JPH04217903A - 溶菌ペプチドおよび加水分解酵素を含有する抗病原体性組成物 - Google Patents

溶菌ペプチドおよび加水分解酵素を含有する抗病原体性組成物

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JPH04217903A
JPH04217903A JP3069129A JP6912991A JPH04217903A JP H04217903 A JPH04217903 A JP H04217903A JP 3069129 A JP3069129 A JP 3069129A JP 6912991 A JP6912991 A JP 6912991A JP H04217903 A JPH04217903 A JP H04217903A
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Philippe B Gay
フィリップ　バーナード　ガイ
Patricia A Ahl-Goy
パトリシア　アー．　アール　ゴイ
Francisco Garcia-Olmedo
フランシスコ　ガルシア−オルメド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、溶菌ペプチドと加水分
解酵素の組合せを有効成分として使用することによる植
物病原体防除用組成物に関する。さらに詳しくは、本発
明は、病原体の細胞膜への溶菌ペプチドの接近を促進す
ることにより該溶菌ペプチドの効果を高めるために少量
のキチナーゼおよび／またはβ−１，３−グルカナーゼ
が使用されている抗病原体組成物に関する。本発明はさ
らに、溶菌ペプチドおよび加水分解酵素を産生し得るト
ランスジェニック植物ならびに植物病原体の防除方法に
関する。 【０００２】 【従来の技術】いくつかの溶菌ペプチドが広範囲の生物
に対して活性であり、それ以外の溶菌ペプチドはほとん
ど産生されないか、または効果がないことは知られてい
る。溶菌ペプチドの一つの標的が膜であることも知られ
ている。抗微生物活性を有する数種の溶菌ペプチドのア
ミノ酸配列はＷＯ８９／０４３７１に開示されている。 加水分解酵素、例えばキチナーゼおよびβ−１，３−グ
ルカナーゼが菌類の成長を阻害することは知られている
〔４６，３２，７：本明細書において〔　　〕内の数字
は表５にまとめて示す参考文献一覧の数字と一致する〕
。 さらに、それらの酵素はかなり容易に精製できる〔５〕
。文献〔２８〕にはヒト好中球デフェンシンに構造的に
相同であるウサギ顆粒細胞からの６種の抗微生物ペプチ
ド（ＡＭＰ）が開示されている。ウサギＡＭＰのうち３
種（ＮＰ−１，ＮＰ−２およびＮＰ−３ａ）はカンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｒｂｉｃａｎｓ）
に対して有効であると開示されている。文献〔２８〕に
はさらに、ＮＰ−５はカンジダ・アルビカンスに対して
直接殺菌性ではないけれども、ＮＰ−５とＮＰ−１の両
方に菌類が暴露された場合にＮＰ−１の殺菌作用を高め
る、いわゆる相乗効果を示すことが開示されている。文
献〔３９〕はβ−１，３−グルカナーゼとキチナーゼの
組合せがイネの処置に有用である有効な殺菌剤および殺
バクテリアであることを開示している。ＷＯ８９／００
９７６は標的作物中でキチナーゼ酵素をコードする遺伝
子を発現することより鱗翅目の幼虫からの栽培植物の損
傷を阻害することを開示している。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの課題は
植物病原体（好ましくは菌類、バクテリアおよび線虫）
を防除するための新規組成物を提供することである。こ
れらの新規組成物は植物に冒す広範囲の病原体に対して
優れた有効性を示す。本発明のもう一つの課題は植物病
原体の膜が溶菌ペプチドによってより容易に分解される
組成物を提供することである。本発明のその他の課題は
以下の物および方法を提供することである：・抗病原体
有効性を誘導し得る抗病原体性薬剤・抗病原体性薬剤の
上記新規組合せを用いる抗病原体性組成物 ・１種またはそれ以上の溶菌ペプチドおよび１種または
それ以上の加水分解酵素の植物細胞内での発現に基づく
抗病原体有効性を有するトランスジェニック植物・溶菌
ペプチドおよび加水分解酵素をコードするＤＮＡ配列を
含むトランスジェニック植物 ・細胞壁を分解し、そして病原体の膜を溶菌ペプチドに
より容易に接近させる加水分解酵素を植物病原体に暴露
することによる該病原体の防除方法。誘導性加水分解酵
素、好ましくはキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナ
ーゼが溶菌ペプチドと組み合わせて使用されるのが本発
明の別の態様である。加水分解酵素の組合せが広範囲の
溶菌ペプチドと有効であることが本発明のもう一つの態
様である。非常に少量のキチナーゼおよびβ−１，３−
グルカナーゼが溶菌ペプチドの阻害効果を著しく高める
ことに有効であることが本発明の一つの利点である。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、抗病原
体性組成物が有効成分として溶菌ペプチドと加水分解酵
素の組合せを用いて提供される。溶菌ペプチドは植物病
原体の細胞膜を攻撃する。該病原体の細胞膜は細胞壁に
より保護されているから、本発明者等は細胞壁溶解酵素
の使用が溶菌ペプチドを植物病原体の細胞膜により接近
しやすくするであろうことを提案した。本発明者等はさ
らに、細胞壁溶解酵素と溶菌ペプチドの組合せが病原体
への溶菌ペプチドの阻害効果を高めるであろうことを仮
定した。そして、本発明者等は非常に少量の加水分解酵
素が試験された全ての溶菌ペプチドの阻害効果を顕著に
高め得ることを見出した。 【０００５】本明細書において「有効成分」とは、１種
またはそれ以上の溶菌ペプチドと１種またはそれ以上の
加水分解酵素との、病原体の成長を阻害する組合せを意
味するために使用される。本発明の有効成分は抗病原体
性組成物、配合剤または製剤における一成分として使用
されてもよい。 【０００６】本明細書において「農学的に許容性の担体
」とは農薬の分野で公知である物質またはそれらの組合
せを意味するために使用され、そして適当である場合に
は固体または液体助剤、溶媒、ならびに界面活性剤およ
び農薬には慣用のその他の化合物を包含し得る。 【０００７】本明細書において使用されているような物
質または組成物の「抗病原体有効量」とは植物に施用さ
れたとき、またはトランスジェニック植物中に発現され
たとき、標的植物病原体を殺すか、または該病原体の成
長を阻害するであろう量を意味する。 【０００８】本明細書において「植物病原体」は菌類、
バクテリア、線虫および昆虫を包含する。本発明に係る
好ましい標的植物病原体は菌類およびバクテリアである
。 【０００９】本明細書において「溶菌ペプチド」および
「細胞膜溶菌ペプチド」は、病原体の細胞膜に浸透もし
くは該細胞膜を溶解または該細胞膜にその他の様式で損
傷を与える性質により抗病原体有効性であり得るあらゆ
る天然もしくは合成ペプチドまたはそれらの機能的誘導
体を意味するために使用される。動物、植物、昆虫およ
び微生物起源の多くの溶菌ペプチド、例えば哺乳類デフ
ェンシン、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）、チオニ
ン（ｔｈｉｏｎｉｎｓ）、メリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｓ
）、昆虫デフェンシン、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ
ｓ）　、アタシン（ａｔｔａｃｉｎｓ）、ジプテリン（
ｄｉｐｔｅｒｉｎｓ）　、サペシン（ｓａｐｅｃｉｎｓ
）、カエルリン（ｃａｅｒｕｌｉｎｓ）　、キセノプシ
ン（ｘｅｎｏｐｓｉｎｓ）　およびそれらのハイブリッ
ドがあり、それらは本発明において使用され得るが、こ
れに限定されない。そのような溶菌ペプチドのアミノ酸
配列はＷＯ８９／１１２９、ＷＯ８６／０４３５６、Ｗ
Ｏ８８／０５８２６、ＵＳ４８１０７７７およびＷＯ８
９／０４３７１、ならびに文献〔３〕および〔４７〕参
照。 【００１０】合成ペプチドもまた本発明の溶菌ペプチド
として有用であり、それらは上記溶菌ペプチドの一つの
機能的誘導体であるか、またはそれらの機能的ハイブリ
ッドであってよい。そのような合成ペプチドの一例は、
マガイニンの誘導体であり、配列番号：１のアミノ酸配
列を有する合成ペプチドＮｏ．３である〔５３〕。 【００１１】本明細書で使用されているような溶菌ペプ
チドという用語は細胞膜に対して活性である物質、例え
ばリゾチームおよびホスホリラーゼを包含する。上記溶
菌ペプチドと同様に、本発明のリゾチームは酵素機能を
介して病原体の細胞膜に浸透もしくは該細胞膜を溶解ま
たは該細胞膜にその他の様式で損傷を与えることができ
る。ホスホリラーゼは細胞膜のリン脂質を攻撃する。 【００１２】溶菌ペプチドの代わりに、その他の細胞膜
分解性成分もまた本発明の有効成分として使用され得る
。例えば、細胞膜分解性界面活性剤例えばトリトンおよ
びＳＤＳを使用することが本発明の範囲内である。 【００１３】本明細書において「加水分解酵素」、「細
胞壁ヒドロラーゼ」、「植物ヒドロラーゼ」および「細
胞壁加水分解酵素」とは植物病原体の細胞壁の分解を補
助し得るあらゆる天然または合成酵素を意味するために
使用される。加水分解酵素は外部から施用されても、ま
たは細胞中に構造成分としてもしくは誘導されて発現さ
れてもよい。本発明において施用され得る加水分解酵素
はキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼを包含す
る。 【００１４】本明細書で使用されているような「構造成
分として」という用語は細胞中にいつでも存在する加水
分解酵素またはその他の物質を意味する。また、「誘導
されて」という用語は、植物がある抑圧条件または外部
刺激に曝されたときにだけ植物細胞中に存在する加水分
解酵素またはその他の物質を意味し、そしてそれにより
加水分解酵素またはその他の物質の産生または存在が活
性化されるか、または増加される。 【００１５】本発明の有害生物防除組成物の標的であり
得る植物病原体は以下のクラスのものを包含する：バク
テリア（例えばシュードモナス、キサントモナスおよび
エルウィニア）；菌類、例えば不完全菌類（例えばボト
リチス、セプトリア）；子嚢菌類（例えばエリシフェ、
モニリア）；オオマイセテス（例えばペロノスポラ、フ
ィトフトーラ、プラスモパラ、コレトトリクムおよびフ
ィチウム）；バシドマイセテス（例えばリゾクトニアお
よびプシニア）；ならびに昆虫および線虫（例えばメロ
イドジーン、カエノルハブジチス、グロボラ、ヘテロデ
ラおよびプラチレンカスの種）。例えば病原菌はボトリ
チス・シネレア、コレトトリクム・ラゲナリウム、エリ
シフェ・グラミニス（小麦病原菌）、モニリア・フルク
チコラ、ペロノスポラ・タバシナ、フィトフトーラ・パ
ラシチカ、プラスモパラ・ビチコラ、フィチウム・ウル
チマム（土壌病原菌）、リゾクトニア・ソラニ（別の土
壌病原菌）およびセプトリア・ノドルム（小麦病原菌）
の種を包含し得る。 【００１６】本発明の範囲内で保護されるべき標的作物
は以下の植物種を包含する：トウモロコシ、穀類（例え
ば小麦、大麦、ライ麦、オート麦、イネ、モロコシおよ
び関連作物）、ビート（例えばサトウダイコンおよびフ
ォダービート）、核果、ナシ状果および軟果（例えばリ
ンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、チェリー、イ
チゴ、ラズベリーおよびブラックベリー）、マメ科植物
（例えばビーン、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、油科
植物（例えばアブラナ、マスタード、ポピー、オリーブ
、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、ココア豆、落
花生）、キュウリ科植物（例えばキュウリ、マロウ、メ
ロン）、繊維植物（例えばワタ、アマ、アサ、ジュート
）、柑橘系果物（例えばオレンジ、レモン、グレープフ
ルーツ、マンダリン）、野菜（例えばホウレンソウ、レ
タス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、
トマト、ジャガイモ、パプリカ）、クスノキ科（例えば
アボカド、シナモン、樟脳）、または植物例えばタバコ
、ナッツ、コーヒー、サトウモロコシ、茶、ブドウ、ホ
ップ、バナナおよび天然ゴム植物、並びに鑑賞用植物。 【００１７】本発明の有効成分中の加水分解酵素の相対
濃度は活性の単位で定義される。加水分解酵素の濃度の
標準単位（「標準濃度」または「ｃ」）は精製加水分解
酵素に見出されるものと同等の絶対活性値を生じるであ
ろう酵素の濃度として定義される。例えば、キチナーゼ
に対する濃度の標準単位は、８８．８６ｎｋａｔａｌ／
ｍｌ抽出物の絶対活性を生じるであろうキチナーゼの濃
度として定義される。β−１，３−グルカナーゼに対す
る濃度の標準単位は、部分的に精製された酵素、例えば
７６．００ｎｋａｔａｌ／ｍｌ抽出物に見出されるであ
ろう絶対活性に同等な絶対活性を示す濃度として定義さ
れる。 【００１８】本発明は溶菌ペプチドと細胞壁加水分解酵
素、例えばキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ
との組合せからなる抗病原体性組成物に関する。本発明
の好ましい実施態様において、キチナーゼおよびβ−１
，３−グルカナーゼの両方が少量、例えば標準濃度（ｃ
）の約１／１０の相対濃度で、またより好ましくは約１
／１００ｃで有効成分中に存在する。加水分解酵素は溶
菌ペプチドに対して病原体の細胞膜への接近をより容易
にする。 【００１９】好ましい実施態様において、本発明の溶菌
ペプチドは約０．１ｐｐｍないし約１０００ｐｐｍ、好
ましくは約０．５ｐｐｍないし約５００ｐｐｍ、特に約
１ｐｐｍないし約２００ｐｐｍの濃度で有効成分中に存
在する。 【００２０】溶菌ペプチドとの組合せで施用されたとき
、試験病原体に対して活性であることが見出されたキチ
ナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼの濃度は、これ
らの加水分解の誘導を導く刺激を前もって行うことなく
、多くの植物中に存在する。しかしながら、天然に存在
するキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼは病原
体に関連せず、そして植物細胞の細胞外空間中よりむし
ろ液胞中見出された〔５，７〕。従って、本発明の一つ
の好ましい実施態様では、溶菌ペプチドは植物内に既に
存在する活性化された加水分解酵素と組み合わせて使用
される。キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼは
両方とも植物中で誘導性である。従って、本発明のもう
一つの好ましい実施態様において、キチナーゼおよびβ
−１，３−グルカナーゼの産生は外部刺激により誘導さ
れる。 【００２１】誘導は化学的手段により行われ得、例えば
植物中で病原体関連タンパク質の誘導体として作用する
公知の化学物質はエチレン、安息香酸、サリチル酸、ポ
リアクリル酸およびそれらの置換誘導体を包含する。誘
導はその他の生理学的および物理的手段、例えば高温も
しくは低温、物理的損傷またはその他のあらゆる公知の
誘導手段により行われ得る。 【００２２】本発明はさらに、有効成分が溶菌ペプチド
と加水分解酵素との組合せである抗病原体性組成物の製
造を包含する。有効成分は１種またはそれ以上を化合物
または上記化合物の群と均一に混合される。本発明はま
た、有効成分または有効成分を含有する抗病原体性組成
物を植物または植物作付地に施用することからなる、植
物病原体の攻撃から植物を保護する方法にも関する。 【００２３】本発明の有効成分は通常、１種またはそれ
以上の農学的に許容性の担体と一緒の組成物の形態で予
防的または治療的に施用され得、そして作付地または処
理すべき植物に同時にまたは連続してその他の化合物を
施用し得る。これらの化合物は肥料もしくは微量栄養成
分供与剤または植物成長に影響を及ぼすその他の製剤で
あってよい。それらはまた選択的除草剤、殺虫剤、殺菌
剤、殺バクテリア剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはこ
れら製剤の混合物であってよく、所望により製剤業界で
慣用のその他の担体、界面活性剤または施用促進助剤を
一緒に用いてもよい。適当な担体および助剤は固体また
は液体であってよく、そして製剤業界で慣用の物質、例
えば天然または再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、増粘
剤、結合剤または肥料に相当する。 【００２４】本発明の有効成分または少なくとも１種の
有効成分を含有する農薬組成物を好ましい施用方法は葉
施用である。施用の回数および施用率は相当する病原体
による広がりの強さに依存する。しかしながら、有効成
分は、液体組成物を植物の作付地に浸すことにより、ま
たは土壌に固体の状態で、例えば顆粒状で化合物を施用
することにより（土壌施用）、土壌を通し根を介して植
物に浸透し得る（浸透作用）。有効成分は、種子を有効
成分含有液体製剤に浸漬するか、または種子を固体製剤
で粉衣するかして種子に施用されてもよい。特別な場合
において、さらに別の施用形態、例えば植物の茎または
芽の選択的処理もまた可能である。 【００２５】病原体例えば細菌エス．ノドルムの成長を
阻害するための抗病原体性組成物のためには、病原体を
加水分解酵素と最初に接触させるのが適当であると考え
られている。キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナー
ゼとの接触の後、細菌の膜は溶菌ペプチドにより接近し
やすい。従って、病原体感染の防御における植物の応答
は異なる多くの異なる機作からなることに留意すること
は重要である。キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ
および種々の溶菌ペプチドの組合せは病原体の細胞壁お
よび病原体の膜を破壊することにより病原体の成長のか
なりの阻害を示す一方で、植物の過敏応答の間に産生さ
れるその他の抗病原体物質への接近により植物の抗病原
体性を補助するように考えられる。従って、本発明のキ
チナーゼ、β−１，３−グルカナーゼおよび溶菌ペプチ
ドの組合せは病原体の防除に有効である。 【００２６】有効成分はそのままの形態で、または好ま
しくは製剤業界で慣用の助剤と共に使用され、そして公
知方法により例えば乳剤原液、被覆可能なペースト、直
接噴霧または希釈しうる溶液、水和剤、溶解性粉末、粉
剤、粒剤、およびさらに例えばポリマー物質に充填した
カプセル剤に製剤化される。組成物の性質と同様に、施
用方法、例えば噴霧、霧化、散布、散水、被覆または注
水等は、目的とする対象および施用環境によって選択さ
れる。施用の有利な率は通常ヘクタール（ｈａ）あたり
有効成分（ａ．ｉ．）５０ｇないし５ｋｇ、好ましくは
１００ｇないし２ｋｇ　　ａ．ｉ．／ｈａ、特に２００
ｇないし５００ｇ　　ａ．ｉ．／ｈａである。 【００２７】有効成分および所望により固体または液体
の助剤を含有する配合剤、組成物または製剤は、公知の
方法により、例えば有効成分を増量剤、例えば溶媒、固
体担体および適当な場合には表面活性化合物（界面活性
剤）と均一に混合することにより製造される。 【００２８】適当な溶媒または分散剤は主として以下の
ものである：芳香族物質例えばトルエン、キシレン、ベ
ンゼンおよびアルキルナフタリン；塩素化芳香族および
塩素化脂肪族炭化水素例えばクロロベンゼン、クロロエ
チレンおよび塩化メチレン；脂肪族炭化水素例えばシク
ロヘキサンおよびパラフィン、例えば石油留分；アルコ
ール例えばブタノールおよびグリコールならびにそれら
のエーテルおよびエステル；ケトン例えばアセトン、メ
チルエチルケトン、メチルイソブチルケトンおよびシク
ロヘキサノン；および強極性溶媒例えばジメチルホルム
アミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホ
キシドまたはジメチルホルムアミド、並びにエポキシ化
植物油例えばエポキシ化ココナッツ油または大豆油；水
。 【００２９】例えば粉剤および分散性粉末に使用される
固体担体は通常、方解石、タルク、カオリン、モンモリ
ロナイトまたはアタパルジャイトのような天然鉱物充填
剤である。物性を改良するために、高分散ケイ酸または
高分散吸収性ポリマーを加えることも可能である。適当
な粒状化吸収性担体は多孔性型のもので、例えば軽石、
破砕レンガ、セピオライトまたはベントナイトであり；
そして適当な非吸収性担体は方解石または砂のような物
質である。更に非常に多くの粒状化された無機質および
有機質の物質、特にドロマイトまたは粉状化植物残骸が
使用され得る。 【００３０】適当な表面活性化合物は良好な分散性およ
び湿潤性を有する非イオン性、カチオン性および／また
はアニオン性界面活性剤である。「界面活性剤」という
語は界面活性剤の混合物をも含むものと理解されるであ
ろう。 【００３１】適当なアニオン性界面活性剤は、いわゆる
水溶性石鹸および水溶性合成表面活性化合物の両方であ
り得る。 【００３２】適当な石鹸は高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２
）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、または非置
換もしくは置換のアンモニウム塩、例えばオレイン酸ま
たはステアリン酸、または例えばココナッツ油もしくは
獣脂から得られる天然脂肪酸混合物のナトリウムまたは
カリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩、例えばシ
ス−２−（メチル−９−オクタデセニルアミノ）−エタ
ンスルホン酸（好ましい製剤中の配合量約３％）のナト
リウム塩もまた界面活性剤として記載し得る。 【００３３】しかしながら、いわゆる合成界面活性剤、
特に脂肪スルホネート、脂肪サルフェート、スルホン化
ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルアリールスル
ホネートまたは脂肪アルコール、例えば２，４，７，９
−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（好ま
しい製剤中の配合量約２％）が更に頻繁に使用される。 【００３４】脂肪スルホネートまたはサルフェートは通
常アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換も
しくは置換のアンモニウム塩の形態にあり、そしてアシ
ル基のアルキル部分をも含む炭素原子数８ないし２２の
アルキル基を一般に含み、例えばリグノスルホン酸、ド
デシルサルフェートまたは天然脂肪酸から得られる脂肪
アルコールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカ
ルシウム塩である。これらの化合物には硫酸化およびス
ルホン化脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物の塩
も含まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、
好ましくは二つのスルホン酸基と８ないし２２個の炭素
原子を含む一つの脂肪酸基とを含む。アルキルアリール
スルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジ
ブチルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホ
ン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カル
シウムまたはトリエタノールアミン塩である。対応する
ホスフェート、例えば４ないし１４モルのエチレンオキ
シドを含むｐ−ノニルフェノール付加物のリン酸エステ
ルの塩もまた適当である。 【００３５】非イオン性界面活性剤は、好ましくは脂肪
族もしくは脂環式アルコール、または飽和もしくは不飽
和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエ
ーテル誘導体であり、該誘導体は３ないし３０個のグリ
コールエーテル基、（脂肪族）炭化水素部分に８ないし
２０個の炭素原子、そしてアルキルフェノールのアルキ
ル部分に６ないし１８個の炭素原子を含む。他の適当な
非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとポリ
プロピレングリコール、エチレンジアミノポリプロピレ
ングリコールおよびアルキル鎖中に１ないし１０個の炭
素原子を含むアルキルポリプロピレングリコールとの水
溶性付加物であり、その付加物は２０ないし２５０個の
エチレングリコールエーテル基および１０ないし１００
個のプロピレングリコールエーテル基を含む。これらの
化合物は通常プロピレングリコール単位当たり１ないし
５個のエチレングリコール単位を含む。非イオン性界面
活性剤の例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノー
ル、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ヒマシ油チオキ
シレート、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加
物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポ
リエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエ
トキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタ
ンの脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンソルビ
タントリオレートもまた適当な非イオン性界面活性剤で
ある。 【００３６】カチオン性界面活性剤は、好ましくはＮ−
置換基として少なくとも一つの炭素原子数８ないし２２
のアルキル基と、他の置換基として低級非置換またはハ
ロゲン化アルキル基、ベンジル基または低級ヒドロキシ
アルキル基とを含む第四アンモニウム塩である。該塩は
好ましくはハロゲン化物、メチル硫酸塩またはエチル硫
酸塩の形態にあり、例えばステアリルトリメチルアンモ
ニウムクロリドまたはベンジルジ−（２−クロロエチル
）エチルアンモニウムブロミドである。 【００３７】製剤業界で慣用的な界面活性剤は、例えば
文献〔３３，５２〕に記載されている。 【００３８】農薬組成物は、有効成分を約０．１ないし
約９９％、好ましくは約０．１ないし約９５％、特に約
３ないし約９０％、固体または液体助剤を約９９．９な
いし約１％、好ましくは約９９ないし約１％、特に約９
５ないし約５％、および界面活性剤を約０ないし約２５
％、好ましくは約０．１ないし約２５％、特に約０．１
ないし約２０％含有する。市販品は濃厚物として製剤化
されるのが好ましいだろうが、最終使用者は希釈製剤を
通常使用するであろう。 【００３９】本発明はまた、少なくとも１種の溶菌ペプ
チドおよび少なくとも１種のヒドロラーゼをコードする
ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物に関する。キ
チナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼをコードする
ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物はＥＰ３９２
２２５およびＥＰ３５３１９１に開示されている。 【００４０】本発明はまた、ａ）１種またはそれ以上の
細胞膜分解性成分および１種またはそれ以上の加水分解
酵素をコード化する組換えＤＮＡ配列を含むトランスジ
ェニック植物を１種作出するか、またはｂ）１種または
それ以上の細胞膜分解性成分および１種またはそれ以上
の加水分解酵素をコード化する組換えＤＮＡ配列を含む
トランスジェニック植物を２種またはそれ以上作出し、
そしてそれらの植物を慣用の育種法により交雑する、こ
とからなる、１種またはそれ以上の細胞膜分解性成分お
よび１種またはそれ以上の加水分解酵素の抗病原体有効
量を合成し得るトランスジェニック植物の作出方法に関
する。 【００４１】細胞膜分解性成分をコード化する組換えＤ
ＮＡ配列を含む第１のホモ接合性トランスジェニック植
物を作出し、β−１，３−グルカナーゼをコード化する
組換えＤＮＡ配列を含む第２のホモ接合性トランスジェ
ニック植物を作出し、キチナーゼをコード化する組換え
ＤＮＡ配列を含む第３のホモ接合性トランスジェニック
植物を作出し、そしてこれらの３つのホモ接合性植物を
慣用の育種法により交雑することからなる方法が好まし
い。 【００４２】トランスジェニック植物において、溶菌ペ
プチドおよ加水分解酵素の合成は誘導性遺伝子および誘
導性調節剤からなる誘導性発現系の施用により誘導され
得る。例えば、１０個以上のタバコＰＲ（病原体関連）
タンパク質遺伝子は化学的に誘導され得る〔２９〕。こ
れら遺伝子のうち３個、ＰＲ−２、ＰＲ−ＮおよびＰＲ
−Ｏはβ−１，３−グルカナーゼ活性を有することが示
され〔２４〕、そして２個、ＰＲ−ＰおよびＰＲ−Ｑが
キチナーゼ活性を有することが示されている〔２７〕。 従って、本発明は少なくとも１種の溶菌ペプチドをコー
ド化する遺伝子を発現するトランスジェニックを誘導し
、次に少なくとも１種の天然または外来加水分解酵素の
蓄積を誘導する誘導性調節剤との処理を行う。 ＡＴＣＣへの寄託 以下の寄託がブダペスト条約に従ってＡＴＣＣになされ
た： ＡＴＣＣ４０４２６，寄託日１９８８年２月１２日ＡＴ
ＣＣ４０５８６，寄託日１９８９年３月２２日【００４
３】 【実施例】次に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に
説明するが、これは説明のためだけのものであり本発明
を制限するものではない。 実施例１：エチレン処理されたマメ葉からのキチナーゼ
およびβ−１，３−グルカナーゼの精製段階１：エチレ
ン処理および植物材料 ファセオルス・バルガスのサクサ栽培品種の種子を２０
℃で１６時間の明所および８時間の暗所の条件下バーミ
キュレート中生長させる。２０日齢のマメ葉を容量０．
２ｍ３　の気密プラスチック容器中保温する。対照植物
を無エチレン空気中同一容器で保温する。４８時間後、
第１葉を集め、そして−２０℃で凍結する。 段階２：酵素粗成物 凍結葉組織６５９．７ｇを０．１Ｍクエン酸ナトリウム
中（２ｍｌ／ｇ新鮮重量）ｐＨ５．０でターミックス・
ホモジナイザーの最高速度でホモジナイズする。ホモジ
ネートを遠心分離し（２５分，１１０００×ｇ）、そし
て上澄み１００ｍｌを酵素粗成物として使用する。残り
の粗抽出物中のタンパク質を９５％飽和まで硫酸アンモ
ニウムを添加することにより沈殿させる。遠心分離後（
３０分，１１０００×ｇ）、沈殿物を１００ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再溶解し、そして５ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析する。 段階３：酵素精製 透析した粗タンパク質画分を５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で平衡化したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ
）−トリアクリル（ＩＢＦ，クリチー，Ｆ）カラムに通
す。カラムを遅れずに通る塩基性タンパク質含有緩衝液
は２０ｍＭ　　ＮａＨＣＯ３　最終濃度で溶出する。ｐ
Ｈを１Ｍ　　ＮａＯＨで８．４に上げ、そして液体を２
０ｍＭ　　ＮａＨＣＯ３　で平衡化された再生キチンの
カラム〔３５〕に注入する。溶出液を集め、ｐＨを１Ｍ
　　ＨＣｌで５．５にする。タンパク質を水に対して透
析し、少量の再生キチンで３回処理し、次いで遠心分離
により微量のキチナーゼを除去する。高活性のβ−１，
３−グルカナーゼを含有する画分を次に凍結乾燥する。 それらを部分精製β−１，３−グルカナーゼの供給源と
する。キチンカラムを２０ｍＭ　　ＮａＨＣＯ３　、次
に２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で
洗浄する。キチナーゼを１００ｍＭ酢酸で溶出容量３１
ｍｌに溶出させる。溶出液のｐＨを１Ｍ　　ＫＯＨで５
．５とし、そしてタンパク質を水に対して透析し、凍結
乾燥する。このタンパク質を精製キチナーゼの供給源と
する。 段階４：タンパク質の測定 タンパク質を文献〔６〕に記載されたように測定する。 段階５ａ：キチナーゼアッセイ キチナーゼ活性を文献〔３５〕に記載されたように測定
する。 段階５ｂ：β−１，３−グルカナーゼアッセイβ−１，
３−グルカナーゼ活性を文献〔１０〕に記載されたよう
に測定する。 段階６：エチレン処理されたマメ葉中での酵素誘導４８
時間のエチレン処理は、表１に結果が示されているよう
にキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼの強い誘
導を導く： 【表１】エチレン処理されたマメ葉中でのキチナーゼお
よびβ−１，３−グルカナーゼ活性 ─────────────────────────
──　　キチナーゼ比活性　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４５．９５　　（ｎｋａｔａｌ／ｍｇタ
ンパク質）────────────────────
───────　　絶対キチナーゼ活性　　　　　　　
　　　　　　　　　　　５４．７１　　（ｎｋａｔａｌ
／ｍｌ抽出物） ─────────────────────────
──　　β−１，３−グルカナーゼ比活性　　　　　　
２８．７２　　（ｎｋａｔａｌ／ｍｇタンパク質）──
─────────────────────────
　　絶対β−１，３−グルカナーゼ活性　　　　３４．
２１　　（ｎｋａｔａｌ／ｍｌ抽出物） ─────────────────────────
──段階７：酵素精製 表２はキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼの精
製プロトコルを示す。キチナーゼは収率２１．６％で３
３倍に精製される。β−１，３−グルカナーゼは３．０
の精製ファクターおよび収率３３．５％で精製される。 ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動は、β−１，３
−グルカナーゼがこれらの精製段階の後に非常に高い精
製度であることを示す〔７〕。 段階８：マメ葉中のキチナーゼおよびβ−１，３−グル
カナーゼの誘導 この実験に使用されたマメ葉において、酵素キチナーゼ
およびβ−１，３−グルカナーゼが予想よりわずかに低
くか誘導されている。例えば文献〔７〕には、５回のエ
チレン処理の平均が絶対キチナーゼ活性８８．８６±６
．６５ｎｋａｔａｌ／ｍｌ抽出物および絶対β−１，３
−グルカナーゼ活性７６．００±６．７７ｎｋａｔａｌ
／ｍｌ抽出物であると報告されている。それ故に、キチ
ナーゼの標準濃度の単位（ｃ＝１）８８．８６ｎｋａｔ
ａｌ／ｍｌ抽出物の活性を得るために必要なキチナーゼ
濃度として定義されている。キチナーゼ抽出物の相対濃
度はその活性の比率で定義されている。部分精製された
β−１，３−グルカナーゼの相対濃度は７６．００ｎｋ
ａｔａｌ／ｍｌ抽出物の活性の比率で定義されている。 段階９：キチナーゼ精製 キチナーゼをアフィニティクロマトグラフィーにより精
製する。精製ファクターは文献〔７〕（３２％）と同等
である。 【表２】エチレン処理されたマメ葉からのキチナーゼお
よびβ−１，３−グルカナーゼの精製プロトコル　　　
　　　　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　Ｂ　　　　
　　Ｂ　　　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　　Ｅ粗抽
出物　　　　　７４０　　　　　　　３４００１　　　
４５．９５　　　　　２２５６６　　　　　　２８．７
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００％　　　　　　　　　　　　　１００％
　　　　　　　　　　　　　　　　硫安画分　　　　　
５２４　　　　　　　３１９４４　　　６０．９４　　
　　　　未測定　　　　未測定　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　９４％　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＤＥＡＥカラム　　　１９１．４　　　　　２
６５９８　　　　１３９　　　　　　　　８９９１　　
　　　　５２．６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　７８．２％　　　　　　　　　　
　　　　４２．３％　　　　　　　　　　　　　　精製
　　　　　　　　　　４．８４　　　　　　７３４１　
　　１５１７　　　　　　　　１１．７８　　　　　　
２．４３　　　　キチナーセ゛　　　　　　　　　　　
　　　　　　２１．６％　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　キチン−カラム　　　　　　８２．１　
　　　　　　　７０１　　　　　８．５４　　　　　　
　７１２９　　　　　８８．６　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３３．５％　　　　　　　　　
　　　　　なお、表２中、Ａ欄は全タンパク質（ｍｇ）
、Ｂ欄はキチナーゼ全活性（ｎｋａｔａｌ）、Ｃ欄はキ
チナーゼ比活性（ｎｋａｔａｌ／ｍｇタンパク質）、Ｄ
欄はβ−１，３−グルカナーゼ全活性（ｎｋａｔａｌ）
、Ｅ欄はβ−１，３−グルカナーゼ比活性（ｎｋａｔａ
ｌ／ｍｇタンパク質）の値である。 段階１０：β−１，３−グルカナーゼの精製精製段階で
文献〔７〕のものより約１／３高いが、３．０の精製フ
ァクターはこれまで観察されたもの程高くない。 【００４４】実施例２：溶菌ペプチドの合成溶菌ペプチ
ドはアプライド・バイオシステムズ・モデル４３０ペプ
チドシンセサイザーを用いて製造業者の推奨に従って合
成される。ペプチドはＨＰＬＣにより精製される。 【００４５】実施例３：エス．ノドルムに対する溶菌ペ
プチドおよび加水分解酵素の阻害効果 ミクロタイタープレートが、エス．ノドルムに対する溶
菌ペプチドおよび加水分解酵素の阻害効果を調べるため
に選択される。２．０×１０４　胞子／ｍｌ試験病原体
の培地が予め接種された液体エンドウ培地９０μｌに試
験物質を添加する。表３は２重／３重の試料で試験され
る試験溶液の組成を示す。試験物質のブランク容量は未
接種液体エンドウ培地にそれらを添加することにより決
定される。プレートを４８時間暗所中シェーカー上２３
℃で湿気室中で保温後に評価される。病原体の成長は、
５９５ｎｍの培地の吸収を測定することにより記録され
る。２重／３重の試料の平均が計算され、そして相当す
る酵素ブランクが差引かれ、成長するマイセリウムの実
際の吸収を得る。使用される試験物質の阻害効果は病原
体の成長を水対照の％として計算することにより決定さ
れる。上記試験の結果を表４にまとめて示す。単一の試
験溶液が施用されたとき、全ての試験物質は、使用され
た濃度に応じ限定された範囲でエス．ノドルムの成長を
阻害し得る。部分精製されたβ−１，３−グルカナーゼ
および溶菌ペプチドの組合せは精製キチナーゼと溶菌ペ
プチドの組合せに比べより強く病原体を阻害することが
わかる。これはエス．ノドルムが精製キチナーゼに比べ
部分精製β−１，３−グルカナーゼに対してより感受性
であるという見解と一致する。表４にしめすとおり、酵
素に対して特定の溶菌ペプチド濃度が１／１００ｃの添
加では、溶菌ペプチド単独の場合と比べて試験物質の阻
害効果をわずかに高める。酵素に対して特定の溶菌ペプ
チド濃度が１／１０ｃの添加では、１／１００ｃの添加
に比べより強く阻害する。両方の酵素に対して溶菌ペプ
チド濃度が１／１０ｃまたは１／１００ｃの添加では、
試験物質の阻害効果を強く阻害することは興味深い。 【００４６】 【表３】 試験結果 試料　　精製キチナーゼ　　精製β−１，３−グルカナ
ーゼ　　溶菌ペプチド　　　　　　　　　　（ｃ）　　
　　　　　　　　　　　　　　（ｃ）　　　　　　　　
　　　　　　（ｐｐｍ）　　０　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　−　　１　　　　　　１
／１０　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　−　　２　　　　　　
１／１００　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　−　　３　　　　　　
　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／１０
　　　　　　　　　　　　　　　　−　　４　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／１
００　　　　　　　　　　　　　　−　　５　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　６
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６０　　７　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２００　　８　　　　　　１／１０　　　　　　
　　　　　　　　１／１０　　　　　　　　　　　　　
　　　−　　９　　　　　　１／１０　　　　　　　　
　　　　　　１／１００　　　　　　　　　　　　　　
−１０　　　　　　１／１００　　　　　　　　　　　
　１／１０　　　　　　　　　　　　　　　　−１１　
　　　　　１／１００　　　　　　　　　　　　１／１
００　　　　　　　　　　　　　　−１２　　　　　　
１／１０　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２０１３　　　　　
　１／１０　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６０１４　　　　
　　１／１０　　　　　　　　　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２００１５　　　　
　　１／１００　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２０１６　　　　
　　１／１００　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６０１７　　　　
　　１／１００　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２００１８　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／１
０　　　　　　　　　　　　　　　　２０１９　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／
１０　　　　　　　　　　　　　　　　６０２０　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
／１０　　　　　　　　　　　　　　２００２１　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
／１００　　　　　　　　　　　　　　２０２２　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
／１００　　　　　　　　　　　　　　６０２３　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
／１００　　　　　　　　　　　　２００２４　　　　
　　１／１０　　　　　　　　　　　　　　１／１０　
　　　　　　　　　　　　　　　２０２５　　　　　　
１／１０　　　　　　　　　　　　　　１／１０　　　
　　　　　　　　　　　　　６０２６　　　　　　１／
１０　　　　　　　　　　　　　　１／１０　　　　　
　　　　　　　　　２００２７　　　　　　１／１００
　　　　　　　　　　　　１／１００　　　　　　　　
　　　　　　２０２８　　　　　　１／１００　　　　
　　　　　　　　１／１００　　　　　　　　　　　　
　　６０２９　　　　　　１／１００　　　　　　　　
　　　　１／１００　　　　　　　　　　　　２００水
対照：蒸留水１０μｌを胞子溶液９０μｌに添加する。 　　【００４７】 【表４】 試験溶液の結果，対照の％での細菌成長試験　　合成ペ
プチド　　　　大麦 溶液　　Ｎｏ．３　　　　　　　　チオニンβ　　　　
メリチン　　　　　　　　酵素　　０　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　１００．００　　１　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　　　７８．６０　　２　　　　　　−
　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　
　　−　　　　　　　　９３．６８　　３　　　　　　
−　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　５０．１８　　４　　　　　
　−　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　
　　　　−　　　　　　　　８１．７５　　５　　８０
．３５　　　　８６．３２　　　　　　７９．６５　　
　　　　　　−　　６　　７３．５１　　　　６３．８
６　　　　　　６５．９６　　　　　　　　−　　７　
　６５．９６　　　　６０．７０　　　　　　２７．３
７　　　　　　　　−　　８　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　　
　　　　　　３４．２１　　９　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　４５．６１１０　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　３９．８２１１　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　６０．８８１２　　６８．４２　　　　
６２．８１　　　　　　６２．８１　　　　　　　　−
１３　　６３．５１　　　　４９．４７　　　　　　５
７．５４　　　　　　　　−１４　　６１．７５　　　
　４７．０２　　　　　　２２．４６　　　　　　　　
−１５　　７７．８９　　　　７５．４４　　　　　　
７３．３３　　　　　　　　−１６　　７１．５８　　
　　６２．８１　　　　　　６５．２６　　　　　　　
　−１７　　６４．２１　　　　５７．１９　　　　　
　２５．６１　　　　　　　　−１８　　４６．６７　
　　　１３．６８　　　　　　１４．７４　　　　　　
　　−１９　　３０．８８　　　　１２．９８　　　　
　　１１．９３　　　　　　　　−２０　　２７．８９
　　　　　　５．２６　　　　　　　　６．３２　　　
　　　　　−２１　　６５．２６　　　　５４．７４　
　　　　　６１．４０　　　　　　　　−２２　　６３
．５１　　　　４６．６７　　　　　　５７．１９　　
　　　　　　−２３　　５３．６８　　　　３９．３０
　　　　　　２５．９６　　　　　　　　−２４　　　
　９．４７　　　　　　７．７２　　　　　　１０．５
３　　　　　　　　−２５　　　　８．４２　　　　　
　２．２２　　　　　　　　７．３７　　　　　　　　
−２６　　　　３．８６　　　　　　０．００　　　　
　　　　０．００　　　　　　　　−２７　　４０．７
　　　　　　４２．４６　　　　　　２２．７２　　　
　　　　　−２８　　３６．４９　　　　３２．９８　
　　　　　２２．１１　　　　　　　　−２９　　３１
．２３　　　　２８．７７　　　　　　１８．７５　　
　　　　　　−加水分解酵素は実施例１に記載の操作に
より葉から精製される。溶菌ペプチドは２０ｐｐｍ、６
０ｐｐｍおよび２００ｐｐｍの濃度で試験される。 【００４８】実施例４：有効成分として溶菌ペプチドと
加水分解酵素との液体組成物を使用する抗病原体性組成
物の配合例 以下、組成の％は重量％である。 １．乳剤原液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ａ　　　　　　ｂ　　
　　　　ｃ有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０％　　
４０％　　５０％カルシウムドデシルベンゼンスルホネ
ート　　　　　　　　５％　　　　８％　　　　６％ヒ
マシ油ポリエチレングリコールエーテル　　　　　　　
　５％　　　　−　　　　　　−（エチレンオキシド３
６モル） トリブチルフェノールポリエチレングリコール　　　　
−　　　　１２％　　　　４％エーテル（エチレンオキ
シド３０モル）シクロヘキサノン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　
１５％　　２０％キシレン混合物　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０％　　
２５％　　２０％懸濁原液を水で希釈することにより、
所望の濃度の懸濁液が得られる。 ２．溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ａ　　　　　　ｂ　　　　　　
ｃ　　　　　　ｄ有効成分　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８０％　　１０％
　　　　５％　　９５％エチレングリコールモノメチル
エーテル　　２０％　　　　−　　　　　　−　　　　
　　−ポリエチレングリコール４００　　　　　　　　
　　　　−　　　　７０％　　　　−　　　　　　−Ｎ
−メチル−２−ピロリドン　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　２０％　　　　−　　　　　　−エポキシ
化ココナッツ油　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　　　　　−　　　　　　１％　　　　５％石油留
分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　−　　　　９４％　　
　　−（沸点範囲１６０〜１９０℃） これらの溶液は微滴の形態での施用に適している。 有効成分を塩化メチレンに溶解し、該溶液を担体上に噴
霧し、その後、溶媒を減圧下で留去する。 担体を有効成分と均一に混合することにより、そのまま
使用し得る粉剤を得る。 【００４９】実施例５：有効成分として溶菌ペプチドと
加水分解酵素との固体組成物を使用する抗病原体性組成
物の配合例 以下、組成の％は重量％である。 １．水和剤 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ａ　　　
　　　　　ｂ　　　　　　　　ｃ　　有効成分　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２０％　　　　６０％　　　　７５％リ
グノスルホン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５％　　　　　　５％　　　　　　−　
　ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３％　　　　　　−　　　　　
　　　５％ジイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリ
ウム　　−　　　　　　　　６％　　　　１０％オクチ
ルフェノールポリエチレングリコールエーテル（エチレ
ンオキシド７−８モル）　　　　　　　−　　　　　　
　　２％　　　　　　−高分散性ケイ酸　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５％　　　　２７％　　　　１０％カオリン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　６７％　　　　　　−　　　　　　　　−
　　有効成分を助剤と十分に混合し、混合物を適当なミ
ル中で摩砕すると、水で希釈することにより所望濃度の
懸濁液を得ることのできる水和剤が得られる。 ２．乳剤原液 有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
％オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル
　　　　　　３％（エチレンオキシド４〜５モル） カルシウムドデシルベンゼンスルホネート　　　　　　
　　　　　　　　　　３％ヒマシ油ポリエチレングリコ
ールエーテル　　　　　　　　　　　　　　　　４％（
エチレンオキシド３６モル） シクロヘキサノン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０％キシレ
ン混合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５０％懸濁原液を
水で希釈することにより、所望の濃度の懸濁液が得られ
る。 担体を有効成分と均一に混合することにより、そのまま
使用し得る粉剤を得る。 ４．押出粒剤 有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０％リグノスルホン酸ナトリウム　　
　　　　　　　　　　２％カルボキシメチルセルロース
　　　　　　　　　　　　１％カオリン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８７％有
効成分を助剤と混合し、そして注意深く粉砕し、そして
混合物を水で湿らす。混合物を押出し、そして空気流中
乾燥させる。 ５．被覆粒剤 有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３％ポリエチレングリコール２００
　　　　　　　　　　３％カオリン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９４％均一に
混合した有効成分を、ミキサー中で、ポリエチレングリ
コールで湿らせたカオリンに均一に塗布する。この方法
により非粉塵性の塗布された粒剤が得られる。 ６．乳剤原液 有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０
％エチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０％ノニル
フェノールポリエチレングリコールエーテル　　　　　
　　　６％（エチレンオキシド１５モル） リグノスルホン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０％カルボキシメチル
セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１％３７％水性ホルムアルデヒド溶液
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２％７
５％水性エマルジョンの形態にあるシリコン油　　　　
　　０．８％水　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３２％細かく粉砕された有効成分を助剤
と最初に均一に混合し、水で希釈することによりあらゆ
る所望の濃度の懸濁液が得られる乳剤原液を得る。 【００５０】実施例６：二重ベクターｐＣＧＮ１７８１
ＣおよびｐＣＧＮ１７８２Ｃの構築 塩基性グルカナーゼの発現をコード化する遺伝子に操作
可能に連結された３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）プロモータをを二重に含むｐＣＩＢ１００
５Ｂを以下のように構築する：プラスミドｐＧＬＮ１７
は、ｐＧＬ３１クローンの５’末端とｐＧＬ３６クロー
ンの３’末端とを融合することにより構築されたエヌ．
タバカム〔５１〕からのβ−１，３−グルカナーゼをコ
ード化するハイブリッドｃＤＮＡである。このハイブリ
ッドｃＤＮＡは配列番号：９の配列を有する。ｃＤＮＡ
は５’末端の先端で切断され、そして全体のシグナルペ
プチドをコード化しない。このタンパク質が適当に標的
化されている（すなわち中央液胞）トランスジェニック
を作出するために、この配列を先端が切断されたｃＤＮ
Ａに戻して添加することが必要である。それ故に、二重
ＣａＭＶ３５Ｓ発現カセットが２段階操作で構築される
。第１の段階でｃＤＮＡのシグナルペプチドをゲノムク
ローン中にコード化されたシグナルペプチドに置き換え
る。第２の段階でこの「修復ｃＤＮＡ」を発現ベクター
内に入れる。 【００５１】プラスミドｐＳＧＬ２はｐＧＬＮ１７ｃＤ
ＮＡのサブクローンである。このプラスミドはＣｌａＩ
およびＥｃｏＲＩ　で消化され、そしてグルカナーゼｃ
ＤＮＡを含む１ｋｂ断片をＬＧＴアガロースゲルから単
離する。ｐブルースクリプトプラスミドをＥｃｏＲＩ　
で消化し、ＣＩＡＰで処理し、そしてＬＧＴアガロース
ゲルで精製する。 プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１は、グルカナーゼ
コード性配列を包含する４．４ｋｂ挿入物、約１．５ｋ
ｂの５’フランキング配列、６００ｂｐイントロンおよ
び約１．５ｋｂの３’フランキング配列を含む。このプ
ラスミドは配列番号：１０または配列番号：１１の配列
を有する２つのプライマーを含有するＰＣＲ実験におけ
る鋳型として使用される。この増幅の結果はグルカナー
ゼｃＤＮＡの先端切除５’末端を置き換えるための断片
を製造することである。ＥｃｏＲＩ　部位を生成する単
一塩基突然変異はクローニング実験を促進するために導
入される。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ　とＣｌａＩで消
化し、そして断片を２．０％ＬＧＴアガロースゲルで分
離する。１２０ｂｐバンドを切出し、ｐＳＧＬ２からの
１ｋｂＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ　断片および精製されたＥ
ｃｏＲＩ　消化ブルースクリプトベクターと混合し、連
結し、そして上記のように形質転換する。形質転換体を
挿入物の存在に対してスクリーニングし、そして適当な
構造体をｐＣＩＢ１００９と命名する。プラスミドｐＣ
ＩＢ１００９をＥｃｏＲＩ　で消化し、そして１．２ｋ
ｂ断片をＬＧＴアガロースゲル上で精製する。プラスミ
ドｐＣＧＮ１７６１をＥｃｏＲＩ　で消化し、そしてＣ
ＩＡＰで処理し、ＬＧＴアガロースゲルで精製し、１．
２ｋｂＥｃｏＲＩ　断片と混合し、次いで連結し、形質
転換する。形質転換体を挿入物の存在に対してスクリー
ニングする。グルカナーゼｃＤＮＡがＣａＭＶプロモー
ターに対してセンス配向にある１つのプラスミドをｐＣ
ＩＢ１００５Ｂと命名する。二重３５Ｓプロモータ断片
がｐＣＧＮ１５４０の植物選択性マーカー遺伝子に近接
するような配向に、ｐＣＩＢ１００５Ｂの４．９ｋｂＸ
ｂａＩ断片をＸｂａＩ消化ｐＣＧＮ１５４０内にサブク
ローン化し、ｐＣＧＮ１７８１Ｃを生成する。塩基性キ
チナーゼの発現をコードする遺伝子に操作可能に連結さ
れた二重３５Ｓ　　ＣａＭＶプロモータを含むプラスミ
ドｐＣＩＢ１００７の構築は以下のように行う：プラス
ミドｐＳＣＨ１０は、ｐＣＨＮ５０〔５０〕内の挿入物
に類似しているが、５’末端に８１ｂｐの延長（配列番
号：１２）を有するタバコ塩基性キチナーゼのｃＤＮＡ
挿入物を含む。ｐＳＣＨ１０をＢａｍＨＩ　で消化し、
次いで実施例５に記載された分子アダプタ（配列番号：
１３）と連結する。連結物を次に精製し、そしてＥｃｏ
ＲＩ　で消化し、アダプタ連結キチナーゼｃＤＮＡを含
む１．２ｋｂ断片をＬＧＴアガロースゲルから精製する
。この断片を、ＬＧＴアガロースゲルから精製されたＥ
ｃｏＲＩ　消化ＣＩＡＰ処理ｐＣＧＮ１７６１と混合し
、そして混合物を連結し、形質転換する。形質転換体を
キチナーゼｃＤＮＡ挿入物に対してスクリーニングし、
ＣａＭＶプロモーターに対してセンス配向にあるキチナ
ーゼｃＤＮＡ挿入物を含む１つのプラスミドをｐＣＩＢ
１００７と命名する。二重３５Ｓプロモータ断片がｐＣ
ＧＮ１５４０の植物選択性マーカー遺伝子に近接するよ
うな配向に、ｐＣＩＢ１００７の４．８ｋｂＸｂａＩ断
片をＸｂａＩ消化ｐＣＧＮ１５４０内にクローン化し、
ｐＣＩＢ１００７を生成する。 【００５２】実施例７：合成溶菌ペプチドＮｏ．３をコ
ード化する遺伝子の構築 上記のように合成溶菌ペプチドＮｏ．３は配列番号：１
のアミノ酸配列を有する。このペプチドをコード化する
合成遺伝子は数段階で構築される。最初に成熟（プロセ
シング後の）タンパク質をコード化する遺伝子を合成し
、クローン化し、次いで植物内での発現および分泌のた
めのシグナルペプチドおよび５’リーダー配列を添加し
、最後に３’非翻訳配列および３’ｍＲＮＡプロセシン
グ部位を添加する。これにより植物中で形質転換され得
、そして細胞外に分泌されるであろう溶菌ペプチドの合
成を指示する合成溶菌ペプチドＮｏ．３をコード化する
遺伝子が得られる。 Ａ．成熟ペプチドに対するコード配列の構築配列番号：
２および配列番号：３の配列を有する２種のオリゴヌク
レオチド、オリゴ１およびオリゴ２は、アプライド・バ
イオシステムズ３８０Ａシンセサイザーによりβ−シア
ノエチル−ホスホルアミジット化学を用いて合成され、
そしてＯＰＣベース精製（アプライド・バイオシステム
ズ）を用いて業者により記載されるように精製する。精
製オリゴヌクレオチドにまずポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸付加し、次いで６５℃でアニール化する。反応
物を３７℃に冷却し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを特級
ＡＴＰと共に添加し、そして連結をさらに１時間保温す
る。反応物を次に６５℃で１時間加熱し、リガーゼを失
活させ、次に希釈し、推奨されたＥｃｏＲＩ　緩衝液中
に１倍とする。ＤＮＡをフェノールで抽出し、そして０
．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールで沈殿
させる。沈殿物を遠心分離により集め１０ｍＭ　　ＴＥ
緩衝液〔４５〕中に再懸濁する。ＤＮＡを３．０％低ゲ
ル化温度アガロースゲルで電気泳動し、そして合成遺伝
子を含むバンドを切出し、そしてｐブルースクリプト（
ストラタジーン）のＥｃｏＲＩ　部位に連結する。連結
反応物は大腸菌内に形質転換され、そしてコロニーを選
択し、そして陽性と予想される構築物を最初に制限消化
により、次にＤＮＡ配列決定により分析される。ｐＢＳ
ｌｙｐｅｐ３と命名される１つの構築物は正しい配列を
含むことが決定され、そして次の操作のために選択され
る。 Ｂ．５’フランキング配列およびシグナルペプチドのｐ
ＢＳｌｙｐｅｐ３への添加 ＰＲ−１ａ遺伝子の５’リーダーおよびシグナルペプチ
ドを文献〔１８〕に記載されたような試験管内遺伝子融
合法に基づいたＰＣＲを用いて合成遺伝子に添加する。 この方法において、遺伝子融合はオーバーラップ末端を
有する２つの断片をＰＣＲにより生成することにより行
われる。次の反応において、これら２つの断片を次にＰ
ＣＲにより再び融合し２つの分子の間の完全融合物を生
成する。この方法は、溶菌ペプチドに対するコード配列
にＰＲ−１ａシグナルペプチドおよびリーダーを融合す
るために使用される。この融合を完了すると、以下の４
つのオリゴヌクレオチドが合成され、そして上記のよう
に精製される：配列番号：４，配列番号：５，配列番号
：６および配列番号：７。オリゴ３（配列番号：４）お
よびオリゴ４（配列番号：５）は互いに相補的であり、
そしてＰＲ−１ａシグナルおよびリーダーと溶菌ペプチ
ドコード配列との間の融合に望ましいＤＮＡ配列を含む
。望ましい融合物は下に示されている（配列番号：８）
。オリゴ５（配列番号：６）はＰＲ−１ａｃＤＮＡの５
’末端と同じ配列を有し、ＥｃｏＲＩ制限部位をコード
化する配列を５’に含む。オリゴ６（配列番号：７）は
溶菌ペプチド３をコード化する合成遺伝子の３’末端に
相補的であり、そして５’末端にＥｃｏＲＩ　部位を含
む。ＤＮＡの２つの切片を融合するために、２回のＰＣ
Ｒ反応が行われる。オリゴ３（配列番号：４）およびオ
リゴ６（配列番号：７）をプライマーとして用いる１回
、およびオリゴ４（配列番号：５）およびオリゴ５（配
列番号：６）をプライマーとして、そしてプラスミドｐ
ＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃｌａ（ＡＴＣＣ４０４２６）を鋳
型として用いるもう１回である。ＰＣＲ反応はジーン・
アンプ・キット（パーキン・エルマー／シータス）を用
いて業者により示唆されるように行われる。ＰＣＲ生成
物はアガロースゲル電気泳動により分析される。次いで
それらは精製され、そして一部を第２のＰＣＲ反応に使
用される。この反応においてプライマーオリゴ５（配列
番号：６）およびオリゴ６（配列番号：７）は生成物を
増幅するために使用される。この方法においてＤＮＡの
２つの切片が上で説明されたような予め決められた様式
で融合される。反応生成物はアガロースゲル電気泳動に
より分析される。ＤＮＡを次にフェノール抽出し、そし
てエタノール沈殿し、そして沈殿したＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ　で消化する。このＤＮＡを次に低ゲル化温度アガロ
ースゲル上での電気泳動により精製し、そしてＥｃｏＲ
Ｉ　で消化されＣＩＡＰ処理されたｐブルースクリプト
内に連結する。 ＤＮＡは大腸菌内に形質転換され、そして形質転換体が
選択される。陽性と予想される構築物を最初に制限消化
によりスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定により
予想した構造を確認する。１つの構築物がｐＢＳＬＰ５
’ＰＲ１と命名され、そして次の操作のために使用され
る。 Ｃ．溶菌ペプチド遺伝子の二重３５Ｓ発現ベクター内へ
のサブクローニング ５’リーダー配列およびシグナルペプチドを有する合成
溶菌ペプチドを植物発現ベクターｐＣＧＮ１７６１（ア
ンピシリン耐性を有する二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
／ターミネータカセット）内にサブクローン化する。ｐ
ＣＧＮ１７６１は二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよび
ｔｍ−Ｉ３’領域を、ｐＵＣ誘導プラスミド骨格中に含
まれたそれらの間のＥｃｏＲＩ　部位と共に含有する。 プロモータ−ＥｃｏＲＩ　−３’プロセシング部位カセ
ットは簡単な除去のために多重制限部位により隣接され
ている。プラスミドは、それ自体ｐＣＧＮ１６４および
ｐＣＧＮ６３８から誘導される最初の二重３５Ｓプラス
ミド、ｐＣＧＮ２１１３から数段階（下記参照）で誘導
される。ｐＣＧＮ１４３１はまた、二重ＣａＭＶ３５Ｓ
プロモータおよびｔｍ−Ｉ３’領域を、それらの間の多
重クローニング部位と共に含有する。プロモータ／ター
ミネータカセットは、アンピシリン耐性遺伝子よりクロ
ラムフェニコールを含むｐＵＣ誘導ベクター内に包含さ
れる。カセットは簡単な除去のために多重制限部位によ
り隣接されている。 ａ．ｐＣＧＮ９８６の構築 ｐＣＧＮ９８６はＣａＭＶ３５ＳプロモータおよびＴ−
ＤＮＡｔｍ−Ｉ３’領域を、それらの間の多重クローニ
ング部位と共に含有する。ｐＣＧＮ９８６は、ＣａＭＶ
３５Ｓプロモータおよび異なる３’領域、ＣａＭＶ領域
ＶＩ３’末端を含有する別のプラスミドｐＣＧＮ２０６
から誘導される。ＣａＭＶ３５ＳプロモータはＡｌｕＩ
断片（ｂｐ７１４４−７７３４）〔１３〕としてＭ１３
ｍｐ７〔３４〕のＨｉｎｃＩＩ部位中にクローン化され
、Ｃ６１４を生成する。Ｃ６１４のＥｃｏＲＩ　消化は
３５Ｓプロモータを含むＣ６１４からのＥｃｏＲＩ　断
片を生成し、これはｐＵＣ〔５５〕ょＥｃｏＲＩ　部位
内にクローン化されｐＣＧＮ１４７を生成する。プロモ
ータ領域、選択性マーカー（２ＡＴＧを有するカナマイ
シン）および３’領域を含むｐＣＧＮ１４８ａはをＢｇ
ｌＩＩ　でｐＣＧＮ５２８を消化し、そしてｐＣＧＮ１
４７からのＢａｍＨＩ　−ＢｇｌＩＩ　プロモータ断片
を挿入することにより製造される。この断片をｐＣＧＮ
５２８のＢｇｌＩＩ　部位内にクローン化し、その結果
ＢｇｌＩＩ　部位をｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝
子に近接させる。この構築のために使用されるシャトル
ベクターｐＣＧＮ５２８は以下のように製造される：ｐ
ＣＧＮ５２５は、カナマイシン遺伝子〔２２〕に近接す
るＴｎ５を含有するプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｂ
ａｍＨＩ　で消化し、カナマイシン耐性遺伝子含有Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ　断片をｐＡＣＹＣ１８４〔
８〕のテトラサイクリン遺伝子中のＨｉｎｄＩＩＩ　−
ＢａｍＨＩ　部位内に挿入することにより製造される。 ｐＣＧＮ５２６は、ＳｍａＩ部位内に挿入されたＸｈｏ
Ｉリンカーで変性されたｐＴｉＡ６〔５４〕のＢａｍＨ
Ｉ　断片１９をｐＣＧＮ５２５のＢａｍＨＩ　部位に挿
入することにより製造される。ｐＣＧＮ５２８は、小さ
いＸｈｏＩを欠失し、そして再連結することにより得ら
れる。ｐＣＧＮ１４９ａはｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩからの
ＢａｍＨＩ　カナマイシン遺伝子断片をｐＣＧＮ１４８
ａのＢａｍＨＩ　部位内にクローニングすることにより
製造される。ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩは、ＸｈｏＩ欠失を
有するが、しかしアクロバクテリウム中での効率的な選
択を可能にするＴｎ９０３からの機能的カナマイシン遺
伝子を含むｐＵＣ４Ｋ変種〔５５〕である。 ｐＣＧＮ１４９ａをＨｉｎｄＩＩＩ　とＢａｍＨＩで消
化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ　とＢａｍＨＩ　で消化さ
れたｐＵＣ８に連結され、ｐＣＧＮ１６９を生成する。 これによりＴｎ９０３カナマイシンマーカーが除去され
る。ｐＣＧＮ５６５およびｐＣＧＮ１６９の両方をＨｉ
ｎｄＩＩＩ　およびＰｓｔＩで消化し、そして連結し、
ＣａＭＶ３５ＳプロモータおよびＴＮ５カナマイシン遺
伝子の５’末端（ＰｓｔＩ部位まで）〔２２〕の一部を
含むプラスミドｐＣＧＮ２０３を形成する。 ３’調節領域をｐＣＧＮ２０４（ＨｉｎｄＩＩＩ　およ
びＰｓｔＩとの消化および連結によりｐＵＣ１８〔１３
〕中にサブクローン化された遺伝子ＶＩの３’領域を含
むＣａＭＶのＥｃｏＲＩ　断片（ｂｐ４０８−６１０５
））からのｐＣＧＮ２０３に添加する。生成するカセッ
トｐＣＧＮ２０６はｐＣＧＮ９８６の構築のための基礎
である。ｐＴｉＡ６Ｔ−ＤＮＡｔｍ−Ｉ３’配列はＢａ
ｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ　断片（ヌクレオチド９０６２な
いし１２８２８、文献〔２〕に番号が付されている）と
してＢａｍ１９Ｔ−ＤＮＡ断片〔５４〕からサブクロー
ン化され、そしてＥｃｏＲＩ　−ＨｉｎｄＩＩ断片およ
びゲンタマイシンマーカー（プラスミドｐＬＢ４１から
）のような、ＢａｍＨＩ　−ＨｉｎｄＩＩ断片のような
複製の起源ｐＡＣＹＣ１８４〔８〕と結合され、ｐＣＧ
Ｎ４１７を生成する。ｐＣＧＮ４１７の単一のＳｍａＩ
部位（Ｂａｍ１９断片のヌクレオチド１１２０７）をリ
ンカーによりＳａｃＩ部位に変え、そしてＢａｍＨＩ　
−ＳａｃＩ部位をｐＣＧＮ５６５内にサブクローン化し
ｐＣＧＮ９７１を得る。ｐＣＧＮ９７１のＢａｍＨＩ　
部位をリンカーによりＥｃｏＲＩ　部位に変え、ｐＣＧ
Ｎ９７１Ｅを得る。生成するｐＣＧＮ９７１ＥのＥｃｏ
ＲＩ　−ＳａｃＩ断片はｔｍ−Ｉ３’調節配列を含み、
ＥｃｏＲＩ　とＳａｃＩでの消化によりｐＣＧＮ２０６
に結合され、ｐＣＧＮ９７５を得る。Ｔｎ５カナマイシ
ン耐性遺伝子の小部分をＳａｃＩおよびＢａｌＩＩ　で
の消化、末端のブラント化およびＳａｌＩリンカーとの
連結によりＣａＭＶ３５Ｓプロモータの３’末端から切
除する。最終発現カセットｐＣＧＮ９８６はＣａＭＶ３
５Ｓプロモータ、それに続くＳａｌＩ部位、ＸｂａＩ部
位、ＢａｍＨＩ　、ＳｍａＩ　ＫｐｎＩ　およびｔｍＩ
３’領域を含む（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド１１２０７
−９０２３）。 ｂ．ｐＣＧＮ１６４の構築 ＣａＭＶ（ｂｐ７１４４−７７３５）のＡｌｕＩ断片〔
１３〕はＡｌｕＩでの消化により得られ、そしてＭ１３
ｍｐ７〔５５〕のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化されて
Ｃ６１４を生成する。Ｃ６１４のＥｃｏＲＩ　消化によ
り３５Ｓプロモータを含むＣ６１４からのＥｃｏＲＩ　
断片を生じ、これはｐＵＣ８〔５５〕のＥｃｏＲＩ　部
位内にクローン化されｐＣＧＢ１４６を生成する。プロ
モータ領域を削除するため、ＢｇｌＩＩ　部位（ｂｐ７
６７０）をＢｇｌＩＩ　およびＢａｌ３１　で処理し、
そして次にＢｇｌＩＩ　リンカーをＢａｌ３１　処理Ｄ
ＮＡに付着させ、ｐＣＧＮ１４７を生成する。ｐＣＧＮ
１４７をＥｃｏＲＩＨｐｈＩで消化し、そして３５Ｓプ
ロモータを含有する生成するＥｃｏＲＩ−ＨｐｈＩ断片
をＥｃｏＲＩ　−ＳｍａｌＩ　消化Ｍ１３ｍｐ８〔５５
〕に連結し、ｐＣＧＮ１６４を生成する。 ｃ．ｐＣＧＮ６３８の構築 ＣａＭＶ〔１３〕のＢｇｌＩＩ　での消化により３５Ｓ
プロモータ領域（ｂｐ６４９３−７６７０）を含有する
ＢｇｌＩＩ　断片が得られ、これをｐＵＣ１９〔３８〕
のＢａｍＨＩ　部位に連結されｐＣＧＮ６３８を生成す
る。 ｄ．ｐＣＧＮ２１１３の構築 ｐＣＧＮ１６４をＥｃｏＲＶ　およびＢａｍＨＩ　で消
化して、一部の３５Ｓプロモータ（ｂｐ７３４０−７３
４４）を含有するＥｃｏＲＶ　−ＢａｍＨＩ　断片を放
出する。ｐＣＧＮ６３８をＨｉｎｄＩＩＩ　およびＥｃ
ｏＲＶ　で消化して、異なる部位の３５Ｓプロモータ（
ｂｐ６４９３−７３４０）を含有するＨｉｎｄＩＩＩ　
−ＥｃｏＲＶ　断片を放出する。これら２つの断片を、
ＨｉｎｄＩＩＩ　とＢａｍＨＩ　で消化されて３５Ｓプ
ロモータを含むＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ　断片を
除去したｐＣＧＮ９８６内に連結する。この連結により
、ｐＣＧＮ９８６からの骨格およびｔｍ−Ｉ３’領域お
よびｐＣＧＮ１６４およびｐＣＧＮ６３８からの２つの
３５Ｓプロモータ断片を含有するｐＣＧＮ６３９が得ら
れる。ｐＣＧＮ６３８をＥｃｏＲＶ　およびＤｄｅＩで
消化して、３５Ｓプロモータの断片（ｂｐ７０７０−７
３４０）を含有するＥｃｏＲＶ　−ＤｄｅＩ断片を放出
する。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片
と処理してブラント末端を生成し、そしてｐＣＧＮ６３
９のＥｃｏＲＶ　部位中に連結して、適当な配向にある
断片を有するｐＣＧＮ２１１３を製造する。 ｅ．ｐＣＧＮ１７６１の構築 ｐＣＧＮ２１１３をＥｃｏＲＩ　で消化し、そしてプラ
スミドをＸｂａＩ部位およびＢａｍＨＩ　部位含有の合
成アダプタ（該アダプタは一端にＥｃｏＲＩ　粘着端を
含むが、隣接する塩基はＥｃｏＲＩ　部位がこの場所で
は認識されない）の存在下で連結して、ｐＣＧＮ２１１
３Ｍを生成する。ｐＣＧＮ２１１３ＭをＳａｃＩで完全
に消化し、次いでＢａｍＨＩ　での部分消化に供する。 このＤＮＡを次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼと処理し、ブ
ラント末端を生成し、そしてＥｃｏＲＩ　リンカーをブ
ラント末端化プラスミド内に連結する。形質転換の後に
、プロモータと無傷のｔｍ−Ｉ３’領域との間の唯一の
ＥｃｏＲＩ　部位を含むプラスミドクローンが選択され
、そしてｐＣＧＮ１７６１と命名される。プラスミドｐ
ＢＳＬＰ５’ＰＲ１をＥｃｏＲＩ　で消化し、そして溶
菌ペプチドおよびＰＲ−１ａシグナル／リーダーを含む
２００ｂｐ断片を低ゲル化温度アガロースゲルから精製
する。この断片をＥｃｏＲＩ　で消化されＣＩＡＰで処
理されたｐＣＧＮ１７６１内に連結され、そして低ゲル
化温度アガロースゲル上で精製する。連結反応物は大腸
菌を形質転換するために使用され、そして形質転換体が
選択され、次に挿入物に対してスクリーニングされる。 溶菌ペプチド遺伝子の配向において異なる２つのタイプ
の形質転換体が回収される。その遺伝子の１つはプロモ
ータに関して「センス」配向にあり、それが選択され、
そして数種のプラスミドがＤＮＡ配列決定により正しい
構築物であることが確認される。正しい配向および予想
されたＤＮＡ配列を有する１つのプラスミドをｐＢＳ２
Ｘ３５ＳＬｙｔＰｅｐと命名され、そして下の試験に使
用される。 Ｄ．２Ｘ３５Ｓ　　ＣａＭＶ／溶菌ペプチド発現カセッ
トの二重ベクター中でのサブクローニング発現カセット
は二重植物形質転換ベクターｐＣＧＮ１５４０内でサブ
クローン化される。該ベクターはアグロバクテリウム・
チュメファシエンスオクトピンＴｉプラスミドｐＴｉＡ
６の左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダー〔９〕、ｐＰＨ
ｉＪＩのゲンタマイシン遺伝子〔１７〕、ｐＬＪＢ１１
からのレプリコンのアグロバクテリウム・リゾゲネスＲ
ｉプラスミドオリジン〔２３〕、ｍａｓプロモータ領域
、Ｔｎ５のカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＴｉＡ６
のｍａｓ３’領域〔２２〕、ｐＢＲ３２２からの複製の
ＣｏｌＥｌオリジン〔４〕、およびｐＵＣ１８からのｌ
ａｃＺ’のスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含有
する。ゲンタマイシン耐性遺伝子ならびにＲｉおよびＣ
ｏｌＥ１オリジンを含むｐＣＧＮ１５４０の骨格はｐＣ
ＧＮ１５３２（下記参照）から誘導される。Ｔｉボーダ
ーおよび植物選択可能なマーカー遺伝子（ｍａｓ５’−
ｋａｎ−ｍａｓ３’）はｐＣＧＮ１５３７からのもので
ある。これに対し植物選択可能なマーカーカセットはｐ
ＣＧＮ１５３６からのものであり、右側ボーダーおよび
ｌａｃＺ’断片はｐＣＧＮ５６５ＲＢｘ２Ｘから誘導さ
れ、左側ボーダーはｐＣＧＮ６５から誘導される。 ａ．ｐＣＧＮ１５３２構築 ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む３．５ｋｂＥｃｏＲＩ
　−ＰｓｔＩ断片をｐＰｈｌＪＩ〔１７〕からＥｃｏＲ
Ｉ　−ＰｓｔＩ消化により除去し、そしてＥｃｏＲＩ　
−ＰｓｔＩ消化ｐＵＣ９〔５５〕内に連結してｐＣＧＮ
５４９を生成する。ｐＣＧＮ５４９のＨｉｎｄＩＩＩ　
−ＰｓｔＩ消化によりゲンタマイシン耐性遺伝子を含む
３．５ｋｂ断片が得られ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片によりブラント末端が製造され、これをＰｖｕ
ＩＩ　消化ｐＢＲ３２２〔４〕内にクローン化してｐＢ
Ｒ３２２Ｇｍを生成する。ｐＢＲ３２２ＧｍをＤｒａＩ
およびＳｐｈＩで消化し、クレノウ酵素と処理してブラ
ント末端を生成し、そして２．８ｋｂ断片を、ＡｐａＩ
で消化されクレノウ酵素でブラント末端が製造されたプ
ラスミドｐＬＪｂＢ１１〔２３〕を含むＲｉオリジン内
にクローン化され、ｐＬＨｂＢ１１Ｇｍを生成する。余
分なＣｏｌＥ１オリジンおよびカナマイシン耐性遺伝子
はｐＬＨｂＢ１１ＧｍからＢａｍＨＩ　での消化および
次の自己閉環により除去され、ｐＧｍＢ１１を生成する
。ｐＧｍＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ　部位はＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　消化および続くクレノウ酵素との処理および自己閉
環により除去され、ｐＧｍＢ１１−Ｈを生成する。ｐＧ
ｍＢ１１−ＨのＰｓｔＩ部位はＰｓｔＩ消化および続く
クレノウ酵素との処理および自己閉環により除去され、
ｐＣＧＮ１５３２を生成する。 ｂ．ｐＣＧＮ１５３６構築 ５．４ｋｂＥｃｏＲＩ　断片をｐＶＫ２３２〔２６〕か
らＥｃｏＲＩ　消化により除去され、そしてＥｃｏＲＩ
　消化ｐＡＣＹＣ１８４〔８〕内にクローン化されて、
ｐＣＧＮ１４を生成する。ｍａｓ５’領域（文献〔２〕
に従ってｂｐ２０１２８−２１５６２）を含むｐＣＧＮ
１４の１４３４ｂｐＣｌａＩ−ＳｐｈＩ　断片をＡｃｃ
Ｉ−ＳｐｈＩ　消化ｐＵＣ１９〔５６〕内にクローン化
してｐＣＧＮ５０を生成する。ｍａｓ５’領域の７４６
ｂｐＥｃｏＲＶ−ＮａｅＩ断片は、ＥｃｏＲＶ　とＮａ
ｅＩでｐＣＧＮ４０を消化し、次に合成ＸｈｏＩリンカ
ーＤＮＡの存在下で連結することによりＸｈｏＩ部位に
置き換えられ、ｐＣＧＮ１０３６を生成する。ｍａｓ３
’領域を含む、ｐＣＧＮ１４の７６５ｂｐＳｓｔＩ−　
ＨｉｎｄＩＩＩ　断片（ｂｐ１８４７４０−１９２３９
）はＳｓｔＩ−　ＨｉｎｄＩＩＩ　消化ｐＵＣ１８〔３
８〕内にクローン化されてｐＣＧＮ４３を得る。 ｐＣＧＮ４３のＨｉｎｄＩＩＩ　部位はＨｉｎｄＩＩＩ
　での消化、クレノウ酵素でのブラント末端付加、およ
び合成ＥｃｏＲＩ　リンカーＤＮＡの連結によりＥｃｏ
ＲＩ　で置き換えられて、ｐＣＧＮ１０３４を生成する
。ｐＣＧＮ１０３４の７６７ｂｐＥｃｏＲＩ　断片は、
ｍａｓ５’領域に近接するｍａｓ３’領域のｂｐ１９２
３９に位置する配向でＥｃｏＲＩ　消化ｐＣＧＮ１０３
６内にクローン化されてｐＣＧＮ１０４０を生成する。 ｐＣＧＮ１０４０をＳｓｔＩでの部分消化に供し、Ｔ−
ＤＮＡポリメラーゼと処理してブラント末端を生成し、
そして合成ＸｈｏＩリンカーＤＮＡの存在下で連結する
。ｂｐ１８４７４の結合部にＳｓｔＩ部位だけを有する
クローンが選択され、そしてベクターＤＮＡ（ｐＣＧＮ
４３内に構築され、そしてｐＣＧＮ１０４０内に運ばれ
た）をＸｈｏＩ部位により置換してｐＣＧＮ１０４７を
生成する。ｐＣＧＮ５６５（上記参照）をＥｃｏＲＩ　
およびＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、クレノウ酵素と処理
してブラント末端を製造し、そして合成ＸｈｏＩリンカ
ーＤＮＡの存在下で連結して、ｐＣＧＮ１００３を生成
する。これによりＸｈｏＩリンカーに隣接するＥｃｏＲ
Ｉ　部位が再び生成される。ｐＣＧＮ１００３をＥｃｏ
ＲＩ　で消化し、クレノウ酵素と処理してブラント末端
を製造し、そして合成ＰｓｔＩリンカーＤＮＡの存在下
で連結して、ｐＣＧＮ１００７を生成する。ｍａｓ５’
領域およびｍａｓ３’領域をそれらの間の多重クローニ
ング部位と共に含有するｐＣＧＮ１００７の１．５ｋｂ
ＸｈｏＩ断片はＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ１００７内にクロ
ーン化されて、ｐＣＧＮ１０５２を生成する。ｐＣＧＮ
１０５２の多重クローニング部位の一部はＸｂａＩおよ
びＳｓｔＩでの消化により除去され、クレノウ酵素と処
理されてブラント末端を製造し、そして連結されてｐＣ
ＧＮ１０５２８δＸＳを生成する。１ＡＴＧカナマイシ
ン耐性遺伝子を含むｐＣＧＮ５５０の１ｋｂＥｃｏＲＩ
　−ＳｍａＩ断片（ｐＣＧＮ７８３に記載）をＥｃｏＲ
Ｉ　−ＳｍａＩ消化ブルースクリプト（ストラタジーン
）内にクローン化してｐＢＳＫｍを生成する。このプラ
スミドは一本鎖ＤＮＡの生成を可能にするＭ１３領域を
含む。一本鎖ＤＮＡは業者の推奨に従って生成され、そ
して試験管内突然変異誘発は合成オリゴヌクレオチド（
配列番号：１４）を用いて行われ〔１〕、カナマイシン
耐性遺伝子内のＰｓｔＩ部位を変更し、そしてそれを消
化されないようにし、ｐＣＧＮ１５３４を生成する。ｐ
ＣＧＮ１５３４をＳｍａＩで消化し、合成ＥｃｏＲＩ　
リンカーＤＮＡの存在下で連結してｐＣＧＮ１５３５を
生成する。ｐＣＧＮ１５３６の１ｋｂＥｃｏＲＩ　断片
をＥｃｏＲＩ　消化ｐＣＧＮ１０５２δＸＳ内にクロー
ン化してｍａｓ５’−ｋａｎ−ｍａｓ３’植物選択性マ
ーカーカセットｐＣＧＮ１５３６を生成する。 ｃ．ｐＣＧＮ５６５ＲＡｘ２Ｘ構築 ｐＣＧＮ４５１（ｐＣＧＮ７８３と記載）をＨｐａＩで
消化し、合成ＳｐｈＩリンカーＤＮＡの存在下で連結し
てｐＣＧＮ５５を生成する。ｐＣＧＮ５５のＸｈｏＩ−
ＳｐｈＩ断片（アグロバクテリウム・チュメファシエン
スＴ−ＤＮＡの右側ボーダーを包含するｂｐ１３８００
−１５２０８，文献〔２〕）をＳａｌＩ−ＳｐｈＩ消化
ｐＵＣ１９〔５６〕内にクローン化してｐＣＧＮ６０を
生成する。ｐＣＧＮ６０のＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨ
Ｉ　断片をＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ　消化ｐＳＰ
６４（プロメガ）内にクローン化してｐＣＧＮ１０３９
を生成する。ｐＣＧＮ１０３９をＳｍａＩおよびＮｒｕ
Ｉで消化し（ｂｐ１４２７３−１５２０８切除，文献〔
２〕）、そして合成ＢｇｌＩＩ　リンカーＤＮＡの存在
下で連結してｐＣＧＮ１０３９δＮＳを生成する。ｐＣ
ＧＮ１０３９δＮＳの０．４７ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ　断片をＥｃｏＲＩ　−ＨｉｎｄＩＩＩ　消
化ｐＣＧＮ５６５（ｐＣＧＮ７８３に記載）内にクロー
ン化しｐＣＧＮ５６５ＲＢを生成する。ｐＣＧＮ５６５
ＲＢのＨｉｎｄＩＩＩ　部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ　消化
、クレノウ酵素との処理および合成ＸｈｏＩリンカーＤ
ＮＡの存在下での連結によりＸｈｏＩで置換されて、ｐ
ＣＧＮ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘを生成する。ｐＵＣ１８〔３
８〕をＨａｅＩＩ　で消化してｌａｃＺ’断片を放出し
、クレノウ酵素と処理してブラント末端を生成し、そし
てｌａｃＺ’断片含有断片を、これをＡｃｃＩおよびＳ
ｐｈＩで消化し、クレノウ酵素と処理し、ｌａｃＺ’プ
ロモータが右側ボーダー断片に近接する配向にあるｐＣ
ＧＮ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘに連結する。この構築物ｐＣＧ
Ｎ５６５ＲＡｘ２Ｘは適当な宿主上に置かれたときｌａ
ｃＺ’発現に対して陽性であり、そして欠失ＡｃｃＩ−
ＳｐｈＩ断片（ｂｐ１３８００−１３９９０）を有する
右側ボーダー断片〔２〕のｂｐ１３９９０−１４２７３
を含む。 ｄ．ｐＣＧＮ６５構築 ｐＣＧＮ５０１は、Ｔ−ＤＮＡの塩基１３３６２−１５
２０８〔２〕（右側ボーダー）を含むｐＴｉＡ６〔９〕
の１．８５ｋｂＥｃｏＲＩ　−ＸｈｏＩ断片をＥｃｏＲ
Ｉ　−ＳａｌＩ消化Ｍ１３ｍｐ９〔５５〕内にクローニ
ングすることにより構築される。ｐＣＧＮ５０２は、Ｔ
−ＤＮＡの塩基６０２−２２１２（左側ボーダー）を含
むｐＴｉＡ６の１．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳｍａＩ
断片をＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳｍａＩ消化Ｍ１３ｍｐ９内
にクローニングすることにより構築される。ｐＣＧＮ５
０１およびｐＣＧＮ５０２を両方ともＥｃｏＲＩ　およ
びＨｉｎｄＩＩＩ　て消化し、そして両方のＴ−ＤＮＡ
含有断片をＨｉｎｄＩＩＩ　消化ｐＵＣ９〔５５〕内に
一緒にクローン化して、両方のＴ−ＤＮＡのボーダー断
片を含有するｐＣＧＮ５０３を得る。ｐＣＧＮ５０３を
ＨｉｎｄＩＩＩ　およびＥｃｏＲＩ　で消化し、２つの
生成するＨｉｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲＩ　断片（Ｔ−Ｄ
ＮＡボーダー含有）をＥｃｏＲＩ　消化ｐＨＣ７９〔１
９〕内にクローン化してｐＣＧＮ５１８を生成する。ｐ
ＣＧＮ５１８からのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片は左側Ｔ
−ＤＮＡボーダーを含有し、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ　消
化ｐＣＧＮ５６５内にクローン化されてｐＣＧＮ５８０
を生成する。 ｐＣＧＮ５８０のＢａｍＨＩ　−ＢｇｌＩＩ　断片をｐ
ＡＣＹ１８４〔８〕のＢａｍＨＩ　部位にクローン化し
てｐＣＧＮ５１を生成する。右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを
含有するｐＣＧＮ６０（ｐＣＧＮ６５ｘ２Ｘの項参照）
の１．４ｋｂＢａｍＨＩ　−ＳｐｈＩ断片をＢａｍＨＩ
　−ＳｐｈＩ消化ｐＣＧＮ５１内にクローン化してｐＣ
ＧＮ６５を生成する。 ｅ．ｐＣＧＮ１５３７構築 ｐＣＧＮ６５をＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、クレ
ノウ酵素と処理してブラント末端を生成し、そして合成
ＢｇｌＩＩ　リンカーＤＮＡの存在下で連結してｐＣＧ
Ｎ６５８δＫＸを生成する。ｐＣＧＮ６５８δＫＸをＳ
ａｌＩで消化し、クレノウ酵素と処理してブラント末端
を生成し、そして合成ＸｈｏＩリンカーＤＮＡの存在下
で連結してｐＣＧＮ６５８δＫＸ−Ｓ＋Ｘを生成する。 Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー切片およびｌａｃＺ’遺伝子を
含有するｐＣＧＮＲＢｘ２Ｘの７２８ｂｐＢｇｌＩＩ　
−ＸｈｏＩ断片をＢｇｌＩＩ　−ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ
６５８δＫＸ−Ｓ＋Ｘ内にクローン化してｐＣＧＮ６５
ｘ２Ｘを置換する。ＣｌａＩ断片ｐＣＧＮ６５ｘ２Ｘを
欠失させ、ＣｌａＩで消化することによりＸｈｏＩリン
カーで置換し、クレノウ酵素と処理してブラント末端を
生成し、そして合成ＸｈｏＩリンカーＤＮＡの存在下で
連結してｐＣＧＮ６５δ２ＸＸを生成する。ｐＣＧＮ６
５δ２ＸＸをＢｇｌＩＩ　で消化し、そしてＢｇｌＩＩ
　消化ｐＣＧＮ５４９（ｐＣＧＮ１５３２の項参照）と
融合させて、両方のプラスミドの骨格を含むｐＣＧＮ１
５３０を生成する。ｐＣＧＮ１５３０をＸｈｏＩで消化
し、再連結し、次にｐＡＣＹＣ１８４誘導骨格を欠失し
たゲンタマイシンクロラムフェニコール感受性クローン
を選択し、ｐＣＧＮ１５３０Ａを生成する。ｍａｓ５’
−ｋａｎ−ｍａｓ３’カセットを含有するｐＣＧＮ１５
３６の２．４３ｋｂＸｈｏＩ断片がＸｈｏＩ消化ｐＣＧ
Ｎ１５３０Ａ内でクローン化されてｐＣＧＮ１５３７を
生成する。 ｆ．ｐＣＧＮ１５４０の最終配置 Ｔ−ＤＮＡボーダー間に植物選択性マーカー遺伝子およ
びｌａｃＺ’スクリーニング可能マーカー遺伝子（多重
クローニング部位と共に）を含有するｐＣＧＮ１５３７
のＢｇｌＩＩ　断片をＢａｍＨＩ　消化ｐＣＧＮ１５３
２内にクローン化させる。複製のｐＢＲ３２２開始部位
に隣接するＴ−ＤＮＡ右側ボーダーを生じる配向のクロ
ーンをｐＣＧＮ１５３９と命名し、そして複製のＲｉプ
ラスミド開始部位に隣接するＴ−ＤＮＡ右側ボーダーを
生じる配向のクローンをｐＣＧＮ１５４０と命名する。 この二重ベクターはＴ−ＤＮＡボーダーの間に最低量の
ＤＮＡ、アグロバクテリウム・チュメファシエンスにお
ける高い安定性、大腸菌内での多いコピー数、および標
的ＤＮＡのクローニングの場合に多重制限部位を有する
ブルー／ホムイトスクリーンを包含するいくつかの利点
を有する。ベクターはＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ
４０５８６）。溶菌ペプチドを含むｐＢＳ２Ｘ３５ＳＬ
ｙｔＰｅｐのＸｂａＩ断片は、プロモータ断片が植物選
択可能なマーカー遺伝子に近接するように、ｐＣＧＮ１
５４０のＸｂａＩ部位にサブクローン化される。このプ
ラスミドはｐＢＳｂｉｎ２Ｘ３５ＳＬｙｔＰｅｐと命名
され、下の実験に使用される。 Ｅ．アグロバクテリウムの形質転換 二重ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエン
スＬＢ４４０４株内に以下の方法に従って形質転換され
る。アグロバクテリウム株をＬＢＭＧ培地（５０％Ｌブ
ロス，５０％マンニトール−グルタメートブロス〔１４
〕）５ｍｌ中３０℃で一晩増殖させる。培養液５ｍｌを
ＬＢＭＧ２５０ｍｌに添加し、そして培養液濃度が６０
０ｎｍの波長でＯＤ＝０．６に達するまで激しく揺動す
る。細胞を８０００×ｇで遠心分離することにより集め
、そしてＬＢＭＧ５ｍｌ中に再懸濁する。細胞２００μ
ｌをＬＢＭＧ中の二重プラスミドＤＮＡ０．２ないし１
μｇに添加し、そして混合物を同時にドライアイス／エ
タノールで凍結させる。５分後チューブを３７℃の水浴
に５分間入れ、次にＬＢＭＧ２ｍｌを添加する。懸濁液
を３０℃の水浴中に２ないし３時間保持し、次いで細胞
を遠心分離により集める。細胞を最低量のＬＢＭＧ中に
再懸濁し、次いで選択培地（１００μｇ／ｍｌゲンタマ
イシン含有ＬＢＭＧプレート）上にプレーティングする
。コロニーは３０℃で２ないし３日後に現れる。プラス
ミドｐＢＳｂｉｎ２Ｘ３５ＳＬｙｔＰｅｐをアグロバク
テリウム内で形質転換し、そして陽性コロニーをサザン
ブロット分析により選択および確認し、そして植物形質
転換実験に使用する。 【００５３】実施例８：安定な形質転換およびトランス
ジェニック植物の再生 植物組織をこの分野で公知のあらゆる技術により上記ベ
クターで形質転換する。ＤＮＡを植物細胞中に導入する
ために使用される方法は例えば以下のものを包含する：
植物、植物組織もしくは細胞のアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスでの直接感染または両者の共培養〔２
０〕、外来ＤＮＡとプロトプラストとの処理〔４０，４
９，４１，３０，１１，３７，ＥＰ１６４５７５，ＧＢ
２１４０８２２〕、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
との保温〔３７〕、マイクロインジェクション〔４２，
４３〕、マイクロプロジェクタイルボンバードメント〔
２５〕。 【００５４】Ａ．タバコの葉ディスク形質転換ｐＨ５．
６に調整し、０．１５％マンニトール、５０μｇ／ｍｌ
カナマイシン、５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよ
び１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したグルタミ
ン酸塩培地中でアグロバクテリウム・チュメファシエン
スを１８ないし２４時間増殖させ、抗生物質を含まない
同一培地中０．２のＯＤ６００まで希釈する。 細菌を次に３ないし５時間増殖させ、０．２ないし０．
４のＯＤ６００まで希釈する。これを、文献〔２０〕に
従ってＧＡ７容器中無菌状態で生長させたニコチアナ・
タバカムのキサンチ栽培品種の葉から打ち抜かれた５な
いし７ｍｍのディスクの感染のために用いる。葉ディス
クをムムシゲおよびスクーグの大量塩および少量塩含有
（ＭＳ）、１ｍｇ／ｌベンジルアデニンおよび１ｍｇ／
ｍｌα−ナフタレン酢酸を含有する０．７％アガー上に
２日間保持し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μ
ｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１００μｇ／ｍｌメフォ
キシンを含有する同様の培地に移す。ディスク上に形成
する苗条を切除し、そしてＧＡ７容器中に５０μｇ／ｍ
ｌカナマイシンを含有するＭＳ培地上で苗条片を継代培
養することにより６つの小植物が得られるまで増殖させ
る。無ホルモンで５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有す
る培地に小植物を根づかせ、土壌に移し、そしてフィト
トロン中で馴化させ、化学制御剤での誘導処理のために
温室に移す。開花時に花は自家受粉するように誘導され
る。種子を集め成熟させる。 【００５５】Ｂ．トランスジェニックタバコカルスおよ
び植物の作出 アグロバクテリウムが葉ディスク（Ａ）から形成するカ
ルスを形質転換するために用いられる。カナマイシン含
有ＭＳＢＮ選択培地上で形成するカルスを、ＭＳ大量塩
、少量塩、およびＦｅ−ＥＤＴＡ（ギブコ，カタログ番
号５００−１１１７；４．３ｇ／ｌ）、ＭＳビタミン、
１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、２０ｇ／ｌショ糖、
２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸および０．３ｍｇ／ｌカイネ
チンからなるカルス増殖培地上に維持する。ＭＳＢＮに
カルス片を移し、次にＡに記載した方法を行うことによ
りトランスジェニック植物を再生させるためにカルスが
使用され得る。 【００５６】Ｃ．ニンジンの形質転換 アグロバクテリウムをＡに記載したように増殖させる。 ０．２のＯＤ６００まで希釈された細菌が、次に表面滅
菌されたニンジンからのディスク切片の感染に使用され
る。ニンジンを表面滅菌するために、ニンジンの皮をむ
き、クロロックスの２０％溶液に２０分間浸す。ニンジ
ンを滅菌水ですすぎ、５ｍｍの片に切り、そして水アガ
ーの上に基部側を上にして置く。細菌２０ないし５０μ
ｌをディスクの上部表面に適用する。 【００５７】Ｄ．ヒマワリの形質転換 アグロバクテリウムをＡに記載したように増殖させる。 ０．２ないし０．４のＯＤ６００まで希釈された細菌が
、次に以下のように調製されたヒマワリ植物の茎の感染
に使用される。ヒマワリの種子を１０％カプタン中に１
０分間浸漬し、次に１０％クロロックス中に１０分間浸
漬し、滅菌水ですすぐ。種子被膜を除去し、そして０．
７％水アガー上で暗所中３日間発芽させ、その後それら
を２３℃および昼と夜が１２時間に設定されたラビリン
インキュベーターに移す。実生を１週間生長させ、その
後先端切除および切断茎表面への細菌の感染を行う。 【００５８】Ｅ．トマトの形質転換 アグロバクテリウムをＡに記載したように増殖させる。 ０．２ないし０．４のＯＤ６００まで希釈された細菌が
、次に以下のように調製されたトマト実生の茎の感染に
使用される。トマトの種子を１０％クロロックス中に２
０分間浸漬し、滅菌水ですすぐ。種子を０．７％水アガ
ー上で暗所中３日間発芽させ、その後それらを２３℃お
よび昼と夜が１２時間に設定されたラビリンインキュベ
ーターに移す。実生を１週間生長させ、その後先端切除
および切断茎表面への細菌の感染を行う。 【００５９】Ｆ．ワタの形質転換 アグロバクテリウムをＡに記載したように増殖させる。 ０．２ないし０．４のＯＤ６００まで希釈された細菌が
、次に以下のように調製されたワタの子葉の感染に使用
される。ワタの種子を１０％クロロックス中に２０分間
浸漬し、滅菌水ですすぐ。種子を０．７％水アガー上で
暗所中発芽させる。実生を１週間生長させ、その後子葉
表面への細菌の感染を行う。 【００６０】Ｇ．ゼア・メイズ優良近交系ファンク２７
１７の特別型のカルスの調製 ゼア・メイズ植物の優良近交系ファンク２７１７を温室
で開花まで生長させ、そして自家受粉させる。長さ約２
ないし２．５ｍｍのはい含む未熟の穂を植物から除去し
、そして１０％クロロックス溶液中で２０分間殺菌する
。胚を穀粒から無菌的に除去し、そして胚軸を下側に向
けて、０．１ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、６％（ｗ／ｖ）ショ
糖および２５ｍＭＬ−プロリンを含み０．２４％（ｗ／
ｖ）ゲルライトで固化されたＯＭＳ培地（開始培地）上
に置く。２週間の暗所中２７℃での培養の後、胚盤上で
生長するカルスを胚から除去し、そして０．５ｍｇ／ｌ
２，４−Ｄを含み０．２４％（ｗ／ｖ）ゲルライトで固
化されたＢ５培地〔１２〕上に置く。カルスを２週間毎
に新鮮培地に継代培養する。胚を開始培地上に置いてか
ら全体で８週間後、特別な型のカルスがその特徴的な形
態により同定される。このカルスは同一培地でさらに継
代培養する。さらに２ヵ月後、カルスを２ｍｇ／ｌ２，
４−Ｄを含みゲルライトで固化されたＮ６培地に移し、
そして連続的に継代培養する。 【００６１】Ｈ．ゼア・メイズ優良近交系ファンク２７
１７の懸濁培養液の調製 Ｇに記載されたカルスを全体で少なくとも６ヵ月継代培
養する。継代培養のために選択されたカルスの型は、液
体培地中に入れた時小さい個々の細胞集合体に分離する
ように、比較的粘着性でなく、球形のそして非常に脆い
ものである。大きく生長した細胞の凝集体を含む培養液
は保持されない。ゼア・メイズ優良近交系ファンク２７
１７の特別な型のカルスの一部５００ｍｇを１２５ｍｌ
デロングフラスコ中の２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ含有Ｎ６培
地３０ｍｌ中に入れる。ロータリーシェーカー上（１３
０ｒｐｍ，移動距離２．５ｃｍ）で暗所中２６℃での培
養１週間後、培地を新鮮培地に移す。懸濁液をこのよう
にして１週間後再び継代培養する。この時培養液を検査
し、そして大きく増殖した細胞のないものを保持する。 大きく増殖した細胞を有する凝集体を含む懸濁培養液を
廃棄する。好ましい組織は、通常の細胞凝集体のもにん
のに比べて特徴的に平滑な表面を有する密集した細胞分
裂性細胞凝集体からなる。保持された培養液はこれらの
小さな凝集体中に現れた細胞の少なくとも５０％を有す
る。これは望ましい形態である。これらの懸濁液は、１
週間より短い倍加時間であって速い成長速度を有する。 懸濁培養液は０．５ｍｌＰＶＣ（充填セル容量：ピペッ
ト中の設定セル容量）を２５ｍｌの新鮮培地に移すこと
により継代培養される。このようにして継代培養を４な
いし６週間行った後、培養液は１週間毎の継代培養あた
り２ないし３倍に増加する。細胞の７５％以上が望まし
い形態である培養液がさらに継代培養を行うことにより
保持される。ポアサイズ６３０μｍのステンレス鋼ふる
いを周期的に通すことが培養液の分散を高めるためにあ
る場合には行われるが、必ずしも必要ではない。 Ｉ．ゼア・メイズの懸濁培養液からプロトプラストの調
製 Ｈで調製された懸濁培養液のＰＶＣ１ないし１．５ｍｌ
を、４％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲＳとＫＭＣ（８．６５
ｇ／ｌＫＣｌ，１６．４７ｇ／ｌＭｇＣｌ２・６Ｈ２　
Ｏ，１２．５ｇ／ｌＣａＣｌ２　・２Ｈ２Ｏ，５ｇ／ｌ
ＭＥＳ，ｐＨ５．６）塩溶液中の１％（ｗ／ｖ）リゾチ
ームとからなるろ過滅菌混合物１０ないし１５ｍｌ中で
保温する。ゆっくり揺れるテーブル上ににおいて３０℃
で消化を３ないし４時間行う。調製液はプロトプラスト
放出に対して倒立顕微鏡で追跡する。放出されるプロト
プラストを以下のように集める：調製液を１００μｍメ
ッシュシーブ、次に５００μｍメッシュシーブを通して
ろ過する。プロトプラストをシーブ上において酵素溶液
の最初の容量と同じ容量のＫＭＣ塩溶液で洗浄する。プ
ロトプラスト調製液１０ｍｌを種々の使い捨て遠心用チ
ューブに入れ、そして０．６Ｍショ糖溶液（０．１％（
ｗ／ｖ）モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳおよびＫ
ＯＨ）でｐＨ５．６に緩衝化）１．５ないし２ｍｌを下
層とした。チューブを６０ないし１００×ｇで１０分間
遠心分離し、そして界面に集まるプロトプラストをピペ
ットで集め、そして新しいチューブに入れる。プロトプ
ラスト調製液を新鮮なＫＭＣ塩溶液１０ｍｌ中に再懸濁
し、そして６０ないし１００×ｇで遠心分離する。上澄
みを除去して廃棄し、残っている滴中にプロトプラスト
をゆっくり再懸濁し、次いで１３／１４強度のＫＭＣ１
０ｍｌを添加する。５分間再び遠心分離した後、上澄み
を再び除去し、そしてプロトプラストプロを６／７強度
のＫＭＣ溶液中に再懸濁する。一部を計数のための採取
し、そして再び遠心分離により沈殿させる。プロトプラ
ストを、ＫＭ−８ｐ培地または０．５Ｍマンニトール含
有６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　または形質転換用のその他の
適当な培地中にｍｌあたり１０７　で再懸濁させる。 【００６２】Ｊ．ゼア・メイズプロトプラストのエレク
トロポレーションによる形質転換 ａ．熱ショックを除いて全ての段階が室温（２２ないし
２８℃）で行われる。プロトプラストをＩの最後の段階
において、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＥＳおよび６ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２　を含有する０．５Ｍマンニトール中に再懸
濁させる。懸濁液の耐性をダイアログ・エレクトロポリ
ーター（ダイア−ログ・ゲーエムベーハー，ドイツ国Ｄ
−４０００デュッセルドルフ）のチャンバー中で測定し
、そして３００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　溶液を用いて１な
いし１．２ｋオームに調整する。試料を含有するチュー
ブを４５℃の水浴に４５℃で浸漬し、次に氷上で室温ま
で冷却することによりプロトプラストに熱ショックを与
える。植物選択性ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む線
状化プラスミド〔４４〕またはキメラ遺伝子構築物４ｇ
および子牛胸腺担体ＤＮＡ２０μｇを上記懸濁液０．２
５ｍｌに添加する。０．５Ｍマンニトール含有３０ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２　中の２４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（ＭＷ８
０００）溶液０．１２５ｍｌをプロトプラストに添加す
る。混合物を十分に、しかしゆっくり混合し、そして１
０分間保温する。試料をエレクトロポレーターのチャン
バーに移し、そして試料を１０秒間隔で３回加える（１
５００，１８００，２３００または２８００Ｖｃｍ−１
の初期電圧，１μ秒の指数関数的破壊時間）。プロトプ
ラストを以下のように培養する。試料を６ｃｍペトリ皿
に室温でプレーティングする。さらに５ないし１５分後
、１．２％（ｗ／ｖ）シープラークアガロースおよび１
ｍｇ／ｌ　　２，４−Ｄを含有するＫＭ−８ｐ培地３ｍ
ｌを添加する。アガロースおよびプロトプラストを十分
に混合し、そして培地をゲル化させる。 ｂ．１つまたはそれ以上の以下の変形を行ってａが繰り
返される：（１）プロトプラスト調製液の耐性が０．５
ないし０．７ｋオームに調整される。 （２）使用されるＰＥＧが分子量４０００を有するＰＥ
Ｇである。 （３）ＰＥＧが添加されないか、または１２％（ｗ／ｖ
）ＰＥＧ１／２容量が添加される。 （４）パルスが３秒の間隔で適用される。 （５）プロトプラストが１６℃の温度に冷却されたプレ
ート上に置かれた皿中でのエレクトロポレーションの後
にプレーティングされる。 （６）プロトプラストをエレクトロポレーションの後に
チューブ中に入れ、６／７強度のＫＭＣ溶液またはＷ５
溶液（３８０ｍｇ／ｌＫＣｌ，１８．３７５ｇ／ｌＣａ
Ｃｌ２　・２Ｈ２　Ｏ，９ｇ／ｌＮａＣｌ，ｐＨ６．０
からなる）１０ｍｌで洗浄し、次に６０×ｇで１０分間
の遠心分離により集め、ＫＭ培地０．３ｍｌ中に再懸濁
し、そしてａのようにプレーティングする。 （７）子牛胸腺担体ＤＮＡを添加しない。 【００６３】Ｋ．ゼア・メイズプロトプラストのＰＥＧ
での処理による形質転換 ａ．Ｉの最後の段階でプロトプラストを１２ないし３０
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　含有の０．５Ｍマンニトール溶液
中に再懸濁する。４５℃５分間の熱ショックをＪに記載
のように行う。プロトプラストを遠心チューブ中の形質
転換のための一部に分散させ、チューブあたり懸濁され
るプロトプラストを０．３ｍｌとする。次の１０分間に
以下の物質を添加する：ＤＮＡ（Ｊと同様）およびＰＥ
Ｇ溶液（ＭＷ６０００，４０％（Ｗ／Ｖ）；０．１ＭＣ
ａ（ＮＯ）３　および０．４Ｍマンニトール含有；ＫＯ
ＨでｐＨ８ないし９）で最終ＰＥＧ濃度を２０％とする
。一部を時折揺動しながら３０分間保温し、次いでプロ
トプラストをペトリ皿中に入れ（直径６ｃｍあたり初期
プロトプラスト懸濁液０．３ｍｌ）、そしてＪに記載の
ように培養する。 ｂ．ａを繰り返し、プロトプラストを洗浄し、２ないし
３分の間隔で５回Ｗ５溶液０．３ｍｌを添加することに
よりＰＥＧ溶液中で３０分間の保温を行う。プロトプラ
スト懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、そしてプロ
トプラストをＪ．ａに記載のように培養する。 ｃ．ＰＥＧ最終濃度を１３と２５％（ｗ／ｖ）の間にす
る以外はａおよびｂを繰り返す。 【００６４】Ｌ．プロトプラストからカルスの再生アガ
ロース中にプロトプラストを含有する植物を２６℃で暗
所に置く。１４日後、コロニーがプロトプラストから生
じる。コロニーを含むアガロースを２ｍｇ／ｌ２，４−
Ｄを含みゲルライトで固化されたＮ６培地を含有する直
径９ｃｍのペトリ皿の表面に移す。この培地を２Ｎ６と
命名する。カルスをさらに２６℃で暗所中培養し、そし
てカルス片を新鮮な固体２Ｎ６培地上に２週間毎に継代
培養する。 【００６５】Ｍ．ゼア・メイズの形質転換されたカルス
の選択 形質転換された細胞を選択するために１００ｍｇ／ｌま
たは２００ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを２Ｎ６培地に
添加する変形を行った以外はＬを繰り返す。 【００６６】Ｎ．トウモロコシ植物の再生ａ．カルスを
維持のために２Ｎ６培地上に置き、そして再生開始のた
めにＯＮ６（２，４−Ｄを含まないＮ６培地）およびＮ
６１培地（０．２５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄおよび１０ｍｇ
／ｌカイネチン含有のＮ６培地）上に置く。ＯＮ６およ
びＮ６１培地上で生長するカルスを明所（白色蛍光灯か
ら８４０ないし８４００ルクスの光を１６時間／日）中
で生長させる。Ｎ６１培地上での延長された時間は有害
であるので、Ｎ６１培地上で生長するカルスを２週間後
にＯＮ６培地に移す。カルスが幾つかの培地配合物に再
び移されても、カルスを２週間ごとに継代培養する。小
植物が約４ないし８週間で現れる。小植物が少なくとも
２ｃｍの高さに達したら、ＧＡ７容器中のＯＮ６培地に
移す。根が２ないし４週間で形成され、そして根が生長
を支持するのに十分形成されたら、小植物をピートポッ
ト中に土壌に移し、日陰に最初の４ないし７日置く。馴
化を補助するために、２ないし３日小植物の上に透明な
プラスチックカップを逆さにかぶせておくおくことはし
ばしば有利である。植物が確立されたら、通常のトウモ
ロコシ植物として処理し、温室で成熟させる。後代を得
るために、植物は自家受粉されるか、または野生型と交
雑させる。 ｂ．カルスを維持するために使用される培地に１００ｍ
ｇ／ｌまたは２００ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを添加
する変形を行った以外はａを繰り返す。 【００６７】Ｏ．ダクチリス・グロメラタ（カモガヤ）
の組織から胚形成性懸濁液の調製 ａ．胚形成性カルスを温室栽培カモガヤの幼若葉の基部
から開始する〔１６〕。葉の表面をクロロックス（５．
２５％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム，クロロックス
・カンパニー，カリフォルニア州オークランド）の１：
１０希釈液中に約１０分間浸漬することにより滅菌し、
次に長さまたは直径１ないし５ｃｍの小片に無菌的に切
断する。これらの切片を、ゲル化剤として０．８％（ｗ
／ｖ）アカロース含有の無菌ＳＨ−３０培地上に置く。 約２５℃の培養下、プレーティング後２ないし６週間で
カルスまたは胚形成性構造物が現れる。新鮮ＳＨ−３０
培地上での２ないし４週間毎の継代培養および２５℃暗
所での培養により胚形成性カルスが維持される。 ｂ．胚形成性懸濁培養液を、４５μＭジカムバおよび４
ｇ／ｌカゼイン加水分解物含有の液体培地〔１５〕５０
ｍｌ中に胚形成性カルスを新鮮重量で約０．５ｇ置くこ
とにより開始する。懸濁培養液を金属キャップおよびパ
ラフィルムで密封された１２５ｍｌデロングフラスコ中
、１６時間の照明（３３００ルクス）、８時間の暗所の
光条件下、ジレイターシェーカー上約１３０ｒｐｍで生
長させる。約４週間後、大きな凝集体を約３０秒間沈殿
させ、そして小さい細胞クラスターを含む上澄み培地の
１０ｍｌを除去し、そして新鮮培地５０ｍｌに移す。 小さい細胞質細胞の存在基づいてより小さい凝集体およ
びよりよい品質により判断される最も成功率の高い培養
物を用いて、上記操作を３ないし４週間毎に繰り返す。 ５ないし８回の移し変えの後に、懸濁液は非胚形成性細
胞を実質的に含まず、そして胚形成性細胞クラスターは
極めて小さい（１５０ないし２０００μｍ）。 【００６８】Ｐ．ダクチリス・グロメラタのプロトプラ
ストの単離および精製 細胞をナルゲン０．２μｍフィルター単位で無菌ろ過し
、そして次にペトリ皿中のプロトプラスト酵素混合物１
２．５ｍｌに新鮮重量で約０．５ｇの細胞を添加するこ
とによりＯの胚形成性懸濁培養液からプロトプラストを
調製する。酵素混合物は２％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲＳ
、７ｍＭ　　ＣａＣｌ２　・Ｈ２　Ｏ、０．７ｍＭ　　
ＮａＨ２　ＰＯ４　・Ｈ２　Ｏ、３ｍＭ　　ＭＥＳ（ｐ
Ｈ５．６）、グルコース（５５０ｍＯｓ／ｋｇＨ２　Ｏ
，ｐＨ５．６）からなり、そしてろ過滅菌される。混合
物をオービタルシェーカー上約５０ｒｐｍ、４００ルク
ス未満の照明下、約４ないし５時間回転させる。消化物
を次にステンレスシーブ（１００μｍメッシュサイズ）
に通し、１２ｍｌの遠心チューブに分配し、約６０ない
し１００×ｇで約５分間遠心分離する。プロトプラスト
含有沈殿物を次に、グルコースで５５０ｍＯｓ／ｋｇＨ
２　Ｏに調整したプロトプラスト培養培地ＫＭ−８ｐで
３回洗浄する。この時点で、浮上段階をプロトプラスト
の精製のためにさらに行ってもよい。この場合、洗浄プ
ロトプラストをショ糖で７００ｍＯｓ／ｋｇＨ２　Ｏに
調整したプロトプラスト培養培地ＫＭ−８ｐ１０ｍｌの
上層に乗せる。約６０ないし１００×ｇで約１０分間遠
心分離後、界面のプロトプラストバンドを細かいピペッ
トを用いて集める。 最後にプロトプラストをＫＭ−８ｐ１ないし２ｍｌ中に
再懸濁させ、そしてステンレスメッシュスクリーン（２
０μｍメッシュサイズ）に通す。放出されたプロトプラ
ストを集め、洗浄し、そしてＫＭ−８ｐ培地中に、また
は形質転換のために適当な浸透圧調整培地に再懸濁させ
る。 【００６９】Ｑ．ダクチリス・グロメラタのプロトプラ
ストの培養およびカルスの生長 ａ．精製プロトプラストを、１．３％（ｗ／ｖ）シープ
ラークアガロースをおよび３０ないし４０％（ｗ／ｖ）
調整培地（３ないし４週齢のダクチリス・グロメラタの
胚形成性懸濁培養液を滅菌ナルゲン０．２μｍフィルタ
ーに通し、グルコースを添加して５５０ｍＯｓ／ｋｇＨ
２　Ｏに調整し、そして再びろ過滅菌することにより得
られた）を含有するＫＭ−８ｐ培養培地中にｍｌあたり
約５×１０５　プロトプラストの密度で置く。次いでプ
レートを暗所中２８℃の定温で置く。１０ないし１４日
後アガロースをウェッジに切断し、最初のアガロース添
加培養液３ｍｌあたり３％（ｗ／ｖ）と共にＳＨ−４５
懸濁培養液２０ｍｌを用いて「ビーズカルチャー」〔４
８〕中に置く。プレートを平坦シェーカー上に置き、６
７０ルクスの照明中５０ｒｐｍで揺動する。新しい懸濁
培養液はアガロースからコロニーが生長するとき形成さ
れ、そして細胞を液体培地中に放出する。生成する懸濁
液培養された細胞をアガー固化ＳＨ−３０培地上に置き
、そしてカルスが形成されるまで暗所中２５℃で置く。 ｂ．培地が調整培地を含まないことを除いて上と同様に
プロトプラストが培養される。 【００７０】Ｒ．ダクチリス・グロメラタのプロトプラ
ストのエレクトロポレーションによる形質転換ａ．プロ
トプラストの精製直後に、エレクトロポレーションが線
状化プラスミドを用いて行われる〔４８〕。最後の洗浄
後、エレクトロポレーション緩衝液（０．４Ｍマンニト
ール，６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　）中にｍｌあたり約７×
１０７　プロトプラストの密度でプロトプラストを再懸
濁させる。プロトプラストを次に１０ｍｌの遠心チュー
ブ中に０．７ｍｌ入れる。プラスミドＤＮＡおよび超音
波処理された子牛胸腺ＤＮＡ（シグマ）をそれぞれ最終
濃度１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌになるように
チューブに添加する。次にＰＥＧ溶液〔０．４Ｍマンニ
トール、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＥＳ（ｐＨ５．６）含有
３０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　中の２４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
（ＭＷ６０００）〕溶液０．３８ｍｌを添加し、そして
溶液をゆっくり混合する。プロトプラスト懸濁液をダイ
アログ・エレクトロポリーターのチャンバー中に移し、
そして初期電圧３２５０Ｖ／ｃｍ１０パルスおよび１μ
秒の指数関数的破壊時間を３０秒間隔で適用する。試料
をチャンバーから取り出し、そして直径１０ｃｍペトリ
皿にプレーティングする。１．２％（ｗ／ｖ）シープラ
ークアガロースを含有するＫＭ−８ｐ培地１０ｍｌを添
加し、プロトプラストを培地に均一に分配し、そして培
地をゲル化させる。 ｂ．初期電圧として３５００Ｖ／ｃｍ、４０００Ｖ／ｃ
ｍ、５０００Ｖ／ｃｍ、３０００Ｖ／ｃｍまたは２５０
０Ｖ／ｃｍが用いられる以外はａを繰り返す。 ｃ．ＰＥＧの分子量が４０００または８０００のものを
使用する以外ａおよびｂを繰り返す。 ｄ．ＰＥＧ最終濃度が１０％と３０％（ｗ／ｖ）の間で
あることを除いて、ａないしｃを繰り返す。 【００７１】Ｓ．ダクチリス・グロメラタのプロトプラ
ストのＰＥＧでの処理による形質転換 ａ．ＰＥＧ介在直接遺伝子導入が文献〔３７〕に従って
行われる。使用されるＤＮＡは線状化プラスミドである
。最後の洗浄に続き、１５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２含有の０
．５Ｍマンニトール中にプロトプラストをｍｌあたり約
２×１０６　の密度で懸濁させる。プロトプラスト懸濁
液１ｍｌを１０ｍｌの遠心チューブに入れる。ＤＮＡを
Ｒに記載のように添加し、次いでＰＥＧ溶液０．５ｍｌ
を添加する〔ＰＥＧ溶液（ＭＷ４０００，４０％（Ｗ／
Ｖ）；０．１ＭＣａ（ＮＯ）３　および０．４Ｍマンニ
トール含有；ｐＨ７．０〕。溶液をゆっくり混合し、そ
して室温（約２４℃）で３０分間時折揺動しながら保温
する。洗浄液１．４ｍｌを添加し、そしてチューブの内
容物をゆっくり混合する。洗浄液は８７ｍＭマンニトー
ル、１１５ｍＭ　　ＣａＣｌ２　、２７ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２　、３９ｍＭ　　ＫＣｌ、７ｍＭトリスＨＣｌおよ
び１．７ｇ／ｌミオイノシトール（ｐＨ９．０）からな
る。さらに洗浄液１．４ｍｌを４分間隔で添加し、各添
加の後に混合する。チューブを次に約６０×ｇで約１０
分間遠心分離し、そして上澄みを廃棄する。沈殿したプ
ロトプラストを１ｍｌＫＭ−８ｐ培養培地中に取り出し
、そして１０ｃｍのペトリ皿に置く。シープラークアガ
ロースを含有するＫＭ−８ｐ培地１０ｍｌを添加し、プ
ロトプラストを培地に均一に分配し、そして培地をゲル
化させる。 ｂ．以下の変形を１またはそれ以上行いａを繰り返す：
（１）洗浄液のｐＨを５．６または７．０に調整する。 （２）使用されるＰＥＧは分子量６０００、２０００ま
たは８０００のものである。 （３）洗浄培地は１５４ｍＭ　　ＮａＣｌ、１２５ｍＭ
　　ＣａＣｌ２　、５ｍＭ　　ＫＣｌ、５ｍＭグルコー
スからなりＫＯＨでｐＨ６．０に調整されたもの、０．
２Ｍ　　ＣａＣｌ２　、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＥＳから
なりＫＯＨでｐＨ６．０に調整されたもの、または０．
２Ｍ　　ＣａＣｌ２　、７ｍＭトリスＨＣｌからなりＫ
ＯＨでｐＨ９．０に調整されたものである。 【００７２】Ｔ．ダクチリス・グロメラタのプロトプラ
ストのエレクトロポレーションまたはＰＥＧでの処理に
よる形質転換 形質転換は、プロトプラストの一部をチューブに分配す
る前または後に、およびＰＥＧの添加の前に約５分間４
５℃でプロトプラストを処理する以外はＲまたはＳの記
載の通り行われる。 【００７３】Ｕ．形質転換されたコロニーの選択ａ．Ｒ
ないしＴからのプロトプラストを含有する培養プレート
（ペトリ皿）を暗所中約２５℃で１０日間保温し、次に
「ビーズカルチャー」のために５つの同様な片に切断す
る。そのうち４つを、４ｇ／ｌカゼイン加水分解物およ
び２０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ含有のＳＨ−４５
培養培地２０ｍｌ中に各々入れる。第５の片を非選択対
照としてハイグロマイシンＢ非含有の同様の培地２０ｍ
ｌ中に入れる。４ないし５週の後、カナマイシンＢ中に
生長する形質転換されたと考えられるプロトプラスト誘
導細胞コロニーをアガロースから切出し、２０μｇ／ｍ
ｌハイグロマイシンＢ含有のＳＨ−４５培養培地２ｍｌ
含有の１９ｍｍのペトリ皿に置き、これをオービタルシ
ェーカー上約５０ｒｐｍで揺動する。さらに４ないし５
週の後、新しい懸濁液を作るように生長する全てのコロ
ニーを１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に移し、
そして培地中に２０μｇ／ｍｌカナマイシンＢを含有す
ることを除いて親懸濁培養と同様の方法で生長させる。 新しい懸濁液を、４ｇ／ｌカゼイン加水分解物および２
０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ含有のＳＨ−４５培養
培地を用いて１ないし３週間毎に継代培養する。これら
の懸濁液からの細胞を２０μｇ／ｍｌハイグロマイシン
Ｂ含有のＳＨ−３０固化培地上に置き、そして暗所中約
２５℃で保温する。プレーティングされた細胞からのカ
ルス生長体は新鮮培地上で２週間毎に継代培養される。 ハイグロマイシンＢの存在下で生長する細胞を形質転換
体であるとみなす。 ｂ．ハイグロマイシンＢ含有培地中で生長するプロトプ
ラスト誘導細胞コロニーが、２０μｇ／ｍｌハイグロマ
イシンＢ含有のＳＨ−３０培地のアガープレートにプレ
ーティングされ、で暗所中２５℃で保温されること除い
て、選択は上記同様に行われる。 【００７４】Ｖ．形質転換されたダクチリス・グロメラ
タ植物の再生 ａ．プロトプラストから誘導されたダクチリス・グロメ
ラタのカルス（Ｕに記載されたように得られる）を固化
ＳＨ−３０培地上で生長させ、そして２週間毎に継代培
養する。形成される胚を取り出し、そして発芽培地（Ｓ
Ｈ−０）上にプレーティングし、そして３８００ないし
４６００ルクスの照明下に置く。これらの胚の発芽は１
ないし４週で起こり、そして生成する小植物をＳＨ−０
培地上照明下に置き、根系を形成させる。それらを６な
いし１２葉期に温室に移し、そして徐々に馴化させる。 ｂ．プロトプラストから誘導されたカルス（Ｕに記載さ
れたように得られる）を０．２４％（ｗ／ｖ）ゲルライ
トで固化させたＳＨ−０培地上３８００ないし４６００
ルクスの照明下で生長させ、そして２週間毎に継代培養
する。生成する小植物を０．２４％（ｗ／ｖ）ゲルライ
トおよび０．４％（ｗ／ｖ）アガーで固化させたＳＨ−
０：ＯＭＳ＝１：１混合培地上照明下に置き、根系を形
成させる。それらを６ないし１２葉期に温室に移し、そ
して徐々に馴化させる。 ｃ．小植物体が上記のように得られ、そして０．８％（
ｗ／ｖ）アガーで固化させたＯＭＳ培地上照明下に置き
、根系を形成させる。それらを６ないし１２葉期に温室
に移し、そして徐々に馴化させる。 ｄ．小植物体が上記のように得られ、そして０．１２％
（ｗ／ｖ）ゲルライトおよび０．４％（ｗ／ｖ）アガー
で固化させたＳＨ−０：ＯＭＳ＝１：１混合培地上照明
下に置き、根系を形成させる。それらを６ないし１２葉
期に温室に移し、そして徐々に馴化させる。 【００７５】実施例９：全ての遺伝子を含有するトラン
スジェニックＴ３種子系の獲得 トランスジェニック植物の遺伝子型命名には以下の方法
がここでは用いられる：形質転換から生じ、そして組織
培養から生長した最初の植物をＴ１植物と命名する。Ｔ
１植物の天然花の自家受粉から生じる植物をＴ２植物と
命名する。これは通常の減数分裂の間に新規遺伝子型を
獲得したものである。同様に、Ｔ２植物（すなわちＴ２
種子から生長した）の天然花の自家受粉から生じた種子
をＴ３と命名する。以下同様である。 【００７６】トランスジェニック植物（Ｔ１）を成熟さ
せる。花を自家受粉させ、そして通常の乾燥の後に種子
サヤを集める。個々の植物からの種子を集め、別々に保
存する。各種子ロットを、カナマイシン耐性特性を生じ
るメンデル遺伝子座の数を決定するために、遺伝子分離
分析により試験する。Ｔ２種子は２％次亜塩素酸塩含有
の０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０で表面滅菌し、次
に滅菌水ですすぐ。約１５０個の種子を、１５０μｇ／
ｍｌカナマイシン含有の０．２Ｘ　　ＭＳ塩〔３６〕で
飽和させた濾紙上に置く。発芽および約５ｍｍまでの子
葉の生長の後に、通常の緑子葉（ｋａｎ−ｒ）対脱色子
葉（ｋａｎ−ｓ）の比率を決定する。約３：１（ｋａｎ
−ｒ：ｋａｎ−ｓ）の比率を示すＴ２種子ロットだけを
さらに分析する。この分離比はカナマイシン遺伝子を生
じる単一のメンデル遺伝子座を示す。 【００７７】４ないし１０の植物が各Ｔ２種子ロットか
ら成熟し（上記同条件）、そして自家受粉させる。Ｔ３
種子の選択、種子滅菌、および種子発芽を上と同様に行
う。試験された種子（ｎ＝１５０）の１００％がｋａｎ
−ｒ表現型を示すＴ３種子ロットが特質に対してホモ接
合性である（すなわちホモ接合性Ｔ２親植物から生じる
）とみなし、表現型分析のために保存する。 【００７８】次いで慣用の育種技術が３つの全ての遺伝
子を同一植物に得るために用いられる。 【００７９】以上、本発明の特定の実施態様について記
載したが、本明細書の記載から考えられ得る数々の変形
、変更および態様は、本発明の範囲内であるとみなされ
る。 【００８０】 【表５】文献一覧 【配列表】 【００８１】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：ペプチド 【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：７５ 配列の型：ヌクレオチド 【００８３】配列番号：３ 配列の長さ：７５ 配列の型：ヌクレオチド 【００８４】配列番号：４ 配列の長さ：３８ 配列の型：ヌクレオチド 【００８５】配列番号：５ 配列の長さ：３８ 配列の型：ヌクレオチド 【００８６】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：ヌクレオチド 【００８７】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：ヌクレオチド 【００８８】配列番号：８ 配列の長さ：３８ 配列の型：ヌクレオチド 【００８９】配列番号：９ 配列の長さ：１３５８ 配列の型：ヌクレオチド 【００９０】配列番号：１０ 配列の長さ：２８ 配列の型：ヌクレオチド 【００９１】配列番号：１１ 配列の長さ：４２ 配列の型：ヌクレオチド 【００９２】配列番号：１２ 配列の長さ：８１ 配列の型：ヌクレオチド 【００９３】配列番号：１３ 配列の長さ：１４ 配列の型：ヌクレオチド 【００９４】配列番号：１４ 配列の長さ：１７ 配列の型：ヌクレオチド

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　以下の有効成分：ａ）１種またはそれ
    以上の細胞膜分解性成分、および ｂ）１種またはそれ以上の加水分解酵素の抗病原体有効
    量を１種またはそれ以上の農学的に許容性の担体ととも
    に含有する植物病原体防除用組成物。
  2. 【請求項２】　　細胞膜分解性成分が溶菌ペプチドであ
    る請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】　　溶菌ペプチドが、病原体の細胞膜に浸
    透もしくは該細胞膜を溶解または該細胞膜にその他の様
    式で損傷を与える性質により抗病原体有効性であり得る
    天然もしくは合成ペプチドまたはそれらの機能的誘導体
    である請求項２記載の組成物。
  4. 【請求項４】　　溶菌ペプチドが哺乳類デフェンシン、
    セクロピン、チオニン、メリチン、昆虫デフェンシン、
    マガイニン、アタシン、ジプテリス、サペシン、カクル
    チン、キセノプシンおよびそれらのハイブリッドからな
    る群から選択される請求項２記載の組成物。
  5. 【請求項５】　　加水分解酵素が植物病原体の細胞壁の
    分解を補助し得る酵素である請求項１ないし４のいずれ
    か１項に記載の組成物。
  6. 【請求項６】　　加水分解酵素が約１／１０ｃの相対濃
    度で有効成分中に存在する請求項１ないし５のいずれか
    １項に記載の組成物。
  7. 【請求項７】　　加水分解酵素が約１／１００ｃの相対
    濃度で有効成分中に存在する請求項６記載の組成物。
  8. 【請求項８】　　加水分解酵素がβ−１，３−グルカナ
    ーゼまたはキチナーゼである請求項１ないし７のいずれ
    か１項に記載の組成物。
  9. 【請求項９】　　加水分解酵素がキチナーゼとβ−１，
    ３−グルカナーゼの両方の組合せである請求項１ないし
    ７のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】　　キチナーゼが約１／１０ｃの相対濃
    度で有効成分中に存在し、そしてβ−１，３−グルカナ
    ーゼが約１／１０ｃの相対濃度で有効成分中に存在する
    請求項９記載の組成物。
  11. 【請求項１１】　　キチナーゼが約１／１０ｃの相対濃
    度で有効成分中に存在し、そしてβ−１，３−グルカナ
    ーゼが約１／１００ｃの相対濃度で有効成分中に存在す
    る請求項１０記載の組成物。
  12. 【請求項１２】　　キチナーゼが約１／１００ｃの相対
    濃度で有効成分中に存在し、そしてβ−１，３−グルカ
    ナーゼが約１／１０ｃの相対濃度で有効成分中に存在す
    る請求項９記載の組成物。
  13. 【請求項１３】　　キチナーゼが約１／１００ｃの相対
    濃度で有効成分中に存在し、そしてβ−１，３−グルカ
    ナーゼが約１／１００ｃの相対濃度で有効成分中に存在
    する請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の組成物
    。
  14. 【請求項１４】　　溶菌ペプチドが約１ないし約２００
    ｐｐｍの濃度で存在する請求項２記載の組成物。
  15. 【請求項１５】　　以下の有効成分：ａ）１種またはそ
    れ以上の細胞膜分解性成分、および ｂ）１種またはそれ以上の加水分解酵素の抗病原体有効
    量を１種またはそれ以上の農学的に許容性の担体ととも
    に含有する組成物の抗病原体有効量を植物病原体または
    それらの生息地に施用することからなる植物病原体の防
    除方法。
  16. 【請求項１６】　　１種またはそれ以上の細胞膜分解性
    成分、および１種またはそれ以上の加水分解酵素の組合
    せの抗病原体有効量をトランスジェニック植物中に発現
    させることからなる植物病原体の防除方法。
  17. 【請求項１７】　　１種またはそれ以上の細胞膜分解性
    成分、および１種またはそれ以上の加水分解酵素をコー
    ド化する組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植
    物。
  18. 【請求項１８】　　細胞膜分解性成分が溶菌ペプチドで
    ある請求項１７記載の植物。
  19. 【請求項１９】　　溶菌ペプチドが、病原体の細胞膜に
    浸透もしくは該細胞膜を溶解または該細胞膜にその他の
    様式で損傷を与える性質により抗病原体有効性であり得
    る天然もしくは合成ペプチドまたはそれらの機能的誘導
    体である請求項１８記載の植物。
  20. 【請求項２０】　　溶菌ペプチドが哺乳類デフェンシン
    、セクロピン、チオニン、メリチン、昆虫デフェンシン
    、マガイニン、アタシン、ジプテリス、サペシン、カク
    ルチン、キセノプシンおよびそれらのハイブリッドから
    なる群から選択される請求項１８記載の植物。
  21. 【請求項２１】　　加水分解酵素が植物病原体の細胞壁
    の分解を補助し得る酵素である請求項１８記載の植物。
  22. 【請求項２２】　　加水分解酵素がβ−１，３−グルカ
    ナーゼまたはキチナーゼである請求項１８記載の植物。
  23. 【請求項２３】　　加水分解酵素がキチナーゼとβ−１
    ，３−グルカナーゼの両方の組合せである請求項１８記
    載の植物。
  24. 【請求項２４】　　以下の段階：ａ）１種またはそれ以
    上の細胞膜分解性成分および１種またはそれ以上の加水
    分解酵素をコード化する組換えＤＮＡ配列を含むトラン
    スジェニック植物を作出し、そして ｂ）該トランスジェニック植物に１種またはそれ以上の
    細胞膜分解性成分および１種またはそれ以上の加水分解
    酵素の合成を引き起こす、からなる植物病原体の防除方
    法。
  25. 【請求項２５】ａ）１種またはそれ以上の細胞膜分解性
    成分および１種またはそれ以上の加水分解酵素をコード
    化する組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物
    を１種作出するか、または ｂ）１種またはそれ以上の細胞膜分解性成分および１種
    またはそれ以上の加水分解酵素をコード化する組換えＤ
    ＮＡ配列を含むトランスジェニック植物を２種またはそ
    れ以上作出し、そしてそれらの植物を慣用の育種法によ
    り交雑する、ことからなる、１種またはそれ以上の細胞
    膜分解性成分および１種またはそれ以上の加水分解酵素
    の抗病原体有効量を合成し得るトランスジェニック植物
    の作出方法。
JP3069129A 1990-03-12 1991-03-08 溶菌ペプチドおよび加水分解酵素を含有する抗病原体性組成物 Pending JPH04217903A (ja)

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