JP2001514898A

JP2001514898A - アンドロクトニンをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び得られた病害抵抗性の形質転換植物

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Publication number: JP2001514898A
Application number: JP2000509852A
Authority: JP
Inventors: フレシネ，ジヨルジユ; ドウローズ，リシヤール; オフマン，ジユール
Original assignee: ローヌ−プーラン・アグロ
Priority date: 1997-08-20
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2001-09-18
Also published as: PL338859A1; CO4790113A1; WO1999009189A1; AR016839A1; AU751263B2; IL134609A0; FR2767537B1; HRP980455A2; HUP0003585A3; EP1007711A1; FR2767537A1; NZ502951A; ZA987450B; CA2301978A1; AU9076698A; HUP0003585A2

Abstract

(57)【要約】本発明はアンドロクトニンをコードするＤＮＡ配列、宿主生物を形質転換するための該ＤＮＡ配列を含むベクター及び形質転換方法に関する。より特定的には本発明は、植物細胞及び植物の形質転換、形質転換植物によって産生され病害、特に菌類由来の病害に対する抵抗性を植物に付与するドロソマイシンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アンドロクトニンをコードするＤＮＡ配列、宿主生物を形質転換す
るための該ＤＮＡ配列を含有するベクター、及び、このような宿主生物の形質転
換方法に関する。

【０００２】より特定的には本発明は、植物細胞及び植物の形質転換に関する。形質転換植
物によって産生されるアンドロクトニンは植物に病害抵抗性、特に菌類病害に対
する抵抗性を与える。

【０００３】今日では、環境保護の目的で抗真菌性防御物質による処理の削減またはより好
ましくはこのような処理の回避が要望されており、従って、植物を特に菌類病害
に対して抵抗性にする必要性が増している。このような病害抵抗性を増強する手
段の１つは、植物自体が病害防御を確保する物質を産生できるように植物を形質
転換させることである。

【０００４】抗菌性または抗真菌性、特に植物の病害の原因となる菌類に対する抗真菌性を
もつ天然起原の種々の物質、特にペプチドは公知である。しかしながら問題は、
植物に抗菌性または抗真菌性を付与するために抗菌性または抗真菌性を維持した
状態で形質転換植物によって産生され得る物質を見出すことにある。本明細書に
使用された殺菌剤または殺真菌剤なる用語は、厳密な意味の殺菌性または殺真菌
性だけでなく静菌性または静真菌性も包含する。

【０００５】アンドロクトニンはサソリ、特にＡｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉ
ｓ種のサソリによって産生されるペプチドである。アンドロクトニン及びその化
学合成方法は、ｉｎｖｉｔｒｏのその抗真菌性及び抗菌性と共に、Ｅｈｒｅｔ
−Ｓａｂａｔｉｅｒらによって記載されている。

【０００６】アンドロクトニンの遺伝子がここに同定された。また、宿主生物、特に植物に
アンドロクトニンを挿入してアンドロクトニンを発現させ、アンドロクトニンを
産生及び単離する方法、並びに、菌類病害及び細菌性病害に対する抵抗性を宿主
生物に付与する方法が知見された。これは上記に提起した問題に特に有利な解決
方法を提供する。

【０００７】最初に、本発明の目的は、アンドロクトニンをコードする核酸フラグメント、
アンドロクトニンをコードするこのようなフラグメントを含み且つ植物などの宿
主生物の体内で機能し得るヘテロロガスな調節要素を５′位及び３′位に含むキ
メラ遺伝子、該キメラ遺伝子を含むように宿主生物を形質転換させるベクター、
並びに、形質転換された宿主生物を提供することである。次に、本発明は、アン
ドロクトニンをコードする少なくとも１つの核酸フラグメントを含む形質転換さ
れた植物細胞、このような細胞を含む病害抵抗性植物、特にこの細胞から再生さ
れた病害抵抗性植物に関する。最後に、本発明は、本発明の形質転換植物の栽培
方法に関する。

【０００８】本文中に使用されたアンドロクトニンなる用語は、サソリ、特にＡｎｄｒｏｃ
ｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ種のサソリから産生及び単離されたいかなるペ
プチドも包含する。これらのペプチドは少なくとも２０個、好ましくは少なくと
も２５個のアミノ酸と、互いにジスルフィド架橋を形成する４個のシステイン残
基とを含む。好ましくは、アンドロクトニンが本質的に以下の一般式（Ｉ）：Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａｂ−Ｃｙｓ−Ｘａｃ−Ｃｙｓ−Ｘａｄ−Ｃｙｓ−Ｘａｅ（Ｉ）

【０００９】〔式中、Ｘａａは少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表し、Ｘａｂは５個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｃは５個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｄは３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｅは少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表す〕のペプチド配
列を含む。

【００１０】好ましくは、Ｘａｂ及び／またはＸａｄ及び／またはＸａｅが少なくとも１つ
、好ましくは１つの塩基性アミノ酸を含む。本文中に使用された塩基性アミノ酸
なる用語は、リシン、アスパラギンまたはホモアスパラギンから選択されたアミ
ノ酸を意味する。

【００１１】好ましくは、Ｘａａがペプチド配列Ｘａａ′−Ｖａｌを表し、ここにＸａａ′はＮＨ_２また
は少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｂがペプチド配列−Ａｒｇ−Ｘａｂ′−Ｉｌｅを表し、ここにＸａｂ′は
３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｃがペプチド配列−Ａｒｇ−Ｘａｃ′−Ｇｌｙを表し、ここにＸａｃ′は
３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｄがペプチド配列−Ｔｙｒ−Ｘａｄ′−Ｌｙｓを表し、ここにＸａｄ′は
１個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｅがペプチド配列−Ｔｈｒ−Ｘａｅ′を表し、ここにＸａｅ′はＣＯＯＨ
または少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表す。

【００１２】より好ましくは、Ｘａａ′がペプチド配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−を表し、及び／または、Ｘａｂ′がペプチド配列Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−を表し、及び／または、Ｘａｃ′がペプチド配列−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−を表し、及び／または、Ｘａｄ′がペプチド残基−Ｔｙｒ−を表し、及び／または、Ｘａｅ′がペプチド配列−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒを表す。

【００１３】本発明の好ましい実施態様によれば、アンドロクトニンは配列１で示される２
５個のアミノ酸のペプチド配列及びこの配列に相同なペプチド配列によって表さ
れる。

【００１４】相同ペプチド配列なる用語は、配列１で示される配列に少なくとも６５％の相
同性を有しており、配列１と同じく４個のシステイン残基をもち、これらのシス
テイン残基の間に配列１と同数のアミノ酸を含み、相同配列の抗真菌活性または
抗菌活性の実質的な変化を誘発しない部位の幾つかのアミノ酸が等価の別のアミ
ノ酸によって置換されているような任意の等価の配列を意味する。相同配列は、
好ましくは少なくとも７５％の相同性、より好ましくは少なくとも８５％の相同
性、いっそう好ましくは９０％の相同性を有している。

【００１５】アンドロクトニンの末端ＮＨ_２残基は例えばアセチル化のような翻訳後修飾を
有し、Ｃ末端残基は例えばアミド化のような翻訳後修飾を有し得る。

【００１６】 “本質的に一般式（Ｉ）のペプチド配列を含むペプチド配列”という表現は、
上記に定義の配列に加えて、特に植物細胞または植物のような宿主生物の体内で
上記に定義の配列を発現及びターゲッティングするために必要なペプチド残基を
いずれか一方の末端または両方の末端に有している配列も包含する。

【００１７】このような配列としては特に、“ペプチド−アンドロクトニン”または“アン
ドロクトニン−ペプチド”の形態、好ましくは“ペプチド−アンドロクトニン”
の形態の融合ペプチドがある。融合ペプチドが酵素系によって植物細胞から切断
されて上記に定義のアンドロクトニンが遊離される。アンドロクトニンに融合す
るペプチドは、特に植物細胞または植物のような宿主生物の一部、例えば細胞質
もしくは細胞膜中で、または、特定種類の植物の場合には細胞区画もしくは組織
中で、または、細胞外マトリックス中でアンドロクトニンの産生を特異的に調節
及び指令し得るシグナルペプチドまたはトランジットペプチドでよい。

【００１８】１つの実施態様によれば、トランジットペプチドは、葉緑体またはミトコンド
リアに特異的なシグナルでよく、後で葉緑体またはミトコンドリア中で切断され
る。

【００１９】本発明の別の実施態様によれば、シグナルペプチドは、小胞体にタンパク質を
保持させるシグナルまたは液胞に特異的なペプチド即ち“プロペプチド”に任意
に結合したＮ−末端シグナル即ち“プレペプチド”でもよい。“細胞機械論”に
よれば、小胞体はシグナルペプチドの開裂のような産生タンパク質の成熟処理を
担当する場所である。

【００２０】トランジットペプチドは一本鎖でも二重鎖でもよく、この場合には任意に中間
配列によって隔てられていてもよい。即ち、欧州特許出願ＥＰ０５０８９０９に
記載されているように、トランジットペプチドは転写方向で順次に、色素体局在
酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、色素
体局在酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列の一部と、色素体局
在酵素をコードする植物遺伝子の第二のトランジットペプチドをコードする配列
とを含んでいる。

【００２１】本発明に有用なトランジットペプチドとしては特に、配列２で示されるコーデ
ィング配列によって表されるタバコのＰＲ−１α遺伝子（ＷＯ９５／１９４４３
）のシグナルペプチドがあり、このシグナルペプチドは配列３によって示される
アンドロクトニンに融合する。このアンドロクトニンは、特にアンドロクトニン
が植物細胞もしくは植物によって産生されるときは配列３の塩基１２−１７６に
対応する融合タンパク質であり、アンドロクトニンが酵母中で産生されるときは
Ｍａｔ α１因子の前駆体である。

【００２２】従って、本発明は先ず、上記に定義のアンドロクトニンをコードする核酸フラ
グメント、特にＤＮＡフラグメントに関する。本発明によればこれらのフラグメ
ントは、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓから単離されたフラグメ
ント、または、ペプチドを発現させる宿主生物体内でアンドロクトニンを発現さ
せるように操作された誘導フラグメントである。核酸フラグメントは標準方法で
単離及び精製することによって得られてもよく、または常用技術である合成オリ
ゴヌクレオチドの連続的ハイブリダイゼーションによって合成してもよい。これ
らの技術は特にＡｕｓｕｂｅｌらによって記載されている。

【００２３】本文中に使用された“核酸フラグメント”なる用語は、ＤＮＡ型またはＲＮＡ
型、好ましくはＤＮＡ型、より特定的にはｃＤＮＡ型、特に二重鎖ｃＤＮＡ型の
ヌクレオチド配列を意味する。

【００２４】本発明の実施態様によれば、アンドロクトニンをコードする核酸フラグメント
は、配列１で示されるＤＮＡ配列、該配列の相同配列または相補配列、特に塩基
１−７５に対応する配列１のコーディング部分である。

【００２５】本文中に使用された“相同”なる用語は、アンドロクトニンをコードしている
が配列１で示される核酸配列に比べて１つまたは複数の配列修飾を有している核
酸フラグメントを意味する。これらの修飾は、常用のミューテーション技術で得
られてもよく、または、ハイブリダイゼーションによって配列を調製するときの
合成オリゴヌクレオチドの選択によって得られてもよい。同一アミノ酸の発現に
導くような核酸の多くの組合せに関しては、配列１で示される基準配列と相同配
列との違いが重要であり、核酸の数が１００未満というサイズの合成によって作
製可能なＤＮＡフラグメントの場合には特に重要である。基準配列に対する相同
性の程度が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少
なくとも９０％が有利であろう。これらの修飾は概して中立である。即ち、得ら
れるアンドロクトニンの一次配列に影響を与えない。

【００２６】本発明はまた、コーディング配列と、前記コーディング配列に機能的に連結さ
れ特に植物細胞または植物のような宿主生物の体内で機能し得る５′位及び３′
位のヘテロロガスな調節要素とから成り、前記コーディング配列が、上記に定義
のアンドロクトニン（“ペプチド−アンドロクトニン”または“アンドロクトニ
ン−ペプチド”の形態の融合ペプチドも含む）をコードする少なくとも１つのＤ
ＮＡフラグメントを含むキメラ遺伝子に関する。

【００２７】宿主生物なる用語は、アンドロクトニンを産生させるために本発明のキメラ遺
伝子を導入することが可能なすべての単細胞または多細胞の下等生物または高等
生物を意味する。特に、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓもしくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｌｕｓのような菌類、バキュロウイルス、または好ましくは植物細胞及び
植物が挙げられる。

【００２８】本文中に使用された“植物細胞”なる用語は、カルス（肉状体）のような未分
化組織、胚のような分化組織、植物の部分、植物または種子を構成し得る植物由
来の任意の細胞を意味する。

【００２９】本文中に使用された“植物”なる用語は、光合成可能な任意の分化多細胞生物
、特に単子葉類または双子葉類、より特定的には、トウモロコシ、コムギ、ナタ
ネ、ダイズ、イネ、サトウキビ、テンサイ、タバコ及び綿などの、動物飼料また
はヒト食料にもなり得る栽培植物を意味する。

【００３０】アンドロクトニンをコードするＤＮＡフラグメントを発現させるために宿主生
物に応じて必要な調節要素は当業者に公知である。調節要素としては特に、プロ
モーター配列、転写アクチベーター、トランジットペプチド、ターミネーター配
列があり、また、開始コドン及び終止コドンがある。調節要素の同定及び選択に
使用し得る手段及び方法は当業者に公知である。

【００３１】酵母または細菌のような微生物を形質転換させるために必要な調節要素は当業
者に公知であり、特に、プロモーター配列、転写アクチベーター、トランジット
ペプチド、ターミネーター配列並びに開始コドン及び終止コドンがある。

【００３２】酵母の培養培地中でペプチドの発現及び分泌を誘発するためには、ヘリオマイ
シンをコードするＤＮＡフラグメントを、以下の要素： −形質転換体を選択し得るマーカー、 −酵母体内でプラスミドを複製し得る核酸配列（複製起点）、 −大腸菌内でプラスミドを複製し得る核酸配列（複製起点）、 −（１）プロモーター調節配列と、（２）特異的ペプチド（またはプロペプチド）に結合したシグナルペプチド（
またはプレペプチド）をコードする配列と、（３）転写終結調節配列またはポリアデニル化配列と、から成る発現カセット、を含むシャトルベクターに組込む。

【００３３】これらの要素は、Ｒｅｉｃｈｈａｒｔら，１９９２，Ｉｎｖｅｒｔ．Ｒｅｐｒ
ｏｄ．Ｄｅｖ．，２１，ｐｐ１５−２４及びＭｉｃｈａｕｔら，１９９６，ＦＥ
ＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３９５，ｐｐ６−１０などのような複数の刊行物に記載
されている。

【００３４】好ましくは、酢酸リチウム法（Ｉｔｏら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１５３，ｐｐ１６３−１６８）によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種の酵母を
発現プラスミドで形質転換させる。

【００３５】本発明はより特定的には植物の形質転換に関する。植物体内のプロモーター調
節配列としては、植物体内で天然に発現される遺伝子の任意のプロモーター配列
、特に細菌、ウイルスまたは植物に由来のプロモーターを使用し得る。例えば、
リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の小サ
ブユニットの遺伝子のプロモーター、植物ウイルス例えばカリフラワーのモザイ
クウイルス（ＣＡＭＶ１９Ｓまたは３５Ｓ）の遺伝子のプロモーター、タバコ
のＰＲ−１ａのような病原体によって誘導されるプロモーターがある。公知の適
当な任意のプロモーターを使用し得る。好ましくは、病原体の攻撃によって構成
的または誘導的にコーディング配列の超発現を促進するプロモーター調節配列、
例えば欧州特許出願ＥＰ０５０７６９８に記載のような少なくとも１つのヒスト
ンプロモーターを含むプロモーター調節配列を利用する。

【００３６】本発明によればまた、プロモーター調節配列に組合せて他の調節配列を使用し
得る。他の調節配列としては、プロモーターとコーディング配列との間に配置さ
れる転写アクチベーター（“エンハンサー”）があり、例えば、国際特許出願Ｗ
Ｏ８７／０７６４４に記載されたタバコのモザイクウイルス（ＴＭＶ）またはＣ
ａｒｒｉｎｇｔｏｎ＆Ｆｒｅｅｄによって記載されたタバコの腐食ウイルス
（ＴＥＶ）の転写アクチベーターがある。

【００３７】転写終結調節配列またはポリアデニル化配列としては、細菌起原の対応する任
意の配列、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏ
ｓターミネーターまたは植物起原の対応する任意の配列、例えば欧州特許出願Ｅ
Ｐ０６３３３１７に記載されたようなヒストンターミネーターを使用し得る。

【００３８】また、本発明のキメラ遺伝子を、形質転換された宿主生物に適応する選択マー
カーに結合させてもよい。このような選択マーカーは当業者に公知である。その
例としては、抗生物質耐性遺伝子または植物の除草剤に耐性の遺伝子がある。

【００３９】本発明はまた、宿主生物を形質転換させるために使用される上記に定義のキメ
ラ遺伝子を少なくとも１つ含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関す
る。このようなベクターは、上記のキメラ遺伝子に加えて、少なくとも１つの複
製起点及び必要に応じて適当な選択マーカーを含む。ベクターは、本発明のキメ
ラ遺伝子の導入によって形質転換されたプラスミド、コスミド、バクテリオファ
ージまたはウイルスから構成され得る。形質転換される宿主生物に応じた形質転
換ベクターの選択は当業者に公知であり、多くの文献に記載されている。

【００４０】植物細胞または植物を形質転換するためには、育成植物の形質転換に使用でき
かつ固有の複製要素及び発現要素を含むウイルスが特に好適である。本発明によ
れば、植物細胞または植物を形質転換するためのベクターがプラスミドであるの
が好ましい。

【００４１】本発明の目的はまた、上記に定義の少なくとも１つの核酸フラグメントまたは
キメラ遺伝子を組込むことから成る宿主生物、特に植物細胞の形質転換方法を提
供することである。多くの専門文献、特に本願に引用された参考文献に記載され
た公知の適当な任意の手段、より特定的には本発明のベクターによって形質転換
を惹起する。

【００４２】１つの方法シリーズでは、ＤＮＡ配列を保有する粒子によって細胞、原形質体
または組織を衝撃する。別の方法シリーズでは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドに挿入したキメラ遺伝子を使用してＤＮ
Ａ配列を植物に導入する。

【００４３】マイクロインジェクション、電気穿孔またはＰＥＧによる直接沈降のような別
の方法も使用し得る。

【００４４】当業者は宿主生物、特に植物細胞または植物の種類に応じた適当な方法を選択
し得る。

【００４５】本発明の目的はまた、上記に定義のアンドロクトニンをコードする配列を内包
するキメラ遺伝子を有効量で含む形質転換された宿主生物、特に植物細胞または
植物を提供することである。

【００４６】本発明の目的はまた、形質転換細胞を含む植物、特に形質転換細胞から再生さ
れた植物を提供することである。再生のためには、例えば参考文献に記載された
方法から種の性質に応じた適当な任意の方法を利用し得る。

【００４７】植物細胞の形質転換方法及び植物の再生方法に関しては、特に以下の特許及び
特許出願、即ち、米国特許ＵＳ４，４５９，３５５、ＵＳ４，５３６，４７５、
ＵＳ５，４６４，７６３、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１８７，０７３、
欧州特許ＥＰ６０４６６２、ＥＰ６７２７５２、米国特許ＵＳ４，９４５，０５
０、ＵＳ５，０３６，００６、ＵＳ５，１００，７９２、ＵＳ５，３７１，０１
４、ＵＳ５，４７８，７４４、ＵＳ５，１７９，０２２、ＵＳ５，５６３，３４
６、ＵＳ５，４８４，９５６、ＵＳ５，５０８，４６８、ＵＳ５，５３８，８７
７、ＵＳ５，５５４，７９８、ＵＳ５，４８９，５２０、ＵＳ５，５１０，３１
８、ＵＳ５，２０４，２５３、ＵＳ５，４０５，７６５、欧州特許ＥＰ４４２１
７４、ＥＰ４８６２３３、ＥＰ４８６２３４、ＥＰ５３９５６３、ＥＰ６７４７
２５、国際特許ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８を引用し得る。

【００４８】本発明はまた、上記のような再生植物の栽培及び／または交配によって得られ
た形質転換植物、並びに、形質転換植物の種子に関する。

【００４９】このような形質転換植物は幾つかの病害、特に幾つかの菌類病害または細菌性
病害に抵抗性である。このため、病害抵抗性植物の栽培を主目的としてアンドロ
クトニンをコードするＤＮＡ配列を組込むことができる。アンドロクトニンは、
Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ特にＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｃｌａｄ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ特にＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ特にＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍもしくはＦｕｓａｒｉｕｍ
ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、または、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ特にＰｈｙｔｏｐ
ｈｔｈｏｒａｃｉｎｎａｍｏｍｉを原因とする菌類病害に有効である。

【００５０】キメラ遺伝子はまた、１種または複数の除草剤耐性遺伝子のような少なくとも
１つの選択マーカーに有利に結合され得る。

【００５１】また、例えば除草剤耐性遺伝子のような別の有益なペプチドまたはタンパク質
をコードする別の配列で植物を形質転換するときに、アンドロクトニンをコード
するＤＮＡ配列を選択マーカーとして組込んでもよい。

【００５２】このような除草剤耐性遺伝子は当業者に公知であり、特に欧州特許出願ＥＰ１
１５６７３、国際特許出願８７／０４１８１、欧州特許出願ＥＰ３３７８９９、
国際特許出願ＷＯ９６／３８５６７またはＷＯ９７／０４１０３に記載されてい
る。

【００５３】勿論、本発明によって形質転換された細胞及び植物は、アンドロクトニンをコ
ードする配列に加えて、細菌性もしくは真菌性の別の病害に対する抵抗性を植物
に付与し得る別の有益なタンパク質例えば相補的ペプチドをコードする別のヘテ
ロロガスな配列、及び／または、特に上記に定義の除草剤に耐性のタンパク質を
コードする別の配列、及び／または、特にＢｔタンパク質のような昆虫抵抗性タ
ンパク質をコードする別の配列を含み得る。

【００５４】別の配列は、アンドロクトニンをコードしている配列を含む本発明のキメラ遺
伝子と、別の有益なペプチドまたはタンパク質をコードする別の配列を含む少な
くとも１つの別の遺伝子との双方を内包する同一ベクターを用いて組込むことが
できる。

【００５５】別の配列はまた、上記に定義の常用の技術を使用し、上記のような別の配列を
少なくとも含む別のベクターを用いて組込むこともできる。

【００５６】本発明の植物はまた、一方がアンドロクトニンをコードする本発明の遺伝子を
含み、他方が少なくとも１つの別の有益なペプチドまたはタンパク質をコードす
る遺伝子を含む両親を交配することによって得られる。

【００５７】別の抗真菌性ペプチドをコードする配列としては、Ｆｅｈｌｂａｕｍら（１９
９４）によるフランス特許出願ＦＲ２７２５９９２及び１９９７年７月２４
日出願の未公開のフランス特許出願ＦＲ９７０９１１５に記載されているよう
なドロソマイシンをコードする配列が挙げられる。

【００５８】本発明は最後に、本発明によって形質転換された植物の栽培方法に関する。方
法は、植物の栽培に好適な培地、特に圃場の表面に形質転換植物の種子を播種し
、該種子または該形質転換植物に実質的に影響を及ぼすことなく農芸化学組成物
を該表面に施用し、次いで、栽培した植物が所望の成熟度に到達したときに収穫
し、収穫した植物の種子を任意に分離する工程から成る。

【００５９】本文中に使用された農芸化学組成物なる用語は、除草剤、殺真菌剤、殺菌剤、
殺ウイルス剤または殺虫剤の活性の少なくとも１つを有している少なくとも１種
類の有効物質を含む任意の農芸化学組成物を意味する。

【００６０】本発明の栽培方法の好ましい実施態様によれば、農芸化学組成物は、少なくと
も１つの抗真菌活性及び／または抗菌活性、より特定的には本発明の形質転換植
物によって産生されたアンドロクトニンの活性に相補的な活性を有している少な
くとも１種類の有効物質を含んでいる。

【００６１】本文中に使用された“アンドロクトニンの活性に相補的な活性を有している物
質”という表現は、相補的な活性スペクトルを有している物質、即ち、アンドロ
クトニンに感受性でない汚染物質（菌類、細菌またはウイルス）の攻撃に対して
有効な物質を意味してもよく、または、アンドロクトニンの活性スペクトルの全
部または一部に重なり合う活性スペクトルを有しているが形質転換植物によって
アンドロクトニンが産生されるのでその施用量を実質的に削減できる物質を意味
してもよい。

【００６２】最後に、形質転換された宿主生物の栽培によってアンドロクトニンが量産され
得る。従って本発明はまた、上記に定義のアンドロクトニンをコードする遺伝子
を含む形質転換宿主生物を適当な培地で栽培し、次いで、得られたアンドロクト
ニンを抽出し完全にもしくは部分的に精製する工程から成るアンドロクトニンの
製造方法に関する。

【００６３】以下の実施例は、本発明のアンドロクトニンをコードする配列、キメラ遺伝子
、組込みベクター及び形質転換植物の製造を説明する。添付の図１から図５は、
キメラ遺伝子を構築するために調製した幾つかのプラスミドの概略構造を示す。
これらの図中、種々の制限部位をイタリック体で示す。

【００６４】（実施例）実施例１：キメラ遺伝子の構築以下に使用したすべての技術は標準的な実験技術である。これらの技術の詳細
なプロトコルは特にＡｕｓｕｂｅｌらに記載されている。

【００６５】ｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐ：タバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペプチドを含むプラ
スミドの作製以下のオリゴ１及びオリゴ２の配列をもつ相補的な２つの合成オリゴヌクレオ
チドを６５℃で５分間ハイブリダイズさせ、次いで３０分を要して温度を３０℃
までゆっくりと低下させる。

【００６６】オリゴ１：５′ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣ３′ オリゴ２：５′ＴＣＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣ３′

【００６７】オリゴ１とオリゴ２とのハイブリダイゼーション後、一本鎖の形態を維持して
いるＤＮＡを、各オリゴの３′末端から二重鎖オリゴヌクレオチドを作製するた
めに（製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）によって規定された
標準条件下で）大腸菌のポリメラーゼ１のクレノウフラグメントのマトリックス
として使用する。得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを次に、制限酵素ＳａｃＩ
Ｉ及びＮａｅＩで消化し、同じ制限酵素で消化したプラスミドｐＢＳＩＩＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングする。このようにして、タバ
コのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含むクローンが得
られる（配列２）。

【００６８】ｐＲＰＡ−ＰＳ−ＰＲ１ａ−ａｎｄｒｏ：３′非転写領域のないシグナルペプチ
ドＰＲ−１ａに融合したアンドロクトニンをコードする配列の作製以下のオリゴ３及びオリゴ４の配列をもつ相補的な２つの合成オリゴヌクレオ
チドを上記のｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐ作製の処理条件でハイブリダイズさせる。

【００６９】オリゴ３：５′ＡＧＧＴＣＣＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧ３′ オリゴ４：５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＧＣＣ３′

【００７０】オリゴ３とオリゴ４とのハイブリダイゼーション後、一本鎖の形態を維持して
いるＤＮＡを、各オリゴの３′末端から二重鎖オリゴヌクレオチドを作製するた
めに（製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）によって規定された
標準条件下で）大腸菌のポリメラーゼ１のクレノウフラグメントのマトリックス
として使用する。アンドロクトニンのコーディング部分（配列１）を含むこの二
重鎖オリゴヌクレオチドを次に、制限酵素ＮａｅＩで消化しておいたプラスミド
ｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐに直接クローニングする。得られたクローンの配向の正否を
配列決定によって確認する。これによって、Ｎ−末端の制限部位ＮｃｏＩとＣ−
末端の制限部位ＳｃａＩ、ＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩとの間に融合タンパク質Ｐ
Ｒ−１ａ−アンドロクトニンをコードする領域（配列３）を含むクローンが得ら
れる。

【００７１】ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３８：融合タンパク質ＰＲ−１ａ−アンドロクトニンをコー
ドする配列を含む植物体内の発現ベクターの作製プラスミドｐＵＣ−１９に由来のプラスミドｐＲＴＬ−２ＧＵＳをＤｒ．Ｊ
ｉｍＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，未
発表）から入手した。図１に示す概略構造をもつこのプラスミドは、タバコの腐
食ウイルスの５′の非翻訳配列（ＴＥＶ５′ＵＴＲ；Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ
＆Ｆｒｅｅｄ，１９９０）を有しているＲＮＡの発現を誘導するカリフラワー
のモザイクウイルスから単離された二重鎖ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｃａ
ＭＶ２×３５Ｓ；Ｏｄｅｌｌら，１９８５）と、大腸菌のβ−グルクロニダー
ゼの遺伝子（ＧＵＳＪｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７）と、その下流のＣａＭ
ＶのＲＮＡ３５Ｓのポリアデニル化部位（ＣａＭＶポリＡ；Ｏｄｅｌｌら，
１９８５）とを含む。

【００７２】プラスミドｐＲＴＬ−２ＧＵＳを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し
、ＤＮＡの大フラグメントを精製する。プラスミドｐＲＰＡ−ＰＳ−ＰＲ１ａ−
ａｎｄｒｏを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、融合タンパク質ＰＲ−
１ａ−アンドロクトニンをコードする領域を含むＤＮＡの小フラグメントを精製
する。次に、精製した２つのＤＮＡフラグメントを互いに結合させ、融合タンパ
ク質ＰＲ−１ａ−アンドロクトニンを植物体内で合成させる発現カセットを作製
する。この発現カセットの概略構造を図２に示す。“ＰＲ−１ａ−アンドロクト
ニン”はｐＲＰＡ−ＲＤ−２３０の融合タンパク質ＰＲ−１ａ−アンドロクトニ
ンのコーディング領域を表す。アンドロクトニンはシグナルペプチドＰＲ−１ａ
の作用によって植物の細胞外マトリックスに運搬される。

【００７３】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５：修飾された多重クローニング部位を含むプラスミドの
作製プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５は、修飾された多重クローニング部位を含
むｐＵＣ−１９に由来のプラスミドである。以下のオリゴ５及びオリゴ６の配列
をもつ相補的な合成オリゴヌクレオチドをｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐに関して記載した
手順でハイブリダイズさせて二重鎖とする。

【００７４】オリゴ５：５′ＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣ３′ オリゴ６：５′ＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧ３′

【００７５】得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを次に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで予め消化し次いで大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメン
トで平滑末端を形成しておいたｐＵＣ−１９に結合させる。これによって、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのベクタープラスミドに発現
カセットを導入し易くするための多重クローニング部位を含むベクターが得られ
る。この多重クローニング部位の概略構造を図３に表す。

【００７６】ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３３：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５内へのｐＲＰＡ−ＲＤ−２３
０のＰＲ−１ａ−アンドロクトニンの発現カセットの導入プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２３０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。Ｐ
Ｒ−１ａ−アンドロクトニンの発現カセットを含むＤＮＡフラグメントを精製す
る。精製したフラグメントを次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで予め消化しウシの
腸ホスファターゼで脱リン酸化しておいたｐＲＰＡ−ＲＰ−１９５に結合させる
。

【００７７】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４：ｐＲＰＡ−ＢＬ−２３７（欧州特許ＥＰ０５０８
９０９）のブロモキシニル耐性遺伝子を含むｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０Ａ（欧州特
許ＥＰ０５０８９０９）に由来のプラスミドＰＣＲ遺伝子増幅によってｐＲＰＡ−ＢＬ−２３７からブロモキシニル耐性遺
伝子を単離する。得られたフラグメントは平滑末端を有している。標準条件下で
ポリメラーゼクレノウを作用させて平滑末端を形成したｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０
ＡのＥｃｏＲＩ部位にこのフラグメントをクローニングする。左端近傍のブロモ
キシニル耐性遺伝子と、右端近傍のカナマイシン耐性遺伝子とこれらの２つの遺
伝子の間の多重クローニング部位とを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓのベクターが得られる。

【００７８】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４の概略構造を図４に示す。この図で、“ｎｏｓ”はＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリーヌ（ｎｏｐａｌ
ｉｎｅ）シンターゼのポリアデニル化部位（Ｂｅｖａｎら，１９８３）、“ＮＯ
Ｓｐｒｏ”はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリ
ーヌ（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼのプロモーター（Ｂｅｖａｎら，１９８３
）、“ＮＰＴＩＩ”は大腸菌のＴｎ５トランスポゾンのネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼの遺伝子（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，１９８１）、“３５Ｓｐ
ｒｏ”はカリフラワーのモザイクウイルスから単離されたプロモーター３５Ｓ（
Ｏｄｅｌｌら，１９８５）、“ＢＲＸ”はＫ．ｏｚａｅｎａｅから単離されたニ
トリラーゼの遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら，１９８８）、“ＲＢ”及び“ＬＢ”は
それぞれ、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラス
ミドの配列の右端及び左端を表す。

【００７９】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４に対する新規な非反復制限部
位の付加以下のオリゴ７及びオリゴ８の配列をもつ相補的な合成オリゴヌクレオチドを
ｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐに関して記載した手順に従ってハイブリダイズさせ二重鎖に
する。

【００８０】オリゴ７：５′ＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧ３′ オリゴ８：５′ＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＴＧＡＧＧＴＴＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧ３′

【００８１】ハイブリダイズした二重鎖オリゴヌクレオチド（９５塩基対）をアガロースゲ
ル（３％のＮｕｓｉｅｖｅ，ＦＭＣ）で分離後に精製する。プラスミドｐＲＰＡ
−ＲＤ−１７４を制限酵素ＸｍａＩで消化し、ＤＮＡの大フラグメントを精製す
る。次いで、得られた２つのＤＮＡフラグメントを互いに結合させる。

【００８２】ブロモキシニル耐性遺伝子と選択マーカーとして機能するカナマイシン耐性遺
伝子との間に別の制限部位を含むｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４に由来のプラスミドが
得られる。

【００８３】プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４の概略構造を図５に示す。図中、“ｎｏｓ
”、“ＮＰＴＩＩ”、“ＮＯＳｐｒｏ”、“３５Ｓｐｒｏ”、“ＢＲＸ
ｇｅｎｅ”、“ＲＢ”及び“ＬＢ”などの用語は図４と同義である。

【００８４】ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３６：細胞外マトリックスに誘導されたアンドロクトニンを
コードする遺伝子構築物を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓのベクターの作製プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２３３を制限酵素ＰｍｅＩ及びＡｓｃＩで消化し
、ＰＲ−１ａ−アンドロクトニンの遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを精製する
。プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４を同じ制限酵素で消化する。次に、ＰＲ−
１ａ−アンドロクトニンの発現カセットを含むＤＮＡフラグメントをｐＲＰＡ−
ＲＤ−１８４に結合させる。これにより、融合タンパク質ＰＲ−１ａ−アンドロ
クトニンをコードする配列を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓのベクターが得られる。この融合タンパク質は植物の細胞外マトリック
ス中でアンドロクトニンを発現させる。

【００８５】実施例２：形質転換されたタバコの除草剤耐性２．１−形質転換ベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−２３６を、コスミドｐＴＶＫ２９１（Ｋｏｍａｒｉ
ら，１９８６）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌
ＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら，１９８７）に導入する。形質転換技術はＨｏｒｓ
ｈら（１９８５）の手順に基づく。

【００８６】２．２−再生３０ｇ／リットルのショ糖と２００μｇ／ｍｌのカナマイシンとを含むＭｕｒ
ａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）基底培地で、タバコＰＢＤ６（産地ＳＥ
ＩＴＡ，Ｆｒａｎｃｅ）を外植葉片から再生させる。外植葉片を温室またはｉｎ
ｖｉｔｒｏで栽培した植物から採取し、葉盤法（Ｈｏｒｓｈら，１９８５）に
よって３つの連続段階で再生させる。第一段階では、０．０５ｍｇ／リットルの
ナフチル酢酸（ＡＮＡ）と２ｍｇ／リットルのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）
とを含有する３０ｇ／リットルのショ糖を加えた培地に１５日間維持して発芽さ
せる。この段階で形成された芽条を次に、３０ｇ／リットルのショ糖を加えたホ
ルモン非含有ＭＳ培地で１０日間栽培して育成する。次に、発育した芽条を摘取
し、塩とビタミンとショ糖とを１／２の濃度にしたホルモン非含有のＭＳ発根培
地で栽培する。約１５日後に、発根した芽条を土に移植する。

【００８７】２．３−ブロモキシニル耐性２０本の形質転換植物を再生させ、ｐＲＡＰ−ＲＤ−２３６構築物用の温室に
移した。これらの植物を５葉期に、１ヘクタールあたり０．２ｋｇの有効物質濃
度即ちブロモキシニル濃度に対応するＰａｒｄｎｅｒの水性懸濁液で温室処理し
た。

【００８８】ブロモキシニルに完全耐性を示した全部の植物を次に種々の実験に使用し、形
質転換植物がアンドロクトニンの発現によって菌類攻撃に抵抗性になっているこ
とを証明する。

【参考文献目録】

【００８９】

【表１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＲＴＬ−２ＧＵＳの概略構造。

【図２】発現カセットの概略構造。

【図３】多重クローニング部位の概略構造。

【図４】プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４の概略構造。

【図５】プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４の概略構造。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者オフマン，ジユールフランス国、エフ−67000・ストラスブール、リユ・クロズネール、５Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD04 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD09 CD21 4B024 AA08 BA80 DA01 EA06 GA11 GA17 GA19 HA01 HA12 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA11 CA19 CC24 DA11 4B065 AA01X AA01Y AA88X AA90Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA53 EA06 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アンドロクトニンをコードする核酸配列を含むことを特徴と
する核酸フラグメント。
【請求項２】ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載
の核酸フラグメント。
【請求項３】アンドロクトニンが、サソリ特にＡｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ
ａｕｓｔｒａｌｉｓ種のサソリから産生及び単離されるペプチドから構成されて
おり、前記ペプチドが、少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２
５個のアミノ酸と、互いにジスルフィド架橋を形成する４個のシステイン残基と
を含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸フラグメン
ト。
【請求項４】アンドロクトニンが本質的に以下の一般式（Ｉ）：Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａｂ−Ｃｙｓ−Ｘａｃ−Ｃｙｓ−Ｘａｄ−Ｃｙｓ−Ｘａｅ（Ｉ）〔式中、Ｘａａは少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表し、Ｘａｂは５個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｃは５個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｄは３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、Ｘａｅは少なくとも１個のアミノ酸を含むペプチド残基を表す〕のペプチド配
列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の
核酸フラグメント。
【請求項５】Ｘａｂ及び／またはＸａｄ及び／またはＸａｅが少なくとも
１つの塩基性アミノ酸を含むことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の核酸フ
ラグメント。
【請求項６】塩基性アミノ酸が、リシン、アスパラギンまたはホモアスパ
ラギンから選択されることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の核酸フラグメ
ント。
【請求項７】Ｘａａがペプチド配列Ｘａａ′−Ｖａｌを表し、ここにＸａ
ａ′はＮＨ_２または少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド残基を表し、及び
／または、Ｘａｂがペプチド配列−Ａｒｇ−Ｘａｂ′−Ｉｌｅを表し、ここにＸａｂ′は
３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｃがペプチド配列−Ａｒｇ−Ｘａｃ′−Ｇｌｙを表し、ここにＸａｃ′は
３個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｄがペプチド配列−Ｔｙｒ−Ｘａｄ′−Ｌｙｓを表し、ここにＸａｄ’は
１個のアミノ酸のペプチド残基を表し、及び／または、Ｘａｅがペプチド配列−Ｔｈｒ−Ｘａｅ′を表し、ここにＸａｅ′はＣＯＯＨ
または少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド残基を表すことを特徴とする請
求の範囲第４項から第６項のいずれか一項に記載の核酸フラグメント。
【請求項８】Ｘａａ′がペプチド配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−を表し、及び／ま
たは、Ｘａｂ′がペプチド配列−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−を表し、及び／または、Ｘａｃ′がペプチド配列−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−を表し、及び／または、Ｘａｄ′がペプチド残基−Ｔｙｒ−を表し、及び／または、Ｘａｅ′がペプチド配列−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒを表すことを特徴
とする請求の範囲第７項記載の核酸フラグメント。
【請求項９】アンドロクトニンが、配列１で示される２５個のアミノ酸の
ペプチド配列及び該配列に相同なペプチド配列によって表されることを特徴とす
る請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の核酸フラグメント。
【請求項１０】核酸フラグメントが、配列１で示される配列、該配列に相
同な配列または相補的な配列、より特定的には配列１の塩基１から７５に対応す
るコーディング部分から成ることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の核酸フ
ラグメント。
【請求項１１】 “ペプチド−アンドロクトニン”または“アンドロクトニ
ン−ペプチド”の形態、好ましくは“ペプチド−アンドロクトニン”の形態の融
合ペプチドをコードする核酸配列を含み、アンドロクトニンが請求の範囲第１項
から第９項のいずれか一項に記載のアンドロクトニンであることを特徴とする核
酸フラグメント。
【請求項１２】アンドロクトニンに融合したペプチドがシグナルペプチド
またはトランジットペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載
の核酸フラグメント。
【請求項１３】トランジットペプチドが葉緑体またはミトコンドリアに特
異的なシグナルであることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の核酸フラグ
メント。
【請求項１４】シグナルペプチドが、小胞体にタンパク質を保持させるシ
グナルまたは液胞特異的ペプチド即ち“プロペプチド”に任意に結合したＮ−末
端シグナル即ち“プレペプチド”であることを特徴とする請求の範囲第１２項に
記載の核酸フラグメント。
【請求項１５】シグナルペプチドが、タバコのＰＲ−１α遺伝子のシグナ
ルペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の核酸フラグメン
ト。
【請求項１６】 “ペプチド−アンドロクトニン”形態の融合ペプチドが、
配列３で示されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の核酸フラグメン
ト。
【請求項１７】コーディング配列が、配列３で表されるかまたは配列３の
相同配列もしくは相補配列で表され、より特定的には配列３の塩基１２−１７６
に対応するコーディング部分で表されることを特徴とする請求の範囲第１６項に
記載の核酸フラグメント。
【請求項１８】 “ペプチド−アンドロクトニン”または“アンドロクトニ
ン−ペプチド”の形態、好ましくは“ペプチド−アンドロクトニン”の形態の請
求の範囲第１１項から第１６項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】コーディング配列と、前記コーディング配列に機能的に連
結されており植物細胞または植物のような宿主生物の体内で機能し得る５′位及
び３′位のヘテロロガスな調節要素とから成り、前記コーディング配列が、請求
の範囲第１項から第１７項に記載のアンドロクトニンをコードする少なくとも１
つのＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項２０】宿主生物が、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓもしくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｌｕｓのような菌類、バキュロウイルス、植物細胞及び植物か
ら選択されることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２１】形質転換された宿主生物に適応する選択マーカーに結合さ
れていることを特徴とする請求項１９または２０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２２】請求の範囲第１９項から第２１項に記載のキメラ遺伝子を
少なくとも１つ含むことを特徴とする宿主生物を形質転換するためのクローニン
グ及び発現用ベクター。
【請求項２３】少なくとも１つの核酸フラグメントまたは請求の範囲第１
９項から第２１項に記載のキメラ遺伝子を組込むことを特徴とする宿主生物、特
に植物細胞の形質転換方法。
【請求項２４】請求の範囲第２２項に記載のベクターを用いてキメラ遺伝
子を組込むことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２５】宿主生物が、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓもしくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｌｕｓのような菌類、バキュロウイルス、植物細胞及び植物か
ら選択されることを特徴とする請求の範囲第２３項または第２４項に記載の方法
。
【請求項２６】宿主生物が植物細胞であることを特徴とする請求の範囲第
２５項に記載の方法。
【請求項２７】形質転換された植物細胞から植物を再生することを特徴と
する請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】請求の範囲第１９項から第２１項のいずれか一項に記載の
キメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換された植物細胞または植物のよう
な宿主生物。
【請求項２９】Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
もしくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｌｕｓのような菌類、バキュロウイルス、植物細胞及び植物から選択される
ことを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の宿主生物。
【請求項３０】請求の範囲第２９項に記載の形質転換された植物細胞を含
むことを特徴とする植物。
【請求項３１】形質転換された植物細胞から再生されることを特徴とする
請求の範囲第３０項に記載の植物。
【請求項３２】請求の範囲第３１項に記載の再生された植物の栽培及び／
または交配によって得られることを特徴とする植物。
【請求項３３】トウモロコシ、コムギ、ナタネ、ダイズ、イネ、サトウキ
ビ、テンサイ、タバコ及び綿から選択されることを特徴とする請求の範囲第３０
項から第３２項のいずれか一項に記載の植物。
【請求項３４】Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ特にＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔ
ｉｃｏｌａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ特にＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｈｅｒ
ｂａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ特にＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍもしく
はＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、または、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ
ｒａ特にＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃｉｎｎａｍｏｍｉなどを原因とする菌類
病害に抵抗性であることを特徴とする請求の範囲第３０項から第３３項のいずれ
か一項に記載の植物。
【請求項３５】請求の範囲第３０項から第３４項のいずれか一項に記載の
植物の種子。
【請求項３６】請求の範囲第３０項から第３４項のいずれか一項に記載の
形質転換植物または請求の範囲第２７項に記載の方法で得られた形質転換植物の
栽培方法であって、前記方法が、前記植物の栽培に好適な培地、特に圃場の表面
に前記形質転換植物の種子を播種し、前記種子または前記形質転換植物に実質的
に影響を及ぼすことなく農芸化学組成物を前記表面に施用し、栽培した植物が所
望の成熟度に到達したときに収穫し、収穫した植物から任意に種子を分離する工
程から成る方法。
【請求項３７】農芸化学組成物が、少なくとも１つの抗真菌活性及び／ま
たは抗細菌活性をもつ少なくとも１種類の有効物質を含むことを特徴とする請求
の範囲第３６項記載の方法。
【請求項３８】有効物質が、形質転換植物によって産生されたアンドロク
トニンの活性に相補的な活性を有することを特徴とする請求の範囲第３７項に記
載の方法。
【請求項３９】請求の範囲第２８項または第２９項に記載の形質転換宿主
生物を適当な培地中で栽培し、次いで、得られたアンドロクトニンを抽出し完全
にもしくは部分的に精製する工程から成る請求の範囲第１項から第１８項のいず
れか一項に記載のアンドロクトニンの製造方法。