PT96999B - Processo para a preparacao de composicoes eficazes que compreendem peptideos liticos e enzimas hidroliticos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 96.99 9

REQUERENTE: CIBA-GEIGY AG., suiça, industrial,

Klybeckstrasse 141, CH-4002 Basel, :Suiça

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES

EFICAZES QUE COMPREENDEM PEPTIDEOS LITICOS E ENZIMAS HIDROLITICOS

INVENTORES: John A.Ryals, Philippe Bernard Gay, Patricia

A. Ahl Goy e Francisco Garcia-Olmedo

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte, 12 de Março 1990 No.49 1 ,801

INPI. MOQ 113 RF 18732 ί

/·

CIBA-GEIGY AG

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES EFICAZES QUE COMPREENDEM PEPTfDEOS LiTICOS E ENZIMAS HIDROLíTICOS

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo de preparação de composições anti-patogénicas eficazes que contêm uma combinação de enzimas hidrolíticos e peptídeos liticos como agente activo. É essencialmente caracterizado por se misturar uma quantidade anti-patogénica eficaz de um ingrediente activo numa percentagem de 0, 1 a. 99%, de preferência de , 1 a. 95%, em conjunto com um ou mais veículos aceitáveis na agricultura numa percentagem de .1. a 99,9%, de preferência de 1 a 99% de um adjuvante sólido ou liquido e de desde cerca de 0 a 25% de preferência 0,1 a 25% de um surfactante. SSo também referidos; métodos de controlo do crescimento de patogénios usando as composições anti-patogéni-

presente invento relaciona-se com composições para o controle de patogénios de plantas através do eroprego como ingrediente activo de uma combinação de peptídeos li ticos e de enzimas hidrolíticos. Mais particularmente, este invento relaciona-se com composições anti-patogénicas em que pequenas quantidades de chitinase e/ou β-1,3-glucanse são usados para o aumento da eficácia dos peptn pep t í deo < s) 1 £ t i c o <

deos 1i t i c os ao facilitarem o acesso dois) da célula do patogénio. 0 membrana presente invento ainda se relaciona com plantas transgénicas que são capazes de produzirem peptídeos líticos e enzimas hidrol£ ticos assim como com métodos para o controle dos referidos patogénios das plantas.

É do conhecimento geral que alguns peptídeos líticos são activos contra uma larga gama de organismos enquanto, que produzem pouco ou nenhum efeito. é também conhecido que um alvo dos peptídeos líticos é a membrana. Sequências de amino-é.c idos para vários peptídeos líticos com actividade antimicrobiana estão desc r i to;

em WO 89/04371. Enzimas hidrolíticos, como chitinase β-1,3-glucanase, são conhecidos como inibidores do crescimento de fungos <Schlumbaum et al., 1986; Mauch et al., 1988; e Burri, 1989). è também do conhecimento geral que a chitinase e a -glucanase são fortemente induzidos em feijões através do mento com etilene aqueles enzimas podem ser β-l,3tratapurif iet al .

S HU· neutrocados muito facilmente <Boller et al., 1983). Lehrer <1986) descreve seis peptídeos anti-microbianos <PAMs) de locitos de coelho que são estruturalmente homólogos aos fi1-defensinas humanos. Trés dos PAMs de coelho (NP—1, NP-2 e WP—3a) são descritos como eficazes contra Candida albicans. Lehrer et al <1986) ainda descreve que o NP-6, embora não seja albicans, demostra o que foi chamado um efeito sinergístico, um aumento na actividade fungicida ds Wp-1, quando o fungo era exposto fungicida directo contra

- X

a. ambos WP—S e WP-1 . Sgasawara et· al . (1373) descreve que a combinação de β— 1,3—glucana.se e de chit-inase é um fungicida e um bac ter i c ida eficaz útil no tratamento do arroz. WO 38/00376 descreve a inibição de prejuízos em colheitas causados por larvas ds Lepidoptera através da síntese de genes com o código para o enzima chit-inase da colheita alvo.

Ê um objectivo do presente invento fornecer novas composições para o controle de patogénios de plantas (preferencialmente fungos, bactérias e neroatóides). Estas novas composições demonstram excelente actividade contra uma larga gama de patogénios que afectam as plantas, é outro objectivo do presente invento fornecer composições em que a membrana do patogénio é mais facilmente degradada pelos peptídeos 1íticos.

έ outro objectivo do presente invento fornecer agentes anti-patogénicos eficazes em que a actividade eficaz anti-patogénica é induzivel. é um outro objectivo do presente invento fornecer composições eficazes anti-patogénicas que empregam as novas combinações anteriores de agentes anti-patogénicos. é ainda outro objectivo do presente invento fornecer plantas transgénicas com actividade eficaz anti-patogénica basiada na sintese de um ou de mais peptídeos líticos e um ou mais enzimas bidrolíticos nas células das plantas. Um outro objectivo do invento é fornecer plantas transgénicas que contêm sequências de código de DNA para peptídeos líticos e para enzimas hidrolíticos. é um modo de realzacão do presente invento controla·,' patogénios de plantas através da sua exposição a enzimas hidrol£ ticos que degradam a parede da célula, e tornam a membrana do patogénio mais acessível a peptídeos 1. iti cos. Um outro modo de realização do presente invento w enzimas hidrol icos .induziveis, preferencialmente chitina.se e β-1,3-glucanase, serem usados em combinação com peptídeos líticos. Um outro modo de realização do presente invento é a combinação dos enzimas hidrolíticos ser eficaz c om

uma larga gama de peptídeos li ticos. Uma vantagem do presente invento é gue quantidades muito pequenas de chitinase e de β-l,3-glucanase serem eficazes ao aumentarem significantemente os efeitos inibitórios dos peptídeos li ticos.

De acordo com o presente invento, composições eficazes anti-patogénicas são fornecidas empregando como ingrediente activo combinações de peptídeos liticos e enzimas hidrolíticos. Peptídeos .liticos atacam a membranas da célula dos patogénios. Porque a membrana da célula dos patogénios está protegida pela parede da célula, investigadores proposeram que a utilização de enzimas liticos para as paredes das células podem permitir a peptídeos liticos o acesso à membrana da célula dos patogénios. Os investigadores ainda fizeram a hipótese que de unicamente pequenas quantidades de enzimas hidrol ít-icos são necessários para aumentarem significativamente o efeito inibitório de todos peptídeos liticos testados.

O termo ingrediente activo é usado para referir a combinação de um ou mais peptídeos liticos e um ou mais enzimas hidroliticos, cujas combinação funciona atrvés da inibição do c rescimento dos patogénios. invento podem ser usados

Os ingredientes activos do presente como um componente de composições, formulações ou preparações eficazes anti-patogénicas.

termo suportes aceitáveis na agricultura é usado para referir aquelas substâncias, ou combinações de substâncias, que são conhecidas no ramo das composições agrícolas, e podem incluir, quando apropriado, adjuvantes sólidos ou líquidos, solventes, assim como surfactantas e outrns compostos normalmente usados em formulações agrícolas.

C-omo usado no presente invento, uma quantidade patogenicamente eficaz de uma substância ou de uma composição significa uma quantidade que matará ou inibirá o crescimento do patogénio da planta alvo quando aplicada a uma planta, ou quando sintetizada por uma planta transgénica.

O termo patogénio de planta inclui fungos, bactérias, nernatóides e insectos. Os patogénios alvo preferidos de acordo com o presente invento são fungos e bactérias.

Os termos peptideo li tico e peptideos líticos para as membranas das células são usados para referirem qualquer peptideo sintético ou natural ou um seu derivado funcional que é capaz de ter actividade eficaz anti-patogénica devido à sua capacidade de penetração, dissolução de tecidos ou de outro >do deteriorar a membrana da célula de patogénios. Existem muitos exemplos de peptideos liticos de fonte animal, de plantas, de insectos e de fontes microbiana que podem ser úteis no presente invento que incluem, mas não limitados a, defensinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, magaininas, atacinas, dipterinas, sapecinas, caerulinas, xenopsinas, ou seus híbridos. Para exemplos das sequências dos amino-áeidos destes peptideos liticos, ver WO 83/11291; UO 86/04356; W0 88/05826; US 4.810.777; e W0 89/04371; Bohlmann et al. <19881; Selsted and Harwig <19871.

Também útil como peptideos liticos do presente invento são peptideos sintéticos, que podem ser derivados funcionais de um dos peptideos liticos anteriores ou de seus híbridos funcionais. Um exemplo desses peptideos sintéticos é Synthetic Peptide No. 3, que é um derivado de uma maga ini na e tem a sequência. de amino-ô.cido SEQ ID NU! 1 (Terry et al . , 19881.

Corno usado na presente aplicação, litico também inclui substâncias que são activas contra membranas de células, como lizosimas e fosfolipases. Diferentemente dos paptídeos li ticos anteriores, as lísozimas do presente invento são capazes de penetração, de dissolução de tecidos e de outro modo deteriorar a membrana da célula do patogénio através de um mecanismo enzimático. As fosfolipases atacam os fosfolipidos das membranas das células.

Em vez de peptídeos li ticos, outros componentes degradantes de membrana das células podem ser empregues no ingrediente activo do presente invento. Por exemplo, está no âmbito de presente invento o emprego de detergentes degradantes da membrana das células como Triton e SDS.

Os termos enzima hidrolitico, bidrolase da parede da célula, bidrolase da planta e enzima hidrolitico para parede da célula são usados para referir qualquer enzima natural ou sintético que é capaz de provocar a degradação da parede da célula de um patogénio da planta. 0 enzima hidrolitico pode ser aplicado exogenosamente, ou pode ser constitutivamente ou induzi— ve.lmente inserido na célula. Exemplos de enziraas hidrol i ti cos gue podem ser usados no presente invento incluem chitinase e (5-1,3~-glucana.se.

ter mo pep t í deo

Como usado no presente i.nvento o termo ' const itu t ivo refere-se a um enzima hidrolitico ou outra substância que está presente a toda a hora na célula da planta. 0 termo induzivel refere-se a um enzima hidrolitico ou ouirs substância que está presente na célula da planta unicamente quando a planta é sujeita a. alguma condição de stress ou de estimulo externo e a produção ou presença ds enzimas hidrolíticos ou de outras substâncias por conseguinte activada ou aumentada.

Patogénios das plantas gue podem ser alvo de composições pesticidas do presente invento incluem membros das classes seguintes: bactérias (por exemplo Pseudomonas, Xamthomonas e Erwínia); fungos, como Fungi imperfecti (por exemplo, Botrytis, Septoria); Ascomycetes (por exemplo, Eryphe, Monilia); Oomycetes (por exemplo, Peronospora, F'by tophtbora, Col letot-r i chum e Pythium); Basidiomycetes (por exemplo, Rhizoctonia e Puccinial; assim como insectos e nematóides (por exemplo as espécies de Meloidogyne, Caenorhabditis, Qlobora, Heterodera e Pratylenchus). Por exemplo, os patogénios de fungos gue podem incluir as espécies de Botrytis cinerea; Col letot-r ichum lagenarium; Eryphe graminis, um patogénio do trigo; Moniiia fructicola; Peronospora tabacina; Phytophthora parasitica; Plasmopara vivicola; Pythium ultimum, um patogénio do solo; Rhizoctonia solani; um outro patogénio do solo; e Septoria nodorum, um patogénio do trigo.

Colheitas alvo a. ser protegidas no âmbito do presente invento incluem as espécies seguintes de plantas: milho, cereais (e.g. trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, sorgo e colheitas relacionadas, beterraba (e.g. açúcar de beterraba e forragem de beterraba), drupas, batatas e ameixa, pêssegos, amêndoas, fruta doce (e.g., maçSs, peras, cerejas, morangos, f ramboesas, amoras), plantas leguminosas (e.g., feijões, lentilhas, ervilhas, feijão de soja), plantas de óleo (e.g., nabo siiveste, mostarda, papoilas, azeitonas, girassóis, coco, plantas de óleo de castor, coco, amendoim), plantas de pepino medula vegetal, melões), plantas de fibra (e.g., algodão, linho, cânhamo, cânhamo da índia), planta de citrino (e.g., laranjas, limões, toranja, tangerina), vegetais (e.g., espinafres, alface, couve, cenouras, cebolas, tomates, batatas, paprica), feijão de (e.g., pepino, espargo)

Lauraceae (e.g., cânfora), ou plantai

C Ο Γ0Ο abacate, canela, tabaco, nozes, café, cana de açúcar, chã, vinha, lúpulo, bananas e plantas de borracha natural, assim como ornamentais.

As concentraçS relativas dos enzimas hidrolíticos no i ngredi ente a c t i do presente

s S o d e f i n i d a s π o s t e r rn o s de unidades de actividade. A unidade padrão concentraçãc < ' concentra cSo padrão

c) do enzi ma bi dro1 i t i c o é def i nido corno a concentração desse enzima gue produzirá um valor de actividade absoluta igual ao encontrado para o enzima hidrolítico purificado. Por exemplo, a. unidade padrão de concentração para a cbitinase é definida como a concentracão de cbitinase gue produzirá uma actividade absoluta de 88,86 nkatal/ml de extracto. A unidade padrão de concentração de 8—1,3—glucanase é definida como a concentração gue demontra um valor de actividade absoluta igual ao encontrado para o enzimna parcialmente purificado, e.g. 76,00 nk a ta1/m1 de ex t rac to.

presente invento relaciona-se com composições anti — -patogénicas eficazes gue compreendem combinações de peptídeos líticos com enzimas bidrolítícos para a parade da célula, como chitina.se e β-1,3-glucanase. Num modo de realização preferido do presente invento, ambos cbitinase e 8-1,3-glucanase estão presentes no ingrediente activo em prequenas quantidades, em concentrações relativas de cerca de 1/10 da padrão < c ), ou, mais pref erenc ialmente, de cerca de 1/1.00 c. Os enzimas bidrolítícos igualmente permitem um melhor acesso à membrana de célula, do patogénio dos peptídeos líticos.

por exemplo, concentração

Num modo de realização preferido, os peptídeos líticos do presente invento estão presentes no ingrediente activo numa concentracão desde cerca de 0,1 ppm a cerca de 1000 ppm, prefe— rencialmente desde cerca de 0,5 ppm a cerca de 500 ppm, especialmente desde cerca de 1 ppm a cerca, de 200 ppm.

As concentrações de chitinase e de 8-1,3-glucanase gue foram encontradas como sendo activas contra patogénios teste, quando aplicados em combinação com pept-ídeos 1 iticos, estão presentes em muitas espécies de plantas, mesmo sem es t í mu1o prévio o que leva à indução destes enzimas hidroliticos. Contudo, as chitinases © as glucanases naturalmente presentes não estão relacionadas com os patogénios, e são encontradas no espaço vazio em vez do espaço extracelular da célula da planta CBoller et al., 1383; Burri, 13831. Assim, num modo preferido do presente invento, o peptídeo lítico é usado em combinação com enzimas hidrolí— ticos activados que estão já presentes na planta. A chitinase e a 8-1,3-glucanase são ambas induzíveis em plantas. Assim, num outro modo de realizãção do presente invento, a produção de chitinase e de β-1,3-glucanase é induzida usando um estímulo externo.

A indução pode ser através de meios químicos, por exemplo, químicos conhecidos que actuam como indutores de patogénios relacionados com áci do benzó i c o, áci do protéinas em plantas, incluem etileno, salicílico, ácido poliacrílico e seus A indução pode ainda ser por outros meios de rivados suo ubs t i tu í dos fisiológicos e físicos, como por temperaturas elevadas ou baixas, feridas físicas ou por qualquer outro meio indutivo conhecido.

presente invento ainda embraça a preparação de composições eficazes anti-patogénicas em que o ingrediente activo é uma combinação de peptideos líticos e de enzimas hidrolíticos. 0 ingrediente activo é misturado homogeneamente com um ou mais compostos ou grupos de compostos descritos aqui. 0 presente invento também se relaciona com métodos de protecção de plantas do ataque de patogénios de plantas, que comprende a aplicação de ingrediente activo, ou de composições eficazes anti-pat-ogéni cas que cont-ên o ingrediente activo, ã planta ou aos habitates dos patogénios.

Os ingredientes activos do presente inventei são normal mente aplicados prof i lati camente oo curati vament-e na forma de composições em conjunto com um ou mais suportes aceitáveis na agricultura, e podem ser aplicados na área de colheita ou na planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucesSo, com outros compostos. Estes compostos podem ser ambos fertilizantes ou doadores de micronutrientes ou outras preparações gue influenciem o crescimento da planta. Eles podem também ser herbicidas, insecticidas, fungicidas, bac ter i c idas, nematicidas, mol. use i. c idas selectívos ou misturas de várias destas preparações, se desejado em conjunto com outros suportes, surfactantes ou adjuvantes promotores de aplicação normalmente empregues no ramo da formulação. Suportes e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos correspondem às substâncias normalmente

Π·3 tecnologia da formulação, e.g. substâncias minerais geradas ou natu r a i s, so1ventesd i spe r santes, ntes de hum i d i f i c aç ão , sgeni de gomosida.de, agentes de ligação ou fertilizantes.

Um métdo preferido de aplicação de ingredientes activos do presente invento ou de uma composição agroqímica gue contém pelo menos o ingrediente activo é a aplicação na folha. O número de aplicações e a razão de aplicação depende da intensidade da infestação pelo patogênio correspondente. Contudo, os ingredientes activos podem também penetrar na planta através das raízes por via. do solo (acção sistémica) por impregnação do local da planta com uma composição líquida, ou por aplicação dos compostos na forma sólida no solo, e.g. na forma granular (aplicação no solo). Os ingredientes activos podem também ser aplicados às sementes (revestimento) por impregnação das sementes ou com uma formulação líquida que contém ingredientes activos, ou pelo seu revestimento com uma formulação sólida. Em casos especiais, outros tipos de aplicação são também possíveis, por exemplo, tratamento selectivo de caules ou de rebentos de plantas.

D© modo a que as composições eficazes anti-patogénicas inibam o crescimento de urs patogénio como o fungo 3. nodorura, é assumido que em primeiro lugar o patogénio toma contacto com os enzimas hidroliticos. Depois do contacto com a chitinase e com a β-1,3-glucanase, a membrana do fungo é mais acesível aos peptídS'.js liticos. pm adição, é impor tante notar a resposta em defesa da infecção patogénica gue consiste em muitos diferentes mecanismos . Enquanto gue combinações de chitinase, β-1,3-glucanase e de vár ios peptí deos 1 í t-i cos mostram uma inibi çSo considerá.ve 1 do crescimento patogénico por destruição da parede da célula dos patogénios e da membrana dos patogénios, eles possivelmente ajudam a capacidade ant.i-patogénica da planta através do fornecimento do acesso de outras substâncias anti-patogénicas, gue são produzidas durante uma resposta hiper-sensitiva da planta. Assim, as combinações de chitinase, de β-1,3-glucanase e de peptideos liticos do presente invento são agentes eficazes para o controlo de pa t-ogén i os .

Os ingredientes activos são usados na forma não modificada ou, preferencialmente, em conjunto com adjuvantes convencíonalmente empregues no ramo da formulação, e são por conseguinte formulados de uma maneira conhecida em concentrados emulsionã— ve is, pa s ta s pui ver izávei. s, Vô 1 5 ; ΡΟΘ I Γα5 / revestidas, soluções diluiveis ou directamente emulsões diluídas, pós humidificáveis, pós solugranulatos, e também encapsulaçôes, por exemplo, em substâncias pol. irnér ica

Dependendo da natureza das c ompos i. — ções, dos métodos de aplicação, como a pulverização, tomizaçãc poeiras, dispersão ou vazamento, eles são escolhidos de acordo com os object-ivos pretendidos e as circunstâncias gue prevelecem. Vias vantajosas de aplicação são normalmente desde 50 g a 5 kg de ingrtediente activo (i.a. ) por hectare fha), preferencialmente desde 100 g a 2 kg i . a . /ha, ma.is pref erenc ialmente desde 200 g a 500 g i.a./ha.

As formulações, as composições ou as preparações que contêm os ingredientes activos e, quando apropriado, um adjuvante sólido ou liquido, são preparados de uma maneira conhecida, por exemplo por mistura homogénea e/ou moagem dos ingredientes activos com extensores, por exemplo solventes, suportes sólidos e, quando apropriado, compostos de superfície activa (surfactantes) .

Solventes adequados incluem hidrocarbonetos aromáticos, preferencialmente as fracções que têm 8 a 12 átomos de carbono, por exemplo, misturas de .xileno ou naftalenos substituídos, ftalatos como ftalato de dibutilo ou ftalato de dioctilo, hidrocarbonetos alifáticos como ciclo-hexano ou parafinas, álcoois e glicóis e outros éteres e ésteres, como etanol, éter de etileno-glicol de monometilo ou de monoetilo, cetonas como ciclo-hexenona, solventes fortemente polares como N-meti1—2-pirrolidona, sulfóxido de dimetilo ou formamida de dimetilo, assim como . óleos vegetais; epoxidados como óleo de coco epoxidado ou óleo de feijão de soja epoxi dado,' ou água.

Us suportas só1idos usados e.g. para poeiras e pôs dispersáveis, são normalmente agentes de enchimento minerais naturais como calcite, talco, caolino, montmor i loni t-e ou atapulgite. De modo a melhorar as propriuedades físicas é também possivel adicionar ácido silícico altamente disperso ou polímeros absorventes altamente disperso. Suportes de adsorção granulados adequados são do tipo poroso, por exemplo pedra polmes, tijolo partido, sepolia ou bentonita,' e suportes não adsorventes adequados são materiais como calcite ou areia. Em adição, um grando número de materiais pré-granulados de natureza inorgânica ou orgânica podem ser usados, e.g. especialmente dolomite ou resíduos de plantas pulverizadas.

Dependendo da natureza do ingrediente activo a ser usado na formulação, compostos de superfície activa adequados são surfactantes não iónicos, catiónicos e/ou aniónicos que têm boas propriedades de emulsão, de dispersão e de humidificacão. O termo surfactantes deve ser entendido como compreendendo misturas de surfactantes.

Surfactantes aniónicos adequados podem ser ambos caldos solúveis em ãgua e compostos de surperfície activa sintéticos £>OiÚV©ÍS .

Caldos adequados são sais de metais metais alcalino terrosos ou sa.is de amónio substituídos por ácidos gordos superiores <de cadeias desde 10 22 átomos de carbono), por exemplo os sódio do ácido oleico ou esteárico, ou natural que pode ser obtido por exemplo ou óleo de sebo. Sais de metiltaurina d alcalinos, sais de i nsubs t i tu í dos ou a

sais de potássio ou de misturas de ácido gordo a. partir de óleo de coco ácido gordo pode também ser usado.

Mais frequentemente, contudo, os chamados surfactantes sintéticos são usados, especiaimente os derivados de sulfonatos gordos, de sulfatos gordos, de benzimidazole sulfonado ou alquilar i 1 sul fatos .

Os sulfonatos ou sulfatos gordos estão normalmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino terrosos ou sais de amómio insubstituidos ou substituídos e têm um radical de alquilo com 8 a 22 carbonos que também incluem a porção alquilo de radicais alquilo, por exemplo o sal de sódio ou de cálcio do ácido 1inhosulfónico, de dodecIsulfato ou de uma mistura de sulfatos de álcool gordo obtidos a partir de ácidos gordos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de ésteres de ácido sulfúrico e ácidos sulfónicos de aductos álcool gordo/óxido de etileno. Os derivados de ben.zimi dazol e sulfonado preferencialmente contêm 2 grupos de ácido sulfónico e um radical de ácido gordo gue contém 8 a 2‘2 átomos de carbono. Exemplos de alquilari]sulfonatos são sais de trietanolamina, de cálcio ou de sódio de ácido de dodecilbenzenosulfónico, ácido de dibutiInaftalenosulfónico, ou de um produto de condensação ácido naftalenosulfónico/formaldeido. Também adequado são fosfatos correspondentes, e.g. sais de éster de ácido fosfórico de um aducto de p—nonilfenol com 4a 14 moles de óxido de etileno.

Surfactantes não iónicos são preferencialmente derivados de éter de poliglicol de álcoois alifáticos ou c ic loal .i f áticos, ou ácidos gordos saturados ou insaturados e alqui1fenóis, contendo os referidos derivados 3 a 30 grupos de éter de glicol e 8 a 20 átomos de carbono na porção de hidrocarboneto (alifático) e 3 a 18 átomos de carbono na porção alquilo de alqui1fenois.

Surfactantes não iónicos ainda adequados são aductos solúveis em água de óxido de polietileno com pol .ipropi leno-gl i — col, etilenodiamino—propiieno—glicol e alquiIpolipropileno-glicol que contêm 1 a 10 átomos de carbono na cadeia de alquilo, cujos aductos contêm 20 a 2S0 grupos de éter de etileno-glicol e 10 a

100 grupos de éter

Es tfi c o m postos no r m a1 — de de propileno-glicol mente contêm la 5 unidades de etileno-glicol por unidade propileno-glicol .

Exemplos representativos de surfactantes não iónicos são noni 1 fenolpol. ietoxietanóis, éteres de poliglicol e de óleo de castor, aductos de polipropileno/óxidc f enoxi po1i e tox i e ta no1, nol. éstere?

de ácidc de polietileno, tributilpol iet i 1 eno-gl icol e oc ti 1 fenoxietoxoetagordo de polioxoeti leno de sorbitano e trioleato de polioxietileno de sorbitano são também surfactantes não iónicos adequados.

Surfactantes catiónicos sSo preferencialmente sais de amónio quaternário que têm, como substituinte de N, pelo menos um radical alquilo e como outros substituintes, radicais alquilo halogenados ou alquilo insubstuido inferior, benzilo ou hidroxilalquilo inferior. Os sais estão preferencialmente na forma dê haletos, meti 1. sul fatos ou eti 1 sul fatos, e.g. cloreto de estear i. 1 tr imet,i larnóni o ou brometo de benzi ldi < 2-c loroeti 1 leti 1amón i o.

Os surfactantes normalmente empregues no ramo da formulação estão descritos, por exemplo, em McCutcheon Detergent-s and Emulsifiers Annual (1373), e Siselz and Wood <13801.

As composições agroquímicas normalmente contêm cerca de 0,1 a cerca de 33 %, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 95 55, e mais preferencialmente desde cerca de 3 a cerca de 90 55 de ingrediente activo, desde cerca de 1 a cerca de 99,9 %, preferencialmente desde cerca de 1 a cerca de 33 55, e mais preferencialmente desde cerca de 5 a cerca de 35 % de um adjuvante liquido ou sólido, e desde cerca de 0 a cerca de 25 55, preferencialmente desde cerca de O,1 a cerca de 25 55, e mais preferencialmente desde cerca de 0,1 a cerca de 20 % de um surfactante.

Enquanto que os produtos comerciais são preferencialmente formulados como concentrados, o utilizador final normalmente emprega formulações diluídas.

presente invento também se relaciona com plantas transgénicas que contêm sequências de uNA wue codifica pelo menos um peptídeo li tico e pelo menos

Planta u ro a h i d ro 1 a. s e .

transgénicas que contêm sequências de DNA que codifica a chitinase e R-l, 3-gIucanase estão descritos em EF’ 332 22S e EF' 3S3 191 .

M-esente invento também se preparação de uma planta transgénica quantidades eficases anti-patogénicas relaciona com um método de que é capas de sintetizar d © um ou mais comp o ne nt es degradantes da membrana da célula e um ou mais enzimas hidrolíticos que o método compreende

a) preparação de uma planta transgénica que compreende sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais componentes degradantes da membrana da célula e um ou mais enzimas h i d r οIí t i c os; ou bl preparação de duas ou mais plantas transgénicas que compreendem sequências de DNA que codificam um ou mais componentes degradantes ds membrana de célula e/ou um ou mais enzimas hidrolíticos, e o cruzamento das referidas plantas usando técnicas criação convencinais.

Preferencialmente, o método compreende a preparação de uma primeira planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica um componente degradante da membrana da célula, a preparação de uma segunda planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica a β-l,3-glucanase, a preparação de uma terceira planta transgénica homozigótica que compreende uma sequência de DNA recombinante que codifica a chit-inase, e o cruzamento das três plantas homozigóticas usando técnicas de c r i aç ão c onvenci ona i s.

Em plantas transgénicas, a síntese de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos podem ser induzida através da utilização de um sistema de síntese induzível que compreende um gene induzi vel © um regulador de inducSo. Por exemplo, mais do que dez genes de protéina do tabaco PR (patogene relacionado) são quimicamente induzíveis (van Loon, 1985; Jamet and Fritig, 1986). Três destes genes, PR-2, PR-N e PR-0 têm sido indicados como tendo a capacidade da 8-1,8-glucanase (Kauffman et al., 1987), e dois,

PR-P e PR-Q, têm sido indicados como tendo chitinase (Legrand et al., 1987). Assim, o inclui plantas transgénicas que sintetizam um gene que pelo menos um peptídeo lítico seguido pelo tratamento capacidade a da p resen te i nven to codi fica c om um regulador de indução que induz a acumulação de enzima, hidrol í tico natural ou estranho.

pelo menos um

O invento é ilustrado em mais detalhe pelos exemplos seguintes, sem implicar qualquer restrição ao que aí está descrito .

Depósitos com fíTCC

Os depósitos seguintes for acordo com o Tratado de Budapeste;

feitos com o ATCC de

ATCC 40426, ATCC 40586, depositado em Fevereiro 1.2, 1988 depositado em Março 22, 1989

Exemp 1 os

Exessplo 1: Purificação de chitinases e de

S— 1,3-glutarsase de folhas de feijão tratadas

Passo 1 ' Tratamento com etileno e material da planta. Sementes de Phaseolus vulgar is L. cv. saxa são crescidas em vermiculite sob um regime de 16 hr de luz:8 hr de escuro, aos 20°C. Plantas de feijão de doze dias de idade são incubadas em câmaras de plástico de ar parado com um volume de 0,2 m'. Plantas de controle são incubadas em câmaras idênticas em ar livre e em etileno. Depois de 48 horas, as primeiras folhas foram colhidas e congeladas aos -20°C.

Passe

Preparação de enzima em bruto. 660,7 de tecido de folha congelado é homogenizado em tampão de citrato de sódio 0,1 M a pH 5,0 (2 ml/g de peso em fresco) com um homogenizador Turmix na. velocidade de topo. 0 homogenizado é centrifugado <25 minutos, 11 000 x g) e 100 ml de sobrenadante são usados como a preparação do enzima em bruto. As proteínas do restante e.xtrac to em bruto são precipitadas por adição de sulfato de amónio a 35 % da saturação. Depois de centrifugação <30 min, .1.1 000 x g) o sedimento foi redissolvido em Tris 100 mM/HCl pH feita separação dos colóides contra Tris 5 mM/HCl pH 8,0.

Passo 3: Purificação do enzima. A fracção de protéina em bruto que sofreu separação dos colóides é passada através de uma coluna de dietilaminoeti1 (DEAE)-trisacrilo (IBF; Clichy, F) equilibrada em Tris 5 mM/HCl pH 8,0. Tampão contendo as protéinas básicas que passam através de uma coluna não retardada é levada a uma concentração final de 20 mM de HaHCO.-, ϋ pH é aumentado a 8,4 com NaoH 1 M e o liquido vai carregar uma coluna de chitina regenerada (Molano et- al . , 1377) equilibrada ern NaHC0_o 20 mM. 0 fluxo que atravessa a coluna, é recolhido e ο pH é levado a 5,5 com HC'l 1 M. As protéinas sofrem separação dos colóides contra água β sSo tratadas três vezes com uma pequena quantidade de chi tina regenerada, seguido por centrifugação para a remoção de vestígios de chitinase. As fracções que contêm uma actividade elevada de β-l, 3-glucanase são depois 1 iof i .1 izadas . Elas são fonte de B-1,3-glucanase parcialmente purificado.

A coluna de chi tina é lavada com Ma.HCO.-, 20 mM, seguido por tampão de acetato de sódio 20 mH pH 5,5. A chitinase é eluida com 100 mM de ácido acético num volume de eluição de 30 ml. 0 pH do elue.to é levado a 5,5 com KOH 1 M e a protéina sofre separação dos colóides contra água e é liofilizada. Esta protéina será a fonte de chitinase purificada.

Passo 4Determinação da protéina. A protéina é medida como descrito por Eíradford <1376).

Passo 5a: Ensaio de chitinase. A actividade da chitinase é medida como descrito por Molano et al. <1377).

Passo 5b: Ensaio de B-1,3-glucanase. A actividade da β-l, 3-glucanase é medida como decrito por Dygert et· al . <1365).

Passo 6! Indução de com etileno. Um tratamento de indução de chitinase e de B-1 resultados do Quadro 1:

enzima em folhas de feijão tratadas etileno de 48 hr leva, a uma. forte 3-glucanase, como demo ns t rado pe1os

Quadro 1: Actividade de chitinase e de 8-1, 3-glucanase em folhas de feijão tratadas com etileno

Actividade de chitinase especifica	45,35
< nkatal/mg	de protéina)
Ac tividade nk atai/ m 1	de chitinase absoluta de extracto)	54,71
Ac tividade C τ*}?'* atai/	de 8-1,3-glucanase especifica de protéina)	28,72
Ac tividade <nkatal/mg	de 8-1,3-glucanase absoluta de extracto)	34,21

Passo 7: PurificacSo do enzima. 0 Quadro 2 mostra o procedimento de purificação da chitinase e da. 8-1,3- gluca.na.se. A chitinase é 33 vezes purificada com um rendimento de 21,6 %. A 8-1,3-glucanse é purificada com um factor de purificação de 3,0 e um rendimento de 33,5 %. A electroforese de gel de poliacrilamida SDS mostra gue a 8-1,3-glucanase está altamente purificada depois destes passos de purificação (Burri, 1333).

Quadro 2: Procedimento de purificação de chitinase e de β-ί,3-glucanase de folhas de feijão tratadas com etileno

Protéina Actividade Actividade Actividade Actividade Total chitinase chitinase β-Ι,-3-glu- 3-l,3-gluEspecifica canase t nfc a t /mg de To ta 1 ο ρote i na) mg)

Total 1 π k a t i canase

Espec í f ic; <nfc a 1/mg protéina >

Extracto

740 em bruto

34001

45,95 100 %

22566

100

Sul fato de a ri~ión i o •524

31944 %

Π«Ο medido não msd i do

Coluna de 191,4 26598

DEA.E 78,2 %

89

3991 42,3 %

Chitinase 4,84 puri f i cada

7341 1517

21,6 %

11,78 2,43

Co 1 una de chi tine

82, 1

701

8,54

7129

W C. ’V

Passo 8: InducSo de chitinase e de β-1,3-glucanase em folhas de feijão. Nas folhas de feijão usadas para esta experiência, o-s enzimas de chitinase e de β—1,3—glucanase são ligeiramente menos induzidas do gue o esperado. Por exemplo, em Burri ('19891, a média dos cinco tratamentos de etileno originou uma actividade de chitinase absoluta de 88,86 ± 6,65 nkata.l/ml de extracto e uma actividade absoluta, de 8-1, 3-glucanase de 76,00 ±

6,77 nkatal/ml de extracto. F'or conseguinte, a unidade de concentração padrão para a chitinase (c = 1) é definida como a concentração de chitinase necessária para obter uma actividade de 88,86 nkatal/ml de extracto. A concsntracSo relativa de extractos de chitinase são definidos nos termos das fraccões dessa actividade. As concentrações relativas de 8-1,3-glucanase pareialmente purificado são definidas nos termos das fraccões de uma actividade de 76,00 nkatal/ml de extracto.

Passo 9; Purificação de chitinase. A chitinase é purificada por cromatografia de afinidade. 8 factor de purificação é comparável com o de Burri <28891 (82 %1.

Passo 10 Purificação de 8-1,3-glucanase. O rendimento de 35,6 % é aproximadamente um terço superior ao de Burri <19891 para esse passo de purificação, enquanto que o factor de purificação de 3.0 não é tão elevado como o previamente observado.

Exemplo 2: Síntese de peptideos liticos

Peptideos liticos são sintetizados usando um Applied Biosystems Model 430 Peptide Synt-hesizer de acordo com as recomendações do preparador . Os peptideos são purificados por CL..AR.

Exemplo 3: O efeito inibitório de peptideos liticos e de enzimas hidroliticos contra S. nodorLMa

Pratos microtitero são seleccionados para investigar o efeito inibitório de peptideos liticos e de enzimas hidroliticos contra 8. nodorum. As substâncias teste são adicionadas em meio de ervilha liquido de 90 ;j! que foi previamente inoculado com 2,0 χ IO¹' esporos/ml de meio do patogénio teste de medo a originar um volume final de 100 ,ul . 0 Quadro 3 ilustra a composição das soluções teste que são testadas em amostras em duplicado/tripli~ cado. Ci valor do banco das substâncias teste ê determinado pela sua adição ao meio de ervilha liquido riSo inoculado. Os pratos são avaliados depois de incubação numa câmara húmida aos 23°C, num misturador ao escuro durante 48 horas.

Soluções teste

Quadro

Amostra	Chitinase Purí fie ada C c )	β-l,3-glutanase Puri ficada < c )	Peptí deo Li ti co (ppm )
o 1	1/10	—	—
2	1/100	-	-
	-	1/10	-
4	-	1/100	-
5	-	-	20
6		—
7	-		200
S	1 /10	1/10	-
9	1/10	1/100	-
10	1 /100	1 /10	-
11	1/100	1/100	-
.12	1/10	-	20
13	1 /10	-	6-0
14	1/10	-	200
15	1/100	-	20
16	1/100	-	60
17	1/100	-	200
.13	-	1/10	20
19	-	1/10	60
20	-	1 /10	200
21	-	1/100	20
22	-	1 /100	60
•«O	-	1/100	200
24	1 /10	1/10	20
25	1 /10	1/10	60
26	1 / .1.0	1 /10	200

27	1 /100	1/100	20
28	1/100	1 /100	80
	1/100	1/100	200

Agua de controle; 10 jul de água destilada são adicionadas a 90 .ul de solução de esporo.

Cf crescimento do patogénio é registado pela medição da absorvância do meio a -595 nm. A média das amostras em duplica— do/t-r ipl i cado é calculada e o ensaio correspondente em branco do enzima é substraído de modo a obter a absorção limpa do crescimento do micélio. 0 efeito inibitório das substância teste usadas é determinada pelo cálculo do crescimento do patogéniio como uma percentagem de água de controle.

Os resultados do teste acima descrito estão compilados no Quadro 4. Quando aplicados como soluções teste simples, todas as substâncias teste são capazes de inibir o crescimento de S. nodorum a um limite extendido, dependendo das concentrações usadas. A combinação de β-1,3-glucanase parcialmente purificado e de peptídeo li tico é encontrada, como sendo mais fortemente inibidora do crescimento pat-ogénico do que combinações de chitinase purificada, e de peptídeo litico. Isto é consistente com o encontrado, de gue o S. nodorum é mais sensível â θ—1.-3—glucanase parcialmente purificado do gue a chitina.se purificada. Como o Quadro 4 demonstra, adições de .1/100 c de ambos enzimas a um peptídeo litico particular aumenta unicamente ligeiramente o efeito inibitório da substância teste em comparação com o peptídeo litico sozinho. Combinações de 1/10 c de ambos enzimas com uma concentracão de peptídeo litico particular inibe mais fortemente o patogénio teste do gue combinações de 1/100 c de enzima com peptídeo litico. é especialmente interessante notar gue combinações de ambos enzimas, ou em concentrações de 1/10 ou de

1/100, com peptídeos líticos aumentam fortemente o efeito inibi t-ório das substâncias teste.

τ

Quadro 4: Resultados das soluções teste, crescimento dos fungos em % em relação ao de controle

3o 1uç ão	Pepd i deo	T i on i na β
Teste	Sintético	da cevada	Μθ 1 1 tl flâ	Ε Π Z i Fft θ. s

no. 3

- - - 73,60

- - - 50,18 _ _ _ 31,75

c„	30,35	36,32	79,65
6	73,51	63,36	65 ,· 96	-
7 z	65,96	60,70	27,37	O Ί
9	-	-	-	o 4 , . 45,
10	-	-	-	•“Ό i -
11	-	-	-	60,:
1 X .z_	63,42	62,31	62,31	-
13	63,51	49,47	57,54	-
14	61,75	47,02	22,46	-
15	77,39	75,44	73,33	-
16	71,53	62,31	65,26	-
17	64,21	57, 1 3	25,61
1 o J.	46,67	13,63	14,74	-
13	30,33	12,33	.11,93	-
20	27,83	5,26	6,32	-
	65,26	54,74	61,40	-
22	(Τ -τ· c 1 P--z , ·_· x	46,67	57,19	-
	6:”!, 63	39,30	25,96	-

3,47 7,72 10,53

3,42

7,37

26	3,86	0,00	0,00	—
•>•7	40,7	42,46	22,72	-
oo	36,49	32,98	22,11	-
2S	31,23	28,77	18,75	—
íDs	enzimas hidroliticos	são pur	ificados a	partir de
folhas pelo	P r o c ed i. men to des c r i to	no Exemplo 1. Os	pep t· i deos
Ixt· icos sSo	testados a concentrações de 20	ppm, 60 ppm	e de 200

ppm .

Exemplo 4: Formulações de composições eficazes anti-patogénicas que empregam composições líquidas de peptídeos líticos e de enzimas hidrolíticos como o ingrediente activo

Noa dados dadas em peso.

seguintes percentagens das composições

1. . Concentrados para emulsão; a

Ingrediente ac tivo

Dode c i1benzenosu1f ona to de c á 1 c i o

Éter de polietileno-glicol de óleo de castor <36 moles de óxido de etileno) Éter de po1ieti1eno-g1i co1 de tr ibu tiIf eno1 < 30 %

% %

% %

5% mo 1 es de ó.x i do de eti 1 eno) 0 i c1o-hexanona Mistura de xileno %

%

O 5.

% % 20 %

%

Emulsões de qualquer concentração necessária podem

SS V produzidas a partir destes concentrados por dilui cão com água.

Soluções;

Ing r ed i en te acti vo éter de monometilo de etileno-gIi c o1 %

% .20 %

Pol iet-i leno-gl icol 400 - 70 %

IM-me t i 1 -2-p i r r o 1 i dona - 20 % óleo de coco epoxidado — Petróleo destilado - (gama de ebulição de 160°C a 130°C) %

Estas soluções são adequadas pera a ap*l 3. cação na mi c rogotas.

i U» t f»ií=í

-•a nu late fc?

Ingrediente ac tivo

Cao1i no

Ácido silicico altamente disperso .^c. %

Atapulgi te ingrediente activo é no, a solução é pulverizada num quentemente evaporado em vacuo.

dissolvido em cloreto de metile~ suporte, e solvente é subs

4. Pós i b

Ing r ed i en te a c tivo	2 %	5 %
Ácido silícico altamente disperso	1 %	5 %
Talco	97 %	-
Caolino	-	90

Pós prontos a usar são obtidos por mistura intima dos suportes com o ingrediente activo.

Exemplo 5: FormulçSo de composiçfies eficazes anti-patogénicas que empregam composicôes sólidas de peptídeos líticos e enzimas bidrolíticos como ingrediente activo

Nos dados . Pós humidificáveis!

t-.

Ing red i en te a c tivo

L i nhosu1f ona to de sôd i o

Lauri1-su1fato de sód i o

Cd. i s o b u t i In a. f t a 1 e η o s u 1 f o n a t o d e sód i o éter de polietiieno—glicol de octilfenol <7 a. S moles de óxido de etileno)

Acido silícico altamente disperso Cao1i no % 60 % 75 % c ·;/ c v — % - 5 % % .1.0 % % 27 % 10 % c v >v _ —

Ο ζ zv ingrediente activo é totalmente misturado com os adjuvantes e a mistura é totalmente moída num moinho adequado, originando pós humidificáveis que podem ser diluídos com ãgua para originar as concentrações desejadas.

2. Concentrado para emulsões:

Ingrediente activo

Éter de pol ieti 1 eno-g I .icol de oc til fenol (4 a 5 moles de óxido de etileno) DodeciIbegnzenosulfunato de cálcio Éter de poliglicol de óleo de castor <36 moles de óxido de etileno)

C i c1o-hexanona Mistura de xileno %

% SO %

Emulsões de qualquer concentração podem ser obtidas a partir deste concentrado por diluição com éigua.

3. Pós: a b

Ingrediente activo Ta 1 c o Cao1i no % 3S %

Pós prontos a usar são obtidos por mistura do .ingrediente activo com os suportes, e moagem da mistura num moinho adequado.

4. Granulato por extrusão;

Ingrediente activo 10 %

Linbosuífonato de sódio 2 %

Carboximeti1 celulose 1 %

Cao 1 i no 87 %

O ingrediente activo é misturado com os adjuvantes, e a mistura é subsequentemente misturada com ãgua. A mistura é ext-rudada e depois seca numa corrente de ar.

· Granulato revestido '

Ingrediente activo 3 %

Po 1 .i e t í .1 eno-g 1 i c o 1 200 3 %

Caolino 94 %

O ingrediente activo finamente moído é uniformemente ap1i c ado, num mis tu r ado r, ao c ao1i no mi s tu r ado c om po1i e t i1eno— -glicol. Os granulatos revestidos sem serem em pó são obtidos desta maneira.

&. Concentrado em suspensão:

Ingrediente activo 40 %

Eti leno-gl .i col 10 %

Éter de polietileno-glicol de nonilfenol 6 % (15 mo1es de óxi do de etileno)

Linhosulfonato de sódio 10 % cs r box i me11 Ice .1 u 1 ose 1 %

Solução de formaldeído aquosa a 37 % 0,2 % óleo de silicone numa emulsão aquosa a 75 % 0,8 %

Agua -_s2 % ingrediente activo finamente dividido é intimamente misturado com os adjuvantes, originando um concentrado em suspensão a partir do gual suspensões de qualquer concentracão desejada pode ser obtida por diluição com ãgua.

Exemplo 6: Construção de vectores binários

PC6N1781C e rCGN1782C pCIBIOOSB, gue contém um promotor do virus de mosaico de. couve-flor 358 duplo (VMCo) operacionalmente ligado a um gene gue codifica a expressão da glucanase básica é construído da segui nte forma:

plasmídeo pGLN17 é um híbrido de ADNc gue codifica a β-l,3-glucanase básica de N. tabacum ÍShinshi et al . , 1388) construído por fusão da extremidade 5' do clone pGL31 e a extremidade 3' do clone pGL35. Este híbrido de ADNc tem a sequência

EQ 1.0 N0; 3.

DN.Ac é truncado

5' e não c od i f i c a ;inal total do peptídeo. Oe modo a fazer a.s plantas transgénicas

em que esta protéina estã apropriadamente marcada. <i.e., o vacuolo central), é necessário adicionar esta sequência novamente ao DNAc truncado. Por consequinte, a cassete de VMCo 35S duplo é construída por um processo de dois passos. No primeiro passo o sinal do peptídeo do DNAc é substituido por um sinal de peptídeo codificado no clone genómico. No segundo passo, este DNAc reparado” é movido para o vector expressão.

□ plasmideo pSGL2 é um subclone do DNAc de p6LN17. Este plasmideo é digerido com Ciai e EcoRI e o fragmento 1 kb que contém o DNAc da glucanase é isolado a. partir de um ge.l de com EcoRI, agarose LGT.

il

Plasmideo pBluescript é digeri· tratado com CI.AP e purificado com um gel de agarose LGT.

O plasmideo pBS—Gluc 39,1 contém uma inserção de 4,4 kb inc lui a sequência do código da glucanase, cerca de 1,5 kb de sequência lateral 5', um intron de 600 bp, e cerca de 1 kb de sequência lateral 3' . Este plasmideo é usado com um modelo na. experiência PCR que contém dois primários com as sequências SEQ

ID NO!10 ou SEQ ID NO:11.

resultado desta ampliação é a produção de um fragmento para a substituição da extremidade 5' truncada do DNAc de glucanase. Uma mutação numa única base cria um sitio EcoRI é introduzido para facilitar as experiências com clones. O produto PCR é degerido com EcoRI e Ciai e os fragmentos sSo separados em gel de agarose LGT a 2%. Uma. banda de 120 bp é excitada, misturada com o fragmento 1 kb Clal—EcoRI de pSGL2 e o vector bluescri.pt digerido EcoRI, purificado, é ligado e transformado como descrito acima. As transformações são registadas pela presença da inserção e um plasmideo com a estrutura apropriada é designado pC IΒ1003.

por

□ plasmideo pCIB1009 é degerido com EcoRI e o fragmento .1,2 kb é purificado num gel da agarose LTC. 0 pasntídeo PCGN1761 é digerido com EcoRI, tratado com CIAR, purificado num gel de agarose LGT, misturado ligado e transformado, presença de inserção. Um c om f r agmento 1,2' As transformações plasmideo, em gue kb EcoRI, e depois são registados pela o DNAc da. glucanase estã em sentidc pCIBIOOSB.

relativo ao promotor VMCo é designado como

O fragmento 4,9 kb Xbal de pCIBIOOSB é subclonado em Xba.I de pCGN1540 digerido numa tal orientação que o fragmento do promotor 35S duplo· está próximo ao gene marcador seleccionado da planta de pCGN.1540 para criar pCG.N1781C.

A construção do plasmideo PCIBÍ007, gue contém promotor VMCo 3SS duplo operacionalmente ligado ao gene codifica a cbitinase básica é o seguinte;

um gue plasmideo pSCHIO contém uma inserção de DNAc da cbitinase básica do tabaco gue é idêntico â inserção em pCHNSO (Shinshi et al, 1.937) mas com uma extensão de 81 bp na extremidade 5' (SEQ ID NO;12).

O pSCHIO é digerido com BamHI e depois ligado com adaptador molecular (SEQ ID NO;13) como descrito no Exemplo 5. produto de ligação é depois purificado e degerido com EcoRI e fragmento de 1,2 kb gue contém o DNAc da cbitinase adaptado pur if içado a parit-r de um gel de agarose LGT.

um

O

Este fragmento é misturado com EcoRI digerido, CIAP de PCGN17S1 tratado gue é também purificado a partir de um gel de agarose e a mistura é ligada e transformada. As transformações pela inserção de DNAc da cbitinase e um gue contém o DNAc de chitinase numa orientação de sentido relativa ao promotor VMCo é designado como pCIB'1007.

fragmento 4,8 kb Xbal de PCGN1007 é clonado em Xbal de pCGN1540 digerido numa t-al orientação que o fragmento do promotor 358 duplo está próximo ao gene marcador seleccionado da planta de pCGN1540 para criar um vector binário pCGN178.2C.

Exemplo 7:

Construção de um gene que codifica um peptídeo lítico sintético No.3 peptídeo lítico sintético No.3 como descrito acima nos exemplos anteriores tem um amino-ácido de sequência SEQ ID ND: 1 .

Um gene sintético gue codifica este peptídeo é construído em vários passos. Primeiro um gene que codifica a protéina madura (processada) é sintetizada e clonada, depois um peptídeo sinal e a sequência guia 5' para a expressão das plantas e da secrecão são adicionados, finalmente uma sequência não transladada 3' e um sítio de processamento de RNAm 3' são adicionados. Disto resulta um gene que codifica o peptídeo sintético No.3 gue pode ser transformado numa planta e gue dirige a síntese de um peptídeo lítico gue será secregado extracelularmente.

A. Construção de um sequência de código para o peptídeo maduro

Dois oligonucleotídeos são sintetizados, Oligo 1 e Oligo 2, com as sequências SEQ ID ND:2 e SEQ J.O N0:3 são sintetizados usando química de β-cianoeti1-fosforamidite num síntetizador Applied Siosystems 380A e são purificados usando purificação á base OPC (Applied Biosystems) como descrito pelo fornecedor. Ds

ol igonuc leotídeos purificados são ern primeiro lugar quinasados com pol inuc .leotideo quinase, e depois aos 65°C. A reacçSo é arrefecida aos anelados durante uma hora 37°C e a ligase DNA T4 é adicionada c<

ATR extra e a ligação é deixada incubar uma aos 65°C durante 1 min e feita 1 X no tampão outra para

EcoRI hora. A reaccão ê depois aquecida inactivar a ligase e depois diluída recomendado. A reaccão de ligação é depois digerida com EcoRI. O DNA é extraído com fenol e precipitado com acetato de sódio 0,3 M e com dois volumes de etanol. O precipitado é recuperado por centrifugação e ressuspenso em tampão TE 10 mM fSambroock et al . , 1389). 0 DNA sofre electroforese num gel de agarose a 8,0 % a uma temperatura de gelacão baixa e a banda que contém o gene sintético é excitada e ligada no sitio EcoRI de pBluesc r ipt(Stratangene). A reaccão de ligação é transformada em E. coli e colónias são seleccionadas e construtores putativos positivos são analizados primeiro por restrição à digestão e depois por Subsequências de DNA. Um constructor que é designado por pBSlypep>3 é determinado como contendo a sequência correcta e é escolhido para outros trabalhos.

8. Adição de uma sequência lateral 5' e do peptídeo s i na1 a pBSIy pep3 primeiro de 5' e o peptídeo sinal do gene PR—la são adicionados ao gene sintético usando um PCR basiado na técnica de fusão in vitro como descrito por Ho et al . (1389.). Nesta técnica a criacSo de dois uma fusão de gene ê feita in vitro através fragmentos com sobreposição das extremidades por PCR. Na novamente moléculas.

subsequente estes dois fragmentos são depois fundidos, por PCR, para gerar uma fusão perfeita entre as duas Esta estratégia é usada para fundir o peptídeo sinal F’R-la e o primeiro de 5·' à sequência que codifica o peptídeo lítico. Para conseguir esta fusão quatro oligonucleotídeos são sintetizados e purificados como descrito acima: SEQ ID N0;4, SEQ ID N0;5, SEQ ID NO;6 e SEQ ID NO:7.

Os oligos 3 (SEQ ID N0,‘4) e 4 (SEQ ID N0,'5) são complementares um ao outro e contêm a sequência de DNA desejada para a fusão entre o sinal PR-la e o primeiro de 5' e a sequência que codifica o peptídeo lítico. A fusão desejada estã no diagrama seguinte (SEQ ID NO:8).

O oligo 5 (SEQ ID NO:S) tem a mesma sequência como a extremidade 5' do DNAc de PR-la e contém na extremidade 5' uma sequência que codifica um sitio de restrição de EcoRI.

oligo 6 (SEQ J.D NO: 7) é complementado à. extremidade 3' do gene sintético que codifica o peptídeo lítico 3 e também con t é m um sítio EcoRI na e x t r e m i d a d e S' .

De modo a fundir duas peças de DNA, duas reacções de PCR são realizadas. Orna que usa o Oligo 3 (SEQ ID NO:4? e o Oligo & (SEQ ID N0:7) como os primários e o plasmídeo pSSLypepS como um modelo e o outro que utiliza o Oligo 4 (SEQ ID NO5 > e o Oligo -5 (SEQ ID NO: 6) como primários e ο ρIasmideos pSS—PR1013CIa (ATCC4042S) como um modelo. As reacções PCR são real, izadas usando o dispositivo Gene Amp· (Perkin Elmer/CETOS) como sugerido pelos fornecedores. Os produtos de PCR são analizados por electroforese de gel de agarose. Eles são depois purificados e uma aliquôta de cada um é usada no segundo estágio da reacção de PCR. Nesta reacção os primários, o Oligo 5 (.SEQ ID NOíSl e o Oligo 5 (SEQ ID NO: 7), são usados para aispliar o produto. Desta forma duas peças de DNA são fundidas na maneira pré-determinada explicada acima. Os produtos de reacção são analizados por electroforese de gel de agarose. 0 DNA é depois extraído com fenol e precipitado com etanol. e o DNA ressuspenso e digerido com EcoRI. Este DNA é depois purificado por electroforese num gel de agarose a temperatura de geíação baixa e ligado em pBIuescript que é digerido, com EcoRI e tratado com CIAR. 0 DNa é transformado em E. coli e os transformados sâo seleccionados. Plasmideos positivos construídos são registados por restrições à digestão e confirmados para a estrutura anticipada por sequências de DMA. Um desses construídos é designado por pBSL.F'5' F'R1 e é usado em experiências subsequentes .

C. Subclonação de gene de peptídeo litico em vector de expressão......35S duplo gene de peptídeo litico sintético com uma sequência de primeiro 5' e um peptídeo de sinal é subclonado no vector expressão da planta pCGW1761 (uma cassete de promotor UM CD 353 duplo/terminador que contém resistência a ampicilina).

pC'GM1761 que contém o promotor de UMCo 353 duplo e a região tm-1 3' com um sitio EcoRI entre eles continha uma estrutura de plasmideo derivada de pUC. A cassete do sitio de processamento do promotor EcoRI-3' é abordado por uma. restricção múltipla de sitios para remoção fácil. 0 plasmideo é derivado por uma série de passos (ver abaixo) a partir de um plasmideo 353 duplo inicial, pCGM2113, que ele próprio é derivado do PCGN164, e PCGM53S.

pCGN1431 também contém o promotor UMCo 353 duplo e a região tm-1 3' com múltiplos sitos de clonação entre eles. Esta cassete promotor/terminador é contida num vector derivado pUC que contém um gene de cloranfenicol em vez de um gene de resistência à ampicilina. A cassete é abordada por sitios de restrição múltipla para remoção fácil.

a Construção de pCGN986 pCGN386 contém um promotor VMCo 358 duplo e uma região T-ADN tm—1 3' com sítios de restrição múltipla entre eles. 0 pCGN'386 é derivado de outro plasmídeo, o pCGN206, que contém o promotor VMCo 358 e uma diferente região 3', a região VMCo VI extremidade 3'. 0 promotor VMCo 358 é clonado com um fragmento Alui <bp 7144-7734) (âsrdner et al . , 1981) no sítio HincII de M13rnp7 (Messing et al . , 1981) para, criar C514. Um EcoRI digere o C614 produz o fragmento EcoRI a partir de C614 que contém o promotor 358 que é clonado no sitio EcoRI de pUCC (Vieira and Mess i ng ,· 1982 ) pa ra pr oduz i r pCGN 147.

pCGN148a que contém uma região de promotor, marcador seleccionado (Kanafflycin com 2 ATGs) e região 3', é preparado por digestão de pCGN528 com BglII e inserção de fragmento de promotor BamHI-BglII de PCGN147. Este fragmento é clonado em sítios BglII de pCGN-528 de modo que o sitio BglII est-é. próximo do gene Kanamic i na de pCGN5.28 .

vector lançador, pCGN528, usado para esta construção é feito da seguinte forma,’ pCGN525 é feito por digestão de um plasmídeo que contém Tn5 que abriga um gene Kanasncina (Jorgensen et al . 1979) com HindiII—BamHI e inserção de fragmentos HíndlIIBamHI que contém o gene de resistência à kanamicina nos sítios Hindi II-BamHI no gene de tetraciclina de pACYC184 (Chang and Coben, 1978). G pCGM525 é feito por inserção do fragmento de BamHI 19 de pTiA6 (Thomashow et al. . , 1980) modificado com ligado— res Xhol inseridos no sitio de Smal, no sitio Bam.HÍ de pCGM525. 0 PCGN525 é obtido por apagar o pequeno Xhol e rei. igacão.

pCGH149a é feito por clonação do fragmento do gene de BamHI Kanamicina a partir de pMB9KanXXI no sítio de BamHI do pCGN148a. 0 pMB9KanXXI é uma variante pUK4K (Vieira and Messig,

1382.» que tem uma falta no sitio Xhol mas contém um gene de funcSo de kanaraicina do Tn303 para permitir uma selecção eficiente em ftgraõacteríuro.

pC6N143a é digerido com HindIII e BamHI e ligado a pUCS digerido com HindIII e BamHI para a produção de P-CGN163.

Isto remove o marcado) de são ambos digeridos com pCGN.20;

um plasmideo que kanaraicina Tn303. Cf pC'GN565 e o pCGN169 HindIII e PstI e ligados para formar contém o promotor VMCo 353 e parte da extremidade? S' do gene de kanamicina TNS (até o sitio PstI, Jorgensen et al., 1373). Uma região de regulação 3' é adicionada a pCGN203 a partir de pCGN204 (um fragmento EcoRI de MVCo <bp 408 - 6105) que contém a região 3' do gene VI subclonado em pUCIS (Ga.rdner et al. . , 1381) por digestão com HindIII e PstI e l igação. A cassete resultante, pCG'M206, é a base para a construção de PCGN986.

As sequénc ias pTIA6 T ADN tm 1 3’ são subc lonadas a. partir de fragmentos bamlS T-ADN (Thomashow et al., 1380) como um fragmento Ba.mHI-EcoRI (nucleotideos 306.2 a 12.823, numeração como em Barker et al., 1983) e combinados com o pACYC184 (Chang and Cohen, 1378) origim de replicação como um fragmento EcoRI-Hindi .1 e um marcador de resistência a gentaiaicina (a partir de pLB41), como um fragmento para a produção de pC6N417.

único sitio •Sma I de pCGN417 (nuc 1. eot í. deo 11.207 do fragmento BamlS) é trocado por um sitio Saci usando ligadores e o fragmento BamHI-SacI é sulclonado em pCGNSSS para originar PCGN971 . Cf sitio BamHI de pCG'M971 é trocado por um sítio ecoRI usando ligadores para originar pCGN371E. 0 fragmento EcoRI-SacI resultante de pCGN971E, que contém as sequências reguladores tm-1 3', é junto a pCGN206 por digestão com EcoRI e Saci para originar p,CGN375 . A pequena parte do gene de resisiténc ia. de ke.nami c ma Tn-5 é apagada ds. extremidade 3' do promotor VMCo 353 por digestão com Sal I e BglII, embotados as extremidades e ligação com ligadores Sall. A cassete da expressão final PCGN98G contém o promotor VMCo 358 seguido por dois sítios Sall, um sitio Xbal, região BamHI, Smal Kpnl e t-.m-l 3' (nucleotídeos 1.1.207 - 3023 do DNA—T).

b. Construção de pCGN164l □ fragmento de Alui de MVCo (bp 7144 — 7735) CSardner et al., 1381) é obtido por digestão com Alui e clonado na sitio de M13mp7 (Vieira and Messing, 1332) para criar C614. Uma digestão de EcoRI de C614 produz um fragmento de EcoRI ει paritr de C614 gue contém o promotor 35S gue é clonado no sítio EvcoRI de pUCS (Vieira and Messig, 1382) para produzir pCGN146. Para preparar a região promotora, o sítio BglII (pe 7670) é tratado com BglII e BaI31 e subsequentemente um ligador BglII é Ligado ao Ba’31 tratado com DNA para produzir pCGN147. 0 pCGN147 é digerido com EcoRI Hphl e o resultante fragmento EcoRI-Hphl gue contém o promotor 35S á ligado em EcoRI-Small digerido M13mp8 (Vieira and Messing, 1932) para criar pC6N164.

c. Construçgo de pCGN53ί produz

A digestão de VMColO (Gardner et al . , 1381) com EiglII um fragmento BglII gue contém uma região promotora 353 (bp 7670) gue está ligada no sítio BamHI de pUC19 (Norrander

1383 ) para cr iar ρCGN633.

d. Construção de PCGN2113!

pCGN164 é digerido com EcoRV

libertar ura fragmento EcoRV-BamHI que contém uma porção de promotor 358' (pe 7340 - 7433.'); pCGNSSS é digerido com HindIII e com EcoRV para libertar um fragmento Hindi 11-EcoRV gue contém uma porção diferente de promotor 358 (bp 3493 - 7340.'). Estes dois fragmentos são ligados em pCGNSSS gue foi digerido com HindIII e com BamHI para a remoção do fragmento HindiIΙ-BamHI gue contém o promotor 353; esta ligação produz pCGNSSS gue contém a estrutura e a região tm-1 3' de pCGNSSS e os dois fragmentos do promotor 358 a. paritr de PCGN1S4 e de pCGNSSS. 0 pCGNSSS é digerido com EcoRV e com Ddel para a libertação de um fragmento do promotor 358 (bp 7070 - 7340); o fragmento é tratado com fragemento Klenow de DNA polimerase I para criar extremidades embotadas, e está ligado no si tio EcoRV de pCGNSSS para a produção de PCGN2113 gue tem o fragmento na orientação apropriada.

θ· Construção de pCGN1761;

PCGN2J. 13 é digerido com EcoRi e o plasmídeo é ligado na presença de adaptor de DNA sintético gue contém sitio Xbal e um sítio BamHI (o adaptador gue contém extremidades apertadas a EcoRi em cada extremidade, mas as bases adjacentes são tais gue um sítio EcoRi não é reconstruído nessa localização) para a produção de pCGN.2113N. 0 pC'GN2113N é digerido para a completação com Saci e depois sujeito a. digestão parcial com BamHI . Este DNA tratado com polimerase de DNA T4 para criar extremidades td O Lr 53« LJ 1 :

embotadas e um ligador EcoRi é ligado a este plasmídec terminação embotada. Depois de transformação um clone de plasmídeo gue contém um único sítio EcoRi entre o promotor e a. região intacta tm~l e seIe c cιo nado e designado por PCGN1761 aaraenw

D plasmídeo pBSLF'5'PRl é degerido com EcoRi e aproxima— ragmento de 200 bp gue contém o gene do peptideo .lít-ico agarose de temperatura de gelacão baixa. Este fragmento estã ligado em pCGN1751 gue é digerido com EcoRI e tratado com CIAR e também purificado em agarose de temperatura de gelacão baixa. A reacçSo de ligação é usada para a transformação de E. coli e as transformaçBes são seleccionadas e depois registadas para a inserção. Dois tipos de transformação são recoperadas que diferem na orientação do gene do peptídeo lítico. Um tipo, em que o gene está, no sentido de orientação em relação ao promotor, é seleccionado e vários plasmídeos são verificados para a construção correcta de sequência de DNA. Um plasmídeo, que tem a orientação correcta e a sequência de DNA anticipada, é designado por pBS2X35SLy t-Pep e usado noutras experiências.

D. Subclonação da cassete de expressão de UNCo

2X353/peptídeo lítico num vector binário

A cassete de expressão é subclonada num vector de transf ormação de planta pCGNl-540 que contém limnites de ADSn-T direito e esquerdo de A. tumefacíens octopine Ti-plasmídeo pTIA6 (Currier and Nester, .1375), o gene de resistência de gentamicina de pPHiJI CHirsch and Beringsr, 1334), um plasmídeo Ri de A. rbizogenss Ri origem de replicação a partir de pLJSll (Jouanin et al., 1335), a região promotora mas uma região mas 3' de pTiAS com o gene de res isi tência a Icanamicina de TnS (Jorgenser. el al . 1379) um ColEl origem de replicação a partir de pBR322 (Bolívar et al . , .1377), e um gene marcador registavel lac,Z' ds pUC18 (Norrander et al., 1933). A estrutura de pCGN1540, que contém o gene de resisitência de gentímicina e as origens

ColEl, ê

ΓΠ S Γ C S ão de derivado de pCGN1532 (ver abaixo). 8s limites Ti e o gene dor seleccionável da planta (mas 5'— kan- mas 3'), PCGN1537; a cassete marcador selecionàvel da planta é por de PC6N1538, enquanto que o limite direito sua ve:

e os ti rada enquanto que e ο

J. imite fragmentos lacz' são derivados de pCGN565RBx2X, esquerdo é derivado de pCGM65.

a· Construção de pCGN1532:

O fragmento de 3,5 kb EcoRI-PstI que contém o gene de resistên+ia de gentamicina é removido de pPhl-JI CHirsch and Beringer, 1334) por digestão de EcoRI-PstI e clonado em EcoRI-Pstl digerido pUC9 (Vieira and Messig, 1932) para gerar pCGN543. A digestão de HindiII-PstJ de pCGN-549 origina fragmentos de 3,1 kb suportando o gene de resistência gentimicina, gue é feita com extremidades embotadas por fragmento Klenow de DNA polimerase I e clonados em PvuII digerido pBR322 (Bolivar et al., 1977) para criar pBR322Gm. 0 pBR322Gm é digerido com Dral e Sphl, tratado com enzima Klenow para ciar extremidades embotadas, e o fragmento 2,3 kb clonado na região Ri origem gue contém o plasmideo pLJbBl1 (..Jouanin et al . , 1935) gue foi digerido com Apal e feito com extremidade embotadas com enzima Klenow, criando pLHbBllfím. A origem ColEl extra e o gene de resistência kanamic.ina são apagados do pLHbBUGM por digestão com Ba.mHI seguido por auto-clausura para criar pGMBll. 0 sítio HindII de pGmBll é apagado por digestão de HindII seguido por tratamento com enzima Klenow e auto-, —clausura, criando pGmBll-Η. 0 sitio PstI de pGmBll-Η é apagado por digestão de PstI seguido por tratamento com enzima Klenow e auto-c1ausura, c riando pCGN1532.

b. Construção de pCGN1536:

fragmento 5,4 kb EcoRI é removido de pVK232 (Knauf and Nester, 1332) por digestão de EcoRI e clonado em EcoRI digerido pACVC184 (Chang and Cohen, 1973) para criar pCGN14. O fragmento 1434 bp Clal-Sphl de pCGN14, gue contém a região mas 5' (bp 2028 - 21562 de acordo com a numeração de Barker et al.,

1983) é cionado em AccI-Sphl digerido pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) para gerar pCGWSO. Um fragmento 746 bp EcoRV- Nael da região mas 5' é substituido por um sítio Xhol por digestão de pCGN40 com EcoRV e com Nael seguido por ligação na presença de um ligador Xho sintético de DNA para criar pCGN1036. 0 fragmento 765 bp SstI-HindIII (bp 18474 - 19239) de pCGN14, que contém a região mas 3', é cionado em Sstl-HindlII al. , 1983) para originar pCGN43.

substituído com um sítio EcoRI dades embotadas s i n té t i c o pCGN 1034 coloca bp cria i· pCGN1040. tratado com das, e ligado selecionado e m e do vector de é substituido Cver acima enzima XI e presença este recria é digerido ex t r em i d a d e s sin té t ico digerido pUC18 (Norrander et 0 sitio HindIII de PCGN43 é d i. ges tão c om HindIII, ext rem i e ligação de ligador EcoRI 0 fragmento 767 bp EcoRI de orientação que ¹ pa r a m 6s 11/ <t rem í dades embota— um clone é de bp 18474 em pCGN1040) O PCGN565 atado com ligado na PCGN1003; 0 pCGN 1003; para criar presença de ligador PstI □ fragmento 1,5 kb Xhol de po r c om enz i ma K.1 enow, de ADN para criar pCGN1034.

é cionado em EcoRI digerido pCGN1036 na 19239 da região mas 3' próxima da região mas 5' pCGN1040 é sujeito a digestão parcial com polimerase de DNA T4 para criar e;

na presença de ligador Xhol de DNA; que unicamente o sitio SstI na junção

DNQ (construído em pCGN43 e car regado por um sítio Xhol para gerar P-CGN1047.

é digerido com EcoRI e com HindIII, tr ’,cw para criar extremidades embotadas, e de ligador Xhol sintético de DNA para criar o sitio adjacente EcoRI ao ligador Xhol. com EcoRI,· tratado com enzima .Xlenow embotadas, e Iigado na de DNA para criar· pCGN 1007.

pCGN1047, que contém a região mas 5' e a região mas com um s it io de pCGN1007 c 1 o n a c ã o m ύ 11 i ρ 1 o e n t r' pa ra. c onst ru i r pCGN 105 eles, cionado a Xhol digerido

i.. im a ρ o r c ã o d e s £ t i o s d e c I o na c 3 o m ύ 1 tipi a. apagado por digestão com Xba.I e SstI, tratada com para formar extremidades embotadas, de pCGN1052 é e η z i m a K1enow gerar ligado para pCGN10S2ó'XS . 0 fragmento 1 kb EcoRI-Smal de pCGNSSO Cdescricão de PCGN7831, que contém o gene de resistência 1 ATG-kanamicina, é cionado em Bluescript ΙΊ13-Κ9 EcoRI-Smal digerido (Stragene, Inc) para criar pBSKm; este plasmideo contém a região 1413 que permite a geração de uma cadeia, simples de DNA. A cadeia simpj.es de DNA é gerada de acordo com as recomendações do fornecedor, e a al

188-4./ usando muta.gene in vitro é realizada (Adelman et oligonucleotídeo sintético (SEQ ID NO:14) para alterar um siti de Rst-I dentro do gene de resistência de kanamicina e torná-1 indigestível, criando pCGN1534. 0 pCGN1534 é dirido com Smal um ligado na presença de 1igador EcoRI a 0 fragmento 1 kb EcoRI de PCGN1536 é EcoRI digerido para criar a cassete marcador planta mas5'-kan mas3' pCGNa53£·.

DNA para gerar pCGN1S35. cionado em pCGN1052£XS de ;elec ionável de

c. Construção de pCGN555RAx2X pCGN451 Cdescricão de pCGN7831 é digerido com Hpal e ligado na presença de 1igador Sphl sintético ao DNA para gerar pCGNSS. O fragmento Xhol—Sphl de pCGNSS (bp 13800 - 15208, que inclui o limite direito, de DNA—T de A. tumefaciens

Baker al

1383) é cionado em pUC1.9 de Sal I-Sphl. digerido (Yanish-Perron et al H i ndIII—BamHI de para pCGNSO é criar pCGNSO . 0 f ragmentc

1,4 cionado em pSF'64 de Hindi II-BamHI digerido (Promega, Inc) para gerar PCGN1039. 0 pC6N1039 é digerido com Smal e com NruI (apagando o bp 14273

15208; Baker et al., 19831 e ligado na. presença de 1 igador BglII sintético ao DNA 0,47 kb Eco-HindiII de

Eco—RI—HindiII digerido 0 sitio criando pCGN1039áNS. O fragmento de pCGN1039ó'NS é cionado em pCGN565 de

Γdescri to na discrição de pCFN7833 para criar pCGN565RB de HindIII de pCGN565RB é substituído com um sítio de Xhol por digestão de HindIII, tratamento com enzima Klenow, e ligação na presença de ligador Xhol sintético ao DNA para criar pCGN565RB—Η+Χ. 0 pUC18 (Norrander et al., 1383) é digerido com HaelI para libertar um fragmento lacZ', tratado com enzima Klenow para criar extremidades embotadas, e o fragmemto que contém lacZ' ligado em pCGN565RB-H+X, que foi digerido com Accl e com Sphí e tratado com enzima Klenow, em tal orientação que o promotor lacZ' está próximo ao fragmento do limite direito; nesta construção, pCGN565Bx2x é positiva, para a expressão lacZ' quando colocado num prato num hospedeiro apropriado e contém bp 13990 — 14273 do fragmento do limite direito (Barker et al . , 1983) que apagou o fragmento Accl-Sphl (bp 13800 — 13390).

d . Construção de pCGN65 ;

O pCGNSOl é construído por clonação de um fragmento 1,85 kb de EcoRI—Xhol de pTiA6 (Currier and Nester, 1976) que contém as bases 13362 —15208 (Barker et al., 1383) do DNA—T (limite direito), em M13mp9 de EcoRI-SalI digerido (Vieira and Messig, 1982). 0 pCGN502 é construído por clonação de um fragmento 1,6 kb HindIII-Smal de pTiA6, que contém as bases 602 - 221.2 de ADN-T (limite esquerdo), em M13mp9 de HindIII-Smal digerido. 0 PCGN501 e o pCGN502 ambos digeridos com EcoRI e com Hindi II e ambos contendo fragmentos de DNA-T clonados em pUC3 de HindiII digerido (Vieira and Nessing, 1982) para originar pCGN503, de fragmentos de DNA-T de ambos limites. O pCGN503 é digerido com HindIII e com EcoRI e os dois fragmentos HindiI Ι-EcoRI resultantes (que contêm os limites de DNA-T) são clonados em pHC79 de EcoRI digerido (Hohn and Collins, 1980) para gerar pC6N518. 0 fragmento Kpnl-EcoRI de pCGN518, que contém o limite esquerdo de DNA—T, é clonado em pCGN565 de Kpnl—EcoRI digerido para gerar PCGN580. 0 fragmento de BamHI-BglII de pCGNSSO é clonado no sitio BamHI de pCYC184 (Chang and Cohen, 1378) para criar pCGNSI. 0 fragmento 1,4 kb de BamHI-Sphl de p'CGN60 (ver pCGN6Sx2X na secção anterior) que contém o fragmento do limite direito de DNA—T, cionado em pCGN51 de BamHI-Sphl digerido para criar pCGN55.

e. Construção de pCGN1537 pCGNSS é digerido com Kpnl e com Xbal, tratado com enzima Klenow para criar presença de ligador de extremidades embotadas, e ligado na BglII sintético ao DNA para criar pCGN65£K.X. 0 pC6N55£KX é digerido com Sall, tratado com enzima Klenow para, criar extremidades embotadas, e ligado na presença de ligador Xbol sintético ao DNA para criar pCGN65£KX—S+X. O fragmento 728 bp BglII-Xhol de pCGNRBx2X, que contém o limite direito de DNA-T e o gene lacZ' , é cionado em pCGN656'KX-S+X de BglII-Xhol digerido, substituindo o pC'GN65x2X . O fragmento Ciai de pCGN6Sx2X é apagado com ligador Xhol por digestão com Ciai, tratado com enzima Klenow para criar extremidades embotadas, e ligado na presença de ligador Xhol sintético ao DNA para criar pCGNS5£2XX. 0 pCGN5552XX é digerido com Bgll e fundido com P-CGN549 de Bgll digerido (ver pCGN1532 na seccão anterior) para criar pCGNISSO que contém ambos plasmédeos; de estrutura. O pCGNISSO é digerido com Xhol e religado, depois um clone sensível a cloramfenicol e resistente a gentamicina é escolhido que tem apagado a estrutura derivada, de p.ACYClS'4, criando pCGN1530A. 0 fragmento .2,43 kb Xhol de pCGN153S, que contém a cassete de mas5' -kan~mas3' > é cionado em pCGN1530A de Xhol para criar pCGN1537.

f. Assembleia final de P-CGN1540 fragmento BglII de fCGN 1-537, que contém o gene ircador se.l ec c ionável de planta e o gene marcador regitá.vel

l.acZ' (com múltiplos sitos de clonação), de DNA-T, é cionado em pCGN153‘2 de BamHI orientação a suportar o limite directo todos entre os limites d i ge r i do. Um c .1 o ne de do DNA-T adjacente à origem pBR322 de replicação é designado por pCGN1539, e a orientação suportando o limite esquerdo do DNA-T adjacente à origem do plasmídeo Ri da replicaçSo é designado por pCGN1540. Estes vectores binários têm várias vantagens, que incluem uma quantidade mínima de DNA entre os limites de DNA-T, alta estabiI idade em hospedeiros Agrobacterium,· número de cópia elevado em hospedeiros E. coli, e um registo azul/branco com vários sítios de restrição para uma clonação simples do DNA alvo..

vector foi depositado em ATCC <ATCC' 40-586). 0 fragmento Xbal de pBS2X35SLy t-Pep, que contém o gene do pept-ídeo lítico, é subclonado no sítio Xbal de pCGN1540 de tal forma que o fragmento promotor está próximo do gene marcador seleccionável da planta. Este plasmídeo é designado por pBSBin2X35SLyPep e é seleccionado para outras experiências.

Ε. Transformação de Agrobaeterium

Os vectores binários são transformados na estirpe A. tumefaciens LB4404 pelo método seguinte. A estirpe Agr oba c ter .i um é crescida aos 30°C durante a noite em 5 ml de meio LBMG <50 % de caldo, 50 % de caldo de manitol-glut-amase (Garfinkel and Nester, 1980)). A cultura de 5 ml é adicionada a 250 ml de LBMG e agitado vigorosamente até que a densidade da cultura atinga um 0D = 0,6 a um comprimento de onda de 600 nm. As células sSo depois recolhidas por centrifugação a 8000 X g e ressuspensas em

200 .ul de células são adicionadas a 0,2 a. 1 binário de DNA em LEMG e a mistura é congelada imediatamente em banho de gelo seco/etanol. Depois de 5 minutos o tubo é colocado num banho de água a 37°C durante 5 minutos e depois 2 ml de LBNG é adicionado. A suspensão é deixada num banho de água aos 30°C durante 2 a 3 horas e depois as células são recolhidas por centr i fugação . As células são ressuspensas num voxume mínimo oe >1 de LBMG.

US de plasmídeo

LBMG e depois colocado num prato num meio selectivo (pratos de LBMQ com 100 ,ug/ml de gentamicina). As colónias aparecem depois de 2 a. 3 dias aos 30°C.

plasmídeo pBSB2X35LyPep é transformado em Agrobacterium e as colónias positivas são seleccíonadas e verificadas por análise da mancha Southern e usado para experiências de transfor— mação de plantas.

Exemplo 8;

Transformação estável e Regeneração de plantas Transgénicas

Tecido de planta é transformado com os vectores descritos acima através de qualquer técnica conhecida no ramo. Estes métodos usados para transrerir o DNA para a célula da planta incluem, por exemplo, infecção directa de ou co-cultivacão das plantas, tecido de plantas ou células de plantas com A. t-umefaciens (Horsch et al., 1385; Marton, 1384), tratamento de protoexogenouso por métodos como os descritos em (1384); EP 164 575; Shillito et al. <1985);

Potrykus et al. <1985); Lorz et al.(1985); Fromm et al.

GB 2.140.822; e Negrutiu et al. <1987); incubação com plastos com DNã Paszkowski et al <1987);

po1 i e t i — leno-glicol <PEG) (Negrutiu et al., 1987); micro-injecção CPeich et al . <1986a e b)3; bombardiamento de microprojécti1 (Klein et a1., 1987).

A. Transformação de disco de folha de Tabaco

Agrobacterium são crescidos durante 18 a 24 horas em meio de sal de glutamate ajustado a pH 5,6 e suplementado com 0,15 % de manitol, 50 ,ul/ml de kanamicina, 50 ,ul/ml de espec ti nomicina e 1 mg/ml de estreptomicina antes de eles serem diluídos em 0D600 de 0,2 no mesmo meio sem antibióticos. As bactérias são

ε-7« depois crescidas durante três a cinco horas antes de diluição num 00600 de 0,2 a 0,4 para inoculação dos discos ds 5 a 7 mm tirados por punção das folhas de crescidas asepticamente

Nicotiana tabacum cv. em recipientes GA7, xanthi que foram seguido por uma modificação do método de Horsch et al . (1985).

Os discos de folhas são mantidos em 0,7 % de agar que e menores (MS), 1 a-naf ta1enoa cético contêm sais de Murashige e Skoogs principais mg/l de benziladenina e 1 mg/ml de ácido durante dois dias antes de serem transferidos para o mesmo meio que contém 50 /jg/ml de Kanamicina, 100 ,ug/ml de carbenic i 1 ina e 100 yjg/ml de mefoxina. Germinações que se formam nos discos são excitadas e propagadas até que seis rebentos são obtidos subcultura das tiras de germinações em meio MS que contém ,ug/ml de kanamicina em recipientes GA7.

por

Os rebentos são enraizados no meio que contém hormonas e 50 jug/ml de kanamicina, transferidos para o solo e endurecidos em fitroton .indução do antes de serem transferidos para uma estufa. para tratamento com reguladores químicos. No tempo da floração as flores são induzidas a auto-polinizarem-se. Sementes são colhidas na maturação seguinte.

B. Produção de Plantas e Callus de Tabaco Transgénico

Agrobacterium é usado para a de callus a num meio de partir dos discos de folha selecção MSBN que contém transformação da formação í. A) . A f or ma c So de c a 11 us kanami.cina é mantido num meio de crescimento de callus que compreende sais principais e menores MS e Pe—EDTA (Gibco 500 1117, 4,3 g/1 ) , vitaminas MS, 100 mg/l de mio—inositol, 20 g/1 de sacarose, 2 mg/l de ácido naftalenoacético e 0,3 mg/l de cinetina.

regenerar cal lues para

Os callus podem ser usados para transgénicas por transferência de peças dos MSBN e seguido pelos métodos descritos em A.

C. Transformação de Cenouras

Agrobacterium são crescidos conto descrito bactérias, diluídas em 0D600 de 0,2 a 0,4, são depois inoculação dos discos cortados a partir de superfície plantas o me i o em A. As usadas para de cenouras es te r i1izadas.

Para esterilizar a superfície as cenouras, elas são peladas e depois embebidas durante 20 minutos numa solução a 10 % de clorox. As cenouras são lavadas com água esterilizada, cortadas em pecas de 5 mm e colocadas pelo lado da base em água e agar. 20 a 50 jul de bactérias são depois aplicados na superfície superior dos discos.

D. Transformação de Girassol bactérias, noculacSo eguinte f

Ag roba c te r i um diluídas em dos caules orma;

são crescidos 0D600 de 0,2 das plantas de como descrito em A. As a 0,4, são usadas para girassol preparadas da

Sementes de girassol são embebidas durante 10 minutos lorox e tes são em aga r em 10 % de lavagem com removidos e captano seguido por 10 minutos em 10 % de c água esterilizada. 0s revestimentos das semen as sementes são germinadas em 0,7 % de água no escuro durante três dias, após os quais eles são colocados num incubador de linha de laboratório a 23°C com um dia de 12 horas e noite. As sementes cresceram durante uma semana antes de serem cortadas e inoculação da bactéria na superfície do caule cortada.

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas a um OD600 de 0,2 a 0,4, são depois usadas para inoculação de pés de sementes de tomate preparados da forma seguinte:

Ε. Transformação de Tomate

Sementes de tomate são embebidos durante 20 minutos em 10 % de clorox e lavados com água esterilizada. As sementes são germinadas em 0,7 % de âgua em agar no escuro durante três dias, depois dos quais são colocados num inoculador de linha de laboratório a 23°C com 12 horas de dia e noite. As sementes cresceram durante uma. semana antes da colheita e da ínoculacão das bactérias na superfície do pé cortada.

F. Transformação de algodão

Agrobacterium são crescidos como descrito em A. As bactérias, diluídas a ODSOO de 0,2 a 0,4, são depois usadas para inoculação dos coti. ledóneos de algodão preparados da forma seguintes:

As sementes de algodão são embebidas durante 20 minutos em 10 % de clorox e lavados com água esterilizada. As sementes são germinadas em 0,7 % de água em agar no escuro. As sementes cresceram durante uma semana antes das bactérias serem introduzidas na supe r f í c i e do c o t· .i 1 edóneo .

G. Preparação de um Tipo especial de Callus de Zsa mays, da Produção Elite......da.......linha Infectada 2717

Plantas de zsa mays da linha de produção Infectada 2717 cresceram até floração numa estufa, e auto-polinizaram-se. Espigas imaturas contendo embriões de aproximadamente 2 a 2,5 mm em comprimento são removidas das plantas e esterilizadas em solução de 10 % de Clorox durante 20 minutos. Os embriões foram aseptieamente removidos dos núcleos e foram colocados em pratos com o eixo do embrião na direcção do meio OMS que contém 0,1 mg/12,4-D, 6 % Cp/v) de sacarose e L-proline 25 mM solidificada com 0,24 % (p/v) de Qerrite^ (meio durante duas semanas inicial). Depois de cultura no escuro a 27°C, o desenvolvimento de callus no escutélio é removido do embrião e colocado num prato em meio B5, (Gamborg et· al , 196S), que contém 0,5 mg/1 2,4-d e R solidificou com 0,24 % (p/v) de Gelrite . 0 callus é subeultivado em todas duas semanas em meio fresco. Depois de um total de oito semanas depois da. colocacão dos embriões no meio inicial, o tipo especial de callus é identificado por morfologia caracteristica. Este callus é subeultivado ainda no mesmo meio. Depois de um outro período de dois meses, o callus é transferido para, e subcultivado esteri1iamente em, meio N6 que contém 2 mg/1 2,4-D e so1i f i c ou c om Ge ]. r i te^'.

H. Preparação de uma Cultura de Suspensão de Zea mays, da produção Elite Infectada 2717 callus descrito em G é subcultivado durante um total de pelo menos seis semanas subeultura é relativamente t· i po de c a 11 us não muc i1ag inouso, escolhido para. a g r a nula r e mui to friável, de modo que é separado em pequenos agregados de. células individuais colocados no meio liquido. Culturas contendo agregaexpandidas não são retidas. Aproximadamg de callus especial de Zea mays da produção elite infectada 2717 são colocados em 30 ml de meio MS que contém 2 mg/1 .2,4~D em frascos de 125 ml Delong. Depois de uma semana de cultura a 26°C no escuro num agitador circular (ISO dos com células grandes, mente a1i quôtas de 500 rpm, com pás de 2,5 cm), o meio é substituído com meio fresco. As suspensões são novamente sulcultivadas deste modo depois de outra semana. A esta altura, as culturas são inspeccionadas, e aquelas em que não há indicacão de um grande número de células expandidas

- 56 são retidas. As culturas em suspensão que contém agregados com células grandes, expandidas são descarregadas. 0 tecido preferido consiste em agregados de células que se c i t-oplasma ti camente que têm uma superfície mais suave do que o tipo usual culturas retidas têm pelo menos nesses agregados pequenos. suspensões também têm uma dividem densamente carac te ri s t i c amente de agregados de células. As 0 % de células representadas

Isto é a morfologia desejada. Estas velocidade de crescimento rápido, com um tempo duplo menor do que uma semana. As culturas de suspensão são semanalmente subcultivadas por transferência de 0,5 ml de PCV ívolume de célula em recipiente: volume da célula indicado numa pipeta) em 25 ml de meio fresco. Depois de quatro a seis semanas de subcul tura desta forma, as culturas aumentam dua.s a três vezes por semana de subcultura. A culturas em que mais do que 75 % das células de morfologia desejada são retidas durante outra subcultura. As linhas são mantidas sempre por escolha para a subcultura do frasco cujo teores exibem a. melhor morfologia. A filtração periódica através de peneiras de aco inoxidável com dimensão de poro de 650 jum todas as duas semanas é usada em alguns casos para aumentar a dispersão das culturas, mas não é necessária.

I. Preparação de Protoplasmas a partir das Culturas de

Suspensão de Zea mays a 1,5 ml de PCV de células de como preparadas em H são incubadas em 10 a estereiizada por filtração que consiste em RS com 1 % (p/v) de Phozyme em solução de : KClJ 16,47 g/1 de MgCl. 6H.-,Cí e 12,5 g/1 de cultura em si 15 ml de uma 4 % (p/v) de c sa i s LMG '. 6', 65 CaC 1.Η,.,0; 5 ispensão mistura elulase g/1 de g/1 de

Mes, pH 5,6). A digestão é realizada em 3Q°C num quadro de agitação lento durante um período de 3 a 4 horas. A preparação é registada sob microscópio invertido durante a libertação do protoplastos. CJs protoplastos que são libertados são recolhidos da forma seguinte,' A preparação é filtrada através de uma peneira de malha de 100 ,um, seguido por uma peneira de malha de 50 ,um. Os protoplastos são lavados através de peneiras com um volume de solução de sal KMC igual ao volume original da solu ml de preparação de protoplastos é colocada em vários tubos de centrífuga plásticos disponíveis, e solução de sacarose 0,6 M (tamponizada. a pH 5,6 com ácido 1inoetano-sulfónico a 0,1 % (p/v) (MES ε KOH)) em camadas por debaixo. 0 tubo é centrifugado a 60 a 100 x g durante 10 minutos, e a camada de protoplastos na interface é recolhida usando uma pipeta, num novo tubo. A preparação de protoplastos é ressuspenso em 10 ml de solução de sal KMC fresca, e centrifugada durante cinco minutos a. 60 a. 100 x g. 0 sobrenadante é removido e descarregado, e o protoplastos ressuspensos suavemente na gota restan te, e depois 10 ml de uma solução KMC de poder 13/14 é gradualmente adicionada. Depois de centrifugação novamente durante cinco minutos, o sobrenadante é novamente removido e os protoplastos ressuspensos numa solução de KMC de poder· 6/7. Uma aliquôta é tirada para contagem, e os protoplastos novamente sedimentados por centrifugação. Os protoplastos são ressuspensos a. 1(2 por ml

olução de	enzima.
	cada	um dos
i e	1,5 a	2 m 1 de
c oro	ác ido	morfo-

em meio KM-Sp ou manitol 0,5 M que contém MgCl._, 6 mM ou em meio adequado para ser usado na transformação.

?u t r o

J · Transformação de Protoplastos de Zea roays poi

Ε1 e c t r opo ração

a. Todos os passos â excepcão do choque por aquecimento são realizados à temperatura ambiente (22 a 2S°C). Ds protoplastos são ressuspensos no último passo ds I em manitol 0,5 M que contém 0,1 % (p/v) de MES e MgCl_o 6 mM. A resistência desta suspensão é medida numa câmara de um Di.alog Electroporator (DIA-LOG GmbH, D-4000 Dusseldorf 13, German·/) e ajustado a 1 a

1,2 kft usando uma solução mgCl._, 300 mM. Os protoplastos sofrem choque por aquecimento por emersão do tubo que contém a amostra em banho de ãgua aos 45°C durante cinco minutos, seguido por arrefecimento â. temperatura ambiente em gelo. 4 g de plasmideo linearizado que contém um gene de resistência bigromicina seleccionável da planta como descrito por Rothstein et· al . <1987), ou gene quimérico constroi-se e 20 ;jg de ADN suporte de t-imus de vitela são adicionados a aliquôtas de 0,25 ml desta suspensão. 0,125 ml de uma solução F'EG a 24 % <p/v> (PM 8000) em manitol 0,5 30 mM são adicionados aos protoplastos. A mistura é bem misturada mas gent-i 1 mente, e incubada, durante 10 minutos. A amostra é transferida para uma câmara do electroporador e as amostras sofrem impulsos três vezes em intervalos de 10 segundos, às voltagens iniciais de 1500, 1800, 2300, ou 2800

Vem ~, e um t-empo de descida exponencial de 1 /jseg.

M que contém MgCl,

Os protoplastos foram cultivados da seguinte forma. As amostras são colocadas em pratos de preti de 6 cm à temperatura ambiente. Depois de 5 a 15 minutos, 3 ml de meio KM-8p que contém

1,2 % (p/v) de agarose SeaPlaque e 1 rol/1 2,4-D são adicionados.

A agarose e ge1i f i c a r.

os protoplastos são misturados e me i o é de i. xado

b. a é repetido com um ou mais das modificações seguin(1) A resistência da ajustado a 0,5 a 0,7 ΚΩ.

preparação do protoplastos (2) 0 PE6 usado é PEG com um peso molecular de 40000.

(8) No F'EG é adiei nado, ou metade do volume de F’EG a 12 % ( ρ/ v) é adie i ona do.

impulsos são aplicados en) intervalos de três (5) Os protoplastos são colocados em pratos depois de electroporacão colocados numa placa arrefecida a uma temperatura de 16°C.

(6) Os protoplastos são colocados em tubos depois de passo de electroporacão, lavados com 10 ml de solução de KMC de poder 6/7 ou com solução W5 (que compreende 3S0 mg/1 de KC1 ; 13,375 g/1 de Ca.Cl.-,. 2H.-.0; 9 g/1 de NaCl; 9 g/1 de glucose, pH 6,0), depois recolhidos por centrifugacão a 60 x g durante 10 minutos, ressuspensos em 0,3 ml de meio KM, e colocados em pratos

C ΟΠ'ρΣ¹ 3 .

(7) 0 DMfí suporte de timus de vitela não é adicionado.

K. Transformação de Protoplastos de Zae mays por

Tratamento com PE <3

a. Os protoplastos são ressuspensos no último passo de I em solução de manitol 0,5 M que contém MgCl._, 12 a 30 mM. Um choque por aquecimento de 45°C durante cinco minutos é dado como descrito em J. Os protoplastos são distribuídos em aliquôtas para transformação em tubos de centrífuga, 0,3 ml de protoplastos suspensos por tubo. Durante os próximos 10 minutos o seguinte foi adicionado; DNA (como para J) e Solução F’LG (F'M 600o, 4 % (p/v); que contém Ca (no.-,).-, 0, 1 M e manitol 0,4 M; pH 8 a 9 com KOH) para originar uma concentração final de 20 % de F'EG. As aliquôtas são incubadas durante 30 minutos com agitação suave ocasional, e depois os protoplastos são colocados em pratos de preti <0,3 ml da suspensão de protoplastos original por prato com 6 cm ds diâmetro) e cultivados como descrito em J.

s depoi s de adição de ois o três sob renadanno Exemplo

b. a é repetido e os protoplastos são lavado 30 minutos de incubação numa solução de PEG de a por 0,3 ml de solução WS cinco vezes em intervalos de d minutos. A suspensão de protoplasto é centrifugada, o te é removido, e os prtoplastos são J. a.

c u11 i vados c orno c .

c onc en t r a ç ão a e b são repetidos com a modificação de final de PEG está entre 13 e 25 % (p/v) .

gue

Regeneração de Callus a partir de Protoplastos

Os pratos gue contêm os protoplastos em agarose são colocados no escuro a 26°C. Depois de 14 dias, colónias c rescem dos protoplastos. A agarose gue contém as colónias é transferida para a superfície de um prato de preti com 3 cm de diâmetro que contém 30 ml de meio N6 gue contém 2 mg/l 2,4-D, solidificou com 0,24 % (p/v) de Gerlite^. Este meio é referido como 2N6. 0 callus é cultivado no escuro aos 26°C e as peças do callus subcultivado todas as duas semanas em meio 2N6 sólido fresco.

M. Selecção de Callus Transformado de Zea mays

L é repetido com a modificação de gue 100 mg/l ou 200 mg/l de bígromicina B é adicionado ao meio 2N6 de modo a seleccionar as células transformadas.

a. Callus é colocado num meio INS para manutenção e num meio CNS (gue compreende o meio NS com falta de 2,4-D) e meio NS!

< gue compreende meio NS gue contém

Ν Regeneração de Rla.ntas de mi. lho de em

8400 meio es te

0,25 mg/l 2,4-D e 10 ml/1 0 cresci men to de c a 11us meio DNS e NS1 é feito à luz <16 horas/dia de luz de 840 a l.xde lâmpadas fluorescente brancas). D callus gue cresce em NS1 é transferido para, o meio DNS depois de duas semanas, este tempo prolongado em meio MSI é fundamental. 0 callus é sul cultivado todas as duas semanas mesmo se o callus deva ser transferido novamente para a mesma formulação do meio. Rebentos aparecera após cerca de quatro a oito semanas. Uma vez gue os rebentos têm pelo menos 2 cm de altura, eles são transferidos para meio DNS em recipientes GA7 . As raízes formaram-se em duas a guatro semanas, e guando as raízes parecerem suficientemente bem formadas para suportarem o crescimento, os rebentos são transferidos para o solo em potes de turfa, sob uma sombra ds luz para os primeiros guatro a sete dias. É normalmente útil inverter um copo de plástico transparente sobre os transplantes durante dois a três dias para, asisti.rem ao seu endurecimento, 'uma vez gue as plantas estão estabelecidas, elas sáo tratadas curou milho e crecem para amadurecerem na estufa, plantas progénies elas são auto-polinizadas tipo bravo.

plantas normais de De modo a obter ou cruzadas com o

b. a é repetido com a modificação de gue 100 mg/l ou

200 mg/1 de higromicina 8 é adicionado ao meio usado para manter o c a 11us.

Ο· Preparação de Suspensão de Embriogénico de Tecidos de Dactylis glomerata L.(pomar de erva)

a. Callue eiftbríogénirci é iniciado a Partir de setcSes da base de folhas mais novas de plantas pomar de erva como descrito por Hanning and Conger (1932). As folhas são esterelízadas na superfície por emersão numa diluição de 1:10 de solução Clorox (5,25 % (p/v) de hipocloreto de sódio; The Clorox Company, OacKland, Ca) durante cerca de 10 minutos e depois cortadas aseptivcamente em pequenos segmentos de 1 a 5 mm de comprimento ou em diâmetro. Estes segmentos são colocados em pratos num meio SH-30 esterelizado que contém 0,8 % (p/v) de agarose como um agente de gelação. Estruturas de callus e/ou embriogénico aparecem em 2 a 6 semanas depois da plantação, depois cultura a cerca de 25°C. Callus embriogénico é mantido por subcultura em meio SH-30 fresco todas as 2 a 4 semanas e cultura no escuro aos 25°C.

b. Culturas de suspensão embriogénicas são iniciadas por colocação em pratos de aproximadamente 0,5 g de peso fresco de callus embriogénico em 50 ml de meio liquido descrito por Gray and Conger (1985) que contém dicamba 45 ,uM e 4 g/1 de hidrolisa— to de caseína. As culturas de suspensão cresceram aos >C sob 15 horas de luz (3300 ix), 8 horas de fotoperíodo de escuro num agitador giratório a cerca de 130 rpm em frascos de 125 ml Delong R c om uma tampa quatro semanas durante cerca metálica e parafilm. Depois de aproximadamente os grupos de arbustos são deixados assentar de 30 segundos e aliquôtas de 10 ml do meio sobrenadante que contêm grupos de células pequenas são removidos e transferidos para 50 ml de meio fresco. Este processo é repetido todnis as a 4 semanas usando as cul. turas com mais sucessu como julgadas pela dimensão dos grupos de arbustos mais pequenos e a melhor qualidade na base da presença de células citoplasmicas, pequenas. Depois de 5 transferências a;

fc-3 essencialmente livres de células não embriogénicas e a maioria dos grupos de células embriogénicas são bem pequenas <150 a 2000 ;jm) .

F'. Isolamento e Purificação de Protoplastos D. glomerata L.

Os protoplastos são preparados a partir de culturas de suspensão embriogénica. de 0 por filtração aseptica das células numa unidade de filtração Nalgene^ 0/2 um e depois adição de 0,5 g de peso fresco de células a cada 12,5 ml (p/v) de Cellulase RS, CaCl._,. Η,.,0 7mM, NaH..,F‘O^ . Η,.,0 0,7 mM, MES 3 mM <pH 5,6), glucose <550 mOs/Kg de H.-.0 de pH 5,6), e é esterel izado por filtração mistura é rodopiada num agitador ofusca << 400 lx) durante 4 a peneirada através de uma peneira jrbital a. cerca de 50 rpm em luz horas. A digestão é depois de aço inoxidável (dimensão de malha 100 ;.im) e distribuída em tubos centrífuga de 12 ml que são centrifugados a cerca de 60 a 100 x g durante cerca de 5 minutos. 0 sedimento que contém o protop.lasto é depois lavado trés vezes com meio de cultura de protoplasto KM-Sp ajustado a 550 mOs/kg de H,,0 com glucose. A esta altura o passo de flotaçSo pode ser incluído para outra purificação dos protoplastos. Neste caso, os protoplastos lavados são encarnados em 10 ml de meio de cultura KM-8p ajustado a 700 mOs/kg de H._,0 com sacarose. Depois de centrifugação a 60 a 100 x g durante 10 minutos, os na interface são recolhidos usando uma pipeta fina.

>s protoplastos são resuspensos em 1 a protoplastos FinaImente, m1 de me i o de c u11u r a

KM-8p e peneirado através de um placa de malha de aco inoxidável (dimensão de malha de 20 /jro). Os protoplastos libertados são recuperados e lavados e ressuspensos em meio KM-8p para cultura, ou num meio ajustado osmot i ca.mente para a transformação.

ίΣ /1

Q · Cultura de Protoplastos de D, glomerata L... e crescimento de Callus

a. Os protoplastos purificados são colocados em c a uma densidade de cerca de 5 x 10 protoplastos por ml num meio· de cultura KM-8p que contém 1,3 % (p/v) de agarose SeaPlaque^R (FMC Corp., Maríne Colloids Diuvion, Rock 1and, Maine, USA) e 30 a % (p/v) de meio condicionado (obtido de culturas de suspensão de D. glomerata L. embriogénico de 3 a 4 semanas de idade por R filtração do meio através de filtro Nalgene esterilizado 02 glucose, colocados 2S°C. Depois de 10 a c o1o c a da em c u 11 u r a tornado o meio a 550 mOs/kg de H...0 por adicã·novamente esterelizacSo). 0s pratos escuro a uma temperatura constante de dias a agarose é cortada em cunba e contas como descrito por Shillito et al. , (1933) usando 20 )-im, θ

no de m .1 por são j S 3 5 C α i' ϋ 3 í¹ Os pratos meio de cultura de suspensão SH-45 com 3 % (p/v) ml de cultura embebida de agarose original colocados num agitador de plataforma e agitada a cerca de 50 rpm à luz a 370 Ix. Novas culturas de suspensão são formadas à medida que as colónias crescem de agarose e libertação des células no meio 1x gu i do. colocadas em

As células cultivadas de suspensão resultantes são pratos em meio SH-30 solidificado e de agar e colocados oa. escuro a 25°C até gue o callus seja formado

b. 0s protoplastos são cultivados como descrito aci excepção do meio de cultura conter nenhum meio condicionado.

R · Transformação de Protoplastos de D. glomerata. po;

meio de Electroporação

a. Imediatamente depois de purificação dos protoplasatos, a electroporação é realizada de acordo com Shilito et al. (1935) usando plasmideo linearizado. Os protoplastos são ressuspensos depois da última lavagem a uma densidade de cerca de x 10'’ protoplastos por ml no tampão de electroporação (manitol

0,4 M, MgCl._, 6 mM). Os protoplastos são colocados em aliguôt-as de

IO ml de tubos centrífuga plásticos. 0 DNA do plasmídeo

0,7 ml e DNA

de timus de vitela sonificado concentrações finais adicionado aos tubos (sigma) para originar ,ug/ml respectivamente é de 10 ug/ml e 50

Depois 0,38 ml de solução PEG C24 % (p/v) de PEG 5000 em manitol 0,4 M, MgCl.., 30 mM, 0,1 % (p/v) de MES (pH 5,6).1 é adicionado e a solução é suavemente misturada. A suspensão de protoplasto é transferida, para, uma câmara de ElectroparaR dor Dialog e 10 impulsos de voltagem inicial de 3250 V/cm e uma descida, constante exponencial de 10 yseg é aplicada em intervalos de 30 segundos. A amostra é removida da câmara, e colocada num prato de preti de 10 cm de diâmetro. 10 ml de meio KM—8p gue R contém 1,2 % (p/v) de piastos distribuídos de i xada. ge 1 i f i c a. r .

agarose Sea.Pla.que ' é adicionado, os proto— totalmente pelo meio, e a agarose foi

b. a é repetido à. excepção de que a voltagem inicial usada é 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm, ou 2500 V/cm.

c . a e b é repetido â excepção de gue F'EG de PM 4000 ou PEG de PM 8000 é usado.

d. a a c são repetidos á excepção de gue a concentração final de PEG está entre 10 % e 30 % (p/v).

8. Transformação de Protoplastos D. glomerata L. por

Tratamento com PEG

a. A transferência do gene direto mediado de PEG é realizada de acordo com Negrutiu et al. (1387). 0 ADN usado é ρ .1 asm í deo 1 i near i zado .

Os protoplastos são suspensos

seguindo a — 66 ώ 11 i sta densidade lavagem em manitol 0,5 M que contém MgCl.., 15 mM a uma de cerca de 2 x 10^b por ml. A suspensão de protoplastos é distribuída como aliguôtas de 1 ml em tubos centrífugas de 10 ml. O DMA é adicionado como descrito em R acima, e depois 0,5 ml de solução PEG adicionada (40 % (p/v) de PEG em manitol 0,4 mM, Ca < N0..,).., 0,1 M, pH 7,0). As soluções são misturadas suavemente e incubadas durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 24°C) durante cerca de 30 minutos com agitação ocasional. 1,4 ml de solução de lavagem é depois adicionada e os teores do tubo suavemente misturados. A solução de lavagem consiste em manitol 87 mM, CaCl.., 115 mM, MgCl.., 27 m.M, KCL 39 mM, Tris-HCl 7mM e 1,7 g/l de mio-inosi.tol, pH 9,0. Quatro outras aliguôtas de 1,4 ml de solução de lavagem são adi. c íonadas em intervalos de 4 minutos, c o m m i stura depois de cada adie ã o. 0 tubo é deρo is c entr i f uga do a cerca de 50 x g durante cerca de 10 minutos, e o sob rena, d na te é desc a r regado.

is pr de meio de cultura cm. 10 beaPlaque e adie xonad >toplastos sedimentados são tirados para 1 ml KM~8p, e colocados em pratos de preti. de 10 ml

R gue contém 1,2 % (p/v.) de agarose

Os protoplastos são eventualmente dxstribuxoos por todo o meio, e a. agarose deixada gel i.f i.car .

b. a é repetido com uma ou mais das modificações segui, ntes;

(1) 0 pH da solução de lavegem é ajustado a 5,6 ou 7,0.

(2) 0 PEG usado é PEG de PM 6000, PEG de PM 2000 ou PEG de PM 8000.

(3) 0 meio de lavagem consiste de NaCl 154 mM, CaC'l_o 125 mM, KC1 5 mM, glucose 5 mM, pH a 6,0 com KCH, de CaCl.., 0,2 M,

0,1 % <p/v) de MES, pH 6,0 com KOH, ou de CaCl.-, 0,2 M, Tris/HCl 7 ml*l, pH 9,0 com KOH.

T Transf o r ma ção de P r o top las tos D. G1 orne rata po r

Electroporacão ou por Tratamento com F‘EG

A transformação é realizada como descrito em R e S, â excepção de que os protoplastos são? tratados a 45°C durante cerca de 5 minutos antes de diluição das a1iquôtas nos tubos para a transformação ou depois de distribuição das aliquòtas, e antes d i1u i cão do PEG.

V. Selecção de Colónias Transformadas

a. Os pratos .de cultura (pratos de preti) que contêm os protoplastos de R a T são incubados durante 10 dias no escuro a depois cortados em 5 tiras iguais para culturas

	-c a de 2	5°C
de	contas	<SI
ern	cada 20	ml
de	caseína	e :
en?	20 m 1 di	o mi

em 20 ml do mesmo meio mas sem higromicina B como um controle não de células derivadas do piOtoplasto transformado colónias putativo em higromicina B são cortadas de agarose e colocadas num prato de preti de 13 mm com 2 ml de meio SH-45 liquido que contém 20 /jl/ml de higromicina B, que é agitada a cerca de 50 rpm num agitador orbital. Depois de outras 4 a 5 semanas todas as colónias que crescem para formarem novas suspensões são transferidas frascos Erlenmeyer de 125 ml e crescem de uma maneira similar cultura de suspensão aprente, à excepção de que 20 /jg/ml higromicina b é incluída no meio.

em â

As novas suspensões são subcultivadas todas a la semanas usando· meio SH—45 que contém 4 g/1 de hidrol isato caseína e 20 /jg/ml de higromicina B. Células destas suspensões são também colocados em pratos de meio SH-30 solidificado que contém 20 jjg/ml de higromicina B e incubados a cerca de 25°C no escuro. Crescimento de calli a partir das células dos pratos são meio fresco. As células B são presumidas como subcultivadas todas as duas semanas em que crescem na presença de higromicina tendo sofrido transformação.

b. A selecção é realizada como descrito em a à excepção de gue o crescimento das colónias derivadas de protoplasto em higromicina B gue contém meio· são colocadas em pratos de agar de meio SH-30 gue contém 20 ;jg/ml de higromicina Ei e incubado a cerca de 25°C no escuro.

V . Regeneração de Plantas D. glomerata Transf o· r ma das

a.

derivado dos subcultivado é removidos

Ca11us de D. P r o t op Ϊ astos todas as dua.

colocado na ocorre em 1 em meio SH-0

e d	2? 1 O C 3. CÍ O C.1 ΠΊ
luz	< 3S00 a
a 4	semanas
na	luz para

glomerata (obtido como descrito· em U) cresceu em meio SH-30 solidificado, e s se·.·· a nas . qualquer smL*r x ao gue se f orma p r a tos no meio de germinação (SH-O 1 e 4600 1.x). A germinbação destes embriões e os rebentos resultantes são colocados a formação do sistema de raízes. Eles são movidos para, a estufa no estagio de seis e ndu r e c x me n t o g r a dua. 1 .

a doze folhas, e b . C a 11 u s (o b t i d o· omo descrito em

IJ1 d e r .i v a d o d e so1i di f i cado c om 0,24 % e subcul tura todas as são colocados numa mistura •m a combinação de 0, 1.2 % protoplastos cresceu em meio SH-0 p

de Gelrite â luz (3800 a 4600 Ix semanas. Os rebentos resultantes de SH-0 e meio OMS solidificado co (p / v) duas 1: i (p/vl para a formaçãc de gelrite e 0,4 % (p/v) de agar ã luz sistema de raízes. Eles são movidos para a estufa no estági·-· -*·= seis a doze folhas,- e endurecimento gradual .

de

c. Rebentos pequenos são obrtidos como descrito acima, e são colocados em meio OMS solidificado com 0,8 % (p/v) m de agar à luz para a formação de sistema de raízes. Eles são movidos para, a estufa no estágio de seis a doze folhas, e endurecimento gradual.

d. Rebentos pequenos são obtidos como descrito acima e são colocados numa mistura 1:1 de SH-0 e de meio OMS solidificado com uma combinação de 0,12 % (p/v) de Gelrite^ e 0,4 % (p/v) de agar â luz para a formacSo de sistema de raizes. Eles são movidos para a estufa no estágio de seis a doze folhas, e endurecimento gradua1.

Exemplo 9: Desenvolvimento de Linhas de Semmenies

T3 transgénicas que contêm todos os três genes

Designações do genotipo para planta; usadas aqui de acordo com a seguinte convenção: a planta inicial que resulta do evento de transformação e tendo crescido a partir da cultura de tecido é designado por planta Tl. Plantas rasultanflorss naturais da planta Tl, são tendo adiquirido um novo genotipo durante o normal. Igualmente, sementes nascidas de auto-polinização de flores naturais das plantas T2 (i.e. crescimento a partir de semente T.2) são designadas por T3, etc.

designadas por T2 ρ· roc esso me i ó t i c

Plantas transgénicas (Tl) cresceram até maturação. Flores são deixadas auto—polinizarem—se e a vagem das sementes são recolhidas após dissecação normal. Sementes de cada planta individual são recolhidas e armezenadas separadamente. Cada lote de sementes é testado para análise de segregação genética para a determinação do número Mendelian loci que suporta a característica da resistência de kanamicina. As sementes T2 são esterelizadas na superfície por lavagem múltipla em 2 % de hipoclorito que (v/v) de Tween-20, seguido por lavagens em água Aproximadamente 150 dessas sementes são colocadas filtro saturado com sais MS 0,2 X (Murashige and

Skoog, 1962) que contém 150 yg/ml de kanamicina. Seguindo germinação e espansSo dos cotiledóneos a aproximadamente 5 mm, a razão de c o t i1odóneo s ve r de ηo rma1 (kan-r) ver sus cotilodóneos b r a n— quiados Ckar.-s) é determinada. Unicamente aqueles lotes de e.x i bem uma razão oe apruximadaniente ·-.': 1 guardadas para outra anal ise,' esta razão de contém 0,02 $ esteri1izada . num pape 1 de sementes

Γ 2 que (kan-r:kan-s) sãc segregação indicativa pai um um c<

s uρ o r t a o gene m a r c ado r.

Quatro das dez plantas cresceram até maturação de cada lote de sementes T2' (usando as mesmas condições descritas acima), e são deixadas auto-polinizarem-se. A colecção de semnetes TS, a esterelização de sementes, e a germinação de sementes c orno sao descrito acima para a semente T2. Os lotes de sementes TS em que

100 % de sementes testadas Cn

150) exibem um fenotipo Kan-r são ( i . e.

asumidas como sendo homogéneas para a caracterização resultante de uma planta aparente T2 homogénea) e são deixadas para a análise do fenotipo.

Técnicas de cr iação convenc ionais são depois usadas para obter todos os três genes na mesma planta.

Enquanto o presente invento estava a ser descrito com referências aos seus modos de realização específicos, foi de apreciar que numerosas variações, modificações, e modos de realização são possíveis, e de acordo, todas essas variações, modificações são olhadas como estando no espirito e no âmbito do presente i nvento.

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Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição anti-patogénica para o controlo de patogénios de plantas, caracterizada por compreender um ingrediente activo juntamente com um ou mais veículos aceitáveis na agricultura; em que o ingrediente activo compreende

   a) um ou mais peptideos liticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com:

   b) ujna ou mais chitinases; e/ou

   c) uma ou mais p-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o peptideo lítico ser qualquer peptideo natural ou sintético ou qualquer seu derivado funcional que é capaz de actividade anti-patogenicamente eficaz devido à sua capacidade de penetrar, lisar ou de outro modo deteriorar a membrana celular dos patogénios.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o peptideo lítico ser seleccionado a partir do grupo que consiste em defensinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, magaininas, atacinas, dipteris, sapecinas, cacrutinas, xenopsinas, ou seus híbridos.
4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações

   -21 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a P-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a p-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
8. 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c e a P~l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c e a P-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.
10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c e a β-1,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c.

    -311. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a chitinase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/100 c e a β-l,3-glucanase estar presente no ingrediente activo numa concentração relativa de cerca de 1/10 c.
11. 12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um dos peptídeos líticos ser peptídeo sintético n°. 3.
12. 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por os peptídeos líticos estarem presentes numa concentração desde cerca de 1 a cerca de 200 ppm.
13. 14. Método de controlo de patogénios de plantas, caracterizado por compreender a aplicação ao patogénio ou ao seu local de uma quantidade anti-patogenicamente eficaz de uma composição que compreende um ingrediente activo juntamente com um ou mais veículos aceitáveis na agricultura; em que o ingrediente activo compreende

    a) um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com:

    b) uma ou mais chitinases; e/ou

    c) uma ou mais β-1,3^1ηο3Μ8β8 numa quantidade sinergisticamente eficaz.
14. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo lítico ser utilizado em combinação com uma ou mais chitinases

    -4activadas; e uma ou mais p-l,3-glucanases activadas, que estão já presentes na planta a ser protegida, utilizando um estímulo indutor externo.
15. 16. Método de controlo de patogénios de plantas por meio de expressão numa planta transgénica um ou mais peptideos líticos juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz, caracterizado por compreender:

    a) preparação de uma planta transgénica que compreende sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptideos líticos, que não seja(m) lisozima; uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais β-1,3glucanases; e

    b) fazer com que a planta transgénica sintetize os compostos mencionados no passo (a).
16. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a(s) chitinases(s) e/ou a(s) P-l,3-glucanase(s) fazerem parte de um sistema de expressão induzível compreendendo um gene induzível e um regulador de indução e por a expressão de pelo menos um peptídeo lítico ser seguida pelo tratamento com um regulador de indução que induz a acumulação de pelo menos uma chitinase natural ou estranha e/ou uma β-l,3-glucanase natural ou estranha.
17. 18. Uma planta transgénica, caracterizada por compreender sequências de DNA recombinante que codificam

    a) um ou mais peptideos líticos, que não seja(m) lisozima, em combinação com:

    «Ά

    -5b) uma ou mais chitinases; e/ou

    c) uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz.
18. 19. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o peptídeo lítico ser qualquer peptídeo natural ou sintético ou qualquer seu derivado funcional que é capaz de actividade anti-patogenicamente eficaz devido à sua capacidade de penetrar, lisar ou de outro modo deteriorar a membrana celular dos patogénios.
19. 20. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por o peptídeo lítico ser seleccionado a partir do grupo que consiste em defensinas de mamíferos, cecropinas, tioninas, melitinas, defensinas de insectos, magaininas, atacinas, dipteris, sapecinas, cacrutinas, xenopsinas, ou seus híbridos.
20. 21. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada por ser uma planta de milho.

    •i
21. 22. Semente de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada por compreender sequências de DNA recombinante tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 18 a 20.
22. 23. Método de preparação de uma planta transgénica que é capaz de sintetizar um ou mais peptídeos líticos juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases, numa quantidade sinergisticamente eficaz;

    caracterizado por compreender os passos de

    -6preparação por transformação e regeneração de uma planta transgéniea compreendendo sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases.
23. 24. Método de preparação de uma planta transgéniea que é capaz de sintetizar um ou mais peptídeos líticos, que não seja(m) lisozima, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais P-l,3-glucanases numa quantidade sinergisticamente eficaz;

    caracterizado por compreender os passos de preparação por transformação e regeneração de duas ou mais plantas transgénicas compreendendo sequências de DNA recombinante que codificam um ou mais peptídeos líticos, juntamente com uma ou mais chitinases; e/ou uma ou mais β1,3-glucanases e cruzamento das referidas plantas utilizando técnicas de reprodução convencionais.