HUT56703A - Compositions having antipathogenic activity and comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes - Google Patents
Compositions having antipathogenic activity and comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes Download PDFInfo
- Publication number
- HUT56703A HUT56703A HU91788A HU78891A HUT56703A HU T56703 A HUT56703 A HU T56703A HU 91788 A HU91788 A HU 91788A HU 78891 A HU78891 A HU 78891A HU T56703 A HUT56703 A HU T56703A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plant
- plasmid
- glucanase
- chitinase
- composition
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A jelen találmány tárgya aktív adalékanyagként litikus peptidek és hidrolitikus enzimek kombinációját alkalmazó, növényi patogének növekedését gátló • ·
- 2 készítmények. Részletesebben, a jelen találmány olyan patogén-ellenes készítményekre vonatkozik, amelyekben kismennyiségü kitinázt és/vagy £-1,4 glűkanázt alkalmaznak a litikus peptidek hatékonyságának növelésére, megkönnyítve a litikus peptid(ek) hozzáférését a patogén sejtmembránjához, A jelen találmány tárgyai továbbá litikus peptidek és hidrolitikus enzimek előállítására képes transzgenikus növények, valamint az említett növényi patogének növekedésének gátlására alkalmas eljárások.
Az ismert, hogy néhány litikus peptid aktív számos organizmussal szemben, mig másoknak kicsi a hatásuk, vagy egyáltalán nincs. Az is ismert, hogy a litikus peptidek egyik támadási pontja a membrán. Számos antimikrobiális aktivitással rendelkező litikus peptid aminosav szekvenciáját írják le a WO 89/04371 jelű szabadalmi bejelentésben, A hidrolitikus enzimekről, , úgymint a kitinázról és a £-1 ,4 glűkanázról ismert, hogy gátolják a gombák növekedését ESchlumbaum et al, , (1986); Mauch et al, (1988); Burri (1989)1, Az is jól ismert tény, hogy a kitináz és a £-1,4 glükanáz keletkezését erősen indukálja az etilénes kezelés. Továbbá, ezek az enzimek me gle hetősen könnyen tisztithatók EBoller et al. (1983)], Lehrer· és munkatársai (1986) hat antimikrobiális hatással rendelkező pepiidet (AMP) írnak le nyúl granulocitákból, . amelyek szerkezetileg homológok a humán neutrpfil defenzinakkel, A három nyúl AMP-ről (NP-1, NP-2 és NP-3a) leírják, hogy aktivak Candida albicans ellen, Lehrer és munkatársai (1986) azt is közük, hogy az NP-5, jóllehet nincs közvetlen fun-
- 3 gicid hatása Candida albicans ellen, de szinergikus hatást mutattak ki, azaz az NP-1 fungicid hatásának növekedését, ha a gombát mind az NP-5, mind az NP-1 hatásának kitették. Ogasawara és munkatársai (1973) leírták, hogy a J3-1 ,3-glükanáz és a kitináz kombinációja hatékony fungicid és baktericid hatással rendelkezik, amely jól alkalmazható a rizs kezelésében. A WO 88/00976 számú szabadalmi leírásban közük, hogy a Lepidoptera lárvák által okozott termés veszteség gátolható, ha a kitináz enzimet kódoló gént expresszálnak a károsításnak kitett termésben.
A jelen találmány egyik tárgya uj készítmények növényi patagén (előnyösen gombák, baktériumok és fonalférgek) ellen. Ezek az uj készítmények kiváló hatást mutatnak igen nagyszámú növénypatogén ellen. A jelen találmány tárgyai továbbá olyan készítmények, amelyekben a patogén membránját könnyebben lebontják a litikus peptidek.
A jelen találmány tárgyai továbbá olyan patogén-ellenes hatással rendelkező hatóanyagok, amelyekben a patogén-ellenes hatás indukálható.
A jelen találmány tárgyai továbbá olyan patogén-ellenes hatással rendelkező készítmények, amelyek a patogén-ellenes hatással rendelkező hatóanyagok említett uj kombinációját alkalmazzák.
A jelen találmány tárgyai továbbá patogén-ellenes hatással rendelkező transzgenikus növények, amelyekben az aktivitás alapja egy vagy több litikus peptid és egy • ·
4*4 vagy több hidrolitikus enzim expressziója a növényi sejtekben.
A jelen találmány tárgyai továbbá olyan transzgenikus növények, amelyek az említett litikus peptideket és Hdrolitikus enzimeket kódoló DNS-szakaszokat tartalmaznak,
A jelen találmány szerinti eljárás egyik jellemzője, hogy úgy gátolja a növényi patogének növekedését, hogy hidrolitikus enzimek hatásának teszi ki őket, amelyek lebontják a sejtfalat, és patogén membránját sokkal hozzáférhetőbbé teszik a litikus peptidek számára,
A jelen találmány másik jellemzője, hogy indukálható hidrolitikus enzimeket, előnyösen kitinázt és J3-1 ,3-glükanázt alkalmaz litikus peptidekkel kombinálva.
A jelen találmány másik jellemzője, hogy a hidrolitikus enzimek kombinációja igen sok különböző litikus pepiiddel hatékony.
A jelen találmány szerinti eljárás egyik * előnye, hogy nagyon kis mennyiségű kitináz és 13-1 ,3-glükanáz hatékony a litikus peptidek gátló hatásának lényeges megnövelésében.
A jelen találmány szerint olyan patogén-ellenes hatással rendelkező készítményeket állítunk elő, amelyek aktív adalékanyagként litikus peptidek és hidrolitikus enzimek kombinációját alkalmazzák, A litikus peptidek
megtámadják a patogén sejtmembránját. Mivel a patogén sejtmembránját a sejtfal védi, ezért a bejelentők javasolják, hogy a sejtfal-oldó enzimek használata lehetővé teszi, hogy a litikus peptidek jobban hozzáférjenek a patogén sejtmembránjához, A bejelentők feltételezik.továbbá, hogy sajtfal-oldó enzimek és sejtmembrán oldó litikus peptidek kombinációja megnöveli a litikus peptidek gátló hatását a patogénekre. A bejelentők úgy találták, hogy csak nagyon kis menynyiségü hidrolitikus enzimre van szükség ahhoz, hogy az öszszes vizsgált litikus peptid gátló hatását lényegesen megnöveljük.
Az aktiv adalékanyag szakkifejezés jelentése egy vagy több litikus peptid és egy vagy több hidrolitikus enzim kombinációja, amely kombináció a patogének növekedését gátolja, A jelen találmány szerinti aktiv adalékanyagok alkalmazhatók patogén-ellenes hatással rendelkező készítmények, formulák vagy preparátumok egyik komponenseként.
A mezőgazdaságban elfogadható hordozók szakkifejezés jelentése olyan anyagok, vagy anyagok kombinációja, amelyek ismertek a mezőgazdasági készítmények szakterületén, és ahol szükséges, tartalmazhatnak szilárd vagy folyékony adjuvánsokat, oldószereket valamint felületaktiv anyagokat és más, a mezőgazdasági készítményekben általában alkalmazott vegyületeket.
A jelen szabadalmi leírásban alkalmazva a patogén-allenes hatással rendelkező mennyiség egy hatóanyagra vagy készítményre vonatkoztatva azt a mennyiséget ja• β
- 6 lenti, amely elpusztítja, vagy növekedésében gátolja a megcélzott növényi patogént, ha felvisszük egy növényre, vagy egy transzgenikus növényben expresszáljuk.
A növényi patogén szakkifejezés jelentése gomba, baktérium, fonalféreg és rovar, A jelen találmány szerinti előnyös patogének a gombák és a baktériumok,
A litikus peptid és sejtmembrán litikus peptid szakkifejezések jelentése bármely olyan természetes vagy szintetikus peptid, vagy annak funkcionális származéka, amely képes patogén-ellenes hatás kifejtésére, mivel képes behatolni, lizálni vagy másképpen megrongálni a patogén sejtmembránját. Számos példa ismert állati, növényi, rovar és mikrobiális eredetű litikus peptidekre, amelyek a jelen találmányban használhatók, ideértve, de nem korlátozva magunkat az emlős defenzinekre, cekropinokra, tioninokra, mellitinekre , rovar defenzinekre, magaininokra, attacinokra, dipterinekre , szapecinekre, cerulinokra, xenopszinokra , vagy ezek hibridjeire. Ezeknek a litikus peptideknek az aminosav-szekvenciáját lásd például a WO 89/11291; WO 86/04356;
WO 88/05826; US 4 810 777; és WO 89/04371 számú szabadalmi leírásokban, valamint a következő publikációkban: Bohlmann és munkatársai (1988); Selsted és Hawig (1987),
A jelen találmány szerinti litikus peptidekként jól használhatók szintetikus peptidek is, amelyek lehetnek a fenti litikus peptidek egyikének funkcionális származékai, vagy azok funkcionális hibridjei. Az ilyen szinte• ·
tikus peptidekre példa a No. 3 Szintetikus Peptid, amely a magainin származéka, aminosav szekvenciája a SEO ID NO;1 (Tey et al, , 1 988).
A jelen szabadalmi leírásban alkalmazva a litikus peptidek szakkifejezés jelentésébe beletartoznak olyan anyagok is, amelyek sejtmembránokkal szemben aktivak, például a lizozimek és főszfolipázok, A fanti litikus peptidektöl eltérően a jelen találmány szerinti lizozimek képesek behatolni, lizálni, vagy más módon megrongálni a patogén sejtmembránját enzimatikus utón, A foszfolipázok a sejtmembrán foszfolipidjeit támadják,
A litikus peptidek helyett más sejtmembrán lebontó komponensek is használhatók a jelen találmány szerinti aktiv adalékanyagként. Az például a jelen találmány oltalmi körébe tartozik, hogy sejt-membrán-lebontó detergenseket, úgymint Tritont és SDS-t alkalmazzunk.
A ”hidrolitikus enzim, sejtfal hidroláz, növényi hidroláz és sejtfal hidrolitikus enzim szakkifejezések jelentése bármely olyan természetes vagy szintetikus enzim, amely képes résztvenni egy növényi patogén sejtfalának lebontásában, A hidrolitikus enzimet alkalmazhatjuk külsőleg, vagy állandóan illetve indukálhatóan expresszálva a sejtben, A jelen találmányban alkalmazható hidrolitikus enzimekre példa a kitináz és a B-1,3- gi ükanáz.
• · · • · ♦
·« · — 8 -*
A jelen szabadalmi leírásban alkalmazva a konstitutív szakkifejezés olyan hidrolitikus enzimre vagy más hatóanyagra vonatkozik, amely állandóan jelen van a növényi sejtben. Az indukálható szakkifejezés olyan hidrolitikus enzimre vagy más hatóanyagra vonatkozik, amely csak akkor van jelen a növényi sejtben, ha a növényt valamilyen stresszhatás vagy külső inger éri, és a hidrolitikus enzim vagy más hatóanyag jelenléte vagy termelése ennek következtében aktiválódik vagy megnő.
A jelen találmány szerinti peszticid készítmények célpontja a következő osztályokba tartozó növényi patogének lehetnek: baktériumok (például Pseudomonas, Xanthomonas és Erwinia); gombák, úgymint a Fungi imperfecti (például Botrytis, Septoria); Ascomycetes (például Erysiphe, Monilia); Oomycetes(például Peronospora, Plasmopara, Colletotrichum és Pythium); Basidiomycetes (például Rhizoctonia és Puccinia); valamint rovarok és fonalférgek (például Meloidogyne, Caenorhabditis, Globoa, Heterodea és Pratyx lenchus fajok). A gomba patogének közé tartozhatnak például a Botrytis cinerea; Colletotrichum lagenarium;
Erysiphe graminis, egy buza-patogén a Monilia fructicola; Peronospora tabacina; Phytophthora parasitica; Plasmopara viticola; Pythium ultimum, egy talajpatogén; Rhizocfconia solani, egy másik talajpatogén; és a Septoria nodoum egy búza-pa togén.
• · · · · • « · · • · · · ♦
-ΘΑ jelen találmány oltalmi körébe tartozó megvédendő célnövények közé a következő növényfajok tartoznak: kukorica, gabonafélék (például búza, árpa, rozs, zabok, rizs, cirok és rokon magvak), répa (például cukorrépa és takarmányrépa), csonthéjas gyümölcsök .magvas gyümölcsök és lágy gyümölcsök (például almák, körték, szilvák, barackok, mandulák, cseresznyék, szamócák, málnák és földi szedrek), hüvelyes növények (például babok, lencsék, borsók, szójababok), olajos növények (például repce, mustár, mák, olivák, napraforgók, kókuszdiók, ricinusolaj növények, kakaóbabok, földimogyorók), uborkanövények (például uborka, tök, dinnye), rostnövények (például gyapot, len, kender, juta), citrusnövények (például narancsok, citromok, grapefruit, mandarinok), zöldségek (például spenót, saláta, aszparágusz, káposzták, répák, hagymák, paradicsomok, burgonyák, papri^ka), Lauraceae (például avokádók, fahéj, kámfor), vagy olyan növények mint például a dohány, diók, kávé, cukornád, tea, szőlők, komlók, banánok és természetes guminövények, valamint a dísznövények.
A jelen találmány szerinti aktív adalékanyagban a hidrolitikus enzimek relatív koncentrációját aktivitásegységekben adjuk meg. A hidrolitikus enzim koncentrációjának standard egységét (standard koncentráció, vagy c) úgy határozzuk meg, mint annak az enzimnek a kon-
centrációját, amely a tisztított hidrolitikus enzimnél talált abszolút aktivitási értékkel egyenlő értéket mutat. Például a kitináz koncentrációjának standard egységét úgy határozzuk meg, mint azt a kitináz koncentrációt, amely 88.86 nkatal/ml extraktum abszolút aktivitást mutat, A B-1 ,3-glükanáz koncentrációjának standard egységét úgy határozzuk meg, hogy az a koncentráció, amely a részlegesen tisztított enzimnél talált abszolút aktivitással, azaz 7600 nkatal/ml extrakt értékkel egyenlő aktivitást mutat.
A jelen találmány olyan patogén-ellenes hatással rendelkező készítményekre vonatkozik, amelyek litikus peptidek és sejtfal hidrolizáló enzimek, például kitináz és jB—1 ,3-glükanáz kombinációját tartalmazzák. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási formája szerint mind a kitináz, mind a Ű-1 ,3-glükanáz kis mennyiségben van jelen az aktív adalékanyagban, például a standard koncentráció (c) 1/10—t kitevő relatív koncentrációban, vagy előnyösebben annak 1/100-ában. A hidrolitikus enzimek nagyon valószínűen azt teszik lehetővé, hogy a litikus peptidek jobban hozzáférnek a patogén sejtmembránjához.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti litikus peptidek az aktív adalékanyagban körülbelül 0,1 ppm - 1000 ppm
-11koncentrációban vannak jelen, előnyösen körülbelül 0,5 ppm -500 ppm, legelőnyösebben 1 ppm - 200 ppm koncentrációban.
A kitináznak és B-1,3-glükanáznak az a koncentrációja, amelyeket aktívnak találtak a vizsgált patogénekkel szemben a litikus peptidekkel kombinációban alkalmazva, számos növényfajban jelen van, még anélkül a megelőző inger nélkül is, amely ezeknek a hidrolitikus enzimeknek az indukciójához vezet. Azonban a természetesen előforduló kitinázok és glükanázok nem kapcsolódnak a patogénezishez, és inkább a vakuólumban találhatók, nem a növénysejt extracelluláris terében (Boller et al., 1983; Burri, 1989). Tehát a jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a litikus pepiidet a növényben már jelenlévő aktivált hidrolitikus enzimekkel kombinálva alkalmazzuk. Mind a kitináz, mind a fi-1 ,3-glükanáz indukálható növényekben. Tehát a jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kitinázt és a fí-1,3-glükanázt külső ingerekkel indukáljuk.
Az indukciót kiválthatjuk kémiai eszközökkel, például olyan vegyszerekkel, amelyekről ismert, hogy növényekben a patogénekhez kapcsolódó fehérjék inducerei, ide értve az etilént, benzoesavat, szalicilsavat, poliakrilsavat, valamint ezek helyettesített származékait. Az indukciót végrehajthatjuk más fiziológiai vagy fizikai módszerekkel, például magas vagy alacsony hőmérséklettel,
- 12 fizikai sérüléssel, vagy bármely más ismert induktív eszközzel.
A jelen találmány magában foglalja továbbá olyan patogén-ellenes hatással rendelkező készítmények készítését, amelyekben az aktív adalékanyag litikus peptidek és hidrolitikus enzimek kombinációja. Az aktív adalékanyagot homogénre keverjük egy vagy több, az alábbiakban leirt anyaggal vagy csoporttal. A jelen találmány tárgya továbbá eljárás növények megvédésére növényi patogének támadása ellen, azzal jellemezve, hogy az.aktív adalékanyagot, vagy az aktív adalékanyagot tartalmazó, patogénellenes hatással rendelkező készítményeket a növényre, vagy a patogén tartózkodási helyére alkalmazzuk,
A jelen találmány szerinti aktív adalékanyagokat általában profilaktikusan vagy kezelésként alkalmazzuk készítmények formájában egy vagy több, mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt, a termőterületre vagy a kezelt növényre kijuttatva, más hatóanyagokkal együtt, vagy egymást követően. Ezek a hatóanyagok lehetnek trágyák, mikrotápigény donorok, vagy más, a növényi növekedést befolyásoló készítmények. Lehetnek még szelektív herbicidek, inszekticidek, fungicidek, baktericidek, nematocidok, molluszkicidek vagy ezek közül néhánynak a keveréke, szükség esetén más hordozókkal, felületaktív anyagokkal, vagy az alkalmazást elősegítő adjuvánsokkal együtt, a formulázás • · ·
-13szakterülstén szokásszerüen alkalmazva, A megfelelő hordozók és adjuvánsok lehetnek szilárd vagy folyadék halmazállapotuak, és megfelelnek a formulázási technológiában szokásszerüen alkalmazott anyagoknak, például természetes vagy regenerált ásványi anyagok, oldószerek, diszpergáló szerek, nedvesítő anyagok, ragasztóanyagok, kötőanyagok vagy trágyák,
A jelen találmány szerinti aktiv adalékanyagok, vagy egy legalább egy aktiv adalékanyagot tartalmazó agrokémiai készítmény alkalmazásának előnyös módja a levélen való alkalmazás. Az alkalmazások száma és sebessége függ az adott patogén által okozott parazita fertőzés intenzitásától. Azonban az aktiv ingrediensek képesek bejutni a növényekbe a gyökereken keresztül a talajból (szisztémiás hatás), folyékony készitménnyel_átitatva a növény területét, vagy a vegyületet szilárd formában, például granulált formában (talaj alkalmazás) alkalmazva a talajra. Az aktiv adalékanyagokat alkalmazhatjuk a magokra is (beburkolás ), a magokat akár az aktiv adalékanyagokat tartalmazó folyadék-készítményekkel átitatva vagy egy szilárd készítménnyel beborítva. Speciális esetekben egyéb tipusu alkalmazásijmód is lehetséges, például a növény szárát vagy bimbóját szelektíven kezelve.
Ahhoz hogy a patogén-ellenes hatással rendelkező készítmények gátolják a patogén, például a S,nodorum gomba növekedését, ahhoz anrsk a feltételnek kell először ···· ·9 • · · * · w »·· ·<··
9 ·
- 14 teljesülnie, hagy a patogén először ε hidrolitikus enzimekkel kerül kapcsolatba. A kitinázzal vagy £-1,3-glükanázzal való érintkezés után a gomba membránja sokkal érzékenyebb a litikus peptidekre. Emellett azt is fontos megjegyezni, hogy egy növény patogén fertőzésre adott védelmi válasza számos különböző mechanizmusból áll, Mig a kitináz, £-1 ,3-glükanáz különböző litikus peptidekkel való kombinációja jelentősen gátolja a patogén növekedését, azáltal hogy lebontja a patogén sejtfalát és a patogén membránját, amellett nagyon valószínű, hogy segíti a növény patogén-ellenes képességét, olymódon, hogy elősegíti a növény hiper-szenzitivitási válaszakor keletkező egyéb patogén-ellenes hatású anyagnak a patogénhez ju tását, tehát a kitináz, £-1,3-glükanáz és a litikus peptidek jelen találmány szerinti kombinációja hatásosak a patogén gátlásában.
Az aktiv adalékanyagokat alkalmazzák módosítatlan formában, vagy előnyösen a formulázásban szokványosán alkalmazott adjuvánsokkal együtt, tehát ismert módon vannak formulázva emulgeálható sűrítményekké, kenhető pasztákká, közvetlenül kipermetezhető vagy hígítható oldatokká, hig emulziókká, nedvesíthető porokká, oldható porokká, granulátumokká, illetve kapszulázva például polimer anyagokban. A készítmények természetéhez hasonlóan, az alkalmazás módszereit,például a permetezést, atomizálást, porlasztást.
• ♦ · · · ♦ · • * 9 9 · • · · · 9 9 9
9 9 • · · a · szétszórást vagy kiöntést is a kitűzött célok és a fennálló körülmények alapján választjuk meg. Az alkalmazott dózis általában 50 gramm - 5 kg adalékanyag (a.i. ) per hektár (hal), előnyösen 100 gramm - 2 kg a.i./ha, legelőnyösebben 200 gramm -500 gramm a.i./ha.
Az aktiv adalékanyagokat, és szükség esetén egy szilárd vagy folyékony adjuvánst tartalmazó készítményeket vagy preparátumokat ismert módon állítjuk elő, például az aktiv adalékanyagokat töltőanyagokkal, például oldószerekkel, szilárd hordozókkal, és szükség esetén felületaktív vegyületekkel homogénen elkeverve vagy őrölve.
A megfelelő oldószerek közé tartoznak az aromás szénhidrogének, előnyösen a 8-12 szénatomot tartalmazó frakciók, például a xilol keverékek vagy helyettesített naftalinok, ftalátok, úgymint a dibutil-ftálát vagy dioktil-ftalát; alifás szénhidrogének, úgymint a ciklohsxán vagy a paraffinok; az alkoholok és glikolok, ezek éterei és észterei, úgymint az etanol, etilénglikol-monometiléter vagy -monometiléter;.ketonok, úgymint a ciklohexanon;
erősen poláros oldószerek, úgymint az N-metil-2-pirrolidon, dimetilszulfoxid vagy dimetilformamid ; valamint az epoxidált növényi olajok, úgymint az epoxidált kókuszdió- vagy szójaolaj; vagy a viz.
A porokhoz vagy diszpergálható porokhoz használt szilárd hordozók általában természetes ásványi töltőanyagok.
- 16 úgymint kalcit, talkum, kaolin, montmorillonit vagy attapulgit, A fizikai tulajdonságok javítása céljából az is lehetséges, hogy erősen diszpergált kovasavat, vagy erősen diszpergált adszorbens polimert alkalmazzunk. Az alkalmas granulált adszorptiv hordozók porózus típusúak, például a habkő, porított tégla, szepiolit vagy bentonit; az alkalmas nem-szorbens hordozók a mészkő vagy homok, vagy a hasonló anyagok. Emellett nagyszámú előre granulált sze rve tlen vagy szerves anyag alkalmazható, például főleg dolomit, vagy porított növényi maradványok.
A formulázáshoz használt aktív adalékanyag természetétől függően az alkalmas felületaktív anyagok lehetnek nem-ionos, kationos és/vagy anionos természetűek, jó emulgeáló, diszpergáló és nedvesítő képességgel. A felületaktív anyagok szakkifejezés alatt felületaktív anyagok keverékeit is értjük,
A megfelelő anionos felületaktív anyagok lehetnek mind vízben oldható szappanok, mind vízben oldható szintetikus felületaktív anyagok.
Az alkalmas szappanok alkáli-fémsók, alkáli-földfém-sók illetve helyettesitetlen vagy helyettesített ammónium-sók, és 8-22 szénatomszámu alkilgyökkel rendelkeznek, amely lehet alkilgyökök alkil egysége, például a lignoszulfonsav , a dodecilszulfát nátrium- vagy kálcium• · · · • · · · · • · · · · · ·
- 17 -sója vagy természetes zsírsavakból nyert zsiralkoholok keveréke. Ezek a vegyületek lehetnek a zsiralkohol/etiléndioxid adduktumok kénsavas vagy szulfonsavas észterének sói. A szulfonát benzimidazol származékok előnyösen 2 szulfonsav csoportot tartalmaznak, és egy zsirsavgyök 8-22 szénatomot tartalmaz. Az alkil-aril-szulfonátokra példa a dodecil-benzol-szulfonsav, a dibutil-naftalin-szulfonsav, vagy a naftalin-szulfonsav/formaldehid kondenzációs termék nátrium-, kalcium- vagy trietanolamin sója. Alkalmasak még a megfelelő foszfátok, például a p-nonil-fenol 4-14 mól etilénoxiddal képezett adduktja foszforsav-észterének sói*
A nem-ionos felületaktív anyagok előnyösen az alifás vagy cikla-alifás alkoholok poliglikol éterei, vagy telitett illetve telítetlen zsírsavak illetve alkil-fenolok, az említett származékok 3-30 glikol-éter csoportot tartalmaznak, valamint 8-20 szénatomot az (alifás) szénhidrogén egységben és 6-18 szénatomot az alkil-fenolok alkil-fenolok alkilcsoportjában.
További alkalmas nem-ionos felületaktív anyagok a polietilén-oxid polipropilén-glikollal, etilén-diamin-propilén-glikollal és alkil-propilén-glikollal képezett vízben oldható adduktumai (az alkil láncban 1-10 szénatomot tartalmaz), amely adduktumok 20-250 etilén-glikol-éter csoportot tartalmaznak, valamint 10-100 propilén-glikol-éter csoportot. Ezek a vegyületek általában 1-5 etilén-
-glikol egységet tartalmaznak egy propilén-glikol egységre számítva.
A nem-ionos felületaktív anyagok jellemző vegyületei a nonil-fenil-polioxi-etanolok, a ricinusolaj poliglikol-éterei, a polipropilén/polietilén-oxid adduktumok, a tributilfenoxi-polietoxietanol, a polietilén-glikol és az oktilfenoxi-atoxietanol. A polioxietilén-szorbitán zsirsavészterei, valamint a polioxietilén-szorbitán trioleát is alkalmas nem-ionos felületaktív anyagok.
A kationos felületaktív anyagok előnyösen kvaterner ammónium sók, amelyek N-szubsztituensként legalább egy 8-22 szénatomos alkil-csoportot tartalmaznak, valamint további szubsztituensként kisebb szénatomszámu helyettesitetlen vagy halogénezett alkil-, benzil-, vagy kisebb szénatomszámu hidroxi-alkil csoportokat. A sók előnyösen halogenid formában vannak, vagy metilszulfát illetve etilszulfát formában, például ilyen molekula a sztesril-trimetil-ammónium-klorid , vagya benzil-d i(2-klór-e til- )-e t il-ammónium-bromid.
A formulálás során szokásosan alkalmazott felületaktív anyagokat például a McCutcheon’s Detergens and Emulsifiers Annual (1979), valamint a Sisey and Wood (1980) publikációkban írják le.
Az agrokémiai készítmények az aktív adalékanyagokból általában 0,1-99 %-ot, előnyösen körülbelül 0,1-95 %- ot, legelőnyösebben 3-90 ?<,ot tartalmaznak, a szí19 « * ··«· ·« ·· ·· ·· ♦· · · · • ♦ · ··· ·«· • · · · · · · · · lárd vagy folyékony adjuvánsból 1-99,9 %-ot, előnyösen körülbelül 1-99 %-ot, legelőnyösebben 5-95 %-ot, és a felületaktív anyagból körülbelül 0-25 %-ot, előnyösen 0,1-25 %-ot, legelőnyösebben körülbelül 0,1-20 ?'-ot.
Míg a kereskedelmi forgalomba kerülő terméket előnyösen sűrítmény formájában szerelik ki, a végfelhasználó hígított készítményeket alkalmaz.
A jelen találmány vonatkozik továbbá legalább egy litikus peptidet és legalább egy hidrolázt kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzgenikus növényekre, A kitinázt és 13-1,3-glükanázt kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó transzgenikus növényeket az EP 353 191 számú szabadalmi leírásban közük.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás olyan transzgenikus növény előállítására, amely képes patogén-ellenes hatásos mennyiségben szintetizálni egy vagy több membrán-lebontó komponenst, és egy vagy több hidrolitikus enzimet, azzal jellemezve, hogy:
a) egy vagy több sejtmembrán-lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó transzgenikus növényt állítunk elő: vagy
b) kettő vagy több, egy vagy több sejtmembrán-lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó transzgenikus növényt ·«
- 20 állítunk elő, és az említett növényeket szokásos tenyésztési módszerekkel keresztezzük.
A módszer során előnyösen először előállítunk egy homozigóta transzgeniku9 növényt, amely egy sejtmembrán-lebontó komponenst kódoló rakombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, majd előállítunk egy második homozigóta transzgenikus növényt, amely £-1,3-glükanázt kódoló rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, végül előállítunk egy harmadik homozigóta transzgenikus növényt, amely kitinázt kódoló rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, majd a három homozigóta növényt szokásos tenyésztési technikákkal keresztezzük.
A transzgenikus növényekben indukálhatjuk a litikus peptidek és hidrolitikus enzimek szintézisét agy indukálható expressziós rendszer alkalmazásával, amely egy indukálható gént és agy indukálható regulatort tartalmaz. Például a dohány tiz patogénekkel kapcsolatos (PR) fehérjéje kémiailag indukálható (van Loon, 1985; Damet and Fritig, 1986). Ezek közül a gének közül háromról, a PR-2-ről, PR-N-ről és a PR-O-ról kimutatták, hogy 13—1 ,3-glükanáz aktivitással rendelkeznek (Kauffman et al. , 1987), és kettőről, a PR-P-ről és a PR-O-tól kimutatták, hogy kitináz aktivitással rendelkeznek (Legrand et al, , 1987). A jelen találmány tárgyai tehát transzgenikus növények, amelyek legalább egy litikus pepiidet kódoló gént expresszálnak, • · ··«« ·« • ♦ · ·· · ··· ··· · ·· ·« amelyekben ezután egy indukáló regulátorral kezelve indukáljuk legalább egy természetes vagy idegen hidrolitikus enzim felhalmozódását.
A találmányt részletesen illusztráljuk az alábbi példákkal, anélkül, hogy a példák korlátoznák a találmány érvényességi körét.
ATCC letétbe helyezések
A következő letéteket helyeztük el az ATCC-nél a Budapesti Egyezmény alapján:
ATCC 40426, 1988. február 12.
ATCC 405S6 , 1989. március 22.
Példák
1. példa
Kitináz és £-1,3-qlükanáz tisztítása etilénnel kezelt bab leveleiből
1. lépés: Etilén-kezelés és növényi anyag
A Phaseolus vulgáris L,cv. saxa magvait vermikulitban növesztjük 16 világosság/ S óra sötét megvilágítási ritmusban 20 °C-on. A tizenkét napos babnövényeket 0,2 m^ térfogatú légzáró műanyag kamrákban inkubáljuk. A kontroli-növényeket azonos kamrákban inkubáljuk, etilénmentes levegőben. 48 óra elteltével az elsődleges leveleket leszedjük és -20 °C-on lefagyasztjuk. 2. lépés
2. lépés: Nyers enzim-preparátum készítése
659,7 g lefagyasztott levél-szövetet homogenizálunk 0,1 mól nátrium-citrát pufferben (pH=5,0) 2 ml/g * · ···· ·«·♦ • · · · ·· ··9 • · · ·· · · · · • ♦ · · · ··· »·· 4 ··*· nyers súly koncentrációban egy Turmix homogenizálóval, maximális sebességgel. A homogenizátumot lecentrifugáljuk (25 perc, 1100 x g), majd a felűluszóból 100 ml-t használunk mint nyers enzim-preparátumot. A maradék nyers extraktum fehérjéit ammónium-szulfát 95 %~os telítésig való hozzáadásával kicsapjuk. Centrifugálás után (30 perc, 1100 x g) az üledéket újra feloldjuk 100 mmól TRIS-HC1ben (pH=8,0), majd 5 mmól TRIS-HCl-lel szemben dializáljuk (pH=8,0).
3. lépés: Enzim-tisztitás
A dializált nyers fehérje-frakciót egy dietil-aminoetil (DEAE)-triszakril (IBF; Clichy, Franciaország) oszlopon bocsátjuk keresztül, amelyet 5 mmólos TRIS-HC1 (pH=8,0) pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopon késleltetés nélkül átfolyó alap fehérjéket tartalmazó puffer végkoncentrációját 20 mmól NaHCO^-ra állítjuk. A pH értékét 8,4-re emeljük 1 mólos nátrium-hidroxiddal,majd a folyadékot 20 mmól NaHCOj-mal egyensúlyba hozott regenerált kitin oszlopra visszük (Molano et al. , 1977). Az átfolyó puffért összegyűjtjük, majd a pH értékét 1 mólos sósavval 5,5-re állítjuk. A fehérjéket vízzel szemben dializáljuk, majd háromszor kezeljük kismennyiségű regenerált kitinnel, majd centrifugáljuk, a kitináz nyomainak eltávolítására, A magas aktivitású JB-1 ,3-glükanázt tartalmazó frakciót ezután liofilezzük. Ez a forrása a. részlegesen tisztított 13-1,3-glükanázna k.
Λ ··
Λ
A kitin-oszlopot 20 mmól NaHCO^-mal mossuk, majd 20 mmól 5,5-ös pH~ju nátrium-acetát pufferrel. A kitinázt 100 mmólos ecetsavval oldjuk le 31 ml eluciós térfogatban. Az eluátum pH-ját 5,5-re állítjuk 1 mmólos KOH-val, majd a fehérjét vízzel szemben dializáljuk és liofilezzük, Ez a fehérje a tisztított kitináz forrása.
4.1épés: Fehérje-meghatározás
A fehérjét Bradford módszerével mérjük (1976).
5a, lépés: Kitináz esszé
A kitináz aktivitását Molano és munkatársai .
módszerével mérjük (1977),
5b, lépés: B-1 ,3-glükanáz esszé
A B-1 ,3-glükanáz aktivitását Dygert és munkatársai módszerével mérjük (1965),
6, lépés: Enzim-indukció etilénnel kezelt levelekben
Egy 48 órás etilén-kezelés a kitináz és a
B-1 ,3-glükanáz erős indukciójához vezet, amit az 1, táblázat eredményei mutatnak:
• ·«····· ·· •· ·· ····· • * · ·»· ··· • · · · · ··· «·· · ·♦ »«
1, táblázat
| Kitináz és £-1,3-glükanáz aktivitás etilénnel | |
| kezelt levelekben | |
| Specifikus kitináz aktivitás (nkatal/mg fehérje) | 45,95 |
| Abszolút kitináz aktivitás (nkatal/ml extraktum) | 54,71 |
| Specifikus £-*glükanáz aktivitás (nkatal/mg fehérje) | 28,72 |
| Abszolút £-1,3-glükanáz aktivitás (nkatal/ml extraktum) | 34,21 |
7, lépés: Enzim tisztítás
A 2, táblázatban látható a kitináz és a £-1 ,3-glükanáz tisztításának leírása, A kitinázt 33-szorosan tisztítottuk 21,6 %-os kitermeléssel, A £-1,3-glükanázt háromszorosan tisztítottuk, 33,5 %-os kitermeléssel,. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis azt mutatja, hogy a £-1,3-glükanáz nagyon erősen megtisztul ezek után a tisztítási lépések után (Burri, (1989),
8, lépés: A kitináz és a £-1,3-glükanáz induk- ciója bab leveleiben
Az ebben a kísérletben használt bab leveleiben a kitináz és a £-1,3-glükanáz enzimek kevésbé induká- 25 Λ lódtak mint várható volt. Például Burri kísérletében (1989) öt etilén kezelés átlaga 88,86 +. 6,65 nkatal/ml extraktum abszolút kitináz aktivitás értéket, és 76,00 4^ 6,77 nkatal/ml extraktum fi-1 ,3-glűkanáz abszolút aktivitás értéket adott. Tehát a kitináz standard koncentrációját (c = 1) úgy definiáljuk, mint olyan koncentrációjú kitinázt, amely ahhoz szükséges, hogy 88,86 nkatal/ml extraktum aktivitást érjünk el, A kitináz extraktumok relatív koncentrációját ennek az aktivitásnak a hányadában állapítjuk meg, A részlegesen tisztított fi—1,3-glükanáz relatív koncentrációit a 76,00 nkatal/ml extraktum aktivitásának a hányadában állapítjuk meg,
9. lépés: Kitináz tisztítás
A kitinázt affinitás-kromatográfiával tisztítjuk, A tisztítási faktor összevethető a Burri (1989) által megadott értékkel (32 %), • · ··«· ·· ·· ·· ♦· ·»··«· • · · ··· ··· • · · · · <·· ··· ♦ ·· ·· kitináz és a 13-1 ,3-glükanáz etilénnel kezelt bab leveleiből
| 1 | CD | |||
| m ι | •rl | 4- | ||
| □ i3 | •P | |||
| 32 r-i | V | CD | ||
| •H CD CO | E | |||
| Η- 1 | X | |||
| •ri tO | c | CD 4-> | CD | |
| O » | KO | KO CO | •í~ | |
| Φ r— | N | P | U | |
| Q-ι | CO | •rl C KD | ||
| ω <3 | > | Σ. | ||
| ι | ||||
| (0 | to 1 | |||
| CD | ||||
| KO | v~ CO | |||
| u | ι | |||
| •rl | N | |||
| <D | KO | CD | ||
| r-1 | CD C | KO | ||
| Φ CO | P | P | ||
| 32 | •rl | CO | ||
| CO | rd ’□ | > | 32 | |
| c | CD r-1 | •H | C | |
| KO | F cdp | |||
| <0 | ||||
| KO | 1 | |||
| P | •rl | 0 | ||
| •rl | P | CD | ||
| P | CD | 4— | ||
| N | 3 CO | |||
| CD | 32 | CD | ||
| rl | •rl N | E | ||
| p | 4- KO | 's'-' | ||
| •rl C | CD | 4~i φ | ||
| co | Ο *rl | KO | CO Π | |
| C | φ P | P | ΐ- | |
| KD | CL-rl | •H | ε KD | |
| P | ω -x | > | v—JC | |
| U | ||||
| =O | 1 | |||
| P | 1 -H •rl P Jsí -X | |||
| CO | ||||
| 0) | ||||
| CD N | CD | P | ||
| •ηκο | KO | CO | ||
| rd C | 4-> -X | |||
| φ -rl | •rl | c | ||
| H 4-- | > | *·—* |
ι <D
Η- O
E CD —φ φ
| < | •O*r-> |
| Tel hőr |
Φ > u KD
E
| |s | CD | 10 | to | CO |
| * | O | te | Kf | te |
| co | c | CM | te | 10 |
| CM | •rl | in | CM | co |
| C | ||||
| CD | ||||
| > | ||||
| U | ||||
| •Φ | ||||
| E | ||||
| CD^ | CD | CO | ||
| cO | O | r- to | IS | cd m |
| in o | C | 0) ' | te | CM ' |
| CM o | •rl | 0) r- | V | v to |
| CM V- | C | CO M· | V | rs to |
| in | t | |||
| CD | CD | is | Kt | |
| te | te | CD | V | in |
| in | o | 1O | LO | te |
| co | V | τ— | ω | |
| X | ||||
| Kf | 00 | |||
| o | Kt X | CD CM | r- lO | |
| o o | CD | in » | * | Τ- |
| Kt O | V | co ω | ΙΟ r- | Ο |
| to Τ- | CO CD | CM fs | IS cm | is |
| * | kJ | |||
| Ο | st | Τ- | CO | r— |
| Μ- | CM | Ο) | te | te |
| is | in | r- | CM | |
| 00 |
N KO
C
| E | •H | |||
| 3 | KO | P | ||
| P | 4- | •H | ||
| 32 | rd | V | D. | |
| CO | □ | CL | O | |
| L. | N | O | P | rd |
| P | CO | rd | P | N |
| X | E | N | O | CD |
| <D | □ | CD | P | O |
| •rl | O | •H | 1 | |
| CD | C | 1 | P | c |
| L. | Ό | LLI | N | •rl |
| CD | E | «í | <0 | P |
| E | LŰ | •rl | rl | |
| < | Q | H. |
• · ·
10.lépés: B-1 ,3-glükanáz tisztítása
A 35,5 %-os kitermelés mintegy egyharmaddal magasabb mint a Burri (1989) által erre a tisztítási lépésre leirt, mig a háromszoros tisztítási faktor nincs olyan magas mint amelyet korábban elértek.
2, példa
Litikus peptidek szintézise
A litikus peptideket egy Applied Biosystems Model
430 peptid-szintetizátorral állitjuk elő, a készülék gyártójának előírásai szerint, A peptideket HPLC-vel tisztítjuk.
3, példa
A litikus peptidek és a hidrolitikus enzimek gátló hatása S, nodorum-ra
Mikrotiter lemezeket választunk a litikus peptidek és hidrolitikus enzimek S, nodorum-ra gyakorolt gátló hatá-
| sának vizsgálatára. | A teszt-vegyületeket 90^ul borsó folya- |
dék táptalajhoz adjuk, amelyet előzőleg a vizsgált patogén
2,0 x 104 spóra/ml végkoncentrációju tenyészetével oltottunk be, a végtérfogat 100/ul. A 3, táblázatban a kétszeres/háromszoros párhuzamosban vizsgált teszt-oldatok összetétele látható.
A vizsgált anyagok vak-értékét beoltatlan borsó folyadék táptalajhoz adva határozzuk meg, A lemezeket nedves kamrában °C-on sötétben 48 órán át való rázatás után értékeljük ki,
A patogén növekedését a táptalaj abszorbanciájának
595 nm-en való mérésével vizsgáljuk. A két/három párhuzamos • · ·· ·♦ ·· ·· ····· * · · ······ • · · · · ··· ·«· ♦ ·· ··
- 28 minta átlagát kiszámitjuk.majd a megfelelő enzim vak-értékét kivonjuk, igy kapjuk a növekvő micélium tiszta abszorpcióját. A vizsgált anyagok gátló hatását úgy számítjuk ki, hogy a patogén növekedését a vizes kontroll százalékában fejezzük ki,
A fenti vizsgálat eredményei a 4, táblázatban láthatók összegyűjtve. Egyedüli teszt-oldatként használva mindegyik oldat képes a S.nodorum növekedését gátolni korlátozott mértékben, a használt koncentrációtól függően, A részlegesen tisztított J3-1 ,3-glükanáz és a litikus peptid kombinációja sokkal erősebben gátolja a patogén növekedését mint a tisztított kitináz és a litikus peptid. Ez megegyezik azzal a megfigyeléssel, hogy a S.nodorum sokkal érzékenyebb a részlegesen tisztított B-1 ,3-glül<anázra mint a tisztított kitinázra. Amint azt a 4, táblázat mutatja, akármelyik enzimből 1/100 c hozzáadása egy bizonyos peptid-koncentrációhoz csak enyhén növeli a vizsgált anyag gátló hatását a litikus peptid egyedüli használatához hasonlítva. Akármelyik enzimből 1/10 c hozzáadása egy bizonyos litikus peptid-koncentrációhoz sokkal erősebben gátolja a teszt patogént mint 1/100 c enzim kombinálása a litikus peptiddel. Különösen érdekes, hogy mindkét enzim kombinálása a litikus peptidekkel, akár 1/10, akár 1/l00c koncentrációban, erősen növeli a teszt-anyagok gátló hatását.
·· ·
| 3, táblázat Teszt oldatok | |||
| Minta | T iszt itott kitináz | T iszt itot t J3-1 ,3-glükazán | Litikus peptid |
| ícj | (c) | (ppm) | |
| 0 | - | ||
| 1 | 1/10 | - | - |
| 2 | 1/100 | - | - |
| 3 | 1/10 | - | |
| 4 | 1/100 | - | |
| 5 | - | 20 | |
| 6 | - | 60 | |
| 7 | - | 200 | |
| 8 | 1/10 | 1/10 | - |
| 9 | 1/10 | 1/100 | - |
| 10 | 1/100 | 1/10 | - |
| 11 | 1/100 | 1/100 | - |
| 12 | 1/10 | 20 | |
| 13 | 1/10 | 60 | |
| 14 | 1/10 | 200 | |
| 15 | 1/100 | 20 | |
| 16 | 1/100 | 60 | |
| 17 | 1/100 | 200 | |
| 18 | 1/10 | 20 | |
| 19 | 1/10 | 60 | |
| 20 | 1/10 | 200 | |
| 21 | 1/100 | 20 | |
| 22 | 1/100 | 60 | |
| 23 | 1/100 | 200 | |
| 24 | 1/10 | 1/10 | 20 |
| 25 | 1/10 | 1/10 | 60 |
| 26 | 1/10 | 1/10 | 200 |
| 27 | 1/100 | 1/100 | 20 |
| 28 | 1/100 | 1/100 | 60 |
| 29 | 1/100 | 1/100 | 200 |
Vizes kontroll: 1O^ul desztillált vizet adunk 90^ul spóra-szuszpenzióhoz «►·♦· 4«
- 30 4, táblázat
A teszt-oldatok eredményei, a gomba-növekedés a kontroll %-ában
| Tesztoldat | 3, sz.szintet!kus peptid----------- | Árpa tionin 13 | Mellitin | Enzimek |
| 0 (Control) | 100.00 | |||
| 1 | 78.60 | |||
| 2 | 93.68 | |||
| 3 | 50.18 | |||
| 4 | 81.75 | |||
| 5 | 80.35 | 86.32 | 79.65 | - |
| 6 | 73.51 | 63.86 | 65.96 | - |
| 7 | 65.96 | 60.70 | 27.37 | - |
| 8 | - | - | - | 34.21 |
| 9 | - | - | - | 45.61 |
| 10 | - | - | - | 39.82 |
| 11 | - | - | - | 60.88 |
| 12 | 68.42 | 62.81 | 62.81 | |
| 13 | 63.51 | 49.47 | 57.54 | |
| 14 | 61.75 | 47.02 | 22.46 | |
| 15 | 77.89 | 75.44 | 73.33 | |
| 16 | 71.58 | 62.81 | 65.26 | |
| 17 | 64.21 | 57.19 | 25.61 | |
| 18 | 46.67 | 13.68 | 14.74 | |
| 19 | 30.88 | 12.98 | 11.93 | |
| 20 | 27.89 | 5.26 | 6.32 | |
| 21 | 65.26 | 54.74 | 61.40 | |
| 2Λ | 63.51 | 46.67 | 57.19 | |
| 23 | 53.68 | 39.30 | 25.96 | |
| 24 | 9.47 | 7.72 | 10.53 | |
| 25 | 8.42 | 2.22 | 7.37 | |
| 26 | 3.86 | 0.00 | 0.00 | |
| 27 | 40.7 | 42.46 | 22.72 | |
| 28 | 36.49 | 32.98 | 22.11 | |
| 29 | 31.23 | 28.77 | 18.75 |
A hidrolitikus enzimeket az 1. példában leirt' módon tisztítjuk a levelekből.A litikus peptideket 20 ppm, ppm és 200 ppm koncentrációban vizsgáljuk.
4. példa
Patoqén-ellenes hatással rendelkező készítmények formulázása, aktiv adalékanyagként a litikus peptideket és a hidrolitikus enzimeket használva A továbbiakban a készítményeket sulyszázalékban adjuk meg.
| 1. Emulqeáló sűrítmények: | a | b | c | |
| Aktiv adalékanyag | 20 % | 40 % | . 50 | % |
| Kálcium-dodecil-benzolszulfonsav | 5 % | 8% | 6 | % |
| Ricinusolaj vagy polietilénglikol éter (36 mól etilén-oxid) | 5 % | - | - | |
| Tributil-fenol-polietilénglikol éter (30 mól etilén-oxid) | - | 12 y. | 4 | 0/ /0 |
| Ciklohexanon | - | 15 % | 20 | 0/ A) |
| Xilol keverék | 70 % | 2 5 % | 20 | 0/ |
Emulziókat bármely szükséges koncentrációban előállíthatunk a fenti sűrítményekből vízzel való hígítással.
2. Oldatok a b c . d %
Aktiv adalékanyag
Etilén-glikol monométiléter %
% 5 % 95 %
| a | b | c | d |
| Polietilén-glikol 400 | 70 % | - | |
| N-metil-2-pirrolidon - | 20 % | - | - |
| Epoxidált kókusz-olaj | - | 1 % | 5 |
| Petróleum desztillátum - | — | 94 % | — |
(forrás pont-tartomány:
160-190 °C)
Ezek az oldatok mikrocsepp formában alkalmazhatók.
| Granulátumok | a | b |
| Aktív adalékanyag | 5 % | 10 % |
| Kaolin | 94 % | - |
| Erősen diszpergált kovasav | 1 % | - |
| Attapulgit | - | 90 % |
| Az aktiv adalékanyagot diklórmetánban oldjuk. | az olda- | |
| tót a hordozóra permetezzük, majd az | oldószert ezután vá- | |
| kuumban elpárologtatjuk. | ||
| 4. Porok | a | b |
| Aktiv adalékanyag | 2 % | 5 % |
| Erősen diszpergált kovasav | 1 % | 5 % |
| Talkum | 97 % | - |
| Kaolin | - | 90 % |
| Az alkalmazásra kész porokat úgy | állítjuk elő | , hogy a |
hordozókat alaposan elkeverjük az aktív adalékanyaggal .:
♦ *· ···· ·· »4 • 4 9 9 · • 999 «·· • · « «4 ·· ··
5, példa
Pa toqén-ellenes hatású készítmények formulázása, aktív adalékanyagként litikus peptidek és hidrolitikus
| enzimek szilárd készítményeit alkalmazva | ||||||
| Az alábbiakban a készítmények összetételét százalékban adjuk meg. | súly- | |||||
| 1, Nedvesíthető porok: | a | t | ) | c | ||
| Aktív adalékanyag | 20 % | 60 | 0/ /u | 75 | % | |
| Ná trium-lignőszulfonát | 5 | 0/ /0 | 5 | 0/ /: | - | |
| Nát rium-lau ril-szulfát | 3 | % | 5 | 0/ /0 | - | |
| Nátrium-diizobut il-naftalin-szulfonát | — | 6 | ez /□ | 10 | % | |
| Okt ilfenil-políet ilénglikol-éter (7-8 mól etilénoxid) | - | 2 | 0/ | - | ||
| Erősen diszpergált kovasav | 5 | % | 27 | 0/ /0 | 10 | % |
| Kaolin | 67 | % | — |
Az aktív adalékanyagot alaposan elkeverjük az adjuvánsokkal, és a keveréket megfelelő malomban megőröljük, igy állítunk elő nedvesíthető porokat, amelyeket vízzel hígítva a kívánt koncentrációjú szuszpenziókhoz jutunk,
2, Emulgeálható sűrítmény;
Aktív adalékanyag 10 %
Oktilfenol-polietilénglikol-éter (4-5 mól etilén-oxid) 3 %
Kálcium-dodecilbenzol-szulfonát 3 %
Ricinusolaj vagy poliglikol-éter (36 mól etilénoxid) 4 %
Ciklohexanon %
Xilol keverék %
Ebből a sűrítményből bármely szükséges koncentrációjú emulziót elő lehet állítani vízzel való hígítással.
3, Porok:
Aktív adalékanyag
Talkum %
Kaolin %
Alkalmazásra kész porokat úgy kapunk hogy az aktív adalékanyagot elkeverjük a hordozókkal, majd a keveréket alkalmas malomban megőrüljük.
4, Extruder granulátum:
Aktív adalékanyag %
Nátrium-lignoszulfonát
Karboximatil-cellulóz %
Az aktív adalékanyagokat összekeverjük az adjuvánsokkal és megőröljük, majd a keveréket ezután vízzel megnedvesitjük. A keveréket ezután éxtrudáljuk és levegőáramban szárítjuk,
5, Bevont granulátum:
% %
%
Aktív adalékanyag
Polietilénglikol 200
Kaolin ···« *·
- 35 A finomra őrölt aktív adalékanyagot egy keverőben egyenletesen felvisszük a polietilén glikollal nedvesített kaolinre, Nem-poros bevont granulátumokat kapunk ilymódon,
6, Szuszpenzíó sűrítmény
Aktív adalékanyag ' 40 %
Etilénglikol 10 %
Nonilfenol-polie tilénglikol (15 mól etilénoxid) 6 %
Nátrium-lignoszulfonát 10 %
Karboximetil-cellulóz 1 %-os vizes formaldehid oldat 0,2 %
Szilikon-olaj 75 %-os vizes emulzióban 0,8 %
Víz 32 %
A finomra őrölt aktív adalékanyagot alaposan el' keverjük az adjuvánsokkal, igy egy olyan szuszpenzió-sűritményt kapunk, amelyből bármely szükséges koncentrációjú szuszpenziót előállíthatunk vízzel hígítva,
6, példa
A PCGN1781C és pCGN1782C bináris vektorok előállítása
A pCIB1005B plazmidot, amely egy dupla 35S karfiol mozaik vírus (CaMV) promotert tartalmaz, müködésileg egy alap glűkanázt kódoló génhez kapcsolva, a következőképpen állíthatjuk elő:
- 36 A pGLN17 plazmidot, amely a N.tabacum alap £-1,3-glükanázt kódoló hibrid cDNS-t tartalmaz (Shinshi et al., 1988), úgy állítjuk elő, hogy a pGL31 klón 5' végét és a pGL36 klón 3* végét fuzionáltatjuk. Ennek a hibrid cDNS-nek a szekvenciája a SEO ID N0:9 jelzéssel rendelkezik.
A cDNS 5' vége csonka, és nem kódolja a teljes szignál-pept idet, Abból a célból, hogy olyan transzgenikus növényeket állítsunk elő, amelyekben a fehérje a megfelelő célpontba kerül (azaz a központi vakuólumba), arra van szükség, hogy ezt a szekvenciát visszaadjuk a csonkított DNS-nek. Tehát a dupla CaMV 35S expressziós kazettát kétlépéses eljárás szerint állítjuk elő. Az első lépésben a cüNS szignál-peptidjét a genomiális klón által kódolt szignál-peptiddel helyettesítjük, A második lépésben ezt a helyrehozott cDNS-t építjük be az expressziós vektorba,
A pSGL2 plazmid a pGLN17 cDNS egyik szubklónja. Ezt x a plazmidot Clal és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, igy kapjuk a glükanáz cDNS-t tartalmazó 1 kb-os fragmentet, és ezt LGT agaróz gélből izolájuk. A pBluescript plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, CIAP-pal kezeljük és LGT agaróz gélen tisztítjuk,
A pBS-Gluc 39.1 plazmid egy 4,4 kb méretű inszertet tartalmaz, amelyen található a glükanázt kódoló szekvencia, • · ·
• *
- 37 körülbelül 1,5 kb méretű 5’ határoló szekvencia, egy 600 bp méretű intron, és egy körülbelül 1 kb méretű 3’ határoló szekvencia. Ezt a plazmidot használjuk templátként a PCR kísérletben, amely két indító molekulát (prímért) alkalmaz, jelük SEO ID N0;10 és SEO ID N0;11.
Ennek az amplifikálásnak az eredményeképpen állítjuk elő azt a fragmentet, amellyel helyettesíteni lehet a glükanáz cDNS csonka 5’ végét, A klónozási kísérletek megkönnyítésére egyetlen bázist érintő mutációt hajtunk végre, amelynek eredménye egy EcoRI restrikciós hasítási hely előállítása, A PCR terméket EcoRI és Clal restrikciós enzimmel emésztjük, majd a fragmenteket 2,0 %-os LGT agaróz gélen választjuk el. Egy 120 bp méretű csikót kivágunk, összekeverjük a pSGL2 plazmádból származó Clal-EcoRI restrikciós fragment tel és az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett Bluescript vektorral, ligáljuk, majd a fentiek szerint transzformáljuk, A transzformánsokat átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e az inszertet, majd egy, megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztunk, ennek jele pCIB1ÜO9,
A pCIB1009 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 1,2 kb méretű fragmentet LGT agaróz gélen való futtatás után megtisztítunk, A pCGN1761 | plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, CIAP-pal ' í
I •4 ·· · · · · · < · · ······ • · · · · ··· * · · · ·· ♦·
- 38 kezeljük, LGT agaróz gélen tisztítjuk, összekeverjük az
1,2 kb méretű EcoRI fragmenttel, majd az elegyet ligáljuk és transzformáljuk. A transzformánsokat átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e az inszertet, Az egyik plazmidot, amelyben a glükanáz cDNS az értelmes orientációban található meg a CaMV promoterhez viszonyítva, pCIBl005B jelzéssel látjuk el.
A pCIB1OO5B plazmid 4,9 kb méretű Xbal fragmentjét Xbal restrikciós enzimmel emésztett pCGN1540 plazmádba szubklónozzuk, olyan orientációban, hogy a dupla 35S promoter fragment a legközelebb essen a pCGNl540 növényi szelekciós márkeréhez, igy állítjuk elő a pCGN1781C plazmidot,
A pCIB1007 plazmidot, amely a dupla 35S CaMV promotert működésileg az alap kitinázt expresszáló génhez kapcsolva tartalmazza, a következőképpen állítjuk elő:
A pSCHlO plazmid tartalmaz egy dohány alap kitináz cDNS inszertet, amely hasonlít a pCHN50-ben lévő inszertre (Shinshi et al., 1987), de az 5' végén egy 81 bp méretű kiterjesztést tartalmaz (SEQ ID N0;12),
A pSCHIO plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy molekuláris adapterrel ligáljuk össze (SEQ ID NO:13) az 5. példában leírtak szerint, A ligálás termékét ezután megtisztítjuk, majd EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és az adapter molekulával ellátott kitináz cDNS~t LGT agaróz gélből tisztítjuk.
»··* · ··« • · · · * • · · · · ·· • · · • «·«·
- 39Λ
Ezt a fragmentet EcoRI restrikciós enzimmel emésztett, CIAP-pal kezelt pCGN1761 plazmiddal keverjük össze, amelyet szintén LGT agaróz gélből tisztítottunk, majd az elegyet ligáljuk és transzformáljuk. A transzformánsokat megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a kitináz cDNS inszertet, és egy plazmidot, amely a kitináz cDNS inszertet a CaMV promoterhez képest helyes orientációban tartalmazza, pCIB1Ű07 jelzéssel látunk el.
A pCGN1007 plazmid 4,8 kb méretű Xbal fragmentjét Xbal restrikciós enzimmel emésztett pCGN1540 plazmidbá ligáljuk olyan orientációban, hogy a dupla 35S promoter fragment a pCGNl540 plazmidban lévő növényi szelekciós marker szomszédja legyen, igy állítjuk elő a pCGN1782C bináris vektort.
7. példa
A 3. számú szintetikus litikus pepiidet kódoló gén előállítása
A fenti példákban leirt 3, számú litikus peptid aminosavszekvenciája a SEO ID N0:1 jelzést viseli.
Az ezt a peptidet kódoló szintetikus gént több lépésben állítjuk elő. Először egy olyan gént szintetizálunk és klónozunk, amely az érett (processzált) fehérjét kódolja, majd ehhez hozzáadunk egy szignál-peptidet, és egy 5- leader szekvenciát a növényekben való expreszszálása és szekréció céljából, végül egy 3' nem-transzlálódó •· ·· · · ·· » » · 9 ····♦· • · · · · • · * »»* · * · ♦ · ’ - 40 szekvenciát és egy 3* mRNS processzáló helyet adunk hozzá. A fenti folyamat eredménye a 3. számú szintetikus pepiidet kódoló gén, amelyet növénybe transzformálhatunk, és amely irányítja egy extracellulárisan szekretálódó litikus pepiid szintézisét,
A. Az érett pepiidet kódoló szekvencia előállítása
Két oligonukleotidot szintetizálunk, az Oligol-et és az 01igo2-t, szekvenciájuk a SEO ID N0;2 és SEO ID N0:3 jelzést viseli, fi-cianoetil-foszforamidit kémiát alkalmazva egy Applied Biosystems 380A DNS szintetizátoron, majd OPC alapú tisztítással tisztítjuk (Applied Biosystems), a gyártó előírásai szerint, A tisztított oligonukleotidokat először polinukleotid kinázzal kináz reakcióba visszük, majd egy órán át 65 °C-on hagyjuk, hogy a hidrogénhid-kötések kialakuljanak. A reakcióelegyet 37 °C-ra visszahütjük, majd T4 DNS-ligázt adunk hozzá fölös mennyiségű ATPvel együtt, és a ligáló elegyet egy további órán át inkubáljuk.A reakcióelegyet ezután 65 °C-ra melegítjük 1 percre, igy inaktiváljuk a ligázt, majd a javasolt EcoRI pufferből annyit adunk az elegyhez, hogy koncentrációja 1X legyen. A ligálási reakciót ezután EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, A DNS-t fenollal extraháljuk ,t majd 0,3 mól nátrium acetáttal és két térfogat etanollál kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással kinyerjük, majd ,10 mmól TE pufferben oldjuk (Sambrook et al. , 1989). A DNS-t 3,0 %-os alacsony olvadáspontu agaróz « ·
- 41 gélen elektroforetizáljuk, majd a szintetikus gént tartalmazó csikót kivágjuk és a pBluescript plazmid (Stratagene) EcoRl helyére ligáljuk. A ligáló elegyet
E. coliba t ranszf ormáljuk ,rna jd olyan telepeket választunk ki, amelyek feltehetően megfelelő szerkezetűek, ezeket restrikciós enzimes elemzéssel, majd DNS szekvenálással vizsgáljuk. Egy konstrukciót választunk ki, ennek jele pBSlypep3, amelyről megállapítható, hogy a megfelelő szekvenciát tartalmazza, és ezt használjuk a további munkákban,
B, 5* határoló szekvencia és sziqnál-peptid hozzáadása a pBSlypep3 plazmidhoz
A PR-1a gén leader - és szignál-szekvenciáját adjuk hozzá a szintetikus génhez, egy PCR alapú in vitro génfuziós technikát alkalmazva (Ho et al. , 1989). E szerint a technika szerint a génfuziót in vitro hajtjuk végre olymódon hogy két, átlapoló véggel rendelkező fragmentet állítunk elő PCR technikával. Egy ezt követő reakcióba ezt a két fragmentet fuzionáltatjuk, ismét PCR technika alkalmazásával, igy hozunk létre tökéletes fúziót a két molekula között. Ezt a stratégiát használjuk a PR-1a szignál-peptichek és leader szekvenciának a litikus peptidet kódoló szekvenciához való illesztésére. Ennek a fúziónak a végrehajtásához négy oligonukleotidot szintetizálunk és tisztítunk a fentiek szerint, jelük SEO ID N0:4, SEO ID NO:5, SEO ID NO:6, SEO ID N0:7.
• 4 ···· ·4♦· •4 ·· · · · ·· * · · ·· · ···
4 4 4·
4·· »«« * · ···
- 424
A hármas (SEO ID N0;4) és a négyes (SEO ID N0:5) oligonukleotidok egymással komplementerek, és a PR-1a szignál és leader-szekvencia valamint a litikus pepiidet kódoló szekvencia közötti fúzióhoz szükséges DNS szekvenciát tartalmazza. A kivánt fúziót az alábbiakban mutatjuk be (SEO ID N0;8),
Az ötös oligonukleotid (SEO ID N0:6) szekvenciája megegyezik a PR-1a cDNS 5’ végével, és egy EcoRI restrikciós helyet kódoló szekvencia 5* végét tartalmazza.
A hatos oligonukleotid (SEO ID N0;7) komplementer a 3, litikus peptidet kódoló szintetikus gén 3* végével, és tartalmaz egy EcoRI helyet az 5' végen.
Abból a célból, hogy két DNS-da rabot fuzionáltassunk egymással, két POR reakciót állítunk fel. Az egyik a hármas oligonukleotidot (SEO ID N0:4) és a hatos oligonukleotidot (SEO ID N0:7) használja primerként és a pBSLypep3 plazmidot templátként, a másik a négyes oligonukl.eotidot (SEO ID N0;5) és az ötös oligonukleotidot (SEO ID NO;6) használja primerként, valamint a pBS-PR1013Gla (ATCC 40426) plazmidot templátként. A PCR reakciókat GeneAmp kit (Perkin Elmer/Cetus) felhasználásával hajtjuk végre, a gyártó előírásai szerint, A PCR termékeket agaróz gélelektroforézissel analizáljuk. Ezeket azután megtisztít43 juk, és mindegyikből egy alikvot részt használunk fel egy második PCR reakcióban. Ebben a reakcióban az ötös oligonukleotidot (SEO ID NO;6) és a hatos öligonukleotidot (SEO ID N0:7) használjuk inditó molekulaként a termék amplifikálására, Ilymódon a két DNS darab az előzőekben elmagyarázott módon, előre meghatározottan fuzionál, A reakció termékét ezután agaróz gélelektroforézissel elemezzük, A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd bepároljuk és EcoRl restrikciós enzimmel emésztjük. Az igy kapott DNS-t elektroforézissel tisztítjuk alacsony olvadáspontu agaróz gélen, majd pBluescript plazmidba ligáljuk, amelyet EcoRl restrikciós enzimmel emésztünk és CIAP-pal kezelünk, A DNS-t E,coliba transzformáljuk a transzformánsokát kiszelektáljuk, A megfelelő plazmid konstrukciókat restrikciós emésztéssel választjuk ki, és a feltételezett szerkezetet DNS szekvenálással igazoljuk. Egy ilyen konstrukció jele pBSLP5'PR1, ezt használjuk a további kísérletekben,
C, A litikus peptid génjének klónozása egy dupla-. 35S expressziós vektorba
Az 5’ leader szekvenciával és egy szignál pepiiddel rendelkező szintetikus peptid-gént a pCGN176l növényi expressziós vektorba szubklónozzuk (ampicillin rezisztenciát tartalmazó dupla CaMV 35S promoter/terminátor kazetta).
• · · *
A PCGN1761 tartalmaz egy dupla CaMV 35S promotert és a tm-1 3’ régiót, a kettő között egy EcoRI réstrikciós hasítási hellyel, egy pUC-ból származó plazmid láncban. A promoter-EcoRl-3’ processzáló hely kazettát többszörös restrikciós hasítási helyek veszik közre, hogy könnyen eltávolítható legyen. A plazmid számos egymás utáni lépésben származik (lásd lejjebb) egy kiindulási dupla 35S plazmidból, a pCGN2113-ból, amely a pCGN164 és pCGN638 plazmidból származik.
A pCGNl431 is tartalmazza a dupla CaMV 35S promotert és a tm-1 3' régiót, közöttük egy többszörös klónozó helylyel. Ez a promoter/terminátor kazetta egy pUC eredetű vektorban van, amely az ampicillin rezisztencia gén helyett egy kloramfenikol rezisztencia gént tartalmaz, A kazettát a könnyű eltávolithatóság céljából többszörös restrikciós hasítási hely határolja,
a) A pCGN986 előállítása
A pCGN986 tartalmaz egy 35S CaMV promotert és egy T-DNS tm-1 3' régiót, közöttük többszörös restrikciós hasítási hellyel. A pCGN986 egy másik plazmidból a pCGN206 Pl azmidból származik, amely egy CaMV 35S promotert és egy. eltérő 3' régiót, a CaMV VI-os régió 3' végét tartalmazza, A CaMV 35S pomotert egy Alul fragment.forrnájában klónozzuk (7144-7734 bp méretű) EGardner et al, , 19811 az Mi3mp7 • * · ·*· ··· • · · · · ♦·♦ ·♦· · ·· ·· plazmid HincII helyére [Messing et al. , 19811 , igy állítjuk elő a C614 plazmidot. A C614 EcoRl restrikciós enzimmel végzett hasítása a 0614-ből egy olyan EcoRl fragmentet eredményez, amely a 35S promotert tartalmazza, és ezt klónozzuk a pUC8 hasítási helyére [Vieira and Messing, 19821, igy állítjuk elő a pCGNl47-et.
A pCGNl48a-t, amely egy promoter régiót, szelektálható genetikai bélyeget (kanamicin, 2 ATG-vel) és 3‘ régiót tartalmaz, úgy állítjuk elő, hogy a pCGN528 plazmidot BglII restrikciós enzimmel emésztjük, majd ide beépítjük a pCGNl47 plazmidból származó BamHI-BglII promoter fragmentet. Ezt a fragmentet klónozzuk a pCGN528 BglII hasítási helyére, igy a BglII hely közvetlen szomszédja a pCGN528 kanacimin génjének.
Az ennek a konstrukciónak az elkészítésében használt ingázó vektort, a pCGN528-at az alábbiak szerint készítjük el: a pCGN525-öt úgy állítjuk elő, hogy egy kanamicin rezisztencia gént hordozó Tn5 transzpozont (Gorgensen et al., 1979) tartalmazó plazmidot HindIII-BamHI restrikciós enzimmel emésztünk, majd a kanamicin rezisztencia gént tartalmazó HindlII-BamHI fragmentet beépítjük a pACYC184 plazmid (Chang and Cohen, 1978) tetraciklin rezisztencia génjének HindlII-BamHI hasitási helyére; a pCGN526 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a Smal helyre beépített ··
- 46 Xhol linkerekkel módosított pTiA6 plazmid (Thomashow -et al. , 1980) 19-es BamHI fragmentjét a pCGN525 plazmid BamHI hasítási helyére építjük be. A pCGN528-at úgy állítjuk elő,hogy a kis Xhol fragmentet kivágjuk, majd összeligáljuk.
A pCGNl49-et úgy állítjuk elő, hogy a pMB9KanXXI plazmid BamHI kanamicin rezisztenciát tartalmazó fragmentjét a pCGN148a plazmid BamHI restrikciós hasítási helyére építjük be. A pMB9KanXXI plazmid egy pUC4K variáns (Vieirra and Messing, 1982), amelyből hiányzik az Xhol restrikciós hasítási hely, de tartalmaz egy Tn903 eredetű kanamicin rezisztencia gént, amely lehetővé teszi Agrobacterium-ban a hatékony szelekciót.
A pCGNl49-et Hindin és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd Hindin és BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pUCB-ba ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGNl69-et, Ezzel eltávolítjuk a Tn903 kanamicin rezisztencia bélyeget. Mind a pCGN565-öt , mind a pCGN169-et HindlII és PstI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd összeligáljuk, igy hozzuk létre a pCGN203 plazmidot, amely tartalmazza a CaMV 35S promotert, és a Tn5 kanamicin rezisztencia gén 5' részét (egészen a PstI hasítási helyig, üorensen et al. , 1979). A pCGN2O3-hoz egy 3' szabályozó régiót adunk a pCGN204-ből (ez a CaMV-nek egy EcoRI fragmentje (408-6105 -ős bázisok), amely tartalmazza a VI-os gén 3* régióját a pUC18-ba szubklónozva (Gardner et al., 1981), HindlII ·«·
- 47 és PstI restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel valamint ligálással. A kapott expressziós kazetta a pCGN206 plazmidban, ez az alapja a pCGN986 plazmid elkészítésének.
A pTiA6 T-DNS tm-1 3' szekvenciáit szubklónozzuk a Bam 19 T-DNS fragmentből (Thomashow et al. , 1980) egy BamHI-EcoRI fragment formájában (Barker és munkatársai (1983) számozása szerint a 9062-12823 nukleotidők), majd a pACYCl84 plazmid (Chang and Cohen, 1978) EcoRI-HindlII fragmentjén található replikációs fragmenttel, és a pLB4 plazmidból származó gentamicin reziszentcia genetikai bélyeggel (BamHI-HindlII fragment) egyesitjük, igy kapjuk a PCGN417 plazmidot.
A pCGN4l7 plazmid egyedülálló Smal helyét (a Bam fragment 11207-es nukleotidja) SacI hellyé változtatjuk linkerek segítségével, majd a BamHI-SacI fragmentet a pCGN565-be szubklónozzuk, igy állítjuk elő a pCGN971 plazmidot. A pCGN97l plazmid BamHI hasítási helyét linkerek segítségével EcoRI hasítási hellyé változtatjuk, igy kapjuk a pCGN97lE plazmidot. A pCGN971E-ből kapott EcoRI-SacI fragmentet, amely tartalmazza a tm-1 3* szabályozó szakaszait, a pCGN206-hoz kapcsoljuk EcoRI és SacI emésztés után, igy kapjuk a pCGN975 plazmidot. A Tn5 kanamicin rezisztencia gén egy kis részét kivágjuk a CaMV 35S promoter 3* végéből, Sáli és BglII hasítást alkalmazva, a végeket tompává alakítva, majd Sáli linkerekkel ligáivá. A végső pCGN986 expressziós kazetta tartalmazza a CaMV 35S promotert, amelyet két Sáli, egy-egy Xbal, BamHI, Smal, KpnI restrikciós hasítási hely követ, és a tm-1 3' régiója (a T-DNS 112 07-9023-as nukleotidjai).
b) A PCGN164 plazmid előállítása
A CaMV Alul fragmentjét (7144-7735-ös bázispár) (Gardner et al. , 1981) Alul restrikciós enzimes emésztéssel állítjuk elő, majd a M13mp7 (Vieira and Messing, 1982) HincII restrikciós hasítási helyére klónozzuk, igy kapjuk a C614 plazmidot. A C614 plazmid EcoRI-es emésztésével kapunk egy olyan EcoRI fragmentet, amely tartalmazza a 35S promotsrt, ezt pedig a pUC8 (Vieira and Messing, 1982) EcoRI hasitási helyére klónozzuk, igy kapjuk a pCGNl46 plazmidot. A promoter régió megrövidítése céljából a BglII hasitási helyet BglII enzimmel emésztjük, majd Bal31 enzimmel kezeljük, végezetül egy BglII linkért kapcsolunk a Bal31-gyel kezelt DNS-hez , igy kapjuk a pCGNl47 plazmidot. A pCGNl47 plazmidot EcoRI és Hphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott EcoRI-Hphl fragmentet, amely tartalmazza a 35S promotert, az EcoRI-Smal restrikciós enzimekkel emésztett M13mp8 (Vieira and Messing, 1982) vektorba klónozzuk.
c) A pCGN638 előállítása
A CaMVlO (Gardner et al. , 1981) BglII restrikciós enzimmel való emésztésével egy olyan BglII fragmentet kapunk, amely tartalmazza a 35S promoter régiót (6493-7670), ezt a fragmentet a pUC19 (Norrander et al., 1983) BamHI restrikciós hasitási helyére klónozzuk, igy kapjuk a pCGN638-at.
d) A PCGN2113 előállítása
A pCGN164 plazmidot EcoRV és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, a keletkező EcoRV-BamHI fragment tartalmazza a 35S promoter egy részét (7340-7433-s bázispárok): a pCGN638-at Hindin és EcoRV enzimekkel emésztjük, az igy kapott HindlII-EcoRV fragment a 35S promoternek egy másik részét tartalmazza (a 6493-7340-es bázispárokat). Ezt a két fragmentet ligáljuk a pCGN986 plazmidba, amelyből a Hindin és BamHI emésztéssel eltávolítjuk előtte a 35S promotert tartalmazó HindlII-BamHI fragmentet; ennek a ligálásnak az eredménye a pCGN639 plazmid, amely tartalmazza a pCGN986 láncát és a tm-1 3* régiót, valamint a pCGN164 és pCGN638 plazmidból származó két 35S promoter fragmentet. A pCGN638 plazmidot EcoRV és Ddel restrikciós enzimmel emésztjük, igy kapjuk a 35S promotert tartalmazó fragmentet (a 7070-7340-es bázispárokat); a fragmentet a DNS polimeráz I Klenow fragmentjével kezeljük tompa ··· · • · · ······ • · · · · ··· ·· · · ·· ·«
- 50 végek előállítása céljából, majd a pCGN639 EcoRV helyére ligáljuk, igy kapjuk a pCGN2H3-at, amelyben a fragment a helyes orientációban található.
e) A PCGN1761 előállítása
A pCGN2í13 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a plazmidot egy Xbal és egy BamHI restrikciós hasitási helyet tartalmazó szintetikus adapter molekula (az adapter EcoRI tapadós végeket tartalmaz mindkét végén, de a szomszédos bázisok olyanok, hogy ezen a helyen nem rekonstruálódik egy EcoRI hely) jelenlétében ligáljuk, igy kapjuk a PCGN2113M plazmidot. A pCGN2H3M plazmidot ezután teljesen megemésztjük SacI restrikciós enzimmel,majd részlegesen emésztjük BamHI restrikciós enzimmel. Ezt a DNS-t ezután T4 DNS polimerázzal kezeljük tompa végek előállítása céljából, majd egy EcoRI linkért ligálunk a tompavégü plazmidba. Transzformálás után egy olyan plazmid kiónt szelektálunk, amely egy egyedülálló EcoRI helyet tartalmaz a promoter és az érintetlen tm-1 3* régió között, ennek a jele pCGN1761.
A pBSLP5*PRl flazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a litikus peptid génjét és a PR-1a szignál/leader peptidet kódoló szakaszt tartalmazó 200 bp méretű fragmentet alacsony olvadáspontu agaróz gélből izolál- • Ί · ······ • · · · · ··· ··· · · * ·· juk. Ezt a fragmentet a pCGNl76l plazmidba ligáljuk, amelyat előtte EcoRI restrikciós enzimmel kezeltünk, CIAP-vel kezeltünk, és szintén alacsony olvadáspontu agaróz gélből izoláltunk, A ligáló reakcióelegyet használjuk Escherichia coli transzformálására, a transzformánsokat szelektáljuk, majd meghatározzuk, hogy tartalmazzák-e az inszertet. Két különböző tipusu transzformánst kapunk, amelyek a litikus peptid génjének orientációjában különböznek egymástól. Az egyik típust, amelyben a gén a promoterhez viszonyítva a helyes orientációban van, kiszelektáljuk, majd számos plazmidban ellenőrizzük DNS szekvenálással a helyes szerkezetet. Az egyik plazmidnak, amely a megfelelő orientációval és a várt DNS szekvenciával rendelkezik, a pBS2X35SLytPep jelölést adjuk, és a további kísérletekben használjuk,
D, A 2X35S CaMV/litikus peptid expressziós kazetta szubklónozása egy binér vektorba
Az expressziós kazettát a pCGN1540 binér növényi transzformációs vektorba szubklónozzuk, amely az A,tumefaciens oktopin Ti-plazmid pTIA6 bal és jobboldali T-DNS határait tartalmazza (Currierr and Nester, 1976), a pPHiül gentamicin rezisztenciát kódoló gént (Hirsch and Beringer, 1984), egy A. rhizogenes Ri plazmid replikációs origót a pLJB11 plazmidból (CJouanin et al, , 1985),
a pTiA6 plazmid más promoter régióját és a más 3' régiót a Tn5 kanamicin rezisztencia génnel együtt (□orgensen et al., 1979), a ColEI replikációs origót a pBR322 plazmádból (Bolivár et al. , 1977), valamint a lacZ* szelektálható genetikai bélyeget a pUC18 plazmidból (Norrander et al., 1983). A pCGN1540 plazmid lánca, amely a gentamicin rezisztencia gént és az Ri valamint ColEI replikációs origót tartalmazza, a pCGN1532 plazmidból származik (lásd az alábbiakban). A Ti határoló szekvenciák és a növényi szelektálható gén (más 5*-kan-mas 3*) a pCGNl537 plazmidból származik: a szelektálható növény marker kazettát viszont a pCGNl536 plazmidból vesszük, mig a jobboldali határoló szakasz és a lacZ' fragmentek a pCGN565RBx2X plazmidból, a baloldal határoló szakasz pedig a pCGN65 plazmidból származik.
a) A pCGN1532 előállítása
A gentamicin rezisztencia gént tartalmazó 3,5 kb méretű EcoRI-PstI fragmentet eltávolítjuk a pHhlüi plazmidból (Hirsch and Beringer, 1984) EcoRI-PstI restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel, majd EcoRI-PstI restrikciós enzimekkel emésztett pUC9 plazmidba klónozzuk (Vieira and Messing, 1982), igy állítjuk elő a pCGN549 plazmidot. ApCGN549 plazmid HindlII-Pstl. restrikciós enzimekkel végzett emésztése egy 3,1 kb méretű t
- 53 fragmentet eredményez, amelyen található a gentamicin rezisztencia gén, ezt tompa végűvé tesszük a DNS polimeráz I Klenow fragmentjével kezelve, és PvuII restrikciós enzimmel emésztett pBR322 plazmidba klónozzuk (Bolivár et al. , 1977), igy állítjuk elő a pBR322Gm plazmidot, A pGGM322Gm plazmidot Dral és Sphl enzimekkel emésztjük,, Klenow fragmenttel kezeljük a tompa vég előállítása céljából, majd a 2,8 kb méretű fragmentet az Ri replikációs origót tartalmazó pLJbBI1 plazmidba klónozzuk (Douanin et al, , 1985), amelyet Apai enzimmel emésztettünk és Klenow enzimmel tettünk tompavégüvé, igy állítjuk elő a pLHbBllGm plazmidot. Az extra ColEI replikációs origót és a kanamicin rezisztencia gént BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztéssel távolitjuk el a pLHbBUGm plazmidból, majd a maradékot önmagával összezárjuk, igy kapjuk a pGMB11 plazmidot, A pGMB11 plazmid Hindii restrikciós haeitási helyét Hindii restrikciós enzimes emésztéssel, majd azt követően Klenow enzimes kezeléssel távolitjuk el, utána összezárjuk a plazmidot, igy kapjuk a pGmB11-H plazmidot. A pGmB11-h plazmid PstI hasítási helyét PstI restrikciós enzimes emésztéssel,majd ezt követően Klenow enzimes kezeléssel távolitjuk el, utána összezárva a plazmidot kapjuk a pCGN1532 plazmidot.
- 54 b) A PCGN1536 plazmid előállítása
Az 5.4 kb méretű EcoRI fragmentet EcoRI restrikciós enzimes emésztéssel eltávolítjuk a pVK232 plazmidból (Knauf and Nester, 1982), és EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pACXC184 plazmidban klónozzuk (Chang and Cohen, 1978), igy állítjuk elő a pCGNl4 plazmidot. A pCGN14 plazmid 1434 bp méretű Clal-Sphl fragmentjét, amely a más 5' régióját tartalmazza (a 20128-21562-es bázispárokat, Barker et al. számozása szerint, 1983), Acc-Sphl restrikciós enzimekkel emésztett PUC19 plazmidba’ klónozzuk (Yanisch-Perron et al., 1985), igy állítjuk elő a pCGN50 plazmidot, A más 5' régiónak egy 746 bp méretű EcoRV-Nael fragmentjét egy Xhol hellyel helyettesítjük, a pCGN40 plazmidot EcoRV és Nael restrikciós enzimekkel emésztve, és szintetikus Xhol linker jelenlétében ligáivá, igy állítjuk elő a pCGNlO36 plazmidot. A pCGN14 765 bp méretű Sst-HindlII fragmentjét (18474-19239-es bázisok), amely tartalmazza a más 3* régióját, Sstl-HindlII emésztett pUCl8 vektorba (Norrander et al. , 1983)klónozzuk, igy kapjuk a pCGN43 vektort. A pCGN43 vektor Hindin hasítási helyét egy EcoRI hellyel helyettesítjük olymódon, hogy HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, tompa végeket hozunk létre Klenow enzimes kezeléssel, majd szintetikus EcoRI linker DNS-t ligálunk bele, igy hozzuk létre a pCGNlO36 vektort. A pCGNlO34 vektor 767 bp méretű EcoRI fragmentjét az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pCGN1036 vektorba klónozzuk, olyan orientációban, amely • * ···· #· ·« ·· ·· · · · Λ · • · · ··· ·· • · ♦ · · ’»· ··· · ·· ·· lehetővé teszi, hogy a más 3’ 19239 bázispár régiója a mag 5’ régiójának közvetlen közelébe kerüljön, igy állítjuk elő a pCGN1ű40 vektort. A pCGN1ű40 plazmidot SstI enzimmel végzett részleges emésztésnek vetjük alá, a tompa végek előállítása céljából T4 DNS polimerázzal kezeljük, majd Xhol szintetikus linker DNS jelenlétében összeligáljuk, egy olyan kiónt váheztunk ki, amelyben csak a 18474-es bázis és a vektor DNS közötti SstI hasitási helyet (a pCGN43ban állítottuk elő, és a pCGNl040-be vittük be) helyettesítettük Xhol restrikciós hasitási hellyel, igy állítjuk elő a pCGNlO47 plazmidot. A pCGN565 vektort (lásd fent) EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel emésztjük, majd Klenow enzimmel kezelve tompa végeket állítunk elő és szintetikus Xhol linker DNS jelenlétében ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGNlOO3 vektort; ezáltal helyreállítjuk az Xhol linkercel szomszédos EcoRI hasitási helyet. A pCGNlOO3 vektort EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel tompavégüvé tesszük, majd szintetikus PstI linker DNS jelenlétében ligáivá állítjuk elő a pCGNlOO= vektort.
A pCGN1ű47 vektor 1,5 kb méretű Xhol fragmentjét, amely tartalmazza a más 5' és 3' régiót, közöttük többszörös klónozási hellyel, az Xhol restrikciós enzimmel emésztett PCGN1007 vektorba ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGNlO52 vektort.
A pCGNlO52 vektor többszörös klónozási helyének egy részét Xbal és SstI restrikciós enzimekkel emésztve el* 9 9999 9999 ·· ·· 9 9 9 99 :9 9 999999
9 99
999 99· 9 999·
- 56távolitjuk, Klenow fragmenttel tompavégüvé tesszük, majd összeligálva állítjuk elő a pCGNlO52J*XS vektort. A pCGN55O vektor (a pCGN783 leírása) 1 ATG kanamicin rezisztencia gént tartalmazó 1 kb méretű EcoRI-Smal fragmentjét EcoRI-Smal restrikciós enzimekkel emésztett Bluescript M13-KS vektorba ligáljuk (Stratagene, Inc,), igy állítjuk elő a pBSKm vektort; ez a plazmid tartalmaz egy M13 régiót, ami lehetővé teszi az egyszálu DNS keletkezését. Az egyszálu DNS-t az előállító utasításai szerint állítjuk elő, majd in vitro mutagenezist végzünk rajta (Adelman et al. , 1983), a SEQ ID NO:14 jelű szintetikus oligonukleotid felhasználásával, ezáltal a kanamicin rezisztencia génben lévő PstI hasítási helyet megszüntetjük, ezáltal a génbe nem vág bele a PstI enzim, igy állítjuk elő a pCGNl534 vektort. A pCGNl534 vektort Smal restrikciós enzimmel emésztjük, majd szintetikus EcoRI linker DNS jelenlétében ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGN1535 vektort, A pCGNl536 vektor 1 kb méretű EcoRI fragmentjét EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pCGN1 0526<TXS vektorba ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGN1536 más 5' - kan - más 3*, növényi szelekciós markar kazettát.
c) A pCGN565RAx2X vektor előállítása
A pCGN45l vektort (lásd a pCGN783 leírását) Hpal restrikciós enzimmel emésztjük, majd szintetikus Sphl linker DNS jelenlétében összeligálva állítjuk elő a pCGN55 vektort.A pCGN55 vektor Xhol-Spol fragmentjét (13800-15208 bázisok, amelyek tartalmazzák az A,tumefaciens T-DNS jobboldali határoló szakaszát; Barker et al. , 1983) Sall-Sphl restrikciós enzimekkel emésztett pUCl9 vektorba (Yanisch-Perron et al,, 1985) klónozzuk, igy állitjuk elő a pCGN60 vektort. A pCGN60 vektor 1 ,4 kb méretű HindlII-BamHI fragmentjét Hind III-BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pSP64 vektorba (Promega, Inc.) klónozzuk, igy állitjuk elő a pCGN1039 vektort. A pCGN1039 vektort Smal és Nrul restrikciós enzimekkel emésztjük (ezzel kivágjuk a 14273-15208-as bázisokat; Barker et al., 1983), majd a szintetikus BglII linker DNS jelenlétében összeligélva kapjuk a pCGNl039 NS vektort. A pCGNl039 NS vektor 0,47 kb méretű EcoRI-HindlII fragmentjét az EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel emésztett pCGN565 vektorba klónozzuk (lásd a pCFN783 vektor leírásánál), igy állitjuk elő a pCGN565RB vektort, A pCGN565RB vektor Hindin restrikciós helyét egy Xhol restrikciós hasítási hellyel helyettesítjük, olymódon, hogy HindlII enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd szintetikus Xhol linker DNS jelenlétében összeligáljuk, igy állitjuk elő a pCGN565RB-H+X vektort, A pUC18 vektort (Norander et el,, 1983) Haell enzimmel emésztjük a lacZ* fragment eltávolítására, majd a lacZ* fragment eltávolítására, majd a lacZ* fragmentet a pCGN565RB-H+X vektorba klónozzuk - a plazmidot előtte AccI és Sphl reetrikciós enzimekkel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük a tompa végek előállítása céljából • · · • · ·· ··
- 58 olyan orientációban, hogy a lacZ' promoter közvetlen szomszédja legyen a jobboldali határoló szekvenciának. Ebben a konstrukcióban a pCGN565RBx2x plazmid megfelelő gazdaszervezetben szélesztvs pozitív a lacZ' expresszióra nézve, és a jobboldali fragmentből (Barker et al., 1983) tartalmazza a 13990-14273 fragmentet, amelyből kivágták az Accl-Sphl fragmentet (13800-13990-es bázisok).
d) A pCGN65 plazmid előállítása
A pCGN50i plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pTiA6 plazmid (Currier and Nester, 1976) 1,85 kb méretű EcoRI-Xhol restrikciós fragmentjét, amely a T-DNS (jobboldali határoló szakasz 13362-15208-as bázisait tartalmazza (Barker et al,, 1983) Ecol-Sall restrikciós enzimekkel emésztett Ml3mp9 (Vieira and Messing, 1982) vektorba klónozzuk, A pCGN502 vektort úgy állitjuk elő, hogy a pTiA6 plazmidnak egy 1,6 kb méretű HindlII-Sall fragmentjét, amely a T-DNS (baloldali határoló szakasz) 602-2212-es bázisait tartalmazza, HindlII restrikciós enzimmel emésztett Ml3mp9 vektorba klónozzuk. Mind a pCGN50i, mind a pCGN502 vektort megemésztjük EcoRl és HindlII restrikciós enzimekkel, majd mindkét T-DNS fragmentet együtt beleklónozzuk HindlII restrikciós enzimmel emésztett pUC9 vektorba (Vieira and Messing, 1982), igy kapjuk a pCGN5Ű2 vektort, amely mindkét T-DNS határoló szakaszt tartalmazza, A pCGN503 vektort HindlII és EcoRl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kelet• * · ·
- 59 kező két HindlII-EcoRI fragmentet (amelyek a T-DNS határoló szakaszait tartalmazzák) EcoRI.restrikciós enzimmel emésztett pHC79 vektorba (Hohn and Collins, 1980) klónozzuk, igy kapjuk a PCGN518 vektort. A pCGN518 vektor KpnI-EcoRI fragmentjét, amely a T-DNS baloldali határoló szakaszát tartalmazza, KpnI és EcoRl restrikciós enzimekkel emésztett pCGN565 vektorba klónozzuk, igy kapjuk a pCGN580 vektort. A pCGN580 vektor BamHI-BglII fragmentjét a pAXYC184 vektor (Chang and Cohen, 1978) BamHI hasítási helyére klónozzuk, igy állítjuk elő a pCGN51 vektort. A pCGN60 vektor 1 ,4 kb méretű BamHI-Sphl fragmentjét (lásd az előzőekben a pCGN65x2x részt), amely a T-DNS jobboldali határoló szakaszát tartalmazza, a BamHI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztett pCGN51 vektorba klónozzuk, igy állítjuk elő a pCN65 vektort,
a) A PCGN1537 vektor előállítása
A pCGN65 vektort KpnI és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, Klenow enzimmel kezeljük a tompa végek előállítása céljából, majd szintetikus BglII linker jelenlétében ligáivá állitjuk elő a pCGN65 KX vektort. A pCGN65<Jkx vektort Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow enzimmel kezeljük a tompa végek előállítása céljából, majd szintetikus Xhol linker DNS jelenlétében ligáljuk, igy állitjuk elő a pCGN65dkX-S+X vektort. A pCGNRRBx2x vektor 728 bp méretű BlII-XhoI restrikciós fragmentjét, amely a T-DNS
jobboldali határoló szakaszát és a lacZ* gént tartalmazza, a BglII és Xhol restrikciós enzimekkel emésztett pCGN65 KX-S+X vektorba klónozzuk, helyettesítve a pCGN65x2x vektort, A pCGN65x2x Clal restrikciós fragmentjét kivágjuk, és Xhol linkerrel helyettesítjük, olymódon, hogy a vektort Clal restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow enzimmel kezeljük a tompa végek előállítására, majd szintetikus Xhol linker DNS jelenlétében ligáljuk, igy állítjuk elő a pCGN65^2XX vektort. A pCGN65<í2XX vektort BglII restrikciós enzimmel emésztjük, majd BglII restrikciós enzimmel emésztett pCGN549 vektorral fuzionáltatjuk (lásd a pCGN1532 leírását), igy állítjuk elő a pCGNl530 vektort, amely mindkét plazmid láncot tartalmazza, A pCGN1539 vektort Xhol enzimmel emésztjük, majd újra összeligáljuk, majd egy gentamicin rezisztens, kloramfenikol érzékeny kiónt választunk ki, amelyből kivágtuk a PACYC184 eredetű DNS láncot. A pCGN1536 vektor 2,43 kb méretű Xhol fragmentjét, amely a más 5*-kan-mas 3* kazettát tartalmazza, az Xhol restrikciós enzimmel emésztett pCGNl53QA vektorba klónozzuk, igy állítjuk elő a pCGNl537 vektort,
f) A pCGNl54O végső összeállítása
A pCGN1537 vektor Bili fragmentjét, amely a növényi szelekciós markert és a lacZ* szelekciós markert és a lacZ* szelekciós markert tartalmazza (többszörös klónozási hellyel), mindegyiket a T-DNS határoló szakaszok között.
- 61 BamHI restrikciós enzimmel emésztett pCGN1532 vektorba klónozzuk. Azt a kiónt, amelyben a T-DNS jobboldali határoló szakasza a pBRR322 replikációs origó közvetlen szomszédságában van, pCGN1539 jelzéssel látjuk el, és azt a kiónt, amelyben a T-DNS jobboldali határoló szakasza az Ri plazmid replikációs origója közvetlen közelében van, PCGN154O jelzéssel látjuk el. Ez a bifunkciós vektor számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik, beleértve azt, hogy minimális mennyiségű DNS van a T-DNS határoló szakaszai között, nagyon stabil Agrobacterium gazdaszervezetekben, nagy kópiaszámmal rendelkezik E.coli gazdaszervezetekIt ben, és egy kék/fehér szelekciós lehetőséggel rendelkezik, többszörös hasítási hellyel, a cél-DNS könnyű klónozása érdekében.
A vektort az ATCC-nél helyeztük letétbe (ATCC 40586). A pBS2X35LytPep vektor Xbal fragmentjét, amely e litikus peptid génjét tartalmazza, a pCGN1549 Xbal restrikciós helyére szubklónozzuk olymódon, hogy a promoterfrag\ ment a növényi szelekciós marker közvetlen szomszédságába kerüljön. Ennek a plazmidnak a jele pBSBin2X35SLytPep, és ezt választjuk a további kísérletekhez.
E) Az Agrobacterium transzformálása
A bifunkciós vektorokat A,tumafaciens LB4404 törzsbe transzformáljuk a következő módszerrel. Az Agro-
- 62 bacterium törzset 30 °C-on növesztjük éjszakán át 5 ml LBMG táptalajban (50 % L táptalaj, 50 % mannitol-glutamát táptalaj (Garfinkel and Nester, 1980), Az 5 ml-es tenyészetet 250 ml LBMG táptalajhoz adjuk, majd alaposan rázatjuk, ameddig a tenyészet sűrűsége eléri az 0D=0,6 értéket 600 nm hullámhosszon mérve, A sejteket ezután lecentrifugáljuk (8000 x g), majd 5 ml LBMG táptalajban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióból 200/ul-t adunk 0,2 -1/ug bifunkciós plazmid DNS LBMG táptalajban készült oldatához, majd a keveréket azonnal lefagyasztjuk szárazjég-etanol fürdőben, 5 perc elteltével a csövet 37 °C-ra helyezzük 5 percre, majd 2 ml LBMG táptalajt adunk hozzá, A szuszpenziót 30 °C-os vízfürdőben tartjuk 2-3 órán át, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük, A sejteket minimális térfogstu LBMG táptalajban szuszpendáljuk, majd szelektív táptalajra visszük ki (LBMG lemezek lOO^ug/ml gentamicinnel kiegészítve). A telepek 2-3 nap elteltével jelennek meg 30 °C-on.
A pBSBin2X35SLytPep plazmidot Agrobacteriumba transzformáljuk, majd a pozitív telepeket kiválasztjuk és Southern biot analízissel azonosítjuk őket, majd növényi transzformációs kísérletekben használjuk.
8, példa
Transzqeníkus növények stabil transzformálása és regenerálása
Növényi szövetet transzformálunk a fentiekben
ismertetett vektorokkal, a szakterületen ismert bár-, mely módszerrel. A DNS molekulák növényi sejtekbe való bejuttatására használt módszerek közé tartoznak például a direkt fertőzés, vagy a növények, növényi szövetek vagy protoplasztok együtt növesztése. A. tumefacienssel (Horsch et al. , 1985; Marton, 1984), vagy a protoplasztok külső DNS-sel való kezelése, (Paszkowski et al., 1984; EP 164575; Shilito et al. , (1985); Potrykus et al, (1985); Lörz et al. , (1985); Fromm et al. (1987); GB 2 140 822 és Negrutiu et al. (1987), vagy polietilén-glikollal (PEG) való inkubálás (Negrutiu et al. , 1987); Mikro-injektálás (Reich et al. , 1986a és b); mikrobelövés (Kiéin et al., 1987).
A. Dohány levélkoronq transzformálása
Agrobacteriumot növesztünk 18-24 órán át glutamát sóoldat táptalajban, melynek pH-ját 5,6-ra állítjuk, és 0,15 % mannitollal, 50 ^ug/ml kanamicinnel, 50/ug/ml spektinomicinnel és 1 mg/ml streptomicinnel egészítjük ki, mielőtt Ο0θθθ=0,2-Γθ hígítjuk ki ugyanabban a táptalajban, amely már nem tartalmazza az antibiotikumokat. A baktériumokat ezután három-öt órán át növesztjük hígítás előtt (°DgQQ=0,2-0,4), majd ezzel oltjuk be a Nicotiana tabacum cv. xanthi leveleiből kivágott 5-7 mm átmérőjű korongokat, majd ezeket aszeptikusán növesztjük GA7 tartályokban, Horsch et al. (1985) módszerének módosításával.
A levélkorongokat Murashige and Skoogs major és minor sókat, 1 mg/ml benziladenint és 1 mg/ml cc-naftol• · ·
-ecetsavat tartalmazó 0,7 %-os agaron tartjuk fenn két napig«mielőtt áttesszük ugyanilyen összetételű táptalaj-
hajtásokat kivágjuk, majd addig szaporítjuk, amig hat növénykezdeményt kapunk a hajtáscsúcsok szaporításával 50/ug/ml kanamicint tartalmazó MS táptalajon, GA7 tartályokban.
ml kanamicint tartalmazó táptalajon meggyökereztetjük, talajra visszük át, majd fitotronban hagyjuk megerősödni őket, mielőtt űvegházba visszük át, a kémiai szabályozó anyagokkal végzett indukció végrehajtására, A virágzás idején a virágokat önmaguk beporzására indukáljuk. A magokat az érés után összegyűjtjük.
B. Transzqenikus dohány kallusz és növény elő- . . állítása
Az Agrobacteriumot használjuk az A.pont szerint a levélkorongokból képződő kallusz transzformálására. A kanamicint tartalmazó MSBN szelekciós táptalajon keletkező kalluszt kallusz növesztő táptalajon tartjuk fenn, amely MS major, minor sókat és Fe-EDTA-t (Gibco // 500-1117; 4,3 g/1), MS vitaminokat, 100 mg/ml mio-inozitolt, 20 g/1 szacharózt, 2 mg/1 naftol-ecetsavat és 0,3 mg/1 * ·
- 65 kinetint tartalmaz.
Azután a kalluszt használhatjuk a transzgenikus növények regenerálására, a kalluszdarabokat MSBN táptalajra átvivő, és az Alpontban leirt módszereket alkalmazva.
C, Répa transzformálása
Az Agrobacteriumot az A.pontban leirt módon növesztjük. A baktériumokat 0,2 - 0,4 ΟΟθθθ értékre hígítjuk, majd a felületén sterilizált répából kivágott korongok beoltására használjuk.
A répa felszíni sterilezése céljából a répát meghámozzuk, majd 20 percre 10 %-os chlorox oldatba áztatjuk, A répákat steril desztillált vizzel leöblítjük, 5 mm-ss darabokra vágjuk, majd az alsó felét fölfelé állítva vizes agarra tesszük. Ezután 20-50/ul baktériumot juttatunk a korongok felszínére.
D. A napraforgó transzformálása
Az Agrobacteriumot az Alpontban leirt módon növesztjük. A baktériumokat 0,2 - 0,4-es OOgQQ-ra hígítjuk, majd a napraforgó növények szárának beoltására használjuk őket az alábbiak szerint:
A napraforgó magokat 10 percre 10 %-os Captan oldatba áztatjuk, majd 10 percre 10%-os chlorox oldatba, végül steril desztillált vizzel öblítjük. A magok héját eltávolítjuk, ma jd a magokat 0,7 %-os vizes agaron csíráztatjuk sötétben három napig, ezután egy LabLine inku-
bátorba helyezzük, amelyben a hőmérsékletet 23 °C-ra állítottuk, a megvilágítás periódusa 12 óra nappal, 12 óra éjszaka. A csiranövényeket egy hétig növesztjük, majd a felső részüket levágjuk, és a baktériumokat a hasított szár-felszinre juttatjuk.
E. A paradicsom transzformálása
Az Agrobacteriumot az A.pontban leirt módon növesztjük. A baktériumokat 0,2 - 0,4-es 0Dg00-ra higitjuk, majd az alábbiak szerint előállított paradicsom csiranövények szárának beoltására használjuk, az alábbiak szerint. A paradicsom magokat 10 percre 10 %-os Captan oldatba áztatjuk, majd 10 percre 10 %-os chlorox oldatba, végül steril desztillált vízzel öblítjük. A magokat 0,7 %-os vizes agaron csíráztatjuk sötétben három napig, ezután egy LabLine inkubátorba helyezzük, amelyben a hőmérsékletet 23 °C-ra állítottuk, a megvilágítás periódusa 12 óra nappal, 12 óra éjszaka. A csiranövényeket egy hétig növesztjük, majd a felső részüket levágjuk, és a baktériumokat a hasított szár-felszinre juttatjuk.
F. A gyapot transzformálása
Az Agrobacteriumot az A.pontban leirt módon növesztjük. A baktériumokat 0,2 - 0,4-es ΟΟ^θθ-τβ higitjuk, majd az alábbiak szerint előállított gyapot sziklevelek beoltására használjuk, az alábbiak szerint:
«·«· »· • · ·
- 67 Λ
A gyapotmagokat 20 percre 10 %-os chlorox oldatba merítjük, majd steril desztillált vízzel öblítjük, A magokat 0,7 %-os vizes agaron csíráztatjuk sötétben, A palántákat egy hétig növesztjük, mielőtt beoltanánk a sziklevelek felszínét a baktériumokkal,
G, A Zea mays Elité beltenyésztett vonal Fűnk 2717 speciális tipusu kalluszának előállítása
A beltenyésztett Zea mays Fűnk 2717 vonal növényeit virágzásig növesztjük üvegházban, majd önmagával beporozzuk. Az éretlen kalászokat, amelyek körülbelül 2-1,5 mm hosszú embriókat tartalmaznak, eltávolítjuk a növényekről,majd 10 %-os Clorox oldatban sterilezzük 20 percig. Az embriókat aszeptikusán eltávolítjuk a magból, majd az embrió tengelyével lefelé DMS táptalajra helyezzük, amely 0,1 mg/1 2,4-D-t, 6 s% szacharózt és 25 mmól L-prolint tartalmaz, 0,24 v% Gelrite-tal (iniciációs táptalaj) megszilárdítva. Miután a növényeket két hétig növesztettük a sötétben 27°C-on, a pajzsocskán növekedő kalluszt eltávolítjuk az embrióról és B5 táptalajra helyezzük (Gamborg et al. , 1968), amely 0,5 mg/ml 2,4-D-t tartalmaz, és 0,24 v% Gelrite-tal van megszilárdítva. A kalluszt kéthetente átoltjuk friss táptalajra. Miután összesen nyolc hét eltelt azután hogy az embriót az iniciációs táptalajra helyeztük, a kallusz speciális típusát azonosítjuk a jellegzetes morfológia alap68 ján.Ezt a kalluszt tenyésztjük tovább ugyanazon a táptalajon. Két hónap elteltével a kalluszt áthelyezzük, és sorozathigitással tenyésztjük N6 táptalajon, amely 2 mg/1 2,4-D-t tartalmaz, és Gelrite-tal van megszilárdítva.
H. A Zea mays Elité beltenyésztett Fűnk 2717 szuszpenziós tenyészetének előállítása
A G.pontban leirt kalluszt összesen legalább hat hónapig tenyésztjük. A tenyésztésre kiválasztott tipusu kallusz viszonylag nem nyálkás, szemcsés és nagyon omlós, úgy hogy folyadék táptalajba helyezve különálló kis sejtaggregátumokra esik szét. Azokat a tenyészeteket, amelyekben az aggregátumok nagy, kiterjedt sejteket tartalmaznak, nem tartjuk meg. A Zea mays elite beltenyésztett fűnk 2717 speciális kalluszából körülbelül 500 mg alikvot részt 125 ml-es Delong lombikban lévő 30 ml N6 táptalajba helyezünk, amely 2 mg/ml 2,4-D-t tartalmaz. Miután egy hétig tenyésztettük 26 °C-on a sötétben egy körkörös rázón (130/perc fordulatszám, 2,5 cm-es kitérés), a táptalajt friss táptalajra cseréljük ki, A szuszpenziót ugyanilyen módon tovább oltjuk egy hét elteltével. Ebben az időpontban megvizsgáljuk a tenyészeteket, és azokat tartjuk meg, amelyek nem tartalmaznak nagy számban kiterjedt sejteket, azokat megtartjuk. Azokat a szuszpen• · · · · ··♦ ··· • · • · · · ziÓ9 tenyészeteket, amelyekben nagy, kiterjedt sejteket tartalmazó aggregátumok vannak, azokat eldobjuk. Az előnyös szövet erősen citoplazmatikus, osztódó sejt-aggregátumokat tartalmaz, amelyek jellegzetesen simább felszínnel rendelkeznek, mint a szokásos sejt-aggregátum típusok. A megtartott tenyészetekben a sejteknek legalább az 50 %-a ezekben a kis aggregátumokban található. Ez a kivánt morfológia, Ezeknek a ezuszpenzióknak nagy a növekedési sebességük, a generációs idő rövidsbb mint egy hét. A szuezpenziós tenyészeteket hetente átoltjuk, 0,5 ml PCV átvitelével (PCV: sejttérfogat, a leülepedett sejtek térfogata egy pipettában) 25 ml friss táptalajba. Miután négy-hat hétig átoldottuk ilymódon, a tenyészetek a havi átoltások során két-, háromszorosra nőnek. Azokat a tenyészeteket tartjuk meg, amelyekben a sejteknek több mint 75 %-a a kivánt morfológiával rendelkezik, ezeket használjuk a további átoltásokhoz, A sejtvonalat úgy tartjuk fent, hogy mindig azt a lombikot választjuk ki tovább tenyésztésre, amelynek a tartalma a legjobb morfológiát mutatja. Néhány szitán szűrtük át a tenyészetet, ezzel növeltük a tenyészet diszperziófokát, de ez nem feltétlenül szükséges.
I. Protoplasztok készítése Zea mays szuszpenziós tenyészetekből
A H.pont szerint előállított szuszpenziós sejt• · · ·· · · · · · • · · ··* ··· • · « · ♦ ······ · ·· ·· tenyészet 1-1,5 ml PCV-jét inkubáljuk 10-15 ml szűréssel sterilezett, következő összetételű elegyben; 4 v% cellulóz RS 1 v% Rhozym-mel KMC-ben (8,65 g/1 KC1, 16,47 g/1 MgCl2.6 H20 és 12,5 g/1 CaClg.HgO, 5 g/1 MES, pH=5,6). Az emésztést 30 °C-on végezzük lassan rázódó asztalon, 3-4 óra hosszat. A preparátumot felületi mikroszkóppal vizsgáljuk, hogy keletkezik-e protoplaszt. A keletkező protoplasztokat a következőképpen gyűjtjük össze: A preparátumot 100/um mesh szitán bocsátjuk át, majd ezt követően egy 50/um mesh szitán. A protoplasztokat az enzimoldat térfogatával megegyező térfogatú KMC oldattal mossuk át a szitákon. 10 ml protoplaszt preparátumot helyezünk minden egyes eldobható centrifugacsőbe, majd 1,5-2,0 ml 0,6 mólos szacharóz oldatot rétegzünk alá (pH=5,6-ra van pufferelve 0,1 v% morfolin-etánszulfbnsavval (MES és KOH). A csövet 60-100 x g-vel centrifugáljuk 10 percig, majd a határrétegben összegyűlő protoplasztokat pipettával összegyűjt jük .majd egy uj csőbe helyezzük. A protoplaszt preparátumot 10 ml friss KMC sóoldatban szuszpendáljuk, majd öt percig 60-100 x g-val centrifugáljuk. A felüluszót eltávolítjuk és elöntjük, majd a protoplasztokat óvatosan felszuszpendáljuk a megmaradt cseppben, majd fokozatosan 10ml 13/14-es erősségű KMC oldatot adunk hozzá. Miután ismét centrifugáltuk öt percig, a felüluszót ismét eltávolítjuk, és a protoplasztokat 6/7 erősségű KMC oldatban szuszpen*· · « ·· ·· • · · • ar * · ·· • · ··· ·♦· · · · ··
- 71 dáljuk. Egy alikvot részt kiveszünk a protoplasztok megszámolására, majd a protoplasztokat ismét leülepitjük centrifugálással. A protoplasztokat 1O> per ml koncentrációban szuszpendáljuk KM-8p táptalajban, vagy 0,5 mól mannitolban, amely 5 mmól MgClg-t tartalmaz, vagy bármely más, a transzformációhoz alkalmas közegben.
□. A Zea mays protoplasztok transzformálása elektroporáclóval
a) A hősokk kivételével az összes lépést szobahőmérsékleten hajtjuk végre (22-28 °C). A protoplasztokat az I.pont utolsó lépésében 0,5 mól mannitolban szuszpendáljuk, amely 0,1 v% MES-t és 6 mmól MgClg-t tartalmaz. Ennek a szuszpenziónak az ellenállását egy Dialóg Elsctroporator (DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf, Németország) kamrájában megmérjük, majd 1-1,2 kQ-ra állítjuk 300 mmólos MgClg oldattal. A protoplasztokat hősokkoljuk olymódon, hogy a mintát tartalmazó csövet 45 °C-os vízfürdőbe merítjük öt percre, majd jégbemártva szobahőmérsékletre hütjük. Ennek a szuszpenziónak 0,25 ml-es alikvot részeihez 4^ug linsarizált plazmidot adunk hozzá, amely egy növényben szelektálható higromicin rezisztencia gént tartalmaz, például olyat, amilyet Rothstein és munkatársai Írtak le (Rothstein et al, , 1987), vagy kiméra génkonstrukciókat és 20^ug borjutimusz hordozó DNS-t. A protoplasztokhoz 0,125 ml 24 v%-os PEG oldatot adunk hozzá (mólsuly 8000) 0,5 mól mannitolban, amely « · ···« ·· ·· ·· ·· ·-»#·» • · « ··»··· • · · · · • · · · ·· · ·· ·· mmól MgClg-t tartalmaz. A keveréket alaposan, de óvatosan megkeverjük, majd 10 percig inkubéljuk. A mintát átvisszük az elektroporátor kamrájába, majd a mintákon három impulzust bocsátunk át 10 másodperces intervallumokban, 1500, 1800, 2300 vagy 2800 Vem’”' kezdeti feszültséggel, és 1 /uszekundumoe exponenciális eltűnési idővel.
A protoplasztokát az alábbiak szerint tenyésztjük. A mintákat 6 cm átmérőjű Petri csészékbe tesszük szobahőmérsékleten. További 15 perc elteltével 3 ml KM-8p táptalajt adunk hozzá, amely 1,2 v% SeaPlaque agarózt tartalmaz, és 1 m/ml 2,4-D-t adunk hozzá. Az agarózt és a protoplasztokát jól összekeverjük, és a közeget hagyjuk gélesedni.
b) Az a) pontbeli eljárást ismételjük meg az alábbi módosítások közül egyet vagy többet alkalmazva:
(1) A protoplaszt preparátum ellenállását 0,5-0,7 kíl-ra állítjuk.
(2) A használt PEG molekulasúlya 4000, (3) Nem adunk hozzá PEG-et, vagy fél térfogat 12 v%-os PEG-et adunk hozzá, (4) Az impulzusokat három másodperces intervallumokban alkalmazzuk.
(5) Az elektroporáció után a protoplasztokat olyan lemezekre szélesztjük, amelyeket 16 °C-ra hütött felületre helyezünk.
(6) Az elektroporációs lépés után a protoplasz- tokat csövekbe helyezzük, 10 ml 6/7-es erősségű KMC oldattal, vagy W5 oldattal (összetétele 380 mg/1 KC1, 18.375 g/1 CaCl2.2H20, 9 g/1 NaCl, 9 g/1 glükóz, pH=6,0) mossuk, majd centrifugálással összegyűjtjük (60 x g, 10 perc) 0,3 ml KM táptalajban szuszpendáljuk, majd az a) pontban leírtak szerint szélesztjük, (7) A borjutimusz hordozó DNS-t nem adjuk hozzá.
K, A Zea mays protoplasztok transzformálása
PEG-es kezeléssel
a) Az I.pont utolsó lépésében kapott protoplasztokat 0,5 mólos mannitol oldatban szuszpendáljuk, amely 12-30 mmól MgCl2-t tartalmaz. Egy ötperces 45 °C-os hősokkot alkalmazunk a □·pont szerint, A protoplasztokat 0,3 ml-es alikvotokban osztjuk szét a transzformáláshoz centrifugacsövekben. A következő 10 percben az alábbiakat adjuk hozzá: DNS (mint a □.pontban) és PEG oldatot tartalmaz, a pH=8-9, KOH-val beállítva), 20 % PEG végkoncentrációban. Az alikvot részeket 30 percig inkubáljuk alkalmankénti enyhe rázással, majd a protoplasztokat Petri csészékbe helyezzük (0,3 ml eredeti protoplaszt szuszpenzió per 6 cm átmérőjű csésze), majd a □.pontban leírtak szerint inkubáljuk.
b) Az a) pontot ismételjük meg, majd a protoplasztokat PEG oldatban végzett 30 perces inkubálás után mossuk 0,3 ml W5 oldat ötszöri, két-három percenkénti hozzáadásával. A protoplaszt szuszpenziót lecentrifugáljuk, a felüluszót eltávolítjuk, majd a protoplasztokat a 3«a) pontban leírtak szerint tenyésztjük.
c) Az a) és b) pontot ismételjük meg, azzal a módosítással, hogy a PEG végkoncentrációja 13 és 25 v% között van.
L. Kallusz regenerálása protoplasztokból
A protoplasztokat agarózban tartalmazó lemezeket sötétbe helyezzük 26 °C-on. 14 nap elteltével telepek keletkeznek a protoplasztokból. A telepeket tartalmazó agarózt átvisszük egy 9 cm átmérőjű Pstri csésze felszínére, amely 30 ml N6 táptalajt tartalmaz, ennek összetétele 2 mg/1 2,4-D, 0,24 v% Gelrite-tal megszilárdítva. Ennek a táptalajnak a jelzése 2N6. A kalluszt tovább tenyésztjük a sötétben 26 °C-on, és a kallusz darabokat minden két hétben átoltjuk friss 2N6 táptalajra.
M, A transzformált Zea mays kallusz szelekciója
Az L.pontot ismételjük meg, azzal a módosítással, hogy 100 mg/1 vagy 200 mg/1 higromicin B-t adunk a 2N6 táptalajhoz, hogy a transzformált sejteket szelektáljuk.
»··· 99 ·♦ • 9 « · *»· «
«·· • 9
- 75 N, A kukorica növények regenerálása
a) A kalluszt fenntartás céljából 2N6 táptalajra helyezzük, majd 0N6 táptalajra (N6 táptalaj, de nincs benne 2,4-D) és N61 táptalajra (N6 táptalaj, amely 0,25 mg/1 2,4-D-t és 10 mg/1 kinetint tartalmaz) a regenerálás iniciálására. Az 0N6 és N61 táptalajokon növekedő kalluszt fényben növesztjük, (napi 16 óra megvilágítás, 840-8400 lx fehér fluoreszcens lámpákból). Az N61 táptalajon növekedő kalluszt 0N6 táptalajra visszük át két hét elteltével, mivel az N61 táptalajon való hosszú idejű tenyésztés káros. A kalluszt minden két hétben átoltjuk, még akkor is, ha a kalluszt ugyanarra a táptalaj-összeételre visszük át. A csiranövények négy-nyolc hét elteltével jelentkeznek. Mihelyt a csiranövények legalább 2 cm magasak, átvisszük GA7 tartályokban lévő 0N6 táptalajra. A gyökerek körülbelül kettő-négy hét alatt alakulnak át, és ha a gyökerek elég erősnek látszanak ahhoz, hogy segítsék a növekedést, akkor a csiranövényeket tőzegedényekben lévő talajra visszük át, az első négy-hét napban fénytől védve őket. Gyakran segít, ha egy tiszta műanyag csészét borítunk az átültetett növényekre két-három napig, hogy a megerősödést elősegítsük. Mihelyt a növények megerősödtek, úgy kezeljük őket mint normál kukorica növényeket és üvegházban teljes kifejlődésig növesztjük. Az utódok nyerése céljából a növényeket önmagukkal porozzuk be, vagy egy vad típussal keresztezzük.
*··· 00 ·*
0 · · · β ··· 990 • · ·
b) Az a) pontot ismételjük meg azzal a módosítással, hogy 100 mg/1 vagy 200 mg/1 higromicin B-t adunk a táptalajhoz, hogy a kalluszt fenntartsuk.
0. Embrioqén szuszpenzió előállítása a Dactylis qlomerata L. (csomóé ebir) Embrioqén szuszpenzióból
a) Embrlogén kalluszt indítunk az űvegházban növesztett csomós ebir növény legfiatalabb leveleiből, Hanning és Conger leírása szerint (1982). A levelek felszínét sterilezzük olymódon, hogy Clorox oldat (5,25 v% nátrium-hipoklorit, The Clorox Company, Oakland, Ca. ) 1:10 arányú hígításába merítjük 10 percre, majd aszeptikusán 1-5 mm hosszú vagy átmérőjű kis darabokra vágjuk. Ezeket a darabokat steril SH-30 táptalajra visszük, amely 0,8 v% agarózt tartalmaz szilárdító anyagként. A kallusz és/vagy embriogén struktúrák a kihelyezés után 2-6 héttel jelennek meg. 25 °C-on tartva a növényeket. Az embriogén kalluszt úgy tartjuk fent, hogy 2-4 hetenként friss SH-30 táptalajra oltjuk át, majd a sötétben 25 °C-on inkubáljuk.
b) Az embriogén szuszpenziós tenyészeteket úgy iniciáljuk, hogy körülbelül 0,5 g friss embriogén kalluszt 50 ml Gray és Conger által leirt (1985) folyadék táptalaj ba visszük át, hidrolizátumot amely 45/umól dicamba-t és 4 g/liter kazein tartalmaz. A szuszpenziós tenyészeteket °C-on növesztjük 16 órás megvilágítással (3300 lx).
»··· «· ·· · 4 « · » • 4 · ··· ··· • · · · · ··· ··· ·> ·· ··
- 77 8 órás sötét periódussal, körkörös rázógépen körülbelül 130/perc fordulatszámmal 125 ml-es Delong lombikban, fémsapkával és parafilmmel lezárva. Körülbelül négy hét elteltével a nagy csomókat hagyjuk leülepedni körülbelül 30 másodpercig, majd a felüluszóból, amely kis sejtcsomókat tartalmaz, 10 ml-es alikvotokat veszünk, és 50 ml friss táptalajba visszük át. Ezt a folyamatot 3-4 hetenként megismételjük, a legjobb tenyészetek felhasználásával, amelyeknek a minőségét annak alapján ítéljük meg, hogy kisebb bennük a csomók mérete, és jobb a minősége, mivel kis, citoplazmatikus sejteket tartalmaz.
5-8 átoltás után.a szuszpenziók lényegében mentesek a nem-embrionális sejtektől, és az embrionális sejtcsomók mérete meglehetősen kicsi (150 - 2000 ^um).
P. D, qlomerata protoplasztok izolálása és tisztítása
Az O.pontban előállított embriogén szuszpenziós tenyészetből állítjuk elő a protoplasztokat olymódon, hogy a sejteket 0,2 mikronos Nalgene szűrőegységen szűrjük át, majd 0,5 g friss sejtet adunk a Petri csészékben lévő protoplaszt - enzim keverék minden 12,5 miéhez. Az enzimkeverék összetétele: 2 v% Cellulase RS, 7 mmól CaCl2.H20, 0,7 mmól Na2HP04.H20, 3 mmól MES (pH= 6,5), glükóz (550 m mOs/kg HgO, pH=5,6), és szűréssel van sterilezve, A keveréket körkörös rázón kevertetjük körülbelül 50/perc fordulatszámmal gyenge fényben (<400 lx), körülbelül 4-5 órán át. Az emésztés után kapott szuszpenziót egy rozsdamentes acél szitán szűrjük át (100 mesh),majd 12 ml-es centrifugacsövekbe tesszük át és körülbelül 60-100 x g-vel centri fugáljuk körülbelül 5 percig. A protoplasztót tartalmazó üledéket ezután háromszor mossuk KM-8p protoplaszt tenyésztő táptalajjal, amelynek a molaritását 550 mOs/kg HgO-ra állítjuk be glükózzal. Ennél a pontnál egy flotációs lépést tehetünk be a protoplasztok további tisztítása céljából. Ebben az esetben a mosott protoplasztokat 10 ml KM-8p tenyésztő táptalajra rétegezzük, amelyben 700 mOs/kg HgO értéket állítunk be szacharózzal. Körülbelül 10 percig centrifugáljuk 60-100 x g-vel, majd a határfelületen összegyűlő protoplasztokat vékony pipettával leszívjuk. Végül a protoplasztokat 1-2 ml KM-8p tenyésztő táptalajban szuszpendáljuk, majd rozsdamentes acél szitán bocsátjuk át (20/um mesh), A keletkezett protoplasztokat összegyűjtjük, mossuk, majd KM-8p táptalajban szuszpendáljuk, hogy a transzformáláshoz ozmotikusán beállított táptalajban tenyésszük,
Q, D-qlomerata protoplaszt tenyészet és a kallusz növesztése
a) A tisztított protoplasztokat körülbelül x 10 protoplaszt per ml koncentrációban kiszélesztjük
KM-8p táptalajban, amely 1,3 v% SeaPlaque agarózt tartalmaz (FMC Corp, , Marino Colloids Division, Rockland, Maine, USA), valamint 30-40 v% kondicionált táptalajt (3-4 hete9 D.glomerata L. embrionális szuszpenziós tenyészetből állítják elő, a táptalajt steril 0,2
Nalgene szűrőn bocsátjuk át a táptalaj ozmolaritását glükóz hozzáadásával 550 mOsm/kg HgO-ra állítjuk be, majd ismét sterilre szűrjük), A lemezeket ezután sötétbe helyezzük állandó 28 °C hőmérsékletre. 10-14 nap elteltével az agarózt ékalakban felvágjuk, majd gyöngy tenyészetbe helyezzük, Shilito et al leirása szerint (1983), 20 ml SH-45 szuszpenziós tenyésztő táptalaj felhasználásával, 3 v% szacharóz/3 ml eredeti agarózba ágyazott tenyészetet alkalmazva. A lemezeket körkörös rázó ra helyezzük, majd körülbelül 50/perc fordulatszámmal rázatjuk fényben, 670 lx megvilágítás mellett. Uj szuszpenziós tenyészetek keletkeznek, amint a telepek kinőnek az agarózból, és kibocsátják a sejteket a folyadék táptalajba. A keletkező szuszpenziós tenyészeteket agarral szilárdított SH-30 táptalajra visszük ki, majd 25 °C-on a sötétbe helyezzük, amíg kallusz nem képződik.
b) A protoplasztokat a fentiek szerint tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy nem tartalmaz kondicionált táptalajt.
R. D.qlomerata L.protoplasztok transzformálása elektroporációval
a) Közvetlenül a protoplasztok tisztítása után az elektroporációt Shilito és munkatársai módszerével hajtjuk végre (1985), linearizált plazmid felhasználásával. A protoplasztokat az utolsó mosás után körül6 belül 7x10 protoplaszt/ml koncentrációban szuszpendál juk az elektroporációs pufferben (0,4 mól mannitol, 6 mmól MgCl2). A protoplasztokat 0,7 ml-es alikvot részek10 ml-es műanyag centrifuga csövekbe helyezzük, Plazben mid
DNS-t és ultrahanggal kezelt borjutimusz DNS-t (Sigma) adunk rációban.
a csövekhez lO^ug/ml illetve 50/ug/ml koncentEzután 0,38 ml PEG oldatot [24 v% PEG 6000
0,4 mól mannitolbanj 30 mmól MgClg, 0,1 x/% MES (pH=5,6)] adunk hozzá, majd az oldatot enyhén összerázzuk. A protoplaszt szuszpenziót egy Dialóg Electropoc_ator kamrájába helyezzük, majd 10 impulzust bocsátunk át rajta, ezeknek a kezdeti feszültsége 3250 V/cm, az exponenciális lecsökkenés ideje 10 mikroszekundum, 30 másodperces intervallumokban. A mintát eltávolítjuk a kamrából és egy 10 cm átmérőjű Petri csészébe helyezzük. 10 ml, 1,2 v% SeaPlaque agarózt tartalmazó KM-8p táptalajt adunk hozzá, a protoplasztokat egyenletesen eloszlatjuk a táptalajban, majd az agarózt hagyjuk megdermedni.
b) Az a) eljárást Ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a használt kezdeti feszültség 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm vagy 2500 V/cm.
c) Az a) és b) pontokat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 4000-es molekulasulyu PEG helyett 8000-es molekulasulyu PEG-et használunk.
d) Az a) - c) pontokat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a végső PEG koncentráció 10 % és % között van.
S. D-qlomerata L.protoplasztok transzformálása PEG kezeléssel
a) PEG hatására végezzük a közvetlen gén-bevitelt Negrutiu et al.(1987) leírása szerint. A használt DNS linearizált plazmid.
A protoplasztokat az utolsó mosás után
0,5 mól mannitolban szuszpendáljuk, amely 15 mmól MgClg-t tartalmaz, 2 χ ΐΟθ/ ml koncentrációban. A protoplaszt szuszpenziót 1 ml-es alikvotokban műanyag centrifuga csövekbe osztjuk szét. A DNS-t az előző, R.pontban leírtak szerint adjuk hozzá, majd 0,5 ml PEG oldatot adunk hozzá (40 v% PEG 4000 0,4 mól mannitolban, 0,1 mól CaíNO^Jg, pH=7,0). Az oldatokat óvatosan összekeverjük, majd 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk (körülbelül 24 °C) alkalmankénti rázogatással. A mosóoldatból 1,4 ml-t adunk • · ··· · ·· ·· ·· · · ·· ·· ♦ • * · ··· ··· • · · · · • · · ··· · ·· ··
- 82 hozzá, majd a cső tartalmát enyhén összerázzuk. A mosóoldat összetétele 87 mmól mannitol, 115 mmól CaCl2 , 27 mmól MgCl2, 39 mmól KC1, 7 mmól TRIS-HC1 és 1,7 g/1 mio-inozitol, pH=9,O. A mosóoldatból négy további 1,4 mles alikvot részt adunk hozzá négyperces intervallumokban, minden egyes hozzáadás után összerázva a cső tartalmát. A csövet ezután körülbelül 60 x g-vel centrifugáljuk körülbelül 10 percig, majd a felüluszót elöntjük. A leülepedett protoplaeztokat 1 ml KM-8p táptalajban vesszük fel, majd 10 cm átmérőjű Petri csészébe helyezzük. 10 ml KM-8p táptalajt adunk hozzá, amely 1,2 v% SeaPlaque agarózt tartalmaz. A protoplasztot egyenletesen eloszlatjuk a táptalajban, majd a gélt hagyjuk megszilárdulni.
b) Az a) pontot ismételjük meg az alábbi módosítások közül egyet vagy többet alkalmazva ;
(1) A mosóoldat pH-ját 5,6 - 7,0-ra állítjuk.
(2) A használt PEG molekulasúly 6000, 2000 vagy 8000.
(3) A mosó táptalaj összetétele: 154 mmól NaCl, 125 mmól CaCl2, 5 mmól glükóz, pH=6,0 KOH-val beállítva;
0,2 mól CaCl2, 0,1 v% MES pH=6,0 KOH-val beállítva; vagy 0,2 mól CaCl2, 7 mmól TRIS-HC1 pH=9,0 KOH-val beállítva * · ···· ·· ·· ·· ·· ·· · • · · ··· ··· • · · · · • · · ··· · ·· ··
- 83 Τ» D.qlomerata L. protoplasztok transzformálása elektroporációval vagy PEG kezeléssel
A transzformálást az R. vagy S. pontban leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a protoplsztokat 45 °C-on kezeljük körülbelül 5 percig az alikvot részek transzformációhoz csövekbe való szétosztása előtt, vagy az alikvotok szétosztása előtt, vagy az alikvotok szétosztása után, vagy a PEG hozzáadása előtt.
U. A transzformált telepek szelektálása
Az R. - i, pontok szerint előállított prot^lasztokat tartalmazó Petri csészéket 10 napig sötétben tartjuk 25 °C-on, majd 5 egyforma szeletbe vágjuk, a gyöngy tenyészet (Shilito et al., 1983) előállítására. A szeletek közül négyet külön-külön 20-20 ml SH-45 táptalajba
4-5 hét elteltével a feltételezett protoplaszt eredetű, higromicin B-n növekvő telepeket kivágjuk az agarózból, és 19 mm átmérőjű Petri csészébe helyezzük, amely 2 ml,
higromicin B. koncentrációju talmaz, majd 5ű/perc fordulatszámmal
SH-45 táptalajt tarrázatjuk körkörös rázón. Újabb 4-5 hét elteltével az összes telepet uj szuszpenziós tenyészet előállítása céljából 125 ml-es Erlenmayer
lombikba tesszük át, és a kiindulási szuszpenziós tenyészethez hasonlóan növesztjük, azzal a különbséggel, hogy a táptalajba 20/ug/ml higromicint is teszünk.
Az uj szuszpenziókat minden 1-3 hétben átoltjuk 4 g/1 kazein hidrolizátumot és 20/ug/ml higromicin
B-t tartalmazó SH-45 táptalajra. Az ezekből a szuszpenziókból származó sejteket szintén kiszélesztjük megszilárdított SH-30 táptalajra, amely 20 B-t tartalmaz, és körülbelül 25 °C-on ug/ml higromicin inkubáljuk a sötétben,. A lemezre kitett sejtekből keletkező kalluszokat minden második héten friss táptalajra oltjuk át, A higromicin B jelenlétében növekedő sejtekről feltételezzük.
hogy transzformánsok.
b) A szelekciót ugyanúgy végezzük mint az a) pontban, azzal a különbséggel, hogy a higromicin B tartalmú táptalajon növekedő protoplaszt eredetű telepeket
2(J/ug/ml higromicin B-t tartalmazó SH-30 táptalajra szűk ki, és sötétben inkubáljuk 25 °C-on, tesz-
V, A transzformált D,qlomerata L, növények reqene rálása
a) Az U. pontban előállított, protoplaszt eredetű D.glomerata L.kalluszt szilárd SH-30 táptalajon növesztjük, majd minden második héten átoltjuk, A keletkező embriókat eltávolítjuk, és csíráztató táptalajra helyezzük ··«· • · · · · ··· ··· · · · ·♦
- 85 (SH-0), majd fényre tesszük (3800 - 4600 lx). Ezeknek az embrióknak a csírázása 1-4 hét alatt bekövetkezik, és a kialakuló csiranövényeket SH-0 táptalajra helyezzük a fényben, hogy kialakuljon a gyökérrendszer, Hat-tizenkét leveles állapotukban űvegházba visszük őket, és hagyjuk lassan megerősödni.
b) Az U. pontban előállított, protoplaszt erede-tü kalluszokat 0,24 v% Gelrite-tal megszilárdított SH-Ö táptalajon növesztjük világosban (3800 - 4600 lx), majd minden második héten átoltjuk. A keletkező csiranövényeket fényben SH-0 és OMS táptalaj 1:1 arányú keverékére tesszük, amelyet 0,12 v% Gelrite és 0,4 v% agar keverékével szilárdítottunk meg, a gyökérrendszer kialakítása céljából. Hat-tizenkét leveles állapotukban üvegházba visszük őket, majd hagyjuk fokozatosan megerősödni.
c) A fentiek szerint kapott kis csiranövényeket 0,8 v% agarral megszilárdított OMS táptalajra helyezzük a fényben, a gyökérrendszer kialakítása céljából , Hat-tizenkét leveles állapotukban üvegházba visszük őket, majd hagyjuk fokozatosan megerősödni.
d) A fentiek szerint kapott kis csiranövényeket SH-0 és OMS táptalaj 1:1 arányú keverékére tesszük, amelyet 0,12 v% Gelrite és 0,4 v% agar keverékével szilárdítottunk meg, a gyökérrendszer kialakítása céljából. Hat-tizenkét leveles állapotukban üvegházba visszük őket, majd hagy-
- 86 juk fokozatosan megerősödni.
9. példa
Transzgenikus T3 sejtvonalak előállítása, amelyek mindhárom gént tartalmazzák
A transzgenikus növények genotípus megjelölését a továbbiakban az alábbi konvenció szerint alkalmazzuk: T1 növénynek nevezzük azt a növényt, amely transzformációs eseményből származik, és szövettenyészetből növesztettük, A T1 növény természetes leveleinek Önbeporzásából származó növények jelölése T2, amelyek a normális meiotikus folyamatok során egy uj genotípust kaptak. Hasonlóképpen, a T2 növények természetes virágainak önbeporzásából származó, (azaz a T2 magokból nőtt) magokat T3-mal jelöljük.
A transzgenikus T1 növényeket teljes érettségig felnövesztjük. Hagyjuk, hogy a virágok önbeporzást végezzenek, majd a magtokokat a normál száradás után összegyűjtjük. Az egyes növényekből származó magokat összegyűjtjük és külön tároljuk. Mindegyik növényből származó magot külön vizsgáljuk genetikai szegregációs analízissel, hogy meghatározzuk a kanamicin rezisztencia bélyeget hordozó Mendeli lokuszok számát. A T2 magok felszínét sterilezzük olymódon, hogy többször mossuk 2 % hipokloritban, amely 0,02 térf% Tween-20-at tartalmaz, majd steril vízben öblítjük. A magok közül körülbelül 150-et 0,2 X Mx sókkal (Murashige and Skoog, 1962) telitett szűrőpapírra teszünk, amely 150/ug/ml kanamicint tar• · • · • · · • · • · ·
- 87 talmaz. A csírázást, valamint a sziklevél körülbelül 5Jmmesre növekedését követően a normál-zöld (kan-r) és a fakó (kan-s) sziklevelek arányát meghatározzuk. Csak azokat a T2 magokat tartjuk meg további analízis céljára, amelyekben a kan-r:kan-s arány körülbelül 3:1, mivel ez az arány jelzi, hogy egyetlen Mendeli lokuszon található a kanamicin rezisztencia jelölés.
Mindegyik T2 magcsoportból négy-tiz növényt nevelünk fel teljes kifejlődésig (a fentiekben ismertetett körülményeket alkalmazva), majd hagyjuk hogy saját magukat beporozzák. A T3 magok összegyűjtését, sterilezését és csiráztatását a T2 magokra leirt módon végezzük. Azokat a T3 vonalakat, amelyekben a vizsgált magvak 100 %-a (n=150) mutatja a kan-r fenotipust, a genetikai bélyegre nézve homozigótának tartjuk (azaz egy homozigóta T2 szülőből származónak), és megtartjuk a fenotipusos analízis céljára.
Ezután a szokványos nemesitési technikákat alkalmazzuk, hogy mindhárom gént összehozzuk ugyanabba a növénybe.
A jelen találmányt specifikus megvalósítási módjain keresztül irtuk le, de nyilvánvaló, hogy számos variáció, modifikáció és megvalósítási mód lehetséges, és az összes ilyen módosítás, variáció és megvalósítási mód a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tekintendő.
Claims (25)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Készítmény növényi patogének növekedésének gátlására, azzal jellemezve , hogy egy aktív adalékanyag patogén ellenes hatással rendelkező mennyiségét tartalmazza egy vagy több mezőgazdaságilag elfogadható hordozóanyaggal együtt, és az aktív adalékanyaga) egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst ésb) egy vagy több hidrolitikus enzimet tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a sejtmembránt lebontó komponens egy litikus peptid.
- 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a litikus peptid lehet bármely természetes vagy szintetikus peptid, vagy ezeknek funkcionális származéka, amely képes patogén ellenes hatás kifejtésére annak a hatásának a következtében, hogy képes áthatolni, lizálni, vagy másképpen gátolni a patogén szervezet sejtmembránjának működését.
- 4. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a litikus peptidet a következő csoportból választjuk; emlős defenzinek, cekropinok, tioninok, mellitinek, rovar defenzinek, magaininok, attacinok, dipterik, szapecinek, cakrutinok, xenopszinok, vagy ezek hibridjei.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim bármely olyan enzim lehet, amely képes résztvenni egy növényi patogén szervezet sejtfalának lebontásában.
- 6. Az 1-5, igénypontok bármelyik^ szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim az aktív adalékanyagban körülbelül 1/iOOc koncentrációban van jelen.
- 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim az aktív adalékanyagban körülbelül 1/iOOc koncentrációban van jelen.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim 13-1,3-glükanáz vagy kitináz.
- 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim fi-1 ,3-glükanáz és kitináz kombinációja.
- 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktív adalékanyagban a kitináz körülbelül 1/10c relativ koncentrációban, a Ű-1 ,3-glükanáz körülbelül 1/1Üc relativ koncentrációban van jelen.
- 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kitináz az aktív adalékanyagban körül belül 1/10c relativ koncentrációban, a fi-1,3-glükanáz az- 90 aktiv adalékanyagban körülbelül 1/100c relativ koncentrációban van jelen,
- 12. A 9, igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktiv adalékanyagban a kitináz körülbelül 1/100c relativ koncentrációban, a £-1,3-glűkanáz körülbelül 1/lOc relativ koncentrációban van jelen,
- 13. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktiv adalékanyagban a kitináz körülbelül 1/100c relativ koncentrációban, a 13-1 ,3-glükanáz körülbelül 1/lOOc relativ koncentrációban van jelen.
- 14. A 2« igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a litikus peptidek körülbelül 1-200 ppm koncentrációban vannak jelen.
- 15. Eljárás növényi patogének növekedésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a patogénre, vagy a támadási helyére egy készítmény patogénellenes hatású mennyiségét visszük fel, amely készítményben egy aktiv adalékanyag patogénellenes hatású mennyisége található egy vagy több mezőgazdaságilag elfogadható hordozóanyaggal együtt, és az aktiv adalékanyaga) egy vagy több sejtmembránt lebontó komponens ésb) egy vagy több hidrolitikus enzim.• « *
- 16. Eljárás növényi kártevők növekedésének gátlására, azzal jellemezve, hogy egy patogénellenes hatással rendelkező mennyiségű, vagy egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst vagy egy vagy több hidrolitikus enzimet expresszálunk egy transzgenikus növényben.
- 17. Transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz,
- 18. A 17. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a sejtmembránt lebontó komponens egy litikus peptid.
- 19. A 18. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a litikus peptid lehet bármely természetes vagy szintetikus peptid, vagy ezeknek funkcionális származéka, amely képes patogén ellenes hatás kifejtésére annak a hatásnak a következtében, hogy képes áthatolni, lizálni, vagy másképpen gátolni a patogén szervezet sejtmembránjának működését.
- 20. A 18. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a litikus pepiidet a következő csoportbók választjuk; emlős defenzinek, cekropinok, tioninok, mellitinek, rovar defenzinek, magaininok, attacinok, dipterik, szapecinek, c^akrutinok, xenopszinok, vagy ezek hibridjei.
- 21. A 18. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim bármely olyan enzim lehet.- 92 amely képes résztvenni egy növényi patogén szervezet sejtfalának lebontásában.
- 22, A 18, igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim 13-1,3-glükanáz vagy kitináz,
- 23. A 18, igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hidrolitikus enzim 13-1 ,3-glükanáz és kitináz kombinációja.
- 24, Eljárás növényi patogének növekedésének gátlására, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll:a) egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó transzgenikus növény előállítása; ésb) a transzgenikus növénnyel egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzim előállítása,
- 25. Eljárás egy transzgenikus növény előállítására, amely képes patogénellenes hatással rendelkező mennyiségű egy vagy több membrán lebontó komponenst és egy vagy több hidrolitikus enzimet szintetizálni, azzal jellemezve, hogya) egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst • ···· ·· ·· ·· · · · · · • · ··· ··· • · _ · · és egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó transzgenikus növényt állítunk elő, vagy bj kettő vagy több olyan transzgenikus növényt állítunk elő, amelyek egy vagy több sejtmembrán lebontó komponenst és/vagy egy vagy több hidrolitikus enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmaznak, majd az említett növényeket szokványos nemesítés! módszerekkel keresztezzük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49180190A | 1990-03-12 | 1990-03-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU910788D0 HU910788D0 (en) | 1991-09-30 |
| HUT56703A true HUT56703A (en) | 1991-10-28 |
Family
ID=23953731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU91788A HUT56703A (en) | 1990-03-12 | 1991-03-11 | Compositions having antipathogenic activity and comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5348743A (hu) |
| EP (1) | EP0448511B1 (hu) |
| JP (1) | JPH04217903A (hu) |
| KR (1) | KR910016255A (hu) |
| AT (1) | ATE203141T1 (hu) |
| AU (1) | AU655579B2 (hu) |
| CA (1) | CA2037806A1 (hu) |
| DE (1) | DE69132660T2 (hu) |
| ES (1) | ES2161210T3 (hu) |
| HU (1) | HUT56703A (hu) |
| IE (1) | IE910800A1 (hu) |
| IL (1) | IL97480A (hu) |
| NO (1) | NO910947L (hu) |
| NZ (1) | NZ237387A (hu) |
| PH (1) | PH30997A (hu) |
| PT (1) | PT96999B (hu) |
| TR (1) | TR26942A (hu) |
| ZA (1) | ZA911766B (hu) |
Families Citing this family (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT97826B (pt) * | 1990-06-07 | 1998-10-30 | Mogem International N V | Processo para a preparacao de purificacao de uma proteina a partir de uma planta com um efeito inibidor num patogenio ou peste e de composicoes anti-fungos que as contem |
| ES2235150T3 (es) * | 1990-06-15 | 2005-07-01 | Syngenta Participations Ag | Nuevas secuencias de señales. |
| US6512166B1 (en) | 1991-06-17 | 2003-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound |
| US6020540A (en) * | 1993-04-14 | 2000-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Gene encoding endochitinase |
| GB9127250D0 (en) * | 1991-12-23 | 1992-02-19 | Unilever Plc | Modification |
| DE69333980T2 (de) * | 1992-07-01 | 2006-10-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Auslöser von überempfindlichkeitsreaktionen in pflanzen |
| CA2145653A1 (en) * | 1992-09-30 | 1994-04-14 | Herbert S. Aldwinckle | Transgenic pomaceous fruit with fire blight resistance |
| US5708139A (en) * | 1993-05-17 | 1998-01-13 | Cornell Research Foundation, Inc. | Pseudomonas syringae pv syringae hrpZ gene |
| US5530187A (en) * | 1993-07-16 | 1996-06-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes |
| IL107080A0 (en) * | 1993-09-23 | 1993-12-28 | Yissum Res Dev Co | A method for the biological control of pollen in plants |
| GB9509461D0 (en) * | 1995-05-10 | 1995-07-05 | Immunova | DNA molecules and constructs and their use in the treatment of mastitis |
| US5850015A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia chrysanthemi |
| PL182459B1 (pl) * | 1995-06-07 | 2002-01-31 | Cornell Res Foundation Inc | Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny |
| HU219315B (en) * | 1995-11-03 | 2001-03-28 | Unilever Nv | Natural composition for combatting fungi |
| US6750381B2 (en) | 1996-03-25 | 2004-06-15 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Pathogen-resistant plants transformed with a DNA encoding sarcotoxin 1A linked to a signal peptide and a method for production thereof |
| US5773696A (en) | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| SI0938564T1 (en) * | 1996-06-26 | 2002-06-30 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Disease resistance in vitis |
| AU759417B2 (en) * | 1996-06-26 | 2003-04-17 | United States Department Of Agriculture | Disease resistance in vitis |
| US6232528B1 (en) * | 1996-06-26 | 2001-05-15 | University Of Florida Research Foundation Incorporated | Disease resistance in vitis |
| US6235974B1 (en) | 1996-12-05 | 2001-05-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6998515B1 (en) | 1997-01-27 | 2006-02-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of a nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor polypeptide to enhance growth in plants |
| US6277814B1 (en) | 1997-01-27 | 2001-08-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Enhancement of growth in plants |
| US5977060A (en) * | 1997-02-28 | 1999-11-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Insect control with a hypersensitive response elicitor |
| US6635740B1 (en) | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| EP1878438B1 (en) * | 1997-03-27 | 2017-11-29 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| AU6587998A (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-20 | Demeter Biotechnologies, Ltd. | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| BR9809699A (pt) | 1997-05-30 | 2000-07-11 | Cornell Res Foundation Inc | Fragmento isolado de uma proteìna ou polipeptìdeo eliciador de resposta hipersensìvel de erwinia, molécula de dna isolada, sistema de expressão, célula hospedeira, planta transgênica, semente de planta transgênica, e, processos para conferir resistência a doença e intensificar crescimento de plantas e para controlar insetos para plantas |
| US6262018B1 (en) | 1997-08-06 | 2001-07-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora and its use |
| US6228644B1 (en) | 1997-08-06 | 2001-05-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora, its use, and encoding gene |
| US6172184B1 (en) | 1997-08-06 | 2001-01-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Pseudomonas syringae and its use |
| US6680058B1 (en) | 1997-09-03 | 2004-01-20 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals |
| US6333302B1 (en) | 1997-09-03 | 2001-12-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of hypersensitive response elicitor protein or polypeptide from Clavibacter michiganensis for disease resistance, growth enhancement and insect control |
| JPH1175594A (ja) | 1997-09-08 | 1999-03-23 | Norin Suisansyo Nogyo Seibutsu Shigen Kenkyusho | チオニン遺伝子を用いた複数病害抵抗性植物の作出方法 |
| US6960705B2 (en) | 1998-10-05 | 2005-11-01 | Eden Bioscience Corporation | Nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor from Xanthomonas campestris |
| US6858707B1 (en) | 1998-10-05 | 2005-02-22 | Eden Bioscience Corporation | Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response |
| US6624139B1 (en) * | 1998-11-05 | 2003-09-23 | Eden Bioscience Corporation | Hypersensitive response elicitor-induced stress resistance |
| US11673926B2 (en) * | 2011-06-07 | 2023-06-13 | Ibio, Inc. | In vivo de-glycosylation of recombinant proteins by co-expression with PNGase F |
| US9345741B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof |
| US9352020B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-31 | Mead Johnson Nutrition Company | Reducing proinflammatory response |
| US9138455B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-22 | Mead Johnson Nutrition Company | Activating adiponectin by casein hydrolysate |
| US9573980B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-21 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots |
| US9345727B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof |
| US8889633B2 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-18 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof |
| US9289461B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-03-22 | Mead Johnson Nutrition Company | Reducing the risk of autoimmune disease |
| AR101961A1 (es) | 2014-09-17 | 2017-01-25 | Bayer Cropscience Lp | Composiciones que comprenden células recombinantes de bacillus y otro agente de control biológico |
| US11044915B2 (en) | 2014-09-17 | 2021-06-29 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising recombinant Bacillus cells and a fungicide |
| BR122023020880A2 (pt) | 2014-09-17 | 2024-01-30 | Spogen Biotech Inc | Método para estimular o crescimento de plantas |
| BR112017005504A2 (pt) | 2014-09-17 | 2018-08-14 | Bayer Cropscience Lp | composições que compreendem células recombinantes de bacillus e um inseticida. |
| CA3221941A1 (en) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Spogen Biotech Inc. | Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes |
| AR113123A1 (es) | 2017-09-20 | 2020-01-29 | Spogen Biotech Inc | Proteínas de fusión, bacterias recombinantes y fragmentos del exosporio para promover la salud de las plantas |
| KR102654962B1 (ko) * | 2021-12-13 | 2024-04-05 | 대한민국 | 봉독을 포함하는 식물병 방제용 조성물 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5166321A (en) * | 1985-01-28 | 1992-11-24 | International Genetic Engineering, Inc. | Cecropin polypetides with activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria |
| KR870700095A (ko) * | 1985-01-28 | 1987-02-28 | 원본미기재 | AraB 프로모터 및 미생물학적 방법에 의해 세크로핀을 포함한 폴리펩타이드를 제조하는 방법 |
| WO1988000976A1 (en) * | 1986-07-25 | 1988-02-11 | Louisiana State University And Agricultural And Me | Method for introduction of disease and pest resistance into plants and novel genes incorporated into plants which code therefor |
| US4810777A (en) * | 1987-03-04 | 1989-03-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antimicrobial compounds |
| DE3850180T2 (de) * | 1987-07-01 | 1995-03-02 | Plant Genetic Systems Nv | Bakteriozide und/oder bakteriostatische Peptide, Verfahren zu ihrer Isolierung, Herstellung und Verwendung. |
| EP0675960A1 (en) * | 1987-11-02 | 1995-10-11 | Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College | Plants genetically enhanced for disease resistance |
| US5032574A (en) * | 1988-05-26 | 1991-07-16 | Invitron Corporation | Novel antimicrobial peptide |
| CA2005122A1 (en) * | 1988-12-21 | 1991-05-16 | Daniel J. Monticello | Control of microbial growth with nisin/lysozyme formulations |
-
1991
- 1991-02-20 PH PH42030A patent/PH30997A/en unknown
- 1991-03-04 DE DE69132660T patent/DE69132660T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-04 ES ES91810144T patent/ES2161210T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-04 AT AT91810144T patent/ATE203141T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-04 EP EP91810144A patent/EP0448511B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-08 IL IL9748091A patent/IL97480A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-08 CA CA002037806A patent/CA2037806A1/en not_active Abandoned
- 1991-03-08 JP JP3069129A patent/JPH04217903A/ja active Pending
- 1991-03-11 NZ NZ237387A patent/NZ237387A/en unknown
- 1991-03-11 IE IE080091A patent/IE910800A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-03-11 AU AU72797/91A patent/AU655579B2/en not_active Ceased
- 1991-03-11 NO NO91910947A patent/NO910947L/no unknown
- 1991-03-11 ZA ZA911766A patent/ZA911766B/xx unknown
- 1991-03-11 PT PT96999A patent/PT96999B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-03-11 HU HU91788A patent/HUT56703A/hu unknown
- 1991-03-12 TR TR00255/91A patent/TR26942A/xx unknown
- 1991-03-12 KR KR1019910003974A patent/KR910016255A/ko not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-06-25 US US08/082,310 patent/US5348743A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7279791A (en) | 1991-09-19 |
| US5348743A (en) | 1994-09-20 |
| TR26942A (tr) | 1994-08-29 |
| EP0448511B1 (en) | 2001-07-18 |
| JPH04217903A (ja) | 1992-08-07 |
| PH30997A (en) | 1997-12-23 |
| PT96999B (pt) | 2002-02-28 |
| EP0448511A1 (en) | 1991-09-25 |
| HU910788D0 (en) | 1991-09-30 |
| CA2037806A1 (en) | 1991-09-13 |
| ES2161210T3 (es) | 2001-12-01 |
| ZA911766B (en) | 1991-11-27 |
| IL97480A (en) | 1996-06-18 |
| DE69132660T2 (de) | 2002-05-23 |
| PT96999A (pt) | 1991-10-31 |
| NO910947L (no) | 1991-09-13 |
| DE69132660D1 (de) | 2001-08-23 |
| KR910016255A (ko) | 1991-11-05 |
| NO910947D0 (no) | 1991-03-11 |
| NZ237387A (en) | 1992-07-28 |
| AU655579B2 (en) | 1995-01-05 |
| ATE203141T1 (de) | 2001-08-15 |
| IE910800A1 (en) | 1991-09-25 |
| IL97480A0 (en) | 1992-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT56703A (en) | Compositions having antipathogenic activity and comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes | |
| US5880328A (en) | DNA encoding plant chitinases | |
| EP0392225B1 (en) | Disease-resistant transgenic plants | |
| US5789214A (en) | Method of inducing gene transcription in a plant | |
| AU2464592A (en) | Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection | |
| CZ209293A3 (en) | Gene of plant chitinase and use thereof | |
| HUT58758A (en) | New signalsequencies | |
| US5446127A (en) | Antipathogenic peptides and compositions containing the same | |
| AU655277B2 (en) | Novel antipathogenic peptides and compositions containing same | |
| AU656907B2 (en) | Recombinant gene coding for a protein having an endochitinase activity | |
| US5851766A (en) | Process for isolating chemically regulatable DNA sequences | |
| JP2001512020A (ja) | 植物における抗微生物ペプチド遺伝子の発現、および複数の植物病原体に対する耐性を創製するためのその使用 | |
| Ornatowski et al. | Introduction and constitutive expression of a tobacco hornworm (Manduca sexta) chitinase gene in soybean | |
| KR20240095530A (ko) | 보트리티스의 rna 기반 방제 | |
| Dekkers et al. | Agricultural biotechnology in focus in the Netherlands | |
| Metz | Transgenic broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (var. capitata) | |
| Bieri | Genetic engineering of wheat for increased resistance to fungal pathogens | |
| JPH07274752A (ja) | 病害抵抗性イネ科植物およびその作出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG, CH |
|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |