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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von
Insekten und diesbezügliche
Zusammensetzungen.
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Im
Besonderen betrifft die Erfindung die Bekämpfung des Insektenbefalls
von Tieren oder Pflanzen und die Prophylaxe von Infektionen von
Tieren oder Pflanzen, welche von Insekten übertragen werden. Die Erfindung
kann ferner Anwendung finden zur Besserung von Infektionen, welche
infolge Insektenbefalls auftreten.
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Im
Besonderen betrifft die Erfindung die Verwendung von Zusammensetzungen,
welche Peptidase-Inhibitoren umfassen, für die Bekämpfung von Insekten und betrifft
ferner die Verwendung von insektenresistenten transgenen Organismen,
welche Peptidase-Inhibitoren exprimieren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Insekten
verursachen weltweit erhebliche Schädlingsprobleme an einer Vielzahl
verschiedener Tiere und Pflanzen; man schätzt, dass trotz der derzeitigen
Bekämpfungsmaßnahmen
pro Jahr 13% der Ernteproduktion verlorengehen. Insektenspezies
der Ordnung Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera,
Isoptera, Thysanoptera und Homoptera verursachen massive Verluste
bei einer Vielzahl von Erntegütern,
welche im Garten oder auf großen
Flächen
angebaut werden, sowie bei eingelagerten und verarbeiteten Kornpro dukten.
Diptera, Anoplura, Malophaga und Siphonaptera verursachen parasitische
Infektionen bei Tieren und beim Menschen. Andere Ordnungen (Hymenoptera,
Dictyoptera, Isoptera) umfassen wichtige Haus- und Industrieschädlinge.
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Viele
der bekannten Bekämpfungsmaßnahmen
für Insekten
beruhen auf dem Einsatz von chemischen Insektiziden, z. B. chlorierte
Kohlenwasserstoffe (DDT, Endosulfan etc.), Organophosphate (Chlorpyrifos,
Diazinon, Marathion, Parathion), Organocarbamate (Carbaryl, Methomyl,
Proxypur) und synthetische Pyrethroide (Cypermethrin, Deltamethrin).
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Zu
den Problemen, welche mit der Verwendung von chemischen Insektiziden
einhergehen, zählen
die Entwicklung von Resistenz bei den Zielinsekten (Organophosphate,
synthetische Pyrethroide), die Persistenz der Chemikalien in der
Umwelt sowie im pflanzlichen und tierischen Gewebe und die Schadwirkungen
auf Nichtzielorganismen (Organochlorine, Insektenwachstumsregulatoren).
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Borverbindungen
(Borax, Polybor) sind ebenfalls für insektizide Zwecke zum Einsatz
gelangt. Borverbindungen sind stabil, töten die Insekten relativ langsam
bei praktischen Dosierungen (Mullens und Rodriguez, 1992), und die
Aufnahme hoher Dosen durch den Menschen kann tödlich sein (Anon, 1991).
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Andere
Kategorien von Insektiziden umfassen Insektenwachstumsregulatoren
(IGRs) und insektizide bakterielle Toxine (z. B. aus Bacillus thuringiensis
(B.t.-Toxine)).
IGRs sind Verbindungen, welche auf eine Weise in die Chitinsynthese
eingreifen. Sie umfassen Juvenilhormonanaloga (Methopren), Chitinsynthesehemmer (Fenoxycarb,
Diflubenzuron, Flurazuron) und Triazin-Derivate (Cyromazin). Gegenüber zahlreichen
Klassen von IGRs ist bereits Resistenz bemerkt worden. Resistenzentwicklung
tritt auch bei bestimmten Lepidopteren gegen B.t.-Toxine auf. Sowohl
bei IGRs als auch bei B.t.-Toxinen gestaltet es sich schwierig,
sicherzustellen, dass die Insekten in einem geeigneten Stadium ihres
Lebenszyklus getötet
werden. Einige IGRs sind stabil und können eine Umweltgefahr darstellen.
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Die
nützlichsten
Gruppen von Insektiziden sind jene, welche eine hohe insektizide
Aktivität
und eine geringe Persistenz in der Umwelt aufweisen (Organophosphate,
synthetische Pyrethroide). Bei ihnen ist jedoch die Entwicklung
von Resistenz bei den Zielinsekten das größte Problem. Man glaubt, dass
90% des Insektizideinsatzes immer noch auf den klassischen neurotoxischen
Insektiziden beruht. Die Suche nach alternativen rückstandsarmen
Insektiziden, die auf Insekten wirksam sind, welche gegen existierende
Insektizide resistent sind, ist daher besonders dringlich.
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Als
Synergisten bezeichnete Mittel können
verwendet werden, um die Effektivität bestimmter Insektizide zu
maximieren. Die Synergisten können
selbst insektizide Wirkung besitzen oder auch nicht. Blood und Studdert
(1988) definieren einen Synergisten als ein Agens, welches mit einem
anderen zusammenwirkt oder dessen Wirkung verbessert. Als Beispiel
sei angeführt,
dass Piperonylbutoxid ein Synergist für synthetische Pyrethroide
ist. Synergisten, welche in Kombination mit einem Insektizid wirksam
sind, sind möglicherweise
in der Kombination mit einem anderen Insektizid nicht wirksam. Synergisten
können
verwendet werden, um Probleme der Insektenresistenz zu überwinden,
wenngleich gegenüber
Synergisten gleichfalls Insektenresistenz auftreten kann. Die Synergistenrolle
in insektiziden Formulierungen kann entscheidend sein für die Erzielung eines ökonomisch
sinnvollen Ergebnisses und für
das Insektizidresistenzmanagement. Die Suche nach effektiven synergistischen
Kombinationen ist ebenso dringlich wie die Suche nach wirksamen
Insektiziden per se (Forrester et al., 1993).
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In
neuerer Zeit sind Insekten-Peptidasen in den Brennpunkt der Aufmerksamkeit
gerückt,
deren Hemmung möglicherweise
ein Mittel zur Insektenbekämpfung
bereitstellen kann. Peptidasen sind ubiquitäre Enzyme, welche Proteine
und Peptide aufspalten und damit das Verdauungsgeschehen sowohl
im Darm als auch in den Zellen unterstützen. Sie nehmen an der Reorganisation
des Gewebes während
der Embryonalentwicklung, Häutung
und Verpuppung von Insekten teil. Sie sind ferner an der Abwehr
invadierender Organismen und an der Proteinregulierung beteiligt.
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Peptidasen
sind eine vielfältige
Gruppe von Enzymen. Das Prinzip, nach dem sie gegenwärtig klassifiziert
werden, beruht
- (a) auf der Reaktion, die katalysiert
wird
- (2) auf der chemischen Natur des katalytisch aktiven Zentrums
und
- (3) auf der evolutionären
Beziehung, wie durch die Struktur offenbart (Barrett, 1994)
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Die
International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMC),
in: Enzyme Nomenclature (1992), klassifiziert Peptidasen nach Enzymklasse-(EC-)Kategorien.
Diese Kategorien sind EC 3.4.11 bis 3.4.19 für Exopeptidasen (jene Enzyme,
welche nur nahe den Enden der Peptidketten wirken) und EC 3.4.21 bis
3.4.99 für
Enzyme, welche bevorzugt auf die inneren Regionen der Peptide wirken.
Die Gruppe EC 3.4.99 ist eine Gruppe von Peptidasen, deren katalytischer
Mechanismus noch unerkannt oder noch nicht charakterisiert ist.
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Die
folgenden Ausführungen
geben einen Überblick über die
Peptidase-Klassen und ihre Beziehung zur Biochemie der Insekten.
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1. Serin-Peptidasen
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Diese
Gruppe umfasst Serin-Typ-Carboxypeptidasen, EC 3.4.16, und Serin-Endopeptidasen, EC 3.4.21.
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Serin-Peptidasen
sind typisch erkennbar durch eine katalytisch aktive Serinaminosäure an ihrem
aktiven Zentrum und durch ihre Empfindlichkeit gegenüber einem
Enzymhemmstoff, 3,4-Dichlorisocumarin (3,4-DCI). Bevorzugte pH-Werte
für die
Aktivität
von Säugetier-Serin-Peptidasen
liegen im Bereich von 2 bis 8; Insekten-Serin-Peptidasen sind jedoch
im Allgemeinen alkalischen Bedingungen angepasst (pH 9 bis über 11 bei
einigen Lepidopteren-Larven).
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Die
Aktivität
der Serin-Peptidasen bei Insekten ist ferner im Allgemeinen definiert
durch die Reaktion der Enzyme mit synthetischen Substraten. Die
drei üblichen
Kategorien von Insekten-Serinpeptidasen (trypsinartig, chymotrypsinartig
und elastinartig) können
auf diesem Wege identifiziert werden.
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Trypsinartige
Serin-Peptidasen reagieren mit den synthetischen Substraten P-Tosyl-L-argininmethylester
(TAME), α-N-Benzoyl-L-argininethylester
(BAEE), α-N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid
(BAPNA) und Benzoyl-DL-argininnapthylamin
(BANA).
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Chymotrypsinartige
Peptidasen können
identifiziert werden durch ihre Reaktion mit:
N-Acetyl-L-phenylalaninester
(APNE)
N-Acetyl-L-tyrosinethylester (ATEE)
N-Benzoyl-L-tyrosinethylester
(BTEE)
N-Benzoyl-L-tyrosin-p-nitroanilid (BTPNA)
L-Glutaryl-L-phenylalanin-p-nitroanilid
(GPPNA)
N-Succinyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (SPAPNA)
L-Glutaryl-L-phenylalaninnaphthylanid
(GPNA)
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Elastaseartige
Serinpeptidase-Inhibitoren können
identifiziert werden durch ihre Reaktion mit synthetischen Substraten
wie N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid
(SAAPLpNA).
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Die
Aktivität
von Serin-Peptidasen kann auch in Beziehung zu ihrer Reaktion mit
Enzyminhibitoren beschrieben werden. Peptidasen der Serin-Gruppe
werden im Allgemeinen durch Diisopropylfluorophosphat (DipF/DFP)
und Paraphenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) inhibiert. Trypsinartige
Peptidasen werden durch Tosyl-L-lysinchloromethylketon (TLCK) inhibiert.
Chymotrypsinartige Peptidasen werden durch Tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon
(TPCK) inhibiert. Elastaseartige Peptidasen werden durch Eglin-C
gehemmt.
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Von
einer Anzahl von natürlicherweise
vorkommenden Proteinen wurde gefunden, dass sie zur Inhibition von
Serin-Peptidasen befähigt
sind. Diese umfassen den kristallinen Trypsininhibitor aus Sojabohnen von
Kunitz (SBTI) und den Trypsininhibitor aus Sojabohnen von Bowman-Birk
(BBTI). Verschiedene andere Leguminosensamen enthalten Peptidase-Inhibitor
bei 1 bis 4% des Gesamtproteins, z. B. der Trypsin-/Chymotrypsininhibitor
aus der Kichererbse (CI), der Trypsininhibitor aus der Limabohne
(LBTI) und der Trypsininhibitor aus der Kuhbohne (CPTI) (Macintosh
et al., 1990). Serin-Peptidase-Inhibito ren tierischer Herkunft umfassen
Trypsininhibitor aus Rinderpankreas (BPTI, Aprotinin), Ovomucoid
aus Ei und α-1-Antitrypsin
aus Blut.
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Von
Serin-Peptidasen mit pH-Optima im alkalischen Bereich wurde erkannt,
dass sie von primärer Wichtigkeit
als lösliche
Enzyme in den digestiven Fluiden von Insekten sind. Beispiele umfassen
Sphingidae (Miller et al., 1974), Noctuidae (Ahmed et al., 1976,
1980; Ishaaya et al., 1971; Prichet et al., 1981; Teo et al., 1990;
Broadway und Duffy, 1986), Bombycidae (Sasaki und Suzuki, 1982;
Euguchi und Iwanito, 1976; Euguchi und Kuriyama, 1985), Pieridae
(Lecadet und Dedonder, 1966; Broadway et al., 1989), Pyralidae (Larocque
und Houseman, 1990; Houseman et al., 1989; Mohammed und Altias,
1987) und Diptera (Bowles et al., 1990). Christeller et al. (1992)
zeigten, dass Serin-Peptidasen an der (Casein-)Verdauungsaktivität von zwölf phythophagen
Lepidopteren beteiligt sind. In diesem Artikel hat Christeller gefunden,
dass kein anderer Typ von Peptidase signifikante Anzeichen von Verdauungsaktivität zeigt.
Von Serin-Peptidasen wurde ferner gefunden, dass sie eine entscheidende
Rolle bei keratinverdauenden Lepidopteren spielen (Christeller et
al., 1994; Prowning und Irzykiewicz 1962; Ward, 1975 a, b). Ferner
kommt ihnen eine bedeutende Rolle in der Verdauungsaktivität einiger
Coleopteren (McGhie et al., 1995, Dymock et al., 1992), einiger
Orthopteren (Sakal et al., 1989; Christeller et al., 1990), einiger
Heteropteren (Cohen, 1993) und einiger Dipteren (Bowles et al.,
1990) zu.
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Die
Verdauungs-Serinpeptidasen unterscheiden sich beträchtlich
sowohl nach Anzahl als auch in ihren katalytischen Eigenschaften
innerhalb einer Art und von Art zu Art (Applebaum, 1985). In einigen
Fällen sind
Inhibitoren für
Serin-Peptidasen
in Insektendiäten
sowohl als fraßabschreckend
als auch als verdauungshemmend wirkend erkannt worden (Dymock et
al., 1992).
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Trypsinartige
Serin-Peptidasen sind als am Schlüsselwachstumsregulationsbereich
der Häutung
beteiligt erkannt worden. Sie zeigen mehrere Rollen, einschließlich Prozesskontrolle,
Aussetzen der Chitinfibrillen dem Einfluss von Chitinase-Enzymen
und Wiederverwertung cuticularen Materials (Samuels und Paterson, 1991).
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Wegen
ihren vorherrschenden metabolischen Rollen, ihrem allgemein natürlichen
Vorkommen und dem Auftreten von zahlreichen natürlichen Inhibitoren in Pflanzen
und Tieren ist den Serin-Peptidasen die größte Aufmerksamkeit als Agenzien
für die
Insektenbekämpfung
zuteil geworden. Es sollte beachtet werden – das ist wichtig – dass das
Umfeld des Einsatzes von Serin-Peptidasen in der Insektenbekämpfung bisher
fast ausschließlich
auf dem Gebiet der transgenen Pflanzen liegt.
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2. Cystein-(Thiol-)Peptidasen
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Diese
Gruppe umfasst Cystein-Typ-Carboxypeptidasen (EC 3.4.18) und Cystein-Endopeptidasen
(EC 3.4.22).
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Diese
Enzyme sind charakterisiert durch den Besitz eines katalytisch aktiven
Cystein-Restes an ihrem aktiven Zentrum und durch ihre Empfindlichkeit
gegenüber
bestimmten Inhibitoren. Cystein-Peptidasen werden charakteristisch
unter reduzierenden Bedingungen aktiviert (Zusatz von Cystein, Dithiothreitol
oder anderer reduzierender Agenzien). Cystein-Peptidasen sind lösliche Enzyme,
die im Allgemeinen in Mitteldarminhalten von Insekten gefunden werden.
Säugetier-Cysteinpeptidasen üben ihre
Funktion im Allgemeinen in einem Milieu niedriger pH-Werte aus,
wohingegen in Insekten fast neutrale oder leicht saure pH-Werte
favorisiert werden (Wolfson und Murdock, 1987).
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Die
Aktivität
von Cystein-Peptidasen wird exemplarisch aufgezeigt durch ihre Reaktion
mit den synthetischen Substraten n-α-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid
(BAPNA) oder Benzoyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-(4 methyl)-cumarylamid
(Z-Phe-Arg-MCA). Die Aktivität
von Cysteinpeptidasen kann ferner beschrieben werden in Beziehung
zu ihrer Reaktion mit Enzyminhibitoren, wie Iodacetamid, Iodacetat,
Schwermetallen, p-Chlormercuribenzoat, Cystincyanid, N-Ethylmaleimid
und, charakteristisch, E-64. E-64 ist ein kleines Peptid (L-trans-Epoxysuccinylleucylamido-(4-guanidinobutan),
welches aus einem Stamm von Aspergillus japonicus erhalten wird.
Natürlich
vorkommende Cysteinpeptidase-Inhibitoren sind in Mikroben (E-64),
Pflanzen (Oryzacystatine I und II aus Reiskörnern und Kartoffel-Multicystatin
(PMC) aus Kartoffelknollen) und Tieren (Cystatin aus Hühnerei,
HEC) identifiziert worden. Antipain ist ein weiterer wohlbekannter
Cysteinpeptidase-Inhibitor.
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Cystein-Peptidasen
spielen eine wichtige Rolle als lösliche Verdauungsenzyme des
Darms einiger Insekten, insbesondere bei Coleopteren (Orr et al.,
1994; Thie und Houseman, 1990; Liang et al., 1991). Die Verwendung
von Cystein-Peptidase-Inhibitoren
zur Bekämpfung
von Insekten ist weitgehend im Zusammenhang mit transgenen Pflanzen
untersucht worden (Orr et al., 1994; Wolfson und Murdock, 1987).
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3. Asparaginsäure-Peptidasen
(EC 3.4.23)
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Diese
Enzyme werden typisch als zwei Aspartyl-Reste am aktiven Zentrum
tragend erkannt. Zahlreiche Asparaginsäure-Peptidasen sind am aktivsten
bei niedrigen pH-Werten. Synthetische Substrate für diese Enzyme
umfassen N-Carbobenzoxyglutamyl-L-tyrosin und N-Acetyl-L-phenanyldiiodtyrosin.
Charakteristische Inhibitoren für
Asparaginsäure-Peptidasen
umfassen Pepstatin und Diphenyldiazomethan (McDonald, 1985). Pepstatin
ist ein natürlich
vorkommender Inhibitor aus mikrobieller Quelle.
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Applebaum
(1985) hat eine Bedeutung der Asparaginsäure-Peptidasen für Dipteren
nahegelegt. Wolfson und Murdock (1987) haben eine Wachstumshemmung
bei einer Käferart
(Colorado-Kartoffelkäferlarve) durch
Pepstatin demonstriert; eine größere Wachstumshemmung
wurde jedoch durch Cystein-Peptidase-Targeting
erreicht.
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Eine
eingehende Durchsicht der Literatur über Peptidasen hat gezeigt,
dass nur in begrenztem Umfang Untersuchungen über Insekten-Aspartylpeptidasen
zur Insektenbekämpfung
entweder durch transgene Modifikation von Pflanzen oder durch topikale
Applikation angestellt worden sind. Christeller et al. (1992) haben
gefunden, dass eine Asparaginsäure-Peptidase-Aktivität in Darmmaterial
von phytophagen Lepidopteren augenscheinlich nicht evident ist.
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4. Metall-Peptidasen
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Diese
Enzyme werden typisch als ein katalytisch aktives Metallion (üblicherweise
Zink) am aktiven Zentrum tragend erkannt sowie durch ihre Empfindlichkeit
gegenüber
komplexbildenden Agenzien. Die Kategorie der Metall-Peptidasen umfasst
einige Endopeptidasen (Enzyme, welche innerhalb der Peptid kette
spalten) und Exopeptidasen (Enzyme, die Aminosäure(n) vom Ende der Peptide
abspalten). Exopeptide können ferner
kategorisiert werden als Carboxypeptidasen (welche Aminosäure(n) vom
C-Terminus abspalten) oder Aminopeptidasen (welche Aminosäuren vom
N-Terminus abspalten).
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Metall-Endopeptidasen
(EC 3.4.22)
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Diese
Enzyme sind an der Biochemie der Insekten nicht beteiligt bis auf
eine mögliche
Rolle bei der Wolleverdauung von keratinphagen Lepidopteren (Prowning
und Irykiewicz, 1962; Ward, 1975 a und b; Christeller et al., 1990,
1994).
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Metall-Carboxypeptidasen
(EC 3.4.17)
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Metall-Carboxypeptidasen
verlangen ein bivalentes Kation (üblicherweise Zn2+)
für die
Aktivität.
Sie existieren sowohl in freier als auch in membrangebundener Form
und favorisieren eine Aktivität
bei hohen pH-Werten (8 bis 10). Synthetische Substrate für Carboxypeptidasen
umfassen Hippuryl-DL-phenylmilchsäure und
Hippuryl-L-arginin für
Carboxypeptidase vom Typ A bzw. Typ B. Die Typ-A-Carboxypeptidase-Enzyme
erscheinen bei Insekten üblicher;
sie wurden in Orthopteren, Coleopteren, Dipteren und Lepidopteren
gefunden.
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Synthetische
Inhibitoren für
Metall-Carboxypeptidasen umfassen 1,10-Phenanthrolin, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), β-Hydroxychinolin
und Phosphoramidon. Ein natürlich
vorkommender Inhibitor für Metall-Carboxypeptidasen
ist der Carboxypeptidase-Inhibitor aus der Kartoffel (PCPI).
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Carboxypeptidase-Enzyme
in freier sowie in membrangebundener Form sind in Mitteldarmmaterial von
Lepidopteren-Larven erkannt worden (Ferreira et al., 1994; Christeller,
1990). Christeller et al. (1992) haben diese Enzyme als erwartete
Komponenten des Proteinverdauungssystems beschrieben. Vor dem Prioritätdatum der
vorliegenden Anmeldung sind diese Enzyme offensichtlich nicht als
Ziele für
transgene Modifikationen von Pflanzen erkannt worden, geschweige
denn als Komponenten für
topikale Bekämpfungsmittel.
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Amino-Peptidasen (EC 3.4.11–3.4.13)
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Amino-Peptidasen
hydrolysieren Aminosäuren
vom N-terminalen Ende der Peptidkette und werden im Allgemeinen
nach ihrer Abhängigkeit
von Metallionen (Zn2+ oder Mg2+)
klassifiziert. Die am besten untersuchten Aminopeptidasen werden
im Verdauungstrakt von Säugetieren
sowohl in membrangebundener als auch in löslicher Form gefunden. Die
Benennung der Aminopeptidasen wird üblicherweise vorgenommen mit
einem angehängten
Buchstaben, der ihr pH-Optimum bezeichnet, d. h. sauer (A), basisch
(B) oder neutral (N), oder durch ihren membrangebundenen (M-)Zustand
oder durch Anzahl und Typ der Aminosäuren, die von Peptidsubstraten
abgespalten werden. Diese Benennungen sind nicht ausschließlich; demnach
ist eine Leucin-Aminopeptidase M oder N ein Enzym, welches bevorzugt,
aber nicht ausschließlich
Leucin von einem Peptid entfernt, membrangebunden ist und dessen
Aktivität
bei neutralem pH-Wert optimal ist. Aminopeptidasen zeigen eine Vorzugshydrolyse
von Leucyl-, Arginyl-, Methionyl-, Aspartyl-, Alanyl-, Glutamyl-,
Prolyl-, Valyl- und Cysteinyl-Resten; die Substratspezifität ist jedoch
im Allgemeinen breit und hängt
ferner von den anderen Resten in der Peptidkette ab (Taylor, 1993
a und b). Die meisten Amino-Peptidasen sind Metall-Peptidasen, wenngleich
einige bakterielle Enzyme bekanntlich keine Metallionen für die Aktivität verlangen
(Taylor, 1993 a und b). Es gibt augenscheinlich keine natürlichen
Inhibitoren für
Aminopeptidase.
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Insekten-Aminopeptidasen
weisen üblicherweise
pH-Optima im alkalischen Bereich auf und werden im Allgemeinen von
Bestatin (Taylor, 1993) und Phenanthrolin (Barrett, 1994) inhibiert.
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Die
Substratspezifitäten
sind breit, wie im Vorstehenden gesagt, wobei jedoch typische Substrate Leu-pNa,
Arg-pNA, Met-pNa und Pro-pNA umfassen.
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Metall-Aminopeptidasen
werden durch Komplexbildner (z. B. EDTA) inhibiert, die entweder
das Metallion von der Peptidase entfernen oder einen inaktiven Komplex
mit dem Enzym bilden können
(Terra und Ferriera, 1994). Die Wirkung eines bestimmten Komplexbildners
wird in Abhängigkeit
vom Typ der Aminopeptidase sowie von der Struktur des Komplexbildners
selbst variieren.
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Amino-Peptidasen
sind ferner als Teil des Insektenkomplements von Verdauungspeptidasen
erkannt worden, und man geht davon aus, dass sie in den Endstadien
der Proteinverdauung beteiligt sind (Terra und Ferriera, 1994).
Christeller et al. (1990, 1992) haben behauptet, dass Exopeptidasen
(einschließlich
Amino-Peptidasen) von geringem Nutzen für die Insektenbekämpfung sein
werden wegen der geringfügigen
Rolle dieser Enzyme in der Verdauung von diätetischem Protein relativ zu
Serin- und Cystein-Peptidasen.
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Von
einer Insektenlarven-Wachstumsverzögerung nach Einwirkung von
spezifischen Leucin-Aminopeptidase-(LAP-)Inhibitoren ist bisher
nicht berichtet worden. Christeller et al. (1990) haben anhand von
Rohextrakten des Darms der Feldgrille aufgezeigt, dass zwar die
Exopeptidaselevels, insbesondere LAP, bedeutungsvoll bei diesem
Insekt sind, die Exopeptidasen aber nur 16 bis 20% zur Proteinverdauung
beitragen. In Christellers Studie wurde ferner gefunden, dass in
Gegenwart von zwei effektiven Serinpeptidase-Inhibitoren der Beitrag
von Exopeptidasen zur Proteinverdauung stark herabgesetzt wurde.
Dies wurde dem Fehlen von Oligopeptid-Kettenenden, die als Substrate
für Exopeptidasen
wirken könnten,
zugeschrieben. Dies deutete weiter auf eine geringfügige Rolle
der Aminopeptidasen bei der Insektenbekämpfung hin.
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Die
obigen Erkenntnisse weisen stark weg von der Verwendung von Exopeptidase-Inhibitoren
(in erster Linie Aminopeptidase-Inhibitoren) als Insektenbekämpfungsmittel
und weisen insbesondere stark weg von der kombinierten Verwendung
von Serinpeptidase-Inhibitoren und Aminopeptidase-Inhibitoren als
Insektenbekämpfungsmittel.
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Neben
ihrer Rolle bei der Verdauung ist Aminopeptidase-Aktivität auch im
Häutungsfluid
des Schmetterlings Manduca sexta (Jungries, 1979) nachgewiesen worden.
Auch hier erscheint jedoch die Rolle der Aminopeptidasen sekundär gegenüber derjenigen
der Serin-(trypsinartigen) Peptidasen. Von keinen natürlich vorkommenden,
in der Insektenentwicklung wichtigen Inhibitoren für Aminopeptidasen
oder Metallpeptidasen ist bisher eine häutungsverzögernde Wirkung berichtet worden.
Keiner ist bisher dafür
verwendet worden, insektenresistente transgene Pflanzen bereitzustellen.
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Theoretisch
scheint ein großes
Potential darin zu liegen, Peptidase-Inhibitoren zur Bekämpfung von Insekten
einzusetzen, welche resistent gegen chemische Insektizide sind.
Erstens unterscheidet sich der Wirkungsmechanismus der Peptidase-Inhibition
vom Wirkungsmechanismus der Organophosphate und der synthetischen
Pyrethroiden. Zweitens erscheint die Aminosäuresequenz der aktiven Zentren
der Peptidase-Enzyme hochkonserviert (Taylor, 1993), was auf ein
niedriges Mutationspotential hinweist, ohne den sonst damit verbundenen
Aktivitätsverlust.
Schließlich
sollte in dem Falle, dass Insektenresistenz gegenüber einem
bestimmten Peptidase-Inhibitor auftritt, diese Resistenz nicht auf
andere Peptidase-vermittelten metabolischen Geschehen übertragen
werden.
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Mit
der Verwendung von Peptidase-Inhibitoren für die Insektenbekämpfung sind
jedoch beträchtliche Probleme
verbunden. Es können
hohe Aufwandmengen notwendig werden, was zu einem Produkt führt, welches
nicht kosteneffektiv ist. Des Weiteren kann der Peptidase-Inhibitor
zwar das Larvenwachstum limitieren, es ist jedoch möglich, dass
ein Plateau in der Dosis-Antwort-Kurve
erreicht wird, auch bei erhöhten
Anwendungsmengen. Peptid-basierte oder Protein-basierte Peptidase-Inhibitoren
sind zwar vermutlich nicht-residual in der Umwelt, sind aber möglicherweise
nur schwer über
längere
Zeiträume
zu speichern und können
ihre Wirksamkeit verlieren, wenn sie in hartem Wasser appliziert
werden. Schwierige Fragen, welche die Quelle eines bestimmten Enzyminhibitors
involvieren, müssen
möglicherweise
angesprochen werden. So hat man zum Beispiel abnorme Antworten bemerkt,
umfassend eine Wachstumshemmung von Costelytra zealandica durch Trypsin-Inhibitoren
aus der Sojabohne, der Kartoffel und der Kuhbohne und eine Wachstumsstimulation
durch Trypsin-Inhibitor aus der Limabohne (Dymock et al., 1992).
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Beträchtliche
Forschungsarbeit hat sich auf biochemische Untersuchungen des Proteinmetabolismus, in
erster Linie des Verdauungsmetabolismus, der Insekten konzentriert,
unter Verwendung von Insektengeweben, Darmextrakten, semi-gereinigten
oder gereinigten Enzymen in vitro.
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Ein
großer
Teil dieser Arbeiten ist auf die Selektion von Enzyminhibitoren
für die
transgene Modifikation von Pflanzen gerichtet, wobei die Beziehung
zwi schen Verdauungsenzymen und Protein- oder Peptid-basierten Inhibitoren
untersucht wird (Applebaum, 1985; Christeller et al., 1989, 1990,
1992; Lenz et al., 1991; Teo et al., 1990; Pritchett et al., 1981,
Santos und Terra, 1984; Dow, 1986; Sakal et al., 1984, 1989).
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Relativ
weniger Untersuchungen demonstrieren einen direkten abträglichen
Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Insektenwachstum und/oder
-reproduktion. Für
Serin- und Cystein-Peptidase-Inhibitoren wurde gezeigt, dass sie
das larvale Wachstum und/oder Überleben
bei verschiedenen Insekten mindern, einschließlich Callosobruchus maculatus,
Leptinotarsa decemlineata, Heliothis spp, Spodoptera exiqua, Costelytra
zealandica, Teleogryllus commodus, Diabrotica sp, Manduca sexta,
rotbrauner Reismehlkäfer
und Speisebohnenkäfer
(Gatehouse und Boulter, 1983; Shukle und Murdock, 1983; Shade et
al., 1986; Wolfson und Murdoch, 1987; Broadway und Duffey, 1986;
Hilder et al., 1987; Dymock et al., 1982; Orr et al., 1994; Burgess
et al., 1994; Hines et al., 1990).
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Allgemein
ist eine Insektenwachstumshemmung mit Inhibitoren der wichtigsten
Verdauungsenzyme des Darms erzielt worden, und ein Verfahren zur
Selektion geeigneter insektizider Inhibitoren auf Basis dieser Enzyme
ist von Christeller et al. (1992) beschrieben worden.
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Keine
der obengenannten Untersuchungen scheint direkt auf die Herstellung
von topikalen Insektenbekämpfungsmitteln
durch Interferenz mit dem Proteinmetabolismus abzuzielen. In der
Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/16565 (Czapla) gibt jedoch
ein Nebenanspruch die topikale Verwendung von Aprotinin oder eines
anderen Serinpeptidase-Inhibitors mit 90% Homologie zu Aprotinin
zur Bekämpfung
des Europäischen
Kornbohrers (ECB) und des "Southern
corn rootworm" (SCR)
an. Es wird beansprucht, dass Aprotinin für sich allein oder in Kombination
mit einem insektiziden Lektin verwendet werden kann. Von Czapla
wurde gefunden, dass die Inkorporierung von Aprotinin, wenn es zu
20 mg/dl in der Diät
verabreicht wurde, 100% der neonatalen ECB-Larven sowie 60% der
neonatalen SCR in einem Labortest abtötete. So hohe Ingestionsraten wären bei
einer topikalen Anwendung schwer zu erzielen, und die Behandlungskosten
wären kaum
wettbewerbsfähig
mit che mischen Insektiziden. Czapla fand, dass der Serinpeptidase-Inhibitor
SBTI (Kunitz und Bowman-Birk) und der Cysteinpeptidase-Inhibitor
Cystatin weniger effektiv waren als Aprotinin.
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Eine
direkte Verfütterung
von SBTI an blutsaugende Insekten ist von Deloach und Spates (1980)
untersucht worden. Sie fanden eine erhöhte Mortalität und supprimierten
Eischlupf, wenn SBTI in Rindererythrocyten eingekapselt als Köder für Hornfliegen
verwendet wurde. Im Blut kommen bekanntlich verschiedene natürliche Peptidase-Inhibitoren
vor (in erster Linie Serin-Peptidasen). Ihrer Wirksamkeit, das Tier
vor dem Angriff von Insekten zu schützen, sind jedoch Grenzen gesetzt
(Sandeman et al., 1990).
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Wolfson
und Murdock (1987) haben beobachtet, dass es zwar eine umfangreiche
Dokumentation über Vorhandensein
und Verteilung von Peptidase-Inhibitoren in Pflanzen gibt und dass
diese Inhibitoren als auf Insekten-Verdauungspeptidasen gerichtet
angesehen werden, dass es aber nur wenige direkte Beweise gibt,
die ihre effiziente Wirkung in der Hemmung des Insektenwachstums
und der Insektenentwicklung belegen könnten. Diese Autoren haben
demonstriert, dass eine Reduzierung des Larvenwachstums beim Colorado
Kartoffelkäfer
durch Fütterung
von E-64 (ein Cysteinpeptidase-Inhibitor) bei Schwellwerten von
50 μg/ml
auf Kartoffelblättern
erzielt werden konnte. Jedoch wurde bei einer viel höheren Anwendungsmenge
(1000 μm/ml)
ein Plateau in der Mortalität
von 74 bis 85% gefunden, was für
den praktischen Einsatz nicht ausreichend ist. SBTIs (Kunitz und
Bowman-Birk) waren ineffektiv als Wachstumsverzögerer und es wurde nur eine
kleine Antwort auf Pepstatin gefunden.
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Ein
Forschungs-Paper von Dymock et al. (1992) hat die Wachstumshemmung
einer Käferart
im Larvenstadium ("New
Zealand native grass grub")
durch Peptidase-Inhibitoren diskutiert. Im Brennpunkt der Untersuchung
stand die genetische Transformation wichtiger Futterpflanzenspezies,
da die Raupen sich von Wurzeln ernähren. Bioassays haben eine
Wachstumshemmung unter Verwendung von Serinpeptidase-Inhibitoren
gezeigt. Einige anomale Antworten auf bestimmte Inhibitoren wurden
bemerkt (Inhibition durch SBTI, POT I, POT II, CpTI, Stimulation
durch LBTI). Christeller et al. (1989) hatten zuvor Trypsin als
die Hauptpeptidase im Darm der obengenannten Raupe gefunden, trotz
der Tatsache, dass normalerweise Coleopteren-Darmpeptidasen überwiegend
in die Cystein-Kategorie fallen. Allgemein war die zum Erhalt von
Mortalität erforderliche
Aufwandmenge von Peptidase-Inhibitoren zu hoch, um für die topikale
Anwendung noch kosteneffektiv zu sein.
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Zusammensetzungen,
welche durch Inhibition von Metall-Peptidasen wirken (einschließlich Aminopeptidase
oder LAP), sind für
die Insektenbekämpfung
nicht kommerziell entwickelt worden. In der Tat weist der Stand
der Technik weg von der Verwendung von Peptid-basierten Aminopeptidase-Inhibitoren
oder Metallpeptidase-Inhibitoren für die Insektenbekämpfung,
denn:
- (a) effektive Inhibitoren der obengenannten
Kategorie, welche für
die genetische Transformation von Pflanzen geeignet wären, sind
noch nicht identifiziert worden,
- (b) die apparente Rolle dieser Enzyme ist geringer relativ zu
den vorherrschenden Cystein- und/oder Serin-Peptidaseaktivitäten im Darm
von Insekten.
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Shenvi
(1993) hat die Verwendung von α-Aminoborsäurederivaten
als effektive Inhibitoren für
Säugetier-Aminopeptidasen
diskutiert. Shenvi bemerkt, dass gewisse Zwischenprodukte bei der
Synthese von α-Aminoborsäurederivaten
insektizide Eigenschaften haben; jedoch hatten diese Zwischenprodukte
keine Aminogruppe, und es wird nicht vorgeschlagen, dass sie entweder
als Aminopeptidase-Inhibitoren oder Peptidase-Inhibitoren irgendeiner
Art wirken.
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Der
sechszähnige
Komplexbildner EDTA wurde von Samuels und Paterson (1995) und Ferreira
und Terra (1986) als Inhibitor einer Aminopeptidase aus dem Häutungsfluid
und Verdauungsmembranen erkannt. Ein insektizider Effekt von EDTA
wird nicht erkannt; jedoch wurden allgemeine Ansprüche auf
die insektizide Wirkung von Metall-Komplexbildnern von Tomalia und
Wilson (1985, 1986) gemacht. Ein Nachweis, der dies unterstützen würde, wurde
nicht erbracht. Die Verwendung von Metall-Komplexbildnern zur Insektenbekämpfung würde erwartungsgemäß abträglich beeinflusst
durch die Verwendung von hartem Wasser bei der Spritz- oder Sprüh applikation
oder im Falle einer mineralischen oder Bodenkontamination der zu
behandelnden Materialien.
-
Wir
haben nun überraschend
gefunden, dass Zusammensetzungen, welche einen Aminopeptidase-Inhibitor
oder Metallpeptidase-Inhibitor umfassen und welche ferner einen
nicht stark komplexbildenden Peptidase-Inhibitor umfassen, dazu
befähigt
sind, den Schlupf von Insekteneiern und/oder die Entwicklung von Insektenlarven
zu verhindern. Für
den Fachmann wird erkennbar sein, dass die große Mehrheit von Aminopeptidase-Inhibitoren
in der Tat nicht stark komplexbildend ist in dem Sinne, wie dieser
Begriff hierin definiert ist.
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Es
wird klar erkennbar sein, dass die Erfindung über vielfältige Mechanismen auf die Bekämpfung von Insekten
Anwendung finden kann. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zum
Beispiel zur tatsächlichen Abtötung der
Insekten führen
oder zur Unterbrechung von Wachstum und Entwicklung der Insekten,
so dass die Reife verzögert
oder verhindert wird. Eine Verhinderung des Schlupfs von Insekteneiern
ist besonders wünschenswert,
weil bei einer großen
Zahl von ökonomisch
wichtigen Insekten der Schaden durch die Fraßaktivitäten ihrer Larven verursacht
wird.
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Es
wird ferner erkennbar sein, dass wegen der breiten Variation der
individuellen biochemischen Kapazitäten innerhalb der Mitglieder
der Klasse der Insekten die jeweilige Antwort auf bestimmte Inhibitoren und/oder
Kombinationen von Inhibitoren von Art zu Art variieren kann. Demnach
ist es möglich,
dass einige Zusammensetzungen im Bereich der vorliegenden Erfindung
bei einigen Insekten eine schlechte oder gar keine Wirkung zeigen,
während
sie bei anderen eine hohe Wirksamkeit entfalten. Variationen in
den Antworten sind auch auf Unterartniveau zu sehen oder in den
verschiedenen Stadien des Lebenszyklus bestimmter Insekten oder
sogar in den Diäten
der Insekten. Für
den Fachmann wird es möglich
sein, die jeweiligen Inhibitoren den Zielinsekten mit Hilfe normaler
Trial-and-Error-Labor- und -Feldversuche anzupassen.
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Für den Fachmann
wird ferner erkennbar sein, dass die Erfindung auf vielfältige Weise
Verwendung finden kann; dazu gehören,
ohne jedoch hierauf beschränkt
zu sein:
- (a) Bekämpfung des Insektenbefalls
durch direkte Applikation auf Pflanzen oder Tiere, die für einen
solchen Befall anfällig
sind;
- (b) Reduzierung der Zahl der Insekten durch Anwendung der erfindungsgemäßen Mittel
auf die Habitate oder Brutplätze
der Insekten;
- (c) Bekämpfung – entweder
prophylaktisch oder schweregradmindernd – von Infektionen bei Pflanzen
oder Tieren, welche durch Insekten übertragen werden; und
- (d) Bekämpfung – entweder
prophylaktisch oder schweregradmindernd – von Infektionen bei Pflanzen
oder Tieren, welche als Folge eines Insektenbefalls auftreten.
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Im
Sinne der vorliegenden Beschreibung ist der Ausdruck "Peptidase-Inhibitor" als eine beliebige
Verbindung zu verstehen, welche eine beliebige Peptidase zu hemmen
vermag.
-
Praktisch
kann ein Peptidase-Inhibitor mit Hilfe des folgenden Verfahrens
identifiziert werden.
- 1. Selektion repräsentativer
aktiver Peptidasen, welche in einem gereinigten Zustand oder in
Zusammensetzungen, welche das aktive Enzym enthalten, vorliegen
können.
- 2. Selektion eines Enzymaktivitäts-Assays für jede der repräsentativen
Peptidasen durch Selektion eines geeigneten Substrates für das Enzym
und geeigneter Bedingungen für
die Reaktion, so dass ein geeigneter quantifizierbaren Endpunkt
innerhalb eines geeigneten Zeitraumes erhalten wird.
- 3. Die Testverbindung wird als ein Peptidase-Inhibitor angesehen,
wenn eine Reaktionshemmung von 50% oder mehr in einem der obengenannten
Enzymaktivitäts-Assays
gefunden wird.
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Im
Besondern kann ein Metallpeptidase-Inhibitor oder ein Aminopeptidase-Inhibitor
auf diese Weise identifiziert werden.
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Der
Ausdruck "nicht
stark komplexbildender Peptidase-Inhibitor" soll einen Peptidase-Inhibitor bedeuten,
der in einem kompetitiven Bindungstest Zn2+-Ionen weniger stark
komplexiert als EDTA. Sowohl EDTA als auch der Inhibitor sollten
bei der gleichen Konzentration in der Reaktionsmischung vorliegen,
wobei ein geeigneter Wert 0,1 mM betragen kann. Der Fachmann wird
in der Lage sein, geeignete Reaktionsbedingungen und Methoden zur
Bestimmung der Zn2+-Verteilung zu wählen (z.
B. unter Einsatz der Mehrkern-Kernspinresonanz (NMR), UV-Spektroskopie,
voltametrischer Techniken und der Massenspektroskopie mit weicher
Ionisation).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem
Aspekt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung für die Bekämpfung von
Insekten, wobei die Zusammensetzung einen Aminopeptidase-Inhibitor
oder einen Metallpeptidase-Inhibitor umfasst und wobei die Zusammensetzung
ferner einen nicht stark komplexbildenden Peptidase-Inhibitor umfasst.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
eine Aminogruppe oder ein Derivat hiervon umfassen oder einen oder
mehrere Aminosäurekomponenten
oder Derivate hiervon. Bevorzugt umfasst der Aminopeptidase-Inhibitor
oder der Metallpeptidase-Inhibitor einen Leucin-, Arginin-, Methionin-, Asparagin-,
Alanin-, Glutamyl-, Prolyl-, Valyl- oder Cystein-Baustein oder ein Derivat hiervon. Noch
bevorzugter umfasst der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor
einen Leucin-Baustein oder ein Derivat hiervon.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
mit einem oder mehreren Metallionen am aktiven Zentrum der Metallpeptidase
oder der Aminopeptidase wechselwirken.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
einen Komplexbildner umfassen, bei dem es sich bevorzugt um einen
zweizähnigen,
dreizähnigen,
vierzähnigen
oder sechszähnigen
Komplexbildner handelt. Bevorzugt ist der Komplexbildner eine Aminocarbonsäure-Komponente
oder ein Salz hiervon mit komplexbildenden Eigenschaften, noch bevorzugter
Ethylen diamintetraessigsäure
oder Nitrilotriessigsäure
oder ein Salz oder Derivat hiervon mit komplexbildenden Eigenschaften.
-
Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
ein wasserlösliches Übergangsmetallion
oder einen Komplex oder ein Derivat hiervon umfassen, ausgewählt aus
der Gruppe, welche aus Kupfer, Cobalt, Zink, Vanadium, Magnesium,
Mangan und Eisen besteht.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
eine Boronsäure-,
Phosphoryl- oder Phosphonyl-Baueinheit umfassen.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
irreversibel an eine Aminopeptidase oder eine Metallpeptidase binden.
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Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
einen selektiven Inhibitor umfassen, welcher Trypsin oder Calpain
nicht inhibiert und welcher bevorzugt andere Serin- oder Cystein-Peptidasen
nicht inhibiert.
-
Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann
ein Enzym inhibieren, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, die
aus Leucin-Aminopeptidasen, Aminopeptidasen vom Typ A, B, N und
M, Arginin-Aminopeptidasen, Methionin-Aminopeptidasen, D-Aminosäure-Aminopeptidasen,
Peptidyl-Dipeptidasen,
Zink-Aminopeptidasen, N-Formylmethionin-Aminopeptidasen, Dipeptidyl-Aminopeptidasen,
Carboxypeptidasen vom Typ A und B, Tripeptidyl-Peptidasen, Dipeptidyl-Peptidasen
und Peptidyl-Tripeptidasen besteht.
-
Bevorzugt
ist der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor
zur Inhibition einer Leucin-Aminopeptidase, noch bevorzugter zur
Inhibition einer Insekten-Leucin-Aminopeptidase befähigt.
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Der
nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor kann einen Serin-Peptidase-Inhibitor,
einen Cysteinpeptidase-Inhibitor, einen Aspartylpeptidase-Inhibitor oder einen
Aminopeptidase-Inhibitor umfassen. Inhibitoren, welche für die vorliegende
Erfindung Anwendung finden können,
umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein:
- – Trypsin-
und Chymotrypsin-Inhibitoren, z. B. Pefabloc;
- – Serin-
oder Cysteinpeptidase-Inhibitoren aus Leguminosen, Gemüsen, Früchten oder
Cerealien;
- – Cystatine
und E-64;
- – Carboxypeptidase-Inhibitoren
aus der Kartoffel oder anderen Quellen;
- – Eglin
C;
- – L-Leucinthiol
-
Trypsin-
und Chymotrypsin-Inhibitoren umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein:
Kunitz-Trypsin-Inhibitor (SBTI), Bowman-Birk-Trypsin- und Chymtrypsin-Inhibitor,
Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, Trypsin-Inhibitor aus Rinderpankreas,
Trypsin-Inhibitor aus Hühnerovomucoid,
Trypsin-Inhibitor aus Cucurbit maxima, POT-I- und POT-II-Trypsin-Inhibitor, α-1-Antitrypsin,
Arrowhead-Trypsin-Inhibior, Erythrin-Trypsin-Inhibitor und humanen
inter-alpha-Trypsin-Inhibitor.
-
Serin-
oder Cystein-Peptidase-Inhibitoren aus Leguminosen, Gemüsen, Früchten oder
Cerealien umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Peptidase-Inhibitoren
aus roten Bohnen, Kuhbohnen, Spalterbsen, Flügelbohnen, Mungobohnen, Senf,
Kürbis,
Gemeiner Kümmel,
Cajun-Erbsen, Baumwolle, Mais, Weizen, Sorghum, Rapssamen, Hirse,
Gerste und Gartenkürbis.
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Cystatine
umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Oryzacystatin
I und II aus Reis, Multicystatin aus der Kartoffel und seine trypsinverdauten
Untereinheiten und Cystatin aus Hühnerei.
-
Immer,
wenn im vorliegenden Text auf Peptidase-Inhibitoren mit ihrem Trivialnamen
Bezug genommen wird, erstreckt der Bezug sich auch auf Analoga dieser
Inhibitoren, d. h. Inhibitoren mit ähnlicher Struktur und/oder ähnlichen
inhibierenden Charakteristika (Wechselwirkungen mit dem aktiven
Zentrum/den aktiven Zentren des Zielenzyms) zu der/den allgemein
anerkannten Substanz/en.
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Geeignete
Analoga können
Teile des benannten Inhibitors, Konjugate desselben oder Substanzen
mit mindestens 70% Homologie, bevorzugt mindestens 80% Homologie,
meistbevorzugt mindestens 90% Homologie zu der benannten Substanz
sein.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann optional ferner ein oder mehrere Additive umfassen, so etwa
Dispergiermittel, viskositätsmodifizierende
Mittel, Gefrierschutzmittel, Benetzer, Co-Lösemittel, UV-Absorber, Farbstoffe
und Träger,
welche pharmazeutisch, veterinärmedizinisch,
landwirtschaftlich oder gartenbaulich zulässig sind.
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Gemäß einer
Ausführungsform
umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung
einen Aminopeptidase-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, welche
aus L-Leucinthiol, Actinonin, Bestatin, 1,10-Phenanthrolin und EDTA
besteht, zusammen mit einem nicht stark komplexbildenden Peptid-Inhibitor,
ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus SBTI, Pefabloc und Antipain besteht.
-
Der
Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor oder
der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor umfasst bevorzugt
ein Peptid, ein Polypeptid und/oder ein Protein.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von
Insekten, welches den Schritt umfasst, die Insekten einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
auszusetzen.
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Bevorzugt
werden die Insekten bekämpft
durch Inhibieren des Schlupfs der Insekteneier und/oder durch Inhibieren
der Entwicklung der Insektenlarven durch Aussetzen der Insekteneier
oder -larven einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
-
Bevorzugt
handelt es sich bei dem Insekt um eine Spezies, die einer Ordnung
zugehört,
ausgewählt aus
der Gruppe der Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera,
Hymenoptera, Dictyoptera, Isoptera, Thysanoptera, Homoptera, Diptera,
Anoplura, Malophaga und Siphonaptera. Noch bevorzugter ist das Insekt
ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus Myiasisfliegen, knospenfressenden Mottenlarven,
Flöhen, Feldgrillen,
Schaben, hellbraunen Apfelmotten und Korn- und Mehlvorratsinsekten
besteht.
-
In
Einklang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann das Zielinsekt durch ein beliebiges geeignetes Mittel dem Enzyminhibitor
ausgesetzt werden. Für
den Fachmann wird erkennbar sein, dass diese Mittel vielfältig variieren
können,
in Abhängigkeit
davon, ob der Inhibitor auf eine Pflanze oder auf ein Tier angewendet
werden soll, und in Abhängigkeit
von der Natur des Zielinsektes und der Pflanze oder des Tieres.
Die Mittel, welche zum direkten Anwenden von Enzyminhibitoren auf
die von dem Insekt angegriffenen Pflanzen oder Tiere geeignet sind,
können
sich erheblich von denjenigen Mitteln unterscheiden, die zum Anwenden
des Enzyminhibitors auf die Insektenhabitate oder -brutplätze geeignet
sind.
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Geeignete
Mittel zum Anwenden von Enzyminhibitoren auf Tiere umfassen, ohne
jedoch hierauf beschränkt
zu sein, die direkte topikale Applikation, z. B. durch Tauch- oder
Sprühmethoden,
oder die innere Anwendung, wie Tränken, Implantate, verzögernd freisetzende
Bolus-Formulierungen oder Vorrichtungen, welche zur Retention im
Rumen geeignet sind, und Insektenköder und Tabletten. Wo die erfindungsgemäßen Agenzien
auf den Menschen angewendet werden, umfassen die zur topikalen Applikation
geeigneten Formulierungen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein,
Sprays, Aerosole, Cremes und Lotionen, und Formulierungen, welche
zur inneren Anwendung geeignet sind, umfassen, ohne jedoch hierauf
beschränkt
zu sein, Tabletten, Kapseln oder flüssige Formulierungen. In manchen
Situationen kann eine parenterale Administration durch Injektion
das geeignetste Behandlungsmittel für Mensch oder Tier sein.
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Wo
der Enzyminhibitor auf Pflanzen angewendet werden soll, umfassen
geeignete Mittel, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Sprays, Stäube, Pellets
oder Aerosole. Das erfindungsgemäße Verfahren
erstreckt sich auch auf den gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden
Einsatz von zwei oder mehr Metallpeptidase-Inhibitoren oder die
Verwendung von einem oder mehreren Metallpeptidase- oder Aminopeptidase-Inhibitoren
in Verbindung – gleichzeitig
oder aufeinanderfolgend – mit
einem oder mehreren Inhibitoren für andere Arten von Enzymen,
einem oder mehreren Inhibitoren für andere insektenphysiologische
Prozesse oder einem oder mehreren anderen insektiziden Agenzien, gleichgültig, ob
die Applikation dieser anderen Inhibitoren topikal, innerlich oder
durch transgene Modifikation geschieht.
-
Einige
Inhibitoren, welche für
die Erfindung Verwendung finden können, sind von ihrer Natur
her Peptide, Polypeptide oder Proteine.
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Für bevorzugte,
nicht-limitierende Ausführungsbeispiele
der Erfindung sind:
- (a) die Tiere, welche mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt werden sollen, ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus Menschen, Schafen, Rindern, Pferden,
Schweinen, Geflügel,
Hunden und Katzen besteht;
- (b) die Pflanzen, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt werden sollen, ausgewählt aus
der Gruppe, welche aus Baumwolle, Ölsaatkulturpflanzen, Zierpflanzen,
Blumen, Obstbäumen,
Getreidekulturpflanzen, Rebenkulturpflanzen, Hackfrüchten, Futterpflanzen
und Gemüsen
besteht;
- (c) die zu bekämpfenden
Insekten im Falle der Anwendung der Erfindung im Gartenbau und im
großenflächigen Anbau:
Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Isoptera, Thysanoptera
oder Homoptera; im Falle von durch Insekten verursachten Infektionen
beim Tier: Diptera, Anoplura, Malophaga oder Siphonaptera; oder
im Falle von Haus- oder Industrieschädlingen: Isoptera, Dictyoptera
und Hymenoptera.
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DETAILBESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung wird nun im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden
nicht-limitierenden
Beispiele rein beispielhaft beschrieben.
-
Die
folgenden Beispiele demonstrieren die Insektenwachstumshemmung oder
die insektiziden Aktivitäten,
welche mit Hilfe der Erfindung erhalten werden. Es versteht sich
jedoch, dass auch andere Verfahren und Anwendungen möglich sind.
Die Effekte von Inhibitoren für
Serin- und Cystein-Peptidasen allein (die nicht in den Bereich der
Erfindung fallen) sind mit aufgenommen, um die Variabilität in den
Antworten auf Inhibitoren von Art zu Art zu veranschaulichen oder
um durch die Verwendung der Erfindung nachfolgend erhaltene additive
oder synergetische Vorzüge
beispielhaft zu befeuchten.
-
Beispiel 1 Einfluss von
einzelnen Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Larven der Schafschmeißfliege (Lucilia
cuprina; Diptera)
-
Verfahren
-
Die
Larven schlüpften
aus Eiern, deren Oberfläche
mit 0,5% Natriumhychlorit sterilisiert und über Nacht bei 27°C inkubiert
worden war. Die Larven im ersten Stadium (im Folgenden auch Erstlarven
genannt) wurden gesammelt und auf 1 ml eines autoklavierten Kulturmediums
mit bzw. oder ohne zusätzliche/n
Inhibitor/en, wie angegeben, gesetzt. Das Kulturmedium bestand aus
2% Agar, 10% Casein, 2% Hefe und 0,5 Glucose in destilliertem Wasser
in einer sterilen Ampulle oder Flasche. Fünf bis fünfzig Larven, je nach vorgesehener
Dauer der Kultur, wurden in jede Flasche eingebracht, die sodann
mit einem Deckel mit einem feinen Kunststoffnetzeinsatz verschlossen
wurde. Diese Kappe gestattete einen freien Luftaustausch in der
Flasche.
-
Die
Flaschen wurden dann in einen großen sterilen Behälter eingebracht,
der dicht verschlossen wurde, um Kontakt mit der Umgebung zu vermeiden.
Der Behälter
umfasste Einlass- und Auslassschläuche, die mit einer Quelle
für sterile,
erwärmte
und befeuchtete Luft bzw. einer Vakuumpumpe verbunden waren. Die Vorrichtung,
einschließlich
der Kulturflaschen, wurde für
24 bis 72 h bei 35°C
gehalten. Dies erlaubte ein Wachstum der Larven bis zu den erforderlichen
Entwicklungsstadien.
-
Die
Kulturen wurden in einer Sterilluftstromhaube angeordnet und in
einer sterilen Umgebung inkubiert, um die Wahrscheinlichkeit einer
Kontamination durch Bakterien, welche das Larvenwachstum fördern oder
behindern könnten
und wodurch die Resultate ihre Gültigkeit
verlieren würden,
auf ein Minimum zu reduzieren. Nach der vorgesehenen Kulturdauer
wurden die Flaschen entnommen und die Larven durch Gefrieren abgetötet. Sie
wurden sodann getrocknet und gewogen, entweder zusammen oder einzeln.
-
Das
Gewicht von Insektenlarven in Kontrollkulturen (Larven, die gleichzeitig
unter den gleichen Umgebungsbedingungen und mit der gleichen Nahrung,
aber ohne Inhibitoren aufgezogen wurden) wurde dann mit dem Gewicht
der Larven mit Inhibitoren verglichen und die Inhibition (I) in
Prozent gemäß der folgenden Formel
berechnet:
worin
a = das Gewicht
der Larven in Gegenwart des Inhibitors ist und
c = das Gewicht
der Kontrolllarven bedeutet.
-
In
diesem Kultursystem ist eine große Zahl von Inhibitoren getestet
worden, von denen eine Auswahl in Tabelle 1.1 aufgelistet ist. Die
Effekte der Inhibitoren auf Erstlarven-Wachstum und -Überleben
sind in Tabelle 1.2 aufgezeigt.
-
Tabelle
1.1
Peptid-Inhibitoren und diesbezügliche Verbindungen im Test
gegen Schmeißfliegenlarven
in vitro
-
Tabelle
1.2
Die Wirkung von verschiedenen Inhibitoren auf Erstlarven-Wachstum
und -Überleben
-
Unsere
Ergebnisse haben gezeigt, dass Inhibitoren, welche trypsin-artige
Enzyme beeinflussen, wirksam sind, das Larvenwachstum zu verlangsamen,
oder – im
Falle von TLCK – die
Larven bei den höchsten getesteten
Konzentrationen abzutöten.
E64, ein Cysteinpeptidase-Inhibitor, war unwirksam; die Wirkungen des
Calpain-Inhibitors auf das Wachstum und die dazwischenliegende Inhibition
durch Leupeptin und APMS (nicht-cysteinspezifische Inhibitoren)
legen jedoch nahe, dass Cysteinpeptidasen möglicherweise eine wesentliche
Rolle zukommt.
-
Die
Unwirksamkeit der Inhibition von Aspartylpeptidase(n) durch Pepstatin
steht in Einklang mit älterer Literatur.
-
Das überraschende
Ergebnis dieses Experiments war der dominierende Einfluss von einigen
Aminopeptidase-Inhibitoren auf das Larvenwachstum. Diese Resultate
zeigen, dass die Wirksamkeit der Inhibition von larvale/r/n Aminopeptidase/n
gegeben war. L-Leucinthiol, EDTA, 1,10-Phenanothrolin, Bestatin,
Amastatin, Leuhistin und Actinonin waren wirksame Wachstumsinhibitoren.
Die Inhibitoren für
Dipeptidylaminopeptidase (Diprotin A) und Methioninaminopeptidase
(Ebalacton) waren unwirksam.
-
Beispiel 2 Einfluss von
kombinierten Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben
von Larven der Schafschmeißfliege (L.
cuprina; Diptera)
-
(a) Verwendung kombinierter
Serin- und Serin:Aminopetidase-Inhibitor-Kombinationen
-
Die
Daten aus den in Beispiel 1 umrissenen Tests ließen vermuten, dass Kombinationen
der Inhibitoren, die trypsinartige und/oder Aminopeptidase-Enzyme
beeinflussten, additive oder synergistische Effekte haben könnten. Es
wurden weitere Versuche durchgeführt,
um diese Möglichkeit
zu untersuchen, unter Einsatz der im Vorstehenden beschriebenen
Methoden. Die Resultate sind in Tabelle 2.1 dargelegt.
-
Tabelle
2.1
Inhibitor-Kombinationen und ihre Wirkung auf das Erstlarvenwachstum
und -überleben
in vitro
-
Aus
der Kombination von SBTI mit Leupeptin oder Pefabloc war nur eine
geringe Wirkung ersichtlich. Eine moderate Wirkung wurde mit SBTI
und EDTA erhalten. Größere Hemmung
trat ein, wenn SBTI mit TLCK oder L-Leucinthiol getestet wurde.
Die Resultate legen nahe, dass eine multiple Inhibition von trypsinartigen Peptidasen
und Aminopeptidasen eine geeignete hemmende Wirkung auf die Larven
hat.
-
(b) Untersuchung der Wirkung
der Kombination eines Serinpeptidase-Inhibitors (SBTI) mit einem
Aminopeptidase-Inhibitor (L-Leucinthiol) auf die Wachstumshemmung
von L. cuprina-Larven
-
Die
Wirkung der Kombination von SBTI- und L-Leucinethiol-Inhibitoren
auf das Larvenwachstum wurde über
einen Bereich von Konzentrationen untersucht, um die Möglichkeit
des Auftretens einer synergistischen Inhibition zu erfor schen. Dieser
Versuch wurde beendet, noch bevor eine signifikante Mortalität eintrat. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2.2 gezeigt.
-
Tabelle
2.2
Inhibierende Wirkung der Kombination von SBTI- und L-Leucinthiol
(L-Leu-)Inhibitoren auf das Larvenwachstum
-
(c) Untersuchung der Wirkung
der Kombination von zwei Aminopeptidase-Inhibitoren (EDTA und L-Leucinthiol) auf
das Wachstum der Larven von L. cuprina
-
Die
Resultate dieser Versuche sind in Tabelle 2.3 aufgezeigt.
-
Tabelle
2.3
Kombination von EDTA und L-Leu
-
Beispiel 3 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf den Larvenschlupf aus Eiern der Schafschmeißfliege
(L. cuprina; Diptera) und Heliothis punctigens
-
Die
folgenden Versuche wurden durchgeführt, um zu ermitteln, ob die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
eine insektizide Rolle durch Inhibition des Eischlupfs erfüllen konnten.
-
Eier
von L. cuprina wurden auf Leberstücke (0,9 g) abgelegt, die sodann
in einzelne Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen
platziert wurden. Eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS,
0,1 ml), welche die Inhibitoren bei bestimmten Konzentrationen enthielt,
wurde zu jeder Vertiefung mit 30 frisch abgelegten und sterilisierten
Eiern von L. cuprina hinzugegeben. Die Kulturplatte wurde dann bei
35°C für 24 h in
einer sterilen Umgebung gehalten; nach Ablauf dieser Zeit wurde
der Schlupf in Prozent beurteilt.
-
Heliothis-Eier
wurden auf einem definierten Medium (Casein 3 g, Weizenkeime 3 g,
Sucrose 5 g, Agar 2,25 g, Multivitamin-B-Tabletten 5 mg, gelöst in 80
ml PBS mit Penicillin und Streptomycin) in Gewebekulturplatten mit
24 Vertiefungen (2 Eier/Vertiefung) kultiviert. Der Eischlupf wurde
nach dreitägiger
Inkubation bei 27°C
beurteilt. Die Resultate sind in Tabelle 3.1 dargestellt.
-
Tabelle
3.1
Die Wirkung von Enzym-Inhibitoren auf die Eischlüpfrate für L. cuprina
in vitro
-
In
anfänglichen
in vitro-Versuchen schlüpften
zehn Heliothis-Eier in einer Mischung von 0,17 mM SBTI und 5 mM
Actinonin nicht, während
alle zehn Kontrolleier schlüpften.
-
Beispiel 4 Einfluss der
Erfindung auf Wachstum und Überleben
des Baumwollknospenwurms (Heliothis punctigens, Lepitdoptera) bei
Fütterung
der Larven mit einer synthetischen Diät
-
Eine
synthetische Diät
wurde wie folgt hergestellt:
Gartenbohnen | 468
Gramm (g) |
Weizenkeime | 100
g |
Hefe | 70
g |
Ascorbinsäure | 70
g |
Paraben | 44
g |
Sorbinsäure | 2,2
g |
Agar | 28
g |
H2O | 800
ml |
Phosphor-
und Propionsäure | 4
ml |
29
ml | Propionsäure |
21
ml | Orthophosphorsäure |
270
ml | dH2O |
500 ml Gesamtvolumen | |
- 1. Die Gartenbohnen wurden
40 Minuten in der Mikrowelle gekocht.
- 2. Der Agar wurde zu dem heißen Wasser hinzugegeben und
auf einer Heizplatte fast bis zum Sieden gerührt.
- 3. Die Gartenbohnen, die Agarmischung, die Hefe und die Weizenkeime
wurden in einem elektrischen Mixer 3 Minuten gemischt.
- 4. Nachdem die Temperatur auf 60°C gesunken war, wurden die Säuren zugesetzt
und mit den Medien vermischt.
- 5. Die Inhibitorlösungen
oder ein gleiches Volumen an Wasser wurden in den angegebenen Konzentrationen
in sterilisierte Glasröhrchen
gegeben. Das synthetische Medium wurde in jedes Röhrchen gegeben (1,5
ml), wobei eine sterile 10 ml-Spritze verwendet wurde. In die Glasröhrchen wurden
Heliothis punctigens-Larven im ersten Stadium gesetzt (1 Larve pro
Röhrchen)
und die Röhrchen
dann verschlossen. Die Röhrchen
wurden 10 Tage bei 25°C
inkubiert. Die Larven wurden getötet,
indem die Glasröhrchen
für 24
h bei –70°C gehalten
wurden; sodann wurden sie einzeln gewogen. Die Inhibition in Prozent
wurde durch Vergleich mit Kontrolllarven berechnet.
-
Die
Resultate sind in Tabelle 4.1 gezeigt.
-
Tabelle
4.1
Wachstum von Heliothis punctigens-Larven bei Fütterung
mit einer synthetischen Diät
mit und ohne Inhibitoren
-
Beispiel 5 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Katzenflöhen (Ctenocephalides
felis; Siphonaptera)
-
Einem
fünf Jahre
alten Merinoschaf, welches seit 18 Monaten nicht mit einem Mittel
gegen Ectoparasiten behandelt worden war, wurde Blut aus der Drosselvene
entnommen. Das Blut wurde in einer 100 ml-Kunststoffflasche gesammelt,
welche 0,8 ml Heparin enthielt, und bei 4°C gehalten. Die Inhibitoren
wurden vorher in sterile 5 ml Kunststoffampullen eingewogen; hierzu
wurden 4,5 ml Blut gegeben. Die Proben wurden gemischt und 24 h
bei –70°C gehalten,
anschließend
gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Proben wurden durch ein
63 μm-Edelstahlsieb
gesiebt und in sterile 5 ml-Kunststoffampullen gegeben (0,15 g pro
Röhrchen).
In jede Ampulle wurden vier Floheier gegeben, und jede Ampulle wurde
mit einem Blatt Tissuepapier, welches mit Hilfe eines elastischen
Bandes befestigt wurde, oben abgedeckt. Die Ampullen wurden bei
25°C und
70 bis 80% r. F. 6 Tage inkubiert. Sodann wurde Vermiculit in jede
Ampulle gegeben, um ein Stützmedium für die Verpuppung
der Flöhe
bereitzustellen, und die Röhrchen
wurden bei 25°C
und 70 bis 80% r. F. wei tere 10 Tage inkubiert. Es wurden zehn Kontrollampullen
und drei Ampullen pro Behandlung getestet.
-
Am
Ende der Inkubationsperiode wurden die Ampullen 24 h bei –20°C gehalten,
um die Flöhe
abzutöten.
Die Zahl der geschlüpften
Eier und das Lebenszyklusstadium wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 5.1 aufgezeigt.
-
Tabelle
5.1
Entwicklung von Floheiern in Trockenblutdiäten (Tag
16)
-
Beispiel 6 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf das Überleben
von Larven der Schwarzen Feldgrilie (Teleogryllus commodus, Orthoptera)
bei Fütterung
einer natürlichen
Diät
-
- (i) Stammlösungen
von Inhibitoren und Kontrolllösungen
wurden als wässrige
Lösungen
oder Suspension hergestellt, wie in Tabelle 6.1 aufgeführt.
- (ii) Zur Mortalitätsbeurteilung
wurde die Untersuchung mit dem ersten Nymphenstadium begonnen.
- (iii) Scheiben aus Kohlblättern
(5 Scheiben mit jeweils 8 mm Durchmesser pro Behandlung) wurden
mit 100 μl
Inhibitor- oder Kontroll-Stammlösungen bestrichen
und trocknen gelassen. Die Scheiben wurden einzeln in 40 mm-Petrischalen
gegeben, zusammen mit einem feuchten Baumwollbausch als Wasserversorgung und
einem Stück
flötenartig
geformten Kunststoff als Unterschlupf.
- (iv) Zehn Nymphen wurde auf jede Scheibe platziert und die Schalen
wurden bei 25°C
inkubiert.
- (v) Die Mortalität
wurde täglich
beurteilt, wobei tote Individuen entfernt wurden.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 6.1 dargestellt.
-
Tabelle
6.1
Effekt von verschiedenen Inhibitoren auf die Mortalität von larvalen
Feldgrillen nach 7 Tagen
-
Beispiel 7 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Schafläusen (Bovicola
ovis; Anoplura)
-
Die
Schaflaus ist ein bedeutendes landwirtschaftliches Schadinsekt in
Australien und vielen anderen Ländern.
Einige Stämme
der Insekten entwickeln hohe Resistenzgrade gegenüber Organophosphaten
und synthetischen Pyrethroiden. Zweck dieses Versuchs war,
- (i) die Beurteilung der Wachstumshemmung oder
insektiziden Aktivität
der für
die Erfindung geeigneten Inhibitoren zu erweitern; und
- (ii) die Beurteilung der Wachstumshemmung oder insektiziden
Aktivität
der Erfindung bei einem Insektenstamm mit bekanntermaßen hohem
Insektizidresistenzgrad.
-
Der
Läusestamm
war ein unter der Bezeichnung Hartley bekannter Referenzstamm. Der
Stamm ist hochresistent gegen synthetische Pyrethroide (Tabelle
7.1, Levot G. W., Aust. Vet. J., 1992, 69, 120).
- (i)
Die Läuse
wurden gesammelt durch Scheren eines kleinen Stücks Wolle von einem stark infizierten Schaf
und Bedecken des geschorenen Bereichs für eine Minute mit einem Baumwolltuch.
Von dem Tuch wurden die Läuse
in einen Behälter
gebürstet.
- (ii) Wässrige
Stammlösungen
oder -suspensionen von Inhibitoren wurden auf Wollbüschel appliziert,
welche von den 40 mm Vlies, die der Haut am nächsten lagen, genommen wurden.
Das Spenderschaf war bekanntermaßen 2 Jahre lang nicht mit
Insektizid behandelt worden und seine Wolle hatte eine Stapellänge von
100 mm beim Scheren.
- (iii) Sorgfältig
darauf bedacht, eine Kreuzkontamination zu vermeiden, behandelte
man vierfache Wollproben durch Eintauchen in wässrige Lösungen oder Suspensionen von
Inhibitoren, danach wurde abtropfen gelassen und 24 h an der Luft
getrocknet.
- (iv) Die Wollproben wurden in etikettierte Kunststoffröhrchen mit
Verschluss gegeben.
- (v) Man ließ die
Läuse über Papier
von einer Lichtquelle wegkriechen (als Viabilitätstest); sodann wurden jeweils
10 Läuse
im adulten, dritten, zweiten und erste Stadium in jedes Röhrchen mit
Wolle gesetzt.
- (vi) Die Röhrchen
wurden bei 35°C
und 60 bis 80% r. F. inkubiert und täglich überprüft.
- (vii) Für
die Beurteilung der Viabilität
wurde davon ausgegangen, dass Läuse,
die beim Berühren
unbeweglich blieben, tot waren.
-
Die
Resultate zeigt Tabelle 7.1
-
Tabelle
7.1
Zahl der lebenden Läuse,
aufgezogen auf inhibitorbehandelter Wolle, nach 24-stündiger Inkubation
bei 35°C
-
Tabelle
7.2
Insektizidresistenzcharakteristika der getesteten Läuse
-
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
zeigte eine hohe Wirkung auf insektizidresistente Schafläuse.
-
Beispiel 8 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben des Kornkäfers Tribolium
castaneum; Coleoptera
-
Die
Insekten wurden in gereinigtem, gemahlenem und gesiebtem Vollkornmehl
aus biologischem Weizen kultiviert. Die Inhibitoren aus Flaschen
mit vorher abgewogenem Material wurden mit dem Mehl trockengemischt
und die Inhibitorreste wurden mit einem kleinen Volumen an Wasser
aus den Flaschen gespült.
Das Spülwasser
wurde dem Mehl zugesetzt und die Mischung erneut vermahlen. Das
imprägnierte
Mehl wurde in eine 20 ml-Ampulle transferiert und unter Schütteln und
Umdrehen gründlich
gemischt.
-
T.
castaneum-Adulten wurde die Eiablage an dem Mehl erlaubt; die Eier
wurden aus dem Mehl herausgesiebt und einzeln mit einem einzigen
Haar in Microwell-Röhrchen
transferiert, welche eine kleine Menge Mehl enthielten. Jedes Behandlungsniveau
wurde dreifach durchführt
mit 32 Vertiefungen/Replikat. Die Assays wurde dreifach durchgeführt. Die
Kulturen wurden bei 30°C
und 55% r. F. inkubiert.
-
Nach
6 Tagen wurde jedes Replikat von 32 Vertiefungen kombiniert, die
Larven wurden gezählt
und die Zahlen mit Zahlen aus der Kontrollbehandlung (ohne Inhibitor)
verglichen. Die Larven wurde als "klein" beurteilt, wenn sie deutlich kleiner
waren als die Referenzlarven, oder als anomal, wenn ungewöhnliche
Verhaltensweisen oder Ausbildungen beobachtet wurden (z. B. Krümmung oder
gekrümmte
Larven).
-
Die
Test-Inhibitoren und Dosisraten waren die gleichen wie die in Beispiel
4 verwendeten.
-
Ergebnisse
-
Tag 6
-
- – Eischlupf
war nicht konsistent beeinflusst am Tag 6
- – Larven
wurden als "klein" beurteilt bei Actinonin
und EDTA in allen Dosierungen, aber normal bei 1,10-Phenathrolin-
und anderen Behandlungen
-
Beispiel 9 Einfluss von
Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben des Getreidevorratsschädlings Oryzaephylus
surinamensis; Coleoptera
-
Das
Bioassay für
dieses Insekt war das gleiche wie für T. castaneum beschrieben,
ausgenommen, dass die Inkubationen bei 32,5°C und 70% r. F. durchgeführt wurden.
Nach 8 Tagen wurden die Insekten aus dem Mehl herausgesiebt und
gewogen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 9.1 dargestellt.
-
Tabelle
9.1
Gewichtsminderung in Prozent bei O. surinamensis-Larven
-
Die
Antwort auf die einzelnen Aminopeptidase-Inhibitoren war unterschiedlich.
1,10-Phenanthrolin war ein hochwirksamer Wachstumsinhibitor, EDTA
zeigte eine moderate Wirksamkeit und Bestatin war unwirksam.
-
Die
Erfindung wurde zum besseren Verständnis ausführlicher beschrieben; für den Fachmann
wird jedoch erkennbar sein, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen
an den Ausführungsformen
und Verfahren, wie sie hierin beschrieben sind, vorgenommen werden
können,
ohne den Bereich des erfindungsgemäßen Konzeptes zu verlassen,
wie in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
-
Hierin
zitierte Schriften sind auf den folgenden Seiten aufgelistet.
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