PT96999A - Processo para a preparacao de composicoes eficazes que compreendem peptideos liticos e enzimas hidroliticos - Google Patents

Description

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CIBA-GEIGY AG "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSICOES EFICAZES QUE COMPREENDEM PEPTÍDEOS LiTICOS E ENZIMAS HlDROLíTICOS"

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo O presente invento diz respeito a um processo de preparação de composiçQes anti-patogénicas eficazes que contêm uma combinação de enzimas hidrol£ ticos e peptídeos líticos como ΓΓϊ© nte carac : ter i zado por se rn i s tu Γ8.Γ UÍYiS © ficaz de Ufi) ingr edie nte act .1 ν’ o nu roa de P P © t 0rênC 2. 3 de 0 3 1 3 95% > e m conjun— a l & i t c* v e -13 vi e. agr i c u 11 ura VI uvo a percsn- ef erênc ia de 1 ck 99% de u ΓΓι a.d juvante to com um ou ma is v&ícu. tagsm de .1. a 9'3,9% , de sólido ou liquido e de desde cerca de 0 a 25% de preferência 0,1 a 25% de um surfactante. São também referidos métodos de controlo oo crescimento de patogênios usando as composições anti—patogêni— cas .

I

0 presente invento relaciona-se com composiçSes para o controle de patogénios de plantas através do emprego como ingrediente activo de uma combinação de peptídeos li ticos e de enzimas hidrolíticos. Mais particularmente, este invento relaciona-se com composicfíes anti— pat-ogêni cas em que pequenas quantidades de chitina.se e/ou β-i , 3-glucanse são usados para o aumento da eficácia dos peptídeos líticos ao facilitarem o acesso do(s) peptideo(s) lítico(s) à membrana da célula do patogénio. 0 presente invento ainda se relaciona com plantas transgénicas que são capazes de produzirem peptídeos líticos e enzimas hidrolíticos assim como com métodos para o controle dos referidos pat-ogé— riios das plantas. É do conhecimento geral que alguns peptídeos líticos são activos contra uma larga gama de organismos enquanto, que produzem pouco ou nenhum efeito. é também conhecido que um alvo dos peptídeos líticos é a membrana. Sequências de amino-ô.cidos para vários peptídeos líticos com act-ividade ant-imicrobiana estão descritos em WO 89/04371, Enzimas hidrolíticos, como chitinase e B-l,3-glucanase, são conhecidos como inibidores do crescimento de fungos (Schlumbaum et al., 1986; Mauch et al., 1988; e Burri, 1989). é também do conhecimento geral que a chitinase e a β-1,3--glucanase são fortemente induzidos em feijSes através do tratamento com etileno, Além disso, aqueles enzimas podem ser purificados muito facilmente (Boi ler et al., 1983). Lehrer et al. (1986) descreve seis peptídeos anti-microbianos CPAMs) de granu-locitos de coelho que são estruturalmente homólogos aos neutro-f .i 1-def ensi nas humanos. Três dos PAMs de coelho (NP-1, NP-2 e NP—3a) são descritos como eficazes contra Candida albicans. Lehrer et a.l. . (1986) ainda descreve que o NFS, embora não seja fungicida directo contra C. albicans, demostra o que foi chamado um efeito sinergísíico, um aumento na act-ividade fungicida de NP—1, quando o fungo era exposto a ambos NP—S e NP-1. Ogasawara

et· al . ¢1973) descreve que a combinação de 8—1,3~glucana.se e de chitinase é um fungicida e um bactericida eficaz útil no tratamento do arroz. WO 88/00976 descreve a inibição de prejuízos em colheitas causados por larvas do Lspidoptsra através da síntese de genes com o código para o enzima chitinase da colheita alvo. É um objectivo do presente invento fornecer novas composições para o controle de patogénios de plantas Cpreferen— cialmente fungos, bactérias e nematóides). Estas novas composições demonstram excelente act-ividade contra uma larga gama de patogénios que afectam as plantas, é outro objectivo do presente invento fornecer composições em que a membrana do patogénio é mais facilmente degradada pelos pept-ídeos lít-icos. É outro objectivo do presente invento fornecer agentes anti-patogéni cos eficazes em que a act-ividade eficaz anti-pat-ogé-nica ê induzivel. É um outro objectivo do presente invento fornecer composições eficazes anti-patogénicas que emipr'ergam as novas combinações anteriores de agentes anti-patogénicos. é ainda outro objectivo do presente invento fornecer plantas transgénicas com act-ividade eficaz anti-pat-ogénica basiada na síntese de um ou de mais pept-ídeos lít-icos e um ou mais enzimas bidrolíticos nas células das plantas. Um outro objectivo do invento é fornecer plant-as transgénicas que contêm sequências de código de DNA para pept-ídeos lít-icos e para enzimas hidrolí ticos. É um modo de realzação do presente invento controlar patogénios de plantas através da sua exposição a enzimas hidrolíticos que degradam a pareds da célula e tornam a membrana, do patogénio mais acessível a peptídeos líticos. Um outro modo de realização do presente invento é enzimas hidrolícos induzíveis, preferencialmente chitinase e 8-1,3-glucanase, serem usados em combinação com peptídeos lít-icos. Um outro modo de realização do presente invento é a combinação dos enzimas hidrolíticos ser eficaz c om 4 uma larga gama de peptideos líticos. Uma vantagem do presente invento é que quantidades muito pequenas de chitinase e de β-l, 3—glucana.se serem eficazes ao aumentarem signif icantemente os efeitos inibitórios dos peptideos li ticos.

De acordo com o presente invento, composições eficazes anti-patogénicas são fornecidas empregando como ingrediente activo combinacSes de peptideos líticos e enzimas hidrol£ ticos. Peptideos líticos atacam a membranas da célula dos patogénios. Porque a membrana da célula dos patogénios está protegida pela parede da célula, investigadores proposeram que a utilização de enzimas líticos para as paredes das células podem permitir a peptideos líticos o acesso â membrana da célula, dos patogénios. Os investigadores ainda fizeram a hipótese que de unicamente pequenas quantidades de enzimas hidrolíticos são necessários para aumentarem significativamente o efeito inibitório de todos peptideos líticos testados. 0 termo "ingrediente activo" é usado para referir a combinação de um ou ma is peptideos líticos e um ou ma. is enzimas hídroliticos, cujas combinação funciona atrvés da inibição do crescimento dos patogénios. Os ingredientes activos do presente invento podem ser usados como um componente de composições, formulações ou preparações eficazes anti-patogénicas. 0 termo "suportes aceitáveis na agricultura" é usado para referir aquelas substâncias, ou combinações de subst-ânc i as, que são conhecidas no ramo das composicôos agrícolas, e podem incluir, quando apropriado, adjuvantes sólidos ou líquidos, solventes, assim como surfactantee e outros compostos normalmente usados em formulações agrícolas. 5

Como usado no presente invento, uma "quantidade patoge-nicament-e eficaz" de uma substância ou de uma composição significa uma quantidade que matará ou inibirá o crescimento do patogé-nio da planta alvo quando aplicada a uma planta, ou quando sintetizada por uma planta transgénica. 0 termo "patogénio de planta" inclui fungos, bactérias, nematóides e insectos. Os patogénios alvo preferidos de acordo com o presente invento são fungos e bactérias.

Os termos "peptideo lítico" e "peptídeos líticos para as membranas das células" são usados para referirem qualquer peptideo sintético ou natural ou um seu derivado funcional que é capaz de ter actividade eficaz anti-patogénica devido á sua capacidade de penetração, dissolução de tecidos ou de outro modo deteriorar a membrana da célula de patogénios. Existem muitos exemplos de peptídeos líticos de fonte animal, de plantas, de insectos e de fontes microbiana que podem ser úteis no presente invento que incluem, mas não limitados a, defensinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, magaininas, atacinas, dipterinas, sapecinas, caerulinas, xenopsi-nas, ou seus híbridos. Para exemplos das sequências dos amino--ácidos destes peptídeos líticos, ver WO 83/11291; WO >86/04356; WO 88/06826; US 4.810.777; e WO 83/04371; Bohlmann et al. < 13881,' Selsted and Harwig 119871.

Também útil como peptídeos líticos do presente invento são peptídeos sintéticos, que podem ser derivados funcionais de um dos peptídeos líticos anteriores ou de seus híbridos funcionais. Um exemplo desses peptídeos sintéticos é -Synthetic Peptide No. 3, que é um derivado de uma magainma e tem a sequência de amino-ácido SEQ ID NO! 1 (Terry et al . , 195:8). 6

Como usado na presente aplicação, o termo peptídeo lítico também inclui substâncias que são activas contra membranas de células, como lizosimas e fosfolipases. Diferentemente dos peptídeos líticos anteriores.· as lisozimas do presente invento são capazes de penetração, de dissolução de tecidos e de outro modo deteriorar a membrana da célula do patogénio através de um mecanismo enzimático. As f osf ol ipases atacam os fosfolípidos das membranas das células.

Em vez de peptídeos líticos, outros componentes degradantes de membrana das células podem ser empregues no ingrediente activo do presente invento. Por exemplo, est-â no âmbito de presente invento o emprego de detergentes degradantes da membrana das células como Triton e SDS.

Os termos "enzima hidrolítico", "hidrolase da parede da célula", "hidrolase da planta" e "enzima hidrolítico para. parede da célula" são usados para referir qualquer enzima natural ou sintético que é capaz de provocar a degradação da parede da célula de um patogénio da planta. 0 enzima hidrolítico pode ser aplicado exogenosamente, ou pode ser constitutivamente ou induzi-velmente inserido na célula. Exemplos de enzimas hidrolíticos que podem ser usados no presente invento incluem chitina.se e fí-1,3--glucanase.

Como usado no presente invento o termo "constitutivo" refere-se a um enzima, hidrolí tico ou outra substância que está presente a toda a hora via célula da planta. 0 termo "xnduzível" refere—se a um enzima hidrolítico ou outra substância que está presente na célula da planta unicamente quando a planta é sujeita a alguma condição de stress ou de estimulo externo e a produção ou a presença de enzimas hidrolíticos ou de outras substâncias é por conseguinte activada ou aumentada.

Patogénios das plantas que podem ser alvo de composições pesticidas do presente invento incluem membros das classes seguintes; bactérias (por exemplo Pseudomonas, Xamthomonas e Erwinia); fungos, como Funei imperfecti (por exemplo, Botrytis, Septoria); Asconr/cetes (por exemplo, Eryphe, Monilia),1 Oomycetes (por exemplo, Peronospora, Phy t-ophthora , Co 11 etotr ichum e Pythium); Basidiomycetes (por exemplo, Rhizoctonia e Puccinia); assim como insectos e nematóides (por exemplo as espécies de Meloidogyne, Caenorhabditis, Globora, Heterodera e Pratylenchus). Por exemplo, os patogénios de fungos que podem incluir as espécies de Botrytis cineres; Colletotrichum lagenarium; Eryphe graminis, um patogénio do trigo; Monilia fructicola; Peronospora tabacina; Phytophthora parasitica; Plasmopara vivicola; Pythium ultimum, um patogénio do solo; Rhizoctonia solani; um outro patogénio do solo; e Septoria nodorum, um patogénio do trigo.

Colheitas alvo a ser protegidas no âmbito do presente invento incluem as espécies seguintes de plantas: milho, cereais (e.g. trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, sorgo e colheitas relacionadas, beterraba (e.g. açúcar de beterraba e forragem de beterraba), drupas, batatas e fruta doce (e.g., maçãs, peras, cânfora), ou plantas como châ, vinha, lúpulo, bananas ameixa, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas, amoras), plantas leguminosas (e.g., feijões, lentilhas, ervilhas, feijSo de soja), plantas de óleo (e.g., nabo silveste, mostarda, papoilas, azeitonas, girassóis, coco, plantas de óleo de castor, feijão de coco, amendoim), plantas de pepino (e.g., pepino, medula vegetal, melões), plantas de fibra (e.g., algodão, linho, cânhamo, cânhamo da índia), planta de citrino (e.g., laranjas, limões, toranja, tangerina), vegetais (e.g., espinafres, alface, espargos, couve, cenouras, cebolas, tomates, batatas, paprica), Lauraceae (e.g., abacate, canela, tabaco, nozes, café, cana de açúcar 0 plantas de borracha natural, assim como ornamentais.

As concsntr ingrediente a c 11'

.ções relativas dos enzimas hidrolíticos no presente invento são definidas nos termos de unidades de actividade. A unidade padrão da concentração ("concentracSo padrão" ou "c"> do enzima hidrolítico é definido como a concentração desse enzima que produzirá um valor de actividade absoluta igual ao encontrado para o enzima hidrolítico purificado. Por exemplo, a unidade padrão de concentração para a chitinase é definida como a concentração de chitinase que produzirá uma actividade absoluta de 88,86 nkatal/ml de extracto. A unidade padrão de concentração de 6-1,3-glucanase é definida como a concentração que demontra um valor de actividade absoluta igual ao encontrado para o enzinana parcialmente purificado, e.g. 76,00 nkatal/ml de extracto. 0 presente invento relaciona-se com composições anti— -patogénicas eficazes que compreendem combinações de peptídeos lí ticos com enzimas hidrolí ticos para a parade da célula, corno chitinase e 6-1,3-glucanase. Num modo de realização preferido do presente invento, ambos chitinase e 6-1,3-glucanase estão presentes no ingrediente activo em prequenas quantidades, por exemplo, em concentrações relativas de cerca de 1/10 da concentração padrão (c), ou, mais preferencialmente, de cerca de 1/100 c. Os enzimas hidrolíticos igualmente permitem um melhor acesso à membrana de célula do patogéni.o dos peptídeos lí ticos.

Num modo de realização preferido, os peptídeos líticos do presente invento estão presentes no ingrediente activo numa concentração desde cerca de 0,1 ppm a cerca de 1000 ppm, preferencialmente desde cerca de 0,5 ppm a cerca de 500 ppm, especial-mente desde cerca de 1 pp>m a cerca de 200 ppm.

As concentrações de chitinase e de 6-1,3-glucanase que foram encontradas como sendo aciivas contra patogénios teste,

— y quando ap3. içados em combinação com peptídeos líticos, estão presentes em muitas espécies de plantas, mesmo sem um estimulo prévio o que leva à indução destes enzimas hidrol£ ticos. Contudo, as chit-inases e as glucanases naiuralment-e presentes não estão relacionadas com os patogénios, e são encontradas no espaço vazio em vez do espaço extracelular da célula da planta (Boller et al., 3.383; Burri, 1989). Assim, num modo preferido do presente invento, o pept-ideo lítico é usado em combinação com enzimas hidrolí-ticos activados que estão já presentes na planta. A chitinase e a 8-1,3-glucanase são ambas induzivsis em plantas. Assim, num outro modo de realizãção do presente invento, a produção de chitinase e de β-l,3-glucanase é induzida usando um estimulo externo. A indução pode ser através de meios químicos, por exemplo, químicos conhecidos que actuam como indutores de pat-ogé— nios relacionados com protéinas em plantas, incluem etileno, ácido benzóico, ácido salicílíco, ácido poliacrílico e seus derivados substituídos. A indução pode ainda ser por outros meios fisiológicos e físicos, como por temperaturas elevadas ou bai.xas, feridas físicas ou por qualquer outro meio indutivo conhecido. 0 presente invento ainda embraca a preparação de composiçSes eficazes anti-patogénicas em que o ingrediente activo é uma combinação de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos. 0 ingrediente activo é misturado homogeneamente com um ou mais compostos ou grupos de compostos descritos aqui. O presente invento também se relaciona com métodos de protecção de plantas do ataque de patogénios de plantas, que comprende a aplicação de ingrediente activo, ou de composiçSes eficazes anti-patogénicas que contêPi o ingrediente activo, ã planta OU aos habitates dos patogénios. 10

Os ingredientes activos do presente invento sá?o normal-mente aplicados profilaticamente ou curativamente na forma de composições em conjunto com um ou rnais suportes aceitáveis na agricultura, e podem ser aplicados na área de colheita ou na planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucesão, com outros compostos. Estes compostos podem ser ambos f ert-i 1 izantes ou doadores de micronutrient.es ou outras preparações que influenciem o crescimento da planta. Eles podem também ser herbicidas, insect-ic idas, fungicidas, bac ter ic idas, nematicidas, mol use ic idas selectivos ou misturas de várias destas preparações, se desejado em conjunto com outros suportes, surfactantes ou adjuvantes promotores de aplicação normalmente empregues no ramo da formulação. Suportes e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem âs substâncias normalmente empregues na tecnologia da formulação, e.g. substâncias minerais geradas ou naturais, solventes, dispersantes, agentes de humidificação, agentes de gomosidade, agentes de ligação ou fertilizantes.

Um métdo preferido de aplicação de ingredientes activos do presente invento ou de uma composição agroqímica que contém pelo menos o ingrediente activo é a aplicação na folha. O número de aplicações e a razão de aplicação depende da intensidade da infestação pelo patogénio correspondente. Contudo, os ingredientes activos podem também penetrar na planta através das raízes por via do solo (acção sistémica.) por impregnação do local da planta com uma composição líquida, ou por aplicação dos compostos na forma sólida no solo, e.g. na forma granular (aplicação no solo). Os ingredientes activos podem também ser aplicados ás sementes (revestimento) por impregnação das sementes ou com uma formulação líquida que contém ingredientes activos, ou pelo seu revestimento com uma formulação sólida. Em casos especiais, outros tipos de apl ica.çêo são também possíveis, por exemplo, tratamento selectivo de caules ou de rebentos de plantas. 11

De modo a que as composiçees eficazes anti—patogénicas inibam o crescimento de um patogénio como o fungo S. nodoruirí; é assumido que em primeiro lugar o patogénio toma contacto com os enzimas hidrol i ti cos. Depois do contacte* com a chitinase o com a β~1 ,3—glucanase, a membrana do fungo é mais acesível aos pepti— deos li ticos. Em adição, é importante notar a resposta em defesa da infecção patogénica que consiste em muitos diferentes mecanismos. Enquanto que combinações de chitinase, β-l,3-glucanase e de vários pept-ídeos li ti cos mostram uma inibição considerável do crescimento patogénico por destruição da parede da célula dos pat-ogénios e da membrana, dos patogénios, eles possivelmente ajudam a capacidade ariti-patogénica da planta através do fornecimento do acesso de outras substâncias anti-patogénicas, que são produzidas durante uma resposta hiper-sensitiva da planta. Assim, as combinacSes de chitinase, de Í3 — 1,3—glucanase e de peptideos líticos do presente invento são agentes eficazes para o controlo de pa togén i os.

Os ingredientes activos são usados na forma não modificada ou, preferencialmente, em conjunto com adjuvantes convencionalmente empregues no ramo da formulação, e são por conseguinte formulados de uma maneira conhecida em concentrados emulsionáveis, pastas revestidas, soluções dilui ve.is ou directamsnte pulverizáveis, emulsões diluídas, pás humidifiçáveis, pôs solúveis, poeiras, grariulatos, e também encapsulações, por exemplo, em substâncias poliméricas. Dependendo da natureza das composições, dos métodos de aplicação, como a pulverização, atomizacão, poeiras, dispersão ou vazamento, eles são escolhidos de acordo com os object-ivos pretendidos e as circunstâncias que prevelecem. Vias vantajosas de aplicação são normalmente desde SO g a 5 kg de ingrtediente activo (i.a. 1 por hectare (ha), preferenc.ialmente desde 100 g a 2 kg i.a./ha, mais preferencialmente desde 200 g a 500 s i . a . ./ha . 1

- ί:

As formulacSes, as composicSes ou as preparações que contêm os ingredientes activos e, quando apropriado, um adjuvante sólido ou liquido, são preparados de uma maneira conhecida, por exemplo por mistura homogénea e/ou moagem dos ingredientes activos com extensores, por exemplo solventes, suportes sólidos e, quando apropriado, compostos de superfície activa (sur f ac ta votes ) .

Solventes adequados incluem hidrocarbonetos aromáticos, preferencialmente as fracçóes que têm 8 a 12 átomos de carbono, por exemplo, misturas de xileno ou naftalenos substituídos, ftalatos como ftalato de dibutilo ou ftalato de dioctilo, hidrocarbonetos alifáticos como ciclo-hexano ou parafinas, álcoois e g], icóis e outros éteres e ésteres, como etanol, éter de etileno— -glicol de monometilo ou de monoetilo, cetonas como ciclo-hexeno-na, solventes fortemente polares como ' N-meti1-2-pirrolidona, sulfóxido de dimetilo ou formamida de dimeti lo, assim como . óleos vegetais epoxidados como óleo de coco epoxidado ou óleo de feijão da soja epoxidado; ou água.

Os suportes sólidos usados e.g. para poeiras e põs dispersáveis, são normalmente agentes de enchimento minerais naturais como calcite, talco, caolino, mont-movi lonite ou atapul-gite. De modo a melhorar as propriuedades físicas é também possível adicionar ácido silícico altamente disperso ou polímeros absorventes altamente disperso. Suportes de adsorção granulados adequados são do tipo poroso, por exemplo pedra polraes, tijolo partido, sepolia ou bentonita; e suportes não adsorventes adequados são materiais como calcite ou areia. Em adicSo, um grando número de materiais pré-granulados de natureza inorgânica ou orgânica podem ser usados, e.g. especialmente dal omite ou resíduos de plantas pulverizadas.

Dependendo da natureza do ingrediente activo a ser usado ria formulação, compostos de superfície activa adequados são surfactantes nSo tónicos, catiónicos e/ou aniónicos que têm boas propriedades de emulsão, de dispersão e de humidificação. O termo "surfactant-es" deve ser entendido como compreendendo misturas de surfac tant es.

Surfactantes aniónicos adequados podem ser ambos caldos solúveis em água e compostos de surperfície activa sintéticos solúveis em água.

Caldos adequados são sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino terrosos ou sais de amónio insubst. i tu idos ou substituídos por ácidos gordos superiores (de cadeias desde 10 a 22 átomos de carbono), por exemplo os sais de potássio ou de sódio do ácido oleico ou esteárico, ou misturas de ácido gordo natural que pode ser obtido por exemplo a partir de óleo de coco ou óleo de sebo. Sais de meti 1 taurina de ácido gordo pode também se r usado.

Mais frequentemente, contudo, os chamados surfactant-es sintéticos são usados, especialmente os derivados de sulfonatos gordos, de sulfatos gordos, de benzimidazole sulfonado ou alquilar i 1 sul fatos .

Os sulfonatos ou sulfatos gordos estão normalmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino terrosos ou sais de amómio insubstituidos ou substituídos e têm um radical de alquilo com 8 a 22 carbonos que também incluem a porção alquilo de radicais alquilo, por exemplo o sal de sódio ou de cálcio do ácido 3 inhosul f óni co, de dodec 3. sul f ato ou de uma mistura de sulfatos de álcool gordo obtidos a partir de ácidos gordos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de 14 ésteres de écido sulfurico e ácidos suifónicos de aductos álcool gordo/óxido de etileno. Gs derivados de ben.zimida.zole sol tonado preferencialmente contém 2 grupos de ácido sulfónico e um radical de ácido gordo que contém 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos de alqui lar i J sul f ornatos sSo sais de tri.etanolamina, de cálcio ou de sódio de ác.ido de dodec .i lbenzenosul fónico, ácido de dibuti .1 nafta— lenosulfónico, ou de um produto de condensação ácido naftaleno-sulfónico/formaldeido. Também adequado são fosfatos correspondentes, e.g. sais de éster de ácido fosfórico de um aducto de p-nonilfenol com 4a 14 moles de óxido de etileno.

Surfactantes não iónicos são preferencialmente derivados de éter de poliglicol de álcoois alifáticos ou c ic loal .i f áticos, ou ácidos gordos saturados ou insaturados e alqui1fenóis, contendo os referidos derivados 3 a 30 grupos de éter de glicol e 8 a 20 átomos de carbono na porção de hidrocarboneto Califático) e 6 a 18 átomos de carbono na porção alquilo de alquilfenois.

Surfactantes não iónicos ainda adequados são aductos solúveis em água de óxido de polietileno com polipropileno-gli-col., etilenodiamino-propileno-glicol e alqui Ipol ipropi leno-gl icol que contêm 1 a 10 átomos de carbono ns cadeia de alquilo, cujos aductos contêm 20 a 250 grupos de éter de etileno-glicol e 10 a 100 grupos de éter de propileno-glicol. Estes compostos normal-mente contêm 1 a 5 unidades de etileno-glicol por unidade de P ropi1eno-g1i c o1.

Exemplos representativos de surfactantes não iónicos são noni 1 fenolpol ietoxiet-anóis, éteres de poliglicol e de óleo de castor, aductos de polipropileno/óxido de polietileno, tributil-fenoxipolietoxietanol, polietileno-glicol e octi 1fenoxietoxoeta- nol. ésteres de ácido gordo de polioxoetileno de sorbitano e 15 trio).eato de pol ioxieti leno de sorbi ta.no sSo também surfactantes não iónicos adequados.

Surfactantes cat-iónicos são preferencialmente sais de amónio quaternário que têm, como subst-i tuint-e de N, pelo menos um radical alquilo e como outros subst-i tuintes, radicais alquilo ha 1 ogenados ou a 1 qu i 1 o i nsubs tu i do inferior, benz i .1 o ou hidroxilalquilo inferior. Os sais estão preferencialmente na forma de halet-os, meti Isulf atos ou eti 1 sul f atos, e.g. cloreto de esteariltrimeti1amónio ou brometo de benziIdi(2-cloroeti1>eti1-amónio.

Os surfactantes normalmente empregues no ramo da formulação estão descritos, por exemplo, em McCutcheon Detergents and Emulsifiers Annual (1373), e Sisely and Wood (1380).

As composições agroquímicas normalmente contêm cerca de 0,1 a cerca de 33 %, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 35 %, e rnais preferencialmente desde cerca de 3 a cerca de 30 % de ingrediente activo, desde cerca de 1 a cerca de 33,3 %, preferen-cialmente desde cerca de 1 a cerca de 33 %, e mais preferencial-mente desde cerca de 5 a cerca de 35 % de um adjuvante liquido ou sólido, e desde cerca de 0 a cerca de 25 %, preferencialmente desde cerca de 0,1 a cerca de 25 %, e mais preferencialmente desde cerca de 0,1 a cerca de 20 % de um surfact-ante.

Enquanto que os produtos comerciais são preferencial-mente formulados como concentrados, o utilizador final normalmente emprega formulações diluídas. 0 presente invento também se relaciona com plantas transgénicas que contêm sequências de ONA wue codifica pelo menos um peptídeo íítico e pelo menos uma hidrolase. Plantas 16 a c h i t.· i -e EP 353

transgénicas que contêm sequências de DNA que codifica nase e β-l, 3-glucanase est-ão descritos em EP 392 225 191 . 0 presente invento também se relaciona com um método de preparação de uma planta transgénica que é capas de sintetizar quantidades eficazes anti-patogénicas de um ou mais componentes degradantes da membrana da célula e um ou mais enzimas hidrolíti-cos que o método compreende a 3 preparação de uma planta transgénica que compreende sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais componentes degradantes da membrana da célula e um ou mais enzimas h i d r o1í t i cos; ou b> preparação de duas ou mais plantas transgénicas que compreendem sequências de DNA que codificam um ou mais componentes degradantes de membrana de célula e/ou um ou mais enzimas hidrolíticos, e o cruzamento das referidas plantas usando técnicas criação convencinais.

Preferencialmente, o método compreende a preparação de uma primeira planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica um componente degradante da membrana da célula, a preparação de uma segunda planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica a β-i,3-glucanase, a preparação de uma terceira planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica a chitinase, e o cruzamento das três plantas homozigótiCas usando técnicas de c r iação convenc ionais. 17 17

Em plantas transgénicas, a síntese de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos podem ser induzida através da utili^a-çcío de um sistema de síntese induzível que compreende um gene induzível © um regulador de indução. Por exemplo, mais do que dez genes de protéina do tabaco PR Cpatogene relacionado) são quimicamente induzíveis (van Loon, 198-5; Ja.met and Fritig, 1986). Três destes genes, F'R-2, PR-N e PR-Q têm sido indicados como tendo a capacidade da 8-1,3-glucanase (Kauffman et al. , 1987), e dois, PR-P e PR—Q, têm sido indicados como tendo capacidade a da chitinase (Legrand et al., 1987). Assim, o presente invento inclui plantas transgénicas que sintetizam um gene que codifica pelo menos um pept-ídeo li tico seguido pelo tratamento com um regulador de indução que induz a acumulação de pelo menos um enzima hidrolítico natural ou estranho. 0 invento é ilustrado em ruais detalhe pelos exemplos seguintes, sem implicar qualquer restrição ao que aí está descrito .

Depósitos com ATCC

Os depósitos seguintes foram feitos com o ATCC de acordo com o Tratado de Budapeste; ATCC 40426-, depositado em Fevereiro 1-2, 198-3 ATCC 40586, depositado em Março 22, 19-39 18

Exemplos

Exemplo 1: Purificação de chi tinases e de β—1,3-glucanase de folhas de feijão tratadas

Passo 1 Tratamento com etileno e material da planta. Sementes de Phaseolus vulgaris L. cv. sa.xa são crescidas em vermiculite sob um regime de 16 hr de luz:8 hr de escuro, aos 200C. Plantas de feijão de doze dias de idade são incubadas em câmaras de plástico de ar parado com um volume de 0,2 m . Plantas de controle são incubadas em câmaras idênticas em ar livre e em etileno. Depois de 48 horas, as primeiras folhas foram colhidas e congeladas aos -20°C.

Passo

Preparação de enzima em bruto. 658,7 g de tecido de folha congelado é homogenizado em tampão de citrato de sódio 0,1 M a pH 5,0 <2 rnl/g de peso em fresco) com um homogeni-zador Turmix na velocidade de topo. 0 homogenizado é centrifugado <25 minutos, 11 000 x g) e 100 ml de sobrenadante são usados como a preparação do enzima em bruto. As protéinas do restante extrac-to em bruto são precipitadas por adição de sulfato de amónio a 35 % da saturação. Depois de centrifugação <30 min, 11 000 x g) o sedimento foi redissolvido em Tris 100 mM/HCl pH 8,0 e feita separação dos colóides contra Tris 5 mM/HCl pH 8,0.

Passo 3: Purificação do enzima. A fracção de protéina em bruto que sofreu separação dos colóides é passada através de uma coluna de diet-i laminoeti 1 (DEAEl—trisacrilo <IBF,‘ Clichy, F) equilibrada, em Tris 5 mM/HCl pH 8,0. Tampão contendo as protéinas básicas que passam através de uma coluna não retardada é levada a uma concentração final de 20 mH de NaHC0,_,. 0 pH é aumentado a 8,4 •Zr chi tina com NaoH 1 M e o líquido vai carregar uma coluna de 19 regenerada (Molano et· al . , 1977) equilibrada em NaHC-U^ ^0 míi. 0 fluxo que atravessa a coluna ê recolhido e o fH é levado a 5,5 com HC1 1 M. As protéinas sofrem separação dos colóides contra água e sSo tratadas três vezes com uma pequena quantidade de chitina regenerada, seguido por centrifugação para a remoção de vestígios de chitinase. As fracções que contém uma actividade elevada de β-l, 3-glucanase são depois 1 iof i .1 izadas . Elas são fonte de β-l,3-glucanase parcialmente purificado. A coluna de chitina é lavada com NaHCO.-, 20 mM, seguido por tampão de acetato de sódio 20 mM pH 5,5. A chitinase é eluída com 100 mM de ácido acético num volume de eluicão de 30 ml. u pH do eluato é levado a 5,5 com K0H 1 M e a protéina sofre separação dos colóides contra água e é liofilizada. Esta protéina será a f onte de chi t- i nase pu r i f i c ada .

Passo 4: Determinação da protéina. A proteína é medida como descrito por Bradford <1976).

Passo 5a: Ensaio de chitinase. A actividade da chi tina-se é medida como descrito por Molano et al. <1977).

Passo 5b ' Ensaio de β-l, 3-glucanase . A actividade da 0-1,3-glucanase é medida como decri to por Dygert et al. <1965).

Passo 6Indução de enzima em folhas de feijão tratadas com etileno. Um tratamento de etileno de 48 hr leva a uma forte indução de chitinase e de 8-1,3-glucanase, como demonstrado pelos resultados do Quadro l:

Quadro l! Activida.de de chi tinase e de 8-1,3-glucanase em folhas de feijão tratadas com etileno

Aciivida.de de chi tinase especifica 45,35 (nkatal/mg de protéina)

Act-ividade de chitinase absoluta 54,71 (nica tal/ml de extracto)

Act-ividade de (3—1,3-glucanase especifica. 28,72 (nkatal/mg de protéina)

Act-ividade de 8-1,3-glucanase absoluta 34,21 (nkatal/mg de extracto)

Passo 7i PurificacSo do enzima. 0 Quadro 2 mostra o procedimento de purificação da chitinase e da 8-1,3- glucs.na.se. A chitinase é 33 vezes purificada com um rendimento de 2.1,6 %. A 8-1,3-glucanse é purificada com um factor de purificação de 3,0 e um rendimento de 33,5 55. A elec trof orese de ge.l de pol iac r i lamida SDS mostra que a 8-1,3-glucanase está altamente purificada depois destes passos de purificação (Burri, 1383).

Quadro 2: Procedimento de purificação de chitinase e de 0—1,3-glucanase de folhas de feijão tratadas com et i leno

Protéina Actividade Actividade Ac ti v.idade Ac tividade Total chitinase c h i ti nase B-l,3-glu— 0-1,3-glu- (mg > Total Espec i f i ca CcSVIaSS c anase ( nk a t) . nk a t /mg de Total Espec i f i ca p ro te i na ) ( nk a t ) (nk a 1/mg protéina > Extracto 740 34001 45,95 22566 O O T *-·-· , / em bruto 100 % 100 % Sul fato 524 81944 60,94 não não de a.mάη i o 94 % medido med i do Coluna de 191,4 26598 139 8991 52,6 DEAE 78,2 % 42,3 % Chi ti nase 4,84 7341 1517 11,78 2,43 pur .i f i ca d· 21,6 % Co1una 82, 1 701 8,54 7129 86,6 de c h i t .i na 33,5 % 1. J {Vi ct de 6,65 nk a t a 1 / m 1

Passo 8: Indução de chitinase e de β-l,3-glucanase em folhas de feijão. Nas folhas de feijão usadas para esta experiência, os enzimas de chitinase e de 0—1,3-glucanase são 1igeiraroen— te menos induzidas do que o esperado. Por exsmplo, em Burri (1933), a média dos cinco tratamentos de etileno originou actividade de chitinase absoluta, de 88,86 ±

extracto e uma actividade absoluta de (3-1,3-glucanase de 7b, 00 ± 6,77 nkatal/ml de extracto. Por conseguinte, a unidade de concentração padrão para a chitinase Cc = 1) é definida como a concentração de chitinase necessária para obter uma actividade de 88,86 nkatal/ml de extracto. A concentracão relativa de extractos de chitinase são definidos nos termos das fracçdes dessa actividade. As conceniracâes relativas de β—1,3—glucanase parcialmente purificado são definidas nos termos das fraeções de uma actividade de 76,00 nkatal/ml de extracto.

Passo 9; Purificação de chitinase. A chitinase á purificada por cromatografia de afinidade. 0 factor de purificação é comparável com o de Eíurri ¢2889) (32 %) .

Passo 10! Purificação de (3-1,3-glucanase . O rendimento de 35,S % é aproximadamente um terço superior ao de Burri (1989) para esse passo de purificação, enquanto que o factor de purificação de 3,0 não é tão elevado como o previamente observado.

Exemplo Síntese de peptídeos líticos

Peptideos líticos são sintetizados usando um Applied Biosystems Mode.1 430 Pept-ide Synthesizer de acordo com as reco-mendaçfíes do preparador. Os peptídeos são purificados por CLAR.

Exemplo 3: O efeito inibitório de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos contra S. nodorua

Pratos microtítero são seleccionados para investigar o efeito inibitório de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos contra S. nodorum. As substâncias teste são adicionadas em meio de ervilha liquido de 90 ;j! que foi previamente inoculado com 2,0

χ 10^<_) esporos/ml de meio do pat-ogénio teste de modo a originar um volume final de 100 yl. 0 Quadro 3 ilustra a composição das soluções test-e que são testadas em amostras em dupl i cado/t-r .ipl i — cado. O valor do banco das substâncias teste é- determinado pela sua adição ao meio de ervilha liquido não inoculado. Os pratos são avaliados depois de incubação numa câmara húmida aos 23°C, num misturador ao escuro durante 45' horas.

Quadro

Soluçfíes teste

Amostra Chi tinase Pur i f i c a da C c ) β-l,3-glutanase Puri ficada C c ) o — __ 1 1/10 - 1/100 -- - 1/10 4 - 1/100 6 - - 7 - - 8 1 /10 1/10 9 1/10 1/3.00 10 3. / .1.00 1 /10 3.3. 1/100 1/100 3.2 1/10 - 13 1 /10 - 14 1 /10 - 15 1/100 - 16 1 /100 - 3.7 1/100 - 18 - 1/10 19 - 1/10 20 - 1 /10 23. - 1/100 22 - 1/3.00 •"‘O - 1/100 24 1 /10 1/3.0 25 1/10 1/10 26 1 / .10 .1 /10

27 1/100 1/100 20 28 1/100 1/100 60 29 1/100 1/100 200 Água de controle: 10 jul de água destilada são adicionadas a 90 .u 1 de solução de esporo. 0 crescimento do pat-ogénio é registado pela medição da absorvânc ia do meio a S9S nm. A média das amostras em duplica— do/triplicado é calculada e o ensaio correspondente em branco do enzima é substraído de modo a obter a absorção limpa do crescimento do micélio. O efeito inibitório das substância teste usadas é determinada pelo cálculo do crescimento do patogéniio como uma percentagem de água de controle.

Os resultados do teste acima descrito estão compilados no Quadro 4. Quando aplicados como soluções teste simples, todas as substâncias teste são capazes de inibir o crescimento de S. nodorum a um limite extendido, dependendo das concentrações usadas. A combinação de (3-1,3-gIucanase parcialmente purificado e de peptídeo lítico é encontrada como sendo mais fortemente inibidora do crescimento patogénico do que combinações de chiti-nase purificada e de pept-ideo lítico. Isto é consistente com o encontrado, de que o S. nodorum é mais sensível à (3—1,3—glucanase parcialmente purificado do que a chitina.se purificada. Como o Quadro 4 demonstra, adições de 1/100 c de ambos enzimas a um peptídeo lítico particular aumenta unicamente ligeiramente o efeito inibitório da substância teste em comparação com o peptídeo lítico sozinho. Combinações de 1/10 c de ambos enzimas com uma concentração da peptídeo lítico particular inibe mais fortemente o patogénio teste do que combinações de 1/100 c de enzima com peptídeo lítico. ê especia1.mente interessante notar que combinações de ambos enzimas, ou em concentrações de 1/10 ou de

1/100, com peptídeos líticos aumentam fortemente o efeito t-ório das substâncias teste. 26 — inibi—

1 τ

Quadro 4: Resultados das soluções teste, crescimento dos fungos em % em relação ao de controle

SoIução Pepd i deo T i on i na .8 Teste Sint-ét-x co da. cevada Me 111· x na E π xc i rn a. s no. 3 0(Cont r o i 1 e 1 - - 100,00 1 - - - 78,60 - - 93,68 - - - 50, 18 4 - - - 81,75 q 80,35 86,32 73,65 - 6 73,51 63,86 65,96 - “7 t 65,36 60,70 27,37 - Cj - - - 34,21 9 - - - 45,61 10 - - - •“'O o o 11 - - - 60,88 1 •L .C. 68,42 62,81 62,81 - 13 63,51 49,47 57,54 - 14 61,75 47,02 22,46 - 15 77,89 75,44 73,33 - 16 7.1,58 62,81 65,26 - 17 64,21 57, 1 9 25,61 ~ 1 o J. 46,67 13,68 14,74 - 13 30,88 12,38 .11,93 - 20 27,83 •5 ; 6,32 - 65,26 54,74 61,40 - (ΤΟ C 1 D--, , ·_· x 46,67 57,13 - 23 CXTC; 39,30 25,96 - 24 3,47 “7 -7-J / t t X. 10,53 - 25 8,4 'Z iL. j jL.jÍ. 7,37 —

I

0,00 26 :, 86 0,00 p~7 40,7 42,46 22,72 - 28 36,49 32,98 22,11 - 29 V·* «L / 4· 28,77 18,75 —

Os enzimas hidroliticos são purificados a partir de folhas pelo procedimento descrito no Exemplo 1. Os peptídeos li ticos são testados a concentrações de 20 ppm, 60 ppm e de 200 ppm.

Exemplo 4: Formulações de composições eficazes anti—patogénicas que empregam composições líquidas de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos como o ingrediente activo

Nos dados seguintes, as percentagens das comp*osi ções são dadas em peso. 1. Concentrados para emulsão; a b c Ingrediente activo 20 % 40 % 50 Dodec i1benzenosu1f onato de CàlciO 5 % 8 % 6 : Éter de polietileno—glicol de óleo de castor <36 5% - - moles de óxido de etileno) Éter de polietileno-glicol de t r i bu t· i 1 f eno 1 < 30 12 % 4 : moles de óxido de etileno) Ci c1o-hexanona — 15 % 20 Mistura de xileno 70 % 25 % 20 ss r

Emulsões de qualquer concentração necessária podem produzidas a partir destes concentrados por diluição com água. 2. Soluções: a b c d Ing red i ente ac t ivo éter de monometilo de 80 % 10 % 5 % 35 etileno-gli col 20 % - - - Po 1 i e t. i 1 eno-g 1 i c o 1 400 - 70 % - - N-me t i1-2-p i rro1idona - 20 % - - óleo de coco epoxidado - - 1 % 5 Petróleo desti1ado (gama de ebulição de 1S0°C a 130 0 C> — 34 % —

Estas soluções são adequadas para a aplicação na "forma ae m x c rogotas. a b 5 % 10 % 34 % — 30 % " · u ΐ" a n u 1 a t o s '

Ingrediente ac tivo Cao1i no Ácido silicico altamenie disperso Atapulgi te 0 ingrediente activo é dissolvido em no, a solução é pulverizada num supo quentemente evaporado em vácuo. te, e c1oreto de metile~ solvente e subse - 30 -

4. pós: <3 b Ingrediente s.ctivo 2 % 5 % Ácido silicico altamente disperso 1 % 5 % Talco 37 % - Caolino - 90 Pós prontos a usar são obtidos por mistura intima dos supor tas c om o i ngr ed i erite a c t i vo .

Exemplo 5: Formulção de composições eficazes anti-patogénicas que empregam composições sólidas de peptídeos líticos e enzimas hidrolíticos como ingrediente activo

Nos dados seguintes, as percentagens das composições são em peso. 1. Pós humidificáveis; 3 j-. c .1 ng r ed i en te a. c t i vo 20 % 60 % 7C L i nhosu1f onato de sód i o C V c y - L 5 ‘.J l1· i. 1 3 Lr! 2 f 3 í- u CÍ0 SÓCÍ 11 3 % - 5 % Diisobutiln a. f t a 1 e π o s u 1 f ο π a t o d e sód i o - 6 % .1.0 éter de po1ieti1eno-glicol de octilfenol (7 a 8 moles de - 2 % - óxido de eti. leno) Acido silícico altamente disperso 5 % “‘"7 'X i 0 Ca o J. i no tT "7 */ O / /o - - 0 ingrediente activo é total mente misturado com os adjuvantes e a mistura é totalmente moída num moinho adequado, originando pós humidifiçáveis que podem ser diluídos com água para originar as concentracâes desejadas. 2. Concentrado para emulsões!

Ingrediente activo 10 % Éter de polietileno-glicol de octilfenol 3 % (4 a 5 moles de óxido de etileno)

Dodecilbegnzenosulfunato de cálcio 3 % Éter de poliglicol de óleo de castor 4 % (36 moles de óxido de etileno)

Ciclo-hexanona 30 %

Mistura de xileno 50 %

EmulsSes de qualquer concentracSo podem ser obtidas a partir deste concentrado por diluição com água. 3. Pós: /W b Ingrediente activo 5 % P. % Talco 95 % - Cao1i no — 92 Pós prontos a usar são obtidos por mistura do ingrediente activo com os suportes, e moagem da mistura num moinho adequado. mistura é extrudada apl içado,

4 . firanulato por ext rusão Ingrediente activo Linhosulfonato de sódio 4 K Carboximeti1 celulose 1 %

Cao1i no: O ingrediente activo ê misturado com os adjuvantes, e a subsequentemente misturada com ãgua. A mistura é e depois seca numa corrente de ar. 5 . Granulato revestido

Ingrediente activo

Po1i e t i1eno-g1i c o1 200

Caolino 0 ingrediente num misturador a c t ivo f i namen te mo £do ao c ao1i no mi s tu r ado % 34 % -glicol. Os granulatos desta maneira. e v e s t i d os sem serem em é u n i f o r m e m e n t e o m p o 1 i e t i 1 e η o— pó são obtidos &. Concentrado em suspensSo) 40 % 10 % 6 %

Ingrediente activo E t- i 1 επο-g 1 x c o 1 é te r de po1i e t iIeno-g1x c o1 de non i1f eno1 C 15 mo 1 es de ó.x x do de e t· i 1 eno )

Linhosul f onat-o de sódio 10 %

Carboximeti .1 celulose 1 %

SolucSo de formaIdeido aquosa a 37 % 0,2 % óleo de si li cone numa emulsão aquosa a 75 % 0,8 % Água 32 % 0 ingrediente activo finamente dividido é infimamente misturado com os adjuvantes, originando um concentrado em suspensão a partir do qual suspensfíes de qualquer concentracão desejada pode ser obtida por diluição com água.

Exemplo 6: Construção de vectores binários

pCfiN1781C e PC6N1782C 0 pCIElOOSB, que contém um promotor do virus de mosaico da couve-flor 35S duplo CVMCo> operacionalmente ligado a um gene que codifica a expressão da glucanase básica é construído da seguinte forma; 0 plasmídeo p6LN17 é um híbrido de ADNc que codifica a β-l,3-glucanase básica de N. tabacum (Shinshi et al., 1988) construído por fusão da extremidade 5' do clone pGL31 e a extre-rnida.de 3' do clone p<3L3S. Este híbrido de ftDNc tem a sequência SEQ ID N0;9. 0 ONAc * truncado na extremidade -5' e não codifica o sinal total do peptideo. De modo a fazer as plantas transgénicas em que esta protéina está apropriadamente marcada Ci.e., vacuolo central), é necessário adicionar esta sequência novamente ao DNAc truncado. Por consequint-e, a cassete de VMCo 3SS duplo ê construída por um processo de dois passos. No primeiro passo o sinal do peptídeo do DNAc é substituído por um sinal de peptídeo codificado no clone genóroico. No segundo passo, este "DNAc reparado" é movido para o vector expressão. O plasmídeo pSGL2 é um subclone do DNAc de pGLN17. Este plasmídeo é digerido com Ciai e EcoRI e o fragmento 1 kb que contém o DNAc da glucanase é isolado a partir de um gel de agarose LGT. O plasmídeo pBluescript é digerido com EcoRI, tratado com CIAP e purificado com um gel de agarose LGT. O plasmídeo pBS—<31uc 39,1 contém uma inserção de 4,4 kb que inclui a sequência do código da glucanase, cerca de 1,5 kb de sequência, lateral 5', um intron de 600 bp, e cerca de 1 kb de sequência lateral 3'. Este plasmídeo é usado com um modelo na experiência PCR que contém dois primários com as sequências SEQ 1D NO!10 ou SEQ ID NO!U. 0 resultado desta ampliação é a produção de um fragmento para a substituição da extremidade 5' truncada do DNAc de glucanase. Uma mutação numa única base cria um sítio EcoRI é introduzido para facilitar as experiências com clones. O produto PCR é degerido com EcoRI e Ciai e os fragmentos são separados em sel de agarose LGT a 2%. Uma banda de 120 bp é excitada, misturada com o fragmento 1 kb Ciai— EcoRI de PSGL2 e o vector bluescri.pt digerido EcoRI, purificado, é ligado e transformado como descrito acima. As transformações são registadas pela presença da inserção e um plasmídeo com a estrutura apropriada é designado por pCIBlOOS.

0 plasmídeo pCIBlOO'3 é degerido com EcoRI e o fragmento •1. »2 kb é purificado num gel de agarose LTC. 0 pasmídeo PCGN1761 é digerido com EcoRI, tratado com CIAP, purificado num gel de agarose LGT, misturado com fragmento 1,2 kb EcoRI, e depois ligado e transformado. As transformacSes são registados pela presença de inserção. Um plasmídeo, em que o DNAc da glucanase está em sentido relativo ao promotor VMCo é designado como pCIS10058. O fragmento 4,9 kb Xbal de pCIBIOOSB é subclonado em Xbal de pCGN1540 digerido numa tal orientação que o fragmento do promotor 35S duplo está próximo ao gene marcador se.lec c ionado da planta de pCGN.1540 para criar pCGN1781C. A construção do plasmídeo PCIB1007, que contém um promotor VMCo 35S duplo operacionalmente ligado ao gene que codifica a chitinase básica é o seguinte; 0 plasmídeo pSCHIO contém uma inserção de DNAc da chitinase básica do tabaco que é idêntico à inserção em pCHNSO CShinshi et al, 1987) mas com uma extensão de 81 bp na extremidade 5' (SEQ ID NO;12). 0 pSCHIO é digerido com BamHI e depois ligado com um adaptador molecular <SEQ ID NO;13) como descrito no Exemplo 5. O produto de ligação é depois purificado e degerido com EcoRI e o fragmento de 1,2 kb que contém o DNAc da. chitinase adaptado é purificado a paritr de um gel de agarose LGT.

Este fragmento é misturado com EcoRI digerido, CIAP de PC6N1761 tratado que é também purificado a partir de um gel de agarose e a mistura, é ligada e transformada. As transformações são registadas pela inserção de DNAc da. chitinase e um plasmídeo '6

que contém o DNAc de chitinase numa orientação de sentido relativa ao promotor VMCo é designado como pCIE'1007. 0 fragmento 4,8 kb Xbal de pCGN1007 é clonado em Xbal de pCGNl-540 digerido numa tal orientação que o fragmento do promotor 35S duplo está próximo ao gene marcador seíeccionado da planta de PC8N1540 para criar um vector binário PCGN1782C.

Exemplo 7; Construção de um gene que codifica um peptídeo lítico sintético No.3 0 peptídeo lítico sintético No.3 como descrito acima nos exemplos anteriores tem um amino-ácido de sequência SEQ ID NO: 1 .

Um gene sintético que codifica este peptídeo é construído em vários passos. Primeiro um gene que codifica a prot-éina madura (processada) é sintetizada e clonada, depois um peptídeo sinal e a sequência guia 5' para a expressão das plantas e da secrecão são adicionados, finalmente uma sequência não transladada 3' e um sítio de processamento de RNArn 3' são adicionados. Disto resulta um gene que codifica o peptídeo sintético No.3 que pode ser transformado numa planta e que dirige a síntese de um peptídeo lítico que será secregado extracelularmente. A. Construção de um sequência de código para o peptídeo maduro

Dois oligonucleotídeos são sintetizados, Oligo 1 e Oligo 2, com as sequências SEQ ID N0!2 e SEQ ID N0:3 são sintetizados usando química de B-cianoeti1-fosforamidite num sintetiza-dor Applied Biosystems 380A e são purificados usando purificação â base OPC (Applied Biosystems) como descrito pelo fornecedor. Os

oligonucleotídeos purificados são em primeiro lugar quinasados com pol inuc leotideo quinase, e depois anelados durante uma hora aos 6S°C. A reacção é arrefecida aos 37°C e a ligase DNA T4 é adicionada com ATP ext-ra e a ligação é deixada incubar uma outra hora. A reaccão é depois aquecida aos 65°C durante 1 rain para inact-ivar a ligase e depois diluída e feita 1 X no tampão EcoRI recomendado. A reacçSo de ligação é depois digerida com EcoRI. O DNA é extraído com fenol e precipitado com acetato de sódio 0,3 M e com dois volumes de etanol. O precipitado é recuperado por centrifugação e ressuspenso em tampão TE 10 mM (Sambroock et al., 1S89). O DNA sofre electroforese num gel de agarose a 3,0 % a uma temperatura de gelação bai.xa e a banda que contém o gene sintético é excitada e ligada no sítio EcoRI de pBluescript-íStratangene). A reaccão de ligação é transformada em E. coli e colónias são seleccionadas e construtores putativos positivos são analisados primeiro por restrição à digestão e depois por Subse-quências de DNA. Um constructor que é designado por pBSlypepS é determinado como contendo a sequência correcta e é escolhido para outros trabalhos. B. Adição de uma sequência lateral 5' e do peptídeo s i na1 a pBSi ypep3 0 primeiro de 5' e o peptídeo sinal do gene PR-la são adicionados ao gene sintético usando um PCR basiado na técnica de fusão in vitro como descrito por Ho et al . (1989.). Nesta técnica uma fusão de gene é feita in vitro através da criacão de dois fragmentos com sobreposição das extremidades por PCR. Na reac cão-subsequente estes dois fragmentos são depois fundidos, novamente por PCR, para gerar uma fusão perfeita entre as duas moléculas. Esta estratégia é usada para fundir o peptídeo sinal PR-la e o pr ime .i r o de 5' è sequência que codifica o pept í deo 1 í t i c o . Pa r a conseguir esta fusão quatro oligonucleotídeos são sintetizados e

SEQ ID NO!5, SEQ ID py p ΐ f ϊ c âdos c omo dt?5c r j. to acima. -bEQ XO NO! 4 j NO; 6 e SEQ ID NU 7 .

Os clisos 3 (SEQ ID NO;4) e 4 (SEQ ID NO;5) são complementares um ao outro e contêm a sequência de DNA desejada para a fusão entre o sinal PR-la e o primeiro de 5' e a sequência que codifica o peptídeo li tico. A fusão desejada está no diagrama segu i nte (SEQ ID NU; tí .> . 0 oliso 5 (SEQ ID NO: S) tem a mesma sequência como a extremidade 5' do DNAc de PR-la e contém na extremidade 5' uma sequência que codifica um sitio de restrição de EcoRI. 0 oliso 6 (SEQ ID NO:7) é complementado á extremidade 3' do gene sintético que codifica o peptídeo lítico 3 e também contém um sítio EcoRI na extremidade 5'.

De modo a fundir duas pecas de DNA, duas reacções de PCR são realizadas. Uma que usa o Oligo 3 (SEQ ID NO:4) e o Oligo S (SEQ ID NO; 7> como os primários e o p.lasmideo pBSLypepS como um modelo e o outro que utiliza o Oligo 4 (SEQ ID NO:5> e o Oligo 5 (SEQ ID NO: 6) c0.050 primários e o plasmideos pBS-PR 1013C1 a (ATCC4042S) como um modelo. As reacçSes PCR são realizadas usando o dispositivo Gene Amp (Perkin Elmer/CETUS) coroo sugerido pelos fornecedores. Us produtos de PCB' são analisados por electroforese de gel de agarose. Eles são depois purificados e uma aliquôta de cada um é usada no seguindo estágio da reacçSo de PCR. Nesta reaccão os primários, o Oligo 5 (SEQ ID NO;6) e o Oligo 6 (SEQ ID NU! 7, são usados para ampliar o produto. Desta forma duas pecas da DMA são fundidas na maneira pré-determinada explicada acima. Us produtos de reacção são analisados por electroforese de gel de agarose. 0 DNA é depois extraído com feno! e precipitado com etanol e o DNA ressuspenso e digerido com EcoRI. Este DNA é

depois purificado por el.ec trof orese num gel de agarose a tempera-t-urs. de gelacão baixa e 1 xgado em ρΈ-luescript que e digerido coív* EcoRI e tratado com CIAR. O DNa é transformado em E. co.li e os transformados são seleccionados. Plasmídeos positivos construídos são registados por restrições è. digestão e confirmados para a estrutura anticipada por sequências de DNA. Um desses construídos é designado por pBSLP5'PRl e é usado em experiências subsequentes . C. Subclonacão de gene de pept-ídeo lítico em vector de expressão 35S duplo 0 gene de pept-ídeo lítico sintético com uma sequência de primeiro 5' e um pept-ídeo de sinal é subclonado no vector expressão da planta pCGN1761 (uma cassete de promotor VMCO 35S duplo/terminador que contém resistência a ampicilina). 0 pC6M1761 que contém o promotor de VMCo 3SS duplo e a região tm—1 3' com um sítio EcoRI entre eles continha uma estrutura de plasmídeo derivada de pUG. A cassete do sit-io de processamento do promotor EcoRI—3’ é abordado por uma restricção múltipla de sítios para remoção f ècil. U plasmídeo & deiivado poi uma série de passos (ver abaixo) a partir de um plasmídeo duplo inicial, pC6N2113, que ele próprio é derivado do pCGN164, e

Γ 0 t\j LZtO si tios por 0 pCGN1431 também contém o promotor VMCo O 5 tf duplo e a região tm— 1 3’ com múltiplos sít-os de clonacSo entre eles. Esta cassete promotor/terminador é contida num vector derivado pUC que contém um gene de cloranfenicoi em vez de um gene ús i esislência à ampicilina. A cassete é abordada por sítios de rest-riçaw múltipla para remoção fácil. 40 a. Construção de pCGN'35’6 0 pCGN'386 contém um promotor VMCo 358 duplo e uma região T-ADN trn-1 3' com sít-ios de restrição múltipla entre eles. O pCGNSSS é derivado de outro plasmídeo, o pCGN20S, que contém o promotor VMCo 358 e uma diferente região 3', a região VMCo VI extremidade 3'. 0 promotor VMCo 358 é clonado com um fragmento Alui (bp 71AA-773A) (Gardner et al . , 1981.) no sítio Hinc II de M13mp7 (Messing et al., 1381) para criar C614. Um EcoRI digere o C614 produz o fragmento EcoRI a partir de CS14 que contém o promotor 35S que é clonado no sítio EcoRI de pUC< (Vieira and Messing.· 1982) para produzir PCGN147. 0 pCGN148a que contém uma região de promotor, marcador seleccionado (Kanamycin com 2 ATGs) e região 3', é prsparado por digestão de f-CGN-528 com Bgl 11 e inserção de fragmento de promotor BamHI-BglII de pCGN'147. Este fragmento é clonado em sítios BglII de pCGN528 de modo que o sítio Bgl II est-é. próximo do gene Kanami-cina de pCGMS28. 0 vector lançador, pCGN528, usado para esta construção é feito da seguinte forma; pC-GNS2S é feito por digestão de um plasmídeo que contém TnS que abriga um gene Kananncina (Jorgensen et al . , 1973) com Hindi 1I—EiamHI e inserção de fragmentos HindJII —

BamHI que contém o gene de resistência á kanamicina nos sítios Hindi II-BamHI no gene de tetraciclina de pACYC184 (Chang and Cohen, 1378). 0 pCGN52S é feito por inserção do fragmento de

BamHI 13 de pTiA6 (Thomashow et al., 1380) modificado com ligado-res Xhol inseridos no sitio de Smal, no sítio BamHI de PCGN525. 0 PC6N525 é obtido por apagar o pequeno Xhol. e rei. igação. 0 pCGN143a é feito por clonação do fragmento do gene de BamHI Kanamicina a partir de pM83KanXXI no sítio de BamHI do 41 pCGN148a. 0 pMB9KanXXI é uma variante pUK4K (Vieira and Messig, .1.982.) que tem uma falta no sitio Xhol mas contém um gene de função de kanamicina do Tn903 para permitir uma selecção eficiente em ftgra.bacter.tum. 0 pC6N149a é digerido com HindiII e BamHI e ligado a pUC8 digerido com Hindi II e BamHI para a produção de PCGN169. Isto remove o marcador de kanamicina Tn903. 0 pCGNBGS e o pCGNIGS são ambos digeridos com HindiII e PstI e ligados para formar PCGN203, um plasmideo que contém o promotor VMCo 35S e parte da extremidade -5' do gene de kanamicina TN-5 (até o sítio PstI , Jorgensen et al., 19731. Uma região de regulação 3' é adicionada a pCGN203 a partir de P-CGN204 (um fragmento EcoRI de MVCo (bp 408 - 6105) que contém a região 3' do gene VI subclonado em pUCIS (Gardner et al., 1981) por digestão com Hindi II e PstI e ligação. h cassete resultante, pC6N206, é a base para a construção de PC6N986.

As sequências pTIAS T-ADN t-m-1 3' são subclonadas a partir de fragmentos baml9 T—AON (Thomashow et al., 1380) como um fragmento BamHI—EcoRI (riuc leotideos 3062 a 12.323, numeração como em Barker et al . , 196)3) e combinados com o pACYC184 (Chang and Cohen, 1978) origim de replicacão como um fragmento EcoRI-HindII e um marcador de resistência a gentamj. cina (a partir de pL.B41), como um fragmento para a produção de pCGN417. 0 único sítio Smal de PCGN417 (nucleotídeo 11.207 do fragmento Baml3> é trocado por um sítio Saci usando ligadores e o fragmento BamHI-Saci é su.lclona.do em pCGNSSS para originar PCGN971. 0 sitio BamHI de PCGM971 é trocado por um sítio ecoRI usando ligadores para originar pCGN971E. 0 fragmento EcoRI-SacI resultante de pCGN971E, que contém as sequências reguladores t-m-1 3', ê junto a p€GN206 por digestão com EcoRI e Saci para originar 42

PCGN375. A pequena parte do gene de resisitência de kanamicina Tn5 é apagada da extremidade 3' do promotor VMCo 35S por digestão com Sa.l.I e BglII, embotados as extremidades e ligação com ligado-res Sa1I A cassete da expressão final pCGN98S contém o promotor VMCo 35S seguido por dois sítios Sal I, um sítio Xbal, região BamHI , Smsl Kpn 1 e tm-1 3' C nuc leotideos 11207 - 9023 do DNA-T) . b. Construção de PCGN164; 0 fragmento de Alui de MVCo Cbp 7144 — 7735) (fiardner et al., 1981) é obtido por digestão com Alui e clonado na sitio de M13mp7 (Vieira and Messing, 1982) para criar 0814. Uma digestão de EcoRI de C614 produz um fragmento de EcoRI a parit-r de C614 que contém o promotor 35S que é clonado no sítio EvcoRI de pUC3 (Vieira and Messig, 1982) para produzir pCGN146. Para preparar a região promotora, o sítio BglII ípe 7870) é tratado com BglII e BalSl e subsequentemente um ligador BglII é ligado ao Ba131 tratado com DNA para produzir pCGN147. 0 pCGN147 é digerido com EcoRI Hphí e o resultante fragmento EcoRI-Hphl que contém o promotor 353 é ligado em EcoRI-SmalI digerido M13mp8 (Vieira and Messing, 1982) para criar pCSN164. c . Construcão de pC6N6381

A digestão de VMCo10 (fiardner et al., 1981) com BglII produz um fragmento Bg111 que contém uma região promotora 3SS (bp 8493 - 7870) que estâ ligada no sítio BamHI de pUCIS (Norrander et al., 1983) para criar pCGN638. d. Const.ri.jc8o de PCGN2113: 0 pCGN164 é digerido

com EcoRV & c om Ba. mH I P® s libertar um fragmento EcoRV-BamHI que contém uma porção de promotor 358 ípe 7340 - 74331; pCGNSSS é digerido com HindIII e com EcoRV para libertar um fragmento Hindi II-EcoRV que contêm uma porção diferente de promotor 358 Cbp 6493 - 73401. Estes dois fragmentos são ligados em pCGNSSS que foi digerido com HindIII e com BamHI para a remoção do fragmento Hindi II-BamHI que contém o promotor 358; esta ligação produz pCGN639 que contém a estrutura e a região tm-i 3' de pCGN986 e os dois fragmentos do promotor 358 a paritr de pCGNl.64 e de pCGNSSS. 0 pCGN638 é digerido com EcoRV e com Ddel para a libertação de um fragmento do promotor 358 (bp 7070 - 7340); o fragmento é tratado com fragemento Klenow de DNA polimerase I para criar extremidades embotadas, e está ligado no sítio EcoRV de PCGN633 para a produção de PCGN2113 que tem o fragmento na orientação apropriada. e. Construção de pCGN1761: 0 pCGN23.13 é digerido com EcoRI e o plasmídeo é ligado na presença de adaptor de DNA sintético que contém sitio Xbal e um sítio BamHI (o adaptador que contém extremidades apertadas a EcoRI em cada extremidade, mas as bases adjacentes são tais que um sitio EcoRI não é reconstruído nessa localização) para a produção de pCGN2113M . 0 pCGN2 113ΓΊ é digerido para a complet-ação com Saci e depois sujeito a digestão parcial com BamHI. Este DNA é depois tratado com polimerase de DNA T4 para criar extremidades embotadas e um ligador EcoRI é ligado a este plasmídeo com terminação embotada. Depois de transformação um clone de plasmídeo que contém um único sitio EcoRI entre o promotor e a região intacta tm-1 3' é seleccionado e designado por PCGN1761. 0 plasmídeo pBSL.P5'PRl é degerido com EcoRI e aproxima-damerite fragmento de 200 bp que contém o gene do peptídeo lítico e o sinal de PR-la/primeiro é purificado a partir de gel de 44 agarose de temperatura de gelacão baixa. Este fragmento está ligado em pCGN1761 que é digerido com EcoRI e tratado com CIAP e também purificado em agarose de temperatura de gelacão baixa. A rsaccSo de ligacSc é usada para a transformação de E. coli e as transformaçfles são sele-ccionadas e depois registadas para a inserção. Dois tipos de transformação são recoperadas que diferem na orientação do gene do peptídeo lítico. Um tipo, em que o gene está no "sentido" de orientação em relação ao promotor, é selec-cionado e vários plasmideos são verificados para a construção correcta de sequência de DNA. Um plasmideo, que tem a orientação correcta e a sequência de DNA anticipada, é designado por pBS2X35SLyt-Pep e usado noutras experiências. D. SubclonacSo da cassete de expressão de UMCo 2X35S/peptídeo lítico num vector binário A cassete de expressão é subcloriada num vector de transformação de planta pCGNl-540 que contém limnites de ADSn-T direito e esquerdo de A. tomefaciens octopine Ti—plasmideo pTIAS fCurrier and Nsster, .1.9761, o gene de resistência de gentamicina de pPHiJI CHirsch and Beringer, 1984), um plasmideo Ri de A. rhizogenss Ri origem de replicação a partir de pLJBil ÍJouanin et al . , 1985), a região promotora, mas uma região mas 3' de pTiA6 com o gene de resisitênc ia a kanamicina de TnS (Jorgenser, el al . 1979) um ColEl origem de replicação a partir de pBR322 (Bolivar et al., 1977), e um gene marcador registavel lacZ' de pUC18 ÍNorrander et al . , 1983). A estrutura, de pCGN 1540, que contém o gene de resisitência de gentimicina e as origens Ri e ColEl, é derivado de pCGN1532 (ver abaixo). Os limites Ti e o gene marcador scleccionável da planta ima?; 5'— kan— mas 3'), são de pCGN1537,‘ a cassete marcador selec ioné.vel da planta é por sua vez tirada de pCGNISSê, enquanto que o limite direito e os

fragmentos lacZ' são derivados de pCGN565RBx2X, e ο I imite ss^usrdo é derivado de pGGNGS. a ConstrucSo de pCGN1532!_ 0 fragmento de 3,5 kb EcoRI-PstI que contém o gene de resistên+ia de gsntamicina é removido de pPhlJI CHirsch and Beringer, 1384) por digestão de EcoRI-PstI e clonado em EcoRI--Pstl digerido pUC3 (Vieira and Messig, 1982) para gerar pCGN549. A digestão de HindIJI-PstJ de pC6N549 origina fragmentos de 3,1 kb suportando o gene de resistência gent-imicina, que é feita com extremidades embotadas por fragmento Klenow de DNA polimerase I e clonados em PvuII digerido pBR322 (Bolivar et ai., 1977) para criar pBR322Gm. 0 pBR322Gní é digerido com Dral e Sphl, tratado com en-ima Klenow para ciar extremidades embotadas, e o fragmento 2,8 kb clonado na região Ri origem que contém o plasmídeo pLJbBll (Jouanin et al., 1985) que foi digerido com Apal e feito com extremidade embotadas com enzima Klenow, criando pLHbEillGm. A origem ColEl extra e o gene de resistência kanamic.ina são apagados do pLHbB.1.1GM por digestão com BamHI seguido por aut-o-clausura para criar pGMBll. 0 sítio HxndII de pGmBll é apagado por digestão de Hindi I seguido por tratamento com enzima Klenow e auto--clausura, criando pGmEUl-H. 0 sitio PstI de pGmBll-Η é apagado por digestão de PstI seguido por tratamento com enzima Klenow e auto-c lausura , criando pCGN1532. b. Construção de PCGN1536:

(. Knauf EcoRI O fragmento 5,4 kb EcoRI é removido de pVK232 and Nester, 1982) por digestão de EcoRI e clonado em digerido PACYC184 (Chang and Cohen, 1378) para criar pCGN14. 0 fragmento 1434 bp Clal-Sphl de pCGN14, que contém a regido mas 5' (bp 2028 - 21562 de acordo com a numeração de Barfcer et al . , 46 1983) é clonado em Accl— Sphl digerido pUC19 (Yanisch—Perron et· al . , 1985) para gerar pCGNSO. Usa fragmento 746 bp EcoRV— Na© I da região mas S' é substituído por um sítio Xhol por digestão de pCGN40 com EcoRV e com Nael seguido por ligação na presença de um ]. igador Xho sintético de DNA para criar pCGN1036. 0 fragmento 765 hp SstI—Hindi II (bp 18474 — 19239) de pCGN14, que contém a região mas 3'i é clonado em SstI-HindJII digerido pUC18 CNorrander et al., 1983) para originar pCGN43. 0 sítio HindIII de pCGN43 é substituído com um sítio EcoRI por digestão com HindIII, extremidades embotadas com enzima Klenow, e ligação de 1igador EcoRI sintético de ADN para criar pCGN1034. O fragmento 767 bp EcoRI de pCGN 1034 ê clonado em EcoRI digerido pCGNl036 na orientação gue coloca bp 19239 da região mas 3' próxima da região mas 5' para criar PCGN1040. 0 pCGN1040 é sujeito a digestão parcial com SstI, tratado com polimerase de DNA T4 para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de 1igador Xhol de DNA; um clone é selecionado em que unicamente o sítio SstI na junção de bp 18474 e do vector de DNQ (construído em pCGN43 e carregado em pCGNl040) ê substituído por um sítio Xhol para gerar pCGNl047. 0 pCGN-565 [ver acima! é digerido com EcoRI e com HindIII, tratado com enzima Klenow para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de 1igador Xhol sintético de DNA para criar pCGNl003; este recria o sítio adjacente EcoRI ao 1igador Xhol. 0 pCGNl003 é digerido com EcoRI, tratado com enzima. Klenow para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de 1igador PstI sintético de DNA para criar pCGN1007. 0 fragmento 1,5 kb Xhol de pCGNl047, que contém a região mas 6' e a região mas 3' com um sítio de clonacão múltiplo entre eles, é clonado a Xhol digerido pCGN1007 pa ra c onstru i r pCGN1052.

Uma porção de sítios de clonacão múltipla de pCGN1052 é spagado por digestão com Xbal e SstI, tratada com enzima Klenow Para formar extremidades embotadas, e ligado para gerar

pCGN1052ó'XS . 0 fragmento 1 kb EcoRI—Smal de pCGNSSO Cdesc r i çSo de PC6N7831, que contém o gene de resistência 1 ATG—kanamicina, é clonado em Bluescript M13—KS EcoRI—Smal digerido (btragene, Inc .) para criar pBSKbj ; este plasmideo contém a regido M13 que permite a geração de uma cadeia simples de DNA. A cadeia simples de DNA é gerada de acordo com as recomendações do fornecedor, e a rnutagene in vitro ê realizada (Adelman et- al . , 1 '383) usando um o 1 i gonuc 1 eo t i deo sintético SEQ ID NO! 14) para alterar um sítio de Pst-I dentro do gene de resistência de kanamicina e torná-lo indigestivel, criando pCGN1534. 0 pC6N1534 é dirido com Smal e ligado na presença de ligador EcoRI ao DNA para gerar PCGN1S35. 0 fragmento 1 kb EcoRI de pCGN1536 é clonado em pCGN10526XS de EcoRI digerido para criar a cassete marcador selecionável de planta roas5'-kan mas3' pCGNaSSS.

c. Construcáo de pC6N565RAx2X 0 pC6N451 Cdescri cão de pCGN7833 é digerido com Hpal e ligado na presença de ligador Sphl sintético ao DNA para gerar pCGNSS. 0 fragmento Xhol-Sphl de pCGNSS < bp 13800 -- 15208, que inclui o limite direito, de DNA-T de A. tumefaciens; Baker et al . , 1383) é clonado em pUC19 de Sal I-Sphl. digerido CYanish-—Ferron et al . , 1985) para criar pCG'NS0 . O fragmento 1,4 kb Hindi II—BamHI de pCGNSO é clonado em pSP54 de Hindi II—BamHI digerido f Promega ,· Inc) para gerar p CGN1039. 0 PC6N1039 é digerido com Smal e com NruI (apagando o bp 14273 - 15208; Baker et al., 1983) e ligado na. presença de ligador BglII sintético ao DNA criando pCGN10396NS. O fragmento de 0,47 kb Eco-HindiII de pCGN1039ó"NS ê clonado em pCGN565 de Eco—RI—Hindi11 digerido Cdesc ri to na. discrição de pCFN7833 para criar pCGNSSSRB. 0 sítio de HindiII de pCGNSSSRB é substituído com um sítio de Xhol por digestão de HindIJI, tratamento com enzima Klenow, e ligação na presença de ligador Xhol sintético ao DNA para criar 48 PCGN565RB—Η+Χ. Ο pUC18 (Norrander et al., 1383) é digerido com HaelI para libertar um fragmento lacZ', tratado com enzima Rlenow para criar extremidades embotadas, e o fragmemto que contém 3.acZ' ligado em pCGN565R8-H+X, que foi digerido com Accl e com Sphl e tratado com enzima Klenow, em tal orientação que o promotor 1acZ5 está próximo ao fragmento do limite direito; nesta construção, pC6N565Bx2x é positiva para a expressão lacZ’ quando colocado num prato num hospedeiro apropriado e contém bp 13SS0 - 14273 do fragmento do limite direito (Barker et al., 1383? que apagou o fragmento Ac cl-Sphl (bp 13800 - 13330?. d. Construção de pCGNS-5: O pCGNSOl é construído por clonaçSo de um fragmento 1,85 kb de EcoRI-XhoI de pTiA6 (Currier and Nest-er, 1376? que contém as bases 133S2 -15208 (Barker et al . , 1383:? do DNA-T (limite direito?, em M13mp3 de EcoRI—Sall digerido (Vieira and Messig, 1382?. 0 pCGN502 é construído por clonacão de um fragmento 1,6 kb Hindi I I-Smal de pTiA6, que contém as bases 602 - 221.2 de ADN-T (limite esquerdo?, em M13mp3 de HindiII-SmaI digerido. 0 pCGNSOl e o pCGN502 ambos digeridos com EcoRI e com HindiII e ambos contendo fragmentos de DNA-T clonados em pUC3 de HindiII digerido (Vieira and Messing, 13823 para originar pCG'N503, de fragmentos de DNA-T de ambos limites. 0 PCGN503 é digerido com HindIII e com EcoRI e os dois fragmentos Hindi I Ι-EcoRI resultantes (que contém os limites de DNA-T? são clonados em pHC7S de EcoRI digerido (Hohn and Collins, 19803 para gerar pCGNSIS. 0 fragmento Kpnl-EcoRI de pCGNSlb’, que contém o limite esquerdo de DNA-T, é clonado em pCGNSSS de Kpnl-EcoRI digerido para gerar pCGNSSO. 0 fragmento de BamHI-BglII de pCGNSSO é clonado no sítio BamHI de pCYC184 (Chang and Cohen, 19783 para criar pCGNSl. 0 fragmento 1,4 kb de BamHI-Sphl de pCGNSO (ver pCGN6Sx:2X na secção 49 anterior) que contém o fragmento do limite direito de DNfi-T, é clonado em pCGNS1 de BamHI-Sphl digerido para criar pCGNSS. e. Construção de pCGNI-537 0 pCGNSS é digerido com Kpnl e com Xbal, tratado com enzima Klenow para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de li gado r de BglII sintético ao DMA para. criar pCGNSSSKX. 0 pC6'N65£KX é digerido com Sall, tratado com enzima Klenow para. criar extremidades embotadas, e ligado na presença de ligador Xhol sintético ao DNA para criar pCGN65<$KX—S+X. O fragmento 728 bp BglII-Xhol de pCGNRBx2X, que contém o limite direito de DNA—T e o gene lacZ', é clonado em pC6N65£KX—S+X de EiglII—Xhol digerido, substituindo o pCGN65x2X. O fragmento Ciai de pCGN85x2X é apagado com ligador Xhol por digest-So com Ciai, tratado com enzima Klenow para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de ligador Xhol sintético ao DNA para criar pCGN65£2XX. 0 pCGN65S2XX é digerido com Bgll e fundido com pCGN549 de Bgll digerido (ver pCGNl532 na secção anterior) para criar pCGNl.530 que contém ambos plasmédeos de estrutura. 0 pCGNISSO é digerido com Xhol e religado, depois um clone sensível a cloramfenicol e resistente a gentamicina é escolhido que tem apagado a estrutura derivada de PACYC184, criando pCGNl530A· 0 fragmento 2,43 kb Xhol de pCGNl 53fc>, que contém a cassete de mas-S* kan—mas81 , é c lons.do em pCGNl530A de Xhol para criar pCGNl537. f. Assembleia final de pCGNl540 0 fragmento BglII de pCGN1537, que contém o gene marcador seleccionável de planta e o gene marcador regitável lacZ' (com múltiplos sitos de clonaçSo), todos entre os limites de DNA-T, é clonado em pCGN1532 de BamHI digerido. Um clone de orientação a suportar o limite directo do DNA-T adjacente à 50 origem pBR322 de replicação é designado por pCGN1539, e a orientação suportando o limite esquerdo do DNA-T adjacente à origem do plasmideo Ri da replicacão é designado por pC'GNi540. Estes vedores binários têm várias vantagens, que incluem uma quantidade mínima de DMA entre os limites de DNA—T, alta estabilidade em hospedeiros Agrobacterium.· número de cópia elevado em hospedeiros E. coli, e um registo azul/branco com vários sítios de restrição para uma clonação simples do DNA alvo.. 0 vector foi depositado em ATCC <ATCG 40536). 0 fragmento Xbal de pBS2X35SLytPep, que contém o gene do peptídeo lítico, é subclonado no sítio Xbal de pCGNl540 de tal forma que o fragmento promotor está próximo do gene marcador seleccionável da planta. Este plasmideo é designado por pB8Bin2X35SLyPep e é seleccionado para outras experiências. E· Transformação de Agrobacterium

Os vectores binários são transformados na estirpe A. t-umefaciens LB4404 pelo método seguinte. A estirpe Agrobacter.ium é crescida aos 30°C durante a noite em 5 ml de meio LBMG <50 % de caldo, 50 % de caldo de manitol-glutamase (Garfinkel and Nsst-er, 1980)). A cultura, de 5 ml é adicionada a 250 ml de LBMG e agitado vigorosamente até que a densidade da cultura atinga um 0D = 0,6 a um comprimento de onda de 600 nm. As células são depois recolhidas por centrifugação a SOO0 X g e ressuspensas em 5 ml de LBMG. 200 .ul de células são adicionadas a 0,2 a 1 »jg de plasmideo binário de DNA em LBMG e a mistura é congelada imediatamente em banho de gelo seco/etanol. Depois de 5 minutos o tubo é colocado num banho de água a 37°C durante 5 minutos e depois 2 ml de L.BMG é adicionado. A suspensão é deixada num banho de água aos 30°C durante 2 a 3 horas e depois as células são recolhidas por centrifugação. As células são ressuspensas num volume mínimo de 51 LBM6 e depois colocado num prato num meio selectivo (pratos de LBMG com 100 .ug/rnl de gentamicina>. As colónias aparecem depois de 2 a 3 dias aos 30°C. 0 plasmídeo pBSB2X35LyPep é transformado em Agrobacte-rium e as colónias Positivas são seleccionadas e verificadas por análise da mancha Southern e usado para experiências de transfoi— mação de plantas.

Exemplo 8: Transformação estável e Regeneração de plantas Transgénicas

Tecido de planta é transformado com os vect-ores descritos acima através de qualquer técnica conhecida no ramo. Estes métodos usados para transrerir o DNA para a célula da planta incluem, por exemplo, infeccão directa de ou co-cultivacSo das plantas, tecido de plantas ou células de plantas com A. tumefa-ciens CHorsch et al . , 1335; ílarton, 1334), tratamento de proto-plastos com DNa exogenouso por métodos como os descritos em Paszkowski et al. (1384); EP 164 575; Shillito et al. (1385); Potrykus et al. (1385); Lorz et a1.(1385); Fromm et al. (1387); GB 2.140.822; e Negrut-iu et al . (1387); incubação com polieti-leno-glicol (PEQ) (Negrutiu et al. , 1337); micro-injecção CReich et al . (1836a e b)l; bornbardiamento de microprojécti 1 (Klein et al., 1387). A. Transformação de disco de folha de Tabaco são O Agrobacterium são crescidos durante 18 a 24 horas em meio de sal de glutamate ajustado a pH 5,6 e suplementado com 0,15 % de manitol; 50 jul/ml de kanamicina, 50 /j 1 /ml de espectino-micina e 1 mg/ml de estreptomicina antes de eles serem diluídos em ODSOO de 0,2 no mesmo meio sem antibióticos. As bactérias 52 -

depois crescidas durante três a cinco horas antes de diluição num 0D600 de 0,2 a 0,4 para inoculação dos discos de 5 a 7 mm tirados por punção das folhas de Nicotiana tabacum cv. xanthi que foram crescidas asepticamente em recipientes GA7, seguido por uma modificação do método de Horsch et al . ( 1335 .

Gs discos de folhas são mantidos em 0,7 % de agar que contêm sais de Murashige e Skoogs principais e menores (MS), 1 mg/.l de benzi ladenina e 1 mg/ml de ácido α-naf talenoacético durante dois dias antes de serem transferidos para o mesmo meio que contém 50 ;jg/ml de Kanamicina, 100 ,ug/m 1 de carbenic i 1 ina e 100 ;jg/ml de rnefoxina. Germinações que se formam nos discos são excitadas e propagadas até que seis rebentos são obtidos por subcultura das tiras de germinações em meio MS que contém 50 jug/ml de kanamicina em recipientes GA7.

Os rebentos são enraizados no meio que contém hormonas e 50 jug/ml de kanamicina, transferidos para o solo e endurecidos em fitroton antes de serem transferidos para uma estufa, para .indução do tratamento com reguladores químicos. No tempo da floração as flores são induzidas a auto~polinizarem—se. Sementes são colhidas na maturação seguinte. 8. Produção de Plantas e Callus de Tabaco Transgénico

Agrobacterium é usado para a transformação da formação de callus a partir dos discos de folha <A.>. A formação de callus num meio de selecção MSBN que contém kanamicina é mantido num meio de crescimento de callus que compreende sais principais e menores MS e Fe—EDTA (Gibco # 500 — 1117; 4,3 g/ll, vitaminas MS, 100 mg/1 de mio—inositol ,· 20 g/í de sacarose, 2 mg/1 de ácido nafta.]enoacético e 0,3 mg/1 de cinetina. 53

Os callus podem ser usados para regenerar plantas transsénicas por transferência de pecas dos cal lues para o meio MSBN e seguido pelos métodos descritos em A. C. Transformação de Cenouras

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas am 0D600 de 0,2 a 0,4, são depois usadas para inoculação dos discos cortados a partir de superfície de cenouras esteri 1izadas.

Para esterilizar a superfície as cenouras, elas são peladas e depois embebidas durante 20 minutos numa solução a 10 % de clorox. As cenouras são lavadas com água esterilizada, cortadas em pecas de 5 mm e colocadas pelo lado da base em água e agar. 20 a 50 «1 de bactérias são depois aplicados na superfície superior dos discos. D. Transformacão de Girassol

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas em 0D600 de 0,2 a 0,4, são usadas para inoculação dos caules das plantas de girassol preparadas da seguinte forma!

Sementes de girassol são embebidas durante 10 minutos em 10 % de captano seguido por 10 minutos em 10 % de clorox e lavagem com água esterilizada. Qs revestimentos das sementes são removidos e as sementes são germinadas em 0,7 % de água em agar no escuro durante três dias, após os quais eles são colocados num incubador de linha de laboratório a 23°C com um dia de 12 horas e noite. As sementes cresceram durante uma semana antes de serem cortadas e inoculação da bactéria na superfície do caule cortada. •54 Ε. Transformação de Tomate

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas a um OD60Q de 0,2 a 0,4, são depois usadas para inoculação de pés de sementes de tomate preparados da forma seguinte:

Sementes de tomate são embebidos durante 20 minutos em 10 % de clorox e lavados com água esterilizada. As sementes são germinadas em 0,7 % de água em agar no escuro durante três dias, depois dos quais são colocados num inoculador de linha de laboratório a 23°C com 12 horas de dia e noite. As sementes cresceram durante uma semana antes da colheita e da inoculação das bactérias na superfície do pé cortada. F. Transformação de algodão

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas a 0DS00 de 0,2 a 0,4, sSo depois usadas para inoculação dos cotiledóneos de algodão preparados da forma seguintes:

As sementes de algodão são embebidas durante 20 minutos em 10 % de clorox e lavados com água esterilizada. As sementes são germinadas em 0,7 % de água em agar no escuro. As sementes cresceram durante uma semana antes das bactérias serem introduzidas na supe r f í c i e do cot .i 1 edóneo . G. Preparação de um Tipo especial de Callus de zea mays, da Produção Elite......da.......linha Infectada 2717

Plantas de Zea rnays da linha de produção Infectada 2717

cresceram até floração numa estufa, e auto—po1inizaram—se. Espigas imaturas contendo embriSes de aproximadament-e 2 a 2,5 mm em comprimento são removidas das plantas e esteri 1 izadas ern solução de 10 % de Clorox durante 20 minutos. Us embrifíes foram asepticamente removidos dos núcleos e foram colocados em pratos com o eixo do embrião na direccão do meio GMb que contém 0,1 mg/12,4~D, 6 % (p/v) de sacarose e L-proline 25 mM solidificada C* com 0,24 % Cp/vl de Qerrite ímeio inicial). Depois de cultura durante duas semanas no escuro a 27°C, o desenvolvimento de callus no escutélio é removido do embrião e colocado num prato em meio BB, <Gamborg et al, 1968), que contém 0,5 mg/1 2,4—d e solidificou com 0,24 % <p/v> de Gelriie . 0 callus é subcultivado em todas duas semanas em meio fresco. Depois de um total de oito semanas depois da colocacão dos embrifles no meio inicial, o tipo especial de callus é identificado por morfologia característica. Este callus é subcultivado ainda no mesmo meio. Depois de um outro período de dois meses, o callus é transferido para, e subcultivado esterí1iamente em, meio NG que contém 2 mg/1 2,4-D e so 1 i f i c ou c om Ge 1 r i te^'. H. Preparação de uma Cultura de Suspensão de Zea mays, da produção Elite Infectada 2717 <: 130 num agi tador c i rcular 0 callus descrito em G é subcultivado durante um total de pelo menos seis semanas. 0 t-ipo de callus escolhido para a subcultura é relativamente não muc.i laginouso, granular e muito friável, de modo que é separado em pequenos agregados de. células individuais colocados no meio liquido. Culturas contendo agregados com células grandes, expandidas não são retidas. Aproxirnada-mente aliquôias de 500 mg de callus especial de Zea mays da produção elite infectada 2717 são colocados em 30 ml de mei’-· N6 que contém 2 mg/1 2,4-D em frascos de 125 ml Delong. Depois de uma semana de cultura a 26°C no escuro

rpm, com pás de 2,5 cm), o meio è substituído com meio fresco. As suspensões são novamente sulcultivadas deste modo depois de outra semana. A esta altura, as culturas são inspeccíonadas, e aquelas em que nSo hã indicação de um grande número de células expandidas são retidas. As culturas em suspensão que contém agregados corn células grandes, expandidas são descarregadas. 0 tecido preferido consiste em agregados de células que se dividem densamente citoplasmaticamente que têm uma superfície caracteristicamente mais suave do que o tipo usual de agregados de células. As culturas retidas têm pelo menos 50 % de células representadas nesses agregados pequenos. Isto é a morfologia desejada. Estas suspensões também têm uma velocidade de crescimento rápido, com um tempo duplo menor do que uma semana. As culturas de suspensão são semanalmente subcultivadas por transferência de 0,5 ml de PCV (volume de célula em recipiente: volume da célula indicado numa pipeta) em 25 ml de meio fresco. Depois de quatro a seis semanas de subcultura desta forma, as culturas aumentam duas a três vezes por semana de subcultura. A culturas em que mais do que 75 % das células de morfologia desejada são retidas durante outra subcultura. As linhas são mantidas sempre por escolha para a subcultura do frasco cujo teores exibem a melhor morfologia. A filtração periódica através de peneiras de aco inoxidável com dimensão de poro de 550 jum todas as duas semanas έ usada em alguns casos para aumentar a dispersão das culturas, mas não é necessária. I. Preparação de Protoplasmas a partir das Culturas de Suspensão de Zea mays 1 a 1,5 ml de PCV de células de cultura em suspensão como preparadas em H são incubadas em 10 a 15 ml de uma mistura esterelizada por filtração que consiste em 4 % (p/v) de celulase RS com 1 % (p/v) de Rhozyme em solução de sais KMC <8,65 g/1 de KC 1; 16,47 g/1 de MgCl . . 6H.-.Q e 12,5 g/1 de CaC 1,H...0,* 5 g/1 de 57

Mes, pH 5,6). A digestão é realizada em 30°C num quadro de agitação lento durante um período de 3 a 4 horas. A preparação é registada sob microscópio invertido durante a libertação do protoplastos. Os protoplast-os que são libertados são recolhidos da forma seguinte! A preparação é filtrada através de uma peneira de malha de 100 ,um, seguido por uma peneira de malha de 50 .um. Os protoplastos são lavados através de peneiras com um volume de solução de sal KMC igual ao volume original da solução de enzima. 10 ml de preparação de protoplastos é colocada em cada um dos vários tubos de centrífuga plásticos disponíveis, e 1,5 a 2 ml de solução de sacarose 0,6 H (tamponizada a pH 5,6 com ácido morfo— 1inoetano—sulfónico a 0,1 % (p/v) (MES e K0H>> em camadas por debaixo. 0 tubo é centrifugado a 60 a 100 x g durante 10 minutos, e a camada de protoplastos na interface é recolhida usando uma pipeta num novo tubo. A preparação de protoplastos é ressuspenso em 10 ml de solução de sal KMC fresca, e centrifusada durante cinco minutos a 60 a 100 x g. 0 sobrenadante é removido e descarregado, e o protoplastos ressuspensos suavemente na gota restante, e depois 10 ml de uma solução KMC de poder 13/14 é gradua1-mente adicionada. Depois de centrifugação novamente durante cinco minutos, o sobrenadante é novamente removido e os protoplastos ressuspensos numa solução de KMC de poder' b/7. Uma aliquãta é tirada para contagem, e os protoplastos novamente sedimentados Por centrifugação. Os protoplastos são ressuspensos a 10 por ml em meio KM-Sp ou manitol 0,5 M que contém Mg Cl.-, 6 mM ou em outro meio adequado para ser usado na transformação. .J. Transformação de Protoplastos de Zea mays por Elec t-roporacão a. Todos os passos à excepcão do choque por aquecimento são realizados à temperatura ambiente (22 a 2S°C). Os protoplastos são ressuspensos no último passo de I em manitol 0,5 M que 58 contém 0,1 % (p/v) de HES e MgCl0 6 mM. A resistência desta suspensão é medida numa câmara de um Dialog Electroporator (DlA—LOG GmbH, D-4000 Dusseldorf 13, Germany) e ajustado a 1 a

1.2 kíi usando uma solução mgCl._, 300 mM. Os protoplastos sofrem choque por aquecimento por emersão do tubo que contém a amostra em banho de água aos 45°C durante cinco minutos, seguido por arrefecimento ã temperatura ambiente em gelo. 4 g de piasmideo linearizado que contém um gene de resistência higromicina selec-cionável da planta como descrito por Rothstein et al. <1887), ou gene quimérico constroi-se e 20 ;jg de ADN suporte de ti mus de vitela são adicionados a aliquôtas de 0,25 ml desta suspensão. 0,125 ml de uma solução ΡΕΘ a 24 % (p/v) (PM 8000) em manitol 0,5 M que contém MgCl0 30 mM são adicionados aos protoplastos. A

jL mistura é bem misturada mas gentilmente, e incubada durante 10 minutos. A amostra é transferida para uma câmara do electropora-dor e as amostras sofrem impulsos três vezes em intervalos de 10 segundos, às voltagens iniciais de 1500, 1800, 2300, ou 2800 0 c rn e um tempo de descida exponencial de 1 ,useg. 0s protoplastos foram cultivados da seguinte forma. As amostras são colocadas em pratos de pret-i de 6 cm á temperatura ambiente. Depois de 5 a 15 minutos, 3 ml de meio KM-8p que contém 1.2 % (p/v) de agarose SeaPIaque e 1 ml/1 2,4-D são adicionados. A agarose e os protoplastos são misturados e o meio é deixado gelificar. b. a é repetido com um ou mais das modificaçSes seguin- te: resistênc ia 0,7 ΚΩ. do protoplastos é (1) A a j us tado a 0,5 a da preparação de 40000. (2) 0 PE6 usado é PEG com um peso molecular 53 (3) No PEG é adieinado, ou metade do volume de PEG a 12 % (p/v} é adicionado. (4) Os impulsos são aplicados em intervalos de três segundos. 051 Os protoplastos são colocados em pratos depois de electroporacSo colocados numa placa arrefecida a uma temperatura de 16°C.

(61 Os protoplastos são colocados em tubos depois de passo de electroporacSo, lavados com 10 ml de solução de KMC de poder 6/7 ou com solução W5 (que compreende 3S0 mg/l de KC1; 13,375 g/1 de CaC 1. 2H.-.01 3 g/l de NaCl; 9 g/1 de glucose, pH oi ai 6,0}, depois recolhidos por centrifugação a 60 x g durante 10 minutos, ressuspensos em 0,3 ml de meio KM, e colocados em pratos c omo em a. (7> 0 DNA suporte de timus de vitela não é adicionado.

K. Transformação de Protoplastos de Zae ma.ys por Tratamento com PEG a. Os protoplastos são ressuspensos no último passo de em solução de manitol 0,5 M gue contém MgCl^, lk a 30 mM. 0m loque por aquecimento de 45°C durante cinco minutos é dado como escrito em J. Os protoplastos são distribuídos em aliquôtas para ansformação em tubos de centrífuga, 0,3 ml de protoplastos jspensos por tubo. Durante os próximos 10 minutos o seguinte foi íicionado! DNA (como para J) e Solução PEG (PM 6000, 4 '/> (.p/vl, Je contém Ca (no.-,}.-, 0,1 M e manitol 0,4 M; pH 3 a 9 com K0H} para ’iginar uma concentração final de 20 % de PEG. As aliqudtas sSo ηcubadas durante 30 minutos com agitação suave ocasional, 60 depois os protoplastos são colocados em pratos de preti <0,3 ml da suspensão de prot-oplastos original por prato com 6 cm de diâmetro) e cultivados como descrito em ·J. b. a ê repetido e os protoplastos são lavados depois de 30 minutos de incubação numa solução de PEG de a por adição de 0,3 ml de solução W5 cinco vezes em intervalos de dois o três minutos. A suspensão de protoplasto é centrifugada, o sobrenadan-te é removido, e os prtoplastos são cultivados como no Exemplo J. a. c. a e b são repetidos com a modificação de que a concentração final de PEG está entre 13 e 25 % (p/v). L. Regeneração de Callus a partir de Protoplastos

Os pratos que contêm os protoplastos em agarose são colocados no escuro a 26°C. Depois de 14 dias, colónias crescem dos protoplastos. A agarose que contém as colónias é transferida para a superfície de um prato de preti com '3 cm de diâmetro que contém 30 ml de meio NS que contém 2 mg/1 2,4-D, solidificou com 0,24 X (p/v) de Gerlite . Este meio é referido como 2 Nb. 0 callus é cultivado no escuro aos 26°C e as peças do callus subcultivado todas as duas semanas em meio 2N& sólido fresco. M. Selecção de Callus Transformado de Zea mays L é repetido com a modificação de que 100 mg/1 ou 200 mg/1 de higromicina E· é adicionado ao mexo 2NS de modo a selec — cionar as células transformadas. 61 Ν. Regeneração de Plantas de milho a. Callus é colocado num meio 1N6 para manutenção e num meio ONS (que compreende o meio NS com falta de 2, 4-D) e meio Nol (que compreende meio NS que contém 0,26 mg/1 2,4-D e 10 rnl/1 de kinetina) para iniciar a regeneração. 0 crescimento de callus em meio ONS e N6.1 é feito à lus (16 horas/dia de lus de 840 a 8400 Ixde lâmpadas fluorescente brancas). 0 callus que cresce em meio N61 é transferido para o meio 0N6 depois de duas semanas, este tempo prolongado em meio N61 é fundamental. 0 callus e sul cultivado todas as duas semanas mesmo se o callus deva ser transrerido novamente para a mesma formulação do meio. Rebentos aparecem após cerca de quatro a oito semanas. Uma vez que os rebentos têm pelo menos 2 cm de altura, eles são transferidos para meio UN6 em recipientes GA7 . As raízes formaram-se em duas a quatro semanas, s quando as raízes parecerem suficientemente bem formadas para suportarem o crescimento, os rebentos são transferidos para o solo em potes de turfa, sob uma sombra de luz para os primeiros quatro a sete dias. é normalmente útil inverter um copo de plástico transparente sobre os transplantes durante dois a três dias para asistirem ao seu endurecimento. Uma vez que as plantas estão estabelecidas, elas são tratadas como plantas normais de milho e crecem para amadurecerem na estufa. De modo a obter plantas progénies elas são auto-polinizadas ou cruzadas com o tipo bravo. b. a é repetido com a modificação de que 100 mg/1 *"‘U i..0o mg/1 de higromicina 8 é adicionado ao meio usado para manter o callus.

0. Preparação de Suspensão de Embriogénico de Tecidos de Dactylis g 3. orne rata L. (pomar de erva) a. Callus embriogéniro é iniciado a Partir de secções da base de folhas ma is novas de plantas poisar de erva como descrito por Hanning and Conger <1982). As folhas são estereliza-das na superfície por emersão numa diluição de 1:10 de solução Clorox <5,2-5 % <p/v> de hipocloreto de sódioJ The Clorox Company, OacKland, Ca) durante cerca de 10 minutos e depois cortadas asept-ivcamente em pequenos segmentos de 1 a 5 mm de comprimento ou em diâmetro. Estes segmentos são colocados em pratos num meio SH-30 esterelizado que contém 0,8 % <p/v) de agarose como um agente de gelação. Estruturas de callus e/ou embriogénico aparecem em 2 a 6 semanas depois da plantação, depois cultura a cerca de 2-5°C. Callus embriogénico é mantido por subcultura em meio SH-30 fresco todas as 2 a 4 semanas e cultura no escuro aos 25°C. b. Culturas de suspensão embriogénicas são iniciadas por colocação em pratos de aproximadamente 0,5 g de peso fresco de callus embriogénico em 50 ml de meio liquido descrito por Cray and Conger <1985) que contém di camba 45 ,<jM e 4 g/1 de hidrol isa— to de caseina. As culturas de suspensão cresceram aos 27°C sob 16 horas de luz <3300 ix), 8 horas de fotoperíodo de escuro num agitador giratório a cerca de 130 rpm em frascos de 12-5 ml Delong

R com uma tampa metálica e parafilm' Depois de aproximadamente quatro semanas os grupos de arbustos são deixados assentar durante cerca de 30 segundos s aliquôtas de 10 ml do meio sobrenadante que contém grupos de células pequenas são removidos e transferidos para 50 ml de meio fresco. Este processo é repetido todas as 3 a 4 semanas usando as culturas com mais sucesso como julgadas pela dimensão dos grupos de arbustos mais pequenos e a melhor qualidade na base da presença de células citoplasmi-cas, pequenas. Depois de 5 a 8 transferências as suspensões são

de células não embriogénicas e a maioria embriogênicas são bem pequenas (150 a 2000 essenc ia1mente livres dos grupos de células ;.ím ) . P. Isolamento e Purificação de Protoplastos D. glome-rata L.

Os protoplastos são preparados a partir de culturas de suspensão embriogénica de O por filtração aseptica das células numa unidade de filtração NalgeneR 0,2 ;jm e depois adição de 0,5 g de peso fresco de células a cada 12,5 ml Cp/v) de Cellulase RS, CaCl.-,. K-,0 7mM, NaH.-,ΡΟ, . H.,,0 0,7 mM, MES 3 mM (pH 5,6), glucose jCm jL j£m *T Am (550 mOs/Kg de H._,0 de pH 5,6), e é es terei izado por filtração. A mistura é rodopiada num agitador orbital a cerca de 50 rpm em luz ofusca (< 400 Ix) durante 4 a 5 horas. A digestão é depois peneirada através de uma peneira de aço inoxidável (dimensão de malha 100 ;.irn) e distribuída em tubos centrífuga de 12 ml que são centrifugados a cerca de 60 a 100 x g durante cerca de 5 minutos. 0 sedimento que contém o protoplasto ê depois lavado três vezes com meio de cultura de protoplasto KM-Sp ajustado a 550 mOs/kg de H.-.0 com glucose. A esta altura o passo de f lotação pode ser incluído para outra purificação dos protoplastos. Neste caso, os protoplastos lavados são encarnados em 10 ml de meio de cultura KM-Sp ajustado a 700 mOs/kg de H._0 com sacarose. Depois de centrifugação a 60 a 100 x g durante 10 minutos, os protoplastos na interface são recolhidos usando uma pipeta fina. Finalmente, os protoplastos são resuspensos em 1 a 2 ml de meio de cultura KM-8p e peneirado através de um placa de malha de aço inoxidável (dimensão de malha de 20 jum). Os protoplastos libertados são recuperados e lavados e ressuspensos em meio KM-Sp para cultura ou num meio ajustado osmoticamente para a transformação.

Q. Cultura de Protoplastos de D. gln^prata L. e crescimento de Callus a. Os protoplastos purificados são colocados em pratos a uma densidade de cerca de 5 x 10“' protoplastos por ml num meio

R de cultura KH-8p que contém 1,3 % (p/v) de agarose 8ea.Pla.que (FMC Corp.,· Marine Colloids Diuvion, Rockland, Maine» UtíA) e 30 a 4-0 % (p/v) de meio condicionado (obtido de culturas de suspensão de D. glomerata L. erabriogénico de 3 a 4 semanas de idade por filtração do meio através de filtro Na 1 gene esterilizado 02 uni; tornado o meio a 550 mOs/kg de H._,0 por adição de glucose, e jL. novamente esterelização) . Os pratos são depois colocados no escuro a uma temperatura constante de 28°C. Depois de 10 a 14 dias a agarose é cortada em cunha e colocada em "cultura de contas" como descrito por Shillito et al., (1983) usando 20 ml meio de cultura de suspensão SH-45 com 3 % (p/v) de sacarose por 3 ml de cultura embebida de agarose original. Os pratos são colocados num agitador de plataforma e agitada a cerca de 50 rpm à luz a 670 lx. Novas culturas de suspensão são formadas è. medida que as colónias crescem de agarose e libertação des células no meio liquido. As células cultivadas de suspensão resultantes são colocadas em pratos em meio SH-30 solidificado e de agar e colocados oa escuro a 25°C até que o callus seja formado. b. Os protoplastos são cultivados como descrito acima a excepcão do meio de cultura conter nenhum meio condicionado. R. Transformação de Protoplastos de D. glomerata por meio de Elect-roporacão a. Imediatamente depois de purificação dos prot-oplasa-tos, a electroporaçSo é realizada de acordo com bhilito et· al . (1985) usando plasmideo linearizado. Us protoplastos são 65 ressuspensos depois da última lavagem a uma densidade de cerca de 7 x iofe protoplastos por ml no tampão de elec troporacSo tmanitol 0,4 M, MgCl^ 6 mM>. Os protoplastos são colocados em aliquôtas de -i!

0,7 ml em IO ml de tubos centrífuga plásticos. 0 DNA do plasrnídeo e DNA de timus de vitela sonifiçado (sigma) para originar concentrações finais de 10 jjg/ml e 50 ,'jg/ml respectivamente é adicionado aos tubos. Depois 0,38 ml de solução PEG C24 X (p/v) de PEG 6000 em manitol 0,4 M,- MgC 130 mM, 0,1 % (p/v) de MES (pH jL. 5,6)1 é adicionado e a solução é suavemente misturada. A suspensão de protoplasto é transferida para uma câmara de Electropara— dor DialogR e 10 impulsos de voltagem inicial de 3250 V/cm e uma descida constante exponencial de 10 yseg é aplicada em intervalos de 30 segundos. A amostra é removida da câmara, e colocada num prato de preti de 10 cm de diâmetro. 10 ml de meio KM—8p que C? contém 1,2 % Cp/v) de agarose SeaPIaque1' é adicionado, os protoplastos distribuídos totalmente pelo meio, e a agarose foi de i xada ge1i f ic a r. b. a é repetido á excepcão de que a voltagem inicial usada é 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm, ou 2500 V/cm. c. a e b é repetido á excepcão de que PEG de PM 4000 ou PEG de PM 8000 é usado. d, a a c são repetidos â excepcão de que a concentração final de PEG está entre 10 % e 30 % (p/v) .

S. Transformação de Protoplastos D, g 1 ornev*5Pl-,r Tratamento com PEG ADN usado a. A transferência do gene direto mediado de PPG realizada de acordo com Negrutiu et al. ¢1387). o P1asm í deo 1i nea r i zado. Uí protoplastos sao suspensos seguindo a última lavagem em manitol 0,5 M que contém MgCl.., 15 mM a uma densidade de cerca de ^ x lo por ml. A suspensão de protoplastos é distri-buída como aliquôtas de 1 ml em tubos centrífugas de 10 ml. 0 DNA é adicionado como descrito em R acima, e depois 0,5 ml de solução PEG adicionada <40 % (p/v> de PEG em manitol 0,4 mM, CaCNO,,)^ 0,1 M, pH 7,0). As soluçfíes são misturadas suavemente e incubadas durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 24°C) durante cerca de 30 minutos com agitação ocasional. 1,4 ml de solução de lavagem é depois adicionada e os teores do tubo suavemente misturados. A solução de lavagem consiste em manitol 87 mM, CaCl2 115 mM, MgCl... 27 mM, KCL 33 mM, Tris-HCl 7mM e 1,7 g/1 de mio-inositol, pH 9,0. Quatro outras aliquôtas de 1,4 ml de solução de lavagem são adicionadas em intervalos de 4 minutos, com mistura depois de cada adição. 0 tubo é depois centrifugado a cerca de 50 x g durante cerca de 10 minutos, e o sobrenadnate é descarregado. Gs protoplastos sedimentados são tirados para 1 ml de meio de cultura KM-8p, e colocados em pratos de preti de 10 cm. 10 ml de meio KM-8p que contém 1,2 % <p/v) de agarose SeaPlaque^' é adicionado. Os protoplastos são eventualraente distribuídos por todo o meio, e a agarose deixada gelificar. b. a é repetido com uma ou mais das modificaçfles segui ntes: (1) 0 pH da solução de lavegem é ajustado a 5,b ou 7,0. (2) 0 PEG usado é PEG de PM 6000, PEG de PM 2000 ou PEG de PM 8000. (3) 0 meio de lavagem consiste de NaC 1 154 mM, CaC 1 125 mM, KC 1 5 rnM, glucose 5 mM, pH a 6,0 com K0H, de CaCl_ 0,2 M, jCm 67 0,1 % <p/v> de MES, rH 6,0 com KOH, ou de Ca.Cl0 0,2 M, Tris/HCl 7 jL. mM, pH 9,0 com KOH.

T. Transformação de Pr o topl as tos D. G1 orne rata por Electroporacâo ou por Tratamento com PEG A transformação é realizada como descrito em R e b, à excepcão de que os prot-oplastos são tratados a 4S°C durante cerca de 5 minutos antes de diluição das aliquôtas nos tubos para a transformação ou depois de distribuição das aliquôtas, e antes diluição do PE6. U. Seleccão de Colónias Transformadas a. Os pratos .d® cultura (pratos de pret-il que contêm os protoplastos de R a T são incubados durante 10 dias no escuro a cerca de 25°C e depois cortados em 5 tiras iguais para "culturas de contas" (Shilito et al., 1983). Quatro das tiras são colocadas em cada 20 ml de meio de cultura SH—45 com 4 g/1 de hidrolisato de caseína e 20 ;jg/ml de higromicina B. A quinta tira é colocada em 20 ml do mesmo meio mas sem higromicina B como um controle não seleccionado. Depois de 4 a S semanas de crescimento as colónias ie células derivadas do protoplasto transformado putativo em -igromicina B são cortadas de agarose e colocadas num prato de aret-i de 19 mm com 2 ml de meio SH-4S líquido que contém 20 ul/rnl de higromicina B, que é agitada a cerca de 50 rpm num agitador urbital. Depois de outras 4a 5 semanas todas as colónias que crescem para formarem novas suspensões são transferidas em frascos Erlenmeyer de 125 ml e crescem de uma maneira similar á cultura de suspensão aprente, à excepcão de que 20 ;.ig/ml de higromicina b é incluida no mexo. 1 a

As novas suspensões são subcultivadas todas a semanas usando meie? SH-45 que contém 4 g/1 de hidrolisatu ue caseína e 20 /jg/ml de higromicina B. Células destas suspens8es são também colocados em pratos de meio SH-30 solidificado que contém 20 jjg/ml de higromicina B e incubados a cerca de 25°C no escuro. Crescimento de cal li a partir das células dos pratos são subcultivadas todas as duas semanas em meio fresco. As células que crescem na presença de higromicina B são presumidas como tendo sofrido transformação. b. A selecção é realizada como descrito em a â excepção de que o crescimento das colónias derivadas de protoplasto em higromicina B que contém meio são colocadas em pratos de agar de meio SH-30 que contém 20 jjg/ml de higromicina E* e incubado a cerca de 25°C no escuro. V. Regeneração de Plantas D. glomerata Transformadas a. Callus de D. glomerata (obtido como descrito em U) derivado dos protoplastos cresceu em meio SH-30 solidificado, e subcultivado todas as duas semanas. Qualquer embrião que se forma é removidos e colocado em pratos no meio de germinação (SH~0> e colocado na luz (3300 a 4600 Ix). A germinbação destes embriões ocorre em 1 a 4 semanas e os rebentos resultantes são colocados em meio SH-0 via luz para a formação do sistema de raízes. Eles são movidos para a estufa no estágio de seis a doze folhas, e endurecimento gradual. h. Callus (obtido como descrito em U) derivado de protoplastos cresceu em meio SH-0 solidificado com 0,24 % (p/v) de Ge.l r.i te ã luz (3300 a 4600 lx), e subcul tura todas as duas semanas. Os rebentos resultantes são colocados numa mistura 1:1 de t-H—0 e meio OMS solidificado com a combinação de 0,1.2 % (ρ/ν)

- 63 - à luz para a formação de para a. estufa no estágio de de gelriteR e 0,4 % (p/v) de agar sistema de raizes. Eles são movidos seis a doze folhas, e endurecimento gradual. c. Rebentos pequenos são obrtidos como descrito acima, e são colocados em meio OMS solidificado com 0,8 % (p/v) m de agar à luz para a. formação de sistema de raízes. Eles são movidos para a estufa no estágio de seis a doze folhas, e endurecimento gradual. d. Rebentos pequenos são obtidos como descrito eit C X fi*í«s 0 são colocados numa mistura 1:1 de SH-Q e de meio OMS solidificado com uma. combinação de 0,12 % (p/v) de Ge 1 r i te' e 0,4 % (p/v) de agar â luz para a formação de sistema de raízes. Eles são movidos para a estufa no estágio de seis a doze folhas, e endurecimento g radua1.

Exessplo 9: Desenvolvimento de Linhas de Sesmentes T3 transgénicas que contém todos os três genes

Designações do genot-ipo para plantas t-ransgénicas são usadas aqui de acordo com a. seguinte convenção: a. planta inicial que resulta do evento de transformacão e tendo crescido a partir da cultura, de tecido é designado por planta TI . Plantas resultan- tes de auto-polini zacão d 'e flores naturais da planta Tl, são designadas por T2, tendo adiquirido um novo genotipo durante O processo me .i ó t i c o normal Igualmente, sementes nascidas de auto—polinização de flores naturais das plantas T2 (i.e. crescimento a partir de semente T2) são designadas por T3, etc.

Plantas transgénicas CT1) cresceram até maturação. Flores são deixadas auto-polinizarem-se e a vagem das sementes 70 são recolhidas após dissecação normal. Sementes de cada planta individual são recolhidas e armezenadas separadamente. Cada lote de sementes é testado para análise de segregação genética para a determinação do número Mendelian loci que suporta a caracterist-i — ca da resistência de kanamicina. As sementes T2 são esterelizadas na superfície por lavagem múltipla em 2 % de hipoclorit-o que contém 0,02 $ (v/v) de Tween—20, seguido por lavagens em água esteri1izada. Aproximadamente 150 dessas sementes são colocadas num papel de filtro saturado com sais MS 0,2 X CMurashige and Skoog, 1962) que contém 150 jug/ml de kanamicina. Seguindo germinação e espansão dos cotíledóneos a aproximadamente 5 mm, a raz£o de cotilodóneos verde normal (kan-r) versus cotilodóneos branqui ados (kan-s) é determinada. Unicamente aqueles lotes de sementes 12 que exibem uma razão de aproximadamente 3;1 (kan-r!kan-s) são guardadas para outra análise; esta razão de segregação é indicativa para um único Mendelian locus que suporta o gene marcador.

Quatro das dez plantas cresceram até maturação de cada lote de sementes T2 (usando as mesmas condiçfíes descritas acima), e são deixadas auto—polinizarem—se. A colecção de semnetes T3, a esterelizacão de sementes, e a germinação de sementes são como descrito acima para a semente T2. Os lotes de sementes T3 em que iOO X- de sementes testadas (n = 150) exibem um fenotipo Kan-r são asumidas como sendo homogéneas para a caracterização (i.e. resultante de uma planta aparente T2 homogénea) e são deixadas para. a análise do fenotipo. depois usadas Técnicas de criação convencionais são para obter todos os três genes na mesma planta.

Enquanto o presente invento estava a ser descrito com referências aos seus modos de realização específicos, foi de moaos de var iações, âmbito do apreciar que numerosas variações, modificaçQes, e realização são possíveis, e de acordo, todas essas modificações sã.o olhadas como estando no espírito e no presente invento.

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Lista de Sequências; SEQ ID NO:1 TIPO DE SEQUÊNCIA: Peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 22 Amino-áeidos

Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe fíly Lys Ala 5 1.0 15

Phe Vai Gly Ile Met Asn Ser 20 SEQ ID NO;2 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA,' 75 pares de bases GAATTCGGGA TCGGCAAGTT CCTGCACAGC GCCAAGAAGT TCGGGAAGGC 50 CTTCGTGGGC ATCATGAACA GCTAA 75 SEQ ID N0:3 TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 75 pares de bases GAATTCTTAG CTGTTCATGA T6CCCACSCC GGCCTTCCCG AACTTCTTG6 50 CGCTGTGCAG GAACTTGCCG ATCCC 75 SEQ ID N0!4 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 38 pares de bases TATCCCACTC TTGCCGTGCC GGGCTCGGCA AGTTCCT6 SEQ ID NO: 5 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídeo 77 COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 38 pares de bases CAGGAACTTG' CCGATCCCGG' CACGGCAAGA GTGQGATA 38

SEQ ID NCOS TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 30 pares de bases GATCGAATTC ATTCAAGATA CAACATTTCT 30 jEcoRI j PR-la j SEQ ID NO;7 TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 27 pares de bases 6AATTCTTAG CTGTTCATGA TGCCCAC 27 SEQ ID N0;8 TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 38 pares de bases TATCCCACTC TTGCCGTGCC GGGATCG6CA AGTTCCTG 38 ATAGGGTGAG AACGGCACGG CCCTAGCCGT T CAAGGAC 38 J PR-la j j pept-ídeo li tico 3 j SEQ ID NO; 9 TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo com a protéina correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 1358 pares de bases CCATCAAA TGG CTG CTA TCA CAC TCC TAG GAT TAC TAC TTG TTG 43

Met Ala Ala Ile Thr Leu Leu Gly Leu Leu Leu Vai “70 / CCA GCA GCA TTG ACA TAG CAG GGG CTC AAT CGA TAG GTG TTT 85 Ala Ser Se r Ile Asp Ile Ala Gly Ala Gin ΟίΞ1 V Ile Gly Vai GCT ATG GAA TGC TAG GCA ACA ACT TGC CAA ATC ATT GGG AAG 127 Cys Tyr G1 y Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Asn His T rp Glu TTA TAC AGC TCT ACA AGT CAA GAA ACA TAG GAA GAC TGA GGC 169 Vai Ile Gin Leu Ty ι- Lys Ser Ar g Asn Ile Gly Arg Leu Arg TTT ATG ATC CAA ΑΤΟ ATG GAG CTT TAC AAG CAT TAA AAG GCT 211 Leu Tyr Asp Pro Asn His Gly Ala Leu Gin Ala Leu Lys Gly CAA ATA TTG AAG TTA TGT TAG GAC TTC CCA ATT CAG ATG TGA 253 Se r Asn Ile Glu Vai Met- Leu Gly Leu Pro Asn Ser Asp Vai AGC ACA TTG CTT CCG GAA TGG AAC ATG CAA GAT GGT GGG TAC 295 Lys His 1.1 e Ala Ser Gly Met Glu His Ala Arg T rp T rp Vai AGA AAA ATG TTA AAG ATT TCT GGC CAG ATG TTA AGA TTA AGT 337 Gin Lys Asn Vai Lys Asp Phe T rp Pro Asp Vai Lys Ile Lys ATA TTG CTG TTG GGA ATG AAA TGA GCC CTG TCA CTG GCA CAT 379 Tyr Ile Ala Vai Gly Asn Glu 11 e !~i@ }* Pro Vai Thr Gly Thr CTT ACC TAA CCT CAT TTC TTA CTC CTG CTA TGG TAA ATA TTT 42.1. S'e r Tyr Leu Thr Ser Phe Leu Thr Pro Ala Met Vai Asn I le ACA AAG CAA TTG GTG' AAG CTG GTT TGG GAA ACA ACA TCA AGG 463 Ty ι- Lys Ala Ile GI y Glu Gly Ala Leu Gly Asn Asn Ile Lys ΤΟ T CAA CTT CTG TAG ACA TGA CCT TGA TTG GAA ACT CTT ATC 505 Vai Ser The Se r Vai Asp Met Thr Leu Ile Gly Asn Ser Tyr 547 79 547 79 CAC CAT CAC AGG GTT CGT TTA GGA ACG ATG CTA GGT GGT TTA Pr ο Pr o Ser Gin Gly Se r Phe Arg Asn Asp Ala Arg T rp Phe CTG ATC CAA TTG TTG 6GT TCT TAA GGG ACA CAC GTG CAC CTT Thr Asp Pro Ile Vai G1 y Pf"?0 Leu Arg Asp Thr Arg Ala Pro TAC TCG TTA ACA TTT ACC CCT ATT TC A GCT ATT CTG GTA ATC Leu Leu Vai Asn Ile Tyr Pro Tyr Phe Se r tyr Se r Gly Asn CAG GGC AGA TTT CTC TCC CCT ATT CTC TTT TTA CAG CAC CAA P v o Gly Gin 1.1 e S'0 r Leu Pro Tyr Ser Leu Phe Thr Ala Pro ATG TGG TAG TAC AAG ATG GTT CAC GCC AAT ATA GGA ACT TAT Asn Vai Vai Vai G1 n Asp Gly Ser Arg Gin Tyr Arg Asn Leu TTG ATG CAA TGC·' TGG ATT CTG TGT ATG CTG CCC TCG ACG GAT Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Vai Tyr Ala Ala Leu Glu Arg CAG GAG GGG CAT CTG TAG GGA TTG TTG TGT CCG AGA GTG GCT Se r Gly Gly Λ1 πια Sí5 V1 Vai Gly Ile Vai Vai SER Glu Ser Gly GGC·' CAT CTG CTG GTG CAT TTG GAG CCA CAT ATG ACA ATG CAG T rp Pro Ser Ala Gly Ala Phe Gly Ala Thr Tyr Asp Asn Ala CAA CTT ACT TGA GGA ACT TAA TTC AAC ACG CTA AAG AGG GTA Ala Thr Tyr Leu A r g Asn Leu Ile Gin His Ala L y s Gly Gly GCC CAA GAA AGC CTG GAC CTA TTG AGA CCT ATA TAT TTG CCA Ser Pro Ara Lys Pro Gly Pro Ile Glu Thr Tyr lie Phe Ais ΤΘΤ TTG ATG AGA ACA ACA AGA ACC CTG AAC TGG AGA AAC ATT Met Phe Asp Glu Asn Asn Lys Asn Pro Glu Leu Glu Lys His 589 631 673 715 757 799 841 925 967

TTG GAT TGT TTT CCC CCA ACA AGC AGC CCA AAT ATA ATA TCA Phe Gly Leu Phe S:er Pr o Asn Lys Gin Pr o Lys Tyr Asn Ile ACT TTG GGG TCT CTG GTG GAG TTT GGG ACA GTT CAG TTG AAA Asn Phe Gly Vai Ser Gly Gly Vai T rp Asp Ser Ser Vai Glu CTA ATG CTA CTG CTT CTC TCG TAA GTG AGA TGT GAGCTGATGAG Th r Asn Ala Th r Ala Ser Leu Vai Se r Glu Met TACGTATTCC TTGGATGGAA TTATGCAAGA TACTAAA7AA TGTTCACCAG TGACGATGCA GTGATATTGG TAA7TTGGCA GCATCATTAA TTATACATCA AACCTA6TAA 1145 CATTGCATGT 1155 ACTCTGÁGTG 1245 AGAAACTTTC 1235 GTTCCATGTT 1345 1358

ACACTTGAAA TCTCTTTACA AAACAAGAGA AATTTTTTCT CTCTGTAAGT CCTCATGGAT GTTTTAAATT CCTTTTCTTT TGTAAGTTTG TGAATTTCAT TGATCAAAAA AAA SEQ ID N0!10 TIPO DE SEQUÊNCIA ; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 8 bases

CATCTGAATT CTCCCAACAA GTCTTCCC SEQ ID NO:ll TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 42 bases

AACACCTATC GATTGAGCCC CTGCTATGTC AATGCTGGTG GC SEQ J.D ΝΟ,‘12 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA : 81 pares de bases 50

GGATCCGTTT GCATTTCACC AGTTTACTAC TACATTAAAA T6AGGCTTTG

TAAATTCACA GCTCTCTCTT CTCTACTATT T SEQ ID NO : 15' TIPO DE SEQUÊNCIA! Nuc leotí. deo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 14 pares de bases

GATCCGGAAT TCCG SEQ ID NO,’14 TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleotídeo COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA; .1.7 bases

ACGAGGC

GAACTCCAGG

Claims (24)

1. - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Composição anti-patogénica para o controlo de patogénios de plantas, caracterizada por compreender um ingrediente activo juntamente com um ou mais veículos aceitáveis na agricultura; em que o ingrediente activo compreende m a) um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com: b) ujna ou mais chitinases; e/ou c) uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz. ♦
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o peptídeo lítico ser qualquer peptídeo natural ou sintético ou qualquer seu derivado funcional que é capaz de actividade anti-patogenicamente eficaz devido à sua capacidade de penetrar, lisar ou de outro modo deteriorar a membrana celular dos patogénios.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o peptídeo lítico ser seleccionado a partir do grupo que consiste em defen-sinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, ma-gaininas, atacinas, dipteris, sapecinas, cacrutinas, xenopsinas, ou seus híbridos.
4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a P-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a p-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
8. 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c e a P-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c e a p-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c e a 3-1,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
11. 11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c e a P-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um dos peptídeos líticos ser peptídeo sintético n°. 3.
13. 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por os peptídeos líticos estarem presentes numa concentração desde cerca de 1 a cerca de 200 ppm.
14. 14. Método de controlo de patogénios de plantas, caracterizado por compreender a aplicação ao patogénio ou ao seu local de uma quantidade anti-patogenicamente eficaz de uma composição que compreende um ingrediente activo juntamente com um ou mais veículos aceitáveis na agricultura; em que o ingrediente activo compreende a) um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com: b) uma ou mais chitinases; e/ou c) uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergistica- mente eficaz.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo lítico ser utilizado em combinação com uma ou mais chitinases activadas; e uma ou mais p-l,3-glucanases activadas, que estão já presentes na planta a ser protegida, utilizando um estímulo indutor externo.
16. 16. Método de controlo de patogénios de plantas por meio de expressão numa planta transgénica um ou mais peptídeos líticos juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz, caracterizado por compreender: a) preparação de uma planta transgénica que compreende sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima; uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais β-1,3-glucanases; e b) fazer com que a planta transgénica sintetize os compostos mencionados no passo (a).
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a(s) chitinases(s) e/ou a(s) P-l,3-glucanase(s) fazerem parte de um sistema de expressão induzível compreendendo um gene induzível e um regulador de indução e por a expressão de pelo menos um peptídeo lítico ser seguida pelo tratamento com um regulador de indução que induz a acumulação de pelo menos uma chitinase natural ou estranha e/ou uma P-l,3-glucanase natural ou estranha.
18. 18. Uma planta transgénica, caracterizada por compreender sequências de DNA recombinante que codificam a) um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com: b) uma ou mais chitinases; e/ou c) uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz.
19. 19. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o peptídeo lítico ser qualquer peptídeo natural ou sintético ou qualquer seu derivado funcional que é capaz de actividade anti-patogenicamente eficaz devido à sua capacidade de penetrar, lisar ou de outro modo deteriorar a membrana celular dos patogénios.
20. 20. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por o peptídeo lítico ser seleccionado a partir do grupo que consiste em defensinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, magaininas, atacinas, dipteris, sapecinas, cacrutinas, xenopsinas, ou seus híbridos. V
21. 21. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada por ser uma planta de milho. <i
22. 22. Semente de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada por compreender sequências de DNA recombinante tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 18 a 20.
23. 23. Método de preparação de uma planta transgénica que é capaz de sintetizar um ou mais peptídeos líticos juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases, numa quantidade sinergisticamente eficaz; caracterizado por compreender os passos de -6-preparação por transformação e regeneração de uma planta iransgénica compreendendo sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases.
24. 24. Método de preparação de uma planta transgénica que é capaz de sintetizar um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz; caracterizado por compreender os passos de preparação por transformação e regeneração de duas ou mais plantas transgénicas compreendendo sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptídeos líticos, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais β-1,3-glucanases e cruzamento das referidas plantas utilizando técnicas de reprodução convencionais. Lisboa, 19 de Setembro de 2001

    ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA