DK175536B1 - Fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme, som angriber en bestemt målplante, som enten er en enkimbladet eller tokimbladet plante, ............... - Google Patents

Description

DK 175536 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme, som angriber en bestemt mål-plante, som enten er en enkimbladet eller tokimbladet plante, baseret på det princip, at skadeorganismen i eller på en 5 plante udsættes for en pesticidt virksom mængde non-plante proteinaseinhibitor, som er forskellig fra eglin B eller C, og som syntetiseres biologisk i planten som følge af ekspression af et fremmedgen, der koder for proteinaseinhibitoren, eller som følge af ekspression af et eller flere fremmed-10 gener, som koder for en eller flere precursorer for proteinaseinhibitoren, en transgen plante, som er en enkimbladet eller tokimbladet plante, og som indeholder et fremmedgen, eller en gruppe af fremmedgener, som omfatter mindst en kodningssektion, som udtrykker en non-plante proteinasein-15 hibitor eller en eller flere precursorer for en proteinaseinhibitor, hvor proteinaseinhibitoren er forskellig fra eglin B eller C og er valgt fra gruppen bestående af inhibitorer af serinproteinaser, thiolproteinaser, metalpro-teinaser og sure proteinaser, og en vektor indeholdende en 20 DNA-sekvens, som koder for en ikke-plante proteinaseinhibitor, som er forskellig fra eglin B eller C, og som kan anvendes til transformation af planteceller eller af Agrobac-terium og til at udtrykke proteinaseinhibitoren i planter.

25 A. Proteinaser og proteinaseinhibitorer

En proteinase betragtes almindeligvis som et enzym, der hydrolyserer peptidbindinger under nedbrydning af molekyler, såsom proteiner, som indeholder disse bindin-30 ger. Hvis proteinasen spalter en peptidbinding ved en terminal aminosyre, kaldes den en "exoproteinase". Hvis enzymet hydrolyserer en non-terminal peptidbinding, kaldes det en "endoproteinase". I forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter udtrykket proteinase imidlertid j 35 også materialer, som spalter peptidbindinger ved hjælp af andre mekanismer end hydrolyse.

DK 175536 B1 I

De to proteinaserklasser har forskellig virkningsmåde. I

Exoproteiner kan spalte enten ved peptidets N-terminal I

eller ved dets C-terminal. Aminopeptidaser virker ved I

N-terminalen, medens carboxypeptidaser angriber ved I

5 C-terminalen. I

Endoproteinaser har mere specifikke aktiviteter. Sædvan- I

ligvis opdeles disse enzymer i fire hovedklasser, som fl

afspejler de hydrolyserede bindingers natur og/eller I

10 kaviteten omkring hydrolysestedet og/eller nødvendigheden H

af en karakteristisk gruppe i proteinasen. I

Serinendoproteinaser er karakteriseret ved deltagelsen af

en serinhydroxylgruppe i hydrolyseringsreaktionen af pro- H

I5 teinet, som deaktiveres. Som gruppe er disse proteinaser H

formentlig de bedst karakteriserede. De synes imidlertid I

at være langt mere almindelige i mikrobiel tvæv og animalsk

end i plantevæv. I

20 Thiolproteinaser, som også kaldes sulfhydrylproteinaser, I

synes at være den mest udbredte type proteinaser i plante- I

væv. De er karakteriseret ved den tilsyneladende I

involvering af svovl i en eller anden form i hydrolyse- I

reaktionen. En fri sulfhydrylgruppe på cystein er

25 identificeret som det aktive sted i en række af disse H

proteinaser.

De sure proteinaser, der også er kendt som carboxylprotei- I

naser, er vidt udbredt i plante- og dyreriget. Aktive I

30 steder synes at indeholde to asparaginsyresidekæder, som I

deler en fælles proton og en hydroxyl gruppe fra en tyro- I

sinrest. I

Ved den foreliggende opfindelse defineres metalloprotei-

35 naserne som en fællesgruppe for de proteinaser, som ikke I

hører ind under en af de ovenfor omtalte tre grupper, og som kræver mindst én metalion til den hydrolytiske virk- DK 175536 B1 3 ning. Blandt de mere almindelige metaller, som findes i sådanne proteinaser, kan nævnes calcium, zink og jern.

Proteinaseinhibitorer er materialer, som ødelægger eller 5 begrænser proteinasernes aktivitet. Der er opstillet forskellige klassifikationssystemer til samordning af de enkelte inhibitorers aktiviteter med målproteinaserne og/eller andre inhibitorer. Det dominerende system samordner inhibitorens aktivitet med proteinasens aktivitet.

10 De fire hovedklasser af proteinaseinhibitorer er således serinproteinaseinhibitorer, thiolproteinaseinhibitorer, sur proteinaseinhibitorer og metalloproteinaseinhibitorer.

Serinproteinaseinhibitorer findes i naturen i adskillige 15 vævstyper i mange planter. De synes at være virksomme mod mange forskellige serinproteinaser fra både insekter og mikroorganismer. Resultater tyder på, at målproteinasen deaktiveres ved dannelse af et stabilt proteinase-inhibitor-kompleks, som ikke kan hydrolysere peptider.

20

Virkningsmekanismen for thiolproteinaseinhibitorer, sur proteinaseinhibitorer og metalloproteinaseinhibitorer kendes ikke i detaljer. Disse inhibitorer findes i hele planteriget, selv om de synes at være mindre udbredt end 25 serinproteinaseinhibitorerne. Det antages, at thiolprotei- naseinhibitorerne primært virker gennem en blokkering af den karakteristiske svovlgruppe.

Proteinaseinhibitorer kan også klassificeres efter 30 struktur. Der kendes forskellige såkaldte "lavmolekylære" proteinaseinhibitorer, der for en stor dels vedkommende er af syntetisk oprindelse, og som er nyttige som laborato-riereagenser. En række naturligt forekommende lavmolekylære inhibitorer er isoleret fra bakterie- og svampekilder 35 og er blevet karakteriseret. Denne gruppe omfatter inhibitorer som leupeptinerne, antipainerne og pepstati-nerne. Et stort antal naturligt forekommende proteinaseinhibitorer er i virkeligheden proteiner, som produceres

I DK 175536 B1 I

I I

I direkte ved genekspression i cellen, eller som syntetise- I

I res ved en række kemiske reaktioner, der reguleres af I

I enzymer, som produceres direkte ved. genekspression i I

I cellen. I

I 5 I

I B. Proteinaseinhibitorer i planter I

I PIanteproteinaseinhibitorer er almindeligt forekommende i I

I plantevæv, tilsyneladende som en del af en biologisk I

I 10 kontrolmekanisme til beskyttelse af planten mod angreb af I

I forskellige skadeorganismer, især insekter eller mikroor- I

I ganismer. Det antages, at planten som svar på et sådant I

I angreb afgiver en eller flere proteinaseinhibitorer, som I

I når de indtages af den angribende organisme deaktiverer I

I proteinaser i den angribende organismes krop. Formentlig I

I indvirker denne deaktivering på den angribende organismes I

I stofskifteprocesser, især fordøjelsesprocesserne, hvorved I

I der sker en nedsættelse eller afbrydelse af organismens I

I stofskifte. I

I 20 - I

I Det er kendt, at tilsætningen af proteinaseinhibitorer til I

I visse insekters føde hæmmer væksten af disse insekter. I

I Gatehouse og Boulter (1983) har eksempelvis påvist, at den I

I såkaldte "cowpea" (Vigna unguiculata) trypsininhibitor I

I 25 nedsætter udviklingen af " cowpea" snudebi Ile larven (Callo- I

I sobruchus maculatus). Imidlertid er sojabønne (Glycine I

I max)“inhibitor og limabønne (Phaseolus lunatus)-inhibitor I

I langt mindre effektive. Murdock et al. (1987) har vist, at I

I nogle biller udviser vækstretardering, når de udsættes for I

30 thiolproteinaseinhibitorer. I

I Disse resultater indicerer, at naturligt forekommende I

I proteinaseinhibitorer er et kraftigt middel til bekæmpelse I

I af skadelige insekter eller mikroorganismer på planter. I

I Imidlertid er der en række ulemper forbundet med anven- I

I delse af naturligt forekommende inhibitorer i stor måle- I

I stok. Disse forbindelser er typisk proteinagtige og derfor I

dyre at udvinde eller fremstille på anden måde i store I

I--- DK 175536 B1 5 mængder, at oprense og at formulere. Da mange af dem let nedbrydes i det naturlige miljø, har de kortvarig virkning, hvilket kræver, at de anvendes flere gange. Foruden at være følsomme for nedbrydning er mange af disse pro-5 teinaseinhibitorer vandopløselige, og de bortskylles derfor ved den første regnstorm eller vanding.

Imidlertid har mange proteinaseinhibitorers uspecificitet muligvis endnu større betydning. Dette betyder, at mange 10 inhibitorer har virkning mod en række forskellige insekter og/eller mikroorganismer. Anvendelse af en specifik inhibitor mod en specifik skadeorganisme kan derfor meget vel have en uheldig indvirkning på nyttige insekter og/eller mikroorganismer.

15 C. In vivo-syntese af proteinaseinhlbitorer i planter

Med udviklingen inden for molekylærbiologien er regulering af de genetiske processer, som fører til biologisk produk-20 tion af proteinmaterialer i en lang række forskellige biologiske organismer, nu i mange tilfælde en rutineforanstaltning. Ved udviklingen af rekombinant DNA teknikken har overføringen af gener fra én organisme til en anden med helt andre egenskaber, hvorved modtageorganismen 25 forsynes med fænotyper, som ikke er karakteristiske for denne organisme, særlig interesse.

Udviklingen inden for transformationen af planter ef gået langsommere end ved transformationen af andre eukaryotiske 3 0 organismer. I de seneste år er der imidlertid udviklet flere og mere pålidelige teknikker til transformation af plantevæv og regenerering af hele, fertile planter. Det er derfor nu muligt at transformere planter til at udtrykke specifikke proteiner med godt resultat og på rimelig 25 effektiv måde.

Som følge af fremskridtende inden for rekombinant DNA teknikken og i erkendelse af ulemperne forbundet med

I DK 175536 B1 I

I 6 I

anvendelsen af proteinaseinhibitorer i ren eller praktisk I I taget ren form, er det nu muligt at udvikle transgene I I planter, som biologisk kan syntetiserer proteinaseinhibi- I I torer, der forsyner planten med en ny eller yderligere I I 5 virkemåde til selvbeskyttelse mod angreb af insekter I I og/eller mikroorganismer, hvilket gør det overflødigt at I I tilføre kemiske stoffer udefra. I

I De tidligere beskrevne ulemper ved anvendelse af praktisk I I 10 taget rene proteinagtige proteinaseinhibitorer afhjælpes I I helt eller næsten fuldstændigt ved hjælp af en sådan frem- I I gangsmåde. Inhibitoreren produceres i ren form i tilstræk- I I kelig mængde, og der er intet behov for påføring eller I I formulering. Nedbrydning og tab på grund af miljøforhold I I 15 bliver minimale eller får endog slet ingen betydning. End- I I videre muliggør den biologiske syntese af en specifik I I proteinaseinhibitor nogen regulering af specificiteten af I I inhibitoren, som anvendes i den pågældende plante. I

I 20 Muligheden for på genniveau at tilføre planter evnen til I I at udtrykke en fremmed proteinaseinhibitor, dvs. en pro- I I teinaseinhibitor, som ikke normalt udtrykkes, er blevet I I påvist fornylig (Hilder et al., 1987). Ved dette arbejde I I transformeres tobaksplanter med det gen, som koder for I I 25 "cowpea" trypsininhibitor, hvorved tobaksplanten får I I resistens mod Heliothis viresenes. I

I Dette resultat er tydeligvis ret informativt. Tobak er I I imidlertid et modelsystem er let at transformere, og der I I 30 anvendes derfor i vid udstrækning til indledende forsøg I I ved plantetransformation. Den foreliggende opfindelse I I vedrører transformation af forskellige plantesorter, såvel I I med henblik på modelstudier som kommerciel udnyttelse, med I I gener for en række forskellige proteinaseinhibitorer. I I 35 I

I Udvalget af planter og inhibitorer omfattet af den fore- I I liggende opfindelse er omfattende. Transformationen af I I tobak med gener, der koder for non-trypsinproteinaseinhi- I

DK 175536 B1 7 torer, har speciel interesse på grund af dens værdi som model. Transformationen af en lang række enkimbladede og tokimbladede planter med vidt forskellig anvendelighed og væsentlig kommerciel nytte repræsenterer et signifikant 5 fremskridt, hvis fordele omfatter hele det agrikulturelle område. Det vil altså sige, at udviklingen af planter med forøget resistens mod skadeorganismer har indlysende fordele for dyrkerne og brugere af planter, der er nyttige som føde, foder, prydplanter, fiber, energi- og farmaceu-10 tiske resourcer.

Det er et hovedformål med opfindelsen at tilvejebringe en transgen plante, der som en fænotype udviser evne til in vivo-syntese af en fremmed proteinaseinhibitor, fortrins-15 vis i en mængde, som er effektiv til bekæmpelse af en specifik skadeorganisme, hvorved planten får ny eller bedre resistens mod denne skadeorganisme.

Det er følgelig også formålet med opfindelsen at udvikle 20 nye transgene enkimbladede planter, som udviser en sådan fænotype.

Det er følgelig endvidere også formålet med opfindelsen at udvikle nye transgene tokimbladede planter, som udviser en 25 sådan fænotype.

Et andet væsentligt formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til bekæmpelse af planteskadeorga-nismer, ved hvilken de udsættes for en sådan transgen 30 plante.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende med henvisning til tegningen, hvor 35 fig. 1 viser konstruktionen af pRK252/Tn903/BglII, fig. 2 viser konstruktionen af pCIB5,

I DK 175536 B1 I

I I

I fig. 3 og fig. 4 viser konstruktionen af pCIB4, I

I fig. 5 viser konstruktionen af pCIB2, I

I fig. 6 viser konstruktionen af pCIBlO, som er et plasmid I

I 5 med bredt værtsområde indeholdende T-DNA kanter og gen til I

I planteselektion, I

I fig. 7 beskriver konstruktionen af pCIB710, I

I fig. 8 beskriver konstruktionen af pCIB10/710, I

I fig. 9 viser sekvensen af et cystatingen, som er inkorpo- I

I 10 reret i en transgen plante ifølge opfindelsen, I

I fig. 10 viser de syntetiske fragmenter, som fremstilles og I

I derefter samles til dannelse af cystatingenet vist i fig. I

I 9, og I

I fig. 11 viser de syntetiske fragmenter til konstruktion af I

I 15 sojabønne Kunitz-trypsininhibitorgenet. I

I Den efterfølgende tabel A indeholder en opremsning af I

I planter i overensstemmelse med deres anvendelser. Den er I

I et uddrag fra Christie (1987). I

I Den efterfølgende tabel B illustrerer repræsentative I

I 20 transgene planter, som indeholder gener for proteinase- I

I inhibitorer eller for precursorer for proteinaseinhibi- I

I torer fremstillet i overensstemmelse med den forelig- I

I gende opfindelse samt repræsentative insekter og andre I

I skadeorganismer, som kan bekæmpes af disse planter. Det er I

I 25 på ingen måde hensigten at begrænse opfindelsens omfang I

I til det her anførte. I

9 DK 175536 B1 A. Fællesaspekter af.opfindelsen

Et fælles aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme, som angriber målplante, 5 ved hvilken fremgangsmåde skadeorganismen udsættes for en pesticidt virksom mængde af en proteinaseinhibitor i eller på planten, hvor (a) inhibitoren er syntetiseret biologisk i planten som et resultat af ekspression af et fremmedgen, som koder for 10 proteinaseinhibitoren, eller som et resultat af ekspression af et eller flere fremmedgener, som koder for en eller flere precursorer for proteinaseinhibitoren, og (b) planten er (1) en enkimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-15 typer bestående af kornarter, grønsager og knolde, olieafgrøder, sukkerafgrøder, foder- og plænegræsser, fiberplanter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter eller (2) en tokimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-20 typer bestående af kornsorter, proteinafgrøder, frugtafgrøder, grønsager og knolde, nødder, olieafgrøder, sukkerafgrøder, foderbælgplanter, fiberplanter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter.

Et andet fsllesaspekt af den foreliggende opfindelse angår 25 også en fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme, som angriber en målplante, ved hvilken fremgangsmåde skadeorganismen udsættes for en pesticidt virksom mængde af en proteinaseinhibitor i eller på planten, hvor inhibitoren 1 i (a) syntetiseres biologisk i planten som et resultat af ekspression af et fremmedgen, der koder for proteinase-

DK 175536 B1 I

10 I

inhibitoren, eller som et resultat af ekspression af et I

eller flere fremmedgener, der koder for en eller flere I

precursorer for proteinaseinhibitoren, og I

5 (b) er valgt blandt gruppen af non-trypsinproteinaseinhi- I

bitorer bestående af inhibitorer af thiolproteinaser, I

metalloproteinaser, sure proteinaser og serinproteinaser. I

Nærmere betegnet angår den foreliggende opfindelse en I

fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme som I

10 angriber en målplante, ved hvilken fremgangsmåde skadeor-

ganismen udsættes for en pesticidt virksom mængde af en H

proteaseinhibitor i eller på planten, hvor inhibitoren: H

(a) syntetiseres biologisk i planten som et resultat af I

ekspression af et fremmedgen, der koder for proteinase- I

15 inhibitoren, eller som et resultat af ekspression af et I

eller flere fremmedgener, der koder for en eller flere I

precursorer for proteinaseinhibitoren, og

(b) er valgt blandt gruppen af proteinaseinhibitorer, som I

består af inhibitorer af thiolproteinaser, af metallopro- I

20 teinaser, af sure proteinaser og af non-trypsinserinpro- I

teinaser. H

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter en I

transgen plante, der indeholder et fremmedgen, som kan H

udtrykke en proteinaseinhibitor, eller et fremmedgen eller I

25 en gruppe af fremmedgener, som kan udtrykke en eller flere I

precursorer for en proteinaseinhibitor, hvor H

(a) genet eller gruppen af gener omfatter mindst ét kod- H

ningsafsnit, der koder for en proteinaseinhibitor eller I

for en eller flere precursorer for en proteinaseinhibitor, I

30 idet proteinaseinhibitoren er valgt blandt gruppen H

bestående af inhibitorer af serinproteinaser, thiolprotei- I

naser, metalloproteinaser og sure proteinaser, og I

DK 175536 B1 11 (b) planten er: (1) en enkimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-typer bestående af kornarter, grønsager og knolde, olie- 5 afgrøder, sukkerafgrøder, foder- og plænegræsser, fiberplanter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter, eller (2) en tokimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-typer bestående af kornarter, proteinafgrøder, 10 frugtafgrøder, grønsager og knolde, nødder, olieafgrøder, sukkerafgrøder, foderbælgplanter, fiberplanter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter.

Et andet aspekt af opfindelsen omfatter en transgen plante, der indeholder et fremmedgen, som kan udtrykke en 15 proteinaseinhibitor, eller et fremmedgen eller en gruppe af fremmedgener, som kan udtrykke en eller flere precurso-rer for en proteinaseinhibitor, hvor (a) genet eller gruppen af gener omfatter mindst et kodningsafsnit, som koder for en proteinaseinhibitor eller 20 for en eller flere precursorer for en proteinaseinhibitor, hvor proteinaseinhibitoren er valgt blandt gruppen bestående af inhibitorer af thiolproteinaser, metallo-proteinaser, sure proteinaser og non-trypsinserinprotei-naser, og 25 (b) planten er (1) en enkimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-typer bestående af kornarter, grønsager og knolde, olieafgrøder, sukkerafgrøder, foder- og plænegræsser, fiberplanter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter, 30 eller

I DK 175536 B1 I

I 12 I

I (2) en tokimbladet plante valgt blandt gruppen af plante-

I typer bestående af kornarter, proteinafgrøder, I

I frugtafgrøder, grønsager og knolde, nødder, olieafgrøder, I

I 5 sukkerafgrøder, foderbælgplanter, fiberplanter, skovplan- I

I ter, lægemiddelplanter, krydderiplanter og aromaplanter. I

I Endvidere angår opfindelsen transgene planter, som udtryk- I

I ker en proteinaseinhibitor, der er nyttig ved den ovenfor I

I beskrevne fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorga- I

I 10 nisme, som angriber en målplante. I

I B. Definitioner I

I for at sikre en klar og koncis forståelse af den forelig- I

I gende beskrivelse og krav, herunder omfanget af disse, I

I anvendes følgende definitioner.: I

I 15 Biologisk syntese af en proteinaseinhibitor: I

I Syntese af en proteinaseinhibitor i en værtcelle. Dette I

I udtryk skal omfatte følgende: (1) fremgangsmåder med I

I hvilken en aktiv proteinagtig eller proteinholdig I

I proteinaseinhibitor produceres som følge af udtrykkelse af I

I 20 et gen, der koder for proteinaseinhibitor en, (2) frem- I

I gangsmåder ved hvilken et translationsprodukt modificeres I

I ved en posttranslationel enzymatisk virkning og (3) frem- I

I gangsmåder ved hvilke en eller flere proteiner produceres I

I som følge af udtrykkelse af et eller flere gener, idet I

I 25 proteinerne indgår i en reaktionsfølge, som omdanner en I

I eller flere proteinagtige eller ikke-proteinagtige I

I precursorer til en aktiv proteinaseinhibitor. Denne sidste I

fremgangsmåde omfatter specielt, men ikke udelukkende, de I

I situationer, hvor et materiale, som er exogent eller endo- I

30 gent over for planten, omdannes ved en sådan reaktions- I

I række til en aktiv proteinaseinhibitor. I

DK 175536 B1 13

Biologisk syntese som følge af genudtrykkelse:

Syntese i en værtscelle af et produkt, som fremkommer direkte ved genudtrykkelsen, dvs. som et translations-5 produkt, eller syntese af et produkt, som indirekte er en følge af genudtrykkelse, dvs. som et produkt af kemiske reaktioner gennemført ved hjælp af translationsprodukter.

Bekæmpelse af en skadeorganisme:

Udryddelse af en skadeorganisme eller inhibieringen af 10 skadeorganismeaktivitet, som er skadelig for en vært.

Fremmedt gen eller gengruppe:

Et gen eller en gruppe af gener, som stammer fra en vært, der er forskellig fra den vært, som til sidst udviser den ønskede fænotype, eller som stammer fra værten, men som er 15 blevet modificeret på en eller anden måde. Modifikation i sidstnævnte tilfælde indbefatter specielt, men ikke udelukkende, enhver ændring i genets DNA-sekvens eller addition af en eller flere kodningssektioner eller -afsnit, som koder for en yderligere fænotype, såsom en 20 antibiotikummarkøregenskab.

Gen:

En DNA-sekvens, der indeholder vilkårlige segmenter, der er nødvendige til gennemførelse af translation af et protein. De nødvendige segmenter indbefatter mindst én 25 promotorsekvens, en kodningssekvens og et terminatorsig-nal. Disse segmenter stammer imidlertid ikke nødvendigvis fra den samme kilde. Dvs. at udtrykket "gen" i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter DNA-segmenter, som stammer fra samme eller forskellige kilder.

I DK 175536 B1 I

I 14 I

I Non-trypsin-proteinase: I

En proteinase hvis virkningsmåde er væsentlig forskellig I

I fra trypsins virkningsmåde ifølge konventionelle klassifi- I

I 5 kationssystemer eller en fagmands opfattelse. I

Udtrykket omfatter især proteinaser, som har to eller I

I flere virkningsmåder, hvoraf den mest betydningsfulde I

I afviger væsentligt fra trypsins virkningsmåde, selvom en I

I mindre betydningsfuld eller den mindst betydningsfulde I

I 10 virkningsmådé kan ligne trypsins virkningsmåde. Udtrykket I

I er dog ikke begrænset hertil. 1 forbindelse med den fore- I

I liggende opfindelse skal der ved en inhibitor af denne I

I type non-trypsinproteinase forstås en inhibitor, som I

I interfererer med i det mindste den primære virkningsmåde, I

I 15 uanset interferensen med trypsinets virkningsmåde. I

I Pesticid virksom mængde: I

I En mængde, der er tilstrækkelig til opnåelse af bekæmpelse I

I af en skadeorganisme. I

I Plante: I

I 20 En plante i udtrykkets almindelige betydning samt plante- I

I væv i en plante eller dyrket f.eks. i et vævskulturmedium. I

I Precursor for en proteinaseinhibitor: I

I Et protein-agtigt eller ikke-proteinagtigt materiale, som

I omdannes enzymatisk til en aktiv proteinaseinhibitor i I

I 25 værtscellen, eller som deltager (enten som en reaktant I

I eller som et enzym) i syntesen af en proteinaseinhibitor. I

I Udtrykket omfatter især en enkel forbindelse eller en I

I gruppe af forbindelser, som endogen eller exogen for en I

I værtscelle, uden at være begrænset hertil, udtrykket I

I 30 omfatter også specielt et eller flere enzymer, som delta- I

DK 175536 B1 15 ger i en reaktionssekvens til syntetisering af en protei-naseinhibitor ud fra cellulære substrater. I denne situation betragtes såvel substratet som enzymet som precursore 5 for en proteinaseinhibitor.

Proteinase:

Et materiale, som enten er en enkel forbindelse eller en gruppe af samvirkende forbindelser, som deaktiverer et protein. Selv om udtrykket "proteinase" i den foreliggen-10 de beskrivelse anvendes ensbetydende méd udtrykket "protease", er "proteinase" det mest anvendte udtryk.

Proteinaseinhibitor:

Et materiale, som enten er en enkel forbindelse eller en gruppe af samvirkende forbindelser, som deaktiverer en 15 proteinase.

Transgen plante:

En plante, som indeholder mindst én DNA-sekvens, som eventuelt kan være et gen, og som er forskellig fra den DNA-sekvens, som forekommer i den analoge vildtypeplante.

20 Anvendt i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter udtrykket en hvilken som helst plante, hvori et vilkårligt DNA er blevet modificeret i forhold til DNA’et i vildtypeplanten. Det er imidlertid ikke nødvendigt, at det modificerede DNA er årsag til en ny fænotype i forhold 25 til vildtypeplanten. Udtrykket omfatter også planter, som indeholder et større antal genkopier i forhold til vildtypen, og planter, der indeholder vilkårlige modificerede DNA-sekvenser, der ikke nødvendigvis er begrænset til de DNA-sekvenser, som koder for proteiner.

I DK 175536 B1 I

I 16 I

I Funktionel ensartethed hos inhibitorer: I

I Inhibitorer er funktionelt ensartede, hvis de kan I

I udskiftes indbyrdes uden signifikant tab af virkning, dvs. I

5 hvis de udviser en virkning af samme art, og hvis deres I

I effektivitet er af samme størrelsesorden. I

C. Transgene planter og fremgangsmåde til skadeorganisme- I

I bekæmpelse I

I (1) Transgene planter indeholdende proteinaseinhibitorer I

I 10 fra alle fire klasser samt anvendelse deraf I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et middel til I

I bekæmpelse af skadeorganismer på en række transgene I

I enkimbladede og tokimbladede målplanter under anvendelse I

I af proteinaseinhibitorer, som er repræsentative for alle I

I 15 fire konventionelle klasser af disse inhibitorer, og som I

I syntetiseres biologisk i disse planter. Skadeorganismer, I

I som kan bekæmpes på denne måde, er hovedsagelig insekter, I

I mider, svampe eller bakterier. I

I Planter, som har særlig interesse i forbindelse med dette I

I 20 aspekt af opfindelsen, indbefatter: (a) enkimbladede I

I planter valgt blandt gruppen af plantetyper bestående af I

I prydplanter og de planter, som er anført i tabel A som I

I kornarter, grønsager, knoldplanter, olieafgrøder, I

I sukkerafgrøder, foderafgrøder og plænegræsser, fiber- I

I 25 planter, skovplanter, krydderiplanter og aromaplanter, og I

I (b) tokimbladede planter valgt ' blandt gruppen af I

I plantetyper bestående af prydplanter og de i tabel A I

I anførte kornarter, proteinafgrøder, frugtafgrøder, I

I grønsager og knoldplanter, nødder, olieafgrøder, sukker- I

I 30 afgrøder, foderbælgplanter, fiberplanter, skovplanter, H

I krydderiplanter og aromaplanter. Dvs., at tokimbladede

I planter af lægemiddelplanteafgrøderne ikke er omfattet af I

I dette aspekt af opfindelsen. I

DK 175536 B1 17

Foretrukne enkimbladede plantetyper omfatter plantetyper fra kornarterne, grønsagerne og knoldplanterne, sukkerr afgrøderne, fodergræsserne og plænegræsserne. Især 5 foretrækkes planter af slægterne Avena (havre), Hordeum (byg), Oryza (ris), Sorghum (durra), Triticum (hvede), Dactylis (hundegræs) og Saccharum (sukkerrør) og Zea mays (majs).

De roest foretrukne planter hører til slægten Dactylis og 10 Zea mays, især Zea mays.

Foretrukne tokimbladede plantetyper omfatter frugtafgrøderne, grønsagerne og knoldplanterne, olieafgrøderne, foderbælgplanterne og fiberplanterne samt skovplanterne.

Især foretrækkes planter hørende til slægterne 15 Lycopersicon (tomat), Solanum (kartoffel), Pisum (ærter),

Beta (roer), Glycine (sojabønne), Brassica (raps og kål) og Gossypium (bomuld). Mest foretrækkes planter af slægterne Lycopersicon, Solanum og Gossypium. En anden foretrukken gruppe planter består af kartofler, raps, 20 tomater, sojabønner, ærter og bomuld.

Inhibering kan iagttages i transgene planter, som indeholder et fremmedgen eller en fremmedgengruppe, der koder for en inhibitor af en serinproteinase. Denne inhibitor er fortrinsvis en inhibitor af mindst en serinproteinase 25 valgt blandt thrombin, plasmin, elastase, kallikrein, subtilisin, cathepsin G, cymase, acrosin, plasminogenakti-vator, Cl"-estease, enterokinase, tryptase, post-prolin-spaltningsenzym (prolylendoproteinasé), ATP-afhængig protease, thermitase, mastcelleproteinase I og II, 30 Streptomyces griseus proteinase A, Staphylococcus aureus V8 proteinase, Tenebrio α-proteinase, urokinase, blodkoagulerings faktorerne, komplementaktiveringsfaktorerne og serincarboxypeptidaserne, eller af en proteinase, som har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med en

I DK 175536 B1 I

I 18 I

I hvilken som helst af disse. I

Endvidere kan inhibitoren være en inhibitor af trypsin I

eller chymotrypsin. Når proteinasen er chymotrypsin, er I

I 5 inhibitoren fortrinsvis en kartoffel I, kartoffel II, I

tomat I eller tomat II inhibitor. I

Der iagttages også inhibering som følge af in vivo-synte- I

I se af andre inhibitorer af serinproteinaser, når en eller I

flere af disse inhibitorer er et medlem af Bowman-Birk- I

I 10 inhibitorfamilien, sojabønne Kunitz-inhibitorfamilien, den I

bovine pancreatiske trypsin (Kunitz) inhibitorfamilie, I

I Kazal trypsininhibitorfamilien, Streptomyces subtilisin I

I inhibitorfamilien, kartoffelinhibitor I-familien, kartof- I

I felinhibitor Il-familien, ai-proteinaseinhibitorfamilien, I

I 15 hirudinfamilien, bdellinfamilien, eglinfamilien, inter-a^- I

I trypsininhibitorfamilien, serpin overfamilien, Cl“-inhi- I

I bitorfamilien, Ascaris inhibitorfamilien, leupeptinerne, I

I antipaineme, elastinal og chymostatin, eller en

I inhibitor, som har væsenlig strukturel eller funktionel I

I 20 lighed med en hvilken som helst af disse. I

I Særligt foretrukne serinproteaseinhibitorer er sojabønne I

I Kunitz trypsininhibitor, g^-antitrypsin (et eksempel på I

I -proteinaseinhibitorfamilien), eglin C og eglin C-mutan- I

I ter, især eglin C (Arg 45). I

I 25 En foretrukken gruppe inhibitorer, der syntetiseres biolo- I

I gisk i en transgen plante, og som er nyttige til I

I bekæmpelse af skadeorganismer, især skadeinsekter, I

I indeholder en inhibitor af thiolproteinase. Foretrukne I

I eksempler på sådanne inhibitorer omfatter inhibitorer af I

I 30 papain, bromelain, ficin, calpain, cathepsin B, cathepsin I

I C, cathepsin L, cathepsin H, cathepsin S, chymopain, H

I asclepain, prolylendopeptidase, pyroglutamylpeptidase, I

I dipeptidylproteinase I, gærproteinase B, Streptococcus

I proteinase, Staphylococcus thiolproteinase eller I

DK 175536 B1 19 actinidin, eller en inhibitor af en proteinase, som har væsentlig strukturel eller funktionel lighed med en hvilken som helst af disse.

5 Specielt foretrækkes en inhibitor, som er eller har væsentlig strukturel eller funktionel lighed med en cystatin, calpastatin, bromelaininhibitor, antipain, leupeptin, chymostatin eller E64 eller et derivat deraf.

E64 er en enkel betegnelse for forbindelsen [ N-(L-3-trans-10 carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl ]-amido(4-guanido)- butan. Derivater af E64 omfatter sådanne forbindelser, hvori gruppen -NH-(CH2)4~NH-C(=NH)-ΝΉ2 er erstattet med forskellige alkylgrupper eller med grupper som -NH-(CH2)4"NH2· -NH-(CH2)2“CH3, -NH-(CH2)7~NH2 eller 15 -02CCH=CH-C0-NHCH)i-propy1)-CO-NH-(CH2)2-CH-(CH3)2.

Foretrukne inhibitorer af cystatintypen er valgt blandt gruppen bestående af æggehvidecystatin, human cystatin A, human cystatin B, human cystatin C, human cystatin S, rottecystatin a, rottecystatin β og kininogen, f.eks.

20 L-kininogen og H-kininogen.

En særlig foretrukken thiolproteinaseinhibitor er æggehvidecystatin.

Endvidere kan transgene planter være resistente mod skadeorganismer, når der ved in vivo-syntese produceres en 25 inhibitor af en metalloproteinase. Foretrukne inhibitorer er sådanne, der inhiberer carboxypeptidase A, carboxypep-tidase B, aminopeptidase, collagenase, calciumafhængig neutral proteinase, thermolysin, angiotensinomdannende enzym, renaldipeptidase, enkephalinase, gelatinase eller 30 keratinase eller inhibitorer af proteinaser, som har væsentlig strukturel eller funktionel lighed med en hvilken som helst af disse.

Især foretrækkes en inhibitor, som er, eller som har

I DK 175536 B1 I

I 20 I

væsentlig strukturel eller funktionel lighed med, en I

I kartoffelcarboxypeptidaseinhibitor, mammal collagenase- I

I inhibitor, a2~macroglobulin, vævsbradykinin-potenserende I

I 5 peptid, phosphoramidon, bestatin eller amastatin. I

I Endelig iagttages inhibering, når inhibitoren er en I

I inhibitor af en sur proteinase. Foretrukne inhibitorer er I

I sådanne, der inhiberer pepsin, rennin, cathepsin D, I

I chymosin, penicillinopepsin eller Scytalidium syreprotease I

I 10 B, eller inhibitorer af proteinaser, som har væsentlig I

I strukturel eller funktionel lighed med en hvilken som I helst af disse.

I Blandt disse inhibitorer foretrækkes især sådanne, som er I

I eller som har væsentlig strukturel eller funktionel lighed I

I 15 med pepstatin, Ascaris carboxylproteinaseinhibitor, I

I Bauhinia pepsininhibitor, Scopolia japonica proteinase-

I inhibitor eller kartoffel cathepsin D-inhibitor. I

I Selv om typiske skadeorganismer på disse foretrukne I

I planter er eller stammer fra insekter, mider, svampe eller I

I 20 bakterier, har insektskadeorganismer særlig betydning. I I

I tabel B er anført nogen foretrukne eksempler på

I målplanter, der som følge af genmanipulation producerer I

I den eller de angivne proteinaseinhibitorer, som tilveje- I

I bringer bekæmpelse af det anførte målinsekt. Disse I

I 25 resultater er på ingen måde begrænsende for opfindelsen.

I Primære målskadeorganismer på enkimbladede planter, f.eks. I

I majs, hører til ordenen Coleoptera eller Lepidoptera, især I

I til slægterne Diabrotica, Diatraea, Ostrinia og Heliothis, I

I f.eks. kornrådorm eller komborer. Primæré målskadeorga- I

I 30 nismer på tokimbladede planter, f.eks. kartoffel, raps, I

I tomat, sojabønne, ærter eller bomuld, hører også til I

I ordenen Coleoptera eller Lepidoptera, især af slægterne I

I Diabrotica, Diatraea, Ostrinia, Heliothis, Spodoptera og I

I Anthonomus, f.eks. kartoffelbillen. I

DK 175536 B1 21

Proteinaseinhibitoren kan udtrykkes i en vilkårlig del af planten, f.eks. i rødderne, stilkene, bladede, frøene eller pollen. Fortrinsvis udtrykkes proteinaseinhibitoren 5 i den plantedel, som er det primære angrebspunkt for den skadeorganisme, som skal bekæmpes.

(2) Transgene planter indeholdende inhibitorer af non-trypsinproteinase og anvendelse deraf

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes også et 10 middel til bekæmpelse af skadeorganismer på et stort antal transgene enkimbladede og tokimbladede målplanter under anvendelse af proteinaseinhibitorer, som er repræsentative for alle fire konventionelle pladser, og som syntetiseres biologisk i disse planter. Nærmere betegnet 15 angår opfindelsen anvendelsen af inhibitorer af non-tryp-sinproteinaser af alle fire klasser, fortrinsvis anvendelse af inhibitorer af non-trypsinserinproteinaser. Skadeorganismer eller skadevoldere, som kan bekæmpes på denne måde, er eller stammer hovedsagelig fra insekter, 20 mider, svampe eller bakterier.

Planter, som har særlig interesse i forbindelse med dette aspekt af opfindelsen, omfatter enkimbladede og tokimbladede planter anført i tabel A som omtalt ovenfor valgt blandt gruppen af plantetyper bestående af kornarter, 25 proteinafgrøder, frugtafgrøder, grønsager og knoldafgrøder, nødder, olieafgrøder, sukkerafgrøder, foder- og prydgræsser, foderbælgplanter, fiberplanter og skovplanter, samt krydderiplanter og aromaplanter og tillige lægemiddelplanter. 1

Foretrukne enkimbladede plantetyper omfatter planter hørende til kornarterne, grønsagerne og knoldplanteme, sukkerafgrøderne samt foder- og prydgræsserne, især foretrækkes planter, som hører til slægterne Avena (havre), Hordeum (byg), Oryza (ris), Sorghum (durra), Triticum

I DK 175536 B1 I

I 22 I

I (hvede), Dactylis (hundegræs) og Saccharum (sukkerrør) og I

I Zea mays (majs). De mest foretrukne planter er af siæg- I

I terne Dactylis og Zea mays. I

I 5 Foretrukne tokimbladede plantetyper omfatter planter I

I blandt frugtafgrøderne, grønsagerne og knoldplanterne, I

I olieafgrøderne, sukkerafgrøderne, foderbælgplanteme, I

I fiberplanterne og skovplanterne samt lægemiddelplanterne. I

I Især foretrækkes planter, som hører til slægterne I

I 10 Lycopersicon (tomat), Solanum (kartoffel), Pisum (ærter), I

I Beta (roer), Glycine (sojabønne), Brassica (raps og kål), I

I Gossypium (bomuld) og Nicotiana (tobak). De mest I

I foretrukne, planter hører til slægterne Lycopersicon, I

I Solanum, Gossypium og Nicotiana. I

I 15 Inhibering kan iagttages i transgene planter, som inde- I

I holder et fremmedgen eller en fremmed gengruppe, som koder I

I for en inhibitor af en non-trypsinserinproteinase. For- I

I trinsvis er der tale om en inhibitor af mindst en I

I non-trypsinserinproteinase valgt blandt thrombin, plasmin, I

I 20 elastase, kallikrein, subtilisin, cathepsin G, chymase, I

I acrosin, plasminogenaktivator, Cl“-esterase, enteroki- I

I nase, tryptase, post-prolinspaltningsenzym (prolylendo- I

I proteinase), ATP-afhængig protease, thermitase, roast- I

I celleproteinase 1 og II, Streptomyces griseus proteinase I

I 25 A, Staphyllococcus aureus V8 proteinase, Tenebrio I

I a-proteinase, urokinase, blodkoaguleringsfaktorerne, I

I komplementaktiveringsfaktorerne og serincarboxypeptida- I

I serne, eller af en proteinase, som har væsentlig I

I strukturmæssig eller funktionel lighed med en hvilken som I

I 30 helst af disse. Desuden kan inhibitoren være en inhibitor H

I af chymotrypsin. Når proteinasen er chymotrypsin, er H

I inhibitoren fortrinsvis en kartoffel I, kartoffel II, I

I tomat I eller tomat II inhibitor. I

I Desuden iagttages inhibering som følge af in vivo-syntese I

I 35 af andre inhibitorer af non-trypsinserinproteinaser, når I

DK 175536 B1 23 en eller flere af disse inhibitorer er et medlem af Bowman-Birk inhibitorfamilien, Streptomyces subtilisin-inhibitorfamilien, kartoffelinhibitor 5 I-familien, kartoffelinhibitor Il-familien, ai-proteina-seinhibitorfamilien, hirudinfamilien, bdellin-familien, eglinfamilien, inter-ai-trypsininhibitorfamilien, serpinoverfamilien, Cl"-inhibitorfamilien, Ascaris-inhi-torfamilien, leupeptineme, antipainerne, elastinal og 10 chymostatin, eller en inhibitor, som har væsentlig strukturel eller funktionel lighed med en hvilken som helst af disse.

Særligt foretrukne non-trypsinserinproteaseinhibitorer af dette aspekt af opfindelsen er eglin C og eglin C-mutan-15 ter, især eglin C (Arg 45).

En foretrukken gruppe inhibitorer, der syntetiseres biologisk i de transgene planter af dette aspekt af opfindelsen, og som er nyttige til at bekæmpe skadeorganismer, især skadeinsekter, omfatter en inhibitor af en thiolpro-20 teinase anført ovenfor. Foretrukne og særligt foretrukne eksempler på sådanne inhibitorer er anført i de efterfølgende afsnit og er ligeledes foretrukket ved dette aspekt af opfindelsen.

Desuden kan transgene planter udvise resistens mod skade-25 organismer, når der ved in vivo-syntese produceres en inhibitor af en metalloproteinase. Foretrukne og særligt foretrukne inhibitorer af dette aspekt af opfindelsen er de inhibitorer, der er anført som foretrukne ovenfor.

Endelig konstateres inhibering, når inhibitoren er en 30 inhibitor for en sur proteinase. Også her er foretrukne og særligt foretrukne inhibitorer af dette aspekt af opfindelsen de inhibitorer, som er omtalt ovenfor som foretrukne.

I DK 175536 B1 I

I 24 I

I Selv om typiske skadeorganismer eller skadevoldere på I

I disse planter er eller stammer fra insekter, mider, svampe I

I eller bakterier, har skadeinsekter særlig betydning. I I

I 5 tabel B er anført nogle foretrukne eksempler på målplan- I

I ter, der ved hjælp af genteknologi er bragt til at I

I producere den eller de anførte proteinaseinhibitorer, som I

I tilvejebringer bekæmpelse af det angivne målinsekt. Disse I

I resultater er på ingen måde begrænsende for opfindelsen. I

I 10 Typiske skadeorganismer eller skadevoldere, som skal I

I behandles, er beskrevet ovenfor. I

I D. DNA-sekvenser I

I For at gennemføre transformationen af planter, som er I

I nødvendige for at danne de transgene planter ifølge I

I 15 opfindelsen og for at udøve fremgangsmåden ifølge opfin- I

I delsen, skal man til DNA-teknikken råde over DNA-sekven- I

I ser, som koder for proteinaseinhibitorerne eller for I

I precursorer for proteinaseinhibitorerne. Følgelig omfatter I

I den foreliggende opfindelse de således anvendte I

I 20 DNA-sekvenser. Teknikker til gennemførelse af disse trans- I

I formationer er beskrevet detaljeret i det følgende. I

I Alment angår opfindelsen en praktisk taget ren I

I DNA-sekvens, som omfatter en kodningssekvens for en I

I proteinaseinhibitor valgt blandt inhibitorer af I

I 25 thiolproteinaser, metalloproteinaser, sure proteinaser og I

I non-trypsinserinproteinaser, eller en kodningssekvens for I

I en eller flere precursorer, som indgår i den biologiske

I syntese af en proteinaseinhibitor, fortrinsvis en non- I

I trypsinproteinaseinhibitor, valgt blandt thiolproteinaser, I

I 30 metalloproteinaser, sure proteinaser og serinproteinaser. I

I Opfindelsen angår endvidere en praktisk taget ren DNA- I

I sekvens, som koder for en proteinaseinhibitor valgt blandt I

I inhibitorer af thiolproteinaser, metalloproteinaser, sure I

I proteinaser og non-trypsinserinproteinaser. I

DK 175536 B1 25

Opfindelsen omfatter endvidere, vektorer, som bærer sekvenser, der koder for proteinaseinhibitorer eller precursorer for proteinaseinhibitorer, samt sådanne 5 sekvenser isoleret i praktisk taget ren form.

Der foretrækkes de sekvenser, som koder for inhibitorer, der er virksomme mod skadelige insekter, mider, svampe eller bakterier. Særlig betydning har de sekvenser, som koder for inhibitorer eller precursorer for inhibitorer, 10 som er virksomme mod insekter.

Sekvensen er typisk en sekvens, hvori inhibitorgenet stammer fra et dyr, en bakterie eller en svamp eller fra en plante af en anden art end målplanten, eller sekvensen har en væsentlig grad af sekvenshomologi med et pro-15 teinaseinhibitorgen, som stammer fra et dyr, en bakterie eller en svamp eller fra en plante af en anden art end målplanten.

I tilfælde af en inhibitor af en non-trypsinserinprotei-nase kan denne være valgt blandt inhibitorer af 20 chymotrypsin, thrombin, plasmin, elastase, kallekrein, subtilisin, cathepsin G, chymase, acrosin, plasminogen-aktivator, Cl--esterase, entérokinase, tryptase, post-prolinspaltningsenzym (prolylendoproteinase), ATP-afhængig protease, thermitase, mastcelleproteinase I og II, 25 Streptomyces griseus proteinase A, Staphylococcus aureus V8 proteinase, Tenebrio α-proteinase, urokinase, blodkoaguleringsfaktorerne, komplementaktiveringsfaktorerne, serincarboxypeptidaserne eller en inhibitor af en proteinase, som har væsentlig strukturmæssig eller funktionel 30 lighed med en hvilken som helst af disse.

Som tidligere anført omfatter opfindelsen DNA-sekvenser, der koder for en eller flere precursorer, som deltager i den biologiske syntese af en proteinaseinhibitor, hvor inhibitoren er valgt blandt thiolproteinaser, metallopro-

I OK 175536 B1 I

I 26 I

I teinaser, sure proteinaser og serinproteinaser. I dette I

I tilfælde er serinproteinasen valgt blandt trypsin, I

I chymotrypsin, thrombin, plasmin, elastase, kallikrein, I

I 5 subtilisin, cathepsin G, chymase, acrosin, plasminogenak- I

I tivator, Cl“-esterase, enterokinase, tryptase, I

I post-prolinspaltningsenzym (prolylendoproteinase), I

I ATP-afhængig protease, thermitase, mastcelleproteinase I I

I og II, Streptomyces griseus proteinase A, Staphylococcus I

I 10 aureus V8 proteinase, Tenebrio a-proteinase, urokinase, I

I blodkoaguleringsfaktorerne, komplementaktiveringsf akto- I

I rerne og serincarboxypeptidaserne, og en proteinase, som I

I har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med I

I en hvilken som helst af disse. I

I 15 Nærmere betegnet kan sekvensen eller sekvenserne være en I

I eller flere, som koder for precursorer, som fører til en I inhibitor, der er medlem af Bowman-Birk-inhibitorfamilien,

I sojabønne-Kunitz-inhibitorfamilien, den bovine pankreati- I

I ske trypsin (Kunitz)-inhibitorfamilie, Kazal trypsininhi- I

I 20 bitorfamilien, Streptomyces subtilisin-inhibitorfamilien, I

I kartoffelinhibitor I-familien, kartoffelinhibitor Il-fami- I

I lien, ai-proteinaseinhibitorfamilien, hirudinfamilien, I

I bdellinfamilien, eglinfamilien, inter-a^-trypsininhibitor- I

I familien, serpinoverfamilien, Cl”-inhibitorfamilien, I

I 25 Ascarisinibitorfamilien, leupeptinerne, antipainerne, I

I elastinal og chymostatin, eller en inhibitor af chymotryp- I sin eller en inhibitor, som har væsentlig strukturmæssig I eller funktionel lighed med en inhibitor af chymotrypsin.

I I dette sidstnævnte tilfælde kan sekvensen være en I

I 30 sekvens, som koder for en inhibitor, hvori inhibitoren er H

I en kartoffel I, kartoffel II, tomat I eller tomat II I

I inhibitor. H

I I en anden udførelsesform kan DNA-sekvensen kode for en H

I proteinaseinhibitor eller en eller flere precursorer for I

I 35 en proteinaseinhibitor, som hører til klassen af inhibi- I

I torer af thiolproteinaser. I dette tilfælde kan H

DK 175536 B1 27 inhibitoren være en inhibitor af papain, bromelain, ficin, calpain, cathepsin B, cathepsin C, cathepsin L, cathepsin H, cathepsin S, chymopapain, clostripain, asclepain, 5 prolylendopeptidase, pyroglutamyl-peptidase dipeptidyl- proteinase I, gærproteinase B, Streptococcus proteinase, Staphylococcus thiolproteinase eller actinidin, eller en inhibitor, som har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med en hvilken som helst af disse.

10 Specielt foretrækkes i dette tilfælde en inhibitor, som er, eller har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med, et cystatin, calpastatin, bromelaininhibitor, antipain, leupeptin, chymostatin eller E64 eller et derivat deraf. Hvis inhibitoren er et cystatin, kan dette være 15 valgt blandt æggehvidecystatin, human cystatin A, human cystatin B, human cystatin C, human cystatin S, rotte cystatin a, rotte cystatin f? og kininogen, f.eks. L-kininogen og H-kininogen.

Desuden kan sekvensen kode for en proteinaseinhibitor, 20 eller for en eller flere precursorer for en proteinaseinhibitor, ‘ sbm er en inhibitor af en metalloproteinase. Inhibitoren kan eksempelvis være inhibitor af carboxypep-tidase A, carboxypeptidase B, aminopeptidase, collagenase, calcium-afhængig neutral proteinase, thermolysin, angio-25 tensinomdannende enzym, renal dipeptidase, enkephalinase, gelatinase eller keratinase, eller en inhibitor af en proteinase med væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med en hvilken som helst af disse.

I dette tilfælde foretrækkes især DNA-sekvenser, som koder 30 for inhibitorer eller for en eller flere precursorer for inhibitorer, hvor inhibitorerne er, eller har væsentlig strukturmæssig eller funktionsmæssig lighed med, en kartoffelcarboxypeptidaseinhibitor, mammal collagenase-inhibitor, a2-macroglobulin, vævsbradykinin-potenserende 35 peptid, phosphoramidon, bestatin eller amastatin.

-:------——:----------:--

I DK 175536 B1 I

I 28 I

I Endelig omfatter opfindelsen DNA-sekvenser, som koder for I

I en proteinaseinhibitor, eller for en eller flere precurso- I

I rer for en proteinaseinhibitor, som er en inhibitor af en I

I 5 zur proteinase. Særlig interesse har de tilfælde, hvor I

I inhibitoren er en inhibitor af pepsin, rennin, cathepsin I

I D, cymosin, penicillinopepsin eller Scytalidium sur I

I protease B, eller en inhibitor af en proteinase, som har I

I væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed en I

I 10 hvilken som helst af disse. I

I Især foretrækkes de tilfælde, hvor inhibitoren er, eller I

I har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med, I

I pepstatin, Ascaris carboxylproteinaseinhibitor, Bauhinia I

I pepsininhibitor, Scopolia japonica proteinaseinhibitor I

I 15 eller kartoffelcathepsin D inhibitor. I

I E. Vektorer I

I Vektorer fremstillet ved hjælp af standardteknikker og I

I indeholdende de ovenfor beskrevne DNA-sekvenser udgør et I

I yderligere aspekt af opfindelsen. I

I 20 Vektorer er rekombinant DNA-sekvenser, som kan anvendes i I

I forbindelse med isolering og formering af de ovenfor I

I omtalte DNA-sekvenser og til transformationen af egnede

I værter med disse sekvenser. Foretrukne vektorer til iso- I

I lering og formering er plasmider, som kan propageres i en I

I 25 egnet værtsmikroorganisme, f.eks. i E. coli. Foretrukne I

I vektorer til transformation er de vektorer, som er nyttige I

I til transformation af planteceller eller af Agrobacterium. I

I Hvis der nærmere beskrevet foretages transformation af I

I planteceller, som ikke er protoplaster, er den foretrukne I

I 30 vektor afledt af et Ti-plasmid. Til den direkte DNA-over- I

I førsel til protoplaster kan der anvendes en hvilken som I

I helst af de nævnte vektorer. Der kendes passende vektorer, I

I der kan anvendes til udgangsmaterialer. Egnede vektorer DK 175536 B1 29 til transformation af plantevæv og pianteprotoplaster er beskrevet af deFramond et al. (1983), An et al. (1985), Potrykus et al. (1985) og Rothstein et al. (1987). Ud over 5 disse kendes der mange andre vektorer, der er egnede som udgangsmaterialer ved den foreliggende opfindelse.

Konstruktionen og formeringen af vektorerne kan gennemføres i en egnet vært, f.eks. i E. coli. Egnede E. coli-stammer indbefatter HB101, JM83, DH1, DH5a, LE392 og 10 lignende stammer. Vektorerne ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne ved en direkte genoverførselsproces eller ved en mikroinjektionsproces. I visse tilfælde kan det være fordelagtigt at linearisere vektoren inden anvendelse. Vektorerne kan eventuelt transformeres til en 15 Agrobacteriumvært. Denne overførsel gennemføres ved anvendelse af konventionel teknik, som omfatter biparental parring (Simon et al., 1983b), triparental parring (Ditta et al., 1980) eller transformation (Holsters et al., 1978). Egnede Agrobacteriumstammer omfatter A. tumefaciens 20 LBA4404, CIB542 og C58Z707, men er ikke begrænset til disse.

Foretrukne vektorer er de vektorer, som indeholder de ovenfor omtalte foretrukne DNA-sekvenser. Endvidere er en foretrukken vektor en sådan, som er funktionel i plante-25 celler eller i Agrobacterium. Især foretrækkes de' vektorer, som er beskrevet i eksemplerne.

F. Fremstil1ingsfremqangsroåder

Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til fremstilling af de omtalte DNA-sekvenser, hvorved DNA-sekvensen 30 isoleres fra en naturligt forekommende kilde, eventuelt muteres, eller syntetiseres ad kemisk vej eller enzymatisk.

Desuden omfatter opfindelsen en fremgangsmåde til frem-

I DK 175536 B1 I

30 I

I stilling af de omtalte vektorer indeholdende en I

I DNA-sekvens som defineret ovenfor, hvor DNA-sekvensen er I

I ligeret til en vektor, som er funktionel i planteceller I

I 5 eller i Agrobacterium. I

Endvidere omfatter opfindelsen en fremgangsmåde til I

I fremstilling af transgene planter som defineret ovenfor, I

I ved hvilken en plantecelle transformeres med en vektor I

I indeholdende en DNA-sekvens ifølge opfindelsen eller I

10 co-kultiveres med Agrobacterium indeholdende en sådan I

I vektor, og plantecellen regenereres til en plante. I

I Der foretrækkes de fremgangsmåder, som fører til de fore- I

I trukne DNA-sekvenser, vektorer og transgene planter ifølge I

I opfindelsen. Især foretrækkes de fremgangsmåder, som er I

I 15 beskrevet i eksemplerne. I

I Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de I

I efterfølgende eksempler, som belyser såvel generelle som I

I specifikke aspekter af opfindelsen. I

I Der anvendes følgende forkortelser: I

I 20 bp: basepar I

I 2,4-D: 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre I

I Dicamba: 3, 6-dichlor-2-methoxy-benzoesyre I

I EDTA: l-ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraeddikesyre I

I kb: kilo basepar I

I 25 MES: 2-(N-morpholino)ethansulfonsyre I

I MV: molekylvægt I

I NAA: α-naphthaleneddikesyre I

I PEG: polyethylenglycol I

I SDS: natriumdodecylsulfat I

I 30 Tris-HCl: tris (hydroxymethyl) methyl amin-hydrochlorid I

I Medier I

DK 175536 B1 31 SH-O-medium: Medium ifølge Schenk og Hildebrandt (1972), uden indhold af hormoner. SH-medium kan være flydende eller størknet med 0,8% agar eller 5 med 0,5% "GelRite"®. Mediet steriliseres sædvanligvis ved opvarmning i en autoklave ved 110-l21eC i 15-20 minutter.

SH-30-mediunt: SH-O-medium indeholdende 30 μΜ Dicamba.

SH-45-medlum: SH-O-medium indeholdende 45 ftM Dicamba.

10 MS-medium og OMS-medium; Medier ifølge Murashige og Skoog (1962). Medierne kan størknes med 0,8% agar eller agarose eller med 0,5% “GelRite”®.

Beasley og Ting-medium (kimspiringsmedium): Medium ifølge

Beasley og Ting (1973). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 KM-8p-medium: Dette medium indeholder makrostoffer, 2 mikrostoffer og Fe-EDTA som beskrevet af Kao og Michayluk 3 (1975) samt følgende organiske forbindelser: Biotin (0,01 4 mg/1), pyridoxin-HCl (1 mg/1), thiamin-HCl (10 mg/1), 5 nicotinamid (1 mg/1), nicotinsyre (0,1 mg/1), folsyre (0,4 6 mg/1), D-calciumpantothenat (1 mg/1), p-aminobenzoesyre 7 (0,02 mg/1), cholinchlorid (1 mg/l), riboflavin (0,2 8 mg/1). vitamin B12 (0,02 mg/1), glycin (0,1 mg/1), 9 saccharose (0,25 g/1), glucose (68,4 g/1), mannitol (0,25 10 g/1), sorbitol (0,25 g/1), cellobiose (0,25 g/1), fructose 11 (0,25 g/1), mannose (0,25 g/1), rhamnose (0,25 g/1), 12 ribose (0,25 g/1), xylose (0,25 g/1), myoinositol (0,1 13 g/1), citronsyre (40 mg/1), fumarsyre (40 mg/l), æblesyre 14 (40 mg/1), natriumpyruvat (20 mg/1), adenin (0,1 mg/1), 15 guain (0,03 mg/1), thymidin (0,03 mg/1), uracil (0,03 16 mg/1), hypoxanthin (0,03 mg/1), cytosin (0,03 mg/1), glutamin (5,6 mg/1), alanin (0,6 mg/l), glutaminsyre (0,6 mg/1), cystein (0,2 mg/1), asparagin, asparaginsyre,

I DK 175536 B1 I

I 32 I

I cystin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, I I phenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrosin I I og valin (alle i en mængde på 0,1 mg/1). Opløsningen I I 5 sterilfiltreres. Slut-pH-værdien er 5,8. I

I Makrostofferne tilberedes som en 10 gange koncentreret I I stamopløsning, og mikrostofferne som en 1000 gange I I koncentreret stamopløsning. Citronsyre, fumarsyre og I I æblesyre og natriumpyruvat præpareres som en 100 gange I I 10 koncentreret stamopløsning indstillet på pH-værdien 5,5 I I med NH4OH. Adenin, guanin, thymidin, uracil, hypoxanthin I I og cytosin præpareres som en 1000 gange koncentreret I I stamopløsning indstillet på pH-værdien 6,5 med NH4OH. I I Aminosyrerne tilsættes under anvendelse af en 10 gange I I 15 koncentreret stamopløsning (pH-værdi 6,5 med NH4OH) til I I opnåelse af de anførte slutkoncentrationer. Vitaminstam- I I opløsninger præpareres normalt i en koncentration på 100 I I gange. I

I N6-medium: Dette medium indeholder makrostoffer, mikro- I I 20 stoffer og Fe-EDTA som beskrevet af Chu et al. (1975) samt I I følgende organiske forbindelser: Pyridoxin-HCl (0,5 mg/1). I I thiamin-HCl (0,1 mg/1), nicotinsyre (0,5 mg/1),(0,5 mg/1), I I glyciri (2,0 mg/1) og saccharose (30,0 g/l). Opløsningen I I autoklaveres. Slut-pH-værdien er 5,6. Makrostofferne fore- I I 25 ligger som en 10 gange koncentreret stamopløsning og I mikrostofferne som en 1000 gange koncentreret I stamopløsning. Vitaminstamopløsning fremstilles normalt i I I en 100 gange så stor koncentration. H

I YEB-medium: 5 g/l kødekstrakt, 1 g/l gærekstrakt, 5 g/l I I 30 papton, 5 g/l saccharose, indstilles på pH-værdi 7,2 med I I NaOH, 2 mM MgCl£ tilsættes efter autoklavering. I

I Agarose: Fremstilling og rensning af agarose er eksempel- I

I vis beskrevet af Guiseley og Renn (1975). Agarose er en af H

I bestanddelene af agar. Kommercielt agar består normalt af H

DK 175536 B1 33 en blanding af neutral agarose og lonformig agaropectin med et stort antal sidegrupper-* Sædvanligvis forbliver et vist antal sidekæder intakte, og de er bestemmende for 5 agarosens fysisk-kemiske egenskaber, såsom geldannelse og smeltetemperatur. Lavtsmeltende agarose, især "SeaPlaque"®-agarose, er et foretrukket størkningsmiddel ved fremgangsmåden beskrevet i det følgende.

Caselnhydrolysat: Caseinhydrolysat - enzymatisk 10 hydrolysat fra bovin mælk, type 1, Sigma Co., St. Louis, MO, USA.

Cellulase RS og R-10: Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo,

Japan.

^GelRite^fJ: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., 15 Fiskersville, R.I. USA.

"Nalgenew®-filter: Nalge Co., Divition of Sybron Corp.,

Rochester, New York, USA.

"Pectolyase"Y-23®; Seishin Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo,

Japan. 1 2 3 4 5 6 "Parafilm"®r "Parafilm"® laboratoriefilm - American Can 2

Co., Greenwich, CT, USA.

3

Almen rekombinant DNA-teknik 4

Da mange af rekombinant DNA-teknikkerne anvendt i 5 forbindelse med den foreliggende opfindelse er rutine for 6 en fagmand, gives der her en kort beskrivelse af disse almindeligt anvendte teknikker i stedet for i hvert enkelt tilfælde, hvor de anvendes i det følgende. Medmindre andet er anført er alle disse rutinemetoder beskrevet i litteraturhenvisningen Maniatis et al. (1982).

I DK 175536 B1 I

I 34 I

I A. Restriktlonsendonucleasespaltninger . I

I Typisk foreligger DNA i reaktionsblandingen i en koncen- I

I tration på fra ca. 50 til ca. 500 pg/ml i pufferopløsnin- I

I 5 gen anbefalet af producenten, New England Biolabs, I

I Beverly, MA. Der tilsættes 2-5 enheder restriktionsendo- I

I nuclease pr. μg DNA, og reaktionsblandingen inkuberes ved I

I den af producenten anbefalede temperatur i fra en til tre I

I timer. Reaktionen afbrydes ved opvarmning til 65eC i 10 I

I 10 minutter eller ekstraktion ved phenol efterfulgt af I

I fældning af DNA'et med ethanol. Denne teknik er også I

I beskrevet på s. 104-106 i Maniatis et al.-henvisningen. I

I B. Behandling af DNA med polymerase til dannelse af

I såkaldte "flush"-ender I

I 15 DNA-fragmenter sættes til en reaktionsblanding i en I

I koncentration på 50-500 /<g/ml i pufferen anbefalet af I

I producenten, New England Biolabs. Reaktionsblandingen I

I indeholder alle fire deoxynucleotidtriphosphater i en I

I koncentration på 0,2 mM. Reaktionsblandingen inkuberes ved I

I 20 15°C i 30 minutter, hvorefter reaktionen afbrydes ved I

I opvarmning til 65°C i 10 minutter. Til fragmenter dannet I

I ved spaltning med restriktionsendonucleaser, som danner I

I 5’-fremspringende ender, såsom EcoRl og BamHl, anvendes I

I det store fragment, eller Klenow-fragmentet, af I

I 25 DNA-polymerase. Til fragmenter dannet ved hjælp af endo- I

I nucleaser, som danner 3'-fremspringende ender, såsom Pstl I

I og SacI, anvendes T4 DNA polymerase. Anvendelsen af disse I

I to enzymer er beskrevet på s. 113-121 i Maniatis et al.- I

I henvisningen. I

I 30 C. Agarosegelelektroforese og rensning af DNA-fragmenter I

I fra geler I

I Agarosegelelektroforese gennemføres i et vandret apparat I

I som beskrevet på s. 150-163 i Maniatis et al.-henvisnin- I

DK 175536 B1 35 gen. Som puffer anvendes tris-boratpufferen beskrevet deri. DNA-fragmenter gøres synlige ved farvning med 0,5 μg/ml ethidiumbromid, som enten findes i gel- og tank-5 pufferen under elektroforesen, eller som tilsættes efter elektroforese. DNA synliggøres ved belysning med kortbølget eller langbølget ultraviolet lys. Når fragmenterne skal isoleres fra gelen, er den anvendte agarose den type, som størkner ved lav temperatur, og som fås fra Sigma 10 Chemical, St. Louis, Missouri. Efter elektroforese udskæres det ønskede fragment, hvorpå det anbringes i et plastrør, opvarmes til 65°C i ca. 15 minutter, hvorpå der ekstraheres tre gange med phenol og fældes to gange med ethanol. Denne fremgangsmåde er en lettere modificeret 15 udgave af fremgangsmåden beskrevet på side 170 i Maniatis et al.-henvisningen.

D. Tilsætning af syntetiske linkerfragmenter til DNA-ender Når man ønsker at tilføje et nyt restriktionsendonuclease-20 sted ved enden af et DNA-molekyle, omsættes molekylet om nødvendigt først med DNA-polymerase til dannelse af såkaldt "flush"-ender som beskrevet ovenfor i afsnit B.

Ca. 0,1-1,0 pg af dette fragment sættes til ca. 100 ng phosphoryleret linker DNA fra New England Biolabs i et 25 rumfang på 20-30 μΐ indeholdende 2 μΐ T4 DNA-ligase fra New England Biolabs og 1 mM ATP i den af producenten anbefalede puffer. Efter inkubering natten over ved 15°C afbrydes reaktionen ved opvarmning af blandingen ved 65*C i 10 minutter. Derpå fortyndes reaktionsblandingen til ca.

30 100 μΐ i en puffer, som er egnet til den restriktions- endonuclease, som spalter ved den syntetiske linker-sekvens, og der tilsættes fra ca. 50 til ca. 200 enheder af denne endonuclease. Blandingen inkuberes ved den hensigtsmæssige temperatur i 2-6 timer, hvorefter fragmentet 35 underkastes agarosegelelektroforese, og fragmentet renses som beskrevet ovenfor under C. Det dannede fragment har nu

36 I

DK 175536 B1 I

ender med termini dannet ved spaltning med restriktions- I

endonucleasen. Disse termini er sædvanligvis kohæsive, I

således at det dannede fragment nu let ligerer til andre I

5 fragmenter med de samme kohæsive termini. I

E. Fjernelse af 5'-terminale phosphater fra DNA- I

fragmenter I

Under plasmidkloningstrin nedsætter behandling af vektor- plasmidet med phosphatase recirkulariseringen af vektoren

10 (beskrevet på side 13 i Maniatis et al.-henvisningen). I

Efter spaltning af DNA’et med den hensigtsmæssige restrik- I

tionsendonuclease tilsættes 1 enhed alkalisk kalvetarm- I

phosphatase fra Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN. I

DNA'et inkuberes ved 37°C i 1 time, hvorpå der ekstra- I

15 heres to gange med phenhol og fældes med ethanol. I

F. Digering af DNA-fragmenter I

Til sammenføjning af fragmenter med komplementære kohæsive I

ender inkuberes ca. 100 ng af hvert fragment i en I

reaktionsblanding på 20-40 μΐ indeholdende ca. 0,2 enheder I

20 T4 DNA-ligase fra New England Biolabs i den af producenten I

anbefalede puffer. Inkuberingen gennemføres i 1-20 timer I

ved 15*0. Når der skal foretages samling af DNA-fragmenter I

med såkaldte "flush"-ender, foretages der inkubering som I

beskrevet ovenfor, bortset fra, at mængden af T4 I

25 DNA-ligase forøges til 2-4 enheder. I

G. Transformation af DNA til E. coli I

Til de fleste forsøg anvendes E. coli-stamme HB101. DNA I

indføres i E. coli under anvendelse af calciumchlorid- I

metoden beskrevet på s. 250-251 i Maniatis et al.-hen- I

30 visningen. Transformerede bakterier kan vokse selektivt på I

medier indeholdende egnede antibiotika. Denne selektive I

evne gør det muligt at skelne de ønskede bakterier fra I

DK 175536 B1 37 værtsbakterier, som ikke har modtaget transformerende DNA. Bestemmelse af det antibiotikum, som er hensigtsmæssigt i det pågældende tilfælde, er en rutinesag ud fra kendskab 5 til lægemiddel resi stensgenerne på det indgående transformerende DNA og lægemiddelfølsomheden hos værtsbakterien. Når værtsbakterien f.eks. vides at være følsom over for ampiclllin, og der findes et funktionelt lægemiddelresistensgen for ampiclllin på det indgående transforme-10 rende DNA, er ampiclllin et hensigtsmæssigt antibiotikum til selektion af transformanter.

H. Screening af B. coli for plasmider

Efter transformation screenes de dannede E. coli-kolonier for tilstedeværelse af det ønskede plasmid ved hjælp af en 15 hurtig plasmidisoleringsmetode. To hensigtsmæssige metoder er beskrevet på s. .356-369 i Maniatis et al.-henvisningen.

I. Isolering af plasmid DNA 1 stor målestok

Metoder til isolering af store mængder plasmider i E. coli er beskrevet på s. 88.94 i Maniatis et al.-henvisningen.

20 J. Kloning i M13-fagvektorer I den efterfølgende beskrivelse er det underforstået, at den dobbeltstrengede replikative form af fag M13-deriva-terne anvendes til rutinemetoder, såsom restriktions-endonucleasespaltninger, ligeringer, osv. 1 I. Identificering af interessante proteinaseinhibitorer.

I DK 175536 B1 I

I 38 I

I Eksempel 1 I

I In vitro-analyse til selektion af proteaseinhibitor(er), I

I som er virksomme mod målInsekter I

I 5 A. Analysemetode. Proteaseinhibitorer screenes I starten I

I for virkning mod det ønskede målinsekt ved måling af I

I specifikke inhibitorers evne til at inhibere proteolyse I

I ved hjælp af homogenater af insekttarmen. Tarme dissekeres I

I fra C02~anæstetiserede eller frosne larver på 2. eller 3. I

I 10 stadium. Tarmene fryses på fast carbondioxid umiddelbart I

I efter dissektionen. Tarmene homogeniseres i 100 mM Tris, I

I 10 mM EDTA, pH 8,5 (wolfson og Murdock, 1987) under anven- I

I delse af 5-10 μΐ puffer pr. tarm. Homogenatet centrifuge- I

I res ved 5000 o/m i 5 minutter ved 4®C til fjernelse af I

I 15 partikler, og supernatanten opbevares i 1 ml alikvoter ved I

I -20eC. Proteaseaktiviteten måles stort set under anvendel- I

I se af fremgangsmåden ifølge Wolfson og Murdock (1987) I

I under anvendelse af I^c-bsa (New England Nuclear) som I

I substratet og måling af solubiliseringsraten for radio- I

I 20 aktivt stof med tiden over et tidsrum på 32 minutter. I

I pH-Optimumværdien for proteaseaktiviteten bestemmes ved I

I måling af hydrolysemængden i hver enkel af nedenstående I

I puffere. I

I £H Puffer I

I 25 2,0 200 mM glycin/HCl I

I 3,0 200 mM glycin/HCl I

I 4,0 200 mM Ø-alanin/HCl I

I 5,0 200 mM natriumacetat I

I 6,0 100 mM natriumphosphat/hydrogenphosphat I

I 30 7,0 100 mM natriumphosphat/hydrogenphosphat I

I 8,0 100 mM Tris/HCl I

I 9,0 200 mM glycin/NaOH I

I Efterfølgende forsøg gennemføres ved pH-værdien ved maksi- I

I mumaktiviteten. Inhibitor inkuberes med homogenatet og I

DK 175536 B1 39 analysepuffer i 5 minutter ved 15®C. Substratet, 14C-methyleret bovint serumalbumin (NEN Products, Boston) indstillet til en specifik aktivitet på ca. 0,5 /xCi/mg med 5 umærket BSA, tilsættes, og alikvoter på 20 μΐ udtages efter henholdsvis 0, 2, 4, 8, 16 og 32 minutters forløb. Disse alikvoter sættes til 200 /il iskold 10% trichlor-eddikesyreopløsning og opbevares på is i 30 minutter. Prøver centrifugeres i 10 minutter ved 5000 o/m ved 4®C 10 til bundfældning af uopløseligt protein. To alikvoter på 75 /il af hver supernatant sættes til 8-10 ml Scintiverse II-scintallationsblanding til tælling, af antallet af radioaktive henfald. Solubiliseringsraten for radioaktiviteten bestemmes, og raten for hver enkel inhibitor sammen-15 lignes med raten for kontrollen.

B. Screening med tarmhomogenater fra Southern Corn Rootworm (Diabrotica undecimpunctata). Ved et typisk forsøg, hvor der anvendes tarmhomogenater fra Diabrotica undecimpunctata, bestemmes pH-værdien ved optimal 20 hydrolyse til at være pH 4. Et antal hibitorer testes i en standardanalysereaktionsblanding indeholdende 10 /il homogenat, 80.000 cpm 14C-BSA i et slutrumfang på 200 μΐ 0,2 M /3-alanin-HCl, pH 4,0. Pepstatinaktivitet analyseres i 0,2 M. glycin-HCl, pH 2,0. Typiske data er anført i 25 nedenstående tabel 1.

Tabel 1

Proteinaseinhibitorers virkning på proteinaseaktivitet i homogenater af D. undecimpunctata-tarme.

Klasse Inhibitorer Kone, (μςι/μΐ) % af kontrol 30 Thiol E-64 0,25 7,2

Antipain 0,1 19,8

Cystatin 0,072 30,9

Thiol+

Serin Leupeptin ^ 0,1 21,6

I DK 175536 B1 I

I 40 I

I Serin Aprotinin (bovin I

I pankreastrypsin- I

I inhibitor) 0,1 85,4 I

I 5 Kyllingtrypsininh. 0,1 62 I

I Kartoffel I chymo- I

I trypsininhibitor 0,1 55,4 I

I Kartoffel II chymo- I

I trypsininhibitor 0,1 42,8 I

I 10 Sojabønne I (Kunitz) I

I trypsininhibitor 0,1 69,7

I Sojabønne II (Bowman- I

I Birk) 0,1 72,5 I

I Limabønnetrypsininhi- I

I 15 bitor 0,1 161 I

I Sur Pepstatin 0,02 2,1 I

I Proteolyse ved hjælp af homogenater af D. virgifera og D. I

I balteata viser tilsvarende kraftig inhibering som følge af I

I inhibitorer af thiolproteaser. I

I 20 C. Inhibering af proteolyse i tarmhomogenater fra Western I

I Corn Root Worm (Diabrotica virgifera) og europæisk I

I kornborer (Ostrinia nubilalis). Proteinaseinhibitorer I

I testes for deres evne . til at inhiberer proteolytisk I

I aktivitet i homogenater af tarme fra Diabrotica virgifera I

I 25 og Ostrinia nubilalis under anvendelse af de ovenfor I

I beskrevne fremgangsmåder. De i nedenstående tabel 2 I

I anførte resultater er i overensstemmelse med data opnået I

I med andre inhibitorer, som viser, at tarmproteaser i I

I Ostrinia inhiberes af serinproteaseinhibitorer, medens I

I 30 dette ikke er tilfældet i Diabrotica. Især er eglin C (Arg I

I 45) yderst virksom ved inhibering af proteolyse ved hjælp I

I af O. nubilalis tarmhomogenater. Eglin C (Arg 45) er I

I væsentlig mere aktiv end eglin C og en anden trypsininhi- I

I bitor, nemlig "cowpea" trypsininhibitor (HiIder et al, I

I 35 1987). I

DK 175536 B1 41

Tabel 2

Inhibering af proteolyse i insekttarmhomogenater.

Inhibitor Kone. (Mg/μΐ) Procent af kontrol- 5 aktivitet D. virgifera O. nubilalis

Eglin C 0,5 107,6% 29,9%

Eglin C (Arg 45) 0,5 110,8% 3,4%

Leupeptin 0,002 6,2% 24,9% 10 "Cowpea” trypsin- inhibitor 0,5 99,2% 29,5%

Tabel 3

Inhibitorkoncentration som er nødvendige til 70%’s inhibering af proteolyse ved hjælp af 0. nubilalis tarm-15 homogenater.

Inhibitor IC70

Eglin C (Arg 45) 12 μΜ

Eglin C 62 μΜ "Cowpea" trypsin-20 inhibitor 50 μΜ

Eksempel2

Fodringsforsøg til udvælgelse af proteaseinhibitorer, som er virksomme mod m&linsekter

En alternativ fremgangsmåde til bestemmelse af 25 inhibitorers effektivitet mod et bestemt målinsekt er at inkorporere inhibitoren i foderet. Inhibitoropløsningen anbringes på overfladen af det normale foder (f.eks. unge majsblade til Ostrinia nubilalis og Heliothis zea, tobaksbladsgiver til H. virescens, majsrødder eller dyrket 30 majsvæv til Diabrotica sp.), hvorpå det henstår til

DK 175536 B1 I

42 I

tørring. Nyudklækkede larver anbringes på dette foder, og I

overlevelsesraten og vægten måles efter 5-6 dage. I

Eventuelt kan larver på 2. og 3. stadium vejes før og I

5 efter 3 dages anbringelse på det behandlede foder. I

A. Proteinaseinhibitorers virkning på væksten af I

Heliothis zea. 1 et typisk forsøg dækkes majsbladsstrimler I

(lxl cm) med 12 μΐ alikvoter af opløsninger af 10 mg/ml I

testmateriale og anbringes i individuelle, foderbægre med I

10 en nyudklækket H. zea-larve. Larvernes vægt bestemmes I

efter 5 dages forløb. Kontrolproteiner, såsom bovin

serumalbumin eller thaumatin, fremkalder en signifikant I

(P<0,05) vægtforøgelse sammenlignet med ubehandlede I

larver. Larver med serinproteaseinhibitorer, såsom Kunitz I

15 sojabønnetrypsininhibitor eller limabønnetrypsininhibitor, I

fremkalder en signifikant nedgang i larvevægten I

sammenlignet med kontrollen (tabel 4). I

Tabel 4 I

Virkning af proteinaseinhiberinger på væksten af nyudklæk- I

20 kede H. zea-larver. I

Behandling Gennemsni ts- n g I

vægt (mg) I

ubehandlet 3,41 15 I

BSA 6,65 13 0,005 I

25 thaumatin 4,57 15 0,1 I

sojabønnetrypsininhibitor 1 1,59 19 0,005 I

limabønnetrypsininhibitor 2,38 13 0,1 I

B. Proteinaseinhibitorers virkning på væksten af I

Diabrotica. Fodringsforsøg med Diabrotica sp. bekræfter I

30 det i eksempel 1 beskrevne in vitro-forsøg. I et repræ- I

sentativt forsøg udblødes celler fra en majscellesuspen- I

sionskultur i 2,5% saccharose indeholdende de ønskede I

mængder inhibitorer og gives til D. undecimpunctata-lar- I

DK 175536 B1 43 ver på 2. stadium. Vægtforøgelsen efter 5 dage er signifikant (t test p<0,05) mindre end hos kontroller, når cellerne er behandlet med leupeptin, antipain eller 5 pepstatin i koncentrationer på mere end 0,3 mg/ml. Ved tilsvarende forsøg hæmmes væksten af D. virgifera-larver ved så lave doser af leupeptin som 0,1 mg/ml (tabel 5).

Tabel 5

Proteaseinhibitorers virkning på væksten af Diabrotica-10 larver.

I DK 175536 B1 I 44

I C. Proteinaseinhibi torers virkning på væksten af I

I Ostrinia. Virkningen af eglin C (Arg 45) på vasksten af I

I nyudklækkede Ostrinia nubilalis-larver bestemmes under I

5 anvendelse af den ovenfor beskrevne forsøgsmetodik. I

Alikvoter af inhibitoropløsning anbringes på majsblads- I

stykker på 1 x 1 cm. Hvert bladstykke anbringes i et I

særskilt foderbæger sammen med en nyudklækket larve. Der I

testes 20 larver pr. dosis. Bægrene inkuberes ved 29°C 16 I

10 dage, hvorefter der foretages bestemmelse af overlevelses- I

rate, insekternes slutvægt og et bladareal. Påføring af I

I 125 fig eglin C (Arg 45) pr. bladstykke resulterer i en I

I signifikant formindskelse af larvernes slutvægt (p>0,05). I

I Typisk bevirker udsættelse for eglin C (Arg 45) en I

I 15 formindskelse af den gennemsnitlige larveslutvægt på ca. I

30% sammenlignet med ubehandlede kontroller. I

I II. Gener og vektorer. I

I Et proteaseinhibitorgen isoleres fra den kilde, hvor det I

I findes naturligt eller syntetiske, og om nødvendigt karak- I

20 teriseres det ved hjælp af konventionelle metoder. Hvis I

I genet er inducerbart, aktiveres det ved hjælp af den I

I egnede regulator. Det ved denne aktivering dannede HNA I

I isoleres og anvendes til konstruktion af et I

I cDNA-bibliotek. Dette bibliotek anvendes til differential- I

I 25 screening under anvendelse af radioaktivt mærket cDNA I

I dannet ud fra (1) RNA isoleret fra det aktiverede system,

I og (2) RNA isoleret fra et andet system, der ikke er akti- I

I veret på denne måde. cDNA-kloner svarende til inducerede I

I kloner isoleres og sekvenseres derefter. I

I 30 Hvis det ønskede gen ikke er kendt for at være inducer- I

I bart, kan det isoleres under anvendelse af immunologiske I

I fremgangsmåder. Proteaseinhibitorproteinet anvendes som I

I antigen til dannelse af antistof, som derefter anvendes I

I til screening af et rekombinant fag cDNA-bibliotek i I

I 35 X-G.T11 i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Young I

DK 175536 B1 45 og Davis (1983). Positive kloner screenes med radioaktivt mærkede blandede oligonucleotider (Wood et al., 1985) dannet ifølge proteinets kendte aminosyresekvens.

5 Eksempel 3

Proteinaseinhibitorgener A. Rensning af proteinaseinhibitorer. Mange proteinasein-hibitorer er kommercielt tilgængelige i renset eller delvis renset form, og der er publiceret oprensningsfor-10 skrifter for adskillige andre (angående udførlige henvisninger henvises til Barrett og Salvesen (1986)). Yderligere oprensning af materiale kan gennemføres ved anvendelse af affinitetskromatografi på søjler af det egnede inaktiverede enzym. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ved en typisk rensning med ananasbromelaininhibitor præ 2 pareres enzymkolonnen med bromelain på stort set samme 3 måde som beskrevet af Anastasi et al. (1983) for carboxy- 4 methylpapain. Bromelainet inaktiveres ved omsætning med 5 iodacetamid. Carboxymethyl-bromelainet kobles derefter til 6 CNBr-aktiveret "Sepharose"® (Pharmacia) under anvendelse 7 af den af producenten anbefalede fremgangsmåde. Efter 8

indgående vaskning af søjlen ækvillbreres den i 0,05 M

9

NaP04, pH 4,0, 0,5 M NaCl, 0,1% Brij 35 og behandles med 10 et søjlerumfang 50 mg/ml bovin serumalbumin i den samme 11 puffer til blokering af uspecifikke bindingssteder. Søjlen 12 vaskes omhyggeligt, og det delvis rensede bromelain 13 (Sigma) opløst i pH 4,O-puffer indeholdende 10% glycerol i 14 stedet for Brij 35 sættes til søjlen. Efter omhyggelig 15

vaskning med pH 4,0-puffer elueres søjlen med 0,05 M

16

NaP04, pH 11,5, 0,5 M NaCl, 10% glycerol. Aktiviteten måles ved testning af evnen til at inhibere .nedbrydningen af l^C-BSA ved hjælp af bromelain.

I DK 175536 B1 I

I 46 I

I Ved isolering af inhibitorer, som har en høj aktivitets- I

I grad på proteasen i et specifikt insekt, kan rensnings- I

I effektiviteten afprøves under anvendelse af den i eksempel I

I 51 beskrevne prøve. For at forøge selektiviteten kan I

I insektenzymet renses ved affinitetskromatografi på en I

I inhibitorsøjle og derpå anvendes til fremstilling af en I

affinitetssøjle til rensning af nye inhibitorer. I

I Om nødvendigt kan der gennemføres yderligere rensning af I

I 10 inhibitorer til proteinsekvensering under anvendelse af I

omvendtfase HPLC. I

I B. Aminosyresekvensering af proteinaseinhibitorer. I I

I tilfælde af proteiner, hvis aminosyresekvens ikke allerede I

I er beskrevet i litteraturen, bestemmes aminosyresekvensen I

15 ved automatisk Edman-nedbrydning under anvendelse af et I

I proteinsekvenseringsapparat model 470A (Applied I

I Biosystems, Foster City, CA) forsynet med en on-line I

I omvendtfase HPLC til analyse af phenylthiohydantionderiva- I

I terne af aminosyrerne og et dataanalysesystem model 900. I

I 20 Peptider produceres ved enzymatisk spaltning med trypsin, I

I Lys-C (lycinendopeptidase), Arg-C (argininendopeptidase) I

I eller Glu-C (Staphylococcus aureus protease V8) og isole- I

I res ved omvendt HPLC inden sekvenseringen. I

I C. Syntese af et gen, som koder for proteinaseinhibitor: I

I 25 Hønseæggehvidecystatin. Til proteiner med mindre end 150 I

I aminosyrer, hvis aminosyresekvens er fuldstændig kendt, I

I kan der konstrueres et gen ved DNA-syntese. I tilfælde af I

I hønseæggehvidecystatin tilbagetranslateres aminosyrese- I

I kvensen (Schwabe et al., 1984 og Turk et al., 1983) under I

I 30 anvendelse af den genetiske kode med kodonfrekvensen I

I beregnet ud fra alle tilgængelige majsproteiner i GenBank I

I databanken under anvendelse af computerprogrammer fra I

I Genetics Computer Group ved University of Wisconsin. I

I Translationsstop- og -startsignaler tilføjes sammen med I

I 35 BamHI linkere ved begge ender af hensyn til de efterføl- I

DK 175536 B1 47 gende trin. På denne måde opnås den fig. 9 viste sekvens.

Oligonucleotider svarende til områderne A-K (fig. 10) syntetiseres under anvendelse af et DNA-synteseapparatur 5 model 380A (Applied Biosystems, Foster City, CA) med Ø-cyanoethyl-kemi.

Genet samles i tre trin:

(1) Addition af 5'-phosphat: Et 5'-phosphat adderes til 5'-enderne af alle fragmenter bortset fra fragmenterne A

10 og K ved blanding 40 pmol af fragmenterne henholdsvis B, C, D, E, F, G, Η, I og J med T4-polynucleotidkinase i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i Maniatis et al. (1982).

(2) Annellering: Efter fjernelse af overskud af reagens 15 ved ekstraktion med phenol/chloroform, ekstraktion med chloroform og fældning med ethanol opløses bundfaldet, som indeholder de phosphoryleréde fragmenter, i T4-ligase-puffer. Der tilsættes 40 pmol af fragment A og fragment K, blandingen opvarmes til 85°C, hvorpå den langsomt afkøles 20 til 15eC og holdes ved denne temperatur i mindst 4 timer for at fragmenterne kan annellere.

(3) Ligering: ATP tilsættes til 1 mM sammen med T4-ligase, og inkuberingen fortsættes i 4 timer. Reagenserne fjernes ved ekstraktion og fældning som beskrevet i 25 trin (1). For at kontrollere reaktionens effektivitet analyseres en alikvot af produkterne på en 10-15%'s acryl-amidgel. Der optræder et synligt 363 bp bånd. Om nødvendigt kan de tilsvarende DNA-fragmenter renses ved præparativ gelelektroforese, inden der foretages ligering 30 i vektoren.

I DK 175536 B1 I

I 48 I

D. Syntese af et gen, som koder for en proteinaseinhi- I

I bitor: Eglin C og Eglin C-mutanter. I

I (1) Eglin C-gen: Fremstilling af plasmidet pML147 inde- I

I 5 holdende eglin C-genet er beskrevet i beskrivelsen til I

I europæisk patentansøgning nr. 146.785. Stammen E. coli I

HB101/pML147, som indeholder dette plasmid, er blevet I

I deponeret den 28. januar 1988 i Deutsche Sammlung von I

I Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 I

I 10 Braunschweig, Forbundsrepublikken Tyskland under nummeret I

I DSM 4380. 230 bp EcoRI-BamHI fragmentet indeholdende det I

I komplette eglin C-gen isoleres fra 10 μg plasmid pML147 I

I ved hjælp af spaltning med restriktionsendonucleaserne I

I EcoRI og BamHl og efterfølgende elektroforese på 1,5% I

I 15 lavtsmeltende agarose. EcoRI-enden omdannes til en I

I BamHl-ende ved ligering med den egnede linker, der vælges I

I således, at kodningssekvensen vil foreligge i den korrekte I

I aflæsningsstruktur. Efter isolering indsættes det modifi- I

I cerede fragment i BamHI-stedet i CaMV35S-promotoren i I

I 20 pC!B710-vektoren som beskrevet i eksempel 5. I

I (2) M13-kloning af Eglin C-genet: Ca. 0,5 μg af 230 bp I

I EcoRI-BamHI-fragmentet indeholdende det komplette eglin I

I C-gen isoleres fra 10 μg plasmid pML147 som beskrevet I

I ovenfor. Dette DNA-fragment (10 ng) blandes med 40 ng

I 25 M13mp8, som forinden er spaltet med EcoRI og BamHl, og der I

I inkuberes i 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, I

I 10 mM dithiothreitol i nærværelse af 0,125 enheder T4-DNA- I

I ligase i et rumfang på 15 /il (Zoller et al., 1983). Den I

I dannede opløsning anvendes til at transformere E. I

I 30 coli-stamme JM101 (Zoller et al., 1983). Transformations- I blandingen påføres som et overtræk på X-Gal I (IPTG-indikatoragar) plader (Zoller et al., 1983). Der fås I . 40 blå (vildtype) plague og 650 farveløse plaque.

I (3) Fremstilling af M13mp8 enkel tstrenge t DNA: 2 ml af en I

I 35 kultur af E. coli JM101 dyrket i L-medium (10 g/1 Bacto M

DK 175536 B1 49 trypton, 5 g/1 Bacto gærekstrakt, 5 g/1 NaCl, 5 g/1 glucose, 0,1 g/1 ampicillin op til en 0Dg23 på ca. 0,5 inokuleres med en farveløs plague udtaget fra agarpladen 5 (se ovenfor), og blandingen holdes i ca. 4-5 timer ved 37®C og 180 o/m. Derefter centrifugeres den dyrkede kultur i 5 minutteri en Eppendorf-centrifuge. Supernatanten overføres til et frisk centrifugerør, og der foretages atter centrifugering. Derpå tilsættes 200 μΐ 20%'s PEG, 1,5 M 10 NaCl, og blandingen holdes ved stuetemperatur i 20 minutter, hvorpå den atter centrifugeres. Supernatanten hældes bort, og pelletten opløses i 100 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM EDTA (TE-puffer). Blandingen blandes med 50 μΐ phenol/TE-puffer, holdes i 15 minutter ved stuetempe-15 ratur, hvorpå den centrifugeres i 5 minutter i en Eppendorf-centrifuge. Til 100 μΐ supernatant sættes 10 μΐ natriumacetat-puffer, pH 6, og 250 μΐ absolut ethanol, og blandingen holdes ved -20eC natten over, hvorpå den centrifugeres som beskrevet ovenfor i 10 minutter. Pelletten 20 vaskes med 1 ml 80%'s ethanol, og der centrifugeres atter. Pelletten tørres ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorpå den opløses i 50 μΐ TE-puffer. Opløsningen indeholder ca.

5 μg Ml3mp8 enkeltstrenget DNA.

(4) Fremstilling af genet, som koder for Eglin C (Arg 25 45): Der anvendes en fremgangsmåde ifølge Zoller et al., 1983, der er kendt under betegnelsen "site directed mutagenesis". Nedenstående nucleotid fremstilles ved kemisk syntese til mutagenesen af Eglin C-genet: * 30 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3'

Den med * mærkede base er forskellig fra den tilsvarende base i den kodende streng i eglin C-genet (a T) og vil til sidst bevirke mutationen fra Leu45 til Arg45. 10 μΐ af oligonucleotidet (1 OD/ml = 500 ng) kinasebehandles i 20 35 μΐ 0,07 M Tris-HCl pH 7,6, 0,01 M MgCl2, 50 mM dithio-

I DK 175536 B1 I

I 50 1

I threitol med γ-32ρ ATP og 74 polynucleotidkinase I

I (Boehringer) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge I

I Maniatis et al. (1982) s. 125. Det kinasebehandlede oligo- I

I 5 nucleotid opløses ilO ml TE-puffer (50 ng/μΐ). I

I 1 /ig af M13mp8 enkeltstrenget DNA og 50 ng af den kinase- I

I behandlede oligonucleotidprimer i 10 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH

I 7,8, 100 mM MgCl2 holdes ved 45eC i 30 minutter, og derpå

I i 5 minutter ved stuetemperatur til annellering. Der I

I 10 tilsættes 1 μΐ af henholdsvis 10 mM dATP, dGTP, dCTP og I

I sTTP, 1 μΐ T4 DNA-ligase, 2 μΐ 50 mM dithiothreitol, 1 |il I

I 10 mM ATP, 1 μΐ gelatine (5 mg/ml), 1 μΐ 10 x I

I Klenow-puffer (0,66 M Tris-HCl pH 7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM I

I dithiothreitol) og 1 μΐ (2,5 enheder) DNA polymerase I

I 15 (Klenow-fragment). Blandingen holdes ved 22*C i 5 I

I minutter, og derpå ved 15°C i 16 timer, hvorpå den til I

I sidst adskilles ved elektroforese på 1% agarose. Det I

I opnåede cirkulære, dobbeltstrengede DNA synliggøres ved I

I ethidiumbromid og isoleres fra gelen ved elektroeluering I

I 20 (ca. 10 ng i 15 μΐ TE-puffer). 5 μΐ (ca. 3,5 ng) af det på I

I denne måde opnåede DNA transformeres til E. coli-stamme H

I JM101, der anbringes som overtræk på X-Gal/IPTG-indikator- I

I plader (se ovenfor). Der fås ca. 100 farveløse plague. I 1

40 af disse plague anvendes enkeltvis til at inokulere 2 I

I 25 ml E. coli JMlOl-kultur (se afsnit (3)). Efter dyrkning af I

I E. coli-cellerne centrifugeres kulturerne til adskillelse I

I af E. coli-cellerne fra supematanterne, som indeholder I fager og enkeltstrenget DNA. Cellepelletterne indeholder

I allerede det tilsvarende muterede dobbeltstrengede DNA. 50 I

I 30 μ 1 af hver af de 40 fag-supernatanter filtreres over I

I nitrocellulose, vaskes to gange med TE-puffer, opbevares I

I under vakuum i 2 timer ved 80°C og undersøges i overens- I

I stemmelse med Southern (1975) for tilstedeværelse af den I

I muterede DNA-sekvens under anvendelse oligonucleotidpri- I

I 35 meren som en radioaktiv probe ved hybridiseringen. 12 H

I fag-supernantanter, der muligvis indeholder eglin C H

DK 175536 B1 51 (Arg45)-genet, Identificeres. Fire af disse positive fag-supernatanter fortyndes i forholdet ca. 1:10^, blandes med E. coli-stamme JM101 og anbringes som overtræk på indika-5 toragar. Tre fager fra hver af de dannede plague isoleres.

Det enkeltstrengede DNA isoleres derfra på samme måde som beskrevet ovenfor. Disse 12 enkeltstrengede DNA1er sekvenseres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Sanger (1977 og 1981). Alle 12 enkeltstrengede DNA’er udviser den 10 ønskede muterede eglin C-sekvens. Med en minipræparation præpareres derpå det pågældende muterede dobbelstrengede DNA (eglin C (Arg45)-gen i plasmid M13mp8) ud fra de tilsvarende E. coli-cellepellets (se ovenfor). Ved restriktionsspaltning med endonucleaserne EcoRI og BamHI 15 udskæres EcoRI-BamHl-insertet, som indeholder det muterede gen, fra vektoren, hvorpå det isoleres og klones i vektoren pHRil48/EcoRl/BamHI (europæisk patentansøgning nr. 146.785). Det derved opnåede plasmid pJPG18 isoleres og transformeres til E. coli-stamme HB101.

20 230 bp EcoRI-BamHI fragmentet, som indeholder det muterede eglin C (Arg45)-gen, udskæres atter af vektoren pJPG18, hvorpå det tilpasses som beskrevet ovenfor i afsnit (1) for det ikke-muterede eglin C-gen.

(5) Fremstilling af genet, som koder for eglin C (Pro44): 25 Mutationen Thr44 til Pro44 gennemføres analogt med den ovenfor i afsnit (4) beskrevne fremgangsmåde. Det anvendte mutagen af oligonucleotid har strukturen * 5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' 2 3 4 5 6 7 2

Den med * mærkede base er forskellig fra den tilsvarende 3 base i den kodende streng i eglin C-genet (et A) og vil 4 til sidst fremkalde mutationen fra Thr44 til Pro44. Ved 5 oparbejdning af mutationsblandingen opnås 18 mulige eglin 6 C (Pro44)-mutanter. Ved kloning af eglin (Pro44) DNA’et i 7 vektoren pHRil48/EcoRI/BamHI opnås plasmid pJB591, som

I DK 175536 B1 I

I 52 I

I anvendes son beskrevet ovenfor.

I Eksempel 4 I

I Konstruktion af en Ti-plasmidafledt vektor I

I 5 Vektoren pCIBlO (Rothstein et al., 1987) er en Ti-plasmid- I

I afledt vektor, der er nyttig til overførsel af det kimære I

I gen til planter via Agrobacterium tumefaciens. Vektoren er I

I afledt af bredværtområdeplasmidets pRK252, som kan fås hos I

I Dr. ' W. Barnes, Washington University, St. Louis, MO. I

I 10 Vektoren indeholder også et gen for kanamycinresistens i I

I Agrobacterium fra Tn903 og venstre og højre T-DNA-grænse- I

I sekvenser eller kant-sekvenser fra Ti-plasmidet pTiT37. I

I Mellem kantsekvenserne findes polylinkerområdet fra plas- I midet pUC18 og et kimært gen, som tilvejebringer kanamy- I 15 cinresistens i planter. 1

Først modificeres plasmid pRK252 således, at genet, der I

I tilvejebringer tetracyclinresistens, ombyttes med et gen,

I som tilvejebringer kanamycinresistens, fra transposonet I

I Tn903 (Oka et al., 1981), og det modificeres endvidere ved I

I 20 ombytning af det entydige EcoRI-sted i pRK252 med et I

I Bglll-sted (se fig. 6 angående en sammenfatning af disse I

I modifikationer). Plasmid pRK252 spaltes først med endo- I

I nucleaserne Sall og Smal, hvorefter det behandles med det I

I store fragment af DNA-polymerase I til dannelse af I

I 25 såkaldte "flush"-ender, og det store vektorfragment renses I

I ved agarosegelelektroforese. Derefter spaltes plasmid p368 I

I med endonuclease BamHI, behandles med det store fragment I

I af DNA-polymerase, og efter agarosegelelektroforese isole- I

I res et ca. 1050 bp fragment. Dette fragment indeholder H

I 30 genet fra transposon Tn903, der tilvejebringer resistens I

I mod antibiotikumet kanamycin (Oka et al., 1981). Plasmid I

I p368 er deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret I

I 67700. Begge fragmenter behandles derpå med det store I

I fragment af DNa-polymerase til dannelse af "flush"-ender.

DK 175536 B1 53

Begge fragmenter blandes og Inkuberes med T4-DNA-ligase natten over ved 15eC. Efter transformation i E. coli-stamme HB101 og selektion for kanamycinresistente kolonier 5 fås plasmid pRK252/Tn903.

Plasmid pRJ252/Tn903 spaltes ved dets entydige EcoRI-sted, hvorpå det behandles med det store fragment af E. coli DNA-polymerase til dannelse af "flush"-ender. Dette fragment adderes, til syntetiske Bglll-restriktionssted-10 linkere, og der inkuberes natten over med T4-DNA-ligase.

Det dannede DNA spaltes med overskud af Bglll-restrik-tionsendonuclease, og det store vektorfragment renses ved agarosegelelektroforese. Det dannede fragment inkuberes igen med T4-DNA-ligase til recirkularisering af fragmentet 15 ved hjælp af de nyadderede Bglll-kohæsive ender. Efter transformation i E. coli-stamme HB101 fås plasmid pRK252/Tn903/BglII (se fig. 1).

Der konstrueres et derivat af plasmid pBR322, som indeholder Ti-plasmid T-DNA-kanterne, polylinkerområdet af plas-20 mid pUC19 og det selekterbare gen for kanamycinresistens i planter (se fig. 2). Plasmid pBR325/Eco29 indeholder 1,5 kbp EcoRI-fragmentet fra nopalin Ti-plasmid pTIT37. Dette fragment indeholder den venstre T-DNA-kantsekvens (Yadav et al., 1982). Til ombytning af EcoRI-enderne i dette 25 fragment med Hindlll-ender spaltes plasmid pBR325/Eco29 DNA med EcoRI, hvorpå der inkuberes med nuclease SI og derpå med det store fragment af DNA-polymerase til dannelse af "flush" eller lige ender, hvorpå der blandes med syntetiske Hindlll-linkere og inkuberes med T4-DNA-30 ligase. Det dannede DNA spaltes med endonucleaser Clal> og overskud af Hindlll, og det dannede 1,1 kbp fragment, som indeholder den venstre T-DNA-kant, renses ved gelelektro-forese. Derefter isoleres polylinkerområdet af plasmid pUC19 ved spaltning af plasmid DNA'et med endonucleaser 35 EcoRI og Hindlll, og det mindre fragment (ca. 53 bp) isoleres ved agarosegelelektroforese. Dernæst spaltes

I DK 175536 B1 I I 54 I

I plasmid pBR322 med endonucleaserne EcoRI og Clal, hvorpå I I der blandes med de to andre isolerede fragmenter, inkube- I I res med T4-DNA-ligase og transformeres til E. coli-stamme I I 5 HB101. Det dannede plasmid pCIB5, indeholder polylinkeren I I og den venstre T-DNA-kant i et derivat af plasmid pBR322 I I (se fig. 2). I

I Der konstrueres et plasmid, som indeholder genet for eks- I I pression af kanamycinresistens i planter (se fig. 4). I I 10 Plasmid Bin6 stilles til rådighed af Dr. M. Bevan, Plant I I Breeding Institute, Cambridge, GB. Dette plasmi er beskre- I I vet i litteraturhenvisningen af Bevand (1984). Plasmid I I Bin6 DNA spaltes med EcoR og HindiII, og fragmentet på ca. I I 1,5 kbp, som indeholder det kimære neomycinphosphortrans- I I 15 ferase (NPT)-gen, isoleres og renses ved agarosegelelek- I I troforese. Dette fragment blandes derefter med plasmid I I pUC18-DNA, som er spaltet med endonucleaserne EcoRI og I I Hindlll. Efter inkubering med T4-DNA-ligase transforme- I I res det dannede DMA til E. coli-stamme HB101. Det dannede I I 20 plasmid betegnes pUC18/neo. Dette plasmid DNA indeholder I I en uønsket BamHI-genkendelsessekvens mellem neomycinphos- I I phortransferasegenet og terminatorsekvensen for nopalin- I I syntasegenet (se Bevan, 1984). Til fjernelse af denne I I genkendelsessekvens spaltes plasmid pUC18/neo med I I 25 endonuclease BamHI efterfulgt af behandling med det store I I af DNA-polymerase til dannelse af lige ender. Fragmentet I I inkuberes derefter med T4-DNA-ligase til recirkularisering I I af fragmentet, og det overføres til E. coli-stamme HB101. I I Det dannede plasmid, pUC19/neo (Barn) har mistet BamHI-gen- I I 30 kendelsessekvensen. I

I Den højre T-DNA-kantsekvens tilføjes derpå ved siden af I I det kimære NPT-gen (se fig. 4). Plasmid pBR325/Hind23 I I indeholder 3,4 kbp HindiII-fragmentet af plasmid pTiT37. I I Dette fragment indeholder den højre T-DNA-kantsekvens I I 35 (Bevan et al., 1983). Plasmid pBR325/Hind23 DNA spaltes I I med endonucleaserne Sacll og Hindlll, og der isoleres et H

DK 175536 B1 55 1,9 kbp fragment indeholdende den højre kant, og det renses ved agarosegelelektroforese. Plasmid pUC18/neo(Bam) DNA spaltes med endonucleaserne Sacll og Hindlll, og 4,0 5 kbp vektorfragmentet isoleres ved hjælp af agarosegelelektroforese. De to fragmenter blandes, inkuberes med T4-DNA ligase og overføres til E. coli-stamme HB101. Det dannede plasmid, pCIB4 (fig. 4), indeholder den højre T-DNA-kant og den planteselekterbare markør for kanamycinresistens i 10 et derivat af plasmid pUC18.

Derefter konstrueres et plasmid, som indeholder både de venstre og højre T-DNA-kanter, med det planteselekterbare kanamycinresistensgen og polylinkeren af pUC18 mellem kanterne (se fig. 5). Plasmid pCIB4 DNA spaltes med 15 endonuclease Hindlll, hvorpå der foretages behandling med det store fragment af DNA-polymerase til dannelse af lige ender, efterfulgt af spaltning med endonuclease EcoRI. 2,6 kbp fragmentet, som indeholder det kimære kanamycinresistensgen og den højre T-DNA-kant, isoleres ved hjælp af 20 agarosegelelektroforese. Plasmid pC!B5 DNA spaltes med endonuclease Aatll, behandles med T4-DNA-polymerase til dannelse af lige ender, hvorpå det spaltes med endonuclease EoRI. Det store vektorfragment renses ved agarosegelelektroforese, blandes med pCIB4 fragmentet, inkuberes med 25 T4 DNA-ligase og transformeres til E. coli-stamme HB101.

Det dannede plasmid, pCIB2 (fig. 5), er et derivat af plasmid pBR322 indeholdende de ønskede sekvenser mellem de to T-DNA-kanter.

De efterfølgende trin færdiggør konstruktionen af vektoren 30 pCIBlO og er vist i fig. 6. Plasmid pClB2 DNA spaltes med endonuclease EcoRV, og der tikføjes syntetiske linkere indeholdende Bglll-genkendelsessteder som beskrevet ovenfor. Efter spaltning med overskud af Bglll endonuclease isoleres ca. 2,6 kbp fragmentet efter agarosegelelektro-35 forese. Plasmid pRK252/Tn903/BglII, beskrevet ovenfor, spaltes med endonuclease Bglll, hvorpå der behandles med

I DK 175536 B1 I

I 56 I

I phosphatase til at forhindre recirkularisering. Disse to I

I DNA-fragmenter blandes, inkuberes med T4-DNA-ligase og I

I transformeres til E. coli-stamme HB101. Det dannede I

I 5 plasmid er den komplette vektor, pCIBlO. I

I Eksempel 5 I

I Konstruktion af et kimært gen med CaMV 35S-promotoren I

I (A) Konstruktion af et CaMV 35S-promotor-kassette- I

I plasmid. pCIB710 konstrueres som vist i fig. 7. Dette I

I 10 plasmid indeholder CaMV-promotor og transkriptionsstop- I

I sekvenser for 35S RNA-transkriptet (Corvey et al., 1981). I

I Et 1149 bp Bglll restriktionsfragment af CaMV DNA (bp I

I 6494-7643 i Hohn et al., 1982, 194-220 og tillæg A til G) I

I isoleres fra plasmid pLWlll, som den 14. maj 1986 under I

I 15 deponeringsnummeret ATCC 40235 er deponeret ved American I

I Type Culture Collection. Fragmentet kan eventuelt isole- I res direkte fra CaMV DNA ved præparativ agarosegelelektro-

I forese. Det blandes med BamHI-spaltet plasmid pUC19 DNA, I

I behandles med T4-DNA-ligase og transformeres til E. coli.

I 20 (Bemærk at BamHl-restriktiorisstedet i det dannede plas- I

I mid er blevet ødelagt ved ligering af de kohæsive

I Bglll-ender til de kohæsive BamHI-ender). Det dannede I

I plasmid, som betegnes pUC19/35S, anvendes derefter til I

I oligonucleotiddirigeret in vitro mutagenese til indsæt- I

I 25 ning af BamHI-genkendelsessekvensen GGATCC umiddelbart I

I efter CaMV nucleotid 7483 (som betegnet i Hohn et al.,

I 1982). Det dannede plasmid pC!B710, indeholder CaMV I

I 35S-promotorområdet og transkriptionsstopområdet adskilt I

I af et BamHI-restriktionssted. DNA-sekvenser indsat i dette I

I 30 BamHI-sted vil blive udtryk i planter ved hjælp af disse

I CaMV-transkriptionsreguleringsekvenser. (Bemærk også, at I

I pCIB710 ikke indeholder ATG-translationsstartkodoner I

I mellem transkriptionsstarten og BamHI-stedet).

I (B) Indsætning af CaMV35S-promotor/terminatorkassetten i I

DK 175536 B1 57 pCIBlO. De efterfølgende trin er vist i fig. 8. Plasmid pCIBlO og pCIB710 DNA'er spaltes med EcoRI og Sall, blandes og ligeres. Det dannede plasmid, pCIBlO/710, har 5 CaMV 35S-promotor/terminatorkassetten indsat i plante-transformationsvektoren pCIBlO. CaMV 35S-sekvenserne findes mellem T-DNA-kanterne i pCIBlO og vil således blive indsat i plantegenomet ved plantetransformationsforsøg.

C. Overførsel til Agrobacterium. Til overføring af det 10 binære pCIB10-afledte plasmid fra E. coli HB101 til Agrobacterium anvendes en E. coli mellemværtsstamme S17-1.

Denne stamme, som kan fås fra Agrigenetics Research Corp., Boulder, Co., er beskrevet i Simon et al., (1983a). Den indeholder mobiliseringsfunktioner, som kan overføre 15 plasmid pCIBlO direkte til Agrobacterium via konjugation, hvorved man undgår nødvendigheden af at transformere nøgent plasmid DNa direkte til Agrobacterium. Først indføres plasmid pCIB10-DNA i calciumchloridbehandlede S17-1-celler. Derefter blandes kulturer af transformerede 20 S17-l-celler og A. tumefaciens-stamme LBA 4404 (Ooms et al., 1981), og de parres på en N-agarplade (difco) natten over ved stuetemperatur. Med en podenål udstryges de dannede bakterier på AB minimalmedium (Ditta et al., 1984), udplades med 50 pg/ml kanamycin og inkuberes ved 25 28eC. Kolonier genstryges på det samme medium, hvorpå de genstryges på N-agarplader. Langsomtvoksende kolonier udtages, genudstryges på AB-minimalmedium med kanamycin, og enkelte kolonier isoleres. Ved denne metode selekteres agrobakterier, der indeholder pCIBlO-plasmidet.

30 III. Transformation og regenerering.

Eksempel 6

Transformation af tobak

Protoplaster fra Nicotiana tabacum cv "Coker 176" frem-

I DK 175536 B1 I

I 58 I

I stilles på følgende måde: 4-5 uger gamle skudkulturer I

I dyrkes under aseptiske betingelser i MS-medium uden I

I hormoner ved 16®C i en periode med 16 timers lys og 8

I 5 timers mørke. Fra planten udtages ca. 1,5 g bladvæv, som I

I fordeles ensartet på 8-10 petriskåle (100 x 25 mM, I

I Lab-Tek), som hver indeholder 10 ml enzymopløsning. I

I Enzymopløsningen indeholder 1% cellulase R-10, 0,25%

I macerase fra Calbiochem Co., 1% pectolyase Y-23 fra I

I 10 Seishin Pharmaceutical Co., 0,45 M mannitol og 0,1 x K3 I

I salte (Nagy og Maliga, 1976). Tobaksbladende udskæres i I

I tynde strimler med en skalpel, skålene forsegles, I

I anbringes på et vandret roterende rysteapparat ved 35 o/m I

I og inkuberes med enzymerne i 4-5 timer ved stuetemperatur. I

I 15 Derpå filtreres skålenes indhold gennem en tragt forsynet I

I med ostelærred, og indholdet opsamles i en kolbe. I

I Filtratet pipetteres til Babcock-kolber, som indeholder 35 I

I ml skyl leopløsning. Skyl leopløsningen indeholder 0,45 Μ I

I saccharose, 0,1% MES og 0,1 x K3 salte. Kolberne centrifu- I

I 20 geres ved 80 G i 10 minutter, hvorefter protoplasterne I

I flyder i toppen af kolben. Protoplasterne udtages med en 1 I

I ml pipette, anbringes sammen i en kolbe og skylles yder- I ligere to gange. De fremkomne protoplaster suspenderes i

I K3-medium i et 15 ml engangscentrifugerør. Koncentratio- I

I 25 nen af protoplaster bestemmes ved tælling i et Fuchs- I

I Rosenthai-hæmocytometer. Protoplasterne udplades derefter I

I med en tæthed på 100.000/ml i 6 ml flydende ^-medium pr.

I petriskål (100 x 20 mm, Corning). Skålene indeholdende I

I protoplasterne inkuberes ved 26°C i mørke i 2 dage, I

I 30 hvorunder cellevæggene regenereres.

I Efter to-dages inkubation sættes 5 μΐ af en stationær I

I kultur af A. tumefaciens indeholdende de ønskede plasmi- I

I der (dyrket i YEP-medium indeholdende 50 μg kanamycin pr. I

I ml ved 28°C til den stationære fase er nået) til skålen I

I 35 med protoplaster. Efter inkubering i yderligere 3 dage ved I 26°C tilsættes cefotaxim (Calbiochem) til en slutkoncen- DK 175536 B1 59 tration på 500 jig/ml for at dræb© agrobakterierne. Den efterfølgende dag fortyndes cellerne med 3 ml frisk K3-medium pr. skål, og der tilsættes atter cefotaxim 5 (slutkoncentration 500 /ig/ml). Celler dyrkes derpå ved 26eC i 2-3 uger, hvorpå de screenes på selektivt medium som beskrevet af de Block et al., (1984).

Eksempel 7

Regenerering af bomuldsplanter ud fra kimbladeksplantater 10 A. Bomuld varietet Acala SJ2 i "Regular Callus Inducing Medium". Frø af Gossypium hirsutum varietet Acala SJ2 (bomuld) steriliseres ved kontakt med 95%'s alkohol i 3 minutter, hvorpå de skylles to gange med sterilt vand og neddyppes i en 15%'s natriumhypochlori topløsning i 15 15 minutter, hvorpå de til sidst skylles i sterilt vand. Steriliserede frø bringes til spiring på et agargrund-medium i mørket i ca. 14 dage til dannelse af kimplanter. Kimplanternes kimblade skæres i stykker, som overføres under aseptiske forhold til et callusinducerende medium 20 bestående af Murashige øg Skoog (MS) major og minor salte tilsat 0,4 mg/1 thiamin-HCl, 30 g/1 glucose, 2,0 mg/1 NAA, 1 mg/1 kinetin, 100 mg/1 myo-inositol og agar (0,8%). Kulturerne inkuberes ved ca. 30eC under betingelser med 16 timers lys og 8 timers mørke i en Percival-inkubator med 25 fluorescerende lys (koldt dagslys), der giver en lysintensitet på ca. 2000 til 4000 lx. På de dannede vævsstykker dannes i løbet af 3-4 uger calli, som har en hvid til grågrøn farve. De dannede calli underdyrkes hver 3.-4. uge på et callusvækstmedium indeholdende MS-medium, som inde-30 holder 100 mg/1 myo-inositol, 2,0 g/1 saccharose, 2 mg/1 NAA og agar. Somatisk kim dannes 4-6 måneder efter den første anbringelse af vævseksplantaterne på det callus-inducerende medium. Callus og kimene holdes på callus-vækstmedium ved underdyrkning på frisk callusvækstmedium 35 hver 3. til 4. uge.

60 I

DK 175536 B1 I

Somatiske kim, som dannes på vævsstykker, overføres enten

til frisk callusvækstmedium eller til Beasley og Ting I

(1973)'s medium (kimspiringsmedium). De somatiske små

5 planter, der dannes ud fra somatiske kim, overføres til I

Beasley og Ting's medium, som indeholder 15 mg/1 ammonium- nitrat og 15 mg/l caseinhydrolysat som organisk nitrogen-

kilde. Mediet størknes med et størkningsmiddel I

("GelRite"®), og småplanter anbringes i Magenta-kasser. De 10 somatiske kim udvikles til småplanter i løbet af ca. 3

måneder. Småplanterne danner rødder på 6-8 bladstrinet I

(højde ca. 7,5-10 cm) og overføres til jord og holdes i en I

inkubator under høj fugtighed i 3-4 uger, hvorefter de I

overføres til et væksthus. Efter hærdning overføres 15 planterne til friland på lerholdig jord.

B. Bomuldvarietet af Acala SJ2 i callusinducerende medium af halv styrke. Der gås frem som beskrevet ovenfor under

A, idet der dog anvendes MS-medium af halv styrke, hvori I

alle komponenterne er blevet formindsket til halvdelen af I

20 den anførte koncentration. Der opnås stort set samme I

resultater. H

C. Andre bomuldsvarieteter. Der gås frem som beskrevet

ovenfor under A og B under anvendelse af Acala I

bomuldsvarieteter (SJ4, SJ2C-1, GC510, B1644, B2724, I

25 B1810, plukkervarieteten Siokra og strippervarieteten I

FC2017. Alle varieteterne regenereres med et godt I

resultat. I

D. Regenerering af bomuldsplanter fra kimeksplantater med I

suspensionscellekultur som mellemtrin. Der gås frem som

30 beskrevet ovenfor under A. frem til dannelse af callus, I

som kan danne somatiske kim. Stykker på ca. 750-1000 mg af

aktivt voksende embryogent callus suspenderes i 8 ml I

enheder væskesuspensionskulturmedium indeholdende MS major

og minor salte tilsat 0,4 mg/1 thiamin-HCl, 20 g/1 saccha- I

DK 175536 B1 61 rose, 100 mg/1 myo-inositol og NAA (2 mg/1) i T-rør, som anbringes i en valsetromle, der roterer med 1,5 o/m under en periode med 16 timers lys og 8 timers mørke. En 5 lysintensitet på ca. 2000-4500 lx tilvejebringes ved hjælp af fluorescerende lys (koldt dagslys). Efter 4 ugers forløb filtreres suspensionen gennem et 840 #tm nylonfilter til fjernelse af større celleklumper. Fraktionen, som er mindre end 840 pin, henstilles til aflejring og vaskes en 10 gang med ca. 20-25 ml frisk suspensionskulturmedium. Denne cellesuspension overføres til T-rør ( 2 ml pr. rør), og hvert enkelt rør fortyndes med 6 ml frisk suspensionskulturmedium. Kulturerne holdes under gentagelse af den ovenfor beskrevne procedure med 10-12 dages mellemrum. Ved 15 hver underkultur filtreres suspensionen, og kun den fraktion, som indeholder celleklumper med en størrelse på mindre end 840 μη overføres til frisk suspensionskulturmedium. I alle tilfælde anbringes fraktionen, som indeholder celleklumper større end 840 μαι, på callusvækst-20 medium til opnåelse af modne somatiske kim. De somatiske kim, som dannes på callusvækstmediet, fjernes og overføres til kimspiringsmedium. Under anvendelse af den ovenfor under A beskrevne fremgangsmåde bringes disse til at spire, hvorpå de udvikles til småplanter, som derefter 25 udvikles til frilandsplanter.

E. Alternativ suspensionsmellemkultur. Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor under D, idet dog suspensionskulturerne dannes ved at overføre 750-1000 mg embryogent callus til en DeLong-kolbe med 15-20 ml 30 flydende MS-medium indeholdende 2 mg/1 NAA. Den kultur-holdige kolbe anbringes på et vandret roterende rystebord og rystes ved 100-110 slag/minut. Efter 3 uger filtreres suspensionen gennem et 840 μΐη nylonklæde til fjernelse af de store celleklumper til plantevækst som beskrevet oven-35 for under D. Suspensionen, som indeholder partikler mindre end 840 μπι, henstår til aflejring, hvorpå den vaskes en gang i det flydende MS-medium og resuspenderes i 2-5 ml

62 I

DK 175536 B1 I

flydende MS-medium. Suspensionen underdyrkes ved overfør- I

sel til frisk medium i en DeLong-kolbe indeholdende 1-2 ml I

suspension og 15 ml frisk flydende MS-medium. Kulturerne I

5 dyrkes ved gentagelse af denne proces ved 7-10 dages H

mellemrum. Ved hver underkultur underdyrkes kun suspen- H

sionen mindre end 840 μπι, og de større klumper (840 μπι H

eller derover) anvendes til plantevækst. H

F. Produktion af planter ud fra store klumper af suspen- H

10 sionsdyrkede celler. Efter 3 eller 4 underkulturer under H

anvendelse af den ovenfor under D og E beskrevne suspen- H

sionsdyrkningsmetode, udplades 1,5-2,0 ml cellesuspension H

fra T-røret og DeLong-kolben i hvert tilfælde på agar- H

størknet MS-medium indeholdende 2 mg/1 NAA og Beasley og H

15 Ting-medium indeholdende 500 mg/1 caseinhydrolysat. I I

løbet af 3-4 uger, kommer embryogene calli roed udviklende H

kim til syne. Atter udplades celleklumper med en størrelse H

på 840 μπι eller derover på callusvækstmediet, hvorved der H

fås embryogene klumper med udviklende kim, der til sidst H

20 vokser til planter. H

Eksempel 8 H

Transformation af bomuldssuspensionskulturceller til I

tumorøs fænotype ved hjælp af Agrobacterium LBA 4434 I

A. Udvikling af plantesuspensionskulturen. En Acala H

25 bomuldssuspensionskultur underdyrkes i "Τ''-rør under I

udskiftning af medium (MS-medium indeholdende 2 g/1 NAA) I

hver 7- til 10. dag. Efter et mediumskift drejes "T"-røret I

90", og cellerne får lov til at aflejre sig. Supernatanten I

fjernes ved hjælp af en pipette inden transformation, og I

30 de dannede celler behandles som beskrevet i det følgende. I

B. Beskrivelse af Agrobacterium-vektoren. Agrobacterium-

stamme LBA 4434 (Heokema et al., 1983) indeholder et Ti- I

plasmidafledt binært plantetransformationssystem. I I

DK 175536 B1 63 sådanne binære systemer indeholder det ene plasmid T-DNA'et fra et Ti-plasmid, det andet plasmid indeholder vir- området fra et Ti-plasmid, og tilsammen virker de to 5 piasmider således, at der frembringes plantetransformation. I Agrobacterium-stamme LBA 4434 indeholder T-DNA-plasmidet pAL1050 Tj, af pTiAchS, et octopin

Ti-plasmid. vir-Plasmidet LBA 4434, pAL 4404 indeholder de intakte virulensområder af pTiAchS (Ooms et al., 1982).

10 Stamme LBA 4434 kan fås ved henvendelse til Dr. Robert Schilperoort, Biokemisk afdeling, Leidens universitet, Holland.

» C. Dyrkning af agrobakterier. Den transformerende Agrobacterium-stamme udtages fra en grundstamme opbevaret 15 i glycerol, inokuleres i en lille kultur natten over, hvorfra der den følgende dag inokuleres en 50 ml kultur. Agrobakterier dyrkes YEB-medium, hvortil der hensigtmæssigt kan være tilsat antibiotika. Absorbansen ved 600 nm af 50 ml overnatkulturen aflæses, kulturen centrifugeres, 20 og pelletten resuspenderes i plantecellevækstmediet (MS-medium indeholdende 2 mg/ml NAA) til en slutabsor-bans ved 600 nm på 0,5. 8 ml af denne bakteriesuspension sættes til hvert "T"-rør indeholdende plantecellerne fra afsnit A ovenfor. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 D. Infektion. "T"-røret, som indeholder plante- og 2 bakteriecellerne, omrøres til resuspendering af alle 3 cellerne, hvorpå det anbringes i en valsetromle i 3 timer 4 for at agrobakterierne kan angribe plantecellerne.

5

Derefter får cellerne lov til at aflejre sig, og super- 6 natanten fjernes. Til "T”-røret sættes en frisk portion 7 vækstmedium, og der inkuberes på en valsetromle i et 8 tidsrum på 18-20 timer i nærværelse af eventuelle 9 resterende agrobakterier. Derpå henstår røret atter til 10 aflejring af cellerne, supernatanten fjernes, og cellerne 11 vaskes to gange med en opløsning af vækstmedium indeholdende cefotaxim (200 jig/ml). Efter vaskning resuspenderes

DK 175536 B1 I

cellerne fra hver T-rør i 10 ml vækstmedium indeholdende

cefotaxim (200 jtg/ml i alle tilfælde), og 1 ml alikvoter I

heraf udplades på petriskåle. I

5 E. Vækst af transformeret væv. Cellerne inficeret med H

agrobakterier vokser på vækstmediet, som ikke er tilsat H

fytohormoner, hvilket indicerer, at vævet har modtaget H

vildtype fytohormongenerne i T-DNA. Disse celler udvikles H

til tumorer, hvilket yderligere indicerer transformation H

10 af kulturerne. I

Eksempel 9 I

Transformation af bomuldssuspensionsceller til en kanamy- I

cinresistent ikke-tumorøs fænotype I

Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor i I

15 eksempel 8, bortset fra at der anvendes andre transforme- I

rende agrobakterier, og at planteselektionsmediet inde- I

holder et antibiotikum til selektionen af transformeret I

plantevæv. I

A. Dyrkning af plantevæv. Gennemføres som i eksempel 8, I

20 afsnit A.

B. Beskrivelse af Agrobacterium-vektoren. De transforrae- I

rende agrobakterier indeholder den T-DNA-holdige binære I

vektor pCIBlO (Rothstein et al., 1987) samt pAL4404 vir- I

plasmidet. T-DNA*et fra pCIBlO Indeholder et kimært gen I

25 sammensat af promotoren fra nopalinsyntasegenet, kodnings- I

området fra Tn5 (koder for enzymet neomycinphosphotrans- H

ferase), og terminatoren fra nopalinsyntasegenet. I

C. Dyrkning af agrobakterier. Agrobakterier, som indehol-

der pCIBlO, dyrkes på YEB, som indeholder kanamycin (50 I

30 //g/ml). I øvrigt er betingelserne de samme som beskrevet i H

eksempel 8, afsnit C. I

DK 175536 B1 65 D. Infektion. Transformationen gennemføres som beskrevet detaljeret i eksempel 8 dog med den ændring, at 1 ml alikvoter dannet under afsnit C straks udplades på medium, 5 som indeholder selektive antibiotika. Selektionsmedium indeholder enten kanamycin (50 /ig/ml) eller G418 (25 jig/ml). Ekspression af det nos/neo/nos-kimære gen i transformeret plantevæv tillader selektionen af dette væv på begge disse antibiotika.

10 E. Dyrkning af transformeret væv. Plantedyrkningsmedier i dette og alle efterfølgende eksempler indeholder fytohormoner som anført i eksempel 7. I løbet af 2-4 uger bliver transformeret væv synligt på selektionspladerne. Uinficeret væv eller kontrolvæv viser ingen tegn på vækst, 15 bliver brunt og dør. Transformeret væv vokser ganske godt i nærværelse af kanamycin eller G418. På dette tidspunkt underdyrkes vævstykker, som vokser godt, på frisk selektionsmedium.

F. Dyrkning af somatiske kim. Somatiske kim danner 20 stykker på disse væv. Somatiske kim overføres til frisk medium (non-selektivt).

G. Spiring. Når kimene begynder at differentiere og spire, dvs. på det tidspunkt, hvor de begynder at danne rødder og har to eller tre blade, overføres de til kasser, 25 som indeholder vækstmedium. Væksten får lov til at fortsætte, indtil den lille plante har 6-8 blade, på hvilket tidspunkt den udtages af agarmediet.

H. Vækst af småplanter. Småplanten anbringes i pottejord, dækkes med et bæger for at bevare fugtigheden og anbringes 30 i en inkubator i 4-8 uger. På dette tidspunkt fjernes bægeret, og planten overføres til et væksthus. Planterne vokser i væksthuset, blomstrer og sætter frø.

66 I

DK 175536 B1 I

Eksempel 10

Transformation af bomuldssuspensionskulturceller til en I

hygromycinresistent ikke-tummorøs fænotype H

5 Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel 9 med de nedenfor anførte undtagelser. Der anvendes andre transformerende agrobakterier, og plante-

selektionsmediet indeholder et antibiotikum, som er I

velegnet til selektionen af transformeret plantevæv.

10 Ά. Dyrkning af plantevæv. Denne gennemføres som i I

eksempel 8, afsnit A.

B. Beskrivelse af Agrobacterium-vektoren. De transfor- merende agrobakterier indeholder T-DNA'et som indeholder binære vektor pCIB715 ((Rothstein et al., 1987) samt

15 vlr-plasmidet. T-DNA'et fra pCIB715 indeholder et kimært I

gen sammensat af promotoren og terminatoren fra CaMV 35S I

transkriptet (Odell et al., 1985) og kodningssekvensen for I

hygromycin B phosphotransferase (Gritz og Davies, 1983).

C. Dyrkning af agrobakterier. Agrobakterier indeholdende I

20 pCIB715 dyrkes på YEB, som indeholder kanamycin (50 I

μg/ml). I

D. Infektion. Transformationen gennemføres som beskrevet I

i detaljer i eksempel 8 med den ændring, at de i afsnit C I

dannede 1 ml alikvoter straks udplades på medium, som H

25 indeholder selektive antibiotika. Selektionsmediet inde-

holder 50 /tg/ml hygromycin. Ekspression af det kimære I

hygromycingen i transformeret plantevæv muliggør selektio- nen af dette væv på medier, som indeholder hygromycin.

E. Dyrkning af transformeret væv. Denne gennemføres på I

30 samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel 9, afsnit E, I

bortset fra at antibiotiket hygromycin anvendes i plante- I

DK 175536 B1 67 selektionsvækstmediet.

Eksempel 11

Transformation af planteceller ved mikroprojektilbombarde-5 ment

En anden metode til at indføre fremmede DNA-sekvenser i planteceller omfatter fastgørelse af DNA*et til partikler, som derefter drives ind i planteceller ved hjælp af en skydemekanisme som beskrevet af Klein et al. (1988). Der 10 kan anvendes et hvilket som helst plantevæv eller plante-organ som mål ved denne metode, herunder kim, apicalt og andet dannélsesvæv, knopper, somatiske væv og formeringsvæv in vivo og in vitro. Transgene celler og callus udvælges under anvendelse af anerkendte fremgangsmåder.

15 Behandlede væv induceres til dannelse af somatiske kim eller regenerering af skud til dannelse af transgene planter i overensstemmelse med velkendte fremgangsmåder.

Den hensigtsmæssige fremgangsmåde kan vælges under hensyntagen til den anvendte planteart. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Den regenererede plante være kimær med hensyn til det 2 inkorporerede fremmed DNA. Hvis cellerne indeholdende det 3 fremmede DNA udvikler sig til enten mikro- eller makro- 4 sporer, vil det integrerede fremmed DNA blive overført til 5 kønnet afkom. Hvis cellerne, som indeholder fremmed 6 DNA'et, er somatiske celler i planten, dannes ikke-kimære 7 transgene planter ved anvendelse af konventionelle frem 8 gangsmåder til vegetativ formering enten in vivo, dvs. ud 9 fra skud eller afskårne stilke, eller in vitro under 10 anvendelse af velkendte fremgangsmåder. Sådanne fremgangs- 11 måder kan vælges under hensyntagen til den anvendte planteart.

68 I

DK 175536 B1 I

Eksempel 12 I

Transformation af planteceller ved injektion I

Transformation af DNA til planteceller kan også opnås ved I

5 injektion i isolerede protoplaster, dyrkede celler og væv I

som beskrevet af Reich et al. (1986 a og b) og injektion i I

dannelsesvæv i frøplanter og planter som beskrevet af de I

la Pena et al. (1987), Graves og goldman (1986), I

Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) og Grimsley et al. I

10 (1987 og 1988). Der opnås transgene planter og afkom deraf I

ved anvendelse af konventionelle fremgangsmåder. I

Eksempel 13 I

Fremstilling af en særlig callustype af Zea mays, I

eliteindavlslinie Funk 2717 I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Zea mays-planter af indavlslinien Funk 2717 dyrkes til I

2

blomstring i et væksthus og selvbestøves. Umodne ører, som I

3

indeholder kim med en længde på ca. 2-2,5 mm, fjernes fra I

4

planterne og steriliseres i 10% "Clorox"®-opløsning i 20 I

5

minutter. Kim fjernes aseptisk fra kernerne og anbringes I

6

med kimaksen nedad på OMS-medium indeholdende 0,1 mg/1 I

7

2,4-D, 6% (v/r) saccharose og 25 mM L-prolin størknet med I

8

0,24% (v/r) "GelRite"® (startmedium). Efter 2 ugers I

9

dyrkning i mørke ved 27°C fjernes calluset, som dannes på I

10

skjoldet, fra kimen og anbringes på B5-medium (Gamborg et I

11

al., 1968), indeholdende 0,5. mg/1 2,4-D og størknet med I

12

0,24% (v/r) "GelRite"®. Calluset underdyrkes hver anden I

13

uge i frisk medium. Efter i alt 8 uger efter anbringelse I

14

af kimene på startmediet, identificeres den særlige I

15

callustype ved hjælp af dets karakteristiske morphologi. I

16

DFette callus underdyrkes yderligere på det samme medium. I

Efter en yderligere periode på 2 måneder overføres I

calluset til og rækkeunderdyrkes på N6-medium indeholdende I

2 mg/1 2,4-D og størknet med "GelRite"®. I

DK 175536 B1 69

Eksempel 14

Fremstilling af en suspensionskultur af Zea mays elite-lndavlslinie Funk 2717 5 Calluset beskrevet 1 dette eksempel underdyrkes i alt i mindst 6 måneder. Den type callus, som vælges til underτ kulturer, er relativ uslimet, granulær og meget sprød, således at det adskiller i små enkelte celleaggregater ved anbringelse i væskemedium. Kulturer, som indeholder aggre-10 gater med store, udvidede celler, bibeholdes ikke. Alikvoter på ca. 500 mg af det særlige callus fra Zea mays eliteindavlslinie Funk 2717 anbringes i 30 ml N6-medium, som indeholder 2 mg/1 2,4-D, i 125 ml DeLong-kolber. Efter 1 uges dyrkning ved 26eC i mørket på et vandret roterende 15 rysteapparat (130 o/m, 2,5 cm udslag), erstattes mediet med frisk medium. Suspensionerne underdyrkes igen på denne måde efter yderligere 1 uge. På dette tidspunkt undersøges kulturerne, og de kulturer, som ikke har et stort antal udviklede celler, bibeholdes. Suspensionskulturer, som 20 indeholder aggregater med store, udviklede celler anvendes ikke. Det foretrukne væv består af aggregater af delende celler med tæt cytoplasma, som har en karakteristisk glatters overflade end den sædvanlige type celleaggregater. De bibeholdte kulturer har mindst 50%'s 25 celler, som er repræsenteret ved disse små aggregater.

Dette er den ønskede morphologi. Disse suspensioner har også en hurtig vækstrate med en fordoblingstid på mindre end 1 uge. Suspensionskulturerne underdyrkes en gang om ugen ved overføring af 0,5 ml pakket cellerumfang (PCV: 30 af lej ret cellerumfang i en pipette) til 25 ml frisk medium. Efter 4-6 ugers underdyrkning på denne måde vokser kulturerne 2-3 gange pr. ugentlig underkultur. Kulturer, hvori mere end 75% af cellerne har den ønskede morphologi, anvendes til yderligere underdyrkning. Linierne

70 I

DK 175536 B1 I

opretholdes ved til underdyrkning hele tiden af vælge den H

kolbe, hvis indhold udviser den bedste morphologi. I

Periodisk filtrering gennem rustfri stålsigter med en I

5 porestørrelse på 630 pm hver anden uge anvendes i nogle I

tilfælde til at forøge kulturernes dispersionstilstand, I

men er ikke nødvendig. I

En Zea mays-suspensionskultur er deponeret i American Type I

Culture Collection (ATCC) under deponeringsnummeret 40326. I

10 Denne deponering er foretaget i overensstemmelse med I

Budapest konventionens bestemmelser den 20. maj 1987. I

Eksempel 15 H

Fremstilling af protoplaster fra suspensionskulturer af H

Zea mays H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1-1,5 ml PCV af suspensionskulturcellerne fremstillet som H

2

beskrevet i ovenstående eksempel inkuberes i 10-15 ml af H

3

en sterilfiltret blanding bestående af 4% (v/r) cellulase I

4

RS med 1% (v/r) "Rhozyme" i KMC saltopløsning (8,65 g/1 I

5

KC1, 16,47 g/1 MgCl2*6H20 og 12,5 g/1 CaCl2*H20, 5 g/1 I

6

MES, pH 5,6). Spaltningen gennemføres ved 30eC på et lang- H

7

somt gående rystebord i et tidsrum på 3-4 timer. Præpara- I

8

tionen følges under et inversionsmikroskop for protoplast- I

9

afgivelse. Protoplasterne, som afgives, samles på følgende I

10

måde: Præparationen filtreres gennem en 100 μπι mesh sigte, I

11

og derpå gennem en 50 μπι mesh sigte. Protoplasterne vaskes I

12

gennem sigterne med et rumfang KMC-saltopløsning svarende I

13

til det oprindelige rumfang enzymopløsning. 10 ml af pro- H

14

toplastpræparationen anbringes enkeltvis i flere engangs- H

15

plastcentrifugerør, og der anbringes 1,5-2 ml 0,6 ·Μ I

16

saccharoseopløsning (pufret til pH 5,6 med 0,1% (v/r) MES I

og Κ0Η) anbringes nedenunder. Røret centrifugeres ved H

60-100 G i 10 minutter, og protoplasterne, som danner et H

bånd ved grænsefladen, udtages under anvendelse af en

pipette og anbringes i et frisk rør. Protoplastpræparatio- I

DK 175536 B1 71 nen resuspenderes i 10 ml frisk KMC-saltopløsning og centrifugeres i 5 minutter ved 60-100 G. Supematanten fjernes og kasseres, og protoplasterne resuspenderes 5 forsigtigt i den tilbageblevne dråbe, hvorpå der gradvis tilsættes 10 ml KMC-opløsning med en styrke på 13/14.

Efter centrifugering igen i 5 minutter fjernes superna-tanten igen, og protoplasterne resuspenderes i KMC-opløs-ning med en styrke på 6/7. En prøve udtages til tælling, 10 og protoplasterne aflejres igen ved centrifugering. Protoplasterne resuspenderes i en mængde på 10? pr. ml i KM-8p-medium i 0,5 M mannitol indeholdende 6 mM MgCl2 eller i et hvilket som helst andet passende medium til anvendelse ved transformationen som beskrevet i de efter-15 følgende eksempler.

Eksempel 16

Transformation af Zea mays-protoplaster ved elektrofo-poration A. Alle trin bortset fra varmechokbehandlingen 20 gennemføres ved stuetemperatur (22-28eC). Protoplasterne fra det sidste trin i eksempel 15 resuspenderes i 0,5 M mannitol indeholdende 0,1% (v/r) MES og 6 mM MgCl2·

Modstanden i denne suspension måles i kammeret i en "Dialog Electroporator"® (DIA-LOG GmbH, D-4000 Dusseldorf 25 13, Forbundsrepublikken Tyskland) og justeres til l-lm2 kQ

under anvendelse af en 300 mM MgCl2~opløsning. Protoplasterne underkastes varmechokbehandling ved neddypning af røret indeholdende prøven i et vandbad ved en temperatur på 45eC i 5 minutter, hvorefter der afkøles til stuetempe-30 ratur på is. 4 μg lineariseret plasmid indeholdende et planteselekterbart hygromycinsresistensgen, såsom beskrevet af Rothstein et al. (1987), eller kimære genkonstruktioner som beskrevet i eksemplerne 32, 36, 41 og 46, og 20 μ g kalvethymusbærer DNA tilsættes i portioner 0,25 35 ml af suspensionen. Til protoplasterne sættes 0,125 ml af

I DK 175536 B1 I

I 72 I

I 24%’s (v/r) polyethylenglycolopløsning (PEG-opløsning, I

I molvægt fr PEG = 8000) i 0,5 M mannitol indeholdende 30 mM I

I MgCl2· Blandingen blandes grundigt men forsigtigt, og der I

I 5 inkuberes i 10 minutter. Prøven overføres til kammeret i I

I elektroporationsapparatet, og prøver underkastes tre I

I impulsbehandlinger med 10 sekunders mellemrum ved begyn- I

I delsesspændinger på 1500, 1800, 2300 eller 2800 Wcm-1 og I

I en exponentionel henfaldstid på 10 με. I

I 10 Protoplasterne dyrkes på følgende måde: Prøverne udplades I

I i 6 cm petriskåle ved stuetemperatur. Efter yderligere I

I 5-15 minutter tilsættes 3 ml KM-8p-medium, som indeholder I

I 1,2% (v/r) "SeaPlaque"®-agarose og 1 mg/1 2,4-D. Agarosen I

I og protoplasterne blandes grundigt, og mediet henstilles I

I 15 til størkning. I

I B. Fremgangsmåden beskrevet ovenfor under A gentages med I

I en eller flere af de følgende modifikationer: I

I (1) Modstanden i protoplastpræparationen indstilles til I

I 0,5-0,7 kfi. I

I 20 (2) Der anvendes PEG med en molekylvægt på 4000. I

I (3) Enten tilsættes intet PEG, eller der tilsættes et I

I halvt rumfang 12%'s (v/r) PEG. I

I (4) Impulsbehandlingerne gennemføres med 3 sekunders I

I mellemrum. I

I 25 (5) Protoplasterne udplades efter elektroporationen i I

I skåle anbragt på en plade afkølet til en temperatur på I

I 16°C. I

I (6) Protoplasterne anbringes i rør efter elektropora- I

I tionstrinet, vaskes med 10 ml KMC-opløsning med en styrke I

I 30 6/7 eller med W5-opløsning (sammensat af 380 mg/1 KC1, I

I 18,375 g/1 CaCl2’2H20, 9 g/1 NaCl og 9 g/i glucose, pH I

I 6,0), hvorpå de samles ved centrifugering ved 60 x G i 10 I

I minutter, resuspenderes i 0,3 ml KM-medium og udplades som I

I beskrevet ovenfor under A. I

I 35 (7) der tilsættes ikke kalvethymusbærer DNA. I

DK 175536 B1 73

Eksempel 17

Transformation af Zea mays-protopiaster ved behandling med polyethylenglyco1 (PEG) 5 A. Protoplasterne resuspenderes på det sidste trin i eksempel 15 i 0,5 M mannitolopløsning, som indeholder 12-30 mM MgCl2· Der gennemføres en varmechokbehandling ved 45°C i 5 minutter som beskrevet i eksempel 16. Protoplasterne fordeles i lige store portioner til transformation i 10 centrifugerør i en mængde på 0,3 ml suspenderet protoplaster pr. rør. I løbet af de næste 10 minutter tilsættes følgende: DNA (som i eksempel 16Ά) og PEG-opløsning (40% (v/r) molekylvægt 6000, indeholdende 0,1 M Ca(N03>2 og 0,4 M mannitol, pH 8-9 med KOH) til en slut-PEG-koncen-15 tration på 20%. Alikvoterne inkuberes i 30 minutter med lejlighedsvis forsigtig omrøring, hvorefter protoplasterne anbringes i petriskåle (0,3 ml oprindelig protoplastsus-penslon pr. skål med en diameter på 6 cm), og dyrkningen gennemføres som beskrevet i eksempel 16A.

20 B. Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor under A, men protoplasterne vaskes efter 30 minutters inkubering i PEG-opløsningen ved tilsætning af 0,3 ml W5-opløsning 5 gange med 2-3 minutters mellemrum. Protoplastsuspensionen centrifugeres, supernatanten fjernes, og protoplasterne 25 dyrkes som beskrevet i eksempel 16A.

C. Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor under A og B, idet dog slutkoncentrationen af PEG ligger mellem 13 o 25% (v/r).

Eksempel 18 30 Regenerering af callus ud fra protoplaster

Pladerne, som indeholder protoplasterne i agarose, anbrin-

74 I

DK 175536 B1 I

ges i mørke ved 26eC. Efter 14 dages forløb udvokser der I

cellekolonier fra protoplasterne. Agarosen indeholdende

kolonierne anbringes på overfladen af en petriskål med en I

5 diameter på 9 cm med 30 ml N6-medium, som indeholder 2

mg/1 2,4-D størknet med 0,24% (v/r) "GelRite"®. Dette I

medium betegnes 2N6. Calluset dyrkes yderligere i mørket H

ved 26°C, og callusstykker underdyrkes hver anden uge på I

frisk fast 2N6-medium.

10 Eksempel 19

Selektion af transformeret callus af Zea mays I

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 18, idet der dog til 2N6-mediet sættes hygromycin B i en

mængde på 100 mg/1 eller 200 mg/1 til selektion af trans- H

15 formerede celler. I

Eksempel 20 I

Regenerering af majsplanter I

A. Callus anbringes på 2N6-medium til opbevaring og på H

0N6 (bestående af N6-medium minus 2,4-D) og på N61-mediurn I

20 (bestående af N6-medium indeholdende 0,25 mg/1 2,4-D og 10 I

mg/1 kinetin) til initiering af regenerering. Callus, som I

dyrkes på 0N6-medium og N61-medium dyrkes i lys (16 I

timer/dag lys på 800-8000 lx fra hvide fluorescerende I

lamper). Callus, som dyrkes på N61-medium, overføres til I

25 ON6-medium efter 2 uger, da længere tid på N61-mediet er skadeligt. Calluset underdyrkes hver anden uge, også selv

om calluset atter skal overføres til den samme medieformu- I

lering. Småplanter fremkommer efter ca. 4-8 uger. Når H

småplanterne har en højde på mindst 2 cm, overføres de til

30 0N6-medium i GA7-beholdere. Rødder dannes i løbet af 2-4 H

uger, og når rødderne ser ud til at være tilstrækkeligt H

veludformede til at understøtte vækst, overføres småplan- DK 175536 B1 75 terne til i tørvepotter under en lysafskærmning . i de første 4-7 dage. Det er også nyttigt at anbringe et omvendt kart plastbæger over transplantaterne i 2 til 3 5 dage for at understøtte afhærdningen. Når planterne er etableret behandles de som normale majsplanter og dyrkes til de er modne i væksthuset. Til opnåelse af afkom selvbestøves planterne eller de krydses med vildtype.

B. Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor under 10 A, idet der dog til mediet, som anvendes til at holde calluset på, sættes hygromycin B i en mængde på 100 mg/l eller 200 mg/l.

Eksempel 21

Fremstilling af embryogene suspensioner ud fra væv af 15 Dactylis glomerata L. (aim, hundegræs) A. Embryogent callus startes fra grundsektioner af de yngste blade af Dactylis glomerata L.f som er dyrket i et væksthus, som beskrevet af Hanning og Conger (1982). Bladené overfladesteriliseres ved neddypning i en 20 1:10-fortynding af "Clorox"®-opløsning [en opløsning af 5,25% (v/r) natriumhypochlorit, The Clorox Company,

Oakland, CA 94623, USA] i ca. 10 minutter, hvorefter de under aseptiske betingelser udskæres i små stykker på 1-5 mm i længde eller i diameter. Disse stykker anbringes på 25 sterilt SH-30-medium, som indeholder 0,8% (v/r) agarose som størkningsmiddel. Callus og/eller embryogene strukturer viser sig i løbet af 2-6 uger efter udpladning ved dyrkning ved ca. 25°C. Embryogent callus holdes ved underdyrkning på frisk SH-30-medium hver 2. til 4. uger og 30 dyrkning i mørket ved 25eC.

B. Embryogene suspensionskulturer startes ved at anbringe ca. 0,5 g (friskvægt) embryogent callus i 50 ml flydende medium beskrevet af Gray og Conger (1985) indeholdende 45

76 I

DK 175536 B1 I

μΜ dicamba og 4 g/1 caseinhydrolysat. Suspensionskultu- I

rerne dyrkes ved 27eC under en belysningsperiode med 16 I

timers lys (3300 lx) og 8 timers mørke på et vandret I

5 roterende rysteapparat ved 130 o/m i 125 ml DeLong-kolber I

forseglet med en metalhætte og "Parafilm"®. Efter ca. 4 I

uger aflejres de store klumper i løbet af ca. 30 sekunder, I

og der udtages 10 ml alikvoter af supernatantmediet inde- I

holdende små celleklumper, som overføres til 50 ml frisk I

10 medium. Denne proces gentages hver 3.-4. uge under I

anvendelse af de bedste kulturer bedømt ved hjælp af lille I

klumpstørrelse og bedre kvalitet baseret på stedeværelsen I

af små, cytoplasmiske celler. Efter 5-8 overførsler inde- I

holder suspensionerne praktisk taget ingen ikke-embryogene I

15 celler, og størsteparten af de embryogene celleklumper er

ret små (150-2000 μπι). I

Eksempel 22

Isolering og rensning af Dactylis glomerata L.-proto- I

plaster I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Protoplaster fremstilles ud fra embryogene suspensionskul- I

2

turer bl.a. som beskrevet i eksempel 21 ved aseptisk fil- I

3 trering af cellerne på en "Nalgene"® 0,2 μια filterenhed, 4 hvorpå der sættes 0,5 g celler (friskvægt) til 12,5 ml 5

protoplastenzymblanding i en petriskål. Enzymblandingen I

6

består af 2% (v/r) "Cellulase" RS, 7 mM CaCl2*H20, 0,7 mM -I

7

NaH2P04*H20, 3 mM MES (pH 5,6), glucose (550 m0s/kg H20, I

8

pH 5,6), og er sterilt filtreret. Blandingen hvirvles i et I

9

orbitalrysteapparat ved ca. 50 o/m i tusmørke (< 400 lx) i I

10

ca. 4-5 timer. Spaltninsblandingen sigtes derpå gennem en I

11 rustfri stålsigte (maskestørrelse: 100 μπι mesh) og forde- 12

les i 12 ml centrifugerør, som centrifugeres ved ca. I

13

60-100 G i 5 minutter. Den protoplastholdige aflejring I

14

vaskes derpå tre gange med protoplastkulturmedium ΚΜ-8ρ I

15

indstillet på 550 mOs/kg H20 med glucose. På dette trin I

16

kan der indskydes et flotationstrin til yderligere rens- I

DK 175536 B1 77 ning af protoplasterne. I det tilfælde anbringes de vaskede protoplaster oven på 10 ml KM-8p-kulturmedium indstillet på 700 mOs/kg H2O med saccharose. Efter cen-5 trifugering ved 60-100 G i ca. 10 minutter udtages protoplaster, som danner bånd ved grænsefladen, ved hjælp af en fin pipette. Til sidst resuspenderes protoplasterne i 1-2 ml KM-8p-kulturmedium og sigtes gennem en rustfri trådnetsigte (maskestørrelse 20 /tm). De frigjorte 10 protoplaster samles og vaskes og resuspenderes i KM-8p-medium til dyrkning eller i osmotisk indstillet medium egnet til transformation.

Eksempel 23

Dactylls glomerata L.-protoplastkultur og dyrkning af 15 callus A. De rensede protoplaster udplades ved en tæthed på ca.

5 x 10® protoplaster/ml i KM-8p-kulturmedium indeholdende 1,3% (v/r) "SeaPlague"®-agarose (FMC Corp., Marine

Colloids Division, Rockland, Maine, USA) og 30-40% (r/r) 20 konditioneret medium (dannet ud fra 3-4 uger gamle D. glomerata L.-embryogene suspensionskulturer ved filtrering af mediet gennem et sterilt "Nalgene"® 0,2 μΐη filter, indstilling af mediet på 550 m0s/kg H2O ved tilsætning af glucose og efterfølgende sterilfiltrering). Pladerne 25 anbringes derefter i mørket ved en konstant temperatur på 28°C. Efter 10-14 dage udskæres agarosen i kiler og anbringes i "bead culture" som beskrevet af Shillito et al. (1983) under anvendelse af 20 ml SH-45-suspensions-kulturmedium med 3% (v/r) saccharose pr. 3 ml oprindelig 30 agaroseindlejret kultur. Pladerne anbringes på et rystebord og omrøres ved ca. 50 o/m i lys ved 670 lx. Der dannes nye suspensionskulturer efterhånden som kolonierne vokser ud af agarosen og afgiver celler til det flydende medium. De dannede suspensionsdyrkede celler udplades på 35 agarstørknet SH-30.medium og anbringes i mørket ved 25eC,

I DK 175536 B1 I

I 78 I

I indtil der er dannet callus. I

I B. Protoplaster dyrkes som beskrevet ovenfor under A, I

I idet dyrkningsmediet dog ikke indeholder konditioneret I

I 5 medium. I

I Eksempel 24 I

I Transformation af Dactylis glomerata L.-protoplaster I

I ved hjælp af elektroporatlon I

I A. Umiddelbart efter rensning af protoplasteme foretages I

I 10 elektroporation som beskrevet af Shillito et al. (1985) I

I under anvendelse af lineariseret plasmid som beskrevet i I

I eksempel 16. Protoplasteme resuspenderes efter den sidste I

I vaskning ved en tæthed på ca. 7 x ΙΟ*» protoplaster/ml i I

I elektroporationspufferen (0,4 M mannitol, 6 mM MgCl2). I

I 15 Protoplasteme anbringes i 10 ml plastcentrifugerør i I

I portioner på 0,7 ml. Til rørene sættes plasmid-DNA til en I

I slutkoncentration på 10 μg/ml og sonificeret kalvethymus I

I DNA (Sigma) til en koncentration på 50 μg/ml. Derpå I

I tilsættes 0,38 ml PEG-opløsning [24% (v/r) PEG 6000 i 0,4 I

I 20 M mannitol, 30 mM MgCl2, 0,1% (v/r) MES (pH 5,6)], og op- I

I løsningen blandes forsigtigt. Protoplastsuspensionen I

I overføres til kammeret i et "Dialogn®-elektroporations- I

I apparat, og der anlægges 10 impulser med en startspænding I

I på 3250 V/cm og en eksponentiel henfaldskonstant på 10 μβ I

I 25 med 30 sekunders mellemrum. Prøven udtages fra kammeret og I

I anbringes i en petriskål med en diameter på 10 cm. Der I

I tilsættes 10 ml KM-8p-medium, som indeholder 1,2% (v/r) I

I "SeaPlaque"®-agarose, protoplasteme fordeles ensartet i I

I mediet, hvorpå skålene henstilles til størkning af

I 30 agarosen. I

I B. Der gås frem som beskrevet ovenfor under A, idet der I

I dog anvendes startspændinger på 2500, 3000, 3500, 4000 I

I eller 500 Vcm”l. I

DK 175536 B1 79 C. Der gås frem som beskrevet ovenfor under A og B, idet der dog anvendes PEG med en molekylvægt på 4000 eller PEG med en molekylvægt på 8000.

5 D. Der gås frem som beskrevet ovenfor under A til C, idet dog PEG-slutkoncentrationen ligger mellem 10 og 30% (v/r).

Eksempel 25

Transformation af Dactylis glomerata L.-protoplaster ved behandling med polyethylenglycol (PEG) 10 A. PEG-medieret direkte genoverførsel gennemføres i over- . ensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Negrutiu et al.

(1987). Protoplasteme suspenderes efter den sidste vaskning i 0,5 M mannitol indeholdende 15 mM MgCl2 ved en tæthed på ca. 2 x 10^ pr. ml. Protoplastsuspensionen 15 fordeles i portioner på 1 ml i 10 ml plastcentrifugerør. DNA'et tilsættes som beskrevet i eksempel 24, hvorpå der tilsættes 0,5 ml af PEG-opløsningen [40% (v/r) PEG 4000 i 0,4 M mannitol, 0,1 M Ca( 1*03)2» pH 7,0]. Opløsningerne blandes forsigtigt og inkuberes i 30 minutter ved stue-20 temperatur (ca. 24eC) med lejlighedsvis omrøring. Derpå tilsættes 1,4 ml af vaskeopløsningen, og indholdet i røret blandes forsigtigt. Vaskeopløsningen består af 87 mM mannitol, 115 mM CaCl2, 27 mM MgCl2, 39 mM KC1, 7 mM Tris-HCl og 1,7 g/1 myo-inositol, pH 9,0. Der tilsættes 25 yderligere fire alikvoter på 1,4 ml af vaskeopløsningen med 4 minutters mellemrum, idet der foretages blanding efter hver tilsætning. Røret centrifugeres atter ved ca.

60 G i ca. 10 minutter, og supematanten hældes bort. De af lej rede protoplaster optages i 1 ml KM-8p-kul turmedium 30 og anbringes i en petriskål med en diameter på 10 cm. 10 ml KM-8p-medium, som indeholder 1,2% (v/r) "SeaPlaque"®-agarose, tilsættes. Protoplasterne fordeles ensartet i mediet, og pladen henstår til størkning af agarosen.

I DK 175536 B1 I

I 80 I

I B. Der gås frem som beskrevet ovenfor under A, idet der I

I dog gennemføres en eller flere af følgende modifikationer: I

I (1) pH-Værdien i vaskeopløsningen indtilles på 5,6 eller I

I 5 7,0. I

I (2) Der anvendes PEG med en molekylvægt på 2000, 6000 I

I eller 8000. I

I (3) Vaskemediet består af (a) 154 mM NaCl, 125 mM Cacl2, I

I 5 mM KC1, 5 mM glucose, pH 6,0 med KOH, (b) 0,2 M Cacl2, I

I 10 0,1% (v/r) MES, pH 6,0 med KOH, eller (c) 0,2 M CaCl2, 7 I

I mM Tris/-HCl, pH 9,0 med KOH. I

I Eksempel 26 I

I Transformation af Dactylis glomerata L.-protoplaster I

I efter varmechokbehandling I

I 15 Transformationen gennemføres på samme måde som beskrevet i I

I eksempel 24 eller 25, idet dog protoplasterne behandles I

I ved 45°C i ca. 5 minutter inden fordelingen af alikvoterne I

I i rør til transformation eller efterfordeling af

I alikvoterne eller inden tilsætning af PEG. I

I 20 Eksempel 27 I

I Selektion af transformerede kolonier I

I A. Kulturplade (petriskåle), som indeholder protoplas- I

I terne fra eksempel 24-26, inkuberes i 10 dage i mørket ved I

I ca. 25eC, hvorpå de skæres i 5 lige store strimler til I

I 25 såkaldte "bead cultures" (Shillito et al., 1983). Fire af I

I strimlerne anbringes hver for sig i 20 ml SH-45-kultur- I

I medium med 4 g/1 caseinhydrolysat og 20 jtg/ml hygromycin I

I Ξ. Den femte strimmel anbringes i 20 ml af det samme

I medium, som , dog ikke indeholder hygromycin B, som en H

I 30 uselektiv kontrol. Efter 4-5 ugers forløb skæres de I

I protoplastafledte cellekolonier, som formentlig er trans- I

81 DK 175536 B1 formerede, og som vokser i hygromycin B, ud af agarosen og anbringes i en petriskål med en diameter på 19 mm med 2 ml flydende SH-45-medium indeholdende 20 μg/nιl hygromycin B, 5 og der omrøres med ca. 50 o/m på et roterende rystebord.

Efter yderligere 4-5 uger overføres alle kolonier, som vokser under dannelse af nye suspensioner, til 125 ml Erlenmeyer-kolber, hvorpå der dyrkes på samme måde som i tilfælde af stamsuspensionskulturen, idet mediet dog 10 indeholder 20 /*g/ml hygromycin B.

De nye suspensioner underdyrkes hver 1. til 3. uge under anvendelse af SH-45-medium, som indeholder 4 g/1 caseinhy-drolysat og 20 jig/ml hygromycin B. Celler fra disse suspensioner udplades også på størknet SH-30-medium, som 15 indeholder 20 μg/ml hygromycin B, og der inkuberes ved ca.

25°C i mørket. Calli udvokset fra de udpladede celler underdyrkes hver anden uge på frisk medium. Cellerne, som vokser i nærværelse af hygromycin B, formodes at være transformanter.

20 B. Der foretages selektion som beskrevet ovenfor under A, idet dog de protoplastafledte cellekolonier, som vokser i medium indeholdende hygromycin B, anbringes på agarplader med SH-30-medium, der indeholder 20 μg/ml hygromycin B, og der inkuberes ved ca. 25°C i mørket.

25 Eksempel 28 i

Regenerering af transformeret Dactylls glomerata L.-planter A. D. glomerata L.-callus (opnået som beskrevet ovenfor i eksempel 27) afledt af protoplaster dyrkes på størknet 30 SH-30-medium og underdyrkes hver anden uge. Alle dannede embryoer udtages og udplades på spiringsmedium (SH-0) og anbringes i lyset (3700 til 4600 lx). Der indtræder spiring af disse embryoer i løbet af 1-4 uger, og de

I DK 175536 B1 I

I 82 I

I dannede småplanter anbringes på SH-O-medium i lyset til I

I dannelse af rodsystemer. Planterne anbringes i væksthuset, I

I når de har nået 6-12-bladsstadiet, hvorpå de gradvis I

I 5 afhærdnes. I

I B. Callus (opnået som beskrevet ovenfor i eksempel 27) I

I afledt af protoplaster dyrkes SH-O-medium størknet med I

I 0,24% (v/r) "GelRite"® i lyset (3700-4600 lx) og under- I

I dyrkes hver anden uge. De dannede småplanter anbringes på I

I 10 en l:l-blanding af SH-0 og OMS-medier størknet med en I

I blanding af 0,12% (v/r) "GelRite"® og 0,4% (v/r) agar i I

I lyset til dannelse af rodsystemer. Planterne overføres til I væksthus, når de har nået 6-12-bladsstadiet, hvor de grad-

I vis afhærder. I

I 15 C. Småplanter frembringes som beskrevet ovenfor under A I

I og 6, og de anbringes på OMS-medium størknet med 0,8%

I (v/r) agar i lyset til dannelse af rodsystemer. Planterne I

I overføres til et væksthus, når de har nået 6-12-bladssta- I diet, hvor de gradvis afhærder.

I 20 D. Småplanter fremstilles som beskrevet ovenfor under A I

I og anbringes på en l:l-blanding af SH-0- og OMS-medier I

I størknet med en blanding af 0,12% (v/r) "GelRite"® og 0,4% I

I (v/r) agar i lyset til dannelse af rodsystemer. Planterne I overføres til et væksthus, når de har nået 6-12-bladssta- I 25 diet, hvor de gradvis afhærder.

I Eksempel 29

I Transformation og regenerering af tomat I

I Tomater transformeres (Nelson et al., 1988) med gensplejs- I

I set A. tumefaciens bærende en planteselekterbar markør H

I 30 (f.eks. kanamycinresistens) og det kimære gen, som koder H

I for den proteaseinhibitor, som har interesse. Bladplade- I transformation af tomat med A. tumefaciens gennemføres i DK 175536 B1 83 overensstemmelse med fremgangsmåden Ifølge McCormick et al. (1986).

Eksempel 30 5 Transformation og regenerering af kartoffel

Kartofler transformeres (Stockhaus et al., 1987) med gensplejset A. tumefaciens, der bærer en planteselekterbar markør, f.eks. kanamycinresistens, og det kimære gen, som koder for den proteaseinhibitor, som har interesse.

10 IV. Resultater.

Eksempel 31

Biotest af transformeret bomuld

Heliothis virescens-æg lagt på stykker af osteklæde fås fra Tobacco Insect Control Laboratory ved North Carolina 15 State University, Raleigh, North Carolina. Osteklædestyk-kerne overføres til et stort overdækket bægerglas og inkuberes ved 29“C ved fugtige papirlommetørklæder til opretholdelse af fugtigheden. Æggene udklækker i løbet af 3 dage. Snarest mulig efter udklækningen overføres 20 larverne (1 larve pr. bæger) til overdækkede små plastbægre. Hvert bæger indeholder bomuldsbladsskiver. Larverne overføres under anvendelse af en malerpensel med fine hår.

Bladskiver med en diameter på 1 cm udskæres fra blade af bomuldsplanter og anbringes på en cirkel af fugtig i 25 filtrerpapir i bægeret med larven. Mindst 6-10 bladskiver, som repræsenterer såvel unge som gamle larver, testes fra hver plante. Bladskiverne anbringes med 2 dages mellemrum eller efter behov til fodring af larverne. Vækstrater (størrelse eller kombineret vægt for alle 30 kopiorm) og dødelighed for larver, som fodres med blade af

I DK 175536 B1 I

I 84 I

I transformerede planter, sammenlignes med tilsvarende data I

I fra larver, som fodres med utransformerede bomuldsblade. I

Larver, som fodres med plader af bomuld transformeret med I

5 et gen, der koder for en proteaseinhibitor, viser et I

stort fald i vækstraten og 100% dødelighed sammenlignet I

I med kontroller. I

Eksempel 32 I

I Majsresistens mod beskadigelse fremkaldt af Diabrotica I

10 (corn root worm) gennem ekspression af aeggehvidecystatin I

I A. Konstruktion af pCIB715/710-cystatin vektoren. I

I Cystatingenet syntetiseres som beskrevet i eksempel 3 C. I

I 363 bp DNA-sekvensen renses og ligeres i BamHI-stedet i I

I pCIB710 vektoren som beskrevet i eksempel 5. Den dannede I

I 15 vektor betegnes pCIB710-cystatin. Denne vektor skæres med I

I EcoRI, og det dannede DNA behandles med alkalisk, phospha- I

I tase. Plasmid pClB715 (Rothstein et al., 1987) skæres med I

I EcoRI og ligeres med det ovenfor fremstillede pCIB710- I

I cystatin. Den dannede vektor betegnes I

I 20 pCIB715/710-cystatin. I

I B. Transformation og regenerering af majs. Majsvæv trans-

I formeres med pCIB710 vektoren eller fortrinsvis med I

I pCIB715/710 vektoren, som bærer cystatingeninsertet, og I

I der foretages regenerering af planter som beskrevet i I

I 25 eksempel 16-20. Til kontrolbrug fremstilles planter trans- I

I formeret med pCIB710 vektoren eller pClB715 vektoren uden I

I geninsertet på samme måde. Transformeret plantevæv I

I udvælges på det egnede antibiotikum. Initialplanterne I

I selvbefrugtes, og der opnås frø (Tl-frø). I

I 30 C. Testning af planter for cystatinekspression. Planter I

I dyrket ud fra Tl-frøene analyseres for tilstedeværelsen og I

I ekspressionen af cystatingenet under anvendelse af flere H

DK 175536 B1 85 test.

(1) DNA isoleres og spaltes med BamHI. Spaltningsblandingen underkastes elektroforese på en 1,5% agarosegel.

5 DNA-fragmenterne overføres til nitrocellulose og hybridi-seres med cystatingenet mærket med 32p ved nicktransia-tion [angående denne teknik henvises til Maniatis et al.

(1982) ]. Tilstedeværelsen af cystatingenet påvises ved hjælp af et bånd på ca. 363 bp, som hybridiserer til 10 proben.

(2) RNA påvises ved hjælp af Northern blot-metoden (Maniatis et al., 1982) som et bånd på ca. 380 baser, der hybridiserer med 32p_CyStatingenet beskrevet ovenfor.

(3) Cystatinprotein påvises under anvendelse af immuno-15 logisk standardteknik med et polyklonalt kaninantistof dannet mod kommercielt tilgængeligt cystatin (Sigma).

(4) Cystatinaktivitet påvises ved immunorensning af materiale fra planteekstrakterne under anvendelse af det polyklonale anticystatin-antistof fra kanin og protein 20 A-Sepharose, hvorpå det isolerede materiale analyseres for evnen til at inhibire proteolyse af l^C-BSA ved hjælp af papain eller ved hjælp af majsrodormstarmehomogenater som beskrevet i eksempel 1.

D. Resistens hos transformerede majsplanter mod Diabro-25 ticabeskadigelse. Tl-kimplanter udplantes i groft vermi-culit i 100 mm petriskåle (5 pr. skål, 5 skåle). Når kimplantemes andet blad kommer frem, Inficeres hver skål med 20 Diabrotica-larver på 2. stadium. Efter 7 dages forløb bestemmes antallet og vægten af de overlevende 30 larver sammen med vægten af majsplantens vaskede rødder. Resistens hos transformerede planter påvises ved hjælp af statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larvevægttilvækst, fald i larveoverlevelsesrate eller fald

I DK 175536 B1 I

86 . I

I i tab af rodvægt i forhold til insektfri planter, når I

I planter, der udtrykker cystatingenet, sammenlignes med I

I kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsert I

I 5 eller utransformerede planter. I

Eksempel 33 I

Resistens hos kartoffel og tomat mod beskadigelse fra I

I Leptinotarsa decemllneata ved ekspression af cystatln I

I A. Konstruktion af pCIBlO-cystatinvektoren. Cystatingenet I

I 10 syntetiseres og ligeres til vektor pCIB710 som beskrevet i I

I eksempel 32 A. Cystatingenet plus 35S CaMV-promotoren I

I underklones ud af pCIB710 vektoren til pCIBlO vektoren ved I

spaltning med Xbal og EcoRl, isolering af 1593 bp I

I fragmentet og ligering af dette fragment med Xbal, EcoRl- I

I 15 spaltet pCIBlO til fremstilling af pCIBlO-cystatinvekto- I

I ren. I

I B. Transformation og regenerering af planter. pCIBlO-cy- I

I statinvektoren eller fortrinsvis pCIB715/710-cystatin-vek- I

I toren indføres i A. tumefaciens, som bærer et virulent I

I 20 plasmid, såsom LBA 4404 (eksempel 5) eller pCIB542. I

I pCIB542 er et gensplejset A. tumefaciens vir plasmid I

I afledt af pTiBo542 (Hood et al., 1986). I pCIB542 er. det I

I bakterielle kanamycinresistensgen erstattet med et bak- I

I terielt strptomycin/spectinomycinresistensgen. Stammen, I

I 25 der bærer både pCIBlO-cystatin eller pCIB715/710-cystatin I

I og pC!B542 anvendes til fremstilling af transformerede I

I tomatplanter under anvendelse af fremgangsmåden ifølge H

I Fischhoff et al (1987) eller som beskrevet i eksempel 29. I

I Kartoffelplanter, som indeholder pCIBlO-cystatin eller I

I 30 pCIB715/710-cystatin, fremstilles ved anvendelse af frem- I

I gangsmåden ifølge Stockhaus et al. (1987), eksempel 30. I

I C. Testning af planter for cystatinekspression. Testning I

af transformanter for cystatinekspression gennemføres som beskrevet ovenfor for majs.

DK 175536 B1 87 D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse 5 af L-decemlineata. 10 4-uger gamle planter inficeres hver for sig med 5 L- decemlineata-larver på 2. stadium. Larverne får lov til at æde i 4 dage, hvorefter der foretages bestemmelse af insektdødelighed, insektvægtilvækst og plantens beskadigelsesgrad. Resistens hos 10 transformerede planter påvises ved et statistisk signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i larvevægttilvækst, fald i larveoverlevelsesrate eller fald i plantebeskadi-gelse ved sammenligning af planter, som udtrykker cystatingenet, med kontrolplanter transformeret med vekto-15 ren uden geninsertet eller utransformerede planter.

Eksempel 34

Dactylis qlomerata (aim, hundegræs) resistens mod beskadigelse fremkaldt af Coleoptera gennem ekspression af cystatin 20 A. Konstruktion af vektor. pCIB710-cystatin og pCIB715/ 710-cystatin fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 32Ά.

B. Transformation og regenerering af planter. Transformerede planter fremstilles på samme måde som beskrevet 1 25 eksempel 24-28 under anvendelse af pCIB710-cystatin og pCIB715/710-cystatin.

C. Testningaf planter for cystatinekspression. Testning af transformanter for cystatinekspression gennemføres på samme som beskrevet i eksempel 32C. 1 D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse fremkaldt af Diabrotica undecimpunctata. Tl-kimplanter

I DK 175536 B1 I

I 88 I

I udplantes 1 fin jord 1 petriskåle med en diameter på 100 I

I mm (10 planter pr. skål, 5 skåle). Når kimplanterne har I

I nået 2-bladsstadiet, inficeres hver af de 5 skåle med 20 I

I 5 larver af D. undecimpuntata op 2. stadium. Efter 7 dages I

I forløb bestemmes antallet og vægten af overlevende larver I

I tillige med vægten af planternes vaskede rødder. Resistens I

I hos transformerede planter påvises ved hjælp af et I

I statistisk signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i I

I 10 larvevægttilvækst, fald i larveoverlevelsesrate eller fald I

I i tab af rodmasse i forhold til insektfri planter, når I

I planter, som udtrykker cystatingenet, sammenlignes med I

I kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet

I eller utransformerede planter. I

I 15 Eksempel 35 I

I Resistens hos bomuld mod beskadigelse fremkaldt af I

I Anthonomus grandis ved ekspression af cystatin I

I A. Konstruktion af vektor, pCIB715/710-cystatin og I

I pCIBlO-cystatin fremstilles som beskrevet overfor i I

I 20 eksempel 32A og 33A. I

I B. Transformation og regenerering af planter. Transfor-

I merede planter opnås under anvendelse af pCIB715/710- I

I cystatin eller pCIBlO-cystatin i Agrobacterium som I

I beskrevet ovenfor i eksemplerne 7-10. H

I 25 C. Testning af planter for cystatinekspression. Testning I

I af transformanter for cystatinekspression gennemføres på I

I samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel 32C. H

I O. Resistens hos transformerede planter mod beskadlgel- I

I se fremkaldt af A. grandis. Ti transformerede planter I

I 30 dyrkes, indtil de begynder at danne frøkapsler. Hver H

I plante inficeres med tre voksne A. grandis-hunner. H

I Plantebeskadigelsen bedømmes efter en uges forløb, og H

DK 175536 B1 89 overlevende snudebiller fjernes. Beskadigelse fremkaldt af larver, konstatering af antal af larver og vægt pr. plante bestemmes hver uge i fire på hinanden følgende uger.

5 Resistens hos transformerede planter påvises ved et statistisk signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i beskadigelsestallet, fald i larveantallet eller fald i larvevægt, når planter, som udtrykker cystatingenet, sammenlignes med kontrolplanter, der er transformeret med 10 vektoren uden geninsertet, eller med utransformerede planter.

Eksempel 36

Resistens hos majs mod beskadigelse fremkaldt af sommerfuglelarver gennem ekspression af sojabønne Kunitz tryp-15 sininhlbitor A. Konstruktion af pCIB715/710-KTI-:vektoren. Sojabønne-trypsininhibitor cDNA fremstilles ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Hoffman et al (1984). 652 bp-fragmentet modificeres således, at sekvensen begyndende ved methio- 20 ninstartkodonet (44 i det oprindelige fragment) og kodoner for de manglende tre aminosyrer plus et stopkodon adderes til 3'-enden. BamHI-linkere adderes til begge ender. Denne konstruktion tilvejebringes ved spaltning af 652 bp-frag-mentet med Eco57I og BstXl og isolering af det dannede 517 25 bp-fragraent efter agarosegelelektroforese. De i fig. 11 viste oligonucleotider syntetiseres. Phosphater adderes til 5’-enderne af 517 bp-fragmentet og oligonucleotider 3M og 5C og alle fragmenter ligeres som beskrevet ovenfor.

Det dannede 630 bp-fragment isoleres og ligeres i BamHI-30 stedet i pCIB710-vektoren som beskrevet ovenfor. Den dannede vektor betegnes pCIB710-KTI.

B. Transformation og regenerering af majs. Majsvæv transformeres med pCIB710-vektoren eller fortrinsvis med pCIB715/710-vektoren, som bærer sojabønne Kunitz trypsin-

I DK 175536 B1 I

I 90 I

I inhibitorgeninsertet, og der regenereres planter under I I anvendelse af den i eksemplerne 16-20 beskrevne fremgangs- I I måde. Til kontrol fremstilles planter transformeret med I I 5 pCIB710-vektoren eller pCIB715-vektoren uden geninsertet I I på samme måde. Transformeret plantevæv udvælges på det I egnede antibiotikum. De første planter selvbestøves, og I I der opnås frø (Tl-frø). I

I C. Testning af planter for sojabønne Kunitz trypsininhi- I I 10 bitorekspression. Planter, som er udvokset fra Tl-frøene, I I analyseres for tilstedeværelsen og ekspression af I sojabønne Kunitz-inhibitorgenet under anvendelse af I følgende test. I

I (1) DNA isoleres og spaltes med BamHl. Spaltningspro- I 15 duktet underkastes elektroforese på en 1,5% agarosegel. I I DNA-fragmenterne overføres til nitrocellulose og hybri- I diseres med sojabønne Kunitz-trypsininhibitorgenet mærket I I 32p ved nicktranslation [ angående metoder . henvises til I I Maniatis et al. (1982)]. Tilstedeværelsen af sojabønne I I 20 Kunitz-trypsininhibitorgenet påvises ved hjælp af et bånd I på ca. 630 bp, som hybridiserer til proben. I

I (2) RNA påvises ved Northern blot-metoden som et bånd på I I ca. 650 baser, som hybridiserer med 32p_SOjabønne Kunitz- H I trypsininhibitorgenet beskrevet ovenfor. I

I 25 (3) Sojabønne Kunits-trypsininhibitorprotein påvises I I under anvendelse af immunologiske standardfremgangsmåder I I med et polyklonalt kaninantistof dannet mod kommercielt I I tilgængelig sojabønne Kunitz-trypsininhibitor (Sigma), som I er blevet yderligere renset ved omvendtfase HPLC på en H I 30 Vydac-phenylsøjle. I

I (4) Sojabønne Kunitz-trypsininhibitoraktivitet bestemmes I I ved immunorensning af materiale fra planteekstrakterne I I under anvendelse af det polyklonale kaninanti-sojabønne I

DK 175536 B1 91

Kunitz-trypsininhibitorantistof og protein A-Sepharose og analysering af det isolerede materiale for evne til at hæmme proteolyse af 14C-BSA med trypsin under anvendelse 5 af den i eksempel 1 beskrevne analysemetode.

D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-frø spires, og bladstykker fra frøplanterne på 4-bladsstadiet anvendes som foder til neonatale Ostrinia nubilalis- eller Heliothis 10 zea-larver. Neonatale larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 cm2. Der anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og den mængde blad, som er blevet ædt. Resistens hos transformerede planter påvises ved hjælp af 15 et statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af ædt blad, når blade fra udtrykkelse af sojabønne Kunitz-trypsininhibi-torgenet sammenlignes med blade fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet eller med blade fra 20 utransformerede planter.

Eksempel 37

Resistens hos bomuld mod beskadigelse af sommerfuglelarver gennem ekspression af sojabønne Kunitz-trypsininhibitor A. Konstruktion af pCIBlO-KTI-vektoren. Sojabønne Kunitz-25 trypsininhibitorgenet sammen med 35S CaMV-promotoren fjernes fra pCIB71-KTI (eksempel 36A) under anvendelse af egnede restriktionsenzymer og ligeres i pCIBlO. Denne vektor betegnes pCIB10-KTI.

B. Transformation og regenerering af planter. Transforme-30 rede planter opnås under anvendelse af pCIB10-KTl eller pCIB715/710KTI (eksempel 36A) i Agrobacterium som beskrevet i eksemplerne 7-10.

I DK 175536 B1 I

I 92 I

I C. Testning af planter for trypsininhibitorekspression. I

I Testning af transformanter for sojabønne Kunitz-trypsin- I

I inhibitorekspression udføres som beskrevet i eksempel 36C. I

I 5 D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse I

I af sommerfugleinsekter. Bladskiver fra 4 uger gamle trans- I

I formerede planter gives som foder til neonatale Heliothis I

I virescens, Heliothis zea eller Pectinophora gossypiella. I

I Neonatale larver anbringes i særskilte foderbægre med et I

I 10 bladstykke på 1 cm^. Der anvendes 50 insekter pr. test- I

I gruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insekt- I

I overlevelse og mægnden af blad, som er blevet ædt. Resi- I

I stens hos transformerede planter påvises ved hjælp af et I

I statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i I

I 15 larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af ædt blad ved I

I sammenligning af blade fra planter, som udtrykker I sojabønne Kunitz-trypsininhibitorgenet med data for

I kontrolplanter, transformeret med vektoren uden genin- I

I sertet eller data for utransformerede planter. I

I 20 Eksempel 38 I

I Tomatresistens mod beskadigelse.af sommerfuglelarver I

I gennem ekspression af sojabønne Kunltz-trypsininhibitor I

I A. Konstruktion af vektor. pCIB715/710-KTI og pCIB10-KTI I

I fremstilles som beskrevet i eksempel 36Ά og 37Ά. I

I 25 B. Transformation og regenerering af planter. Transfor- H

I merede planter opnås som beskrevet i eksempel 33B under I

I anvendelse af pCIB10-KTI-vektoren eller pCIB715/710-KTI- I

I vektoren. H

I C. Testning af planter for trypsininhibitorekspression. H

I 30 Testning af transformanter for sojabønne Kunitz-trypsin- I

I inhibitorekspression gennemføres som beskrevet i eksempel H

I 36C. I

DK 175536 B1 93 D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse af sommerfugleinsekter. Bladskiver fra 4 uger gamle transformerede planter gives som foder til neonatale Heliothis 5 zea eller Manduca sexta. Neonatale larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 cm^. der anvendes 50 insekter pr. gruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og den mængde blad, som er blevet ædt. Resistens hos transformerede planter påvises 10 ved et statistisk signifikant (Student's, t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker sojabønne Kunitz-trypsininhibitorgenet med blade fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden gen-15 insertet eller blade fra utransformerede planter.

Eksempel 39

Tobaksresistens mod beskadigelse af sommerfuglelarver ved ekspression af sojabønne Kunitz-trypsininhibitor A. Konstruktion af vektor. pCIB10-KTI-vektoren fremstil-20 les som beskrevet i eksempel 37A.

B. Transformation og regenerering af planter. Transformerede planter opnås som beskrevet i eksempel 6 under anvendelse af pCIB10-KTI-vektoren eller pCIB715/710-KTI-vektoren (eksempel 36A) i Agrobacterium.

25 C. Testning af planter for trypsininhibitorekspression. Testning af transformanter for sojabønne Kunitz-trypsin-inhibitorekspression gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 35C.

D. Resistens hos transformerede planter mod skader frem-30 kaldt af sommerfugleinsekter. Bladskiver fra 4 uger gamle transformerede planter gives som foder til neonatale

I DK 175536 B1 I

I 94 I

I Heliothis zea eller Manduca sexta. Neonatale larver I

I anbringes 1 særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 I

I cm^. Der anvendes 50 Insekter pr. testgruppe. Efter 5 I

I 5 dages forløb bestemmes Insektvægt, Insektoverlevelse og I

I mængde af konsumeret blad. Resistens hos transformerede I

I planter påvises ved et statistisk signifikant (Student's t I

I test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller I

I mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra I

I 10 planter, som udtrykker sojabønne Kunitz-trypsininhibitor- I

I genet, med blade fra kontrolplanter transformeret vektoren I

I uden geninsertet eller med blade fra utransformerede I

I planter. I

I Eksempel 40 I

I 15 Resistens hos almindeligt hundegræs mod skader fremkaldt I

I af sommerfuglelarver ved ekspression af sojabønne Kunitz- I

I trypsininhibitor

I A. Konstruktion af vektor. pCIB710-KTI og pCIB715/710-KTI I

I fremstilles som beskrevet ovenfor i eksempel 36A. I

I 20 B. Transformation og regenerering af . planter. H

I Transformerede planter fremstilles som beskrevet ovenfor i I

I eksempel 24-28 under anvendelse af pCIB710-KTI og I

I PCIB715/710-KTI. I

I C. Testning af planter for trypsininhibitorekspression. I

I 25 Testning af transformanter for sojabønne Kunitz-trypsin- I

I inhibitorekspression gennemføres på samme måde som beskre- I

I vet i eksempel 36C. I

I D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse I

I fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-kimplanter udplantes i I

I 30 fin jord i petriskåle med en diameter på 100 mm (10 pr. I

I skål, 5 skåle). Når kimplanterne har nået 2-bladsstadiet,

I inficeres hver skål med 20 larver på det andet stadium af I

DK 175536 B1 95

Crambus caliginosellus. Efter 7 dages forløb bestemmes antallet og vægten af overlevende individer tillige med vægten af de skyllede græsrødder. Resistens hos transfor-5 merede planter bestemmes ved hjælp af statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larvevægt-tilvækst, fald i larveoverlevelsesrate eller fald i tab af rodvægt i forhold til insektfri planter, som man sammenligner planter, der udtrykker sojabønne Kunitz-trypsin-10 inhibitorgenet, med kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet eller med utransformerede planter.

Eksempel 41

Resistens hos majs mod beskadigelse af sommerfuglelarver 15 gennem ekspression af cn -antitrypsin ‘ A. Konstruktion af pCIB715/710-AATI-vektoren. DNA-sekven-serne, som koder for «i-antitrypsin, fremstilles ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Rosenberg et al.

(1984). Til indsættelse i BamHI-stedet i pCIB710-vektoren 20 spaltes DNA-fragmentet med passende enzymer, og de syntetiske oligonucleotider, der er nødvendige for dannelse af forenelige ender, llgeres sammen med BamHI-spaltet pCIB710 under anvendelse af den ovenfor beskrevne teknik. Den dannede vektor betegnes pCIB710-AATI. Denne vektor udskæ-25 res med EcoRI, og det dannede DNA behandles med alkalisk phosphatase. Plasmid pCIB715 (rothstein et al., 1987) skæres med EcoRI og ligeres med det ovenfor fremstillede pCIB710-AATI. Den dannede vektor betegnes PCIB715/710-AATI. 1 B. Transformation og regenerering af majs. Majsvæv transformeres med pCIB710-vektoren eller, fortrinsvis, pCIB715/710-vektoren, som bærer a^-antitrypsingeninsertet, og der regenereres planter som beskrevet i eksemplerne 16-20. Til kontroller transformeres planter med pCIB710-

I DK 175536 B1 I

I 96 I

I vektoren eller pCIB715-vektoren uden geninsertet på

I tilsvarende måde. Transformeret plantevæv selekteres på I

I det egnede antibiotikum. Initialplanterne selvbestøves, og I

I 5 der fås frø (Tl-frø). I

I C. Testning af planter for αχ-antitrypsinekspression. I

I Planter udvokset fra Tl-frø analyseres for tilstedeværelse

I og ekspression af cc^-antitrypsingenet under anvendelse af H

I nedenstående tests. I

I 10 (1) DNA isoleres og spaltes med BamHI. Spaltningsproduk- I

I tet underkastes elektroforese på en 1,5% agarosegel. DNA- I

I fragmenterne overføres til nitrocellulose og hybridiseres I

I med ai~antitrypsingenet mærket med 32p ved nicktransla- I

I tion. Tilstedeværelsen af c*i-antitrypsingenet påvises ved I

I 15 hjælp af et bånd på ca. 1200 bp, som hybridiserer til I

I proben. I

I (2) RNA påvises ved hjælp af Northern blot-metoden som et I

I bånd på ca. 1200 baser, der hybridiserer med 32p_ai_arvti_

I trypsingenet beskrevet ovenfor. I

I 20 (3) «i-Antitrypsinprotein påvises under anvendelse af I

I immunologiske standardmetoder med et polyklonalt kanin- H

I antistof dannet mod kommercielt tilgængeligt a^-anti- I

I trypsin (Sigma). I

I (4) ai-Antitrypsinaktivitet påvises ved at analysere I

I 25 materiale, som er immunrenset fra planteekstrakterne under H

I anvendelse af det polyklonale kaninanti-ai-antitrypsin- I

I antistof og protein A-Sepharose, hvorpå der analyseres for H

I evnen hos det isolerede materiale til at inhibere proteo- I

I lyse af ^c-ijsa med trypsin under anvendelse af den oven- I

I 30 for beskrevne analysemetode. I

I D. Transformerede planters resistens mod beskadigelse I

I fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-frø spires, og dannede I

DK 175536 B1 97 bladstykker fra kimplanter på 4-bladsstadiet anvendes som foder til neonatale Ostrinia nubilalis- eller Heliothis zea-larver. Neonatale larver anbringes i særskilte foder-5 bægre med et bladstykke på 1 cm^. Der anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængden af konsumeret blad. Resistens hos transformerede planter påvises ved hjælp af et statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larve-10 overlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad, når man sammenligner blade frå planter, der udtrykker a^-antitrypsingenet, med blade fra kontrolplanter, som er transformeret med vektoren uden geninsertet, eller med blade fra utransformerede planter.

15 Eksempel 42

Resistens hos bomuld mod beskadigelse fremkaldt af sommerfuglelarver gennem ekspression af cm -antitrypsin A. Konstruktion af pCIB10-AATI-vektoren. a^-Ant!-trypsingenet plus 35S CaMV-promotoren fjernes fra pCIB710- 20 AATI (eksempel 41A) og ligeres i pCIBlO under anvendelse af egnede enzymer. Denne vektor betegnes pCIB10-AATI.

B. Transformation og regenerering af planter.

Transformerede planter opnås tander anvendelse af pCIBlO-AATI eller pCiB715/710-AATl (eksempel 41A) i Agrobacterium 25 som beskrevet i eksempel 7-10.

C. Testning af planter for o^-antitrypsin-ekspression. Testning af transformanter for ai-anti-trypsinekspression gennemføres som beskrevet i eksempel 41C. 1 ------- D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse af sommerfugleinsekter. Bladskiver fra fire uger gamle transformerede planter anvendes som foder til

I DK 175536 B1 I

I 98 I

I neonatala Heliothis virescens, H. zea eller Pectlnophora I

I gossyplella. Neonatale larver anbringes i særskilte foder- I bægre med et bladstykke på 1 cm^. Der anvendes 50 insek- I 5 ter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes

I insektvægt, insektoverlevelse og mængden af konsumeret I

I blad. Resistens hos transformerede planter påvises ved et I

I statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i I

I larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret I

I 10 blad ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker I

I αχ-antitrypsingenet, med blade fra kontrolplanter I

I transformeret roed vektoren uden geninsertet eller med

I blade fra utransformerede planter. I

I Eksempel 43 I

I 15 Resistens hos tomat mod beskadigelse af sommerfuglelarver

I ved ekspression af cn -antitrypsin I

I A. Konstruktion af vektor. pCIB715/710-AATI og

I pCIB10-AATI fremstilles som beskrevet ovenfor i I

I eksemplerne 41A og 42A. I

I 20 B. Transformation og regenerering af planter. I

I Transformerede planter fremstilles som beskrevet ovenfor i I

I eksempel 33B under anvendelse af pCIBlO-AATI-vektoren og I

I pCIB715/710-AATI-vektoren. I

I C. Testning af planter for αχ-antitrypsin- I

I 25 ekspression. Testning af transf ormanter for αχ-anti- I

I trypsinekspression gennemføres som beskrevet i eksempel H

I 4ic. I

I D. Resistens hos transformerede planter mod I

I beskadigelse fremkaldt af sommerfugleinsekter. Bladskiver I

I 30 fra fire uger gamle transformerede planter gives som foder I

I til neonatale Heliothis zea eller Manduca sexta. Neonatale I

I larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke I

DK 175536 B1 99 på 1 cm2. Der anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængde af konsumeret blad. Resistens hos transformerede 5 planter påvises ved et statistisk signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker «i-antitrypsingenet, med blade fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet 10 eller med blade fra utransformerede planter.

Eksempel 44

Resistens hos tobak mod beskadigelse af sommerfuglelarver og ved ekspression af gi-antritrypsin A. Konstruktion af vektor. pCIB715/710-AATI og 15 pCIB10-AATI fremstilles som beskrevet ovenfor i eksempel 41A og 42A.

B. Transformation og regenerering af planter.

Transformerede planter fremstilles som beskrevet ovenfor i eksempel 6 under anvendelse af pCIB10-AATI-vektoren eller 20 pCIB715/710-AATI-vektoren (eksempel 41A) i Agrobacterium.

C. Testning af planter for ai-antitrypsin- ekspression. Testning af transformanter for a^-anti-trypsinekspression gennemføres som beskrevet i eksempel 41C.

f 25 D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse fra sommerfugleinsekter. Bladskiver fra fire uger gamle transformerede planter anvendes som foder til neonatale Heliothis virescens eller Manduca sexta. Neonatale larver anbringes i særskilte foderbægre med et 30 bladstykke på 1 cm2. Der anvendes 50 insekter pr. gruppe.

Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængde af konsumeret blad. Resistens hos

I DK 175536 B1 I

I 100 I

I transformerede planter påvises ved hjælp af et statistisk I

I signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i larve- I

I overlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad ved I

I 5 sammenligning af blade fra planter, som udtrykker a^-anti- I

I trypsingenet, med blade fra kontrolplanter transformeret I

med vektoren uden geninsertet eller med blade fra I

I utransformerede planter. I

I Eksempel 45 I

I 10 Resistens hos almindeligt hundegræs mod skader fremkaldt I

I af sommerfuglelarver ved ekspression af cn -antritrypsin I

I A. Konstruktion af vektor. pCIB710-AATI og I

I pCIB715/710-AATI fremstilles som beskrevet i eksempel 41A.

I B. Transformation og regenerering af planter.

I 15 Transformerede planter fremstilles som beskrevet i I

I eksempel 24 til 28 under anvendelse af pCIB710-AATI og

I pCIB715/710-AATI. I

I C. Testning af planter for αχ-antitrypsin- I

I ekspression. Testning af transformanter for a^-anti- I

I 20 trypsinekspression gennemføres som beskrevet i eksempel I

I 41C- I

I D. Resistens hos transformerede planter mod skader

I fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-kimplanter udplantes i I

I H

I fin jord i petriskåle med en diameter på 100 mm (10 pr.

I 25 skål, 5 skåle). Når kimplanteme har nået tobladsstadiet, I

I inficeres hver enkelt skål med 20 larver af Cr ambus I

I caliginosellus på det andet larvestadium. Efter 7 dages

I forløb bestemmes antallet af overlevende og deres vægt I

I tillige med vægten af de vaskede græsrødder. Resistens hos I

I 30 transformerede planter påvises ved statistisk signifikant H

I (Student's t test p<0,05) fald i larvevægtt il vækst, fald i I

I larveoverlevelsesrate eller fald i tab af rodmasse i I

DK 175536 B1 101 forhold til insektfri planter ved sammenligning af planter, som udtrykker a^-antitrypsingenet, med kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet eller 5 utransformerede planter.

Eksempel 46

Resistens hos ma.js mod skader fra sommerfuglelarver gennem ekspression af eglin A. Konstruktion af pCIB715/710-eglin-vektor. DNA-10 sekvenserne, som koder for eglin C og eglin C-mutanter, ' fremmstilles som beskrevet ovenfor i eksempel 3 D. Til indsætning i BamHI-stedet i pCIB710-vektoren spaltes DNA-fragmentet med egnede enzymer, og de syntetiske oligonucleotider, som er nødvendige for dannelse af 15 kompatible ender, ligeres sammen med BamHI spaltet pClB710 under anvendelse af den ovenfor beskrevne teknik. Den dannede vektor afledt af eglin C (Arg45) mutanten betegnes pC!B710-eglin. Denne vektor skæres med EcoRI, og den dannede DNA behandles med alkalisk phosphatase. Plasmid 20 pCIB715 (Rothstein et al., 1987) skæres med EcoRI og ligeres med pCIB710-eglinet fremstillet ovenfor.. Den ' dannede vektor betegnes pCIB715/710-eglin.

B. Transformation og regenerering af majs. Majsvæv transformeres med pCIB710-vektoren eller, fortrinsvis, 25 pCIB715/710-vektoren, som bærer eglin C (Arg45) geninsertet, og der regenereres planter som beskrevet ovenfor i eksempel 16-20. Til kontrol fremstilles planter transformeret med pCIB710-vektoren eller pCIB715-vektoren uden geninsertet på samme måde. Transformeret plantevæv 30 selekteres på det egnede antibiotikum. Initialplanterne selvbestøves, og der opnås frø (Ti-frø).

C. Testning af planter for eglinekspression. Planter dyrket ud fra Tl-frø analyseres for tilstedeværelse og

102 I

DK 175536 B1 I

ekspression af eglin C (Arg45) genet under anvendelse af I

følgende tests. I

(1) DNA isoleres og spaltes med BamHI. Spaltnings- I

5 produktet underkastes elektroforese på en 1,5% agarose- I

gel. DNA-fragmenterne overføres til nitrocellulose og I

hybridiseres med eglin C (Arg45) genet mærket med 32p ved I

nicktranslation. Tilstedeværelsen af eglingenet påvises I

ved hjælp af et bånd på ca. 230 bp, som hybridiserer til I

10 proben. I

(2) RNA påvises ved hjælp af Northern blot metoden I

som et bånd på ca. 230 baser, der hybridiserer med I

32p_egiin C (Arg45) genet beskrevet ovenfor. H

(3) Eglin C (Arg45) mutantprotein påvises under I

15 anvendelse af immunologiske standardmetoder med et H

polyklonalt kaninantistof dannet mod eglin C (Arg45). I

(4) Eglinaktivitet påvises ved at analysere I

materiale, som er immunorenset fra planteekstrakterne I

under anvendelse af det polyklonale kanin-antieglin C I

20 (Arg45) antistof og protein A Sepharose og testning for

det isolerede materiales evne til at inhibere proteolyse I

af med trypsin under anvendelse af den ovenfor I

beskrevne metode. H

D. Resistens hos transformerede planter mod

25 beskadigelse fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-frø I

spires, og bladstykker fra frøplanter på firebladsstadiet I

anvendes som foder til neonatale Ostrinia nubilalis eller I

Heliothis zea larver. Neonatale larver anbringes i I

særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 x 1 cm. Der

30 anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb H

bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængde af H

konsumeret blad. Resistens hos transformerede planter H

påvises ved hjælp af et statistisk signifikant (Student's H

DK 175536 B1 103 t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker eglin C (Arg45) genet, med blade 5 fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet eller med blade fra utransformerede planter.

Eksempel 47

Resistens hos bomuld mod beskadigelse fremkaldt af sommerfuglelarver gehnem ekspression af eqlin

10 A. Konstruktion af pCIBlO-eglin-vektoren. Eglin C

(Arg45) genet plus 35S CaMV promotoren fjernes fra pCIB710-eglin (eksempel 46A) og ligeres i pCIBlO under anvendelse af egnede enzymer. Denne vektor betegnes pCIBlO-eglin.

15 B. Transformation og regenerering af planter.

Transformerede planter fremstilles under anvendelse af pCIBlO-eglin eller pCIB715/710-eglin (eksempel 46A) i Agrobacterium som beskrevet i eksempel 7-10.

C. Testning af planter for eglinekspression.

20 Testning af transformanter for eglinekspression gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 46C.

D. Resistens hos transformerede planter mod beskadigelse fra sommerfugleinsekter. . Bladplader fra fire uger gamle transformerede planter er givet som foder til 25 neonatale Heliothis virescens, Heliothis zea eller Pectinophora gossypiella larver. Neonatale larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 x 1 cm.

Der anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængden 30 af konsumeret blad. Resistens hos transformerede planter påvises ved hjælp af et statistisk signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller

I DK 175536 B1 I

I 104 I

I mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra I

I planter, som udtrykker eglin C (Arg45) genet, med blade I

I fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden I

I 5 geninsertet eller med blade fra utransformerede planter. I

I Eksempel 48 I

Resistens hos tomat mod beskadigelse fremkaldt af I

I sommerfuglelarver ved ekspression af eglin I

A. Konstruktion af vektor. pCIB715/710-eglin og I

I 10 pCIBlO-eglin fremstilles som beskrevet i eksempel 46A og I

I 47A. I

I B. Transformation og regenerering af planter. I

I Transformerede planter fremstilles som beskrevet i I

I eksempel 33B under anvendelse af pCIBlO-eglin-vektoren og I

I 15 pCIB715/710-eglin-vektoren. I

I C. Testning af planter for eglinekspression. I

I Testning af transformanter for eglinekspression gennem- I

I føres som beskrevet i eksempel 46C. I

I D. Resistens hos transformerede planter mod I

I 20 beskadigelser fremkaldt af sommerfugleinsekter. Bladskiver I

I fra fire uger gamle transformerede planter gives som foder I

I til neonatale Heliothis zea eller Manduca sexta. Neonatale

I larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke I

I på 1 x 1 cm. Der anvendes 50 testinsekter pr. gruppe. I

I 25 Efter 5 dages forløb bestemmes insektvægt, insektover- I levelse og mængde af konsumeret blad. Resistens hos I transformerede planter påvises ved hjælp af et statistisk

I signifikant (Student's t test p<0,05) fald i larve- I

I overlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad I

I 30 ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker I

I eglin C (Arg45) genet, med blade fra kontrolplanter I

I transformeret med vektoren uden geninsertet eller med I

DK 175536 B1 105 blade fra utransformerede planter.

Eksempel 49

Resistens hos tobak mod skader fremkaldt af 5 sommerfuglelarver gennem ekspression af eglin A. Konstruktion af vektor. pCIB715/710-eglin og pCIBlO-eglin fremstilles som beskrevet i eksempel 46A og 47A.

B. Transformation og regenerering af planter.

10 Transformerede planter fremstilles som beskrevet i eksempel 6 under anvendelse af pCIBlO-eglin-vektoren eller pCIB715/710-eglin-vektoren (eksempel 45A) i Agrobacterium.

C. Testning af planter for eglinekspression. Testning af transformanter for eglinekspression gennem- 15 føres på samme måde som beskrevet i eksempel 46C.

D. Resistens hos transformerede planter mod skader fremkaldt af sommerfugleinsekter. Bladplader fra fire uger gamle transformerede planter gives som foder til neonatale Heliothis virescens eller Manduca sexta larver. Neonatale 20 larver anbringes i særskilte foderbægre med et bladstykke på 1 x 1 cm. Der anvendes 50 insekter pr. testgruppe. Efter 5 dage bestemmes insektvægt, insektoverlevelse og mængde af konsumeret blad. Resistens hos transformerede planter påvises ved hjælp af statistisk signifikant 25 (Student's t test p<0,05) fald i larveoverlevelse, larvevægt eller mængde af konsumeret blad ved sammenligning af blade fra planter, som udtrykker eglin C (Arg45) genet, med blade fra kontrolplanter transformeret med vektoren uden geninsertet eller med blade fra 30 utransformerede planter.

I DK 175536 B1 I

I 106 I

I Eksempel 50 I

I Resistens hos almindeligt hundegræs mod skader fremkaldt I

I af sommerfuglelarver gennem ekspression af eglin I

I 5 A. Konstruktion af vektor. pCIB710-eglin og I

I pCIB715/710-eglin fremstilles som beskrevet i eksempel I

I 46A. I

I B. Transformation og regenerering af planter. I

I Transformerede planter fremstilles som beskrevet ovenfor i I

I 10 eksempel 24-28 under anvendelse af pCIB710-eglin og I

I pCIB715/710-eglin. I

I C. Testning af planter for eglinekspression. I

I Testning af transformanter for eglinekspression gennem- I

I føres på samme måde som beskrevet i eksempel 46C. I

I 15 D. Resistens hos transformerede planter mod skader I

I fremkaldt af sommerfuglelarver. Tl-kimplanter udplantes i I

I fin jord i petriskåle med en diameter på 100 mm (10 plan- I

I ter pr. skål, 5 skåle). Når kimplanteme har nået toblads- I

I stadiet, inficeres hver skål med 20 larver på andet I 20 larvestadium af Crambus caliginosellus. Efter 7 dages I forløb bestemmes antallet og vægten af overlevende larver

I tillige med vægten af de vaskede græsrødder. Resistens hos I

I transformerede planter påvises ved hjælp af statistisk

I signifikant (Student’s t test p<0,05) fald i larvevægt- I

I 25 tilvækst, fald i larveoverlevelsesrate eller fald i tab

I af rodmasse i forhold til insektfri planter, ved I

I sammenligning af planter, som udtrykker eglin C (Arg45) I

I genet, med kontrolplanter transformeret med vektoren uden I

I geninsert eller med utransformerede planter. I

I 30 Deponeringer I

I (1) E. coli HB101/pML147 (DSM 4380) er deponeret den I

DK 175536 B1 107 28. januar 1988 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) i Braunschweig, Forbundsrepublikken Tyskland.

5 Nedenstående mikroorganismer er deponeret i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, USA: (2) Plasmid plWlll (ATCC-40235), 14. maj 1986.

(3) Zea mays suspensionskultur (ATCC-40326), 20. maj 1987.

(4) Plasmid p368 (ATCC-67700), 19. maj 1988.

I DK 175536 B1 I

I 108 I

I Litteraturhenvisninger

I An, G., Watson, B.D., Stachel, S., Gordon, M.P., Nester, £.W., EMBO J. 4, I

I 277, 1985 I

I Anastasi, A., Brown, M.A., Kembhavi, A.A., Nicklin, Sayers, C.A., I

I Sunter, D.C., Barrett, A.J., Biochem. J. 211, 129, 1983 I

I Barrett, A.J., Salvesen, G. (Eds.), Proteinase inhibitors, Research I

I monographs in cell and tissue physiology 12, Elsevier, Amsterdam, 1986 I

I Beasley, C.A., Ting, J.P., Amer. J. Bot. 60, 130, 1973 I

I Bevan, M., Barnes, W.M., Chilton, M.-D., Nucl. Acids Res. 11, 369, 1983 I

I Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12,.-8711, 1984 I

I de Block, M., Herrera-Estrella, L., van Montagu, M., Schell, J., I

I Zambryski, P., EMBO J. 3, 1681, 1984 I

I Christie, B.R. (Ed.), CRC Series in Agriculture, CRC Handbook of Plant I

I Science in Agriculture I, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1987 I

I Chu, C., Wang, C., Sun, C., Hsii, C., Yin, K. Chu, C., Bi, F., Scientla I

I Sinica 18, 659, 1975 I

I Covey, S.N., Lomonossoff, G.P., Hull, R., Nucl. Acids Res. 9, 6735, 1981 I

I Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D.R., Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 77, 7347, 1980 I

I Fischhoff, D.A., Bowdish, K.S., Perlak, F.J., Marrone, P.G., I

I McCormick, S.M., Niedermeyer, J.G., Dean, D.A., Kusano-Kretzmer, K., H

I Mayer, E.J., Rochester, D.E., Rogers, S.G., Fraley, R.T., Biotechno- Η I logy 5, 807, 1987

I de Framond, A.J., Barton, K.A., Chilton, M.-D., Biotechnology 1, 262, I

I 1983

I Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K., Exptl. Cell Res. 50, 151, 1968 I

I Gatehouse, A.M.R., Boulter, D., J. Sci. Food Agric. 34, 345, 1983 I

I Graves, A.C.F., Goldman, S.L., Plant Mol. Biol. 7, 43, 1986 I

I Gray, D.J., Conger, B.V., Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 123, 1985 I

I Grimsley, N., Hohn, T., Davies, J.W., Hohn, B., Nature 325, 177, 1987 I

I Grimsley, N.H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B., Biotechnology 6, 185, H

I 1988

I Gritz, L., Davies, J., Gene 25, 179, 1983 I

I Guiseley, K.B., Renn, D.W., Agarose, Marine Colloids Division, FMC I

I Corporation, Rockland, Maine, 1975 I

DK 175536 B1 - 109

Hanning, G.E., Conger, B.V., Theor. Appl. Genet. 63, 155, 1982

Hilder, V.A., Gatehouse, A.M.R., Sheerman, S.E., Barker, R.F.,

Boulter, D., Nature 330, 160, 1987

Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykas, P.J.J., Schilperoort, R.A.,

Nature 303, 179, 1983

Hoffman, L.M., Sengupta-Gopalan, C., Paaren, H.E., Plant Mol. Biol. 3, 111, 1984

Hohn, X., Richards, K., Lebeurier, G., in: Gene cloning in organisms other than E.coll, Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 193, 1982

Holsters, M., de Waele, D., Depicker, A., Messens, E., van Montagu, M.,

Schell, J., Mol. Gen. Genet. 163, 181, 1978

Hood, E.E., Helmer, G.L.,. Fraley, R.T., Chilton, M.-D., J. Bacteriol. 168, 1291, 1986

Hooykaas-Van Slogteren, G.M.S., Hooykaas, P.J.J., Schilperoort, R.A.,

Nature 311, 763, 1984

Kao, K.N., Michayluk, M.R., Planta 126, 105, 1975

Klein, T.M., Gradziel, T., Fromm, M.E., Sanford, J.C., Biotechnology 6, 559, 1988

Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982

McCormick, S., Niedermeyer, J., Fry, J., Barnason, A., Horsch, R.,

Fraley, R., Plant Cell Reports 5, 81, 1986

Murashige, T., Skoog, F., Physiol. Plant. 15, 473, 1962

Murdock, L.L., Brookhart, G.,Dunn, P.E., Foard, D.E., Kelley, S.,

Kitch, L., Shade, R.E., Shukle, R.H., Wolfson, J.L., Comp. Biochem.

Physiol. 87B, 783, 1987

Nagy, J.I., Maliga, P., 2. Pflanzenphysiol. 78, 453, 1976

Negrutiu, I., Shillito, R., Potrykus, I., Biasini, G., Sala, F., Plant Mol. Biol. 8, 363, 1987 j i

Nelson, R.S., McCormick, S.M., Delannay, X., Dube, P., Layton, J., j

Anderson, E.J., Kaniewska, M., Proksch, R.K., Horsch, R.B., Rogers, S.G., j

Fraley, R.T., Beachy, R.N., Biotechnology 6, 403, 1988

Odell, J.T., Nagy, F., Chua, N.-H., Nature 313, 810, 1985

Oka, A., Sugisaki, H., Takanami, M., J. Mol. Biol. 147, 217, 1981

Ooms, G., Hooykaas, P.J.J., Moolenaar, G., Schilperoort, R.A., Gene 14, 33, 1981

I DK 175536 B1 I

I 110 I

I Ooms, G., Hooykaas, va.i Veen, R.J.M., van Beelen, P., Regensburg- I

I Tuink, Schilperoort, R.A., Plasmid 7, 15, 1982 I

I de la Pena, A. , Lorz, H., Schell, J., Nature 325, 274, 1987 I

I Potrykus, J. , Saul, M.W. , Petruska, J., Paszkowski, J., Shillito, R.D., I

I Mol. Gen. Genet, 199, 183, 1985 I

I Reich, T.J., Iyer, V.N., Haffner, M. ,~ Holbrook, L.A., Miki, B.L., Can. J. I

I Bot. 64, 1259, 1986a . I

I Reich, T.J., Iyer, V.N., Miki, B.L., Biotechnology 4, 1001, 1986b I

I Rothstein, S.J., Lahners, K.N., Lotstein, R.J., Carozzl, N.B., I

I Jayne, S.M., Rice, D.A., Gene 53, 153, 1987 I

I Rosenberg, S., Barr, P.J., Najarian, R.C., Hallewell, R.A., Nature 312, H

I 77. 1984 I

I Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, I

I 5463, 1977 I

I Sanger, F., Science 214, 1205, 1981 I

I Schenk, R.U., Hildebrandt, A.C., Can. J. Bot., 50, 199, 1972 I

I Schwabe, C., Anastasi, A., Crow, H., McDonald, J.K., Barrett, A.J., I

I Biochem. J. 217, 813, 1984 I

I Shillito, R.D., Paszkowski, J., Potrykus, 1., Plant Cell Reports 2, 244, I

I 1983 I

I Shillito, R.D., Saul, M.W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, i., I

I Biotechnology 3, 1099, 1985 I

I Simon, R. , Priefer, U. , Piihler, A. , in: Piihler, A. (Ed.), Molecular I

I Genetics of the Bacterla-Plant Interaction, Springer Verlag, Berlin, 98, I

I 1983a

I Simon et al., Biotechnology 1, 784, 1983b I

I Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503, 1975 I

I Stockhaus, J. , Eckes, P., Blau, A., Schell, J., Willraitzer, L., Nucl. I

I Acids Res. 15, 3479, 1987 I

I Turk, V., Brzin, J., Longer, M., Ritonja, A., Eropkin, M., Borchart, U., I

I Machleidt, W., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364, 1487, 1983 I

I Wolfson, J.L., Murdock, L.L., Entomol. Exp. Appl. 44, 235, 1987 I

I Wood, W.I., Gitschier, J., Lasky, L.A., Lawn, R.M., Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 82, 1585, 1985 DK 175536 B1 111

Yadav, N.S., Vanderleyden, J., Bennett, D.R. Barnes, W.M.,

Chilton, M.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6322, 1982

Young, R.A. , Davis, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194, 1983

Zoller, M.J., Smith, M., in: Wu, R., Grossman, L., Moldave, K., Methods in Enzymology 100, 468, 1983 \

Claims (66)

112 I PATENTKRAV I

1. Fremgangsmåde til bekæmpelse af en skadeorganisme, I som angriber en bestemt målplante, som enten er en enkim- I 5 bladet eller tokimbladet plante, baseret på det princip, at I skadeorganismen i eller på en plante udsættes for en pesti- cidt virksom mængde non-plante proteinaseinhibitor, som er I forskellig fra eglin B eller C, og som syntetiseres biologisk I i planten som følge af ekspression af et fremmedgen, der I 10 koder for proteinaseinhibitoren, eller som følge af ekspres- I sion.af et eller flere fremmedgener, som koder for en eller I flere precursorer for proteinaseinhibitoren. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I 15 proteinaseinhibitoren stammer fra et dyr, en bakterie eller I en svamp, eller at inhibitorgenet har væsentlig sekvenshomo- I logi med et proteinaseinhibitorgen, som stammer fra en af de nævnte organismer. I 2 0 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I skadeorganismen er et insekt, en mide, en svamp eller en I bakterie. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I 25 typen af den enkimbladede plante er valgt blandt gruppen bestående af kornarter, grøntsager, og knoldplanter, foder- I og plænegræsser. H

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den H 30 enkimbladede plante er valgt fra gruppen bestående af Dactylis (hundegræs, aim. hundegræs) og Zea mays, (majs). I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I typen af den tokimbladede plante er valgt fra gruppen be- H 35 stående af frugtafgrøder, grøntsager og knoldafgrøder, olie- H afgrøder, drogeholdige planter, fiber- og træplanter. I DK 175536 B1 113

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den tokimbladede plante er valgt fra gruppen af slægter bestående af Lycopersicon (tomat), Solanum (kartoffel), Nicotiana (tobak) og Gossypium (bomuld). 5

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinaseinhibitoren er en inhibitor af en serinproteinase.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at 10 inhibitoren er valgt fra gruppen bestående af -antitrypsin, aprotinin og kyllingtrypsin-inhibitor.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at inhibitoren er en inhibitor af en thiolproteinase. 15

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at inhibitoren er valgt fra gruppen af cystatin, antipain, leupeptin, E64 og derivater deraf.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved. at inhibitoren er antipain eller leupeptin.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at inhibitoren er hønseæggehvidecystatin. 25

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at inhibitoren er en inhibitor af en metalproteinase.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 30 inhibitoren er en inhibitor af en sur proteinase. 1 35 Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at inhibitoren er pepstatin og en inhibitor, som har væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med pepstatin. I DK 175536 B1 I I 114 I

17. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at H I (a) planten er en enkimbladet plante, og I I (b) proteinaseinhibitoren er valgt fra en gruppe bestående H I af inhibitorer af serinproteinasen, thiolproteinaser, metal- H I 5 proteinaser og sure proteinaser. · H

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at I I proteinaseinhibitoren er en inhibitor af en serinproteinase. I I 10 19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at I I inhibitoren er et a^antitrypsin. I

20. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at H I proteaseinhibitoren er en inhibitor af en thiolproteinase. I I 15 I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at I inhibitoren er valgt fra gruppen bestående af cystatin, I I antipain, leupeptin, E64 og derivater deraf. I I 20 22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at I I inhibitoren er antipain eller leupeptin. I

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at I I inhibitoren er hønseæggehvidecystatin. I I 2 5 I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at H I den enkimbladede plante er majs. H

25. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at H I 30 skadeorganismen hører til ordenen Coleoptera eller Lipidop- I tera. I

26. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at H I skadeorganismen er Diabrotica. I I 35 I

27. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at H DK 175536 B1 115 proteinaseinhibitoren udtrykkes i plantens rødder, stilke, blade, frø eller pollen.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5 (a) planten er en tokimbladet plante og (b) proteinaseinhibitoren er valgt blandt gruppen bestående af inhibitorer af serinproteinaser, thiolproteinaser, metal-proteinaser og sure proteinaser.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at proteinaseinhibitoren er en inhibitor af en serinproteinase.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved, at inhibitoren er α^-antitrypsin. 15

31. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at proteinaseinhibitoren er en inhibitor af en thiolproteinase.

32. Fremgangsmåde ifølge krav 31, kendetegnet ved, at 20 inhibitoren er valgt fra gruppen af cystatin, antipain, leupeptin, E64 eller derivater deraf.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 32, kendetegnet ved. at inhibitoren er antipain eller leupeptin. 25

34. Fremgangsmåde ifølge krav 32, kendetegnet ved, at inhibitoren er hønseæggehvidecystatin.

35. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at 30 den tokimbladede plante er kartoffel, tomat, tobak eller bomuld. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at skadeorganismen hører til ordenen Coleoptera eller Lepidop- 35 tera. DK 175536 B1 I 116

37. Fremgangsmåde ifølge krav 36, kendetegnet ved, at I skadeorganismen er valgt blandt gruppen af slægter bestående I af Diabrotica, Leptinotarsa og Anthonomus. I

38. Fremgangsmåde ifølge krav 37, kendetegnet ved, at H skadeorganismen er en kartoffelbille. H

39. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at I proteinaseinhibitoren udtrykkes i plantens rødder, stilke, I 10 blade, frø eller pollen. I

40. Fremgangsmåde ifølge krav l til bekæmpelse af en I skadeorganisme, som angriber en bestemt målplante, baseret I på det princip, at skadeorganismen i eller på en plante I 15 udsættes for en pesticidt virksom mængde non-piante pro- I teinaseinhibitor, som er forskellig fra eglin B eller C, og I som syntetiseres biologisk i planten som følge af ekspression H af et fremmedgen, der koder for proteinaseinhibitoren, eller I som følge af ekspression af et eller flere fremmedgener, I 20 som koder for en eller flere precursorer for proteinase- inhibitoren, hvor polypeptidet er valgt fra gruppen af pro- teinaseinhibitorer af thiolproteinaserne, metalproteinaseme, I sure proteinaser og serinproteinaser.

41. Fremgangsmåde ifølge krav 40, kendetegnet ved, at I planten er en tokimbladet plante. I

42. Fremgangsmåde ifølge krav 41, kendetegnet ved, at I den tokimbladede plante er valgt blandt gruppen af slægter 30 bestående af Lycopersicon (tomat), Solanum (kartoffel), I Gossypium (bomuld) og Nicotiana (tobak). I

43. Fremgangsmåde ifølge krav 40, kendetegnet ved, at proteinaseinhibitoren er en inhibitor af en serinproteinase. I DK 175536 B1 117

44. Transgen plante, som er en enkimbladet eller tokimbladet plante, og som indeholder et fremmedgen, eller en gruppe af fremmedgener, som omfatter mindst en kodningssektion, som udtrykker en non-plante proteinaseinhibitor eller 5 en eller flere precursorer for, en proteinaseinhibitor, hvor proteinaseinhibitoren er forskellig fra eglin B eller C og er valgt fra gruppen bestående af inhibitorer af serin-proteinaser, thiolproteinaser, metalproteinaser og sure proteinaser. 10

45. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at typen af den enkimbladede plante er valgt fra gruppen bestående af kornarter, grøntsager, knoldafgrøder, foder- og plænegræsser.

46. Plante ifølge krav 45, kendetegnet ved, at den enkim bladede plante er valgt fra gruppen bestående af Zea mays (majs) og Dactylis (hundegræs, aim. hundegræs).

47. Plante ifølge krav 46, kendetegnet ved, at den tokim-20 bladede plante er valgt fra gruppen af frugtafgrødeplanter, grøntsager, knoldafgrødeplanter, olieplanter, drogeplanter, fiber- og træplanter.

48. Plante ifølge krav 47, kendetegnet ved, at den tokim-25 bladede plante er valgt fra gruppen af slægter bestående af Lycopersicon (tomat), Solanum (kartoffel) , Nicotiana (tobak) og Gossypium (bomuld).

49. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at proteinase-30 inhibitoren stammer fra et dyr, en bakterie eller en svamp, eller hvor inhibitorgenet har en væsentlig grad af sekvens-homologi med et proteinaseinhibitorgen, som stammer fra en af de ovennævnte organismer. 1 2

50. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at proteinase 2 inhibitoren er en inhibitor af en serinproteinase. 118 DK 175536 B1 I

51. Plante ifølge krav 50, kendetegnet ved, at inhibitoren er -antitrypsin.

52. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at inhibitoren 5 er en inhibitor af en thiolproteinase.

53. Plante ifølge krav 52, kendetegnet ved, at inhibitoren I er valgt fra gruppen bestående af cystatin, antipain, leu- peptin, E64 eller derivater deraf, og inhibitorer, som har I 10 væsentlig strukturmæssig eller funktionel lighed med disse.

54. Plante ifølge krav 53, kendetegnet ved, at inhibitoren I er antipain eller leupeptin. I 15 55- Plante ifølge krav 53, kendetegnet ved, at inhibitoren er hønseæggehvidecystatin. I

56. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at inhibitoren I er en inhibitor af en metalproteinase. I

20 I

57. Plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at inhibitoren I er en inhibitor af en sur proteinase. I

58. Plante ifølge krav 57, kendetegnet ved, at inhibitoren I 25 er pepstatin. I

59. Transgen plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at I planten er en enkimbladet plante. I

60. Plante ifølge krav 59, kendetegnet ved, at den enkim- I bladede plante er majs. I 1 Plante ifølge krav 59, kendetegnet ved, at den bekæm- per skadeorganismer af slægten Diabrotica.

35 I DK 175536 B1 119

62. Plante ifølge krav 59, kendetegnet ved, at proteinase-inhibitoren udtrykkes i plantens rødder, stilke, blade, frø eller pollen.

63. Plante ifølge krav 62, kendetegnet ved, at proteinase- inhibitoren udtrykkes i plantens rødder.

64. Transgen plante ifølge krav 44, kendetegnet ved, at den er en tokimbladet plante. 10

65. Plante ifølge krav 64, kendetegnet ved, at den tokimbladede plante er tomat, kartoffel, tobak eller bomuld.

66. Plante ifølge krav 64, kendetegnet ved, at den bekæm-15 per kartoffelbiller.

67. Plante ifølge krav 64, kendetegnet ved, at proteinase-inhibitoren udtrykkes i plantens rødder, stilke, blade, frø eller pollen. 20

68. Vektor indeholdende en DNA-sekvens, som koder for en ikke-plante proteinaseinhibitor, som er forskellig fra eglin B eller C, kendetegnet ved, at vektoren kan anvendes til transformation af planteceller eller af Agrobacterium og 25 til at udtrykke proteinaseinhibitoren i planter.

69. Vektor ifølge krav 68, kendetegnet ved, at den er afledt af Ti-plasmidet. 1

70. Vektor ifølge krav 68, kendetegnet ved, at den er afledt af plasmid pCIBlO eller pCIB715.