 014-015 (řetězec č. 7)..,

a) bloty byly promyty při mírně omezujících podmínkách,

b) bloty byly promyty při vysoce omezujících podmínkách.

V případě každého vzorku obsahovala dráha 1 vzorek lambdaDNA, rozštěpené HindlII jako označení nebo neobsahovala žádné označení, dráhy 2 a 3 obsahovaly DNA genomu Haemonchus, rozštěpenou enzymy EcoRI a HindlII.

Na obr. 11 je znázorněn Western blot rekombinantních složených bílkovin GST-M1 a GST-B1A, jako sonda byly použity protilátky proti elektroforeticky čištěné bílkovině H110D (H110DE), čištěné afinitní chromatografií.

Na obr. 12 je znázorněn Western blot antigenu ConA H110D, jako sonda bylo použito antisérum proti ConA H110D a antisérum proti rekombinantním složeným bílkovinám GST-M1 a GST-B1A.

Na obr. 13 jsou znázorněny a) výsledky analýzy bílkovin H11OD a aktivita enzymu aminopeptidázy ve frakcích, ktere byly získány čhromatografií na iontoměniči při použití ConA H11OD na sloupci MonoQ, b) SDS-PAGE pro frakce, znázorněné na obr. 13a).

Na obr. 14 jsou znázorněny

a) hodnoty pH při nichž byly získány frakce při pokusu se stanovením isoelektrického bodu,

b) elektřoforéza na SDS-PAGE za redukčních podmínek pro frakce z obr. 14a), spodní pás dubletu H11OD je ve frakci 6 a horní pás ve frakci 16, množství v jednotlivých frakcích se mění,

c) Western blot pro frakce, znázorněné na obr. 14b), jako sonda byly použity i) monoklonální protilátky TS 3/19,7 a ii) afinitní čhromatografií čištěné polyklonální protilátky proti Ml, kontrolní protilátky nevyvolaly žádnou zjistitelnou reakci.

Na obr. 15 jsou znázorněny a) hodnoty pH, při nichž byly získány frakce při dalším pokusu pro získání hodnoty isoelektrickéhobodu, b) elektroforéza na SDS-PAGE za redukčních podmínek pro frakce z obr. 15a), spodní pás dubletu H11OD se nechází ve frakcích 4 až 6 a spodní pás ve frakcích 16 až 18, množství v jednotlivých frakcích se mění, c) specifické účinnosti frakcí z obr. 15b) vzhledem k mikrosomální aminopeptidáze.

Na obr. 16 je znázorněna ochrana ovcí vakcinací při použiti odděleného horního pásu (U), spodního pásu (L), směsi pásů (U-rL) a dubletu (D) bílkoviny H11CD.

a) Kladení vajíček (počet vajíček na 1 g výkalů),

b) uhynulí červi relativně ve srovnání s kontrolami.

ha obr. 17 je znázorněna ochrana ovcí po vakcinaci při použití ve vodě rozpustného fragmentu HUS, získaného z bílkoviny H110D rozštěpením působením elastázy a při použití H11A, fragmentu, rozpustného ve smáčedle z bílkoviny K113D.

a) Kladení vajíček (počet vajíček na 1 g výkalů),

b) uhynulí červi relativně ve srovnání s kontrolami (C).

ha obr. 18 jsou znázorněny příklady vztahů mezi inhi bicí Ai), Bi) účinnosti, podobné aminopeptidáze M a Aii), Bii) účinnosti podobné aminopeptidáze A bílkoviny H110D po působení antisér jednotlivých ovcí, očkovaných bílkovinou H110D, ochrana byla měřena v případě Ai) a Aii) procentem redukce uhynulích červů a v případě Bi) a Bii) redukcí snížení počtu vajíček ve výkalech v procentech. Prázdné čtverečky znamenajá účinnost proti H110D, plné čtverečky účinnost proti ferritinu koně jako kontrolní látce.

Na obr. 19 je znázorněna histochemická lokalizace účinnosti enzymu aminipeptidázy u dospělých jedinců Haemonchus contortus, mikrofotografie zmrazených řezů dospělých samic Haemonchus contortus prokazují účinnost aminopeptidázy (červené reakční produkty se jeví jako tmavý pás, označený šipkou) ve spojení s mikroklky (mv) střeva (i). Žádná z dalších tkání, například pokožka (c), hypodermis (h), genitální systém (gt), nebo svalovina stěny (wm) neobsahovala enzym. Na obr. 19a byl jako substrát použit L-leucin-4-methoxy-beta-naftylamid, na obr. 19b byl jako substrát použit alfa-(4-methoxy-beta-naftylamid) kyseliny glutamové.

Na obr. 20 je znázorněna mapa PCR-produktu 3,5, klon 2 (řetězec č. 8) po subklonování ve vektoru pro expresi pBlue3acII z baculoviru.

Na obr. 21 je znázorněn Western blot extraktu z hmyzu Spodoptera frugiperda po infekci baculovirem, extrakt byl připraven z buněk (Sf)9 při použití protilátek proti H110DN jako sondy. U dvou klonovaných plaků, P3A a P4A došlo k expresi imunopositivní bílkoviny H110D v plné délce (označen šipkou), v případě kontrol nebylo možno expresi prokázat

Podstatu vynálezu tvoří také molekuly nukleovýcn kyselin, obsahující jeden nebo větší počet nukleotidových řetězců, v podstatě odpovídajících nebo v podstatě komplementárních k jednomu nebo většímu počtu řetězců z klonů Ml,

BIA, B1A-3', B2, M1AUS, AustBl, 014-015 (2,5 PCR), 014-872 (3,5 PCR klon 2), A-648 (5' -zakončení Bl), A-650 (5'-zakončení 2,5 PCR), A-649 (5'-zakončení 3,5 PCR), 014-178 (3'-zakončení AustBl, klon 2), 014-178 (3'-zakončení AustBl, klony 6 a 6), 014-872 (3,5 PCR, klon 10) a 014-872 (3,5 PCR, klon 19), Hll-1, Hll-2, a Hll-3, řetězce č. 1 až 15 a 19 až 21 z obr. 2,3, 4 a 5 nebo řetězce, které jsou s těmito řetězci v podstatě homologní, nebo které hybridizují s kterýmkoliv z uvedených řetězců.

Jak již bylo uvedeno, při srovnání řetězců různých svrchu uvedených klonů a počítačových databazí známých řetězců bylo možno prokázat podstatnou homologii pro skupinu mikrosomálních aminopeptidáz (Ec. 3.4.11.-). Enzymatické studie a studie, týkající se inhibitorů, prováděné s bílkovinou H110D a s jejími frakcemi potvrzují, že bílkovina je ve skutečnosti mikrosomální aminopeptidázou (mikrosomální hydrolázou alfa-aminoacylpeptidu). Tyto zkoušky dále prokázaly přítomnost účinnosti typu aminopeptidázy A a aminopepti dázy M, takže pro každou ze složek dubletu H110D je možno jednotlivě prokázat enzymatickou účinnost.

Byly také provedeny zkoušky s proteolytickým štěpením ílkoviny H11CD. Při použití enzymu elastázy bylo možno prokázat , že bílkovinu H110D lze částečně rozštěpit za vzniku dvcu frakcí, _;a to frakce, rozpustné ve smáčedlecb, která zůstává spojená s membránou a frakce, která je rozpustná ve vodě a byla označena HUS. HUS se vyskytuje ve formě dimeru bílkoviny, který je možno rozložit na dvě složky.

Je zajímavé, že bylo prokázáno, že ve vodě rozpustná frakce HUS má pouze účinnost typu amincpeptidázy M, kdežto frakce, která je rozpustná ve smáčedlecb, má pouze účinnost typu aminopeptidázy A.

V následujícím příkladu je podrobně popsána řada pokusů, které vedly ke stanovení řetězců, znázorněných na obr. 1 až 7.

Příklad provedení vynálezu

Metody

Konstrukce banky U.K. lambdaGTll

Izolace mRNA

0,5 g dospělých jedinců Haemonchus contortus původu UK, zmrazených v kapalném dusíku bylo rozdrceno v kapalném dusíku při použití předem zchlazeného moždíře a tlouku.

RNA byla z mletého materiálu extrahována při použití 10 objemů 4M guanidinhydrochloridu ve 25 mM citrátu sodného s obsahem 0,5 % sarkosylu a 0,7 %,2-menkaptoethanolu s následnou extrakcí fenolem a chloroformem při použití postupu podle publikace Chomczynski a Sacchi, 1987. Z tohoto materiálu byla připravena mRNA afinitní chromatografií na oligo dT celulose, dvakrát opakovanou podle publikace Maniatis a další, 1982, kvalita byla ověřena translací in vitro při použití zkušebního baličku s lyzátem retikulocytu králíka a S-methioninu (Amersham International plc) podle návodu výrobce. Tímto způsobem byly prokázány polypeptidy až do molekulové hmotnosti 120 000.

Příprava komplementární DNA

DNA, komplementární k prvnímu řetězci (cDNA) byla syntetizována z 1 mikrogramu mRNA při použití náhodné syntézy s použitím primeru a reverzní transkriptáz-y ptáků, druhý řetězec byl syntetizován při použití RNázy H a DNA polymerázy I z E. coli, načež byly upraveny 3'-přečnívájící konce při použití T4 DNA polymerázy způsobem podle publikace Gubler a Hoffman, 1983. Výtěžek cDNA s dvojitým řetězcem (ds) byl přibližně 400 ng z 1 mikrogramu mRNA. Tato ds cDNA byla analyzována elektroforézou na 1% agarozovém gelu a pak autoradiografií a bylo prokázáno, že její velikost je v rozmezí 0,2 až 9,4 kb, přičemž většina materiálu měla velikost v rozmezí 0,5-2,3 kb.

Klonování cDNA v lambdagtll

Vybraná cDNA bez vymezení velikosti molekul byla použita pro konstrukci banky v lambdagtll při použití systému pro klonování cDNA, zkušebního balíčku č. RPN 1280 (Amersham International plc) a zkušebního balíčku č. N 334, obsahující příslušné extrakty pro postup in vitro (Amersham Internationa plc) podle návodu výrobce, současně byly použity oligonukleotidové spojovníky se zakončením po štěpení enzymem EcoRI (5'GGAATTCC). Výsledná banka byla použita spolu s kmenem E. coli Y1090 v přítomnosti isopropylthio-beta-D-galaktosidu (IPTG) a 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktosidu (X-gal), za těchto podmínek se rekombinantní lambdagtll jeví jako čiré bílé plaky a přírodní lambdagtll se jeví jako modré plaky. Banka obsahovala 90 % bílých plaků a účinnost klonování byla vypočítána jako 4 x 10 jednotek pro tvorbu plaků, pfu/mikrogram cDNA, titr banky byl ó

x 10 pfu/ml. AnalýzA ONA ve 20 náhodně odebraných vzorcích prokázala průměrnou velikost uloženého řetězce 0,51 kb. Tento průměr byl však poněkud měněn přícomncstí jediného klonu s velikostí uloženého řetězce 3,5 kb. Většina uložený?: řetězců obsahovala více než 300 párů baží, bp. Pak byla tato banka lambdagtll bez amplifikace, odvozená od uvedené mRNA vyšetřena na imunologickou účinnost.

Příprava protilátek pro použití jako sondy

Antiserum proti bílkovinám, integrovaným v membráně

Z dospělých jedinců Haemonchus contortus (původu UK) byla vyjmuta střeva a homogenizována v ledovém fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,4 s obsahem 1 mM-· kyseliny ethylendiamintetracctové, EDTA a 1 mM fenylmethyIsulfonylfluoridu, PMSF. Homogenát byl 10 minut odstředován v mikroodstředivce a usazenina byla znovu uvedena do suspenze ve stejném pufru s obsahem 0,1 % objemových Tween 20. Po opakovaném odstředění byla usazenina znovu uvedena do suspenze v tomtéž pufru s obsahem 2 % objemových prostředku Triton X-100 a pak byla směs extrahována 2 hodiny při teplotě 4 °C. Extrakt byl odstředěn stejným způsobem jako svrchu, čímž byl získán supernatant, obsahující bílkovinu, typickou pro integrovanou bílkovinu v membráně, IMP.

Ovce byla hyperimunizována při použití IMP ve Freundově úplném pomocném prostředku FCA nitrosvalovou injekcí 50, 50, 120 a 130 mikrogramů IMP, injekce byly postupně v uvedeném pořadí podány v týdnech 0, 7, 11 a 15. Šest týdnů po poslední injekci bylo odebráno sérum a označeno EE-068.

Příprava integrálních bílkovin membrány extrakcí

Haemonchus contortus s použitím smáčedla

Extrakt byl připraven tak, že hlísti byli homogenizováni v 5 až 10 objemech P3S s obsahem 1 mi·! EDTA a 1 mM PMSr. Suspenze byla odstředěna při 10 000 g celkem 20 minut při teplotě 4 °C a usazenina byla promyta tímtéž pufrem s obsahem 0,1 % objemových prostředku Tween 20, pak byl materiál extrahován pěti objemy Tritonu X-100 v koncentraci 2 % objemová svrchu uvedeným způsobem. Supernatant byl znovu odstředěn 1 hodinu při 100 000 g a výsledný supernatant, obohacený o H110D a obsahující ještě další IMP, byl použit pro Western blot a pro přípravu nedenaturované bílkoviny H110D, jak bude dále uvedeno.

Příprhva H110D a protilátka proti H110DN, čištěná afinitním způsobem

Extrakt, obohacený H110D byl podroben afinitní chromatograf ii na ConA-agarose, pak byla provedena chromatografie na iontoměniči na sloupci MonoQ (podle patentových přihlášek W088/00835 a W090/11086). Čištěná bílkovina H110D byla nitrosvalově podána jehňatům ve FCA. Byly podány tři dávky po 100 mikrogramech v intervalu 3 týdny. Sérum bylo odebráno 4 týdny po poslední injekci a čištěno afinitním postupem absorpcí na sloupec, obsahující čištěnou bílkovinu H110D, vázanou na Sepharose (Pharmacia), aktivovanou bromkyanem. Vazba H110D na Sepharose, vazba antisera a eluce protilátek proti H110D byly uskutečněny podle instrukcí Pharmacia. Tyto protilátky, čištěné uvedeným afinitním způsobem byly označeny anti-HHODN. Písmeno N odlišuje tyto protilátky od protilátek, které byly produkovány proti denaturované, elektroforeticky čištěné bílkovině H110D, tyto protilátky byly označeny anti-HHODE.

Western blot

Western blot byl proveden obvyklým způsobem podle publikace Jonnstone a další, 1985.

Izolace a charakterizace klonů

Vyšetření banky lambdagtll (původ UX) na imunologickou účinnost

Pro zjištění imunologické účinnosti banky byl v podstatě použit postup, popsaný v publikaci Bowtell a další, 1986. Před použitím bylo sérum (EE-068) zbaveno protilátek proti E. coli absorpcí lyzátem a úplnými buňkami kmene E.

coli Y1090. Pak byla banka nanesena na plotny s E. coli _v „ 3

Y1090 v množství 10 pfu na jednu plotnu s průměrem 90 mm. Plotny byly převrstveny nitrocelulosovými filtry, impregnovanými IPTG a inkubovány přes noc. Filtry byly omyty TBST (50 mM tris o pH 7,4, 150 mM NaCl a 0,05 % objemových Tween 20) a pak byly blokovány koňským sérem v TBST s koncentrací 5 % objemových po dobu 2 hodiny. Pak bylo přidáno sérum EE-068, ředěné v poměru 1 : 200 v TBST s obsahem 5 % koňského séra a filtry byly inkubovány 4 hodiny za mírného kolébavého pohybu. Pak byly filtry znovu promyty TBST a inkiubovány spolu s koňskými protilátkami proti ovčímu

IjgG ', konjugovanými s peroxidázou z křenu, HRP v ředění 1 : 500 v TBST s obsahem 5 % objemových koňského séra po dobu 2 hodiny. (Anti-serum proti ovčímu IgG bylo získáno z koně, protilátka proti IgG ovce byla čištěna afinitní chromatografií na sloupci Sepharose s ovčím IgG a protilátky byly konjugovány s HRP podle publikace Nakane a Kawaoi, 1974). Filtry byly znovu promyty TBST a positivní plaky byly zjištěny při použití 0,6 mg/ml 3,3'-diaminobenzídinu (DAB) a 0,1% peroxidu vodíku (% objemová). Bylo odebráno

- 30 25 klonů s pravděpodobnou positivitou a tyto klony byly znovu sledovány na přítomnost protilátky proti afinitně čištěné bílkovině H110DN svrchu uvedeným způsobem. Po této druhé zkoušce bylo 5 rekombinantních klonů stále ještě positivních, přičemž u klonu, označeného Ml byl prokázán nejsilnější signál.

Afinitní čištění protilátky na rekombinantním fágu

Byly připraveny plotny se souvislou vrstvou buněk kmene E. coli Y1090 tak, že na každou plotnu bylo naneseno 10 pfu každého z klonů lambda, positivních na tvorbu protilátek nebo totéž množství nerekombinantního negativního kontrolního fágu lambdagtll. Plotny byly inkubovány 4 hodiny při teplotě 42 °C a pak na ně byly uloženy filtry, impregnované IPTG a plotny byly dále inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Pak byly filtry z ploten odstraněny a promyty TBST, načež byly blokovány koňským sérem v koncentraci 5 % objemových po dobu 1 hodiny. Pak byly filtry inkubovány 6 hodin v antiséru EE-068 v ředění 1 : 100, načež byly důkladně opláchnuty TBST. Vázané protilátky byly z filtrů vymyty při použití 2 x 2 ml elučního pufru (5 mM glycinu, 500 mM NaCl, 0,2% Tween 20, pH 2,3) po dobu 2 až 3 minuty pokaždé, načež byl materiál neutralizován přidáním 200 mikrolitrů 1M pufru tris-HCl o pH 7,4, materiál byl zředěn v poměru 1 : 200 a použit pro vyšetření imunologické účinnost metodou Western blot při použití obohaceného extraktu H110D.

Řetězce DNA v klonu Ml

Z klonu Ml byla izolována lambda DNA způsobem podle publikace Maniatis a další, 1982. Fragment s velikostí 2,38 kb po štěpení enzymy KpnI-Sstl, obsahující fragment

- 31 Ml o velikosti 300 bp se izoluje elektroforézou na gelu a pak čistí při použití zkušebního balíčku GENFCLEAN (Stratagene, C-ENECLEAN je chráněná slovní známka BI01C1) a pak se subklcnuj.e v plasmidu pBluescript II SK (Stratagene). Fragment po štěpení enzymem EcoRI se čistí stejným způsobem a pak se znovu subklonuje ve stejném vektoru.

Nukleotidový řetězec uloženého řetězce Ml se stanoví při použití balíčku pro analýzu řetězce T7 (Pharmacia, U.K.) při použití běžných i reversních primerů M13.

Příprava banky hlístu australského původu v lambdagtll a lambdaZAP

Izolace mRNA g dospělých jedinců Haemonchus contortus (australský kmen McMaster) bylo zmraženo v kapalném dusíku a pak mleto rovněž v kapalném dusíku a RNA byla extrahována horkým fenolem podle publikace Cordingley a další, 1983. Výtěžek RNA celkem byl 10,35 mg. Pak bylo 1,3 mg této RNA užito pro přípravu mRNA afinitní chromatografií na oligo dT celulose při použití dvojího čištění způsobem podle publikace Maniatis a další, 1982. Výtěžek mRNA byl 21,6 mikrogramů. Kvalita mRNA byla ověřena in vitro translací s použitím lyzátu retikolucytů králíka v přítomnosti S-methioninu (Amersham) podle návodu výrobce. Získaný produkt translace měl zřetelně odlišitelné pásy včetně pásu s velikostí vyšší než molekulová hmotnost 200 000, jak bylo prokázáno elektroforézou na SDS-polyakrylamindových gelech s následným provedením fluorografie.

- 32 Syntéza cDNA a příprava banky

Pro přípravu cDNA s použitím oligo dT nebo statistických primerů bylo užito 1 mikrogramu mP.NA a zkušebního balíčku pro syntézu cDNA (Amersham Internationa plc) podle návodu výrobce. Bylo získáno 115 ng ds cDNA. Tato cDNA byq p la analyzována elektroforézou po označení '“p na alkalickém agarosovém gelu podle instrukcí na zkušebním balíčku. Velikost řetězce cDNA, stanovená srovnáním s označením, k němž byl použit lambda-HindlII (New England Biolabs). byla 150 bp až více než 10 kb, přičemž většina řetězců produktu měla velikost v rozmezí 0,6 až 5 kb. Při použití oligo Dt-primerů a statistických primerů byly získané vzorky ds cDNA spojeny a navázány na přebytek spojovníků s obsahem 8 baží po štěpení EcoRI, 5 -GGAATTCC3' (New England Biolabs, číslo katalogu 1018) po označení gamma- p-ATP a T4-polynukleotidkinázou. Takto vázaná cDNA pak byla rozštěpena enzymem EcoR' a přebytečné spojovníky byly odstraněny chromatografií na Sepharose 4B (PHarmacia) způsobem podle publikace Maniatis a další, 1982. Frakce ze sloupce byly spojeny do dvou podílů, z nichž jeden obsahoval cDNA o větší velikosti než 2 kb a druhý cDNA s velikostí nižší než 2 kb. Každý podíl pak byl odděleně navázán na 1 mikrogram lambdaZapII po zpracová ní enzymem EcoRI a fosfatázou (Stratagene) a zpracován odděleně při použití balíčku Gigapck Gold (Stratagene). Při použití cDNA s větším řetězcem bylo získáno 1,3 x 10⁵ rekombinantních klonů, při použití cDNA s kratším řetězcem bylo získáno 1,4 x 10^ rekombinantních klonů, klony byly spojeny, čímž byla získána banka, obsahující 2,7 x 10⁵ klonů. Tato banka lambdaZap byla amplifikována při použití buněk XLl-Blue (Stratagene) a banky v množství 2 x 10⁴ pfu na jednu plotnu s průměrem 135 mm. Titr amplifikované banky byl 7 x 10⁷ pfu/ml.

<_z i -

Další 2 mikrogramy mRNA byly užity pro přípravu cDNA svrchu uvedeným způsobem, avšak jako primer byl použit pouze oligo dT. Výtěžek ds cDNA byl 740 ng. Tato cDNA byla zpracována BcoRI methylázou způsobem ocdle publikace Maniatis a další, 1982, pak byly v tomto případě spojovníky s 12 bázemi, (Ne:·.· England Biolabs, č. katalogu 1019). Po rozštěpení takto vázané cDNA působení BccRI byly všechny frakce ze sloupce Sepnarose 43, které obsahovaly cDNA spojeny a navázány na 2 mikrogramy lambdagtll po rozštěpení EcoRI a po zpracování fosfazázou (Stratagene). Vazná směs byla rozdělena na dva podíly, které byly zpracovány s použitím dvou podílů

Gigapack Gold (Stratagene) a získané materiály byly opět θ spojeny za vzniku banky lambdagtll s obsahem 7 x 10 pfu. Tato banka byla amplifikována při použití buněk ST9 a 5 x 10^ pfu na jednu plotnu s průměrem 135 mm. Titr amplifikované banky lambdagtll byl 4,5 x 10¹¹ pfu/ml.

Vyšetření banky lambdagtll z australských hlístů při použití antiséra proti H110D

Antiséra byla získána tak, že ovcím byla injekčně podána bílkovina H110D (původu UK) po elektroeluci z polyakrylamidového gelu po elektroforéze na SDS následujícím způsobem. ConA H110D, získaný podle zveřejněných patentových přihlášek WO 88/00835 a W0 90/11086 byl podroben elektroforéze na SDS polyakrylamidovém gelu podle publikace Laemmli, 1970, čímž byla získána bílkovina H110D. Po elektro foréze byla oblasr polyakrylamidového gelu s obsahem bílkoviny H110D vyříznuta, uložena do zařízení pro elektroeluci (Atto) a eluce byla prováděna 3 hodiny při 10 W. Bílkovina H110D, získaná elektroeluci a označena H110DB byla koncentrována v zařízení Centriprep 10 (Amicon) a pak byla uskutečněna výměna pufru na sloupci PD10 (Pharmacia), pufr byl

- 34 vyměněn za 50 mM uhličitan amonný s 0,07 % SDS, pak byl materiál smísen s pomocnými prostředky a injekčně podán ovcím. Imunoglobuliny ze sér byly vysráženy síranem amonným podle publikaCE Johnstone a Thorpe, 1982. Vysrážené protilátky byly znovu uvedeny do suspenze v množství 60 mg/ml ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem a roztok byl dialyzován proti roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem a pak zředěn v poměru 1 : 10 ve fyziologickém roztoku chloridu sočného s tris-pufrem (TBS) s obsahem 5 % hmotnostních práškovaného odtučněného mléka. 10 mg ConA H110D bylo rozpuštěno na roztok s obsahem 0,5 % SDS, roztok byl zahřát na 3 minuty na 100 °C a pak byl sušen na nitrocelulosovém filtru. Po promytí TBS s obsahem 0,2 % objemová Tween 20 a 0,5 % Tritonu X-100 (TBSTT) byl filtr inkubován 1 až 2 hodiny při teplotě místnosti s protilátkami proti H110DE. Po promývání filtru 2 hodiny při použití TBSTT byly vázané protilátky vymývány při použití 3 ml 0,1M glycinu, 0,15M chloridu sodného o pH 2,6 celkem 2 minuty, načež bylo pH roztoku okamžitě upraveno na neutrální přidáním 75 mikrolitrů 1,5 M tris o pH 8,0. Tyto protilátky, čištěné afinitním postupem a označené amti-HHODE byly použity k analýze 5 x 10 pfu banky cDNA lambdagtll z hlístů australského původu tak, jak již bylo popsáno svrchu.

x 10 rekombinantních klonů z banky lambdagtll, odvozené od australského hlísta Haemonchus contortus bylo vyšetřeno na imunologickou účinnost a byly izolovány tři positivní klony. Po dalším vyšetření byly dva z těchto rekombinantních klonů stále ještě positivní, tyto klony byly označeny BIA a B2.

Analýza řetězce z klonů BIA a B2 c y 1 z z z 31A a ně ICO ce byly a jejic líčku S

Uvedené dva klony byly rozštěpeny enzymem Ec skán jediný uložený úsek řetězce o přibližně 3 fragmenty, B2A o přibližně 431 bp, 325 o bp a B2C o přibližně 100 bp v případě 32. Ty subklonovány v plasmidu pBluescript SX (Str li řetězec byl analyzován při použití zkušebn equenase 2,0 (United States Biochemicals).

OH.

ρ ri o i to ře ne ) ího b

Exprese klonů Ml a BIA

Řetězce pro Ml (řetězec č. 1) a pro BIA (řetězce č.

a 3) byly pro dosažení exprese uloženy do E. coli při použití vektoru pGEX podle publikace Smith a Johnson, 1988.

Při použití tohoto vektoru je možno dosáhnout exprese bílkovin na C-terminálním zakončení glutathion-S-transferázy (GST) ze Schisostoma japonicum. Uložené řetězce Ml a BIA po rozštěpení enzymem EcoRI byly navázány na materiál pGEXl po rozštěpení EcoRI a po působení fosfatázy a pak byl výsledný produkt použit k transformaci E. coli, kmene JM101 podle publikace Maniatis a další, 1982. Z každé transformace bylo užito 8 vzorků a kultury po dvou ml byly pěstovány 6 hodin při teplotě 37 °C. Pak byl přidán IPTG k indukci syntézy složených bílkovin a inkubace pokračovala přes noc. Buněčný materiál byl oddělen odstředěním, rozrušen povarením v pufru pro odběr vzorku (Laemmli, 1974) a extrakty byly analyzovány elektroforézou na SDS-PAGE a metodou Western blot při použití ovčích protilátek, čištěných afinitním způsobem a specifických proti SDS denaturovanému dubletu H11OD (anti-HHODE, jak bylo uvedeno svrchu). Vázané protilátky byly prokázány při použití konjugátu alkalické fosfatázy s králičí protilátkou proti IgG ovce (Jackson Immunoresearch.) a pak následovala detekce pomocí 5-brom-4-chlor-3-indolyl36 fosfátu (BCIP) a tetrazoliové nitromcdři (N3T). Kultury imunopozitivních klonů pak byly pěstovány a indukovány svrchu uvedeným způsobem a pak rozrušeny pomocí ultrazvuku. Materiál po působení ultrazvuku byl rozcdělen na rozpustnou a nerozpustnou frakci odstředěním v odstředivce Servali RC-23 s rotorem HS4 30 minut při 7000 ot/min a oři teplotě 4 °C. Nerozpustné usazeniny byly znovu uvedeny do suspenze v Si·! močovině při použití ultrazvuku a vzorky jednotlivých frakcí byly podrobeny elektroforéze na SDS-PAGI. Bylo prokázáno, že složené bílkoviny se nacházejí v nerozpustné frakci inkluzních tělísek. Každý z těchto vzorků byl použit k vakcinaci dvou ovcí 3x po sobě, pro každou dávku bylo použito 150 mikrogramů složené bílkoviny ve Freundově pomocném prostředku. Pozitivní kontrolní ovce byly imunizovány nativní bílkovinou ConA H110D, negativní kontrolní ovce byly imunizovány solubilizovanou bílkovinou z E. coli s obsahem vektoru pGEX bez uloženého řetězce z Haemonchus. Séra z vakcinovaných ovcí byla analyzována metodou Western blot proti H1103

Vyšetření banky lambdaZAP australského původu při použití * hybridizace DNA s uloženými řetězci Ml a 31A

DNA plasmidů Ml a BIA (klonované v pBluescript) byly rozštěpeny enzymem EcoRI a uložené řetězce byly izolovány elektroforézou v TBE (tris-boritan-EDTA s ovsahem 89 mM tris-boritanu, 89 mM kyseliny borité a 2 mM EDTA, pH přibližně 8,3) v 1% agarozovém gelu, pak byl materiál čištěn při použití balíčku GENECLEAN. Izolace a čištění bylo opakováno tak, aby nedošlo ke kontaminaci sondy řetězce DNA plasmidu, který by hybridizoval s řetězcem lambdaZAP a tak nežádoucím způsobem zvýšil pozadí. Čištěné řetězce uložených DNA byly značeny pomocí alfa- P-dCTP při použití balíčku pro simulovanou translaci (Promega Biotech) podle návodu výrobce. Značená DNA byla oddělena od neuložené značené DNA chromatografií 'a sloupci za současného odstředění podle publikace Maniatis další, 1982. Na osm ploten s průměrem 135 mm s obsahem 5 ranky lambdaZAP bylo naneseno 10 pfu/plotna a vznikle platy byly přeneseny na nitrocelulosové filtry podle publikace lar.iatis a další, 1932. Po zahřívání ve vakuové peci 2 hcdity na teplotu 80 C byly filtry předem hybridizovány 2 hodiny a pak byly hybridizovány přes noc při teplotě 42 °C tak, ;ak bude dále popsáno v odstavcích, popisujících analýzu Southern blot. Byly analyzovány čtyři filtry se sondou Ml a čtyři filtry se sondou BIA. Filtry byly dvakrát omyty při soužití 2 x SSC s obsahem 0,5 % SDS, jednou 1 x SSC s obsahem 0,5 % SDS a pak ještě jednou 0,5 x SSC s obsahem 0,5 % 3DS, vždy při teplotě 50 °C a pak byla provedena autoradiografie. Byly odebrány potenciálně pozitivní plaky a znovu analyzovány při použití týchž sond. Zásobní fágy s vysokým titrem byly připraveny z pozitivních vzorků (byly označeny M1AUS pro Ml-hybridizující klon a AusBl pro BlA-hybridizující klon) a klony byly znovu uloženy do plasmidu pBluescript podle instrukcí výrobce lambdaZAP (Stratagene) při použití kmene ΒΒ4Έ. coli jako hostitelského kmene. Malá množství DNA plasmidu z výsledných kolonií bylo připraveno rozrušením buněk za alkalických podmínek podle publikace Maniatis a další, 1982, vzorky DNA pak byly rozštěpeny enzymem EcoRI. Materiál byl analyzován elektroforézou na agarozovém gelu.

Analýza uloženého řetězce v M1AUS

Analýza řetězce DNA byla provedena na čištěné DNA plasmidu pBluescript při použití balíčků s 2,0 Sequenázou (United States Biochemicals), postup byl prováděn podle národu výrobce. Nejprve byly užity primery pro zakončení řetězců vektoru. Údaje, získané z těchto reakcí byly užity pro konstrukci druhého páru primerů a z údajů, které byly získány pomocí druhých primerů byla uskutečněna konstrukce

- 38 třetího páru příměrů. Tímto způsobem byl analyzován celý řetězec DNA postupně od obou zakončení, 5'-zakončení i 3 -zakončení.

Analýza uloženého řetězce v Aust31

Tento řetězec byl analyzován při pcuži-í balíčku Sequenáza 2,0 T7 (USB Biochemicals) podle návodu výrobce obdobným způsobem jako v případě M1AUS.

PCR-reakce

Příprava cDNA mikrogram mRNA z H. contortus původu U.K. 11 dnů po infekci, připravené způsobem, popsaným pro dospělé hlísty se smísí s T17 adaptorem-primerem se vzorcem

5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3' v diethylpyrokarbonátu DEPC ve vodě, a pak se směs zahřívá 5 minut na 65 °C, načež se okamžitě uloží do ledu. Pak se přidá hydroxid methyl měďnatý do konečné koncentrace 28,6 mM a směs se inkubuje 3 minuty při teplotě místnosti. Pak se přidá 2-merkaptoethanol do konečné koncentrace 14,2 mM a směs se uloží do ledu. Aby bylo možno syntetizovat cDNA, byla přidána RNA-áza Guard (Pharmacia) v množství 1 jednotka/mikrolitr, pufr pro reverzní transkriptázu (Life Sciences) v běžné koncentraci, dATP, dGTP, dCTP a dTTP vždy do koncentrace 1 mM a referzní transkriptáza AMV (Life Sciences) v množství 2 jednotky/mikrolitr (jde vždy o konečné koncentrace). Vzorky byly inkubovány 75 minut při teplotě 41 °C a pak byly extrahovány fenolem a chloroformem a čištěny chromatografií na sloupci za současného odstředění podle publikace Maniatis a další, 1982. Čištěné reakční směsi byly 2,5x zředěny a uloženy při teplotě 4 °C.

PCR-amplifikace cDNA při použití příměru, specifických pro M1AUS tv.-.-reaxce cyiy provaaeny pri pcucici crcgramovate.néhc zařízení pro cyklické tepelné zpracování (?!. J. Researc lne.) . Reakční směs obsahovala 1 mikrclízr z 250 mikrolitrů zředěné cDNA, připravené svrchu uvedeným způsobem, 25 pmol prvního řetězce adaptoru-primeru T17, 25 pmol druhého řetěz ce amplifikačního primeru (může jít o primer na bázi poloh 855 až 884, 5' ACGGGTGTTCGGTTTCCGTAT 3' , nebo na bázi poloh 30 až 49, 5' C-CTGAATCTAACTCCAATCC 3' řetězce M1AUS, jde o řetězec č. 5) 1 x Taq pufr (Northumbria Biologicals Ltd) a 0,5 mM každého z dATP, dTTP, dGTP a DcTP v reakčním objemu 100 mikrolitrů, vzorky byly převrstveny 40 mikrolitry minerálního oleje k zábraně odpařování. Uvedená směs pak byla zahřívána 2 minuty v zařízení pro cyklické tepelné zpra cování na teplotu 95 °C a pak byla udržována na teplotě 72 °C. Při teéto teplotě byly přidány dvě jednotky Taq polymerázy (Northumbria Biologicals Ltd) a směs byla opatrně promíchána s dalšími reakčními složkami. Pak byl v zařízení pro tepelné zpracování uskutečněn následující program:

stupeň	1:	zahřívání	5 minut na	50 °C
stupeň	2:	zahřívání	40 minut na	72 °C
stupeň	3:	denaturace 40 sekund	při 94 °C
stupeň	4:	zahřívání	2 minuty na	50 °C
stupeň	5 :	zahřívání	3 minuty na	72 °C
stupeň	6:	39 cyklů	stupňů 3 až	5
stupeň	7:	konečné zahřívání 15	minut na 72
stupeň	8:	udržování	na 4 °C.

Tyto podmínky byly převzaty podle publikace Frohman a další, 1988.

Klonování PCR-produktů

PCR-produkty ze svrchu uvedených reakcí byly děleny elektroforézou na agarosovém gelu. Pásy DNA s velikostí přibližně 2,5 a 3,5 kb byly odděleny elektroelucí při pcužioí materiálu ze skelných vláken (Whatman), extrahovány fenolem a čištěny chromatografií na G50 (Pharmacia) podle publikace Sambrook a další, 1989. Čištěná DMA byla navázána na pT7Blue T-vekzor (Novagene) podle návodu výrobce.

Analýza řetězce produktů PCR o velikosti 2,5 kb'a 3,5 kb

Analýza řetězce DNA byla prováděna při použití balíčku Sequenase 2,0 (US Biochemicals) při postupu podél řetězce tak jak byl popsán svrchu při analýze řetězce M1AUS.

PCR-reakce pro 5'-zakončení

Příprava prvního řetězce cDNA mikrogram mRNA Haemonchus contortus původu UK 11 dnů po infekci, získané způsobem, popsaným pro dospělé hlísty byl smísen s konstantním primerem s řetězcem 5 AAIGAAAGCGGATGGCTTGAIGC 3' , který byl konstruován z konzervované oblasti v AustBl a s produkty 2,5 kb PCR a 3,5 kb PCR, jde o řetězce č. 6, 7 a 8. Směs byla zahřívána 5 minut na teplotu 65 °C, pak byla uložena do ledu a byl přidán hydroxid methylměďnatý do konečné koncentrace 28,6 mM Směs byla inkubována 5 minut při teplotě místnosti, pak byl přidán 2-merkaptoethanol do konečné koncentrace 14,2 mM a směs byla uložena do ledu. DNA prvního řetězce byla připravena při použití reakčních činidel ze systému 5' RACE (Gibco/BRL) v konečné koncentraci 20 mM Tris/HCl o pH 8,4, mM KCL, 2,5 mM MgClg, 100 mikrogramů/ml BSA, a 0,5 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Pak bylo přidáno ještě 200 jednotek reverzní transkriptázy Superscript a reakční směs byla inkubována 30 minut při teple hřáta ješte na 5 minut na teplotu 55 °C. Pak byla PhAáza H do konečné koncentrace 100 jednotek, směs byla inkubována ještě 10 minut při teple byla uložena do ledu. Pak byla cDNA čištěna na sloupci Glassmax (Gibco/BRL), získaný materiál byl pak uložen při teplotě -20 °C.

tě ^2 C a pak zao s > n’z i a r rican Τ' A

C a o ak

C-prcdloužení cDNA

1/5 prvního řetězce cDNA byla zahřívána 5 minut na 70 °C a pak byl materiál 1 minutu chlazen v ledu. Pak byla přidána reakční činidla ze systému 5RACB (Gibco/BRL) do konečné koncentrace 10 mM Tris/HCl o pH 8,4, 25 mM KOI,

1,25 mM MgClg, 50 mikrogramů/ml BSA a 0,2 mM dCTP. Pak bylo přidáno ještě 500 jednotek/ml terminální transferázy, reakční směs byla inkubována 10 minut při 37 °C, pak byla zahřátá na 15-minut na 70 °C a pak skladována v.-ledu.

PCR-amplifikace při použití specifických primerů AusBl,

2,5 kb PCR a 3,5 kb PCR

PCR-reakce byly prováděny na programovatelném zařízení pro cyklické tepelné zpracování (M. J. Research lne). Pro 3 -zakončení byl užit jeden z následujících tří primerů1. Primer, specifický pro PCR-produkt o 2,5 kb na bázi poloh 374 až 394, 5' TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA 3'.

2. Primer, specifický pro PCR produkt o 3,5 kb na bázi poloh 1210 až 1229, 5' CATCTTIAGTTATCTGACCAG 3'.

3. Primer, specifický pro klon AustBl cDNA na bázi poloh 357 až 377, 5' GACCATCGCTGATGAAGTCGG 3'.

Pro 5 -zakončení byl při této reakci použit společný primer pro zakotvení, který je možno vyjádřit řetězcem 5' OUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIZGGGIIGGGIIG 3' .

Každá reakční·. směs obsahovala 4 mikrolitry z 50 mikrolitru cDNA s C-prodlcužením, 25 pmol příslušných dvou primeru, lx pufr pro Taq polymerázu (Boehringer Mannheim) a 0,5 mM každého z dATP, DCTP, dGTP a dTTP, konečný objem vzorku byl 100 mikrolitru. Směs byla převrstvena 50 mikrolitry minerálního oleje a ve svrchu uvedeném zařízení zahřáta na 2 minuty na 95 C. Pak bylo k reakční směsi při teplotě 80 °C přidáno 0,6 jednotek Taq-polymerázy, načež byl zařazen následující program:

1. zahřívání 5 minut na 50 °C

2. extense 10 minut při 72 °C

3. denaturace 45 sekund při 94 °C

4. zahřívání 1 minutu na 50 °C

5. extenze 2,5 minut při 72 °C

6. 39 cyklů 3 až 5

7. extenze 15 minut při 72 °C

8. udržování na 4 °C.

Klonování 5-PCR produktu

PCR-produkty byly od sebe odděleny elektroforézou na agarozovém gelu a pásy s očekávanou velikostí přibližně 1,3 kb byly vyříznuty a DNA byla čištěna při použití balíčků GENECLEAN a navázána na PT7Blue T-vektor (Novagene) podle návodu výrobce.

PCR-reakce pro produkci 3 -zakončení AustBl

První řetězec, použitý pro cDMA byl řetězec, který byl popsán pro cDNA při použití spolu s primery M1AU3. Byl použit specifický primer na bázi polen 1414 až 1-35,

5' TCTTC-AAGAAATGAAAAAC-CTT 3' v AustBl s řetězcem č. £ spolu s T17-adaptorovým primerem, použitým pro PCR v případě M1AU3 reakce byla prováděna v zařízení pro cyklické tepelné zpracování (M. J. Research lne.). Reakční směs obsahovala 25 pne každého příměru, 2 mikrolitry cDNA, lx pufr pro Taq polymerázu (Boehringer Mannheim), 0,5 mMkaždého z dAT?, aCTR, dGTP a DTTP v konečném objemu 100 mikrolitrů. Směs byla převrstve na 50 mikrolitry minerálního oleje a zahřívána 2 minuty na teplotu 95 °C. Pak bylo přidáno 0,6 mikrolitrů Taq polymerázy a byl uskutečněn tentýž program jako v případě 5-Ρ0Ρ, tak jak bylo svrchu popsáno.

Klonování a analýza řetězce 3-produktu

Produkty PCR byly od sebe oděleny elektroforézou na agarozovém gelu a pás s očekávanou velikostí 1,3 kb byl vyříznut a DNA byla čištěna při použití balíčku GENECLEAN a navázána na PCR-Script (Stratagene) podle návodu výrobce.

Analýza řetězce klonovaných PCR-produktů

DNA z klonů, získaných PCR byla analyzována při použití balíčku Sequenáse 2,0 (United States Biochemcal) podle návodu výrobce. Svrchu uvedeným způsobem byly zkonstruovány oligonukleotidové primery postupně podél řetězce DNA pro jednotlivé klony současně od obou zakončení, 5'-zakončení i 3'-zakončení.

Analýza všech řetězců DNA

Řetězce byly analyzovány při použití Softwaru pro analýzu, řetězce GCG (.Genetics Computer Group) pcdle publikace Devereux a další, 1984.

Analýza Northern blot a Southern blot

Příprava Northern blot

Analýza Northern blot byla prováděna na formaldehydových gelech v podstatě podle publikace Maniatis a další, 1982. Vzorky mRNA z jedinců H. contortus ve stáří 11, 15 a 23 dmů byly zpracovány působením formaldehydu s koncentrací 17,5 % objemových a formamidu s koncentrací 50 % objemových v pufru MOPS (20 mM kyseliny 3-(N-morfolin)propansulfonové o pH 7,0, 8 mM octanu sodného, 1 mM EDTA) 15 minut při teplotě 65 °C, pak byly vzorky zchlazeny v ledu. Gely byly podrobeny elektroforéze v pufru MOPS a pak byl proveden blot na membrány z Duralonu pomocí kapilárního přenosu podle publikace Sambrook a další, 1989.

Příprava Southern blot g dospělých jedinců Haemonchus contortus byly po zmrazení v kapalném dusíku mlety na jemný prášek v kapalném dusíku. Prášek byl pak pomalu přidán ke 25 ml pufru pro roz rušení buněk s obsahem 0,05 M tris-HCl o pH 7, 0,1 M EDTA, % hmotnostní Sarkosylu a 0,05 mg/ml proteinázy K (Boehrin ger Mannheim) a vzniklá směs byla inkubována 2 hodiny při teplotě 65 °C. Pak byla suspenze extrahována dvakrát vždy jedním objemem fenolu s chloroformem, pak ještě dvakrát dvěma objemy chloroformu a pak byl materiál vysrážen ethanolem. Vysrážená DNA genomu byla znovu uvedena do suspenze ve 20 ml pufru Tris s EDTA (TE, pH 8) přes noc při teplotě 4 C na kolébající se podložce a pak byl materiál dialyzovan proti 1 litru pufru TE, který byl dvakrát vamšněn. RNA byla odstraněna inkubaci s RNAázou typ 1, prostou DNAazy (Sigma) v konečné koncentraci 20 mikrogramů/ml· po dobu 1 hodina při teplotě 37 °C, pak byla provedena extrakce fenolem a chloroformem, další extrakce chloroformu a materiál byl vysrážen ethanolem stejně jako svrchu. Vysrážená usazenina DNA genomu byla dvakrát promyta ethanolem s koncentrací 70 % objemových a znovu uvedena do suspenze v 1 ml TE stejným způsobem jako svrchu.

Pak byla DNA genomu rozštěpena enzymy EcoRI a HindlII (25 mikrogramů DNA pro každé štěpení) přes noc při teplotě 37 °C a pak byla provedena elektroforéza při použití 5 mikro gramů materiálu v jedné dráze na 1% agarozovém gelu v tris-acetátovém pufru. Gel byl použit pro analýzu Southern blot s použitím kapilárního přenosu podle publikace Maniatis a další, 1982 a membrány Hybond-N (Amersham International).

DNA byla na membránu fixována při použití ultrafialového světla podle doporučení výrobce.

Příprava sond

Plasmidy pBluescript s obsahem uložených řetězců M1AUS, BIA nebo AustBl byly rozštěpeny působením enzymu EcoRI. Plasmidy pT7Blue, obsahující uložený řetězec 3,5 kb PCR byly rozštěpeny enzymem BamHI a tytéž plasmidy, obsahující uložený řetězec 2,5 kb PCR byly rozštěpeny enzymy BamHI a Xball. Rozštěpený materiál byl podroben elektroforéze, uložené řetězce byly izolovány a radioaktivně označe32 ny pomoci alfa- P-dCTP a simulované translace svrchu uvedeným způsobem při analýze banky lambdaZAP.

Hybridizační podmínky

Podmínky pro Southerm blot

Membrány byly rozřezány na proužky a předem nybridizovány v hybridizačním pufru 3 hodiny při teplotě 2S °C svrchu uvedeným způsobem. Proužky Southern blot DNA genolu byla hybridizovány při použití každé ze svrchu uvedených sond přes noc při teplotě 28 °C, pak byly dvakrát omyty při teplotě místnosti 24 °C a pak ještě dvakrát při teplotě 42°C s použitím 2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS (mírně omezující podmínky) a pak byla provedena autoradiografie. Po vyvíjení autoradiografických záznamů byly proužky promyty za vysoce omezujících podmínek při použití 0,1 x SSC, 0,1% SDS při 65 °C a znovu byla provedena autoradiografie.

Podmínky pro Northern blot

Podmínky pro sondy Ml, M1AUS a BIA (řetězce č. 1, 5 a 2)

Jako sonda pro Northern blot mRNA z Haemonchus contortus ve stáří 11, 15 a 23 dnů byl nejprve užit uložený řetězec Ml. Filtr byl předem hybridizován 2 hodiny při 42 °C ve 2 x SSC (20 x SSC = 3 M NaCl, 0,3 M citrátu dosného o pH 7,2) s obsahem 5 x Denhardťs (0,1% Ficoll 400 (PHarmacia) 0,1% polyvinylpyrrolidon, 0,1% sérový albumin skotu, frakce V (Sigma Chemical Corp.)), 0,5% SDS (dodecylsíran sodný),

10% dextransulfát, 0,1 mg/ml DNA z varlat lososa a 50% deionisovaný formamid. Hybridizace na sondu byla uskutečněna v tomtéž pufru přes noc při teplotě 42 °C. Filtry byly dvakrát promývány 30 minut v 2 x SSC s obsahem 0,5% SDS a 50% formamidu, pak ještě dvakrát 30 minut ve 2 x SSC s obsahem 0,5% SDS a ještě dvakrát 30 minut ve 2 x SSC. První promytí bylo uskutečněno při teplotě 42 °C, zbývající při teplotě °C. Po autoradiografii byly membrány promyty ve vroucím 0,1% SDS a znovu podrobeny autoradiografi i tak, aby bylo možno ověřit odstranění sondy. Tentýž blot byl pak zpracová uleženým řetězcem MlAUS jako sondou, promyt a podroben auto radiografii. Po promytí bylo znovucvěře.no odstranění sondy, načež byl jako sonda použit uložený řetězec BIA. Blot byl pak zpracován stejně jako bude dále uvedeno.

Podmínky pro sondy AustBl, 2,5 kb a 3,5 kb PCP-produkty (řetězce č. 5, 7 a 8)

Northern blot byl hybridizován při použití uloženého řetězce AustBl a mírně omezujících podmínek tak, jak bylo popsáno při hybridizaci Southern blot. Po autoradiografii byla membrána promyta vroucím 0,1% SDS podle pokynů výrobce membrány (Amersham), pak byl jako sonda použit uložený řetězec 2,5 kb PCR (klon 2), po opětném promytí byl jako sonda použit uložený řetězec 3,5 kb PCR (klon 2).

Štěpení bílkoviny H110D a stanovení enzymatické účinnosti

Příprava H110D

Nativní bílkovina H110D (H110DN) byla připravena způsobem popsaným ve zveřejněných patentových přihláškách W088/00835 a W090/11086.

Příprava elastázového fragmentu HUS z bílkoviny H110D

Dospělí jedinci Haemonchus byli homogenizováni v 10 objemech ledového PBS s 0,02 % azidu sodíku a pak byl materiál odstředěn 20 minut při 13000 ot/min. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 10 objemech PBS s azidem, znovu homogenizována a bylo opakováno odstředění. Po resuspenzi v 50 mM pufru MOPS o pH 7,4 (objem suspenze je ml na každých 0,17 g.hlístů) a po předehřátí na 30 minut ua 37 °C se materiál z usazeniny rozštěpí působením elastázy po dobu 1 hodiny, užije se 800 mikrolitrů na 20 ml suspenze, vždy 1 mg/nil zásobního roztoku se doplní 1 mM HCl a mM vápenatých iontů. Štěpení se zastaví přidáním 3,4-dichlorisokumarinu, užije se 300 mikrolitrů zásobního roztoku 10 mM v DMSO na 20 ml rozštěpeného materiálu. Směs se pak odstředí 20 minut při 13000 ot/min, usazený materiál se uloží a supernatant se odstředí 1 hodinu a 20 minut v ultraodstředivce při 100 000 g. Výsledný supernatant se nanese na sloupec ConA, čímž se získají vazné frakce. Pro analýzu se tato frakce zpracovává elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a elektroforeticky se přenese na polyvinylidendifluuoridovou membránu Immobilon-P (Millipore), slabě zbarvenou modří Coomassie, vyřízne se pás o 105 000 a analyzuje se v automatickém zařízení pro analýzu aminokyselin v plynné fázi. Pro vakcinaci se frakce, vázané na ConA dále čistí zahuštěním a nanesením na sloupec Superose 12 (Pharmacia) , po této filtraci na gelu se odebírají frakce, které obsahují aminopeptidázu.

Štěpení H110D thermolysinem

H110D ve formě dubletu se čistí elektroelucí z 8% SDS-polyakrylamidového gelu, čímž se získá H110DE, jak bylo popsáno ve zveřejněné mezinárodní patentové přihlášce W090/11086, elektroelucí se získá dimerní forma s molekulovou hmotností těsně nad 200 000 (poskytující charakteristický dublet při 110 000 při opakované elektroforéze na SDS-PAGE), čímž se získá H110DE. Roztoky H11ODE se zahustí na 200 mikrolitrů, přidá se chlorid vápenatý do molární koncentrace 5 mM a směs se zahřeje na 37 °C. Pak se přidá čerstvě připravený roztok 1 mg/ml thermolysinu (v 1 mM HC1, 2 mil CaCl^) v poměru 0,1 mikrogram thermolysinu na 1 mikrogram H110DE. Směs se inkubuje 120 minut při teplouš 37 a pak se reakce zastaví přidáním 5 mikrolitrů 0,5M EDTA.

Fragmenty bílkoviny se oddělí elektrcforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu a materiál se elektroforeticky přenese na polyvinylidendifluoridcvou membránu (Immobilon-P, Millipore). Po barvení modří Coomassie se nejintenzivnějsi souvislé pásy vyříznou a analyzují v zařízení pro analýzu řetězce aminokyselin v plynné fázi.

Příprava frakce H11A bílkoviny H110D, obohacené o aminopeptidázu A

Usazený materiál, získaný po působení elastázy a po 20 minutovém odstředění při 17 000 g svrchu uvedeným způsobem se znovu uvede do suspenze v PBS při teplotě 4 °C, pak se znovu odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 1% Tween v PBS s azidem a pak se 1 hodinu míchá. Pak se suspenze odstředí po dobu 20 minut při 17 000 g a supernatant se odstraní. Usazenina se opakovaně extrahuje 1% Thesitem v PBS s azidem. Supernatanty po odstředění 20 minut při 17 OQOg se spojí a odstředí 1 hodinu a 20 minut v ultraodstředivce při 100 000 g. Supernatant se nanese na afinitní sloupec ConA (Affigel, Biorad) a navázaný materiál se vymývá a dále dělí chromatografií na iontoměniči MonoQ.

Stanovení enzymatické účinnosti

Účinnost alfa-aminoacylapeptidhydrolázy, (mikrosomální) aminopeptidázy v H110D je možno stanovit zkouškami v roztoku při použití L-leucinu, methioninu, fenylalaninu,

- 50 kyseliny alfa-glutamové a lysin-p-nitroanilidů (pNA). Všechny p-nitroanilidy aminokyselin jako substráty (s výjimkou kyseliny alfa-glutamové), byly získány od Sigma, Poole, Dorset UK, kyselina alfa-glutamová byla získána od Fluka, Dorset UK. Jednotlivé hydrofobní (leucin- nebo fenylalanin-) a jednotlivé aminokyseliny s nábojem (deriváz pNA kyseliny alfa-glutamové) jsou substráty pro aminopeptidázu ssavců M (ApM) a A (ApA) a byly zvoleny pro měření účinku inhibitoru enzymu a prostanovení inhibice účinnosti aminopeptidázy H110D v krevním séru.

a) Zkouška na mikroplotnách

Plotny mikro-ELISA (Dynatech Immulon 1, Virginia,

USA), a to jednotlivá vyhloubení těchto ploten byla naplněna 250 mikrolitry 50 mM HEPES nebo MOPS o pH 7, mimoto bylo přidáno 1 až 10 mikrolitrů zkoumané frakce. Plotny pak byly předem inkubovány 10 minut při teplotě 37 °C a pak bylo přidáno 10 mikrolitrů 25 mM p-nitroanilidu aminokyseliny jako substrátu na jedno vyhloubení. Pak byla měřena, optická hustota OD při 405 nm v čase 0 při použití odečítacího přístroje pro plotny ELISA a plotny pak byly inkubovány 15 až 30 minut při teplotě 37 °C. Konečné odečtení OD pak bylo provedeno stejným způsobem a byla vypočítána změna OD za minutu na mg bílkoviny.

b) Citlivost na inhibitor

Bylo použito postupu pro stanovení enzymu stejně jako v odstavci a) s tím rozdílem, že ke 250 mikrolitrů pufru plus 1 mg/ml ConA H110D byly přidány inhibitory a směs byla inkubována 10 minut při teplotě 37 °C, načež byly přidány substráty, leucin-pNA nebo kyselina alfa-glutamová-pNA). Inhibice v procentech byla vypočítána podle vztahu —x 100 = inhibice v %, x kde x = deltaOD/min pro enzym bez inhibitoru a y = deltaOD/min pro enzym s přidaným inhibitorem.

Jednotlivě bylo zkoušeno devět sloučenin s rozdílnou inhibici enzymu a to: amastatim betastatin (metalloproteáza, aminopeptidáza), 1,10 fenanthrolin, EDTA (Metalloproteáza), fosforamidon (metalloproteáza, thermolysin, kolagenáza), aprotinin (serinproreáza), pepstatin (proteáza kyseliny asparagové), PMSF (proteáza šeřinu a cysteinu) a E54 (proteáza cysteinu). Amastatin, bestatin, 1,10 fenanthrolin, PMSF a pepstatin byly získány od Sigma, Dorset, UK. Všechny ostatní inhibitory byly získány od Boehringer, Mannheim. Každý inhibitor byl použit ve dvou koncentracích, rovných nebo vyšších než maximální koncentrace, doporučená Boehringer, Mannheim.

c) Zkouška na inhibici enzymu působením antisera

Zkouška byla provedena stejně jako ve stupni a) svrchu s tím rozdílem, že byly použity dvě mikroplotny ÉLISA. Na jedné plotně bylo inkubováno 10 mikrolitrů ConA H110D (1 mg/ml) s 10 mikrolitry antisera od každé ovce 15 minut při teplotě 37 °C. Na druhé plotně bylo rovněž předem inkubováno 250 mikrolitrů HEPES/hydrogenuhličitanového pufru s 10 mikrolitry fenylalanin-pNA nebo alfa-glutamové kyseliny -pNA v jednom vyhloubení, rovněž 15 minut při teplotě 37 °C. Pak byly ke směsi pufru a substrátu přidány směsi ConA H110D-serum na druhé plotně pomocí vícečetné pipety. Pak byla·, stanovena hodnota deltaOD/min. Pro účely korelace byla vypočítána inhibice v procentech při použití vzorce, uvedeného svrchu v odstavci b), kde x znamená průměr deltaOD/min pro vyhloubení, obsahující enzym a sérum z negativních kontrolních ovcí (po vakcinaci ferritinem z koňské sleziny) a y = hodnota deltaOD/min pro vyhloubení, obsahující enzym a sérum z jednotlivých ovcí po vakcinaci HllOD. Pro účely korelace (obr...18) byla ochrana v procentech vypočítána při použití svrchu uvedeného vzorce, v němž x = průměrný počet vajíček v 1 g výkalů nebo celkový průměrný počet hlístů u kontrol a y = počet vajíček na 1 g výkalů u pokusných zvířat nebo počet hlístů u jednotlivých ovcí, které byly očkovány podáním HllOD.

Lokalizace enzymu histochemickým způsobem

Účinnost aminopeptidázy byla prokazována na zmrazených řezech s tlouštkou 10 mikrometrů z dospělých jedinců Heomonchus contortus při použití L-leucin-4-methoxy-beta-naftylamidu a 4-methoxy-beta-naftylamidu kyseliny alfa-L-glutamové jako substrátů při použití postupů podle publikací Nachlas a další, 1957, Nakane a další, 1974 a Lojda a další, 1980.

Exprese rekombinantního HllOD v eukaryotickém systému baculovirus-hmyzí buňka

Konstrukce plasmidu pro expresi

Svrchu uvedené 3,5-PCR-fragmenty byly získány amplifikací při použití oligo-dT-adaptoru (s obsahem místa působení Sáli) a oligonukleotidu 872, representujícíhd baze č.

až 49 v řetězci M1AUS a fragmenty byly klonovány ve vektoru pT7Blue. Klon pT73,5-2 je orientován tak, že sousedí s místem BamHI vícevazného spojovníku na svém 5-zakončení a s místy působení HindlII, Xbal a Sáli na svém 3 -zakončení. Řetězec na 5 -zakončení je možno charakterizovat následujícím způsobem:

BamHI η!-----oligo 872-----------!--3,5K----5' GG A1C CGA TTG CTG AAI CTA ACT CCA ATC C .......3'

Leu Asn Leu Phr Pro Ile .........

Hvězdička označuje 3' dT/dA přečnívající konec, užitý pro klonování ve vektoru pT7 Blue.

Pak byl 3,5 PCR klon 2 rozštěpen enzymem HindlII (jediné místo ve vícevazném spojovníku vektoru na 3-zakončení genu 3,5K) a konce byly vyplněny pomocí deoxynukleotidů při použití DNA polymerázy I (Klenowův fragment) podle publikace Maniatis a další, 1982. Na zarovnané konce byl navázán spojovník BamHI (5' CGGATCCG 3', New England Biolabs, č. v katalogu 1021) a byly vybrány klony s místem působení 3amHI navíc, u nichž bylo možno vyštěpit gen pro H11OD v celé délce jako fragment po rozštěpení enzymem BamHI. Fragment BamHI byl izolován elektroforézou na 0,6% agarosovém gelu v tris-acetátovém pufru s následným čištěním při použití balíčku GENECLEAN (BI0101). Tento postup byl proveden dvakrát. Čištěný fragment byl pak navázán na plasmid pBlueBac II po působení fosfatázy a rozštěpení BamHI (Invitrogen Corp.) a klony s uvedeným fragmentem ve správné orientaci (to znamená s 5 -zakončením 3,5 PCR klonu 2 pod řízením polyhedrinového promotoru baculovirus) byly stanoveny rozštěpením enzymy Nhel a Xbal. Výsledný plasmid byl částečně rozštěpen enzymem BamHI a zakončení byla vyplněna svrchu uvedeným způsobem.

Pak byl přidán spojovník Ncol, obsahující ATG (5'CCCATGGG 3', New England Biolabs, č. v katalogu 1040) a směs byla navázána. Klony, obsahující spojovník na 5’ zakončení s místem BamHI v 3,5 PCR klonu 2 a nikoliv na 3 zakončení byly stanoveny štěpením enzymem Ncol. Výsledný plasmid byl označen pBB3,5-2(N) a je schematicky znázorněn na obr. 19.

Tato konstrukce má za následek uložení ATG do čtecího rámce na 5'zakončení 3,5 PCR klonu 2 tak, aby mohla být zahájena translace. Dále je znázorněn výsledný řetězec s obsahem tohoto kodonu ATG:

BamHI--NcoIvazba-3amHI---—jí !-----ologo 872----------5'GGATCCCC ATG GGG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC C . .

Met Gly Ile Arg Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ile

V bílkovině po expresi budou scházet aminokyseliny 2 až 9 odpovídajícího řetězce H110D a navíc budou přítomny tři aminokyseliny řetězce spojovníku, který následuje bezprostředně po kodonu ATG.

Konstrukce rekombinantního baculoviru, obsahujícího řetězec pro H110D

Plasmid pBB3,5-2(N) byl užit k transfekci buněk Spodoptera frugiperda (Sf9), buňky byly získány od Invitrogen Corp. a postup byl prováděn s použitím lineárního viru pro polyhedrosu jader Autographica californica (ACNPV) a tato DNA i kationtové liposomy (Invitrogen Corp., modul pro transfekci), byly užity podle návodu výrobce. Buňky byly pěstovány na prostředí TC-1OO (Sigma), doplněném fetálním telecím sérem (CSL Ltd, sérum bylo inaktivováno 45 minut při teplotě 55 °C) a antibiotiky (penicilin/streptomycin, gentamycin, CSL Ltd.). Byla také provedena kontrolní transfekce s použitím plasmidu pBB3,5-2(N) s kodonem ATG, uloženým na 3 zakončení 3,5 PCR klonu 2. Rekombinantní plaky byly izolovány na bázi skutečnosti, že vektor pBlueBac II je rov55 něž kódovým řetězcem pro beta-galaktosidázu E. coli (beta-gal), postup byl prováděn tak, že X-gal byl uložen do převrstvující vrstvy agarosy v doporučené koncentraci. Pak byly jednotlivé plaky izolovány podle svého modrého zbarvení a byly ještě dvakrát čištěny, pc této době již souvislé vrstvy buněk nebyly kontaminovány divokým typem viru (což by se projevilo změněným tvarem jader). Čištěný virus byl označen 3,5-2-P2A, 3,5-2-P3A a 3,5-2-P4A a byl amplifikován před použitím dvojí opakovanou infekcí buněk Sf9. Flak, čištěný po této kontrolní transfekci byl označen 3,5-2-rev.

Průkaz exprese H110D v hmyzích buňkách, infikovaných rekombinantním baculovirem

Souvislé vrstvy buněk Sf9 (1 a 10° buněk v lahvích s objemem 25 ml) byly infikovány virem 3,5-2, divokým typem viru (wt), kontrolním virem, u nějž dochází k expresi beta-gal nebo nebyly vůbec infikovány. Po 4 dnech růstu při teplotě 26 °C byly souvislé vrstvy buněk uvolněny jemným potřásáním, buněčný materiál byl izolován odstředěním 10 minut při 2000 ot/min a usazeniny buněk byly rozrušeny trojím opakovaným zmrazením a roztátím. Rozrušený materiál byl uveden do suspenze v 500 mikrolitrech PBS a podíly po 25 mikrolitrech byly sledovány na účinnost ApM ve vyhloubeních na mikroplotnách.

Podíly rozrušeného materiálu po 15 mikrolitrech (3 x 10 buněk) byly podrobeny elektroforéze na denaturujícím 7,5% SDS-polyakrylamidovém gelu. Jeden ze vzorků byl pak zbarven modří Coomassie, aby bylo možno stanovit velikost exprese. Druhý vzorek byl analyzován metodou Western blot při použití sondy s protilátkou proti H110DN, jak již bylo popsáno svrchu.

- 56 Výsledky

Analýza imunopositivnícn klonů

Analýza afinity protilátek, čištěných na klenu iii

Byly připraveny afinitně čištěné protilátky, specifické pro každý z pěti klonů, positivních na protilátky a protilátky byly použity jako sondy při analýze extraktu, obohaceného o H110D metodou Western blot. Jak je. zřejmé z obr. 8, všech pět klonů rozpoznává dublet H110D. Avšak při reakci s klonem Ml byl pozorován nejsilnější signál (obr. 8d) ve srovnání s blotem negativní kontroly lambdagtll (obr. 8e). Tento klon byl proto dále analyzován.

Analýza Northern blot klonu Ml

Analýza Northern blot mRNA z Haemonchus contortus při použití uloženého řetězce Ml jako sondy je-znázorněn na obr. 9. Bylo možno pozorovat jediný pás mRNA o velikos ti přibližně 3,5 kb. Tato velikost je dostatečná k tomu, aby šlo o kódový řetězec pro bílkovinu s molekulovou hmotností přibližně 110 000.

Analýza řetězce klonu Ml

Analýza uvedené DNA po rozštěpení EcoRI prokázala, že velikost uloženého řetězce Ml je přibližně 300 bp. Byl stanoven řetězec DNA fragmentu Ml, který je znázorněn na obr. 3. Fragment obsahuje 295 párů baží při otevřeném čte cím rámci, začínajícím na bázi č. 3.

Analýza Northern blot klonu BIA

Analýza mRNA z Haemonchus contortus metodou Northern blot při použití sondy ve formě uloženého řetězce 51A je znázorněna na. obr. 9c. Stejně jako v příoadě NI je možno pozorovat jediný pás mRNA s velikostí přibližně 2,5 kb.

Analýza řetězce klonů BIA a 32

Klony BIA byly analyzovány (řetězce č. 2 a 3) a byl prokázán úplný řetězec (řetězec č. 2), který je na obr. 5 srovnáván s řetězcem pro Hll-1 (řetězec č. 19) a řetězcem pro AustBl (řetězec č. 6). Uložená část má délku 484 bp a od první baze má otevřený čtecí rámec. Byl analyzován řetězec všech tří fragmentů B2, vzniklých štěpením enzymem EcoRI úplný řetězec pro B2 (řetězec č. 4) má délku 581 bp a je znázorněn ve srovnání s řetězcem pro Hll-2 na obr. 4. Řetězec má otevřený čtecí rámec oč polohy 2 do polohy 213, stop kočon a nepřenášená oblast odpovídá oblasti produktu 2,5 kb PCR (řetězec č. 7).

Exprese Ml a BIA v E. coli

Při subklonování ve vektoru pro expresi GST byly získány klony, u nichž docházelo k expresi složených bílkovin o velikosti 38 000 až 40 000 v případě Ml a 45 000 v případě BIA. Tyto výsledky odpovídají předpověděné velikosti uvedených řetězců, jde o molekulovou hmotnost glutathion—S—transferázy. Obě složené bílkoviny velmi silně reagovaly při metodě Western blot s afinitně čištěnými protilátkami proti H110DE (obr. 11). K expresi složených bílkovin došlo ve formě nerozpustných inkluzních tělísek.

Tvorba protilátek u ovcí po vakcinaci Ml-GST a

B1A-GST složenými bílkovinami

Antisera z ovcí, jimž byly injekčně podány složené bílkoviny, byla zkoumána metodou Western blot proti H110D. Jak při podání GST-M1, tak při podání GST-D1A došlo ke tvorbě protilátek, které specificky rozpoznávaly dublet řillOD (obr. 12). Séra z negativních kontrolních ovcí tento dublet nerozpoznáváj í.

Izolace a stanovení vlastností klonů, vybraných hybridizací pomocí uložené DNA typu Ml nebo BIA

Pozitivní klon, hybridizující se sondou Ml byl označen M1AUS (řetězec č. 5), klon, hybridizující s BIA byl ozna· cen AustBl (řetězec č. 6). Štěpení čištěné DNA plasmidu enzymem EcoRI prokázal, že velikost uloženého řetězce je 900 bp pro M1AUS a přibližně 1,5 kb pro AusBl. Jak je zřejmé z obr. 9b a 9d, hybridizují při metodě Northern blot řetězce M1AUS i AustBl s mRNA téže velikosti přibližně 3,5 kb stejně jako Ml a BIA.

Analýza řetězce M1AUS

Úplná analýza fragmentu M1AUS byla uskutečněna při použití syntetických oligonukleotidů postupně podél celého řetězce DNA od obou konců. Analýza prokázala, že uložený řetězec M1AUS má velikost 948 bp, jak je znázorněno na obr. 3. Tento řetězec (řetězec č. 5) začíná kodonem ATG pro methionin a po celé své délce má otevřený čtecí rámec. Řetězec je o 19 párů baží delší než řetězec Ml na 5zakončení a o 634 bp delší na 3 zakončení. Řetězce, společné oběma klonům (baze 20 až 314) byly totožné a lišily se pouze dvěma nukleotidy ve třetím kodonu. Srovnání všech čtecích rámců z různých databazí prokázalo, že čtecí rámec, začínající ATG na bázi č. 1 je homologní s řetězci ze skupiny mikrosomálních aminopeptidáz.

Řetězec AustSl

Analýza celého řetězce fragmentu AustBl byla uskutečněna při použití syntetických oligonukleotidů postupně podél řetězce DNA od obou konců. Řetězec této DNA (řetězec č. 5) je znázorněn na obr. 5. Klon má délku 1689. bp a má otevřený čtecí rámec od zbytku č. 2. Tento řetězec tvoří část Hll-1, jak je zřejmé z obr. 1. Translace aminokyselin tohoto řetězce prokázala místo pro vazbu zinku, které je charakteristické pro enzym aminopeptidázu.

Amplifikace PCR cDNA pro mRNA H110D při použití primerů Ml AUS

Uvedená cDNA byla syntetizována z mRNA,.přičemž jako primer byl použit oligo-dT, obsahující řetězec adaptoru k usnadnění následného klonování a manipulace s DNA. Získaná cDNA pak byla užita k amplifikaci řetězce M1AUS pomocí PCR, přičemž jako primer pro 5 -zakončení byl použit syntetický oligonukleotid na bázi poloh 865 až 885. Byl amplifikován PCR-fragment o velikosti přibližně 2,5 kb. Jde přibližně o očekávanou velikost fragmentů na bázi známé velikosti mRNA a na bázi řetězce cDNA pro aminopeptidázu ssavců.

Druhá skupina PCR-reakcí byla uskutečněna při použití primeru v blízkosti 5'-zakončení M1AUS, baze 30 až 49.

Na agarosovém gelu byly prokázány čtyři pásy. Největší z nich s velikostí 3,5 kb odpovídá předpokládané velikosti pro produkt PCR.

Klonování a analýza řetězce produktů PCR o velikosti 2,5 kb a 3,5 kb při použití primerů M1AUS

PCR produkty o velikosti 2,5 kb a 3,5 kb byly klonovány a označeny 2,5 PCR (řetězec č. 7) a 3,5 PCR (řetězce č, 8, 15 a 15 pro klony č. 2, 10 a 19). Při metodě Northern blot hybridizovaly 2,5 PCR a 3,5 PCR (klon 2, 3,5 PCR-2) s mRNA o velikosti přibližně 3,5 kb (obr. 9e, f) stejným způsobem (vzhledem ke stáří Haemonchus, který byl použit pro získání mRNA) jako Ml, BIA, M1AUS a AustBl.

Analýza celého řetězce těchto klonů byla prováděna postupně při použití oligonukleotidu. Jak je zřejmé z obr.

1, je řetězec pro produkt o 2,5 kb (řetězec č. 7) částí řetězce pro Hll-2 (řetězec č. 20) a řetězec pro produkt o velikosti 3,5 kb (řetězec č. 8) tvoří hlavní část řetězce pro Hll-3 (řetězec č. 21). Translace aminokyselin pro oba tyto řetězce, znázorněná na obr. 6 prokazuje skupinu pro vazbu zinku, His Glu Xaa Xaa His Xaa Trp (HEXXHXW), která je charakteristická pro mikrosomální aminopeptidázy. ·'

Stanovení řetězce na 5'-zakončení PCR klonů

Odpovídající cDNA byla syntetizována při použití primerů, odpovídajících konzervovanému řetězci v klonu cDNA AustBl, 2,5 PCR a 3,5 PCR (řetězce č. 6, 7 a 8), tyto řetězce hybridizují s mRNA uvedených řetězců přibližně ve vzdálenosti 1,3 kb od 5 -zakončení. Tyto cDNA byly C-prodlouženy na 5 -zakončení a pak byly provedeny PCR reakce při použití univerzálního zakotvujícího primeru (A) pro 5'-zakončení a tří primerů, specifických pro každý z řetězců AUSTB1, 2,5 PCR a 3,5 PCR klon 2 (řetězce č. 6, 7, 8) na 3 -zakončení Při reakcích vznikly produkty s předpokládanou velikostí těsně pod 1,3 kb: 1301 bp (řetězec č. 9), 1280 bp (řetězec č. 10) a 1292 bp (řetězec č. 11). Všechny tři tyto řetězce mají nepřenášenou oblast na svém 5'-zakončeni, jak je zřejmé z obr. 2. Všechny tyto řetězce začínají stejnou počáteční částí o 22 párech baží, 5' GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG 3', který je znám jako vedoucí řetězec 1 (SL1) a nachází se v nepřenášené 5 -oblasti celé řady druhů nematodů, jak bylo popsáno v publikaci Huang a další, 1990. V řetězcích č. 9 a 10 se řetězec SL1 nachází bezprostředně před iniciačním kodonem ATG. V řetězci č. 11 se mezi řetězcem SL1 a iniciačním kodonem ATG nachází ještě 13 párů baží. Všechny tři řetězce mají úplný otevřený čtecí rámec.

Analýza řetězce AustB na 3^-zakončení PCR klonu

Při použití specifického primerů pro polohy 1414 až 1438 v AustBl (řetězec č. 6), bylo možno získat PCR produkt s pásem s předpověděnou velikostí přibližně 1,3 kb. Při analýze klonovaného pásu byly získány řetězce č. 12 a 13. Tyto řetězce měly otevřený čtecí rámec v rozsahu párů baží 1 až 615 a nepřenášenou oblast.

Analýza řetězce klonovaných PCR produktů

Na obr. 2 jsou uvedeny řetězce složených bílkovin, označených Hll-1, Hll-2 a Hll-3. Řetězec aminokyselin, odvozený od těchto řetězců je uveden na obr. 6a. Platnost předpověděné translace těchto řetězců DNA je v podstatě potvrzena analýzou řetězců aminokyselin pomocí Edmanovy degradace z CNBr a fragmentů po proteolytickém štěpení, jak je zřejmé z obr. 7. To znamená, že 27 zbytků z 29 zbytků N-terminálního řetězce Hll-S (řetězec č. 16) odpovídá řetězci Hll-2 v rozmezí zbytků 61 až 90, jak je zřejmé z obr. 7b. Odpovídající valin (V) v poloze 78 a glycin (G) v poloze 90 jsou charakteristické pro Hll-2 vzhledem k tomu, že Hll-3 obsahuje asparagin (N) v poloze 90 a Hll-1 obsahuje leucin (L) v poloze 86, která odpovídá v poloze 78 v Hll-2. Dva zbytky na N-terminálním zakončení řetězce aminokyselin Hll-S (řetězec č. 16) neodpovídají žádnému ze tří řetězců H110D, jak byly uvedeny. Je třeba uvést, že existují přesné identické úseky řetězců ve velmi podobných, avšak jinak odlišných řetězcích Pep A a B (které byly dříve popsány ve WO 90/11086) a Hll-2 a Hll-1 v oblasti zbytků 540 až 555. Podobně v oble.sti zbytků 450 - 470 obsahuje Pep D krátký řetězec, který přesně odpovídá Hll-2, kdežto podobný, avšak odlišný řetězec Pep E je bližší řetězci Hll-3.

Na obr. 6b je přenášený řetězec aminokyselin z jednoho z řetězců v jeho plné délce (Hll-3) srovnáván se dvěma· řetězci pro mikrosomální aminopeptidázu ssavců. Homologie přenášeného řetězce H110D s těmito aminopeptidázami je znázorněna tek, že totožné aminokyseliny jsou uzavřeny do rámečků. Charakteristickou skupinou aminokyselin pro mikrosomální aminopeptidázy je řetězec HEXXHXW, který je určen pro vazbu zinku podle publikací Jongeneel a další, 1989, Vallee a další, 1990, jak je znázorněno na obr. 6 hvězdičkami. Tento'řetězec, který je přítomen v přenášené oblasti Hll-1, Hll-2 a Hll-3, je konzervován ve všech mikrosomálních aminopeptidázách. Další vlastností, která je společná mikrosomálním aminopeptidázám ssavců a Haemonchus, je přítomnost poměrně krátké intracelulární oblasti, kterým je jediný transmembránový řetězec v blízkosti N-zakončení, mimoto je přítomno několik potenciálních míst pro glykosylaci. Úroveň homologie (podobnost 52 až 55 % a totožnost 30 až 32 %) Hll-1, Hll-2 a Hll-3 s mikrosomálními aminopeptidázami ssavců je znázorněna na obr. 2.

Analý:

Southern biol

Výsledky analýzy Southern blot při použití DNA. genomu H. contortus a různých H110D cDNA klonů a POR produktů jako sond jsou znázorněny na obr. 10. Pro všechny sondy je možno prokázat vicečetné pásy hybridizace, což je typické pro skupinu genů s obsahem většího počtu genů. Jak bylo očekáváno, je možno pro BIA a AustBl prokázat podobný typ hybridizace stejně jako pro M1AUS a 3,5 kb PCR. Avšak tyto typy se od sebe navzájem lišily a současně se lišily také od hybridizace pro 2,5 kb PCR, a to i za mírně omezujících podmínek, jak je znázorněno na obr. 10A, což odráží odlišné úrovně homologie mezi těmito třemi řetězci cDNA.

Průkaz účinnosti typu aminopeptidázy pro H110D

Účinnost typu mikrosomální aminopeptidázy byla prokázána pro ty frakce, které obsahovaly H11OD, to znamená pro supernatanty po extrakci Thesitu v ultraodstředivce, pro frakce po vazbě ConA (ConA H110D) a také pro ty' frakce s obsahem H110D, které byly získány chromatografií na iontoměniči při.použití sloupce MonoQ, jak je zřejmé z následující tabulky 3. Specifická účinnost se v případě všech zkoumaných substrátů zvyšovala souběžně s čistotou H11OD.

Tabulka 3

Enzymatická účinnost frakcí typické šarže K110D frakce specifická účinnost enzymu (O.D./min/mg bílkoviny) feny1alanin -pNA leucin lysin -pNA -pNA kyselina methionin alfa-glu- -pNA tamová-pNA .fyziologický roztok IJaCl s fosfátovým

pufrem (PBS)	0,20	0,08	0,12	0,01	0,16
Tween 20(PBS)	0,15	0,15	0,09	0,01	0,09
Thesit/PBS	1,94	1,25	0,57	0,64	1,91
ConA H110D	4,08	3,01	1,43	2,09	3,84
GamQ H110D	6,55	5,01	3,01	3,90	6,41

Účinek inhibitorů aminopeptidáz ssavců na účinnost aminopeptidázy H110D

Přidání inhibitoru bestatinu, který inhibuje mikrosomální aminopeptidázu ssavců ke ConA H110D v koncentraci doporučené výrobcem (Boehringer Manngeim) snížilo účinnost proti leucin-p-nitroanilidu o přibližně 70 %. Byla provedena řada pokusů s různými inhibitory proteáz. Inhibiční účinek měly ty inhibitory, které jsou specifické pro metalloproteázy nebo aminopeptidázy. Účinek těchto inhibitorů na rychlost reakce je uveden v následující tabulce 4. Nejúčinnější byl fenanthrolin v koncentraci 5 mM.

substrát pro aminopeptidázu

Ό O

O

O 3 H· 3 o n o •o rf I—'· CL 0' N c

>

ω m w c/i

2> o < <

o o

O c·

^4	ι—i	R	σ	>
o	-	σ	o	ΣΖ
o	—J	H	ω	5
H	O	>	cr	00
O			□
o	R		rr	ó
o	O		i—.
g	3		Zj	h—
H·	0			3
r\	3
O	rf
3	3·
	O
	O
	U-l
	H·
	3

tr t—* O O c c 3 2 o σ> o o c c 2 2 tn

O O c c 2 S

X o

o o

o

ΓίΤ

O

O

O

Ό i—' (—‘ cn co no i—> ι-- Ό ω no cn ω

CO XO	H
— << 1	3
C 01 3	3·
rr O H·	H·
21 —1 rr	σ
3 H. -5	κ·
0 3 0	O
< << 23	O
O' 3
HO H·	<
t—' t->
R H·
21 CL

I <! O σ> co σ> σ> co ω σ> o σ> ι

	H·
O 1	3
C 3	σ
O H-	Η·
H· cf	σ
3 O	Η·
C O	Ο
.Ml	ο
3
H-	<
>—<
H-
a

Inhibice účinku aminopeptidázy H110D různými inhibitory proteáz

Subfrakcionace H11OD

Distribuce účinnosti ve frakcích po chromatografi i ConAHllOD na sloupci iontoměniče McnoQ je znázorněna na obr. 13a, elektroforéza na SDS-PAGE pro jednotlivě frakce je znázorněna na obr. 13b.

Enzymatická účinnost byla spojena s podíly frakcí H11OD, které bylo možno od sebe oddělit opakovaným stanovením isoelektrického bodu, jak je znázorněno na obr. 14 a 15. Při nižších hodnotách pí (pH 4,5) obsahují tyto podíly pouze větší z pásů, tvořících dublet H110D při elektroforéze na SDS-PAGE a při vyšších hodnotách (pH 6,5) obsahují tyto podíly pouze menší z pásů pro dublet H110D. Mezifrakce obsahují oba tyto pásy. Menší pás může být také získán jako samostatná frakce při chromatografii na iontoměniči MonoQ při použití Pharmacia SMART . Všechny tyto podíly a menší frakce jsou schopné vázat ovčí protilátky proti afinitne čištěné bílkovině H11OD po expresi klonu lambdagtll Ml, kdežto protilátky z lambdaftll bez uloženého řetězce nejsou schop né vazby, jak je zřejmé z obr. 14c. Všechny malé frakce jsou schopné se vázat na myší monoklonální protilátky, označené TS 3/19,7 (obr. 14c), které jsou rovněž schopné se vázat na rekombinantní bílkovinu, k jejíž expresi dochází klonem Ml. Všechny podfrakce mají účinnost mikrosomální aminopeptidázy (obr. 15c), přestože tato účinnost je poměrně nízká u frakcí, získaných při nejvyšších a nejnižších hodnotách pí. Tato nižší účinost může být způsobena nižší koncentrací bílkoviny, účinkem extrémního pH při dělení frakcí nebo požadavkem na přítomnost malého i velkého pásu pro maximální účinnost protuktu.

Vakcinace jednotlivými složkami H11OD

Oddělené horní a spodní pásy, získané stanovením isoelektrického bodu nebo chromatografií na iontcměniči vyvolávají tvorbu ochranných protilátek po vstřiknuoí ovcím, jak je možno prokázat následujícím pokusem. 30 ovcí ve stáří přibližně 6 měsíců bylo rozděleno do pěri skupin po šesti ovcích tak, aby každá ze skupin měla přibližně stejnou hmotnost. Každé ovci bylo injekčně podáno celkem 150 mikrogramů bílkovin ve třech stejných dávkách podle publikací Munn a další, 1992 a Tavernor a další, 1992a, b v průběhu 54 dnů. Zvířata ve skupině L byla očkována podáním menšího pásu z dubletu H110, zvířata ve skupině U byla očkována horním pásem, ve skupině U+L byla podána směs horního a spodního menšího pásu, skupině D byl podán nerozdělený pás ve směsi horního a spodního pásu, získaný při středních hodnotách pH a kontrolní skupině C byl podán ferritin ze sleziny koní jako antigenně nepříbuzná bílkovina. Ovcím bylo po třech týdnech po očkování podáno po třetí injekci 10 000 infekčních larev a pokus byl ukončen 29 až 31 dnů po této--infekci. Výsledek pokusu je shrnut na obr. 16. Injekční podání jakékoliv ze subfrakcí snižuje výskyt vajíček parazitů v průběhu pokusu přibližně o 90 % a celkový počet hlístů o 63 až 84 %, ve všech případech jde o statisticky významný rozdíl (p je menší než 0,5) ve srovnání s kontrolními zvířaty. Snížení 70 až 88 % bylo větší pro samice hlístů než pro samce hlístů, avšak s výjimkou snížení počtu samců u ovcí se směsí horního a spodního pásu, kde pravděpodobnost byla pro p je menší než 0,07 bylo ve všech případech snížení pro óbě pohlaví statisticky významné při p menším než 0,05.

- 68 Očkování pomocí HUS a H11A

Zkrácenou, ve vodě rozpustnou formu H11OD (HUS, která si uchovává svou enzymatickou účinnost) je možno získat z přírodní molekuly působením elastázy. Bylo prokázáno, že tato forma má účinnost, převážně podobnou účinnosti enzymu ApM, extrakt materiálu po štěpení elastázou, extrahovaný Thesitem (H11A) byl obohacený o účinnost typu ApA, jak je zřejmé z následující tabulky 5.

Tabulka 5

Poměr aminopeptidáza-M : aminopeptidáza-A (leucin-pNA) (kyselina alfa-glutamová-pNA)

H110D 1,44 : 1

HUS 26,0 : 1

H11A 0,48 : 1

Následující pokus prokazuje, že vakcinace ovcí pomocí HUS nebo H11A poskytuje ochranu proti infekci Haemonchus. Skupina 18 ovcí ve stáří přibližně 8 měsíců byla rozdělena na tři části po šesti ovcích tak, aby každá skupina šesti ovcí měla přibližně stejnou hmotnost. Každému zvířeti bylo injekčně podáno ve dvou stejných dávkách přibližně 100 mikrogramů bílkoviny podle publikací Munn a další, 1992 a Tavernor a další, 1992a, b v průběhu 23 dnů. Zvířatům ve skupině A byla injekčně podána frakce H11A, zvířatům ve skupině S frakce H11S a zvířatům ve skupině 0 byl podán ferritin ze sleziny koní jako antigenně nepříbuzná bílkovina, to znamená jako negativní kontrola. 25 dnů po druhé injekci bylo ovcím podáno 10 000 infekčních larev a pokus byl uk 34 až 36 dnů po infekci. Výsledky pokusu jsou shrnu obr. 17. Injekční podání HUS snížilo množství vají výkalech o 89 % a celkový počet hlístů o 75 %. Inje dání H11A snížilo množství vajíček ve výkalech o 92 ončer.

-y na ček ve kční docelkový počet hlístů o 84 %. Běží sedy o statisticky významný rozdíl při p menším než 0,5 oproti kontrolám.

Inhibice účinku aminopeptidázy H110B protilátkami

Roztoky s obsahem 110B byly inkubovány spolu se vzorky sér z jednotlivých ovcí po injekčním podání frakcí s obsahem H110D nebo se vzorky sér kontrolních ovcí. Pak. byly roztoky sledovány na účinnost aminopeptidázy při použití fenolalaninu -p-NA a kyseliny alfa-glutamové-p-NA jako substrátu. Inhibice účinnosti, jejíž hodnota byla maximálně 80 %, byla v korelaci se stupněm ochrany u jednotlivých ovcí, jimž bylo odebráno sérum, jak je zřejmé z obr. 18.

Lokalizace enzymatické účinnosti

Zmrazené řezy dospělých jedinců Haemonchus contortus byly zkoumány na účinnost aminopeptidázy. Jak je zřejmé z obr. 19, je účinnost aminopeptidázy lokalizováno v průsvitu střeva. Bílkovina H110D je rovněž specificky uložena v této lokalizaci.

Exprese H110D (3,5 PCR klon 2) při použití eukaryotického systému baculovirus-hmyzí buňky

Exprese účinnosti aminopeptidázy v hmyzích buňkách

Infikované buňky byly zkoumány na účinnost aminopeptidázy při použití phe-, leu-, met- a lys-piíA jako substrátu. Analýza byla komplikována skutečností, že hmyzí buňky obsahují aminopeptidázu, která výrazně přednostně štěpí amidové vazby lysinu. Avšak buněčné extrakty s obsahem HllOD po expresi mimoto štěpily také vazby leu-, me*- a phe-pNA v uvedeném pořadí přednosti.

Molekulová hmotnost a imunoreaktivita bílkoviny HllOD (3,5 PCR klon 2) po expresi

Vzorky extraktů infikovaných nebo kontrolních buněk byly podrobeny elektroforéze na 7,5% SDS-polyakrylamidovém gelu, který pak byl barven modří Coomassie. Lysáty infikovaných buněk 3.5-2-P3A a 3,5-2-p4A obsahovaly pásy stejného rozměru jako pás pro HllOD s molekulovou hmotností 110 000, který se pohyboval přímo pod pásem pro beta-gal s molekulovou hmotností 120 000, k jejíž expresi docházelo současně. Tento pás s molekulovou hmotností 110 000 nebyl přítomen v rozrušených negativních kontrolních lysátech .·' Byl rovněž nepřítomen v lysátu buněk P2A, u nichž nedochází k expresi enzymu.

Gel byl ve dvojím opakování analyzován metodou Western blot, jako sonda byla použita protilátka proti H110DN, jak je zřejmé z obr. 21. Bylo možno pozorovat velmi silnou specifickou imunologickou reakci na pás s molekulovou hmotností 110 000, k jehož expresi dochází buňkami 3,5-2-P3A a také 3.5-2-P4A a proti nativnímu dubletu HllOD v kontrolní dráze, obsahující ConA HllOD, žádnou reakci nebylo možno pozorovat v negativních kontrolních drahách.

Literatura

Andreason, G.L. & Evans, G.A. (1980) Biotechmgues 6 650 .

Blin, N;, & Stafford, D.W. (1976). Nucleic Acids Research 3, 2303-2308.

Bowtell, D.D.L., Saint, R.B. , Rickard, M.D. & Mitchell G.F. (1936). Parasitology 93. 599-610.

Chomcyznski,	P. &	Sacchi,	N. (1987). Analvticál
Biochemistry	162 ,	156-159	•
Cordingley, J	.S. ,	Taylor,	D.W., Dunne, D.W. i
Butterworth,	A. E.	(1983)	Gene 26, 25-39.

Devereux, J., Kaerberli, S. & Smithies, 0.(1984), Nucleic Acids Research 12, 387-395

Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983). Analytical Biochemistry 132, 6-13.

Fire, A. (1986) EMBO Journal 5, 2673-2680.

Fire, A. & Waterston, R.H. (1989) EMBO Journal 8, 3428 .

Francis, M.J. & Clarke, B.E. (1989) Methods in Enzymology 178, 659

Frohnan, M.A., Dush, M.K. and Martin, G.R. (1968) Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington 8_5., 8998-9002.

3419

Gubler, N. & Hoffman, 3.J. (1983). Gene 25, 263-265.

Han, M. 6 Sternberg, ?.K. (1990) Cell-63, 921-931.

- 72 Huang, Χ.-Υ. & Hirsch, D. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences Washington 86, 8640-8644.

iohnstone, A. and Thorpe, R. (1982) Immunochemistry in Practice. Blackwell Scientific. London

Jongeneel, C.V., Bouvier, J. & Bairoch, A. (1989). FEBS Letters 242. 211-214.

Kenny, A.J. & Maroux, S. (1982). Physiological Reviews, 6 2, 91-128.

Kenny, A.J. & Turner, A.J. (1987). Mammalian

Lctoenzymes. Elsevier Press, Amsterdam. Volume 14 of Research Monographs in Cell and Tissue Biology, (editors J.T.Dingle & J.L.Gordon).

Laemmli, U.K. (1970) Nátuře 227. 680-685.

Lojda, Z. & Gossrau, R. (1980) Histochemistry 67 . 267290.

Baniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982). Kolecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Barbor Laboratory Publication.

Merrifield, R.B. (1964) Biochemistry £, 1385-1390.

Kunn, E.A., Smith T.S., Graham, Μ. , Greenwood, C.A., Tavernor, A.S. & Coetzee, G. (1992) Parasitology 106, 63-66.

Kachlas, M.M., Crawford, D.T. and Seligman, A.M. (1957) J Histochem i Cytochem. 5, 264-278.

Kakané, P.K. & Kavoi, A.K. (1974). Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22., 1084-1091.

- 73 Nc ’βη, G., Sjostron, H . , Damelsen, E. M . , Cowe li, G . M. £.

Skovbjerg,H. (1986). The Enzymes of the Enterocyte Plasma Membrane. In Molecular and Cellular Basis of Dicestion. Elsevier Press, Amsterdam, (editors P.Desnueile, H.Sjostrom ί* 0.Nořen) .

Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Edition.

Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Senenza, G. (1986). Annual Review of Cell Biology, 2, 255-313.

Smith, D.B. í Johnson, K.S. (1988) Gene 67, 31-40.

Spieth, J. MacMorris, M. , Broverman, S., Greenspoon, S.

& Blumenthal, T. (1988) Dev. Biol. 130. 285-293.

Tavernor, A.S., Smith, T.S.·Langford, C.F., Graham, M. & Munn, E.A. (1992a) Parasite Immunol. 14 . 671-675.

Tavernor, A.S., Smith, T.S., Langford, C.F., Munn, E.A.

& Graham, M. ( 1992b) Parasite Immunol 14 , 645-655.

Vallee, B.L. & Auld, D.S. (1990) Biochemistry 29 , 56475659.

Watt, V.M. í Yip, C.C. ( 1989) Journal of Biological Chemistry 264, 5480-5487.

Woodward, MP, Young, WW Jr and Bloodgood, P.A (1985) . Detection of Monoclonal Antibodies specific for carbohydrate epitopes using periodate oxidation. J. Immunol. Meth. 7?,. 14 3-153.

Wu, Q. , Lahti, J.M., Air, c-.M. , Burrows, P.D. & Cooper. M.D. (1990) Procedinas of the National Academy cf Sciences, Washington 37, 993-997.

délka; 255 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 1:

CGCGGACA77 GC7GAA7C7A ACTCCAATCC G7C7TA77G7 CGCATTATTT CTAGTAGCTG 6 0

CTGCAGTCGG CCTC7C7A7T CG7C7CACC7 ATTACTTTAC TCGCAAAGCG TTCGA7ACCT 120

CAGAAAAGCC AGGGAAGGAT GATACTGGTG GCAAGGACAA AGACAA7TCT CCCTCTGCGG ISO

CGGAACTACT TCTTCCAAGT AATATAAAAC CA77G7CT7A CGACTTGACG ATCAAAACAT 24 0

A7CTACCTGG TTATGTGGAC T7CCCACCGG AGAAAAACCT CACATTCGAC GGGCG 29 5

Informace pro řetězec č. 2: Vlastnosti řetězce:

délka: ^84 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 2:

GCAATATCAG GATTCAATAC AATTTTGGAC TTTTTCGGCA GCGAACCCGA ATCTCAATGG 6 0

GCTTCGGAAT ACATGCGAAA AC7GA7GAAG CCAATTTATG ACAAGAGTAG CATCAAGTTT 120

ATAGCGGAGA ACTACAAAAA AGATTCGCTT TTCTTCAAAA ATAATCTCCA AATAGCTGTT 180

ATTGACACAT ACTGTGGTCT TGGAGGCAAA GAATGTCTTG AAGAAATGAA AAAGCTTTTT 24 0

GACAAGGAGG TCATGAAATG 7CAACC7GG7 CAGCAAGCGA CCGACTGCGT AAAGGTAACT 300

GCTCCTCTCC GAAAAACTGT TTACTGCTAT GGGGTCCAGG AAGGCGGTGA TGAGGCATTC 36 0

GACAAGGTGA TGGAACTATA TAATGCGGAA CAAGTGCAGT TGGAGAAAGA CAGTCTACGT 4 20

GAAGCATTGG GATGCCATAA AGACGTTACA GC7C7AAAGG GAC77CT7A7 GC7GGGTTTG 480

GA7C 484

Poois rť :ZCí i i <.A\J

Z“·*»»* — <*· «“» Z* Z·»·» Z*» 1 </— —· » * <— * » <*“* ** VJUfVW.<J i O

TACA3CTCTA

CAAGCGACCG CAGG AAGG <-G CAGTTGGAGA AAGoG ACTTC

AC7GCG7AAA

GTGATGAGGC

AAGACAG7CT

ZpZ»» « řWZ. HZWZ* M • 1 Λ i L»\- 1 UU'GGTAACTG“ CCTC~CGAAAA CTGTTTACTG Αχ i CGACz^G G i GA λ G^r^-^G i A7A7AA7GC ACGTGAAG i i Gxj^A i G^<. A. i ř\AAGACGT TTTGGA

120

180

216

Informace pro řetězec č. 4: Vlastnosti řetězce:

délka: 581 párů baží typ: nukleové kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 4:

GG<jAGGr\AA i CAC7GGGAGC 7. GGAAACAG C77G77GCAC AGGAAT7CGC TGCCAACAAC AG/-unCA?\ i GC CcAGGCTAAG rAGTTCCATA CATTA7CGCA ATTCTTCAAG AGAGCAAGAT ACCTCTTCAA ACTAGGAGAC AGTTTTGCTG GCCATCCATT CGAATACAAC CAACCCCATT AATTTCGAAT ATATTATGAA GCTTGTATCT TAGAGCTCAC TCTCCATTTT GTAGCTGTGA OCCTATAATC TTTCCCCAAT ACATTCCAAA AGATTTGTTT CTTTGTCTGC 7ATCCATCTA

AACACAGAGC AGTTGATAAA GTGGTCGGCG AAATAGATCA GCTGAAGAAG AATCTACAGA AAATTGCCTG GA7CAAGAAA CATTTTCACA CATAGCTTTT CACACTGAGC TCCAATTTTA AAAAGTCAGT TTCACATT77 CCGTTTGAAT TTAAGTACCT TTCATTCACA GTGATTACTA TGAACGTTAT GATCGGTGAC TTTCAATTTA TGACTTGCAT TTAAGACCCA CCATTTACCA CTCCGATCAC CTCCACCGCT GACAATGCCC AC7G7T7CGA 7

120 ISO 24 0 300 360 420 480 54 0 581

Informace pro řetězec č. 5: Vlastnosti řetězce:

délka: 948 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

- 76 ,3 retezcí

A7GA.CG7CGC

G G AT Γ AT77 C

UíX-rtAAUVU * υΛ\ΰ%Λ . i C . IS* X r· x />» *x x xj/sL» . a xjzsUvJ/n

ACA 77 GGATG CTCAA7TCAA /w\i i '-úAAr. AAAAGCCAAC AGCAACAGCC -ATCGC7GCAG <·« > «**<«*«··* * x m

G7C7CGAA7G AAG77C77GA GAA7ACAT CG GCAAAGAAGA

AGGGGAGAAC 7AG7AGC7GC T CGA7ACCT C CC7C7GCGG\»x«x x x X >«··· «τ»χ 1 u-W.^LA 1 Λ

GGCG7G7GGA

AGAAGA7CTC

77GAAAG7G7 i <ίυ/νν\ΛΑυΛ

7TGG7GGAAT

TTTCACAAAA

ACAAAGCAAA □λλ iLv/VkU i

C7AC7CCACG ruhuu Γυ/νν%

7GACACAATA <a s- oG ACAT T G 7GCAG' TCGGG A\j AAAAG C CA GwAA¹ 7G7ACG7GG7 λλ * λ a C.-v% i U

7G7AA7ACCC A.AAGGAGCAC Ί i CACAAA7C CTACCAGACC 7GAGCCCA7A C7GGACCG7T GAACGGAGAT GA7GTCA7CC AA.AGACGGGT 7GCTC7GCAA

C7GAA7C7A.A

C7C7C7A7TG írti U ΐ υ\)Λ^ a

G77G7AA77G

CAAGAATGTG

CCAAGAC7GG

T7GC7CAAGT

AC7TATACCA

GA7GCTCG7C

ACTG7CA7TC

GGAGAGATCA

TAC7TG77GG

G7TCGG7TCC

TC7GG7A7CA

C7CCAA.7CCG GTCTCACCTA A.AG7GG7GG

TAAAACx. i

X λ X x />XX X X

AACTGG7A7C AAAAGGTTG A CG G C7T A CA 7 ϋΛΛ i UU i ΛίΑ.

A7CCA_A.AA.GG G7GG7GA77G lunu ; *Λ* oo i U i Λ i Λ i UO λ U

AG7GCA7A i <,*

ΤΤ/ηΐ777 ACT /*X » Z*»*«X z·® X X X ΐΛΛυυΛίΛΛΛ

AIVGTC7TAC G AAAAAC CT C ‘•j 1 Λ .

i a i<i iaTC CGGTCTCATC CACCCCTAiAG

Λ A UK-Λ A <3\Jrt i

CACCAAAGCC

GATCACATCG

TTCAGAATTT

ACGCCCAGAG

0 120 130 24 0 300 360 420 430 540 600 660 720 78Θ 840 900 948

Informace, pro řetězec č. 6: Vlastnosti řetězce:

délka: 1689 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

A.A7TCCGGCT CGTCCGGAAG CTA7GAAGA7 GACAGAA7A7 GCC.A7GA7AG CTGGAATCAA 6 0 A7GTTTGGA7 TACTATGAGG ACTTCTTCGG GATCAAATTC CCAC7TCCAA AACAAGATAT 120 GGTTGCTCTT CCTGACTTCT CATCTGGTGC TATGGAGAAC TGGGGTCTCA TCACATACAG 180 GGAGGGTTCC GTGCTCTACG ATGAAAACCT CTACGGACCA ATGAA7AAGG AGCGGGTTGC 24 0 AGAAGTGATC GCGCACGAAC TTGCACATCA GTGCTTCGGT AATTTGGTCA CGATGAAGTG 300 GTGGGATAAC CTATGGCTGA ACGAAGGATT CGCGTCATTC GTGGAATACA TCGGAGCCGA 36 0 CTTCATCAGC GATGGTCTAT GGGAAATGAA AGATTTCTTC CTGCTGGCAC CGTACACAAG 4 20 TGGTATTACG GCTGATGCAG TAGCTTCAAG CCATCCGCTT TCCTTCAGAA TAGATAAGGC 4 80 TGCAGATGTA TCAGAAGCGT TCGATGATAT CACATACCGT AAAGGAGCAT CCGTTCTTCA 54 0 AATGCTATTG AATTTAGTTG GGGACGAAAA TT7CAAGCAG TCTGTTTCGC GTTACCTCAA 6 00 GAAGTTTTCA TATGATAATG CGGCTGCTGA AGAT7TA7GG GCAGCATTCG ACGAAACCGT 660 CCAAGGTATA ACCGGACCTA ATGGTGGACC ATTGAAAATG TCCGAGTTTG CGCCACAATG 7 20 GACAACTCAG ATGGGGTTCC CTGTTCTTAC TGTCGAGTCG GTTAACGCAA CGACTTTGAA 7 80 AGTCACCCAA AAACGATACA GGCAGAACAA GGATGCAAAG GAACCAGAGA AGTACCGTCA 84 0 TCCAACTTAT GGGTTCAAAT GGGATGTTCC TCTGTGCTAT CAGGAAGATG AACAGCAAGT 9 00 GAAAAGAACT 7GGT7AAAAA GAGAGGAACC GCTCTATTTC CA7G7AAGGA ATTCTGATTC 960 GTC.AG7TG7G G7GAA7GCCG AACG7CG7GC 7TTTTGCCGA 7CAAAC7ATG ACGCTAACGG 1020 7TGGAGGAAC ATTA7GAGAA GACTCAAGCA GAA7CA7AAG GTC7A7GGTC CACGAACAAG 10 8 0 AAACGCTC7C A7AAGTGA7G CGT7TGCAGC AGC7GCAGTT GAGGAAATGA ATTACGAGAC 114 0 CGTATTTGAA A7GCTCAAAT ACACCG7GAA AGAAGAGGAT 7ACTTACCAT GGAAGGAGGC 1200

AATATCAGGA TTCAA7ACAA TTTTGGAC7T TTTCGGCAGC GAACCCGAAT CTCAATGGGC 1260 TTCGGAATAC ATGCGAAAAC 7GA7GAAGCC AA77TA7GAC AAGAGTAGCA TCAAGTTTAT 1320 AGCGGAGAAC 7ACAAAAAAG ATTCGCT7TT CT7CAAAAAT AA7CTCCAAA TAGCTGTTAT 138 0 TGACACATAC TGTGG7CTTG GAGGCAAAGA ATGTC7TGAA GAAATGAAAA AGCTTTTTGA 14 4 0 CAAGGAGGTC A7GAAA7GTC AACC7GG7CA GCAAGCGACC GACTGCGTAA AGGTAACTGC 1500 7CCTCTCCGA AAAACTGTTT ACTGC7A7GG GG7CCAGGAA GGCGGTGA7G AGGCATTCGA 156 0 CAAGG7GATG GAACTA7ATA A7GCGGAACA AGTGCAGT7G GAGAAAGACA GTCTACGTGA 162 0 AGCATTGGGA 7GCCA7AAAG ACG7TACAGC TCTAAAGGGA CT7CTTATGC 7GGCTTTGGA 1680 TCGGAATTC 1689

Zníc mace pro řetězec c, 7: Vlastnosti řetězce:

délka: 2^72 páru baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární Popis řetězce č. 7:

AiOOxjO i GTTC TTGGATGCTG CT <í\j AAAAAC GGCC7TA7CA AA7AAACAGC C ?G GTCACAC GAGTATCTTG CTCGA7GGAA TTTAGGATTG G o G 0 GT Z AG C.iCTGCAAT CTCTT'C AATG CAATTTACCC AA iGCGACCG

GGTTCCGTAT GCATCAGATG AAGATATGAT * r·»

Li i/MrtkjrvUrt

GGGTTGCTCT TGAAGTGGTG GAATGGACGA TGGATCGOGG ACAAAGCGGC TTCTCACTAT ACCTCAAGAA AAGTTGTCAA ATCACTGGAC C C CT AAAG GT

ATGGTCTCGA

C— « m i i <_

MM* MM*M* M MMW x * C _Λ i OC i GG ATT CT v i C

CC x x x sus. I

GGATGATACG AATTAGCCAC AATGAGAGCT AGAAGTTGCC GCTACGGG CT GTTCTCCTAC AGGTCTTAAG GT ATCAGATG iACGCAGAGC

CCAGAGAAAT

GAAGGCAATA

AACGTCAACA

CAAAACTATG

GTCTTCGGTC

GACGCAATCG

TTCTTGCCTT

GAGCCGGAGA

AAGAGCAGCA

AATACTCAAA

CAATA7AAGG

ACCAAATGCG

GAAGGTGGTG

CTGGAGAAGG

GAAC7TCTTT

ACCGCTTTCC

ATGGAGAGAT

GTGGTCGGCG

CTACAGAAGA

GGAGAACATA

AGAGCAAGAT

AGTTTTGCTG

CAATAATACC

GAAGCTTGTA

TTTGTAGCTG

AATACATTCC

TGCTATCCAT

TGACGTTGGT

ATCGTAATCC

GCAAAGAGGT

ATCGGGATAC

ATGCCAACGG

CAAGGACAAG

ACTATGAAAC

GGAAGGAAGC

CAAAACCAGC

TTGATTACAT

AGGATATCAT

ATATCTTCTA

TTAAGGTTTC

AAGAAGCTTT

GTATCCTGTT

TGCGAGCCCT

GTGCTGTATC

GGGAGGAAAT

CTTG7TGCAC

ACAATGCGCA

AAATTGCCTG

CATAGCTTTT

AAAAGTCAGT

ATTTTAAGTA

TCTTGAACGT

TGATGACTTG

AAACTCCGAT

CTAACTGTTT

GT

AAAATACGGG

CAAGCGAACA

A7CCCTTGTG

TTGGAAAAAG

GAACGCTATC

TC7ATTCGAA

TCTGTCCGGC

7AGAGC7TAC

CGTCAAGAAT

TGATGCATAT

CCATGAGC7T

CGCTCCTCTT

TGAAAAGGTG

CAAAGCCTTG

GGACCGTAAA

TGAAAACCCT

CACTGCGAGC

AGGAATTCGC

GGCTAAGAAG

GATCAAGAAA

CACACTGAGC

TTCACATTTT

CCTTTCATTC

TATGATCGGT

CAT7TAAGAC

CACCTCCACC

CGATCGCCGG

CCAGAGG CGA x ATGAGAAGT GATTTCACCG CTATACGATG CACGAGCTTG TGGTTGAACG AACAATTTCA GACTCGGCAG GAAG CCTríG TTGATTGGAG AGCAATGCAC GGTCCTGACC G^jTTATCCTG CGCT ACAACA

AACGAATGAC T CTTT G A CAT CTGGTGCCAT AAAAAA7TT A CTCATCAGTG AAGGTTTTGC GAACGCAAGA CATCGAGCCA ACGATATTTC ACGACAA7TA AAG^wAGCCGA GCAACGTCAT TCCTTAAACT CAAAT AAAGA

TTCAAGTGGC ,

TGGCTAAAAA I

GTGAACGC7G ,

ATAATCAAGC ATAAGCGATG

CTACTTGAAT

ATGTTCGCAG

ATGATGAGCA

7ATTTGGATG

TGTTCCCTTG

ATGCCCAAGT

CGAGCCAATG

ATGGGGCTGT

GCATGCCACA

TCGTCGTTTG

G7GGGCGAAG

TTGGAAACAG

TCCCAACAAC

TTCGGCTCAT

CA7TT7CACA

TCCAATTTTA

CCGTTTGAAT

ACAGTGATTA

GACTTTCAAT

CCACCATTTA

GCTGACAATG

TTGTTTGTCA

ATGTTCCCCT i GAGA7GAACC ( ATCGACA7GG , ACCTCAAGAA < CA7TTGC7CC , ATCCCAAAAA· ' TTTTAAACTT TATTAGAACC A7ACGT7A77 GA7 CAAAGGA G7AAGGCCGG T7TAC7G77A ATC7AGCAGA AAGATGTTAC TGCGTC77CA AATTCATGTT AACACAGAGC AAATAGATCA TCACCCAGGA GATTATCGGA ACGTCTTCAA GCCATCCA77 , CTGAAŤTTCG ' T7ATAGAGCT . CCAGCCTAGA i CCCAGAT7TG I ATTGC77ATC

GGCATACGCT AAAATTCCCT GGA-AAA C ? GG x

GTi CGG CAAT AACA777G77 777C77C77G 7CCGCT7TCG ATACGCCAAG CAGGAATGCT 7C7G7GGAAC GAAAATCGAC AGAAGAATTT CGCCT7GGAA

ATGCTATCAG GCTCTACTTG ATTTTATCGA AGATCACAAG AGC7ACGATT TGAAGAGGAA CTTCGGTAAT GATGTATAAT CACAAAAATT C7G7ATAAAG GGAAGCAGCA TGG7GTACAG AGATG7TCAA AGC7CTAAAA GGATGTCCCT CAATTTCCTA AGTTGATAAA GCTGAAGAAT AATCGAAAAA AT7CTTCAAG AC7AGGAGAC CGAATACAAC AATATATCAT • CAC7CTCCAT . ATCTTTCCCC

120 ISO 240 300 360 420 4 80 540 600 6 6 0 720 7 30 H4 0 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440

1500 1560 1620 1680 17 4 0 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2472

Informace pro řetězec č. 8: Vlastnosti řetězce:

délka: 3305 párů 'cazí typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojizý topologie: lineární

Popis řetězce č. 8:

GC7GAA7C7A AC7CCAA7CC G7C77A77G7 CC7C7C7AT7 GG7C7CACC7 A77AC777AC AGGGAAGGAT GA7AC7GG7G GCAAGGACAA CC77CCAAG7 AA7ATAAAAC CA77G7CTTA 77A7GTTGGAC 77CCCACCGG AGAAAAACCT GG77G7AA77 GAGCCAACAA AGAG7ATCGT CCAAGAATG7 GAACTGGTA7 CGGGCGATAA CCCAAGACTG GAAAAGGTTG AC7TTCTTAT C77GC7CAAG G7CGGC7ACA TCGGTCTCAT CAC77A7ACC ACCCCGGATG GCACCCCTAA AGATGCTCGT CGAA7GGTAC CA7GCATGGA TAC7G7CA77 CATCCAAAAG GCACCAAAGC TGGAGAGATC AG7GG7GA7T GGATCACATC CTACTTGTTG GCAGTTATGG TTTCAGAATT 7G77CGG77C CGTATATGGT CACGCCCAGA A7C7GG7ATC AAGTGCATAG AATTCTACGA GAAACAAGAT ATGATTGCCC TTCCTGATTT CATCACTTAC AGGGAAAACT CTTTGT7G7A ACAGCGAATT GCTCGCATTG 7TGCTCATGA TACGATGAAG TGGTGGGATA A777G7GG7T TATTGGAGCT GGTCAGATAA CTCAAGATGA 7G7AC7TGAA CGCGCTT7GA AAGCTGAT7C AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTGAAGAAGC T7CTGTTCTT ACTATGCTGA GAGCCTTGAT GCAGTACCTC AAGAAGTTCT CGTATAGCAA TGATGAAGTT G7CACTGACG TCGAAGGTCC

TCCAAGTCAG TGGACGACTC AGATGGGC7T GACTACTTTG AAATTAACGC ,\AAG7CGATA GAAGTACCGT CACCCGAAAT ACGGATTTAA CGATAAGAAG GAGATAAAGC GAACATGGTT TAGTGATGCT GGCGCTCCCT TTGTGGTGAA TCATCACCCT AATGGTTGGA AAAAGATAAT CAGTCCCCGG ACAAGGAATG TCATCATTAG AATTGAGTAT GAGAC7G7AT TTGAACTTCT ACCATTAGAA ATCGCAATGT CCGGGATCTC AGAGGCAAAG CCAGCTCAAA CATACATGAT CAG7ATCGAC 7TCA77GCCA ATAACTACAG CCAAAAAGAT GTCATTGATA TGTTCTGCGC TAAAAAACTT TTCGATGACG AAGTCATGAA ATGCGTAAGA ATCGCCGCTC CTCTCCGATC CGGTGATTAT GCTTCCGACA AGGTGATGGA AAAAGACTTC C7ACGCC7AG CAT7GGGATG TCTCTTGCGG GCTCTGGACA GGAATTCGTC 7T7CAACGAT G7AGCAGCAA ATCC7AT7GG GAGATGGCCA GATATCATTG AAAG7ATAGG ACCAGCCTGC ACTTCAGGAA TCCGCTCACA GAAAAATGGC A7GAACGC7C GTCAATTCGG AAATAGGGTG GATTGGATTA AAAAACATTT

UjOu íaa · i U i x CGsj

TCGCAAAGCG TTCGA7ACCT CAGAAAAGCC AGACAATTCT CCCTCTGCGG CGGAACTACT CGACTTGACG ATCAAAACAT ATC7ACC7GG CACATTCGAT GGGCGTG7GG AAATATCAAT ACTCAATTCA AAGAAGA7C7 CTG7AATACC AAAACTCGAA AT7GAAAG7G TAAAGGAGCA CAAAAGCCAA CTGGAAAAA.G ATCAACAAAT CAGCAACAGC 777GG7GGAA TCTACCAGAC GATCGCTGCA C7TTCACAAA ATGAGCCCAT TGAACCGAAA TACAAAGCAA ACTGGACCGT CG7C7CGAA7 GGAA7CGAAG TGAACGGAGA GAAG77C77G ACTACTCCAC GGA7G7CATC TGAATACATC GAAGGTGAAA CAAAGACGGG GGCAAAGAAG ATGACACAAT ATGCTCTGCA AGATTTCTTT GATATCAGAT TCCCTCTGAA CTCTGCCGGT GCCATGGAGA ATTGGGGCCT CGATGACAGA TTC7ATGCAC CGATGAATAA GCTTGCTCAT CAGTGGTTCG ' ÓCGACTTGGT GAATGAAGG7 TTTGCAAGAT TCACAGAATT CGCCAGAATG AGGAACTACT TCCTGATTGA GG7AGCG7CA AGCCA7CCAC TTTCCTTCAG CTTTGATGAT ATCACATACG CCAAAGGAGC TGGAGAAGAA AAACATAAGC ATGCAGTATC TGCAGAAGCG ACTGATCTAT GGGCAGTTTT AGACGGCAAA CC7A7GAAAA CCACAGAGTT CCCAGTTATT TCCCTAGCAG AGTTTAACTC TGAGGCGAAT AAAGACGCTG TGGAGAAAGA ATGGGATATT CCACTGTGGT ATCAGGAAGG GAGAAGAGAT GAACCGCTTT ACTTGCATGT CGCAGACCGC TATGGATTTT ATCGACAAAA CAAGCACCTC AAGGA7AATC ATGAGGTTTA CGATCCGTTT GCTGCGGCTG CAACTGACGC GAATTATGCC GAAAAAGAAA CGGAATATCT TTCGATTTTG AAATACTTCC C7ACCGAGCC GAACA7A7TG AAACCGÁTGT A7GAAAAAAG AAATGACAAG CTGTTTTTCC AAA7CAACCT CCTCGGATCG CAAGACTGCA GGAAGAAATA CAAATGCAGG GA7GGTCAAG CAGCAACCGA AAGTGTTTAT 7G77ATGG7G TGAAGGAAGG GCTTTATACG GCCGAAACAC TCGCCCTAGA TCATAAAGAT GTTACTGCTT TGAAAGGACT GTTCGTACGT ATGCAGGATA TCCCAAGTGC CGAAGAATTC ATTTTCAATT TCCTTA7TGA AACGAAGCAC ACATATGTTG AGAAAG7GAT ACAGCAGATT GACCAGCTGA AGAATCTGCA TGCATTCGAT AAAGCAATCG AACGAGCACA CCAAAAATTA GCGGCTTTCT 7CAAGAAAGC

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680 1740 1800 1860 1920 1980 204 0 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 276 0 2820 2880

294 0 3000 3060 3120 3180 324 0 3300 3305

Informace prc ret

č. 9

Vlastnosti řetězce:

délka: 1301 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 9:

GGT7TAA77A CCCAAGTTTG AGATGACAGC AGAGGAGAG7 CAGGAGCAGG AGACGCAGCA 6 0

ACCACGAAAA AATACAGTGC TACGGCTCAC CCCAATCAAG TCTCTCTTTG CTTTGTTAGT 120

GGTAGCTGCT GCCGTCGGCC TCTCAATCGG TCTCACCTAT TACTTTACAA GGAAAGCTTT 180

TGATACTACT GGCGGAAATG GAAAAGGGGA TCAACCTATT GTCGATGATA ATTCCCCATC 24 0

AGCTGAAGAA TTACGTC7CC CAACAACCAT AAAACCTTTG ACATACGACT TAGTAATCAA 300

AACGTATCTG CCAAACTATC TAAACTATCC ACCTGAGAAA GATTTCGCTA TTGATGGGAC 36 0

TGTGGTGATT GCTATGGAAG TTGTGGAGCC AACAAAGTCT ATTGTGCTCA ACTCGAAAAA 420

TATTCCTGTA ATTGCAGACC AGTGCGAACT GTTTTCTAAC AACCAAAAAC TCGACATCGA 4 80

AAAGGTTGTG GATCAGCCAA GGCTGGAGAA AGTCGAATTC GTTTTGAAGA AAAAGCTGGA 54 0

GAAGAATCAG AAAATCACGC TCAAGATTGT ATACATTGGC CTTATCAACG ACATGCTTGG 600

AGGACTTTAT CGAACAACCT ACACGGA7AA AGATGGTACA ACCAAGATTG CTGCATGCAC 66 0

TCA7ATGGAA CCGACGGACG CCCGTCTTAT GGTCCCCTGT TTCGACGAGC CGACGTTTAA. 7 20

GGCAAACTGG ACTGTGACTG TGATTCATCC GAAGGGCACC AGTGCCGTGT CGAATGGAAT 7 80

AGAAAAGGGA GAAGGAGAAG TCTCTGGCGA TTGGGTCACA ACCAGATTCG ATCCAACCCC 840

GCGAATGCCT TCGTATTTGA TTGCTCTTGT GATTTCCGAA TTTAAGTACA TTGAAAATTA 9 00

TACGAAAAGC GG7CTTCCA7 TCCGAATATG CGCTCGTCCG GAAGCTATGA AGATGACAGA 960

ATATGCCATG GTAGCTGGAA TCAAA7GCTT GGATTACTAT GAGGACTTCT 7CGGGA7CAA 102 0

ATTCCCTCTT CCAAAACAAG ATATGGTTGC 7C77CC7GAC 77C7CA7C7G G7GC7A7GGA 1080

CAACTCGGGT CTCATCACAT ACAGGGAGGG TTCCGTACTA TACGATGAAA ACCTCTATGG 114 0

ACCAATGAAT AAGGAGCGGG TTGCAGAAGT CATTGCACAC CAGCTTGCAC ATCACTGGTT 12 0 0

CGGTAATTTG CTCACGATGA AGTGGTGGGA TAACCTATGG CTAAACGAAG GATTCGCGTC 126 0

ATTCGTAGAA TACATTGGAG CCCACTTCAT CAGCGATGGT C 1301

- 80 mfzrmace oro řetězec 2. 10: Vlastnosti řezězce:

délka: 1280 cárů bací tyc: nukleová kyselina typ řezězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řezězce č. 9:

GGTTTAATTA

CTCACCTATC

TGGTCTTACC

TGACAGTGGT

GAACATAAAA

CTTTCCACCA

TGAGCCTACA

CGAACTG77C

TGACAAGCTT

GATCACTTAC

TGATAAGGAC

TCGTATAGCG

T CATC CCAAA

CAAGGGTGAT

GGCTATTATT

CCGTATATGG

CAGATGTCTG

TATGATTGCT

CAGAGAGGAT

TGCTCTCGTA

GTGGTGGGAT

GGACGAAATT

CCCAAGTTTG

AGCCTACTTT TATTACTTCA

GGTAAAGAAA

CCAGTCTCGT

GAAAAGAATC

AATAGTATTG

TCAGGTAATC

GAGATTACCC

ACCGGCCTTA

GGAAAAACTA

CCATGCTTTG

GGTACAAAGG

TGGATAACGT

GTTTGTGAAT

TCTCGACCAG

GAGTTCTATG

CTACCTGATT

TCTCTTCTAT

GTTGCACACG

GATACGTGGT

AGCCACAACA

AGATGACGGC

GTACATTATT

CTCGTAAAGC

AGGATAATTC

ACGACTTGAA

TCACATTTGA

TGCTGAACTC

AGAAACTTGA

TCAAAAATCA

TTAGCGACAC

AGATCGTTGC

ACGAACCGAA

CTGCATCGAA

CTAAATTTAA

TTGAATACAT

AGGCGATGGC

AGAGATTCTT

TCACCGCTGG

ACGATGAGAA

AGCTTGCTCA

TGAACGAAGG

GGAGTGGCAG

TGTATTAGCT

ATTCGATACC

TCCTTCTGCA

CATCAAAACA

TGCCCATGTG

GAAGAAAATC

CATCGAAAGT

GCTGCAAAAA

TCTCGGTGGG

TGTTTCACAA

GTACAAGGCA

CGGCATTGAA

AACTACCCCA

TGAAGGAÍ i i’

AATGACGGGA

TGACATCAAA

TGCTATGGAA

AATTTATGCG

TCAGTGGTTC

TTTTGCGACA

AAGCGTCGAA

GCTGCCGTTG

ACACAAAAAG

GAAGAACTAC

TATCTACCGG

GAGATTGČTA

ACTTTGGCAC

GTAAAGATGC

GATCTGAAAA

CTCTACCAGT

AATGAACCAT

ACATGGACTG

GCAAATGGAA

CCGATGTCGT

ACAAAAACAG

TATGCCCTGG

TTCCCTCTGG

AAuTGGGGTC

CCGATGAATA

GG CAAT CTGG

TTTGTTGAAT

TCTTGGGCTT

GACTCTCCAT

AACAGAAGGA

TTCTTCCAAC

GTTACGTGAA

TGGTTGTGGT

AAGGAGGATG

AGGAAAGACT

TCCTGCTCAA

CCATCTACAC

CAGACGCTCG

TCACCGTCGT

AAGGGGAGCT

CCTATTTATT

GTGTACGGTT

ATGCTGGCAT

AAAAACAAGA

TTATCACTTA

AGCAGCGGGT

TCACATTGAA

ATCTTGGAAT

120 180 24 0 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080

1140

1200

1260

1280

Informace pro řetězec č. 11: Vlastnosti řetězce:

délka: 1293 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

CCC

TCTAACTCCA

TATTGGTCTC

GGATGATACT

. G

AAA T CTT G CT •vGACC

A\_ i _A A

CC.n * z\<jA7GC C^GTTACTGT GAGAxGGAGA

CGGGTGTTCG TGC AATCTGG i GAA.GAAACA GCCTCATCAC λ i AAACAGCG i G\j , i ACGAT <Ά. « CACTGG . zw ι λ* Λ

GGACTTCCCA AA/ÍT G A.G CCA AT GTG AACTG ACTGGAAAAG CAAGGT \_GGC TACCACCCCG TCGTCGAATG CATTCATCCA GA i QčiG i Gw x GTTGGCAGTT Gů 7 C CGT ATA TATCAAGTGC ΑΟΛ tλΤολi I TTACAGGGAA AATTGCTCGC CAAGTGGTGG AGCTuG í •CAG nGvjGTCTCCA λ - <-CGTCT7A ACCTATTACT GGTGGCAAGG AAACCA77G7 C <»G\jAG AAAA A C-iAAG AGT A GiATCGGGCG GTT GAGT77 C i ACATCGGTC GATGGCACCC GTACCATGCA AAAGGCACCA GATTGGATCA m x GGTTTCAG TGGTCACGCC ATAGAATTCT GCCCTTCCTG AACT CI7 ’ ÍGT A7TCTTGCTC CATAATT7C7 AT AACT CAAG . t

ACCTCACATT TCG7AC7CAA AT AAAAAA CT TTATCAAAAG TCATCAGCAA C7AAGA7CCC TGGA7GAACC AAGCCGTCTC CATCGAAGTT

AATTTGAATA CA G AGG CAAA ACGAAGATTT ATTTCTCTGC TGTACGATGA ATGAGCTTGC GGTTGAATGA ATG x CTAGATGAC TTGTCGCATT x x /%<» i Lus-,run λ CAAA gacaa

GACGATCAAA CGA x 'jGsjC^ . TT CAAA. G A A G CG AAA.TTG AA CCAAC7GGAA CAGs— CTTGvj x TG CAC.7x CA r* » *»»»*»**»

ΟΛΛ i SJOr-. * <* X . í\w X

C* ««<»/«· « « <«**·«» λ x Ι.υηΛ^’υ x

GAAGATGA CA CTTT G AT AT C CGG * GCCA i G CAG ATTCT AT TCATCAGTGG λ z-A C\j CG g a G-^ x wCTGCAG ACC * CAG AAA

ACA7ATCTAC GT GG AAAT AT ATCTCTGTAA AGTGTAAAGG AAAGAT CAA C GGAATCTACC CAAAATGAGC G CAAACT GG A GAAGTGAACG CCACGGATGT GAAACAAAGA CAATATGCTC AGATTCCCTC GAGAATTGGG GCACCGATGA TTCGGCGACT AGATTCACAG

1Z0

ISO

240

300

360

420

4S0

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1293

Informace pro řetězec č. 12: Vlastnosti řetězce:

délka: 746 párů baží typ; nukleová kyselina typ·řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 12:

CTTGAAGAAA TGAAAAAGCT TTTTGACAAG GCGACCGACT GCGCGAAGGT AACTGCTCCT CAGGAAGGCG GTGATGAGGC ATTCGACAAG CAGTTGGAGA AAGACAGTCT ACGTGAAGCA AAGGGACTTC TTATGCTGGC GTTGGATCGG CATGATGTGT TTAACATTGT ATCCAGAAAT CTCACAGAGC GATGGGAAGA GATACTTGAA CGAGTGATCA AAGCCTGTAC TCGAGGACTA AATCTATACA AAAATGACAA GCGTGCTCGC AGATCGGAAC ACAGAGTCAA ATGGATTGAG AAAAAATCTA ATTCATAATT CTGAAATGGC ATCATCCAAA AAGATTAATG ATGTTTTTTT TGTCATCGAT TCAAGTGTCT GTATTG

GAGGTCATGA AATGTCAACC TGGTCAGCAA CTCCGAAAAA CTGTTTACTG CTATGGGGTC GTGATGGAAC TATATAATGC GGAACAAGTC TTGGGATGTC ATAAAGACGT TACTGCTCTA AATTCGTCAT TTGTGCGTCT TCAAGATGCT CCTGTTGGAA ACGAACTGCT GTTCAATTTC AGTTTGTCAA TACGACACAG ATCAGTTGAT CGATCCAGGG AACAAGTACA ACAGTTGAAG GAATACGGTG CATTTGGTGG GGCAATAGAA AAACATTTCC GAAAACTAGC AGCTTTCTTC TATAACTAGC ACACTGGATA GTTGTCTCGA ACTAGATAAT ATGGAGATAT TCTGTAAATT

120 ISO 240 200 360 420 480 54 0 600 660 720 746

Informace pro řetězec č. 13: Vlastnosti řetězce:

délka: 1274 cárů 'cazí typ: nukleová kyselina tyt řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 13:

TCTTGAAGAA A7GAAAAAGC 777TCGACGA GCAAGCGACC GAC7GCGTAA AGGTAACTGC GGTCCAGGAA GGCGGTGATG AGGCATTCGA AGTCCAATTG GAGAAAGACA GTCTACGTGA TCTAAAGGGA CT7C77A7GC TGGCTTTGGA TGCTCATGAT GTG77TAACA TTGTATCCAG TTTCCTCACA GAGCGATGGG AAGAGATACT TGATCGAGTG ATCAAAGCCT GTACTCGAGG GAAGAATCTA TACAAAAATG ACAAGCGTGC AGAAAGATCG GAACACAGAG TCAAATGGAT CTTCAAAAAA TCTAATTCAT AATTCTGAAA TCGAATCATC CAAAAAGATT AATGATGTTT AATTTGTCAT CGATTCAAGT GTCTGTATTG GAATTTTTGA TGGAATTATT 7TCTCCTCAA ACCAATCTTT GAGAGAAATC 7TT7GCAATA TTTCATTATT GTAATTTTTG TACTCTTCAA GTGATTTACT CGAGTAATTT 7A7TCTTCTC AGACTTTGTA GCTCAACTGT TTTCTGCCCT GTGATGAACT TACCTGAAG“ TGTAGGTTTT TCTTCATGCC ATTGTTCTTT GGACTTTCTC AATGGAATTC 7AATTTTCGT TTACTTACAT AAAAAAAAAA AAAA

AGAGGTCATG AAAAAATGTA GACCTGGTCA TCCTCTCCGA AAAACTGTTT ACTGCTATGG CAAGGTGATG GAACTATATA ATGCGGAACA AGCATTGGGA TGTCA7AAAG ACGTTACTGC TCGGAATTCG TCATTTGTGC GTCTTCAAGA AAATCCTGTT GGAAACGAAG TGCTCTTCAA TGAAAGTTTG TCAATACGAC ACAGATCAGT ACTACGATCC AGGGAACAAG TACAACAGTT TCGCGAATAC GCTGCATTTG GTGGGGCAAT TGAGAAACAT TTCCGAAAAC TAGCAGCTTT TGGCTATAAC TAGCACACTG GATAGTTGTC TTTTACTAGA TAATATGGAG ATATTCTGTA CAGCCACATT ACATATCTCG ATGGTTCTGT AATAGACACT ATGCGCTAAC TCCCATTATT TACCCTAAAT AGCCCTTGGG AACTAGCTTT ATGACGTATT TCCAACATGA CACATTCTCA AATTGCAGTG CC77A77G77 .A7TCGCTTTG GCTGTCTTCT TCTCTTTATC TACTACTTCA AAGAAAGAAA TAACTATTTT CCATAACTCA ATGCTTCACA T7G7AGAGA7 ATTTACTAAA AAAAATCACT TATTGCCTAA AAAAAAAAAA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1274

Informace pro řetězec č. 14 Vlastnosti řetězce:

délka: 3296 párů baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Popis řetězce č. 14:

GC7GAA i Cl·.-. CG7G7G7A77 AGGGAAGGAi ; - ATGTGAAC GG . . uTAA77 CCAAGAA7GT

C χ * \J

CTT G CT CAA G CAC7TACA.CC AGA7GC7CGT 7AG7G7CA.77

TC*»» <* * <» *

UAUAUrt 1 U

C7.AG77G77G 7G x GGGG77G 77 AT GG7A7 C AAAA CAA G A7

AGAGGGAA77 7 A CAA7G AAG CAT7GGAGCT 7G7AC77GAA AATCGACAAA

GGAG7ACG7C CGA7GAAGTT 7 G CAAGT GAG

GAAG7ACCGT

CGA7AAGAAG

X XVU 1 ΛΛ X x

TCA7GACGCT i r\u i x Uuu AATTGAG7AT ACGG77GGAA GG AAG CAAAG CAG7A7CGAG C GAAAAGG A7 T AAAAAA CTT zn x uuu X ΌΛυη ICu i UAl *Λ«

AAAAGACTTC 7C7CT7GCGG 777CAACGA7 GAGA7GGGCA AGGAGGG7GG G AAAAA7GGG AAA 7AG G G7G CACCTTGTAG GiGGGAACTG 777T7ACCA7 AG7AT7AGGA CCCTCTTCCT CACTTTCTCC TTGTATAGAT

ACTCCAA7CC GG7G7CACG7 GA7AG7GGiG AA7A7AAAAC TTCCCACCGG G AG G GAA CAA GAAC7CC7A7 GAAAAGGTG G Gi CGGCTATa ACCCCGAATG uz-uv 1UO X z\U

CATCCAAAAG

AGTGGTGATT

GCAG7TA7GG

CGCA7A7GGT

AAATGCATAG

ATGATCGCCC

AGGGAAAACT

GCTCGCAT7G

TGGTGGGATA

GGTCAGATAA

CGCGCTT7GA

GCTGCAGAAG

ACTATGT7GA

AAGAAGTTCT

GTCACTGACG

TGGACGACTC

AAATTAACGC

CATCCGAAAT

GAGATAAAGC

GGTGCTCCAT

AATGGTTGGA

ACAAGGAATG

GAGACTGTTT

ATAGCAATGT

CCAGCTCAAG

TTCATTACCA

GTCGTTGATA

TTCGATGACG

ATCGCCGCTC

GCT7TCGACA

CTACGCCTAG

GCTCTGGACA

GTAGCAGCAA

GATATCAT i G

ACTTCAGGAA

ATAAATGCTC

GATTGGATTA

TTTGAATTAC

ACTGTCTGTT

CCCAGTGATC

ACCTGAATTC

TCGATAGCTT

TAGTTATCTG

GTCT A A i.. ί ATTACTTTAC GCAAGGGCAA CATTGTCTTA AGAAGAATCT

Ar· .

<ΙΛυ 1 ΖΛ . 1 « «Μ * »

AG i

C77CT 7i_GGC CTCAT GCACCCCTAA CATGCATGGA GCACCAAAGC GGAT CACA7C

CACGCCCAGA

AG77CTACGA

T7CCTGATT7

TTGCTCATGA

ATCTGTGGTT

CTAAAGATGA

AAGCTGATTC

TTGAAGAAGC

GAGCCTTGAT

CGTATAGCAA

TCGAAGGTCC

AGATGGGCTT

AAAGTCGATA

ACGGATTTAA

GAACATGGCT

TTGTGGTGAA

AAAAGATAAT

TCATCATTAG

TTGAACTTCT

CCGGGATCTC

TGTACATGAT

ATAACTACAG

TGTTCTGCGC

AAGTCATGGC

CTCTCCGATC

AGGTGATGGA

CA7TAGGATG

GGAATTCGTC

ATCCTATTGG

AAAGTATAGG

TCCGCTCACA

GTCAATTTGG

AAAAACATTT

GTCGCCATTA

G*j'I ΤΑι» 1 u l i

TGAGGGGTCA

AATATTACTT

AGAAATTTGT

ATAAATATTG

TCGCAAAGCG AGACAATTCT CGATÍTGACG CACA77CGA? GC7 CAAT T CA AAAACACGAA TAAGAACCAA CAGCAACAG7 GATCGCTG GA CGAACCGAAA CGTCTCGAAT GAAGTTCTTG TGAA7ACA77 GGCCAAGAAG AGAT7TCTTT CTCAGCAGGA CGA7GACAGA GCTTGCCCAT GAATGAAGGT CGCCAGAATG GGTAGCGTCA C77TGATGAT TGGAGAAGAA TGCAGAAGCG AGACGGCAAA CCCAGTTATT TAAGGCGAAT ATGGGATATT GAGAAGAGA7 CGCAGACCGC CAAGCAGCTC CGATGCGTTT GAAATATGCC TTCGA7777G GAACATATTG AAACGACACG CCTTCGATCG GAAATGCAGG AAGTGTTTAT GCTTTATACG TCACAAAGAT ATTCGTACCT CGAAGAATTC AACGAAGCAC ACAGCAGATT TGCATTCGAT CCAAAAATTA ATCCAGATCT CCACTGAATG TTGTTGTCAC TTGCTTCATC TCATATTCGT TTTCTTTTGA ATCGCTAAAA

CTAGTAGC2

77CGA7ACC

CCCTCTCCC uuCu i u χ

AAGAAGATCT AT? G AAA G7 G CT G G A“AAA u C77 GG AGG Av C7TTCACAAA TACAAAGCAA GGAATCGAAG AC7AC7CGAC GAAGGTGAAA A7GACAAAAC ur\xnl Lw\i GCCATGGAGA TTCTATGCAC CAG7GGT77G T7TGCAAGAT AGGAAC7ACT. AGCCA7CGAC ATCACATACG AAACA7AAGC ACTGATC7AT CC7ATGAAAA 7CCGTAGGAG AAAGACGC7G CCA77G7GGT GAACCGC777 TATGGA77T7 AAGGACAATC GCTGCAGGCG GAAAAAGAAA AAGTACT7CG AAGCCGA7G7

CAAGACTGCA

GATGG7CAAG

TGTTA7GG7G

GCCGAAACAC

GTTAC7GC7T

ATGCAGGATA

ATTTTC.AA77

ACA7ATG77G

GACCAGC7GA

AAAGCAATCG

GCGGC777CT

TAAAGC7CGC

GAAČÍΓi ita

TTGAATAGTA

AAATTGTTAC

TTG7AGTCTG

77G7A7TGAT

AAAAAAAAAA

C7<i'—nG i Cvjkj CAGAAAAG G G CGGAAC7AC7 A7G7ACG7GG AAA7A7CAAT C7G7GATACC 7.AAAGGAG — A AT G.--ACA.--AT 7 C TAGCAGAG ATGAGCCCAT AC7GGACCGT 7GAACGGAGA GGn íGTCA,C CAAGGACGGo 77GG7TTGGA TCGC7C7GAA ACT GGGGT CT CGA7GAATAA GGGAC7TGG7 TCACGGAA7T .T7C7GA7TGA T77CCTTCAG CCAAAGGAGC A7GGAGTATC GGGGAGTTTT CCACGGAATT AG777AAC7C TGGAGAAAGA A7CAGGAAGG AC7TGCATG7 A7CGACAAAA A7GAGG777A CAACTGACGG CGGAATACC7 G7ACCGAGCC A7GAAAAAAG AAATCAACCT GGGAGAAA7A CAGCAACCGA TGAAGGAAGG TTGCCC7AGA TGAAAGGAC1 TCCCAAGTGC TCC7CA7TGA AGAAAG7GAT AGAATCTGCA AACGAGGACA TCAAGAAAGC 7AAGGAA7AT CCCACAAAAA AACAAAGCTC C77C7CTATA T7GCTCAGAA CC7TTTACAA AAAAAA

120

ISO

240

300

360

420

430

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3296

- 84 nformace pro řetězec č. 15:

Vlastnosti řetězce:

120

180

7C77CCAACC AACA7AAAAC CA77G7C77A CGATTTGACA ATCAAAACAT A7CTACCTGG 24 0

TTATGTGAAC TTCCCACCGG AGAAGAATCT CACATTTGAT GGGCGTGTCG AAATTTCAAC 3 00

GGTTGTCATT GAGCCAACAA AGAG7ATCGT CCTCAATTCA AAGAAGATC7 CAGTAATACC 36 0

CCCTGAATGT GAACTGGTAT CGGGCGGTAA AAAACTCGAA A7CGAAAATG TAAAGGATCA 4 20

CCCAAGACTG GAAAAGGTTG AGTTTCTTCT TAAGAACCAA CTGGAAAAAG A7CAACAAAT 4 80

CTTGCTCAAG G7TGCCTACA TCGGCCTCAT CAGCAACAGC CTTGGCGGAA TCTACCAGAC 54 0

CACTTACACA ACCCCGGATG GCACCCCCAA GATCGCTACA GTGTCACAAA ATGAGCCCAT 6 00

AGATGCTCGT CGGATGGTGC CATGCATGGA 7GAACCGAAA TACAAAGCGA ATTGGACCGT 66 0

TACTGTCATT CATCCAAAAG GTACAAAAGC CGTCTCGAAT GGCATCGAAA CGAACGGAGA 7 20

TGGAGAGATC AGTGGTGATT GGATTACGTC GAAGTTCTTG ACTACTCCGA GGATGTCATC 7 80

CTACTTGTTG GCAGTTA7GG TATCAGAATT TGAATTTATC GAGGGTAAAA CAAAGACAGA 84 0

TGTTCGGTTC CGTATATGGT CACGCCCAGA GGCCAAGAAG ATGACAAAAC TTGCTTTGGA 9 00

TTATGGTATC AAATGCATAG AGTTCTACGA AGA777C777 GATATCAGAT TCCCCTTAAA 96 0

GAAACAAGAT ATGATCGCCC TTCCTGAT7T CTCAGCAGGA GCCATGGAGA ACTGGGGTCT 1020

TATCACTTAC AGGGAAAACC CTTTGTTGTA CGA7GACAGA TTCTATGCAC CGA7GAATAA 1080

ACAGCGAATT GCTCGCATTG TTGCTCATGA GCTTGCCCAT CAGTGGTTTG GCGACTTGGT 114 0

TACGATGAAG TGGTGGGATA A7C7G7GG7T GAA7GAAGG7 TTTGCAAGAT TCACAGAATT 1200

CATTGGAGCT GG7AAGA7AA C7GAAGA7GA CGCCAGAA7G AGGAACTACT TCCTGATTGA 1260

TGTACTTGAA CGCGCGTTGA AAGCTGATTC CGTAGCGTCA AGCCATCCAC TTTCCTTCAG 13 20

AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTGAAGAAGC GTTTGATGAT ATCACATACG CCAAAGGAGC 13 8 0

TTCTGTTCTT ACGA7GC7GA GAGCGTTGAT CGGAGAAGAA AAACA7AAGC ATGCGGTATC 14 4 0

GCAGTATCTC AAGAAGTTCT CGTA7AGCAA 7GCAGAAGCG ACTGATCTAT GGGCAGTTTT 15 00

CGATGAAGTT GTCACTGATG TCGAGGGTCC AGACGGCAAA CCTATGAAAA CCACGGAATT 156 0

CGCAAGTCAG TGGACAACTC AGA7GGGC77 TCCAGTAATT TCTGTGGCAG AGTTTAACTC 1620

GACTACTCTG AAACTAACGC AAAGTCGATA 7AAGGCGAA7 AAGGACGCTG TTGAGAAAGA 16 8 0

GAAATACCGT CA7CCGAAA7 ACGGA77CAA GTGGGA7A77 CCATTGTGGT A7CAGGAAGG 174 0

CGA7AAGAAG GAGG7AAAGC GAGCATGGTT AAGAAGAGG7 GAACCGCTTT ACTTGCATGT 180 0

GAGTGATCCT GGCGCTCCAT 77G7GG7GAA TGCGGACCGC TATGGATTTT ACCGACAAAA 186 0

CCACGACACT AATGGTTGGA AAAAGATAA7 CAAGCAGCTC AAGGA7AA7C ATGAGGTTTA 1920

CAGTCCCCGG ACAAGGAA7G CCA7CA7TAG CGATGCGTTT GCTGCGGCTG CAACTGACGC 19 8 0

GA77GAG7AC GAGAC7G7AT TCGAACTTCT GAAA7A7GCC GAAAAAGAAA CGGAATACCT 204 0

A.CCGTTGGAA A7AGCAA7G7 CTGGAATCTC 77CGA7777G AAG7AC77CG GTACCGAGCC 2100

CGAGGCAAAG CCAGCTCAAA CA7ACA7GA7 GAACA7A77C AAGCCGATGT ATGAGAAAAG 216 0

CGA7ATCGAC TTCATTGCCA AAAAC7ACAA GGACGACAAG CTGTTTTTCC AAATCAACCT 2220

CCAAAAAGAT GTCATTGATA TGTTCTGCGC CCTTGGATCG CAAGACTGCA GGAAGAAATA 228 0

AAAAAACTT TTCGATGACA AAGTCATGGC GAAA7GCAGG GATGGCCAAG CAGCAACCGA 234 0

A7GCG7GAAA ATCGCCGCTC CTCTCCGATC AAGTGTTTAT 7G77A7GG7G TGAAGGAAGG 24 00

CGGTGATTAT GCTTTCGACA AGGTGATGGA GCTTTATACG GCCGAAACAC TCGCCCTAGA 24 6 0

AAAAGACT7C CTACGCCTAG CATTAGGATG TCACAAAGAT CTTACCGCTT 7GAAAGGAC7 2520

TCTCCTGCGG GCTCTGGACA GGAATTCGTC GTTCGTACGA ATGCAGGATA TCCCAAGTGC 258 0

TTTCAACGAT GTAGCAGCAA ATCCTATTGG CGAAGAA77C ATTTTCAATT 7CC77AT7GA 264 0

GAGATGGCCA GATATCGTTG AAAGTATAGG AACGAAACAC ACATATGTTG AAAAAGTGAT 27 0 0

ACCAGCTTGC ACTTCAGGAA TCCGCTCACA ACAACAGATT GACCAGCTGA AGAATCTGCA 27 6 0

CAAA.AATGGC ATAAACGCTC GTCAATTTGG TGCATTCGAT AAAGCGATCG AACGAGCACA 2820

AAA7AGGG7G GATTGGATTA AAAAACATTT CCAAAAATTA GCGGCTTTCT 7CAAGAAAGC 2’80

CACCTTGTAA TTCGTATTAC ATCACCATGA ATCCAGATCT TAAAACTCAC TAAGGAATGT 29 i 0

CTGGGAACTG ACTGTCTGTT GCTTACTGTT CCAC7GAA7G GAAGTTTTTA CCCA7AAAAA 3 0 0 0

TTTTTACCAT TTGCCTTCCG TCAGGGGTCA TTGTTGTCAC TTGAATAGTA AACAAAGCTC 3ι·ο0

AOTATTCCAC CCAGTCATCA A7AT7ACTT7 CGCTTCATCG AATTCTTACC TTCTCTATAC 3120

CCTCCTCCTA CCTCAATTCA CACATTTCTT CATATTTGTT TGTAGTCTCT TGCTCAGAAC 3180

ACTTTCTCTT CGATAGCTTT TTGTTTCTTT 7TCTT77GA7 TCTATTGATC CTTTTACAAT 324 0

TGTATAGATT AGTTATCTGA TAAATATTCA TCGCTAACGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3 300

A/LAAAAAAAA z\AAAAAAA/t 3 319 informace pro řetězec č. 16: Vlastnosti řetězce:

delxa: 30 aminokyselin typ: peptid

Popis řetězce č. 15:

Asp 1

Asn

Ser

Pxo

Sex 5

Aia

Glu

Glu

Leu

Leu 10

Leu

Pro

Thx Asn Ile 15

Lys

Pro

Val

Sex

Tyx 20

Asp

Leu

Lys

Ile

Ala 25

Thx

Tyx

Leu Pxo Gly 30

Infrormace pro řetězec č. 17: Vlastnosti řetězce:

délka: 15 aminokyselin typ: peptid

Popis řetězce č. 17:

Leu Tyx Leu Ais 1

Glu Asp Val Gin Leu Xaa Lys Gly Ile Leu-'Ph ⁵ 10 i tn <0

Informace pro řetězec č. 18: Vlastnosti řetězce:

délka: 15 aminokyselin typ: peptid

Poois řetězce č. 18:

5U A xa Tyx A.sp G.

ser Ty, Xl. _{Asp Asn Lys cin}

Informace pro řetězec č. 19: '/lastncsti řetězce:

délka: 20S2 páru baží typ: nukleová kyselina typ řetězce: dvojitý topologie: lineární

Poois řetězce č. 19:

Gu .11AATTA

ACCACGAAAA

GG7AGC7GC7

7GA7AC7AC7

AGC7GAAGAA

AACG7A7C7G

TG7GGTGA77

7A77CZ7G7A

AAAGG7TG7G

GAAGAATCAG

AGGACTT7AT

TCATATGGAA

GGCAAACTGG

AGAAAAGGGA

GCGAATGCCT

TACGAAAAGC

ATATGCCATG

A7TCCCACTT

GAACT GGGGT

ACCAATGAAT

CGGTAATTTG

ATTCGTGGAA

CTTCCTGCTG gctttccttc

CCGTAřAGGA

GCAG7CTG7T

ATGGGCAGCA

AATGTCCGAG

GTCGGTTAAC

AAAGGAACCA

GTATCAGGAA

TITCCATGTA

CCGATCAAAC

TAAGGTGTAT

AGTTGAGGAA

GGATTACTTA

CAGCGAACCC

TGACAAGAGT

AAATAATCTC

TGAAGAAATG

GACCGAZTGC

GGAAGGZGGT

CCCAAGTTTG AGATGACAGC AATACAGTGC TACGGCTCAC GCCGTCGGCC TCTCAATCGG GGCGGAAATG GAAAAGGGGA TTACGTCTCC CAACAACCAT CCAAACTATG TAAACTATCC GCTATGGAAG T7GTGGAGCC ATTGCAGACC AGTGCGAACT GATCAGCCAA GGCTGGAGAA AAAATCACGC TCAAGATTGT rc

TGATG i¹ □ ..*

CACAGAGCGA

AGTGATCAAA

TCTATACAAA

ATCGCAACAC

AAAATC7AAT

CATCCA/XAAA

TCAtrCCATTC

AGAGGAGAGT CAGGAGCAGG CCCAATCAAG TCTCT TCTCACCTAT TACTTTACAA TCAACCTATT GTCGATGATA AAAACCTTTG ACATACGACT ACCTGAGAAA GATTTCGCTA AACAAAG7CT ATTGTGCTCA GTTTTCTAAC AACCAAAAAC AGTCGAATTC GTTTTGAAGA ATACATTGGC CTTATCAACG

CGAACAACCT ACACGGATAA AGATGGTACA ACCAAGATTG CCGACGGACG CCCGTCT7AT GGTCCCCTGT TTCGACGAGC ACTGTGACTG TGATTCATCC GAAGGGCACC AGTGCCGTG7 GAAGGAGAAG TCTCTGGCGA TTGGGTCACA ACCAGATTCG TCGTATTTGA TTGCTCTTGT GA7TTCCGAA TTTAAGTACA GGTGTTCGAT TCCGAATTCC GGCTCGTCCG GAAGCTATGA ATAGCTGGAA TCAAATGTTT GGATTACTAT GAGGACTTCT CCAAAACAAG ATATGGTTGC TCTTCCTGAC TTCTCATCTG CTCATCACAT ACAGGGAGGG TTCCGTGCTC TACGATGAAA AAGGAGCGGG TTGCAGAAGT GATCGCGCAC GAACTTGCAC GTCACGATGA AGTGGTGGGA TAACCTATGG CTGAACGAAG TACATCGGAG CCGACTTCAT CAGCGATGGT CTATGGGAAA GCACCGTACA CAAGTGGTAT TACGGCTGAT GCAGTAGCTT AGAATAGATA AGGCTGCAGA TGTATCAGAA GCGTTCGATG GCATCCCTTC TTCAAATGCT ATTGAATTTA GTTGGGGACG TCGCGTTACC TCAAGAAGTT TTCATATGAT AATGCGGCTG TTCGACGAAA CCGTCCAAGG TATAACCGGA CCTAATGGTG TTTGCGCCAC AATGGACAAC TCAGATGGGG TTCCCTGTTC GCAACGACTT TGAAAGTCAC CCAAAAACGA TACAGGCAGA GAGAAGTACC GTCATCCAAC TTATGGGTTC AAATGGGATG GATGAACAGC AAGTGAAAAG AACTTGGTTA AAAAGAGAGG AGCAATTCTG ATTCCTCAGT TGTGGTGAAT GCCGAACGTC TATGACGCTA ACGGTTGGAG GAACATTATG AGAAGACTCA GGTCCACGAA CAAGAAACGC TCTCATAAGT GATGCGTTTG ATGAATTACG AGACCGTATT TCAAATGCTC AAATACACCG CCATGGAAGG AGGCAATATC AGGATTCAAT ACAATTTTGG GAATCTCAAT GGGCTTCGGA ATACATGCGA AAACTGATGA AGCATCAAGT TTATAGCGGA GAACTACAAA AAAGATTCGC CAAATAGCTG TTATTGACAC ATACTGTGGT CTTGGAGGCA AAAAAGCTTT TTGACAAGGA GGTCATGAAA TGTCAACCTG GTAAAGGTAA CTGCTCCTCT CCGAAAAACT GTTTACTGCT GATGAGGCAT TCGACAAGGT

GACAGTCTAC GTGAAGCATT ATGCTGCCTT TGGATCGGAA AACATTGTAT CCAGAAATCC TGGGAAGAGA TACTTGAAAG GCCTGTACTC GAGGACTACG

GATGGAACTA TATAATGCGG GGGATGCCAT AAAGACGTTA TTCGTCATTT GTGCGTCTTC TGTTGGAAAC GAACTGCTGT TTTGTCAATA CGACACAGAT ATCCAGGGAA CAAGTACAAC

AATGACAAGC GTGCTCGCGA ATACGGTGCA TTTGGTGGGG AGAGTCAAAT GGATTGAGAA ACATTTCCGA AAACTAGCAG TCATAATTCT GAAATGGCTA TAACTAGCAC ACTGGATAGT GATTAATGAT GTTTTTTTAC TAGATAATAT GGAGATATTC AAGTGTCTGT ATTG

AGACGCAGCA TGT7AGT

GGAAAGCTTT ATTCCCCATC TAGTAATCAA 77GA7GGGAC ACTCGAAAAA TCGACATCGA AAAAGCTGGA ACATGCTTGG CTGCATGCAC CGACGTTTAA CGAATGGAAT ATCCAACCCC TTGAAAATTA AGATGACAGA TCGGGATCAA GTGCTATGGA ACCTCTACGG ATCAGTGGTT GATTCGCGTC TGAAAGATTT CAAGCCATCC ATATCACATA AAAATTTCAA CTGAAGATTT GACCATTGAA TTACTGTCGA ACAAGGATGC TTCCTCTGTG AACCGCTCTA GTGCTTTTTG AGCAGAATCA CAGCAGCTGC TGAAAGAAGA ACT7TTTCGG AGCCAATTTA 7777C77CAA AAGAATGTCT GTCAGCAAGC ATGGGGTCCA AACAAGTGCA CAGC7C7AAA AAGA7GC7CA 7CAA777CC7 CAGTTGA7CG AG77GAAGAA CAA7AGAAAG C777C77CAA 7CTC7CGAA7 7G7AAA777G

120

ISO

2-50

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2530

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3084

řetězce č. 27:

GG. iTAAí ,A CCCAAGTTTG AGATGACGGC CTCACCTATC AGCC7AC7TT GTACATTATT TGGTCTTACC TATTACTTCA CTCG7AAAGC TGACAGTGGT GG7AAAGAAA AGGATAATTC GA-ACATAAAA CCAGTCTCCT ACGACTTGAA c.. ICCACCA GAAAAGAATC TGACA^JJi¹ i GA TGAGCCTACA AATAG7ATTG TGCTGAACTC CGAACTGTTC TCAGGTAATC AGAAACTTGA TGACAAGCTT GAGATTACCC TCAAAAATCA GATCACTTAC ACCGGCCTTA TTAGCGACAC TGATAAGGAC GGAAAAACTA AGATCGTTGC TCGTATAGCG CCATGCTTTG ACGAACCGAA TCATCCCAAA GGTACAAAGG CTGCATCGAA CAAGGGTGAT TGGATAACGT CTAAATTTAA GGCTATTATT GTTTGTGAAT TTGAATACAT CCGTATATGG TCTCGACCAG AGGCGAAACG CAGATGCCTG GAGTTCTATG AGAAGTTCTT TATGATTGCT CTTCCTGATT TCACCGCTGG TAGAGAGGAT TCTCTCCTAT ACGATGAAAA TGCTCTCGTA GTTGCTCACG AGCTTGCTCA GTGGTGGGAT GATACGTGGT TGAACGAAGG GGACGAAATT AGCCACAACA ATTTCAGAAC TCGCGGAATG AGAGCTGACT CGGCAGCATC AGCGGCAGAA GTTGCCGAAG CCTTTGACGA CACTATGCTA CGGGCTTTGA TTGGAGAGGA CAAGAAGTTC TCCTACAGCA ATGCACAAGC TGTCAAAGGT GTTAAGGGTC CTGACGGCAA G7GGACGTAT CAGATGGGTT ATCCTGTGGT AAAGGTTACG CAGAGCCGGT ACAAGACAAA TAATCCAAAA TACGGGTTCA AGTGGGATGT AGAGGTGAAG CGAACATGGC TAAAAAGAGA GGATACATCC CTTGTGGTGA ACGCTGATCG CAACGGTTGG AAAAAGATAA TCAAGCAGCT GACAAGGAAC GCTATCATAA GCGATGCA1 í TGAAACTGTA TTCGAACTAC TTGAATATGC GGAAGCTCTG TCCGGCATGT TCGCAGTTTT ACCAGCTAGA GCTTACATGA TGAGCATATT TTACATCGTC AAGAATTATT TGGATGATAC TATCATTGAT GCATATTGTT CCCTTGGATC CTTCTACGAT GAGGTTATGC CCAAGTGTAA GGTTTCCGCT CCTCTTCGAG CCAATGTTTA AGCTTTTGAA AAGGTGATGG GGCTGTATCT CCTGTTCAAA GCCTTGGCAT GCCACAAAGA AGCCCTGGAC CG7AAATCGT CGTTTGTGCG TGTATCTGAA AACCCTGTGG GCGAAGAATT GGAAATCACT CCGAGCTTGG AAACAGAACA TTGCACAGGA ATTCGCTCCC AACAACAAAT TGCGCAGGCT AAGAAGTTCG GCTCATTCAC TGCCTGGA7C AAGAAACATT TTCACAGATT GCTTTTCACA CTCAGCTCCA ATTTTAACCT CTCACTTTCA CATTTTCCGT TTGAATGCCA TAAC7ACCTT TCATTCACAG TGATTACTGA GAACGTTATC ATCCGTGACT TTCAATTTAT GACTTGCATT TAACACCCAC CATTTACCAC TCCGATCACC TCCACCCCTG ACAATCCCCA CTGTTTCCAT CCCCCGTTC7 TTCTCAATTC

GGAGTGGCAG AAGCGTCGAA TCTTGGGCT7 TGTATTAGCT GCTGCCGTTG GACTCTCCAT ATTCGATACC ACACAAAAAG AACAGAAGGA TCCT7CTGCA GAAGAACTAC TTCTTCCAAC CATCAAAACA TATCTACCGG GTTACGTGAA TGCCCATGTG GAGATTGCTA TGGTTGTGGT GAAGAAAATC ACTTTGGCAC AAGGAGGATG CATCGAAAGT GTAAAGATGC AGGAAAGACT GCTGCAAAAA GATCTGAAAA TCCTGCTCAA TCTCGGTGGG CTCTACCAGT CGATCTACAC TGTTTCACAA AATGAACCAT CAGACGCTCG GTACAAGGCA ACATGGACTG TCACCGTCGT CGGCATTGAA GGAAA7GGAA AAGGGGAGG7 AACTACCCCA CCGATGTCGT CCTATT7ATT TGAAGGATTT ACAAAAACGG G7G77CGG77 AATGACGGCA TACGCTTTGG ATGCTGGCAT TGACATAAAA TTCCCTCTGG AAAAACAAGA ŤGCCATGGAA AACTGGGGCC TTA7CACTTA AATTTATGCA CCGATGAATA AACAGCGGGT TCAGTGGTTC GGCAATCTGG TCACACTGAA TTTTGCAACA TTTGTTCACT ATCTTGGAAT GCAAGATTTC TTCTTGCTCG ATGGAATGGA GAGCCATCCG CTTTCGTTTA GGATTGACAA TATTTCATAC GCCAAGGGAG CGTCAGTTCT CAATTACAGG AATGCTGTTG TGCAATACCT AGCCGATCTG TGGAACCTCT TCAA7GAAGT CGTCATGAAA ATCGACCAAT TTACCGATCA TAAAGTAGAA GAATTTAATG CGACCGCCCT TAAAGACGCC TTGGAACCAG AGAAATATCG TCCCCTATGG TATCAGGAAG GCAATAGCAA TGAACCGCTG TACTTGAACG TCAACAATCG ACATGGATTT TATCGACAAA ACTATGATGC CAAGAAAGAT CACAAGGTCT TCGGTCCAAG TGCTGCAGCT ACGATTGACC CAATCGACTA CAAAAATGAA GAGGAATTCT TGCCTTGGAA AAAGTTCTTC GG7AATGAGC CGGAGACAAA AGAACCGATG TATAATAAGA GCAGCATTGA GTTATTCACA AAAATTAATA CTCAAAAGGA AAAGGACTGT ATAAAGCAAT ATAAGGATAT GGCCGGGGAA GCAGCAACCA AATGCGTTAA CTGTTATGGT GTACAGGAAG GTGGTGAAGA AGCAGAAGAT GTTCAACTGG AGAAGGG7AT TGTTACAGCT CTAAAAGAAC TTCTTTTGCG TCTTCAGGAT GTCCCTACCG CTTTCCGTGC CATGTTCAAT TTCCTAATGG AGAGATGGGA CAGAGCAGTT GATAAAGTGG TCGGCGCTTG AGATCAGCTG AAGAATCTAC AGAAGAACAA CCAGGAAATC GAAAAACGAG AACATAAAAT ATCGGAATTC TTCAAGAGAG CAAGATCATA CTTCAAACTA GGAGACACTT TTGCTGAAAA TCCATTCGAA TACAACCAAT AATACCATTT ATTTCGAATA TATCATCAAG CTTGTATCTT ACACCTCACT CTCCAT7TTG TAGCTGTGAT CC7ACAATCT 7TCCCCAA7A CATTCCAAAC GATTTCTTTT TTTCTCTCCT ATCCATCTAA CTTATCTCAT AAATATTGAC GTTGGTGT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3358

- 88 Ir.f c rmmace pro řetězec č. 21: Vlastnosti řetězce:

délka: 3365 párů baží typ: r.uklecvá kyselina tyt řetězce: dvojitý tctclcgie: lineární ? c t i s řetězce č. 21:

G<j i * . A.A. . A C2ZAAG i i ÍG AGGG7G7GGA 7C .AGA7GAC G7CGGAGGGG AGAACGCGGA CA i * GG ; GAA 7C7AAC7CGA A7CCG7GT7A 77G7CGCA77 A.T'7G7AG7A GG7GG7GCAG 7CGGCG7C7G 7A77GG7C7C ACC7A77AC7 77AG7CGCAA AGGG7TCGA7 ACCTCAGAAA AGCCAGGGA.A GGA7GA7AG7 GG7GGCAAGG ACA.AAGACA.A 77C7CCC7C7 GCGGGGGAAC 7AC7GG77GC AAG7AA7A7A AAACCAT7C7 C77ACCAC77 GACGA7CAAA ACA7A7C7AC C7GG77A7G7 GGACTTCCCA CCGGAGAAAA ACGTCACA77 CGA7GGGCG7 GTCGAAA7AT CAATGG7TG7 AATTGAGCGA ACAAAGAG7A 7CG7AC7CAA TTCA.AAGAAG ATC7CTGTAA TACCCCAAGA A7G7GAAC7G G7A7CGGGCG ATAAAAAACT CGAAAITGAA AG7G7AAAGG AGCACCCAAG AC7GGAAAAG G7TGAGTT7C 7TATCAAAAG CCAACTGGAA AAAGA7CAAC AAATCT7GC7 CAAGGTCGGC 7ACATCGGTC TCATCAGCAA CAGC7TTGG7 GGAA7CTACC AGACCACTTA TACCACCCCG GATGGCACCC C7AAGATCGC TGCAGTTTCA CAAAATGAGC CCATAGATGC TCGTCGAATG GTACCATGCA 7GGA7GAACC GAAATACAAA GCAAACTGGA CCGTTACTGT CATTCATCCA AAAGGCACCA AAGCCGTCTC GAA7GGAATC GAAG7GAACG GAGATGGAGA GATCAGTGGT GATTGGATCA CATCGAAGTT CTTGACTACT CCACGGATGT CATCCTACTT GTTGGCAGTT ATGGTTTCAG AA777GAA7A CATCGAAGGT GAAACAAAGA CGGGTGTTCG GTTCCGTATA TGGTCACGCC CAGAGGCAAA GAAGATGACA CAATATGCTC TGCAATCTGG TATCAAGTGC ATAGAATTCT ACGAAGATTT C77TGA7A7C AGATTCCCTC TGAAGAAACA AGA7ATGATT GCCCTTCCTG ATTTCTCTGC CGGTGCCATG GAGAAT7GGG GCCTCATCAC TTACAGGGAA AACTCTTTGT 7G7ACGA7GA CAGATTCTAT GCACCGATGA ATAAACAGCG AATTGCTCGC ATTGTTGCTC ATGAGCTTGC TCATCAGTGG TTCGGCGACT TGGTTACGAT GAAGTGGTGG GATAATTTGT GG77GAATGA AGGTTTTGCA AGATTCACAG AATTTATTGG AGCTGGTCAG ATAACTCAAG ATGACGCCAG AATGAGGAAC TACTTCCTGA TTGATGTACT TGAACGCGCT TTGAAAGCTG ATTCGGTAGC GTCAAGCCAT CCACTTTCCT TCAGAATCGA CAAAGCTGCA GAAGTTGAAG AAGCCTTTGA TGATATCACA TACGCCAAAG

GAGCTTCTGT TCTTACTATG CTGAGAGCCT TGATTGGAGA AGAAAAACAT AAGCATGCAG TATCGCAGTA CCTCAAGAAG 7TC7CG7A7A GCAA7GCAGA AGCGACTGAT CTATGGGCAG TTTTTGATGA AGTTGTCACT GACGTCGAAG GTCCAGACGG CAAACCTATG AAAACCACAG AGTTTGCAAG TCAGTGGACG ACTCAGA7GG GCT7CCCAGT TATTTCCGTA GCAGAGTTTA ACTCGACTAC TTTGAAATTA ACGCAAAGTC GATATGAGGC GAATAAAGAC GCTGTGGAGA AAGAGAAGTA CCGTCACCCG AAATACGGA7 TTAAATGGGA TATTCCAC7G TGGTATCAGG AAGGCGATAA GAAGGAGATA AAGCGAACAT GGTTGAGAAG AGATGAACCG CTTTACTTGC ATGTTAGTGA TGCTGGCGCT CCC7TTG7GG TGAACGCAGA CCGCTATGGA TTTTATCGAC AAAATCATGA CGC7AA7GGT 7GGAAAAAGA TAATCAAGCA GCTCAAGGAT AA7CATGAGG TT7ACAGTCC CCGGACAAGG AATGTCATCA 77AGCGA7GC GTTTGCTGCG CCTGCAACTG ACGCAATTGA G7A7GAGAC7 GTATTTGAAC TTCTGAATTA TGCCGAAAAA GAAACGGAAT ATCTACCATT AGAAATCGCA ATGTCCGGGA 7C7C77CGA7 TTTGAAATAC TTCCCTACCG AGCCAGAGGC AAAGCCAGCT CAAACATACA TGATGAACAT ATTGAAACCG A7G7A7GAAA AAAGCAGTAT CGACT7CA77 GCCAATAACT ACAGAAATGA CAAGCTGTTT TTCCAAATCA .ACCTCCAAAA AGA7G7CA77 GATATGTTCT GCGCCCTCGG A7CGCAAGAC TGCAGGAAGA AA7A7AAAAA ACTTTTCGAT GACGAAGTCA TGAACAAATG CAGGGA7GGT CAAGCAGCAA CCGAATGCGT AAGAATCGCC CCTCCTCTCC GATCAAGTGT TTATTGTTA7 GGTGTGAAGG AAGGCGGTGA TTATGCTTCC GACAAGGTGA TGGAGCTTTA TACGGCCGAA ACACTCGCCC 7AGAAAAAGA CTTCCTACGC CTAGCATTGG GA7G7CA7AA AGA7G7TAC7 GCTTTGAAAG GAC7TCTCTT GCGGGCTCTG GACACGAATT CGTCGTTCGT ACGTATGCAG GATATCCCAA CTGCTTTCAA CGA7G7AGCA GCAAATCCTA TTGGCGAAGA ATTCATTTTC AATTTCCTTA

77GAGAGA7G GCCAGA7A7C ATTGAAAG7A 7AGGAACGAA GCACACATAT GTTGAGAAAG TGATACCAGC CTGCACTTCA GGAATCCGCT CACAACAGCA GATTGACCAG C7GAAGAA7C TGCAGAAAAA 7GGCA7GAAC GCTCG7CAA7 TCGGTGCATT CGATAAAGCA A7CGAACGAG CACAAAATAG GG7GCAT7GC A77AAAAAAC A777CCAAAA A7TAGCGGC7 T7C77CAAGA AAGCCACC77 G7AA77CGAA 77ACA77GCC AG7AA7CCAG A7CT7AAAGT 7CA7GAAGGA A7A7GACAGG GAAC7GAC7G 7C7G77CC7C AC7GT7CCAC 7GAA7GGAAG 77777ACC7A CAAAAAT77T 7A7CG77A7A 777GCCT7CC G7GAGGGG7C AT7G77G7CA CT7CAA7AG7 AAACAAAGC7 CAG7AT7GGC AACCG7AGAA CAA7AT7ACT 77CGCT7CA7 CAAA77C77A 7CT7CCC7A7 ACCC7CT7CC 7AAC7CAA77 CGGAAA777C T7CA7A77CC 77TC7AC7C7 CTTCCZTCAGA ACAC7T7C7C CTCAA7ACCT 7CT7G777CT ΤΤΤΤΓΓΓΓΓσ A7TCTAT7GA 7CG77T7ACA A77G7A7AGA T7ACTTATC7 7ATAAA7A7T GA7GG77AAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΛ AAAAAAAAA

SO

120

ISO

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1250

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 27 6 0 2820 2980 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300

3360

3369

Lttu Ala	Pto	Ty r	Thr . 440	Ser	Cly	Ile Thr Ala Aso Ala val Ala Ser
445	450
S<tl His	Pto	Leu	Ser	Phe	Arg	Ile Asp Lys .	Ala Ala Asp Val ser
			455			460	4 6 5
C. u /a 1 a	Phe	Asp	Asp	Ile	Thr	Tyr Arg Lys -	Gly Ala Ser Val Leu
			470			475	4 80
Gin Met.	Leu	Leu	Asn	Leu	val	Gly Asp Glu	Asn Phe Lys Gin Ser
			485			490	495
Ve 1 Ser	Arg	Tyt	Leu	Ly s	Lys	Phe Ser Tyr	Asp Asn Ala Ala Ala
			500			505	510
Gi u Asp	Leu	Trp	Ala	Ala	Phe	Asp Glu Thr	Val Gin Gly Ile Thr
			515			520	525
Gly Pro	Asn	Cly	Gly	Pro	Leu	Lys Mec Ser	Glu Phe Ala Pro Gin
			530			535	540
Tip Thr	Thr	GLn	Mec	Gly	Phe	Pro Val Leu	Thr Val Glu Ser Val
			545			550	555
Asn Ala	Thr	Thr	Leu	Lys	Val	Thr Gin Lys	Arg Tyr Arg Gin Asn
			560			565	57 0
'Lys Asp	Ala	Lys	Glu	Pro	Glu	Lys Tyr Arg	His Pro Thr Tyr Gly
			57S			580	585
Phe Lys	Trp	Asp	Val	Pro	Leu	Trp Tyr Gin	Glu Asp Glu Gin Gin
			590			595	600
Val Lys	Arg	Thr	Trp	Leu	Lys	Arg Glu Glu	Pro Leu Tyr Phe His
			605			610	615
Val Sex	Asn	Ser	Asp	Ser	Ser	Val Val Val	Asn Ala Glu Arg Arg
			620			625	630
Ala Phe	Cys	Arg	Ser	Asn	Tyr	Asp Ala Asn	Gly Trp Arg Asn Ile
			635			640	645
Met Arg	Arg	Leu	Lys	Gin	Asn	His Lys Val	Tyr Gly Pro Arg Thi
			650			655	660
Arg Asn	Ala	Leu	Ile	Ser	Asp	Ala Phe Ala	Ala Ala Ala Val Glu
			665			670	675
Glu Met	Asn	Tyr	Glu	Thr	Val	Phe Glu Met	Leu Lys Tyr Thr Val
			680			685	690
Lys Glu	Glu	Asp	Tyr	Leu	Pro	Trp Lys Glu	Ala Ile Sex Gly Phe
-			695			700	705
Asi Thi	Ile	í Leu	, Asp	Phe	: Phe	ϊ Gly Ser Glu	Pro Glu Ser Gin Trp
			710			715	720

Ala

Ser Glu

Tyr

Mec

Arg

Lys

Leu

Met

Lys

Pro

Ile

Tyr

Asp

Lys

725

730

735

Se:

Ser Ile

Lys

Phe

Ile

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Lys

Asp

Ser

Leu

740

745

750

Phe

Phe Lys

Asn

Asn

Leu

Gin

Ile

Ala

val

Ile

Asp

Thr

Tyr

Cys

755

760

765

Gl·,'

Leu Gly

Gly

Lys

Glu

Cys

Leu

Glu

Glu

Met

Lys

Lys

Leu

Phe

770

775

780

Asp

Lys Glu

Val

Mec

Lys

Cys

Gin

Pro

Gly

Gin

Gin

Ala

Thr

Asp

785

790

795

Cys

Val Lys

Val

Thr

Ala

Pro

Leu

Arg

Lys

Thr

Val

Tyr

Cys

Tyr

800

805

810

Gly

val Gin

Glu

Gly

Gly

Asp

Glu

Ala

Phe

Asp

Lys

Val

Mec

Glu

815

820

825

Leu

Tyr Asn

Ala

Glu

Gin

Val

Gin

Leu

Glu

Lys

Asp

Ser

Leu

Arg

830

835

840

Glu

Ala Leu

Gly

Cys

His

Lys

Asp

val

Thl

Ala

Leu

Lys

Gly

Leu

845

850

855

Leu

Mec Leu

Ala

Leu

Asp

Arg

Asn

Ser

Ser

Phe

Val

Arg

Leu

Gin

860

865

870

Asp

Ala His

Asp

Val

Phe

Asn

Ile

val

Ser

Arg

Asn

Pro

va 1

Cly

875

880

885

Asi

Glu Leu

Leu

Phe

Asn

Phe

Leu

Thr

Glu

Arg

Trp

Glu

Glu

Ile

890

895

900

Lev

Glu Ser

Leu

Ser

I le

Arg

His

Arg

Ser

val

Asp

Arg

Va 1

Ile

905

910

915

Lvr

Ala Cys

Thr

Arg

Cly

Leu

Arg

Ser

Arg

Glu

Gin

Va 1

Gin

Gin

920

925

930

Lev

Lvs Asn

Leu

Tyt

Lvs

Asn

Asp

Lvs

Arg

Ala

Arg

Glu

Tvr

Gly

A 1 β τ I e

Asn

PC.e

Glu

Se:

G lv h: s

A l β 9 5 0 Phe 9óS

Ί 0 le Clu Arg Se: Clu 955 : c Lys Leu Ala Ala 970

		9 4 5
Η 1 S	A: g Val	Lvs T:p 9óQ
Pne	Pne Lys	Lvs Se: 975

Me: Thr	Aia	Glu	Trp Gin	Lys	Arg	Arg	Ile	Leu Gly	Phe	Ser Pro
1			5				10			15
Ile Ser	Lsu		Cys Thr	Leu	Phe	Val	Leu	Ala Ala	Ala	Val Gly
			20				25			30
Leu Ser	I le	Gly	Leu Thr	Τνχ	Tyr	Phe	Thr	Arg Lys	Ala	Phe Asp
			15				40			4 5
Thr Thr	Gin	Ly s	Glu Gin	Lys	Asp	Asp	Ser	Gly Gly	Lys	Glu Lys
			50				55			60
As? Asn	Ser	Pro	Ser Ala	Glu	Glu	Leu	Leu	Leu Pro	Thr	Asn Ile
			65				70			75
Lys Pro	Val	Ser	Tyr Asp	Leu	Asn	Ile	Lys	Thr Tyr	Leu	Pro Gly
			80				85			90
Tyr Val	Asn	Phe	Pro Pro	Glu	Lys	Asn	Leu	Thr Phe	Asp	Ala His
			95				100			105
Val Glu	Ile	Ala	Met Val	Val	Val	Glu	Pro	Thr Asn	Ser	Ile Val
			110				115			120
Leu Asn	Ser	Lys	Lys Ile	Thr	Leu	Ala	Gin	Gly Gly	Cys	Glu Leu
			125				130			135
Pne Ser	Gly	Asn	Gin Lys	Leu	Asp	Ile	Glu	Ser Val	Lys	Met Gin
			140				145			150
Glu Arg	Leu	Asp	Lys Leu	Glu	Ile	Thr	Leu	Lys Asn	Gin	Leu Gin
			155				160			165
Lys Asp	Leu	Lys	Ile Leu	Leu	Lys	Ile	Thr	Tyr Thr	Gly	Leu Ile
			170				175			180
Ser Asp	Thr	Leu	Gly Gly	Leu	Tyr	Gin	Ser	Ile Tyr	Thr	Asp Lys
			185				190			195
Asp Gly	Lys	Thr	Lys Ile	Val	Ala	Val	Ser	Gin Asn	Glu	Pro Ser
			200				205			210
Asp Ala	Arg	Arg	Ile Ala	Pro	Cys	Phe	Asp	Glu Pro	Lys	Tyr Lys
			215				220			225
Ala Thr	Trp	Thr	Val Thr	Val	Val	His	Pro	Lys Gly	Thr	Lys Ala
			230				23 5			240
Ala Ser	Asn	Gly	Ile Glu	Ala	Asn	Gly	Lys	Gly Glu	Leu	Lys Gly

245 250 255

Asp

Trp

Ile

Thr

Ser 260

Lys

Phe

Lys

Thr

Thr 26 5

Pro

Pro

Met

Ser

Ser 27 0

—.. 1 } -

Leu

Leu

Ala

Ile

Ile

Val

Cys

Glu

Phe

Glu

Tyr

Ile

Glu

Gly

27 5

280

285

Phe

Thr

Lys

Thr

Gly

Val

λΖ

Phe

Arg

Ile

Trp

Ser

Arg

Pro

Glu

290

29 5

300

Ala

Lys

Arg

Met

Thr

Ala

Tyr

Ala

Leu

Asp

Ala

Gly

Ile

Arg

Cys

305

310

315

Leu

Glu

Phe

Tyr

GLu

Lys

Phe

Phe

Asp

Ile

Lys

Phe

Pro

Leu

Glu

320

325

330

Lvs

Gin

Asp

Met

Ile

Ala

Leu

Pro

Asp

Phe

Thi

Ala

Gly

Ala

Met

335

340

345

Glu

Asn

Trp

Glv

Leu

I le

Thr

Tyr

Arg

Glu

Asp

Ser

Leu

Leu

Tyr

350

355

360

Asp

Glu

Lv s

1 le

Tví

Ala

Pro

Met

Asn

Lvs

Gin

Arg

val

Ala

Leu

365

37 0

375

Ala va 1

Val Ala

His Glu Leu 380

H i s

Gin Trp 385

Phe

Glv Asn Leu

Va l 390

Thr Leu

Lvs

Trp

Trp

Asp

Asp

Thr

Trp

Leu

Asn

Glu

Glv

Phe

Ala

395

400

405

ťh: Phe

Val

Glu

Tyr

Leu

Gly

Mec

Asp

Glu

Ile

Ser

His

Asn

Asn

4 10

4 15

420

Phe Aig

Thr

Gin

ASp

Phe

Phe

Leu

Leu

Asp

Gly

Mec

Asp

Arg

Gly

425

430

435

Hec Arg

Ala

Asp

Ser

A la

Ala

Ser

Ser

His

Pr o

Leu

Ser

Phe

Arg

440

445

450

Cle Asp

Lys

Ala

Ala

Glu

Val

Ala

Glu

Ala

Phe

Asp

Asp

Ile

Ser

455

460

465

Tyx Ala

Lys

Gly

Ala

Ser

Val

Leu

Thr

Mec

Leu

Arg

A la

Leu

Ile

470

475

480

Gly Glu

Asp

Asn

Tyr

Arg

Asn

Ala

Val

Val

Gin

Tyr

Leu

Lys

Lys

485

490

495

5he Ser

Tyr

Ser

Asn

Ala

Gin

Ala

Ala

Asp

Leu

Trp

Asn

Val

Phe

500

505

510

Asn Glu

Val

Val

Lys

Gly

Val

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Asn

Val

MeC

515

520

525

Lys Ile

Asp

Gin

Phe

Thr

Asp

Gin

Trp

Thr

Tyr

Gin

Mec

Gly

Tyr

530

535

54 0

Pro Val

Val

Lys

Val

Glu

Glu

Phe

Asn

Ala

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

545

550

555

”hr Gin

Ser

Arg

Tyr

Lys

Thr

Asn

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Pro

Glu

560

565

57 0

l.ys Tyr

Arg

Asn

Pro

Lys

Tyr

Gly

Phe

Lys

Trp

Asp

Val

Px©

Leu

575

580

585

Trp Tyr

Gin

Glu

Gly

Asn

Ser

Lys

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Trp

Leu

590

595

600

l.ys Arg

Asp

Glu

Pro

Leu

Tyr

Leu

Asn

Val

Asn

Asn

Arg

Asp

Thr

605

610

615

Ser Leu

Val

Val

Asn

Ala

Asp

Arg

His

Gly

Phe

Tyx

Axg

Gin

Asn

620

625

630

Tyr

Asp

Ala

Asn Gly 635

Trp

Lys

Lys

Ile

Ile 640

Lys

Gin

Leu

Lys

Lys 645

Asp

His

Lys

Val Phe

Gly

Pro

Arg

Thr

Arg

Asn

Ala

Ile

Ile

Ser

650

655

660

Asp

Ala

Phe

Ala Ala

Ala

Thr

Ile

Asp

Ala

Ile

Asp

Tyr

Glu

Thr .

665

670

675'

Val

Phe

Glu

Leu Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Asn

Glu

Glu

Glu

Phe

Leu

680

685

690

Pro

Trp

Lys

Glu Ala

Leu

ser

Gly

Mec

Phe

Ala

Val

Leu

Lys

Phe

695

700

705

Phe

Gly

Asn

Glu Pro

Glu

Thr

Lys

Pro

Ala

Arg

Ala

Tyr

Mec

Mec

710

715

720

Ser

Ile

Leu

Glu Pro

Mec

Tyr

Asn

Lys

Ser

Ser

Ile

Asp

Tyr

Ile

725

730

735

Val

Lys

Asn

Tyr Leu

Asp

Asp

Thr

Leu

Phe

Thr

Lys

Ile

Asn

Thr

740

745

750

G ln

Lys

Asp

Ile Ile

Asp

Ala

Tyr

Cys

Ser

Leu

Gly

Ser

Lys

Asp

755

760

765

cys

Ile

Lys

Gin Tyr

Lys

Asp

Ile

Phe

Tyr

Asp

Glu

val

Mec

Pro

770

77 5

780

Lys

Cys

Lys

Ala Gly

Glu

Ala

Ala

Thr

Lys

Cys

val

Lys

val

Ser

785

790

79 5

Ala

Pro

Leu

Arg Ala

Asn

val

Tyr

Cys

Tyr

Gly

val

Gin

Glu

Gly

800

805

810

Gly

Glu

Glu

Ala Phe

Glu

Lys

val

Mec

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ala

Glu

815

820

825

Asp

va 1

Gin

Leu Glu

Lvs

Gly

Ile

Leu

Phe

Lvs

Ala

Leu

Ala

Cys

830

835

840

His

Lys

Asp

val Thr

Ala

Leu

Lvs

Glu

Leu

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

845

850

855

Asp

Ar g

Lvs

Ser Ser

Phe

va 1

Arg

Leu

Gin

Asp

val

Pro

Thr

Ala

060

865

87 0

Phe

Arg

Ala

val Ser

Glu

Asn

' Pí o

Val

Glv

Glu

Glu

Phe

Mec

Phe

4

320 325 330

Ly:;

Gin

Asp Met

Ile Ala 335

Leu

Pro

Asp

Phe Ser 340

Ala Gly

Ala

Met 345

Glu

Asn

Tip

Gly

Leu

I le

Thr

Tyr

Arg

Glu

Asn

Ser

Leu

Leu

Tyr

350

355

360

Asp

Asp

Arg

Phe

Tyr

Ala

Pro

Mec

Asn

Lys

Gin

Arg

Ile

Ala

Arg

365

37 0

375

Ile

Val

Ala

His

Glu

Leu

Ala

His

Gin

Trp

Phe

Gly

Asp

Leu

Val

380

385

390

ThJ

Met

Lys

Trp

Trp

Asp

Asn

Leu

Tip

Leu

Asn

Glu

Gly

Phe

Ala

395

400

405

A r c1

Phe

Thx

Glu

Phe

Ile

Gly

Ala

Gly

Gin

Ile

Thr

Gin

Asp

Asp

410

415

420

Ale

Arg

Mec

Arg

Asn

Tyr

Phe

Leu

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Axg

Ala

425

430

435

Lev

Lys

Ala

Asp

Ser

Val

Ala

Sei

Ser

His

Pro

Leu

Ser

Phe

Arg

440

445

450

Ile:

Asp

Lys

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Ala

Phe

Asp

Asp

Ile

Thx

455

460

465

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ala

Ser

Val

Leu

Thx

Mec

Leu

Arg

Ala

Leu

Ile

470

475

480

Gly

Glu

Glu

Lys

His

Lys

His

Ala

val

Ser

Gin

Tyr

Leu

Lys

Lys

485

490

495

Phe

Sex

Tyx

Sex

Asn

Ala

Glu

Ala

Thx

Asp

Leu

Trp

Ala

Val

Phe

500

505

510

Asp

Glu

val

Val

Thr

Asp

Val

Glu

Gly

Pro

Asp

Gly

Lys

Pro

Mec

515

520

52S

Lys

Thx

Thx

Glu

Phe

Ala

Ser

Gin

Trp

Thr

Thr

Gin

Mec

Gly

Phe

530

535

540

Prc

Val

Ile

Sex

Val

Ala

Glu

Phe

Asn

Sex

Thr

Thx

Leu

Lys

Leu

545

550

555

Thx

Gin

Sex

Arg

Tyr

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Ala

Val

Glu

Lys

Glu

560

565

570

Lys

Tyx

Axg

His

Pro

Lys

Tyx

Gly

Phe

: Lys

Trp

> Asp

Ile

Pro

> Leu

575 580 585

Trp

Tyr

Gin

Glu

Gly Asp

Lys

Lys

Glu

Ile

Lys

Axg

Thx

Trp

Leu

590

595

600

Arg

Arg

Asp

Glu

Pro Leu

Tyr

Leu

His

Val

Ser

Asp

Ala

Gly

Ala

605

610

615

Prc

Phe

Val

Val

Asn Ala

Asp

Arg

Tyr

Gly

Phe

Tyx

Arg

Gin

Asn

620

625

630

His

Asp

Ala

Asn

Gly Trp

Lys

Lys

Ile

Ile

Lys

Gin

Leu

Lys

Asp

635

640

645

Asn

His

Glu

val

Tyr Ser

Pro

Arg

Thr

Arg

Asn

Val

Ile

Ile

Ser

650

655

660

Asp

Ala

Phe

Ala

Ala Ala

Ala

Thr

Asp

Ala

Ile

Glu

Tyr

Glu

Thr

665

67 0

675

Val

Phe

Glu

Leu

Leu Asn

Tyr

Ala

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Tyr

Leu

680

6?5

690

Pro

Leu

Glu

Ile

Ala Mec

Ser

Gly

Ile

Ser

Ser

Ile

Leu

Lys

Tyr

695

700

705

Phe

Pro

Thr

Glu

Pro Glu

Ala

Lys

Pro

Ala

Gin

Thr

Tyr

Mec

Mec

710

715

720

Asn

Ile

Leu

Lys

Pro Met

Tyr

Glu

Lys

Ser

Ser

Ile

Asp

Phe

Ile

725

730

735

Ala

Asn

Asn

Tyr

Arg Asn

Asp

Lys

Leu

Phe

Phe

Gin

Ile

Asn

Leu

740

745

750

(Gin

Lys

Asp

va 1

Ile Asp

Mec

Phe

Cys

Ala

•Leu

Gly

Ser

Gin

Asp

755

760

765

Cys

Arg

Lys

Lys

Ty i Ly s

Lys

Leu

Phe

Asp

Asp

Glu

Val

Mec

Asn

770

775

780

Lys

Cys

Arg

Asp

Gly Gin

Ala

Ala

Thr

Glu

Cys

Val

Arg

Ile

Ala

785

790

795

Ala

Pro

Leu

Arg

Ser Ser

Val

Tyr

Cys

Tyr

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

800

805

810

Gly

Asp

Tv r

Ala

Ser Asp

Lys

Val

Met

Glu

Leu

Tyi

Thr

Ala

Clu

815

820

825

Thr	Leu	Ala	Leu	Glu 830	Lys	Asp	Phe
Ki S	Lys	Asp	va 1	Thr 845	Ala	Leu	Lys
Asp	Arg	Asn	Ser	Sex 860	Phe	val	Arg
Phe	Asn	Asp	Val	Ala 875	Ala	Asn	Pro
Asn	Phe	Leu	Ile	Glu 890	Aig	Tip	Pio
Thi	Lys	His	Thx	Tyx 905	val	Glu	Lys
Gly	I le	Arg	Sei	Gin 920	Gin	Gin	Ile
Lys	Asn	Gly	Met	Asn 935	Ala	Arg	Gin
Ile	Glu	Aig	Ala	Gin 950	Asn	Arg	Val
Gin	Lys	Leu	Ala	Ala 965	Phe	Phe	Lys

—	o 5 -
Leu	Arg	Leu	Ala	Leu	Gly	cys
	835					840
Gly	Leu	Leu	Leu	Arg	Ala	Leu
	850					855
Met	Gin	Asp	I le	Pr o	Ser	Ala
	865					870
Ile	Gly	Glu	Glu	Phe	Ile	Phe
	880					885
Asp	Ile	Ile	Glu	Sei	Ile	Gly
	895					900
Val	Ile	Pio	Ala	Cys	Thx	Ser
	910					915
Asp	Gin	Leu	Lys	Asn	Leu	Gin
	925					930
Phe	Gly	Ala	Phe	Asp	Lys	Ala
	940					945
Asp	Tip	Ile	Lys	Lys	His	Phe
	955					960
Lys	Ala	Thr	Leu
	970

Zastupuje

Claims (11)

1. Molekuly nukleových kyselin tvořené jedním nebo větším počtem kódových nukleotidových řetězců pro aminopepsidázu z hlístů nebo pro jejich antigenně účinnou část, přičemž tyto řetězce obsahují celý řetězec nebo část nukleotidového řetězce z obr. 2, 3, 4 nebo 5, to znamená řetězce č.

. až 15 nebo jsou molekuly nukleových kyselin tvořeny kódový ni řetězci pro aminopeptidázu hlístů s identitou řetězce 50 % nebo vyšší nebo s hybridizací s kterýmkoliv z uvedených řetězců za podmínek 2 x SSC při teplotě místnosti, kde SSC obsahuje 0,15 M chloridu sodného a 0,015 M citronanu sodného při pH 7,2.

2. Molekuly nukleových kyselin, tvořené jedním nebo větším počtem kódových nukleových řetězců pro polypeptid, schopný vyvolat tvorbu protilátek proti parazitickým hlístům, přičemž tyto řetězce obsahují jednu nebo větší počet kódových pblastí pro antigenní determinanty z kódových řetězců pro cminopeptidázy z obr. 2, 3, 4 nebo 5, to znamená z řetězců

č. 1 až 15.

3. Molekuly nukleových kyselin, tvořené jedním nebo větším počtem nukleotidových kódových řetězců, které odpovídají nebo které jsou komplementární k jednomu nebo většímu počtu řetězců klonů, identických alespoň na 50 % s řetězci z obr. 2, 3,

4 a 5 nebo může jít o řetězce s totožností více než 50 % nebo o řetězce, které hybridizují s kterýmkoliv z uvedených řetězců za podmínek 2 x SSC, kde SSC dosahuje 0,15 M chloridu sodného a 0,015 M citronanu sodného při pH 7,2.

λ755 _ cnv

Vektor pro exp: cí se tím ccdis nároků 1,

5. Prckarvec ký organismus, uje molekulu n , L. _

2 ne b o neoo Rior.c .V--, - - cká r.eco eukaryotická buňka nebo trar.svyznačující se tím, že kleové kyseliny podle nároků 1, 2 nebo 2.

6. Syntetický polypeptid, vyznačující se t í m , že obsahuje řetězec aminokyselin enzymu aminopeptidázy nebo jeho antige.nní části, odpovídající celému řetězci nebe části nukleotidového řetězce z obr. 2, 3, 4 nebo 5, to znamená řetězce 1 až 15 nebo odpovídající funkční ekvivalentní variantě, přičemž řetězec syntetického polypeptidu je odlišný od bílkoviny H11OD ve formě dubletu nebo od syntetického polypeptidu ze skupiny:

(a) Met Phe Gly Tyr Pro Val Val Lys Val ' Glu Glu (b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser (c) Met Gly/Phe Asr. Phe Lys Ile Glu/Val Thr/Gli Ala Gly (d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/Lys Leu - Ile Thr (e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Val (f) Met Leu Ala Glu/Tvr Asp Gin/Ala Glu Asp V (g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr (h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro (i) Lys His/Tyr Asn/Val : Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly (3) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn (k) Lys Ala Ala Glu val Ala Glu Ala Fhe Asp Ile - - Lys Gly

“ 53

(i) Lys Asp i Ala !»sp Val Ile Glu Thr? Val/Pro Ala Glu Ala Phe ;iv Pro Ser Tyr c (a) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met (n) Lys L-rSU — - - Pro Phe Asn,· 'Asp Ile G...u A_a (o) Xsc Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys (?) Mer Gly Tvr Pro Val Val Ly s Val Glu Glu Phe - Ala Thr Ala Leu (q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser - Tyr? - Thr (Γ) Met Glu/Phe Asn Phe Leu : Ile Glu/Val Thr/Glu Ala Gly Ile Thr :s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr - Thr Ser Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Pi ne Pro cu) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Tnr/Lvs Leu - Ile Thr - Gly (v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser . - Phe Val Gly? (V) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gin/ Ala Glu Asp Val (X) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala Glu Ksn/Leu Leu Asn/Gly (Y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn I z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - Ile - - - Lys Gly <aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr? Tyr - - Gly Pro Ser (bb) Lys Glu Gin Thr Glu Ile Phe Asn Met (cc) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp Ile GLu Ala Leu (dd) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys

7. Syntetické polypeptidy podle nároku čující se tím, že jsou tvořeny řez selin enzymu aminopeptidázy nebo antigenní čá zymu, odpovídající celému řetězci nebo části řetězců z ocr. 2. 3, 4 nebe 5, jde o řetězce nebe jde o funkčně ekvivalentní variantu, v p v' tou jiných složekHaemonchus contortus.

6 , vyznáězoem aminokysti tohoto ennukleotidových č. 1 až 15 , odstatě pros

8. Syntetické polypeptidy podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jde o složený polypeptid, obsahující ještě další polypeptid, vázaný na řetězec aminokyselin podle nároku 6 nebo 7.

9. Způsob výroby syntetického polypeptidu podle nároků 5 , 7 nebo 8,vyznačující se tím, že se pěstuje prokaryotická nebo eukaryotická buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároků 1, 2 nebo 3, za podmínek, při nichž dochází k expresi polypeptidu, který se pak izoluje.

10. Vakcína pro stimulaci imunologické odpovědi proti parasitickým hlístům u člověka nebo jiného živočicha, v yznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden syntetický polypeptid podle nároků 6, 7 nebo 8 nebo virus nebo hostitelskou buňku s obsahem nukleové kyseliny podle nároků 1, 2 nebo 3 pro stimulaci imunologické odpovědi na polypeptidy, pro něž je kódem uložená molekula nukleové kyseliny, spolu s farmaceutickým nosičem.

11. Použití molekuly nukleové kyseliny podle nároků 1, 2 nebo 3 nebo syntetického polypeptidu podle nároků 5,

7 nebo 8 pro výrobu vakcíny pro stimulaci imunologické odpovědi proti parasitickým hlístům u člověka nebo u jiného živočicha.