HRP980455A2 - Gene coding for androctonine, vector containing it and disease-resistant transformed plants obtained - Google Patents
Gene coding for androctonine, vector containing it and disease-resistant transformed plants obtainedInfo
- Publication number
- HRP980455A2 HRP980455A2 HR9710632A HRP980455A HRP980455A2 HR P980455 A2 HRP980455 A2 HR P980455A2 HR 9710632 A HR9710632 A HR 9710632A HR P980455 A HRP980455 A HR P980455A HR P980455 A2 HRP980455 A2 HR P980455A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- peptide
- sequence
- androctonin
- nucleic acid
- plants
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 111
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 82
- 101710185380 Androctonin Proteins 0.000 claims description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 241000239238 Androctonus australis Species 0.000 claims description 4
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 4
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 claims description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 claims description 2
- 241001149956 Cladosporium herbarum Species 0.000 claims description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 2
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 claims description 2
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims 1
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 claims 1
- 241000233618 Phytophthora cinnamomi Species 0.000 claims 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 6
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000025540 plastid localization Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 101710120040 Antifungal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101150075884 BRX gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 101710164770 Drosomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000588744 Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- ABLACSIRCKEUOB-UHFFFAOYSA-N Resistomycin Chemical compound O=C1C(C)(C)C2=CC(O)=C3C(C)=CC(O)=C4C3=C2C2=C1C(O)=CC(O)=C2C4=O ABLACSIRCKEUOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229950011491 heliomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Sadašnji izum odnosi se na sekvenciju DNA šifriranu za androktonin, vektor za transformaciju organizma domaćina koji ju sadrži, te postupak transformacije rečenog organizma.
Izum se posebice odnosi na transformaciju biljnih stanica i biljaka, te na androktonin koji proizvode tranformirane biljke, pri čemu nastaje otpornost prema bolestima, ponajprije bolestima gljivičnog podrijetla.
Danas postoji sve veća potreba za dobivanjem biljaka otpornih na bolesti, osobito gljivične bolesti, da bi se time smanjile, štoviše potpuno izbjegle obradbe proizvodima za protugljivičnu zaštitu, a sa ciljem zaštite okoliša. Jedan od načina povećanja te otpornosti na bolesti sastoji se u transformaciji biljaka, tako da one proizvode tvari koje same po sebi omogućuju njihovu obranu od bolesti.
Poznate su različite tvari prirodnog podrijetla, ponajprije peptidi koji pokazuju baktericidna ili fungicidna svojstva, posebice protiv gljiva odgovornih za biljne bolesti. Međutim, problem je u pronalaženju onih tvari koje nisu samo proizvedene od transformiranih biljaka, nego i zadržavaju svoja baktericidna ili fungicidna svojstva, te ih daju rečenim biljkama. U smislu sadašnjeg izuma pojmovi baktericidan ili fungicidan odnose se kako na stvarna baktericidna ili fungicidna svojstva, tako i na bakteriostatička i fungistatička svojstva.
Androktonini su peptidi koje proizvode škorpioni, ponajprije oni vrste Androctonus Australis. Jedan androktonin i njegovu pripravu kemijskom sintezom opisali su Ehret-Sabatier et al., kao i njegova in vitro protugljivična i protubakterijska svojstva.
Androktoninski geni sada su identificirani, a pronađeno je također da mogu biti umetnuti u organizam domaćina, ponajprije u biljku, sa ciljem ekspresije androktonina kako za pripravu i izolaciju tog androktonina, tako i za pridjeljivanje rečenom organizmu domaćinu svojstva otpornosti prema gljivičnim bolestima i bolestima bakterijskog podrijetla, čime se priskrbljuje posebice prikladno rješenje gore istaknutog problema.
Stoga je predmet izuma ponajprije fragment nukleinske kiseline šifriran za neki androktonin, kimerni gen koji sadrži rečeni fragment šifriran za neki androktonin, potom heterologne elemente regulacije na položajima 5’ i 3’ koji mogu funkcionirati u organizmu domaćinu, ponajprije u biljkama, te vektor transformacije organizama domaćina koji sadrži taj kimerni gen kao i transformirani organizam domaćina. Izum se također odnosi na transformiranu biljnu stanicu koja sadrži barem jedan fragment nukleinske kiseline šifriran za androktonin, te biljku otpornu na bolesti, koja sadrži spomenutu stanicu. Izum se, na kraju, odnosi i na postupak uzgoja transformiranih biljaka prema izumu.
Prema izumu, izraz androktonin odnosi se na bilo koji peptid koji mogu proizvesti škorpijoni ili se iz njih može izolirati, a ponajprije iz vrste Androctonus australis, pri čemu ti peptidi sadrže najmanje 20 aminokiselina, ponajprije najmanje 25, te 4 cisteinska ostatka koji među sobom tvore disulfidne mostove.
U prednosti je da androktonin u suštini sadrži peptidnu sekvenciju donje općenite formule (I):
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I)
u kojoj
Xaa predstavlja peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu,
Xab predstavlja peptidni ostatak od 5 aminokiselina,
Xac predstavlja peptidni ostatak od 5 aminokiselina,
Xad predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, a
Xae predstavlja peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu.
U prednosti Xab i/ili Xad i/ili Xae sadrže najmanje jednu bazičnu aminokiselinu, ponajprije 1. Prema izumu se izrazom bazična aminokiselina podrazumijeva aminokiselina odabrana između lizina, asparagina i homoasparagina.
Ponajprije,
Xaa predstavlja peptidnu sekvenciju Xaa’-Val, u kojoj
Xaa’ predstavlja NH2 ili peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu, i/ili
Xab predstavlja peptidnu sekvenciju -Arg-Xab’-Ile, u kojoj
Xab’ predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, i/ili
Xac predstavlja peptidnu sekvenciju -Arg-Xac’-Gly-, u kojoj
Xac’ predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, i/ili
Xad predstavlja peptidnu sekvenciju -Tyr-Xad’-Lys, u kojoj
Xad’ predstavlja peptidni ostatak od 1 aminokiseline, i/ili
Xae predstavlja peptidnu sekvenciju -Thr-Xae’, u kojoj
Xae’ predstavlja COOH ili peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu.
Ponajprije,
Xaa’ predstavlja peptidnu sekvenciju Arg-Ser-, i/ili
Xab’ predstavlja peptidnu sekvenciju -Gln-Ile-Lys-, i/ili
Xac’ predstavlja peptidnu sekvenciju -Arg-Arg-Gly-, i/ili
Xad’ predstavlja peptidni ostatak -Tyr-, i/ili
Xae’ predstavlja peptidnu sekvenciju -Asn-Arg-Pro-Tyr.
Prema najpovoljnijem obličju izuma, androktonin je predstavljen peptidnom sekvencijom od 25 aminokiselina, opisanom sekvencijskim identifikatorom br. 1 (SEQ ID No 1) i homolognim peptidnim sekvencijama.
Pod homolognom peptidnom sekvencijom podrazumijevaju se sve ekvivalentne sekvencije koje su barem 65% homologne sa sekvencijom predstavljenom sekvencijskim identifikatorom br. 1, pri čemu se podrazumijeva da 4 cisteinska ostatka i niz aminokiselina koje ih razdvajaju ostaju identični, dok se neke aminokiseline zamjenjuju drugačijima ali ekvivalentnima, na položajima koji ne induciraju bitne promjene glede protugljivične ili protubakterijske aktivnosti spomenute homologne sekvencije. Ponajprije homologne sekvencije sadrže barem 75% homolognosti, posebice barem 85% homolognosti, a prije svega 90% homolognosti.
NH2-terminalni ostatak androktonina može pokazati poslijetranslacijsku modifikaciju, primjerice acetiliranje, dok C-terminalni ostatak može pokazati poslijetranslacijsku modifikaciju, primjerice amidiranje.
Pod ekspresijskom peptidnom sekvencijom koja u biti sadrži peptidnu sekvenciju općenite formule (I) podrazumijevaju se ne samo gore navedene sekvencije, nego i sve one sekvencije koje sadrže na jednom ili drugom svom kraju, ili na oba kraja, peptidne ostatke, osobito one potrebne za njihovo izražavanje i ciljanje u organizama domaćina, ponajprije u biljnih stanica ili biljaka.
To se ponajprije odnosi na “peptid-androktonin” ili “androktonin-peptid”, ponajprije “peptid-androktonin”, cijepanje kojega u enzimskim sustavima biljnih stanica, dozvoljava dolje definirano oslobađanje androktonina. Peptid spojen s androktoninom može biti signalni peptid ili tranzitni peptid koji dopušta kontrolu i usmjeravanje proizvodnje androktonina na specifičan način u dijelu biljne stanice ili biljke, kao što je primjerice citoplazma ili stanična membrana, ili u slučaju biljaka u specifičnom tipu staničnih odjeljaka ili tkiva ili u izvanstaničnoj matrici.
Prema jednom obličju, tranzitni peptid može biti signal kloroplastnog ili mitohondrijskog adresiranja, koji se potom cijepa u kloroplastu ili mitohondriju.
Prema drugom obličju izuma, signalni peptid može biti N-terminalni signal ili “prepeptid”, opcijski povezan sa signalom odgovornim za zadržavanje proteina u endoplazmičkom retikulumu, ili peptid vakuolnog adresiranja ili “propeptid”. Endoplazmički retikulum je mjesto na kojemu “stanična strojarnica” preuzima operacije sazrijevanja proizvedenog proteina, kao na primjer cijepanje signalnog peptida.
Tranzitni peptidi mogu biti bilo jednostruki, bilo dvostruki, a u tome slučaju opcijski odvojeni intermedijernom sekvencijom, to jest onu koja sadrži u smjeru transkripcije sekvenciju šifriranu za tranzitni peptid biljnog gena koji je šifriran za plastidni lokalizacijski enzim, dio sekvencije zrelog N-terminalnog dijela biljnog gena šifriranog za plastidni lokalizacijski enzim, te sekvenciju šifriranu za drugi tranzitni peptid biljnoga gena koji je šifriran za plastidni lokalizacijski enzim, kako je opisano u patentnoj prijavi EP 0 508 909.
Kao tranzitni peptid koristan prema izumu može se navesti ponajprije signalni peptid duhanovoga PR-1α gena (WO 95/19443), predstavljen svojom šifriranom sekvencijom pomoću sekvencijskog identifikatora br. 2 (SEQ ID NO.2), a fuzioniran s androktoninom pomoću sekvencijskog identifikatora br. 3 (SEQ ID NO. 3), ponajprije u odgovarajući fuzijskom peptidu koji odgovara bazama 12 do 176 te sekvencije, a posebice kada je androktonin proizveden u biljnim stanicama ili biljkama, ili prekursor Mat α1 faktora kada je androktonin proizveden u kvascima.
Stoga se sadašnji izum odnosi u prvom redu na fragment nukleinske kiseline, ponajprije fragment DNA, šifriran za gore definiran androktonin. Prema izumu, to može biti fragment izoliran iz Androctonus australis, ili alternativno izvedeni fragment, prilagođen za ekspresiju androktonina u organizmu domaćinu u kojemu će peptid biti izražen. Fragment nukleinske kiseline može se dobiti prema standardnim metodama za izolaciju i čišćenje, ili alternativno sintezom prema uobičajenim tehnikama uzastopne hibridizacije sintetičkih oligonukleotida. Te tehnike opisali su ponajprije Ausubel et al.
Prema sadašnjem izumu izraz “fragment nukleinske kiseline” odnosi se na nukleotidnu sekvenciju koja može biti bilo DNA tipa ili RNA tipa, ponajprije DNA tipa, a prije svega cDNA, ponajprije dvolančanog tipa.
Prema obličju izuma, fragment nuleinske kiseline šifriran za androktonin je DNA sekvencija opisana sekvencijskim identifikatorom br. 1 (SEQ ID NO. 1), homologna sekvencija ili sekvencija komplementarna rečenoj sekvenciji, ponajprije šifrirajući dio toga SEQ ID NO.1, koji odgovara bazama 1 do 75.
Prema izumu, pod izrazom “homologno” podrazumijevaju se fragmenti nukleinskih kiselina koji uključuju jednu ili više modifikacija u usporedbi s nukleotidnom sekvencijom opisanom sekvencijskim identifikatorom br. 1 šifriranim za androktonin. Ove modifikacije mogu se dobiti uobičajenim tehnikama mutacije ili alternativno odabirom sintetičkih oligonukleotida uporabljenih u pripravi rečene sekvencije hibridizacijom. S obzirom na višestruke kombinacije nukleinskih kiselina koje mogu dovesti do ekspresije iste aminokiseline, razlike između referentne sekvencije opisane sekvencijskim identifikatorom br. 1 i homologne sekvencije mogu biti znatne, tim više ako se radi o fragmentu DNA čija je veličina manja od 100 nukleinskih kiselina, a koji se mogu pripraviti kemijskom sintezom. Ponajprije iznosi stupanj homolognosti barem 70% prema referentnoj sekvenciji, povoljnije barem 80%, a najpovoljnije barem 90%. Ove su modifikacije općenito neutralne, to jest one ne utječu na primarnu sekvenciju rezultirajućeg androktonina.
Sadašnji izum također se odnosi na kimerni gen (ili ekspresijsku kasetu) koji sadrži šifrirajuću sekvenciju i heterologne regulacijske elemente u položajima 5’ i 3’ koji mogu funkcionirati u organizmu domaćinu, ponajprije u biljnim stanicama ili biljkama, pri čemu su ti elementi funkcionalno spojeni s rečenom šifrirajućom sekvencijom, a šifrirajuća sekvencija sadrži najmanje jedan DNA fragment šifriran za androktonin kao što je gore definirano (uključujući fuzijski peptid “peptid-androktonin” ili androktonin-peptid”).
Podrazumijeva se da se izraz organizam domaćin odnosi na bilo koji jednostanični ili višestanični organizam nižeg reda ili višeg reda, u koji se može uvesti kimerni gen prema izumu, sa ciljem proizvodnje androktonina. Takvi organizmi su ponajprije E. coli, kvasci, prije svega kvasci roda Saccharomyces ili Kluyveromyces, Pichia, gljive, prije svega Aspergillus, bakulovirus ili ponajprije biljne stanice i biljke.
Pod “biljnom stanicom” podrazumijevaju se prema izumu sve stanice nastale iz jedne biljke koje mogu sačinjavati nediferencirana tkiva kao što su žuljevi, diferencirana tkiva kao što su zametci, dijelovi biljaka, biljke ili klice.
Pod “biljkom” se prema izumu podrazumijevaju svi diferencirani višestanični organizmi sposobni za provođenje fotosinteze, ponajprije monokotiledoni ili dikotiledoni, a posebice biljne kulture namijenjene hranjenju životinja ili ljudi, ili bez takve namjene, kao što su kukuruz, žito, repica, soja, riža, šećerna trska, šećerna repa, duhan, pamuk, itd.
Regulacijski elementi potrebni za izražavanje fragmenta DNA šifriranog za androktonin dobro su poznati stručnjaku kao funkcija organizma domaćina. Oni uključuju ponajprije promotorske sekvencije, transkripcijske aktivatore, tranzitne peptide i terminacijske sekvencije, te kodone start i stop. Sredstva i metode identifikacije i odabira regulacijskih elemenata dobro su poznati stručnjaku iz tog područja.
Za transformaciju mikroorganizama kao što su kvasci ili bakterije, regulacijski elementi dobro su poznati stručnjacima u tome području, te uključuju ponajprije promotorske sekvencije, transkripcijske aktivatore, tranzitne peptide, terminacijske sekvencije i kodone start i stop.
Sa ciljem usmjerenja ekspresije i sekrecije peptida u kvaščevoj uzgojnoj sredini, DNA fragment šifriran za heliomicin ugrađen je u prijenosni vektor koji sadrži sljedeće elemente:
• markere koji omogućuju odabir tranformanata,
• sekvenciju nukleinske kiseline koja omogućuje replikaciju (ishodište replikacije) plazmida u kvascu,
• sekvenciju nukleinske kiseline koja omogućuje replikaciju (ishodište replikacije) plazmida u E. coli,
• ekspresijsku kasetu koja se sastoji od
1. promotorske regulacijske sekvencije,
1. sekvencije šifrirane za signalni peptid (ili prepeptid) kombinirane s nekim adresirajućim peptidom (ili propeptidom),
1. poliadenilacijske ili terminatorske regulacijske sekvencije.
Ovi su elementi opisani u nekoliko publikacija, uključujući Reichhart et al., Invert. Reprod. Dev., 21 (1992) 15-24, te Michaut et al., FEBS Letters, 395 (1996) 6-10.
Ponajprije, kvasci specija S. cerevisiiae transformiraju se pomoću ekspresijskih plazmida metodom litijevog acetata (Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1993) 163-168).
Izum se odnosi posebice na transformaciju biljaka. Kao promotorsku regulacijsku sekvenciju u biljaka moguće je uporabiti bilo koju promotorsku sekvenciju gena koja je prirodno izražena u biljkama, ponajprije promotor bakterijskog, virusnog ili biljnog podrijetla, kao što je primjerice onaj gena za malu podjedinicu ribuloza biskarboksilaza/oksigenaza (RuBisCO), ili onaj biljnog virusnog gena kao što je primjerice onaj virusa mozaika cvjetače (CAMV 19S ili 35S), ili promotor koji može biti induciran patogenima kao što je duhanski PR-1α, pri čemu se mogu uporabiti svi poznati prikladni promotori. Ponajprije se rabi promotorska regulacijska sekvencija koja favorizira nadekspresiju šifrirane sekvencije na konstitutivan način ili induciranu napadajem patogenih, kao što je primjerice ona koja sadrži najmanje jedan histonski promotor kao što je opisano u patentnoj prijavi EP 0 507 698.
Prema izumu se također može primijeniti, zajedno sa promotorskom regulacijskom sekvencijom i druge regulacijske sekvencije, koje su smještene između promotorske i šifrirane sekvencije, kao što su transkripcijski aktivatori (“enhancers”), primjerice translacijski aktivator virusa mozaika duhana (TMV) opisan u patentnoj prijavi WO 87/07644, ili translacijski aktivator duhanovog virusa etch (TEV) koji su opisali Carrington & Freed.
Kao poliadenilacijska ili teminacijska regulacijska sekvencija može se primijeniti bilo koja odgovarajuća sekvencija bakterijskog podrijetla, kao primjerice terminator Agrobacterium tumefaciens, ili alternativno biljnog podrijetla kao primjerice histonski terminator opisan u patentnoj prijavi EP 0 633 317.
Prema sadašnjem izumu kimerni gen može se kombinirati i sa selekcijskim markerom adaptiranim u odnosu na transformirani organizam domaćina. Takvi selekcijski markeri dobro su poznati stručnjacima u tom području. Takvi markeri mogu biti antibiotički rezistencijski gen ili herbicidni tolerancijski gen za biljke.
Sadašnji izum također se odnosi na klonski ili ekspresijski vektor za transformaciju organizma domaćina koji sadrži najmanje jedan kimerni gen kao što je gore definirano. Osim gornjeg kimernoga gena, taj vektor sadrži najmanje jedno replikacijsko ishodište, te prema potrebi i prikladan selekcijski marker. Taj se vektor može sastojati od plazmida, kozmida, bakteriofaga ili virusa, koji su transformirani uvođenjem kimernoga gena prema izumu. Ovisno o organizmu domaćinu koji treba transformirati, takvi transformacijski vektori dobro su poznati stručnjacima u tome području i potanko su opisani u literaturi.
Za transformaciju biljnih stanica ili biljaka takav je vektor ponajprije virus koji se može primijeniti za transformaciju razvijenih biljaka, a koje sadrže i vlastite replikacijske i ekspresijske elemente. Ponajprije, vektor za transformaciju biljnih stanica ili biljaka prema izumu je plazmid.
Predmet izuma također je postupak transformacije organizma domaćina, ponajprije biljnih stanica, inkorporiranjem najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline ili jednog kimernog gena prema gornjoj definiciji, pri čemu je moguće postići tu transformaciju bilo kojim od poznatih prikladnih načina koji su dostatno opisani u specijaliziranoj literaturi, a posebice u navodima citiranim u sadašnjoj patentnoj prijavi, prije svega pomoću vektora prema izumu.
Niz metoda sastoji se u bombardiranju stanica, protoplasta ili tkiva česticama na koje su povezane sekvencije DNA. Drugi niz metoda sastoji se u primjeni kimernog gena umetnutog u Ti plazmid iz Agrobacterium tumefaciens ili Ri plazmid iz Agrobacterium rhizogenes kao transfernog sredstva u biljku.
Od ostalih se metoda mogu primijeniti mikroinjekcijska ili elektroporna metoda, ili alternativno izravno taloženje primjenom PEG.
Stručnjak u tom području odabrati će prikladnu metodu prema prirodi organizma domaćina, ponajprije biljne stanice ili biljke.
Predmet sadašnjeg izuma također je transformirani organizmi domaćini, ponajprije biljne stanice ili biljke, koji sadrže djelotvornu količinu kimernog gena koji uključuje sekvenciju šifriranu za gore definirani androktonin.
Također su predmet sadašnjeg izuma biljke koje sadrže transformirane stanice, ponajprije biljke regenerirane iz transformiranih stanica. Regeneracija se postiže bilo kojim prikladnim postupkom koji ovisi o prirodi vrste, kao što je opisano primjerice u gornjim navodima.
Za postupke transformacije biljnih stanica i regeneracije biljaka treba ponajprije citirati sljedeće patente i patentne prijave: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267 159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 i WO 95/06128.
Predmet sadašnjeg izuma također su transformirane biljke dobivene uzgojem i/ili križanjem regeneriranih biljaka, kao i sjeme transformiranih biljaka.
Tako transformirane biljke otporne su prema nekim bolestima, ponajprije nekim gljivičnim ili bakterijskim bolestima. Posljedično tome, sekvencija DNA šifrirana za androktonin može se umetnuti s glavnim sredstvom za proizvodnju biljaka otpornih na rečene bolesti, budući da je androktonin djelotvoran protiv gljivičnih bolesti kao što su one prouzročenih vrstama Cerospora, ponajprije Cerospora beticola, Cladosporium, ponajprije Cladosporium herbarum, Fusarium, ponajprije Fusarium culmorum ili Fusarium graminearum, ili Phytophtora, ponajprije Phytophtora cinnamoni.
Kimerni gen može se ponajprije kombinirati s najmanje jednim selekcijskim markerom, kao što je jedan ili više herbicidnih tolerancijskih gena.
Sekvencija DNA šifrirana za androktonin može se također umetnuti kao selekcijski marker za vrijeme transformacije biljaka drugim sekvencijama šifriranim za druge peptide ili proteine od interesa, kao što su primjerice herbicidni tolerancijski geni.
Takvi herbicidni tolerancijski geni dobro su poznati stručnjacima u tom području i ponajprije su opisani u patentnim prijavama EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ili WO 97/04103.
Naravno, stanice i biljke transformirane prema izumu mogu također sadržavati sekvenciju šifriranu za androktonin, druge heterologne sekvencije šifrirane za proteine od interesa kao što su drugi komplementarni peptidi sposobni za pružanje otpornosti biljkama prema drugim bolestima bakterijskog podrijetla ili gljivičnog podrijetla, i/ili druge sekvencije šifrirane za herbicidne tolerancijske proteine, ponajprije one definirane ranije, i/ili druge sekvencije šifrirane za insektne rezistencijske proteine, kao što je ponajprije protein Bt.
Druge sekvencije mogu se umetnuti pomoću istog vektora koji sadrži kimerni gen prema izumu, a koji sadrži sekvenciju šifriranu za androktonin i najmanje jedan drugi gen koji uključuje drugu sekvenciju šifriranu za neki drugi peptid ili protein od interesa.
One mogu također biti umetnute pomoću nekog drugog vektora koji sadrži najmanje jednu od rečenih drugih sekvencija, prema uobičajenim gore navedenim tehnikama.
Biljke prema izumu mogu također biti dobivene križanjem roditelja, pri čemu jedan od njih donosi gen prema izumu šifriran za androktonin, a drugi donosi gen šifriran za najmanje jedan drugi peptid ili protein od interesa.
Među sekvencijama šifriranim za druge protugljivične peptide može se spomenuti onu šifriranu za drosomicin, opisanu u patentnoj prijavi FR 2,725,992 i koju su opisali Fehlbaum et al. (1994), te u neobjavljenoj patentnoj prijavi FR 97/09115 zaprimljenoj 24. srpnja 1997.
Sadašnji izum odnosi se konačno na postupak uzgoja biljaka transformiranih prema izumu, postupak koji se sastoji od sijanja sjemena rečenih transformiranih biljaka u površinu uzgojnog okoliša, ponajprije polja prikladnog za uzgoj rečene biljke, primjene agrokemijskog pripravka na rečenu površinu, bez bitnog utjecaja na rečeno transformirano sjeme ili biljke, potom pobiranje kultiviranih biljaka koje su postigle željenu zrelost i opcijski odvajanje sjemena od pobranih biljaka.
Prema izumu, izrazom agrokemijski pripravci podrazumijevaju se svi agrokemijski pripravci koji sadrže najmanje jedan djelotvoran produkt koji posjeduje bilo herbicidnu, fungicidnu, baktericidnu, virucidnu ili insekticidnu aktivnost.
Prema načinu realizacije postupka uzgoja koji je u prednosti prema izumu, agrokemijski pripravak sadrži najmanje jedan djelotvoran produkt koji pokazuje najmanje fungicidnu i/ili baktericidnu aktivnost, te uz to ponajprije posjeduje aktivnost komplementarnu onoj androktonina proizvedenog u biljci transformiranoj prema izumu.
Prema izumu, kao ekspresijski produkt koji ima aktivnost komplementarnu onoj androktonina podrazumijeva se produkt koji posjeduje spektar komplemantarnih aktivnosti, što znači produkt koji će biti aktivan protiv napadaja kontaminanata neosjetljivih na androktonin (gljive, bakterije ili virusi), ili alternativno produkt čiji spektar aktivnosti potpuno ili djelomice prekriva onaj androktonina, te čija je aplikacijska doza znatno smanjena zbog prisutnosti androktonina proizvedenog u transformiranoj biljci.
Konačno, uzgoj transformiranih organizama domaćina omogućuje široku ljestvicu proizvodnje androktonina. Predmet sadašnjeg izuma je stoga također postupak priprave androktonina, koji uključuje korake uzgoja transformiranih organizama domaćina koji sadrže gen šifriran za androktonin prema gornjoj definiciji u prikladnom uzgojnom okruženju, te potom ekstrakciju i potpuno ili djelomično čišćenje dobivenog androktonina.
Primjerima navedeni dalje omogućena je ilustracija izuma, priprave sekvencije šifrirane za androktonin, kimernog gena, integracijskog vektora i transformiranih biljaka. Priložene slike 1 do 5 ocrtavaju shematske strukture nekih plazmida pripravljenih za konstrukciju kimernih gena. U tim slikama su različiti restrikcijski položaji označeni kurzivom.
Primjer 1
Konstrukcija kimernih gena
Sve dalje primijenjene tehnike standardne su laboratorijske tehnike. Detaljni postupci tih tehnika posebice su opisali Ausubel et al.
pRPA-MD-P: Priprava plazmida koji sadrži signalni peptid za duhanov PR-1α gen.
Dva komplementarna sintetička oligonukleotida Oligo 1 i Oligo 2 navedena dalje, hibridzirana su pri 65 °C kroz 5 minuta, a potom uz polagano sniženje temperature na 30 °C kroz 30 minuta.
[image]
Nakon hibridizacije između Oligo 1 i Oligo 2, preostala jednolančana DNA služi kao matrica za klenow fragment iz E. coli polimeraze 1 (pod standardnim uvjetima preporučenima od proizvođača (New England Biolabs)) za pripravu dvolančanog oligonukleotida počevši od 3’ kraja svakog oligo. Dobiveni dvolančani oligonukleotid potom je digeriran s restrikcijskim encimima SacII i NaeI i kloniran u plazmid pBS II SK(-) (Stratagene) digeriran s istim restrikcijskim encimima. Dobiven je time klon koji je sadržavao regiju šifriranu za signalni peptid duhanovog PR-1α gena (SEQ ID NO. 2).
pRPA-PS-PR1a-andro: Priprava sekvencije šifrirane za androktonin spojen na PR-1α signalni peptid bez netranskribiranog 3’ područja.
Dva komplementarna sintetička oligonukleotida Oligo 3 i Oligo 4 hibridzirana su prema radnim uvjetima navedenima za pRPA-MD-P.
[image]
Nakon hibridizacije između Oligo 3 i Oligo 4, preostala jednolančana DNA služi kao matrica za klenow fragment iz E. coli polimeraze 1 (pod standardnim uvjetima preporučenima od proizvođača (New England Biolabs)) za pripravu dvolančanog oligonukleotida počevši od 3’ kraja svakog oligo. Dobiveni dvolančani oligonukleotid koji sadrži dio šifriran za androktonin (SEQ ID NO. 1) potom je kloniran izravno u plazmid pRPA-MD-P, koji je digeriran s restrikcijskim enzimom NaeI. Pravilna orijentacija dobivenog klona provjerena je sekvenciranjem. Dobiven je time klon koji je sadržavao regiju šifriranu za fuzijski protein PR-1α-androktonin, smještenu između restrikcijskog položaja na N-terminalnom kraju te restrikcijskim položajima ScaI, ScaII i BamHI C-terminalnog kraja (SEQ ID NO. 3).
pRPA-RD-238: Priprava ekspresijskog vektora u biljaka koji sadrži sekvenciju šifriranu za fuzijski protein PR-1α androktonin.
Plazmid pRTL-2 GUS izveden iz plazmida pUC-19 dobiven je od Dr. Jim Carringtona (Texas A&M University, neopisan). Taj plazmid čija je shematska struktura prikazana na slici 3, sadrži dvostruki promotor CaMV 35S izoliran iz virusa mozaika cvjetače (promotor CaMV 2x35S; Odell et al., 1985) koji usmjerava ekspresiju RNA, koja sadrži netranslatiranu sekvenciju na 5’ duhanovog virusa etch (TEV 5’ UTR; Carrington i Freed, 1990), β-glukuronidazni gen iz E. coli (GUS; Jefferson et al., 1987), potom CaMV RNA 35S poliadenilacijski položaj (CaMV polyA; Odell et al., 1985).
Plazmid pRTL-2 GUS digeriran je s restrikcijskim enzimima NcoI i BamHI i glavni fragment DNA je očišćen. Plazmid pRPA-PS-Pr1a-andro digeriran je s restrikcijskim enzimima NcoI i BamHI i mali fragment DNA koji je sadržavao regiju šifriranu za fuzijski protein PR-1a-androktonin također je očišćen. Dva očišćena fragmenta DNA potom su zajedno spojena u ekspresijskoj kaseti u biljkama koje sintetiziraju fuzijski protein PR-1a-androktonin. Shematska struktura tih ekspresijskih kaseta prikazana je na Slici 2. “PR-1a-androktonin” predstavlja područje šifrirano za fuzijski protein PR-1a-androktonin iz pRPA-RD-230. Androktonin je transportiran u ekstracelularnu matricu biljke djelovanjem peptidnog signala PR-1a.
pRPA-RD-195: Priprava plazmida koji sadrži modificiran višestruki položaj kloniranja.
Plazmid pRPA-RD-195 je plazmid deriviran iz pUC-19 koji sadrži modificiran višestruki položaj kloniranja. Komplementarni sintetički oligonukleotidi Oligo 5 i Oligo 6 prikazani dolje, hibridizirani su i imaju dvostruki lanac prema postupku opisanom za pRPA-MD-P.
[image]
Dobiveni dvolančani oligonukleotid potom je umetnut u pUC-19 koji je prethodno digeriran s restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII i otupljen na vrhovima primjenom fragmenta klenow DNA polimeraze 1 iz E. coli. Dobiven je vektor koji je sadržavao višestruke klonske položaje za omogućavanje uvođenja ekspresijskih kaseta u plazmidni vektor iz Agrobacterium tumefaciens. Shematska struktura višestrukog klonskog položaja prikazana je na slici 3.
pRPA-RD-233: Uvođenje ekspresijske kasete PR-1a-androktonina iz pRPA-RD-230 u pRPA-RD-195.
Plazmid pRPA-RD-230 digeriran je s restrikcijskim enzimom HindIII. Fragment DNA koji je sadržavao ekspresijsku kasetu PR-1a-androktonina očišćen je. Očišćeni fragment potom je umetnut u pRPA-RD-195 koji je prethodno digeriran s restrikcijskim enzimom HindIII i defosforiliziran s telećom intestinalnom fosfatazom.
pRPA-RD-174: Plazmid izveden iz pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) koji je sadržavao tolerancijski gen na bromoksinil iz pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Tolerancijski gen na bromoksinil izoliran je iz pRPA-BL-237 pomoću PCR genske amplifikacije. Dobiveni fragment ima tupe vrške i kloniran je u položaju EcoRI iz pRPA-BL-150A koji je dobio tupe vrške djelovanjem polimeraze klenow pod standardnim uvjetima. Dobiven je vektor Agrobacterium tumefaciens koji je sadržavao tolerancijski gen na bromoksinil u blizini svojega desnog kraja, tolerancijski gen na kanamicin u blizini svojeg lijevog kraja i višestruki klonski položaj između ta dva gena.
Shematska struktura pRPA-RD-174 predstavljena je na slici 4. Na toj slici “nos” predstavlja poliadenilacijski položaj nopalin sintaze iz Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), “NOS pro” predstavlja promotor nopalin sintaze iz Agrobacterium tumefaciens, “NPT II” predstavlja neomicin fosfotransferazni gen transposona Tn5 iz E. coli (Rothstein et al., 1981), “35S pro” predstavlja promotor 35S izoliran iz virusa mozaika cvjetače (Odell et al., 1985), “BRX” predstavlja nitrilazni gen izoliran iz K. ozaenae (Stalker et al., 1988), “RB” i “LB” predstavljaju desni, odnosno lijevi kraj sekvencije Ti plazmida iz Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Dodatak novog, jedinstvenog restrikcijskog položaja u pRPA-RD-174.
Komplementarni sintetički dolje prikazani oligonukleotidi Oligo 7 i Oligo 8 hibridizirani su i pripravljen im je dvostruki lanac prema postupku opisanom za pRPA-RD-183.
[image]
Hibridizirani dvolančani oligonukleotidi (96 parova baza) očišćen je nakon separacije na agarnom gelu (3 % Nusieve, FMC). Plazmid pRPA-RD-174 digeriran je s restrikcijskim enzimom XmaI i glavni fragment DNA je očišćen. Dva dobivena fragmenta DNA potom su međusobno spojena.
Dobiven je plazmid izveden iz pRPA-RD-174 koji je sadržavao druge restrikcijske položaje između tolerancijskog gena za bromoksinil i selekcijskog markera kanamicin gena.
Shematska struktura plazmida pRPA-RD-184 prikazana je na slici 5, u kojoj izrazi “nos”, “NPT II”, “NOS pro”, “35S pro”, “BRX gen”, “RB” i “LB” imaju isto značenje kao i na slici 4.
pRPA-RD-236: Priprava vektora Agrobacterium tumefaciens koji sadrži gensku konstrukciju šifriranu za androktonin usmjeren prema ekstracelularnoj matrici.
Plazmid pRPA-RD-233 digeriran je s restrikcijskim enzimima PmeI i AscI, a DNA fragment koji sadrži gen PR-1a-androktonin je očišćen. Plazmid pRPA-RD-184 digeriran je s istim restrikcijskim enzimima. DNA fragment koji sadrži PR-1a-androktonin ekspresijsku kasetu potom je umetnut u pRPA-RD-184. Tako je dobiven vektor iz Agrobacterium tumefaciens koji je sadržavao sekvenciju šifriranu za fuzijski protein PR-1a-androktonin koji je doveo do ekspresije androktonina u ekstracelularnoj biljnoj matrici.
Primjer 2
Tolerancija na herbicide u transformiranih biljaka duhana
2.1 - Transformacija
Vektor pRPA-RD-236 uveden je u lanac Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al., 1987) koji je u sebi nosio kozmid pTVK291 (Komari et al., 1986). Tehnika transformacije temeljena je na postupku koji su opisali Horsh et al. (1985).
2.2 - Regeneracija
Regeneracija duhanskih biljaka PBD6 (podrijetlo SEITA Francuska) počevši od folijarnih eksplanata provedena je u bazičnoj sredini Murashige-Skoog (MS) uključujući 30 g/l sukroze i 200 μg/ml kanamicina. Folijarni eksplanti su unaprijed uzeti s kultiviranih biljaka u stakleniku ili in vitro i regenerirani tehnikom folijarnih diskova (Horsh et al., 1985) u tri uzastopna koraka: prvi korak uključuje indukciju mladica u sredinu u koju je dodano 30 g/l saharoze koja sadrži 0.05 mg/l naftiloctene kiseline (NAA) i 2 mg/l benzilaminopurina (BAP) kroz 2 tjedna. Mladice formirane tijekom tog koraka potom su uzgajane kroz 10 dana kultiviranjem u sredini MS kojoj je dodano 30 g/l saharoze ali bez hormona. Potom, razvijene mladice izvađene su i kultivirane u sredini MS za ukorjenjivanje sa polovicom sadržaja soli, vitamina i šećera, a bez sadržaja hormona. Nakon približno 2 tjedna ukorijenjene mladice su premještene u staklenik.
2.3 - Tolerancija na bromoksinil
Dvadeset transformiranih biljaka regenerirano je i stavljeno u staklenik, s ciljem konstrukcije pRPA-RD-236. Te su biljke u stakleniku obrađene vodenom suspenzijom po Pardner-u koja odgovara 0.2 kg bromoksinilne aktivne tvari po hektaru do stadija od 5 listova.
Sve biljke koje su pokazale potpunu toleranciju prema bromoksinilu potom su uporabljene za različite pokuse koji pokazuju da ekspresija androktonina u transformiranih biljaka rezultira njihovom otpornošću prema gljivičnom napadaju.
LITERATURNI IZVORI
Ausubel, F.A. et al. (eds. Greene), Current Protocol in Molecular Biology, Publ. Wiley & Sons.
Bevan, M. et al., Nuc. Acids Res. 11 (1983) 369-385.
Carington and Freed, J. Virol. 64 (1990) 1590-1597.
Ehret-Sabatier et al., The Journal of Biological Chemistry, 271, 47 (1996) 29537-29544.
Horsch et al., Science 227 (1985) 1229-1231.
Jefferson et al., EMBO J. 6 (1987) 3901-3907.
Komari et al., J. Bacteriol. 166 (1986) 88-94.
Rothstein et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45 (1981) 99-105.
Stalker et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6310-6314.
Odell, J.T. et al., Nature 313 (1985) 810-812.
POPIS SEKVENCIJA
(1) OPĆENITE INFORMACIJE:
(i) PRIJAVITELJ:
(A) NAZIV: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) ULICA: 14/20 Rue Pierre BAIZET
(C) GRAD: Lyon
(E) DRŽAVA: Francuska
(F) POŠTANSKI BROJ: 69009
(ii) NASLOV IZUMA: Gen šifriran za androktonin, vektor koji ga sadrži, te dobivene transformirane biljke otporne na bolesti
(iii) BROJ SEKVENCIJA: 11
(iv) RAČUNALNI OBLIK:
(A) TIP PODRŠKE: Floppy disk
(B) NARUČITELJ: IBM PC compatible
(C) PRIMIJENJENI SUSTAV: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGIČKA PODRŠKA: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO 1:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 110 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: dvostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: DNA
(ix) DODATNE ZNAČAJKE:
(A) NAZIV/KLJUČ: CDS
(B) POLOŽAJ: 1..75
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 1:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO 2:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 106 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: dvostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: DNA
(ix) DODATNE ZNAČAJKE:
(A) NAZIV/KLJUČ: CDS
(B) POLOŽAJ: 12..101
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 2:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 3:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 211 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: dvostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: DNA
(ix) DODATNE ZNAČAJKE:
(A) NAZIV/KLJUČ: CDS
(B) POLOŽAJ: 12..176
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 3:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 4:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 75 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 1”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 4:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 5:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 72 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 2”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 5:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 6:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 44 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 3”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 6:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 7:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 97 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 4”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 7:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 8:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 85 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 5”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 8:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 9:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 66 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 6”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 9:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 10:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 93 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 7”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 10:
[image]
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO. 11:
(i) ZNAČAJKE SEKVENCIJE:
(A) DULJINA: 93 parova baza
(B) TIP: nukleotid
(C) LANČANOST: jednostruka
(D) TOPOLOGIJA: linearna
(ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kiselina
(A) OPIS: /opis = “sintetički oligonukleotid 8”
(xi) OPIS SEKVENCIJE: SEQ ID NO. 11:
[image]
Claims (39)
1. Fragment nukleinske kiseline, naznačen time, da sadrži sekvenciju nukleinske kiseline šifriranu za androktonin.
2. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 1, naznačen time, da je to sekvencija DNA.
3. Fragment nukleinske kiseline prema bilo kojemu od zahtjeva 1 ili 2, naznačen time, da se androktonin sastoji od peptida koji mogu proizvesti škorpioni ili se iz njih može izolirati, a ponajprije iz vrste Androctonus australis, pri čemu ti peptidi sadrže najmanje 20 aminokiselina, ponajprije najmanje 25 aminokiselina, te 4 cisteinska ostatka koji među sobom tvore disulfidne mostove.
4. Fragment nukleinske kiseline prema bilo kojemu od zahtjeva 1 do 3, naznačen time, da se androktonin u suštini sastoji od peptidne sekvencije općenite formule (I)
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I)
u kojoj
Xaa predstavlja peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu,
Xab predstavlja peptidni ostatak od 5 aminokiselina,
Xac predstavlja peptidni ostatak od 5 aminokiselina,
Xad predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, a
Xae predstavlja peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu.
5. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 4, naznačen time, da Xab i/ili Xad i/ili Xae sadrže najmanje jednu bazičnu aminokiselinu.
6. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 5, naznačen time, da se bazične aminokiseline odabiru između lizina, asparagina i homoasparagina.
7. Fragment nukleinske kiseline prema bilo kojemu od zahtjeva 4 do 6, naznačen time, da
Xaa predstavlja peptidnu sekvenciju Xaa’-Val, u kojoj
Xaa’ predstavlja NH2 ili peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu, i/ili
Xab predstavlja peptidnu sekvenciju -Arg-Xab’-Ile, u kojoj
Xab’ predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, i/ili
Xac predstavlja peptidnu sekvenciju -Arg-Xac’-Gly-, u kojoj
Xac’ predstavlja peptidni ostatak od 3 aminokiseline, i/ili
Xad predstavlja peptidnu sekvenciju -Tyr-Xad’-Lys, u kojoj
Xad’ predstavlja peptidni ostatak od 1 aminokiseline, i/ili
Xae predstavlja peptidnu sekvenciju -Thr-Xae’, u kojoj
Xae’ predstavlja COOH ili peptidni ostatak koji sadrži najmanje 1 aminokiselinu.
8. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 7, naznačen time, da
Xaa’ predstavlja peptidnu sekvenciju Arg-Ser-, i/ili
Xab’ predstavlja peptidnu sekvenciju -Gln-Ile-Lys-, i/ili
Xac’ predstavlja prptidnu sekvenciju -Arg-Arg-Gly-, i/ili
Xad’ predstavlja peptidni ostatak -Tyr-, i/ili
Xae’ predstavlja peptidnu sekvenciju -Asn-Arg-Pro-Tyr.
9. Fragment nukleinske kiseline prema jednom od zahtjeva 1 do 8, naznačen time, da je androktonin predstavljen peptidnom sekvencijom od 25 aminokiselina opisanih sekvencijskim identifikatorom br. 1 (SEQ ID NO. 1) i homolognim peptidnim sekvencijama.
10. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 9, naznačen time, da je predstavljen sekvencijskim identifikatorom br. 1 (SEQ ID NO. 1), homolognom sekvencijom ili sekvencijom komplementarnom rečenoj sekvenciji, te posebice šifriranim dijelom tog SEQ ID NO. 1 koji odgovara bazama 1 do 75.
11. Fragment nukleinske kiseline, naznačen time, da sadrži sekvecniju nukleinske kiseline šifriranu za fuzijski peptid “peptid-androktonin” ili “androktonin-peptid”, ponajprije “peptid-androktonin”, pri čemu je androktonin definiran prema jednom od zahtjeva 1 do 9.
12. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 11, naznačen time, da je peptid fuzioniran s androktoninom signalni peptid ili tranzitni peptid.
13. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 12, naznačen time, da je tranzitni peptid kloroplastni adresirajući signal ili mitohondrijski adresirajući signal.
14. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 12, naznačen time, da je signalni peptid neki N-terminalni signal ili “prepeptid”, opcijski u kombinaciji sa signalom odgovornim za zadržavanje proteina u endoplazmičkom retikulumu, ili vakuolni adresirajući peptid ili “propeptid”.
15. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 14, naznačen time, da signalni peptid predstavlja signalni peptid duhanovog PR-1α gena.
16. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 15, naznačen time, da je fuzijski peptid “peptid-androktonin” predstavljen sekvencijskim identifikatorom br. 3 (SEQ ID NO. 3).
17. Fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 16, naznačen time, da je predstavljen sekvencijskim identifikatorom br. 3 (SEQ ID NO. 3), homolognom sekvencijom ili komplementarnom sekvencijom, te posebice šifriranim dijelom tog SEQ ID NO. 3 koji odgovara bazama 12 do 176 te sekvencije.
18. Fuzijski peptid “peptid-androktonin” ili “androktonin-peptid”, ponajprije “peptid-androktonin”, naznačen time, da je definiran prema jednom od zahtjeva 11 do 16.
19. Kimerni gen koji sadrži šifriranu sekvenciju i heterolognne regulacijske elemente u položajima 5’ i 3’ koji mogu funkcionirati u organizmu domaćinu, ponajprije biljnim stanicama ili biljkama, pri čemu su ti elementi funkcionalno spojeni na rečenu šifriranu sekvenciju, naznačen time, da rečena šifrirana sekvencija sadrži najmanje jedan DNA fragment šifriran za androktonin, definiran prema zahtjevima 1 do 17.
20. Kimerni gen prema zahtjevu 19, naznačen time, da se organizam domaćin odabere između bakterija, primjerice E. coli, kvasaca, ponajprije kvasaca roda Saccharomyces ili Kluyveromyces, Pichia, gljivica, ponajprije Aspergillus, bakulovirusa, te biljnih stanica i biljaka.
21. Kimerni gen prema bilo kojemu od zahtjeva 19 i 20, naznačen time, da je kombiniran sa selekcijskim markerom, prilagođenim transformiranom organizmu domaćinu.
22. Klonski ili ekspresijski vektor za transformaciju organizma domaćina, naznačen time, da sadrži najmanje jedan kimerni gen definiran prema zahtjevima 19 do 21.
23. Postupak transformacije organizama domaćina, ponajprije biljnih stanica, naznačen time, da se odvija inkorporiranjem najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline ili jednog kimernog gena kao što je definirano zahtjevima 19 do 21.
24. Postupak prema zahtjevu 23, naznačen time, da se kimerni gen inkorporira pomoću vektora prema zahtjevu 22.
25. Postupak prema bilo kojemu od zahtjeva 23 ili 24, naznačen time, da se organizam domaćin odabere između bakterija, primjerice E. coli, kvasaca, ponajprije kvasaca roda Saccharomyces ili Kluyveromyces, Pichia, gljivica, ponajprije Aspergillus, bakulovirusa, te biljnih stanica i biljaka.
26. Postupak prema zahtjevu 25, naznačen time, da je organizam domaćin biljna stanica.
27. Postupak prema zahtjevu 26, naznačen time, da je biljka regenerirana iz transformiranih biljnih stanica.
28. Transformirani organizam domaćin, ponajprije biljna stanica ili biljka, naznačen time, da sadrži kimerni gen definiran prema nekom od zahtjeva 19 do 21.
29. Organizam domaćin prema zahtjevu 28, naznačen time, da se odabere između bakterija, primjerice E. coli, kvasaca, ponajprije kvasaca roda Saccharomyces ili Kluyveromyces, Pichia, gljivica, ponajprije Aspergillus, bakulovirusa, te biljnih stanica i biljaka.
30. Biljke, naznačene time, da sadrže transformirane biljne stanice prema zahtjevu 29.
31. Biljka prema zahtjevu 30, naznačena time, da se regenerira iz transformiranih biljnih stanica.
32. Biljka, naznačena time, da se dobije uzgojem i/ili križanjem regeneriranih biljaka prema zahtjevu 31.
33. Biljka prema nekom od zahtjeva 30 do 32, naznačena time, da je odabrana između kukuruza, žita, repice, soje, riže, šećerne trske, šećerne repe, duhana i pamuka.
34. Biljka prema nekom od zahtjeva 30 do 33, naznačena time, da je otporna na gljivične bolesti kao što su one prouzročene vrstama Cerospora, ponajprije Cerospora beticola, Cladosporium, ponajprije Cladosporium herbarum, Fusarium, ponajprije Fusarium culmorum ili Fusarium graminearum, ili Phytophtora, ponajprije Phytophtora cinnamoni.
35. Biljno sjeme, naznačeno time, da je prema nekom od zahtjeva 30 do 34.
36. Postupak uzgoja transformiranih biljaka prema nekom od zahtjeva 30 do 34, ili dobivenih postupkom prema zahtjevu 27, naznačen time, da se sastoji od sijanja sjemena rečenih transformiranih biljaka u površinu uzgojnog okoliša, ponajprije polja prikladnog za uzgoj rečenih biljaka, od primjene agrokemijskog pripravka na rečenu površinu, bez suštinskog utjecaja na rečeno transformirano sjeme ili biljke, potom od pobiranja uzgojenih biljaka koje su postigle željeni stupanj zrelosti, te opcijski od odvajanja sjemena od pobranih biljaka.
37. Postupak uzgoja prema zahtjevu 36, naznačen time, da agrokemijski pripravak sadrži najmanje jedan aktivni produkt koji posjeduje barem fungicidnu i/ili baktericidnu aktivnost.
38. Postupak prema zahtjevu 37, naznačen time, da aktivni produkt posjeduje aktivnost komplementarnu onoj androktonina proizvedenog u transformiranim biljkama.
39. Postupak priprave androktonina definiranog prema nekom od zahtjeva 1 do 18, naznačen time, da uključuje korake uzgoja transformiranog organizma domaćina definiranog prema bilo kojemu od zahtjeva 28 ili 29 u prikladnom uzgojnom okolišu, potom ekstrakcije, i potpunog ili djelomičnog čišćenja dobivenog androktonina.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9710632A FR2767537B1 (fr) | 1997-08-20 | 1997-08-20 | Gene codant pour l'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP980455A2 true HRP980455A2 (en) | 1999-04-30 |
Family
ID=9510484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR9710632A HRP980455A2 (en) | 1997-08-20 | 1998-08-19 | Gene coding for androctonine, vector containing it and disease-resistant transformed plants obtained |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1007711A1 (hr) |
| JP (1) | JP2001514898A (hr) |
| AR (1) | AR016839A1 (hr) |
| AU (1) | AU751263B2 (hr) |
| CA (1) | CA2301978A1 (hr) |
| CO (1) | CO4790113A1 (hr) |
| FR (1) | FR2767537B1 (hr) |
| HR (1) | HRP980455A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0003585A3 (hr) |
| IL (1) | IL134609A0 (hr) |
| NZ (1) | NZ502951A (hr) |
| PL (1) | PL338859A1 (hr) |
| WO (1) | WO1999009189A1 (hr) |
| ZA (1) | ZA987450B (hr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7414173B1 (en) | 2002-07-12 | 2008-08-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Isolated nucleic acid molecules encoding orally active androctonus amoreuxi pesticidal biopeptides |
| AR080105A1 (es) | 2010-02-02 | 2012-03-14 | Bayer Cropscience Ag | Transformacion de soja usando inhibidores de hidrofenil piruvato dioxigenasa (hppd) como agentes de seleccion |
| PL236444B1 (pl) * | 2017-12-04 | 2021-01-11 | Politechnika Slaska Im Wincent | Sposób otrzymywania degradowalnych hydrożeli na bazie pochodnych trehalozy i zastosowanie hydrożeli |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
| ES2199931T3 (es) * | 1989-03-24 | 2004-03-01 | Syngenta Participations Ag | Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. |
| FR2673643B1 (fr) * | 1991-03-05 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide. |
| GB9321469D0 (en) * | 1993-10-18 | 1993-12-08 | Zeneca Ltd | Insecticidal proteins |
| FR2745004B1 (fr) * | 1996-02-16 | 1998-03-27 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide antibacterien et antifongique |
-
1997
- 1997-08-20 FR FR9710632A patent/FR2767537B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-08-18 ZA ZA987450A patent/ZA987450B/xx unknown
- 1998-08-18 PL PL98338859A patent/PL338859A1/xx unknown
- 1998-08-18 HU HU0003585A patent/HUP0003585A3/hu unknown
- 1998-08-18 WO PCT/FR1998/001814 patent/WO1999009189A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1998-08-18 EP EP98942749A patent/EP1007711A1/fr not_active Withdrawn
- 1998-08-18 AU AU90766/98A patent/AU751263B2/en not_active Ceased
- 1998-08-18 JP JP2000509852A patent/JP2001514898A/ja active Pending
- 1998-08-18 CA CA002301978A patent/CA2301978A1/fr not_active Abandoned
- 1998-08-18 NZ NZ502951A patent/NZ502951A/en unknown
- 1998-08-18 IL IL13460998A patent/IL134609A0/xx unknown
- 1998-08-19 HR HR9710632A patent/HRP980455A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1998-08-20 CO CO98047698A patent/CO4790113A1/es unknown
- 1998-08-20 AR ARP980104113A patent/AR016839A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ502951A (en) | 2001-11-30 |
| PL338859A1 (en) | 2000-11-20 |
| FR2767537B1 (fr) | 2001-07-13 |
| AR016839A1 (es) | 2001-08-01 |
| CA2301978A1 (fr) | 1999-02-25 |
| HUP0003585A3 (en) | 2002-10-28 |
| WO1999009189A1 (fr) | 1999-02-25 |
| CO4790113A1 (es) | 1999-05-31 |
| HUP0003585A2 (hu) | 2001-02-28 |
| AU9076698A (en) | 1999-03-08 |
| ZA987450B (en) | 1999-02-22 |
| JP2001514898A (ja) | 2001-09-18 |
| IL134609A0 (en) | 2001-04-30 |
| FR2767537A1 (fr) | 1999-02-26 |
| EP1007711A1 (fr) | 2000-06-14 |
| AU751263B2 (en) | 2002-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021258028A1 (en) | Copi coatomer alpha subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests | |
| US8212110B2 (en) | Use of bacteriophage outer membrane breaching proteins expressed in plants for the control of gram-negative bacteria | |
| KR20170068467A (ko) | 딱정벌레류 및 노린재류 해충에 대한 저항성을 부여하는 copi 코토머 델타 서브유닛 핵산 분자 | |
| KR20170066404A (ko) | 딱정벌레류 및 노린재류 해충에 대한 저항성을 부여하는 copi 코토머 베타 서브유닛 핵산 분자 | |
| KR20160093727A (ko) | 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에 대한 저항성을 부여하는 ras 오포지트 (rop) 및 관련 핵산 분자 | |
| WO2009012481A1 (en) | Use of bacteriophage outer membrane breaching proteins expressed in plants for the control of gram-negative bacteria | |
| Bundó et al. | Rice seeds as biofactories of rationally designed and cell-penetrating antifungal PAF peptides | |
| AU739137B2 (en) | Chimeric gene encoding drosomycin, vector containing it and production of disease-resistant transgenic plants | |
| AU758749B2 (en) | Gene coding for thanatin, vector containing same and resulting transformed disease-resistant plants | |
| CA2166309A1 (en) | Antimicrobial proteins | |
| HRP980455A2 (en) | Gene coding for androctonine, vector containing it and disease-resistant transformed plants obtained | |
| US7919601B2 (en) | Identification and use of genes encoding holins and holin-like proteins in plants for the control of microbes and pests | |
| WO2018136962A1 (en) | Compositions and methods for protecting hosts against pathogen infections | |
| CA2391128C (en) | A method of making transgenic plants expressing a cecropin-mellitin hybrid cationic peptide imparting broad-spectrum pathogen resistance | |
| CA2365099C (en) | Transgenic plants that are resistant to a broad spectrum of pathogens | |
| US7041815B2 (en) | Sporamin promoter and uses thereof | |
| AU4892702A (en) | Gene coding for androctonine vector containing same and transformed disease-resistant plants obtained | |
| CZ2000601A3 (cs) | Gen kódující androctonin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám | |
| US8653332B2 (en) | Extracellular plant ferredoxin-like protein and uses thereof | |
| CZ20001683A3 (cs) | Gen kódující thanatin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám | |
| CA2986910A1 (en) | Spt5 nucleic acid molecules to control insect pests | |
| CZ200067A3 (cs) | Chimérický gen kódující drosomicin, vektor obsahující tento gen a způsob přípravy transgenních rostlin rezistentních k chorobám | |
| Siti Nur Akmar | Over-expression of two putative disease resistant genes NBS-type rgc and wrky against Fusarium oxysporum f. sp. cubense in plants/Siti Nur Akmar Mazlin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODBI | Application refused |