PL236444B1 - Sposób otrzymywania degradowalnych hydrożeli na bazie pochodnych trehalozy i zastosowanie hydrożeli - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania hydrożeli sieciowanych pochodnymi trehalozy o zróżnicowanej degradowalności w środowisku lekko kwaśnym (pH 3,5-7;0), mających zastosowanie jako nośniki związków biologicznie aktywnych.

Trehaloza jest dwucukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy, połączonych wiązaniem a,a’-1,1’- O-glikozydowym, wykazującym właściwości protekcyjne białek oraz komórek podczas stresu środowiskowego: działania wysokich lub niskich temperatur, w stanie odwodnienia oraz podczas stresu osmotycznego [1]. Trehaloza jest uznana przez Amerykańską Agencję do Spraw Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration (FDA)) jako substancja bezpieczna do spożycia. Po opracowaniu wielkotonażowej metody syntezy, trehaloza znalazła liczne zastosowania w różnych gałęziach przemysłu, głównie w przemyśle spożywczym kosmetycznym, farmaceutycznym i medycynie. Stale rośnie ilość publikacji naukowych dotyczących jej potencjalnych zastosowań. W medycynie trehaloza stosowana jest jako składnik roztworów do przechowywania narządów i tkanek przeznaczonych do transplantacji oraz kriokonserwacji komórek macierzystych. W produktach farmaceutycznych trehaloza jest stosowana jako substancja pomocnicza stabilizująca białka w lekach takich jak Advate®, Avastin®, Lucentis®, Herceptin®.

Liczne badania dowodzą, że ochronne właściwości trehalozy mogą być zintensyfikowane, gdy jest ona wbudowana w struktury glikopolimerów. Y. Miura i in. pokazali, że glikopolimery zawierające trehalozę ograniczają proces nieprawidłowej agregacji i odkładania się specyficznych białek w przebiegu wielu chorób neurodegeneracyjnyęh, takich jak choroba Alzhaimera, Parkinsona czy Huntingtona [2, 3]. Maynard i in. wykazali korzystny wpływ trehalozy i jej glikopolimerów na aktywność enzymatyczną wybranych białek w warunkach stresu środowiskowego [4, 5].

W ostatnich latach obserwuje się wyraźne ukierunkowanie badań nad możliwością wykorzystania polimerów zawierających trehalozę w zastosowaniach biomedycznych. Wbudowanie trehalozy do struktury polimerów pozwoliło na uzyskanie wielu ciekawych makrocząsteczek o różnorodnych zastosowaniach, w tym: polimerów o właściwościach bioprotekcyjnych w stosunku do białek, degradowałnych materiałów hydrożelowych, czynników do transfekcji kwasów nukleinowych, termoczułych matryc do hodowli komórkowych 3D czy magnetycznych nanocząstek rozpoznawanych przez mykobakterie. W tej grupie materiałów mieszczą się hydrożele zawierające trehalozę, dotychczas niewiele jest doniesień na temat zastosowania pochodnych trehalozy w syntezie hydrożeli. Wbudowanie trehalozy w strukturę hydrożelu można zrealizować na kilka sposobów: jako fragment łańcucha głównego [6] Jako czynnik sieciujący [7, 8, 9] lub jednocześnie jako czynnik sieciujący i grupę wiszącą [10, 11, 12].

Pierwszym doniesieniem w literaturze naukowej na temat syntezy hydrożeli zawierających trehalozę było wykorzystanie dwupodstawionej pochodnej trehalozy, jako czynnika sieciującego, opisane przez Burek i współpracowników w 2014 roku [7]. Syntezę termoczułego hydrożelu zrealizowano w wyniku polimeryzacji rodnikowej poli(N-izopropyloakrylamidu) z udziałem 4,6:4’,6’-di-O -(x-alloksybenzylideno)-a,a’-trehalozy (związki 1 a, b, c) przy zastosowaniu układu nadsiarczan amonu/N,N,N’N’-tetrametyloetylenodiamina jako inicjatora. Otrzymano serię hydrożeli ulegających degradacji w PH 3 w różnym czasie w zależności od miejsca podstawienia pierścienia aromatycznego (pozycja orio, meta lub para) i warunków reakcji. I tak, w najkorzystniejszym przykładzie zastosowanie 1% pochodnej para (związek 1a) jako czynnika sieciującego skutkowało materiałem, który degradował w pH 3 po 5 h. Analogiczny hydrożel z czynnikiem sieciującym podstawionym w pozycji meta degradował 67 h. Istnieje zatem możliwość kontrolowania czasu degradacji w zależności od użytego czynnika sieciującego. Możliwość degradacji hydrożeli w pH wyższym niż 3 nie była badana.

Ta sama grupa badawcza zastosowała w syntezie termoczułych hydrożeli alifatyczne monoi diacetale trehalozy: 4,6-O -akrylideno-a,a’-trehalozę i 4,6:4’,6’-di-O-akrylideno-a,a’-trehalozę [11, 12]. Dyspersje mikrożeli uzyskanych w wyniku polimeryzacji strąceniowej inicjowanej nadsiarczanem amonu wykorzystano jako matryce do hodowli komórkowych 3D [II], natomiast makrohydrożele syntezowane w temperaturze pokojowej zastosowano jako nośniki białek [12], Warty podkreślenia jest fakt, że diacetale trehalozy są dotychczas jedynymi, cyklicznymi acetalami cukrowymi zastosowanymi jako czynniki sieciujące.

Ostatnio grupa badawcza Maynard wykorzystała w syntezie hydrożeli eterowe pochodne trehalozy: 6-O-(p -winylobenzylo)-a,a’-trehalozę oraz 6,6’-di-O -(p -winylobenzylo-a,a’-trehalozę [10]. W polimeryzacji wolnorodnikowej w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem układu inicjującego redox (nadsiarczan amonu/N,N,N’N’-tetrametyloetylenodiamina) otrzymano hydrożele, które wykorzystano do

PL 236 444 Β1 stabilizacji enzymu. - fitazy. Fitaza spulapkowana do matrycy hydrożelowej zachowała 100% aktywności po ogrzaniu do 90 °C w porównaniu z 39% aktywnością, gdy enzym był ogręewany bez hydrożelu. Możliwość degradacji hydrożeli nie była badana.

Ponadto, znane są informacje na temat zastosowania pochodnych trehalozy w syntezie hydrożeli z kilku opisów patentowych.

Z opisu WO2014160377 znane jest wykorzystanie diestrowych pochodnych trehalozy zawierających ugrupowania winylowe lub tiolowe otrzymane w wyniku reakcji katalizowanej za pomocą C. antarctica lipazy B, gdzie podstawieniu ulegają jedynie pierwszorzędowe grupy hydroksylowe w pozycji C-6 i C-6’. Hydrożele stosowane były jako system dostarczania leków biologicznych.

Z innego opisu WO2016025551 znane jest zastosowanie hydrożeli zawierających trehalozę do stabilizacji i dostarczania białek; gdzie eterowe, bądź acetalowe pochodne trehalozy zostały wykorzystane do konstrukcji łańcucha głównego i/lub jako czynniki sieciujące. Syntezy hydrożeli oparto o pochodne monopodstawione: 6-O-(p-winylobenzylo)-a,a’-trehalozę, 4,6-O-winylobenzylideno-a,a-trehalozę oraz pochodne di podstawione: 6,6’-di-O-(p-winylobenzylo)-a,a’-trehalozę i 4,6:4’,6’-di-O>-winylobenzylideno-a,a’-trehalozę. Reakcje polimeryzacji przeprowadzono z monomerami trehalozowymi w różnych kombinacjach stosując inicjację termiczną (azobis(izobutyronitryl)) lub układ inicjujący redox (nadsiarczan amonu/N,N,N,N’-tetrametyloetylenodiamina). Hydrożele oparte o diacetale p-winylobenzylidenowe trehalozy (związek 2) jako czynniki sieciujące łatwo degradują w środowisku 10% kwasu trifluoroctowego (TFA), jednakże nie obserwowano degradacji w pH 3 i 5.

Opis patentowy EP3187510 ujawnia wykorzystanie pochodnych trehalozy do sieciowania naturalnych polisacharydów, takich jak kwas hialuronowy, chondroityny oraz siarczanu chondroityny. Odpowiednio sfunkcjonalizowane pochodne 6,6’-diamino-6,6’-dideoksy-a,a’-trehalozy, zawierające reaktywne grupy aminowe były kondensowane z polisacharydami za pomocą chlorowodorku 4-(5,6-dimetoksy-1,3,5-triazyn-2-ylo)-4-metylomorfoliny jako czynnika kondensującego.

Niedogodnością powyższych rozwiązań jest brak degradacji hydrożeli w środowisku lekko kwaśnym o pH 3,5-7,0 lub brak doniesień na temat możliwości degradacji w pH wyższym niż 3.

Polimery ulegające degradacji w roztworach kwaśnych są szeroko badane jako potencjalne systemy dostarczania leków o zlokalizowanym działaniu, w których uwalnianie miałoby następować dopiero po osiągnięciu miejsca chorobowo zmienionego wykazującego lekko kwaśne pH jak np. miejsce stanu zapalnego czy otoczenie nowotworu. Występowanie gradientu pH wykorzystuje się również przy projektowaniu nośników do uwalniania wewnątrzkomórkowego, u podstaw czego leży obniżanie się pH

PL 236 444 B1 podczas endocytozy od 7,2-7,4 we krwi i przestrzeni zewnątrzkomorkowej do 4,0-6,5 w strukturach wewnątrzkomórkowych takich jak endosomy i lizosomy. [13]

Istnieją dwie podstawowe strategie degradacji nośników: enzymatyczna i chemiczna. Druga z nich najczęściej wykorzystuje zwiększoną kwasowość w tkankach guza, gdzie może nastąpić hydroliza kwasowa nośnika. Aby taka strategia zakończyła się powodzeniem, koniecznym jest, aby nośnik zawierał w strukturze ugrupowania labilne w środowisku lekko kwaśnym. Jednym ze sposobów zapewnienia degradacji hydrożelowych nośników jest wybranie odpowiedniego czynnika sieciującego. Najczęściej stosowanymi czynnikam sieciującymi wrażliwymi na środowisko kwaśne są: aceta le, ketale, hydrazony, iminy, oksymy. Jednymi z często stosowanych czynników sieciujących są acetale i ketale [13, 14]. Wiązanie acetalowe jest stosunkowo trwałe w środowisku zasadowym i obojętnym, natomiast w środowisku kwaśnym ulega hydrolizie.

Spośród acetalowych czynników sieciujących najbardziej podatne na hydrolizę kwasową są aromatyczne acetale, z uwagi na efekty ezomeryczne pierścienia aromatycznego, które znacząco wpływają na szybkość hydrolizy ugrupowania acetalowego w hydrożelu. Etapem limitującym hydrolizę jest utworzenie jonu karboksoniowego, który może być stabilizowany mezomerycznie poprzez sam pierścień aromatyczny, a poza tym przez elektrodonorowe podstawniki pierścienia. Alifatyczne acetale charakteryzują się znacząco wolniejszą hydrolizą w porównaniu do aromatycznych odpowiedników, gdyż nie ma tak dobrej stabilizacji karboksoniowego produktu pośredniego. Reakcja acetalizacji jest często wykorzystywana w chemii cukrów jako metoda zabezpieczania określonych grup hydroksylowych. W literaturze znajdujemy przykłady jej wykorzystania do otrzymywania nienasyconych monomerów cukrowych, takich jak pochodne trehalozy [7, 11, WO 2016/025551 Al, 15], sacharozy [16] glukopiranozydu [17, 18], mannopiranozydu [18] lub mannitolu i sorbitolu [19]. Zastosowanie acetali cukrowych jako czynników sieciujących w syntezie hydrożeli zostało opisane tylko dla acetali trehalozy [7, 11, 12, WO 2016/025551 Al], jednakże hydrożele zsyntezowane z ich udziałem nie ulegały degradacji w środowisku kwaśnym, zbliżonym do warunków fizjologicznych.

Zadaniem proponowanego wynalazku jest opracowanie sposobu o hydrożeli na bazie pochodnych trehalozy, charakteryzujących się degradowalnością w środowisku o pH 3,5-7,0.

Cel ten osiągnięto stosując do syntezy hydrożeli diacetalowe pochodne trehalozy jako czynniki sieciujące.

Istota rozwiązania według wynalazku polega na tym, że proces syntezy hydrożeli prowadzi się dwuetapowo, przy czym I etap obejmuje czteroetapową (etapy a, b, c, d) syntezę czynnika sieciującego o wzorze ogólnym I, II lub III, gdzie podstawniki, Ri, R2, R3, R4 oznaczają: atom wodoru lub grupę hydroksylową, lub (halogeno)alkilową lub (haiogeno)alkiloksylową, nitrową, lub nitrylową, lub (alkilo)aminową lub fenyloksylową, lub halogen; a R5 oznacza atom wodoru lub grupę metylową, gdzie:

etap a) obejmuje reakcję hydroksybenzaldehydu lub jego pochodnych z czynnikiem alkilującym H-(L)n-X w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do hydroksybenzaldehydu, przy czym jako czynnik alkilujący stosuje się związek H-(L)n-X z grupą łatwo odchodzącą X=Cl, Br, 1, O -toluenosulfonyl, O -metanosuIfonyl, gdzie L to grupy etoksylowe lub propyloksylowe, przy czym liczba grup etoksylowych lub propyloksylowych w zakresie n = 1-25, a reakcję prowadzi się w środowisku zasadowym, korzystnie w obecności K2CO3 w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do hydroksybenzaldehydu w rozpuszczalniku aprotycznym, korzystnie dimetylosulfotlenek (DMSO) w temperaturze w zakresie 50-120°C w czasie od 10 do 48 h, etap b) otrzymany surowy produkt rozpuszcza się w metanolu, dodaje się trimetyloortomrówczan w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do surowego produktu oraz katalizator kwasowy w ilości od 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunku do surowego produktu, a reakcję prowadzi się temperaturze wrzenia rozpuszczalnika; w czasie od 0,5 do 48 h, etap c) wydzielony produkt rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie tetrahydrofuran (THF) i do tak otrzymanego roztworu dodaje się trietyloaminę (TEA) w ilości od 1 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do wydzielonego produktu, następnie wkrapla się kwas (met)akrylowy lub jego pochodną, korzystnie chlorek (met)akryloilu w ilości od 1 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do wydzielonego produktu, a reakcję prowadzi się w temperaturze od 0 do 25 °C w czasie od 0,5 do 48 h, etap d) po czym prowadzi się reakcję trehalozy z otrzymanym w etapie c) produktem w ilości od 2 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do trehalozy w obecności katalizatora kwasowego w ilości od 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunku do trehalozy, w rozpuszczalniku aprotycznym, ko

PL 236 444 B1 rzystnie dimetyloformamid (DMF) w temperaturze od 40 do 120°C, korzystnie 80°C w obecności inhibitora polimeryzacji wolnorodnikowej, korzystnie hydrochinonu w ilości 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunku do trehalozy;

w II etapie prowadzi się reakcję polimeryzacji wolnorodnikowej wybranych (ko)monómerów w ilości od 80 do 99,5% wagowych z czynnikiem sieciującym o wzorze ogólnym I, II lub III w ilości od 0,5 do 20% wagowych wszystkich (ko)monomerów, przy czym jako (ko)monomery stosuje się pochodne akrylowe, metakrylowe, winylowe, olefinowe, allilowe, korzystnie 2-hydroksyetyloakryloamid (HEAAm), polimeryzację prowadzi się w wodzie lub układzie rozpuszczalników woda/rozpuszczalnik organiczny, przy udziale inicjatora termicznego, fotochemicznego lub układu redox w ilości 0,1-5% mol, w temperaturze od 5 do 70°C, korzystnie wobec układu redox: nadsiarczan amonu/N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina w ilości 0,5-2/0,75-3%mol i temperaturze 25°C, dodatkowo wprowadza się do układu reakcyjnego substancję biologicznie aktywną i tak przygotowany hydrożel następnie stanowi degradowalny nośnik substancji biologicznie aktywnej w roztworach o pH 3,5-7,0.

Korzystnie jako hydroksybenzaldehyd stosuje się pochodne orto, meta lub para hydroksybenzaldehydu, gdzie podstawniki Ri, R2, R3, R4 oznaczają atom wodoru lub grupę hydroksylową, lub (halogeno)alkilową, lub (halogeno)alkiloksylową, lub nitrową, lub nitrylową, (alkilo)aminową, lub fenyloksylową lub halogen.

Korzystnie jako katalizator kwasowy w etapie b) stosuje się ZnCl2, LiBF4 NaBF4 KBF4, kwas/ptoluluenosulfonowy lub kwas siarkowy.

Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny w etapie c) stosuje się tetrahydrofuran (THF), pirydynę, CH2CI2, CHCl3 lub eter dietylowy.

Korzystnie stężenie (ko)monomerów w układzie reakcyjnym polimeryzacji wynosi od 2 do 75% wagowych.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zastosowanie hydrożeli otrzymanych sposobem określonym powyżej jako degradowalnych nośników związków biologicznie aktywnych, w szczególności białek, peptydów, oligonukleotydów w roztworach o pH 3,5-7,0.

Wynalazek objaśniono w podanych poniżej przykładach jego realizacji.

Przykład 1

Synteza czynnika sieciującego (Wzór I, Ri= R2=R3=R4=H, R5=H, n = 1)

Etap a Do roztworu pochodnej p-hydroksybenzaldehydu (0,120 mola) w 120 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) dodaje się 2-chloroetanol (0,217 mola; 1,8eq.) i K2CO3 (0,132 mola; 1,8 leq.). Reakcję prowadzi się przez 20 h w temperaturze 94°C. Następnie po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej, dodaje się 170 ml wody dejonizowanej i produkt ekstrahuje za pomocą octanu etylu (4x110 ml). Fazy organiczne łączy się i przemywa nasyconym roztworem Na2CO3 (3 x 200 ml), a następnie nasyconym roztworem NaCl (2 x 200 ml). Fazę organiczną suszy się bezwodnym MgSO4 i po przesączeniu zatęża na wyparce uzyskując p-(2-hydroksyetoksy)benzaldehyd w postaci żółtych kryształów (wyd. 76%).

Charakterystyka 1H NMR surowego produktu.

PL 236 444 Β1

^ŁH NMR (CDCh, 600 MHz) δ [ppm]: 2.24 (s, IH, -OH); 4.02 (d, 2H, J=3.4 Hz, -CH₂OH); 4.18 (m, 2H, PhOCH₂-); 7.03 (d, 2H, J=8.8 Hz, H^c); 7.84 (d, 2H, J=8.8 Hz, H^b); 9.89 (s, IH, -CHO).

Etap b Surowy p-(2-hydroksyetoksy)benzaldehyd (0,078 mola) rozpuszcza się w 40 ml metanolu (MeOH), dodaje LiBF4(3,9 mmola; 0,05 eq.) oraz trimetyloortomrówczan (0,117 mola; 1,5 eq.). Reakcję prowadzi się w temperaturze wrzenia przez 3h. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodaje się 180 ml nasyconego roztworu NaHCs oraz 70 ml wody dejonizowanej. Mieszaninę ekstrahuje się za pomocą octanu etylu (4 x 120 ml). Fazy organiczne łączy się i przemywa nasyconym roztworem NaHCOs (120ml). Fazę organiczną suszy się bezwodnym MgSO4 i po przesączeniu zatęża na wyparce uzyskując acetal dimetylowy p-(2-hydroksyetoksy)benzaldehydu w postaci żółtego oleju (wyd. 92%).

Charakterystyka ¹H NMR surowego produktu.

PL 236 444 Β1

fl(WMi)

NMR (CDCh, 600 MHz) δ [ppm]: 2.28 (t, IH, 1=6.2 Hz, -OH); 3.31 (s, 6H, -CH₃); 3.95 (m, 2H, CH₂OH); 4.08 (m, 2H, -PhOCHr); 5.35 (s, IH, -OCHO-); 6.91 (d, 2H, 1=8.8 Hz, H^c); 7.37 (d, 2H, 1=8.4 Hz, H^b).

Etap c. Do roztworu uzyskanego acetalu dimetylowego p-(2-hydroksyetoksy)benzaldehydu (0,068 mola) w 380 ml tetrahydrofuranu (THF) dodaje się trietyloaminę (TEA) (0,205 mol; 3 ekwiwalentów) i schłodzi na łaźni wodno-lodowej. Chlorek akryloilu (0,102 mola w 30 ml THF; 1,5 ekwiwalentów) wkraplano do mieszaniny przez około 30 minut. Reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej. Powstały osad odsączono, a przesącz zawierający produkt zatężono na wyparce. Uzyskano 0,064 mola (94%) surowego produktu w postaci oleju.

Charakterystyka ¹H NMR surowego produktu

PL 236 444 Β1

io.o os μ sj a,ο zs zo a.s e.o s.s s.o 4.s 4.0 xs a.c i.s 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 n w ^LH NMR (CDCI₃, 600 MHz) <5 [ppm): 3.31 (s, 6H, -CH₃); 4.22 (t, 2H,/=4.8 Hz, -PhOCHr); 4.51 (t, 2H,/=4.8

Hz, -CH₂OC(O)-); 5.35 (s, 1H, -OCHO-}; 5.86 {dd, 1H, /=10.5 Hz, -CH=CH₂ cis); 6.17 (m, 1H, -CH=CH₂);

6.44 (dd, 1H, /=17.3 Hz, -CH=CH₂ trans); 6.91 (d, 2H, /=8.8 Hz, H^c); 7.37 (d, 2H, /=8.4 Hz, H^b).

Etap d. Do roztworu bezwodnej trehalozy (0,024 mola) w 45 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) dodano acetal otrzymany w etapie c/ (0,062 mola; 2,6 ekwiwalentów), hydrochinon (0.48 mmola; 0,02 ekwiwalentów) oraz kwas p-toluenosulfonowy (0,96 mmola; 0,02 ekwiwalentów). Reakcję prowadzono w temperaturze 80°C przez 3h. Po tym czasie dodano trietyloaminę (TEA) (3,8 mmol; 0,16 ekwiwalentów) i zatężono na wyparce. Produkt macerowano eterem dietylowym (5 x25 ml) i pozostawiono do wysuszenia. Po wysuszeniu oczyszczano metodą flash chromatografii stosując CHCb/MeOH/TEA 97:2:l(v/v) jako układ do elucji. Otrzymano 0,0096 mola czynnika sieciującego w postaci białego osadu (wyd. 40%).

Charakterystyka ¹H NMR czystego związku o Wzorze I (Ri=R₂=v R3=R4=H, R5=H, n = 1).

PL 236 444 Β1

fl (ppmj ⁷Η NMR (DMSOde, 600 MHz) δ [ppm]: 3.36 (t, 2H, H-4, H-4'); 3.42 |m, 2H, H-2, H-2'); 3.63, 3,76 (m, 2H, H-3, H-3'); 3.63, 4.09-4.00 (m, 6H, H-5, H-5', H-6, H-6'); 4.23 (t, 2H,7=4,55 Hz, -PhOCH₂-); 4.44 (t, 2H, 7=4.55 Hz, - CH₂OC(O)-); 4.93 (d, 2H, 7=3.7 Hz, H-l, H-l'}; 5.19 (d, 2H, C3-OH, C3'-OH'); 5.25 (d, 2H, C2OH, C2'-OH'); 5.51 (s, 2H, -OCHO-, -OCHO-); 5.96 (dd, 2H, 7=10.3 Hz, 1.5 Hz, -CH=CH₂ cis, -CH=CH'₂ cis); 6.22 (dd, 2H, 7=17,3 Hz, 10.3 Hz, -CH=CH₂, -CH'=CH₂); 6.35 (dd, 2H, 7=17.3 Hz, 1.5 Hz, -CH=CH₂ trans, -CH=CH₂ trans); 6.94 (d, 4H, 7=8.8 Hz, H^c); 7.37 (d, 4H, 7=8.4 Hz, H^b).

Przykład 2

Polimeryzacja wolnorodnikowa - synteza hydrożelu polyiHEAAm]

2-hydrpksyetyloakryloamid (HEAAm) (92,5% wagowych) i czynnik sieciujący o Wzorze I (Ri=R₂=R3=R4=H, R₅=H, n = 1) (7.5% wagowych) o łącznej masie 0,15 g rozpuszczono w układzie rozpuszczalników H2O/DMF (2:1 v/v, 2 ml), dodano Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametyloetylenodiaminę (3%mol) i umieszczono w fiolce o poj. 7 ml. Roztwór przedmuchano argonem i zainicjowano polimeryzację dodając nadsiarczan amonu (2%mol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej. Mieszaninę pozostawiono na 24h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie hydrożel przełożono do wody dejonizowanej na okres 5 dni, wodę wymieniano co 12 h. Odmyty hydrożel pocięto na krążki, wysuszono na powietrzu, masa suchego krążka ok. 10 mg, wydajność 67%.

Przykład 3

Polimeryzacja wolnorodnikowa - synteza hydrożelu poly(EAAm) zawierającego BSA

Polimeryzację prowadzono analogicznie jak w przykładzie 2, z ta różnicą, że do mieszaniny reakcyjnej oprócz 2-hydroksyetyloakryloamid (HEAAm), czynnika sieciującego o Wzorze I (Ri= R₂= R3—R4—H, R₅=H, n = 1) Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametyloetylenodiaminy, dodano surowiczą albuminę wołową (BSA) (30 mg). Po odmyciu hydrożelu, w wodzie z przemywać oznaczono białko metodą Bradforda. Masa suchego krążka ok. 15 mg, wydajność 76%, stopień spułapkowania białka (PL) 19%, efektywność pułapkowania (EE) 60%.

PL 236 444 Β1

Przykład 4

Opis uwalniania substancji biologicznie aktywnej

Hydrożele zawierające spułapkowaną surowiczą albuminę wołową (BSA) w formie wysuszonych krążków (ok. 15 mg) umieszczono w buforze PBS (5 ml) o różnym pH w zakresie 3,5-7,0. Roztwory mieszano (400 rpm) i termostatowano w cieplarce w 37°C. W określonych odstępach czasu pobierano próbki (0,05 m|) i oznaczano stężenie białka metodą Bradforda. Źa każdym razem uzupełniano pobraną objętość buforem. PBS o odpowiednim pH w zakresie 3,5-7,0. Stopień uwalniania białka (cumulative release,%) obliczono ze wzoru: cumulative release [%] = (WR/WL) x 100 (WR - masa leku uwolnionego z hydrożelu, WL - początkowa masa leku spułapkowanego w hydrożelu). Przykładowe profile uwalniania BSA z hydrożeli Poly[HEAAm] zawierających 5, 7,5, i 10% czynnika sieciującego o Wzorze I (Ri=R2= R3—R4—H, R₅=H, n = 1) w buforze PBS o pH 5 przedstawia poniższy wykres.

Sposób otrzymywania hydrożeli obejmuje dwa etapy I i II które zostały przedstawione na Rysunku W Etapie I otrzymuje się di(met)akrylany cyklicznych, benzylidenowych diacetali trehalozy w wyniku czteroetapowej syntezy, a w Etapie II otrzymuje się hydrożele z udziałem trehalozowych czynników sieciujących i odpowiednich monomerów w wyniku polimeryzacji wolnorodnikowej. Syntezę hydrożeli prowadzi się korzystnie w temperaturze pokojowej w wodzie wobec układu inicjującego redoks polimeryzacji wolnorodnikowej. Ideę wynalazku przedstawiono schematycznie na przykładzie hydrożelu na bazie 2-hydroksyetyloakryloamidu (HEAAm), w syntezie którego jako czynnik sieciujący zastosowano cykliczny diacetal trehalozy i (p-akrylanoksyetoksy)benzaldehydu (Wzór I, Ri=R2=R3=R4=H, R=H, n = 1). W przedstawionych przykładach syntezę hydrożeli oparto o HEAAm jako główny monomer. W syntezie hydrożeli mogą zostać wykorzystane inne monomery, takie jak np.: akrylowe (2-hydroksyetyloakrylan), metakrylowe (2-hydroksyetylometakrylan, 2-hydroksypropylometakryloamid), winylowe (N-winylo-2-pirolidon, N-winylokaprolaktam).

Z uwagi na podatność wiązania acetalowego na hydrolizę kwasową oraz zależność jej szybkości od miejsca podstawienia pierścienia aromatycznego i odległość łańcucha głównego polimeru od fragmentów aromatycznych otrzymano serię hydrożeli ulegających degradacji w lekko kwaśnym środowisku o pH 3,5-7,0 różniących się czasem degradacji. Przykładowo czas całkowitej degradacji dla hydrożelu Poly[HEAAM] sieciowanego pochodną trehalozy o Wzorze I (R1* R2=RFRł=H, R^AH, n = 1) wynosił w zależności od stężenia monomeru 6-21 h w pH 3,5, natomiast 24-120 h w pH 5,0. W fizjologicznym pH 7,4 degradacji nie obserwowano do 120h. Czas degradacji można dowolnie modulować w zależności od zastosowanego tintera i podstawników w pierścieniu aromatycznym czynnika sieciującego oraz masy i postaci hydrożelu, Uwalnianie substancji biologicznie aktywnej z hydrożelu zostało opisane w Przykładzie 4.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest możliwość degradacji hydrożeli w lekko kwaśnym środowisku (pH 3,5-7,0), a zachowanie, stabilności w pH odpowiadającym kwasowości krwi (pH 7,2-7,4).

PL 236 444 B1

Literatura

[1] Teramoto N, Sachinvala N. D., Shibata M. „Trehalose Trehalose-based Polymers for Environmentally Benign, Biocompatible and Bioactive „Materials” Molecules 2088, 13, 1773*1816.

[2] Miura Y., You C., Ohnishi R. „Inhibition of Alzheimer amyloid β aggregation by polyvalent trehalose” Sci. Technol. Adv. Mater. 2008,9,1-6.

[3] Wada M., Miyazawa Y., Miura Y. „A specific inhibitory effect of multivalent trehalose toward Aβ(1—40) aggregation” Polytn. Chem. 2011,2, 1822-1829.

[4] Mancini R. J., Lee J., Maynard H. D. „Trehalose Glycopolymers for Stabilization of Protein Conjugates to Environmental Stressors” J, Am. Chem. Soc. 2012, 134,8474-8479.

[5] Lee 1, Lin E. W., Lau U. Y., Hedrick J. L., Bat E., Maynard H. D. „Trehalose Glycopolymers as Excipients for Protein Stabilization” Biomacromolecutes 2013, 14, 2561-2569.

[6] O'Shea, T. ML; Webber, M. J.; Aimetti, A, A.; Langer, R. „Covalent Incorporation of Trehalose within Hydrogels for Enhanced Long-Term Functional Stability and Controlled Release of B iomacromolecu les” Adv. Healthc. Mater. 2015, 4, 1802-1812.

[7] Burek, M.; Czuba, Z. P.; Waskiewicz. S. „Novel Acid-Degradable and Thermo-Sensitive poly(N- Isopropylacryiamide) Hydrogels Cross-Linked by α,α-TrehaIose Diacetals. „Polymer 2014, 55, 6460-6470.

[8] Burek, M.; Kowalczyk, M,; Czuba, Z. P.; Kral, W.; Pilawka, R.; Waskiewicz, S. „Poly(N-Isopropyiacrylamide) Hydrogels Cross-Linked by α,α-Trehalose Diacetals as Thermo-Responsive and AcidDegradable Carriers for Drug Delivery”. Polym. Degrad. Stab. 2016, 129, 296-305.

[9] Cassano, R.; Trombino, S. „Trehalose-Based Hydrogel Potentially Useful for the Skin Bum Treatment”. J. Appl. Polym. Sci. 2017, 134, 1-6.

[10] Lee, J.; Ko, J. H.; Lin, E.-W.; Wallace, P.; Ruch, F.; Maynard, H. D. „Trehalose Hydrogels for Stabilization of Enzymes to Heat”. Polym. Chem. 2015,6, 3443-3448.

[11] Burek, M.; Waśkiewicz, S.; Lalik, A.; Student, S.; Bieg, T.; Wandzi k, 1. „Thermoresponsive Mtcrogels Containing Trehalose as Soft Matrices for 3D Cell Culture”. Biomater. Sci. 2017, 5, 234-246.

[12] Burek, M.; Waskiewicz, S., Awietjan, S.; Wandzik, I. Thermoresponsive Hydrogels with Covalently Incorporated Trehalose as Protein Carriers”. React. Fusel. Polym. 2017,119,105-115.

[13] Binauld S, Stenzel.M.H. „AcM-degradable polymers for drug delivery: a decade of innovation”. Chem. Commun. 2013, 49, 2082-2102.

[14] Bin Liu, Thayumanavan S. „Substituent Effects on the pH Sensitivity of Acetals and Ketals and Their Correlation with Encapsulation Stability in Polymeric Nanogels” J. Am. Chem. Soc. 2017, 139.2306-2317.

[15] Lee, J.; Lin, E.-W.; Lau, U.Y.; Hedrick, J. L; Bat, E.; Maynard, H.D. „Trehalose Glycopolymers as Excipients for Protein Stabilization”. Biomacromolecules, 2013, 14,2561-2569; Teramoto, N.; Unosawa, M,: Matsushima, S.; Shibata, M. „Synthesis and Properties of Thermoplastic Alternating Copolymers Containing Trehalose and Siloxane Units by Hydrosilylation Reaction”. Polym. J., 2007, 39,975-981

[16] Fanton, E.; Fay et, C.; Gelas, J.; Jhurry, D.; Deffieux, A.; Fontanille, M.; „Etfaylentc acetals of sucrose and their copolymerization with vinyl monomers” Carbohydr. Res, 1992,226,337-343.

[17] Jedliński, Z.; Maślinska, J.; „The synthesis, properties and structures of some unsaturated methyl- a.d-gIucopyranoside acetals” Tetrahedron 1963, 19, 1171-1173, Jedliński, Z.; Maślińska-Solich, J. „Polymerization of unsaturated methy1-a,D-glucopyranoside acetals”. I. Polym. Sci.: Part C 1968, 16, 3611-3618, Maślińska-Solich, J.; Kukowka, S; Markowski, P.; „Polyethers of cinnamaldehyde acetal. Part 1: Williamson etherification of 1 n-dibromoalkanes with methyl 4,6-O-cinnamylidene-a-d-glucopyranoside”. React. Funct Polym. 2008, 68, 544-556.

[18] Jedliński, Z.; Maślińska-Solich, J.; Dworak, A. „Synthesis and configuration of some dialkenylidene derivatives of methyl a-d-mannopyranoside”. Carbohydr. Res. 1975, 42,227-231.

[19] Haworth, W N.; Gregory. H.; Wiggins, l .F. „Some derivatives of simple carbohydrates containing unsaturated substituents”. J. Chem. Soc. 1946,488-491.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania hydrożeli, jako nośników związków biologicznie aktywnych znamienny tym, że proces syntezy hydrożeli prowadzi się dwuetapowo, przy czym I etap obejmuje czteroetapową (etapy a, b, c, d) syntezę czynnika sieciującego o wzorze ogólnym I, II llub III, gdzie podstawniki Ri, R2 R3, R4 oznaczają: atom wodoru tub grupę hydroksylową, lub (halogeno)alkilową lub (halogeno)alkiloksylową, nitrową, lub nitrylową, lub (alkilo)aminową, lub fenyloksylową, lub halogen; a R5 oznacza atom wodoru lub grupę metylową, gdzie:

   etap a) obejmuje reakcję hydroksybenzaldehydu lub jego pochodnych z czynnikiem alkilującym H-(L)n-X w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do hydroksybenzaldehydu, przy czym jako czynnik alkilujący stosuje się związek H-(L)a-X z grapą łatwo odchodzącą X=Cl, Br, 1, O- p-tohienosuIfonyl, O-metanosulfonyl, gdzie L to grupy etoksylowe lub propyloksylowe, przy czym liczba grup etoksylowych lub propyloksyIowych w zakresie n = 1-25, a reakcję prowadzi się w środowisku zasadowym, korzystnie w obecności K2CO3 w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do hydroksybenzaldehydu w rozpuszczalniku aprotycznym, korzystnie dimetylosulfotlenek (DMSO) w temperaturze w zakresie 50-120°C w czasie od 10 do 48 h, etap b) otrzymany surowy produkt rozpuszcza się w metanolu, dodaje się trimetyloortomrówczan w ilości od 1 do 2 ekwiwalentów molowych w stosunku do surowego produktu oraz katalizator kwasowy w ilości od 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunku do surowego produktu, a reakcję prowadzi się temperaturze wrzenia rozpuszczalnika; w czasie od 0,5 do 48 h, etap c) wydzielony produkt rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie tetrabydrafitran (THF) i do tak otrzymanego roztworu dodaje się trietyloaminę (TEA) w ilości od 1 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do wydzielonego produktu, następnie wtapia się kwas (met)akrylowy lub jego pochodną, korzystnie chlorek (met)akrytoilu w ilości od 1 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do wydzielonego produktu, a reakcję prowadzi się w temperaturze od 0 do 25°C w czasie od 0,5 do 48 h, etap d) po czym prowadzi się reakcję trehalozy z otrzymanym w etapie c) produktem w ilości od 2 do 4 ekwiwalentów molowych w stosunku do trehalozy w obecności katalizatora kwasowego w ilości od 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunki do trehalozy, w rozpuszczalniku aprotycznym, korzystnie dimetyloformamid (DMF) w temperaturze od 40 do 120°C€, korzystnie 80°C w obecności inhibitora polimeryzacji wolnorodnikowej, korzystnie hydrochinonu w ilości 0,01 do 0,1 ekwiwalentów molowych w stosunku do trehalozy; w II etapie prowadzi się reakcję polimeryzacji wolnorodnikowej wybranych (ko)monomerów w ilości od 80 do 99,5% wagowych z czynnikiem sieciującym o wzorze ogólnym I, II lub III w ilości od 0,5 do 20% wagowych wszystkich (ko)monomerów, przy czym jako (ko)monomery stosuje się pochodne akrylowe, metakrylowe, winylowe, olefinowe, allilowe, korzystnie 2-hydroksakryloamid (HEAAm), polimeryzację prowadzi się w wodzie lub układzie rozpuszczalników woda/rozpuszczalnik organiczny, przy udziale inicjatora termicznego, fotochemicznego lub układu redoxw ilości 0,1-5% mol, w temperaturze od 5 do 70°C, korzystnie wobec układu redox: nadsiarczan amonu/N,N,N’,N’-tetrametytoetylenodiamina w ilości 0,5-2/0,75-3% mol i temperaturze 25°C, dodatkowo wprowadza się do układu reakcyjnego substancję biologicznie aktywną i tak przygotowany hydrożel następnie stanowi degradowalny nośnik substancji biologicznie aktywnej w roztworach o pH 3,5-7,0.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako hydroksybenzaldehyd stosuje się pochodne orlo, meta lub para hydroksybenzaldehydu, gdzie podstawniki R1, R2, R3, R4 oznaczają atom wodoru lub grupę hydroksylową, lub (halogeno)aik i Iową, lub (halogeno)ałkiloksylową, lub nitrową, lub nitrylową, (alkilo)aminową, lub fenyloksylową lub halogen.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, te jako katalizator kwasowy w etapie b) stosuje się ZnCl2, LiBF4, NaBF4, KBF4, kwas p -toluenosulfonowy lub kwas siarkowy.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, te jako rozpuszczalnik organiczny w etapie c) stosuje się tetrahydrofuran (THF), pirydynę, CH2CI2, CHCb lub eter dietylowy.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, te jako czynnik sieciujący stosuje się diacetalowe, benzylidenowe pochodne trehalozy z ugrupowaniami etoksylowymi lub propyloksyłowymi zakończonymi grapami (met)akrylowymi.

   PL 236 444 Β1
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie (ko)monomerów w układzie-reakcyjnym polimeryzacji wynosi od 2 do 75% wagowych.
7. 7. Zastosowanie hydrożeli otrzymanych sposobem określonym w zastrz. 1, jako degradowalnych nośników związków biologicznie aktywnych, w szczególności białek, peptydów, oligonukleotydów w roztworach o pH 3,5-7,0.