CN1158551A - 昆虫的生物控制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合物以及应用它控制昆虫的方法。该组合物含有氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂，还含有一种非牢固螯合的肽酶抑制剂。优选该组合物局部施用，并且优选引起昆虫卵孵化受抑制和/或昆虫幼虫的发育受抑制和/或昆虫幼虫死亡。

Description

昆虫的生物控制
本发明涉及一种昆虫控制方法和为此使用的组合物。
本发明特别涉及到对昆虫侵扰动植物的控制和对由昆虫传播的动植物感染的预防。本发明也可被运用于减轻由于昆虫侵扰引起的感染。
本发明还特别涉及到几种用于控制昆虫的含肽酶抑制剂的组合物，并涉及到能表达肽酶抑制剂的抗虫转基因生物的利用。现有技术描述
昆虫会对世界范围的很多种类的动植物造成严重的虫害。据估计，虽然使用了现有的控制手段，每年仍有约13％的作物收成被损失掉。一些昆虫如鳞翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、啮虫目(Psocoptera)、等翅目(Isoptera)、缨翅目(Thysanoptera)和同翅亚目(Homoptera)的昆虫会使很多种园艺作物和大田作物，以及储存的谷物和谷产品遭到很大损失。双翅目(Diptera)、Anaplura、食毛目(Malophaga和蚤目(Siphonaptera)的昆虫会造成动物和人的寄生感染。其他目(膜翅目(Hymenoptera)、网翅目(Dictyoptera)、等翅目(Isoptera))中包括重要的生活害虫和工业害虫。
许多现有的昆虫控制手段依赖于使用化学杀虫剂，如加氯烃(DDT、硫丹等)、有机磷酸盐(毒死蜱、二嗪农、马拉息昂、硝基硫磷酯)、有机甲氨酸酯(甲氨酰、灭多虫、proxypur)和合成的拟除虫菊酯(氯氰菊酯、deltamethrin)。
使用化学杀虫剂的问题是靶昆虫会产生抗药性(有机磷酸盐、合成拟除虫菊酯)、环境中和动植物组织内的化学物质残留和化学杀虫剂对非目标生物的有害作用(有机氯制剂、昆虫生长调节剂)。
硼化合物(四硼酸钠、polybor)也被用来杀虫。硼化合物稳定，在实用剂量下杀虫相对慢一些(Mullens和Rodriguez，1992)，人体大剂量摄入会致命(Anon，1991)。
其他类型的杀虫剂有昆虫生长调节剂(IGRs)和能杀虫的细菌毒素(如苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素)。IGRs是通过某种途径干扰几丁质合成的化合物，其中包括保幼激素类似物(蒙五一五)、几丁质合成抑制剂(双氧威、diflubenzuron、flurazuron)和三嗪衍生物(cyromazine)。关于昆虫对很多种IGR的抗药性已有记载。某些鳞翅目昆虫也在对Bt毒素产生抗药性。使用IGR和Bt毒素，在技术上很难保证在生活史中的合适阶段对昆虫有足够杀伤。有些IGR稳定并可能造成环境危害。
最有用的杀虫剂是那些有高的杀虫活性和低的环境残留的种类(有机磷、合成的拟除虫菊酯)。但使用这些杀虫剂最大的问题是靶昆虫会产生抗药性。据认为，90％使用的杀虫剂仍然是以传统的神经毒素杀虫剂为基础的。因此，迫切需要研制出替代的、低残留的、对于抗现有杀虫剂的昆虫有效的杀虫剂。
称为增效剂类的药剂可以最大限度地增强特殊杀虫剂的效用。增效剂自身可以有，也可以不具有杀虫作用。Blood和Studdert(1988)将增效剂定义为对另一种化学药剂起作用或有增强作用的化学药剂。例如，胡椒基丁醚是合成拟除虫菊酯的增效剂。与一种特定的杀虫剂联用时有效的增效剂，在与其他种类杀虫剂联用时可能没有效果。虽然昆虫也可能对增效剂产生抗性，但增效剂仍可被用来解决昆虫抗药的难题。增效剂在杀虫剂配方中的作用对于获得一个商业上可行的结果以及对杀虫剂抗性的管理都是非常重要的。寻找有效的增效联用，如同寻找有效的杀虫剂本身一样迫切需要(Forrester等，1993)。
近来，人们把注意力集中到昆虫的肽酶上，该酶的抑制为昆虫的控制提供了可能的途径。肽酶是普遍存在的裂解蛋白质和肽类的酶，有助于肠和细胞中的消化作用。它们与昆虫的胚胎发育、蜕皮和化蛹时的组织重排有关，也与防御入侵的有机体和蛋白质调节作用有关。
肽酶是种类繁多的一类酶。目前根据下列标准分类：
(1)催化的反应
(2)催化位点的化学性质以及
(3)由化学结构所揭示的进化关系。(Barrett，1994)
在酶命名法(1992)中，国际生物化学和分子生物学会(IUBMC)以酶分类(EC)的各类别划分肽酶。这些类别是：EC 3.4.11-3.4.19为外肽酶(这些酶只在接近于肽链末端处起作用)，EC 3.4.21-3.4.99为优先作用于肽链内部的酶。EC 3.4.99是一族催化机理尚未确认或非特征性的酶类。
综述肽酶种类及其与昆虫生物化学的关系如下：1、丝氨酸肽酶类
这一族酶类有丝氨酸羧肽酶EC 3.4.16和丝氨酸肽链内切酶EC 3.4.21。
丝氨酸肽酶的典型特征在于其活性位点有一个起催化作用的丝氨酸以及这类酶对酶抑制剂3，4-dichloroisocoumarin(3，4-DCI)敏感。哺乳类丝氨酸肽酶起作用的适宜pH范围为2-8，不过，昆虫的丝氨酸肽酶普遍适于碱性环境。(一些鳞翅目幼虫的丝氨酸肽酶的适宜pH范围为pH9-pH＞11)。
昆虫体内丝氨酸肽酶的活性也常常以酶和合成的底物的反应来定义。三个普通类型的丝氨酸肽酶(类胰蛋白酶、类凝乳酶和类弹性蛋白酶)就可以按这种方式定义。类胰蛋白酶的丝氨酸肽酶可与下列合成底物起反应：P-甲苯磺酰基-L-精氨酰甲基酯[p-tosyl-l-arginine methylester(TAME)]，α-N-苯甲酰基-L-精氨酰乙酯[α-N-benzoyl-L-arginine ethyl ester(BAEE)]，α-N-苯甲酰基-DL-精氨酰-P-硝基苯[α-N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide(BAPNA)]和苯甲酰基-DL-精氨酰萘胺[benzoyl-DL-arginine naphthylamine(BANA)]。
类凝乳酶可根据其与以下物质的反应来确定：
N-乙酰基-L-苯丙氨酰乙酯(N-acetyl-L-phenylalanineester)(APNE)
N-乙酰基-L-酪氨酰乙基乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethylester)(ATEE)
N-苯甲酰基-L-酪氨酰乙基乙酯(N-benzoyl-L-tyrosine ethylester)(BTEE)
N-苯甲酰基-L-酪氨酰-p-硝基苯(N-benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilide)(BTPNA)
L-戊二酰基-L-苯丙氨酰-p-硝基苯(L-glutaryl-L-phenylalanine-p-nitroanilide)(GPPNA)
N-琥珀酰-L-苯丙氨酰-p-硝基苯(N-succinyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide)(SPAPNA)
L-戊二酰基-L-苯丙氨酰萘胺(L-glutaryl-L-phenylalanine-naphthylanide)(GPNA)
类弹性蛋白酶的丝氨酸肽酶抑制剂可以据其和合成底物，如N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮氨酰p-硝基苯(N-succinyl-ala-ala-pro-leu p-nitroanilide)(SAAPLpNA)的反应来确定。
丝氨酸肽酶的活性可以据其与酶抑制剂的反应来说明。丝氨酸肽酶类酶通常被二异丙基-氟磷酸盐(Di-isopropyl-fluro-phosphate)(DipF/DFF)和对苯基甲基磺基氟化物(paraphenyl methyl sulphonyl fluoride)(PMSF)抑制。类胰蛋白酶的肽酶被甲苯磺酰基-L-赖氨酰-氯甲基酮(tosyl-L-lysine chloromethyl ketone)(TLCK)抑制。类胰蛋白酶的肽酶被甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯甲基酮(tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)(TPCK)抑制。类弹性蛋白酶的肽酶被水蛀(蛋白酶)抑制剂C(Eglin-C)抑制。
已发现一些天然形成的蛋白质能抑制丝氨酸肽酶的活性。这些物质包括结晶的大豆胰蛋白酶抑制剂Kunitz(SBTI)和大豆胰蛋白酶抑制剂包曼-毕尔克抑制剂Bowman-Birk(BBTI)。其他不同的豆科作物种子含有占全部蛋白质的1-4％的胰蛋白酶抑制剂，如鹰嘴豆胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂(CT)、菜豆胰蛋白酶抑制剂(LBTI)和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)(MacIntosh等，1990)。动物来源的丝氨酸肽酶抑制剂有牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI，抑肽酶Aprotinin)，来源于卵的卵粘蛋白和血中的α-l-抗胰蛋白酶。
丝氨酸肽酶具碱性最适pH条件，被认为是昆虫消化液中首要的可溶性酶。如：天蛾科(sphingidae)(Miller等，1974)、夜蛾科(noctuidae)(Ahmed等，1976，1980；Ishaaya等，1971；Prichet等，1981；Teo等，1990；Broadway和Duffy，1986)、蚕蛾科(bombycidae)(Sasaki和Suzuki，1982；Euguchi和Iwanito，1976；Euguchi和Kuriyama 1985)、粉蝶科(pieridae)(Lecadet和Dedonder，1966；Broadway等，1989)，螟蛾科(pyralidae)(larocque和Houseman，1990；Houseman等，1989；Mohammed和Altias，1987)和双翅目(diptera)(Bowles等，1990)。Christeller等(1992)指出丝氨酸肽酶与十二种植食性的鳞翅目昆虫的酪蛋白消化活性有关。在这篇文献中，Christeller指出未发现其他肽酶显示重要的消化活性。他还发现丝氨酸肽酶在消化角朊的鳞翅目昆虫中起主要作用(Christeller等，1994；Prowning和Irzykiewicz，1962；ward 1975a，b)。而且，它们在一些鞘翅目昆虫(McGhie等，1995，Dymock等，1992)、一些直翅目昆虫(Sakal等，1989；Christeller等，1990)、一些异翅目昆虫(Cohen，1993)和一些双翅目昆虫(Bowles等，1990)的消化活动中起着重要作用。
种内和种间的消化性的丝氨酸肽酶在数目和催化特性上都有相当大的不同(Applebaum，1985)。在一些实例中，认为昆虫食物中丝氨酸肽酶的抑制剂会引起消化抑制、以及摄食障碍(Dymock等，1992)。
类胰蛋白酶的丝氨酸肽酶被认为是涉及蜕皮关键的生长调节区。它们所显示的作用包括蜕皮过程控制、将几丁质纤维暴露给几丁质酶以及表皮物质的循环(Samuels和Paterson，1991)。
由于其显著的代谢作用、普遍的自然发生以及动植物体内很多天然抑制剂的出现，丝氨酸肽酶作为昆虫控制剂受到了极大关注。值得注意的是，将丝氨酸肽酶用于昆虫防治的内容几乎都是在转基因植物方面。2、半胱氨酸肽酶
这一类酶包括半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)和半胱氨酸肽链内切酶(EC3.4.22)。
这些酶的特征是在活性位点具有催化活性的半胱氨酸残基，以及对某些抑制剂敏感。半胱氨酸肽酶特征性地在还原条件下被激活(加入半胱氨酸、二硫苏糖醇或其他还原剂)。半胱氨酸肽酶是昆虫中肠中常见的可溶性酶。虽然在昆虫体内半胱氨酸肽酶适宜的pH值是中性或弱酸性，但哺乳动物的半胱氨酸肽酶则一般在低pH值条件下起作用(Wolfson和Murdock，1987)。
半胱氨酸肽酶的活性可以根据它和合成的底物n-α-苯甲酰-L-精氨酰-p-硝基苯胺(n-α-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide)(BAPNA)或苯甲酰-氧-羰基-苯丙氨酰-精氨酰-7-(4甲基)香豆酰胺(benzoyloxy carbonyl-phe-arg-7-(4 methyl)coumarylamide)(Z-Phe-Arg-MCA)的反应为例来说明。丝氨酸肽酶，特别是E-64的活性也可以据其和酶抑制剂，如碘乙酰胺、碘乙酸、重金属、p-对氯[高]汞苯甲酸、胱氨酸氰化物、N-乙基-顺丁烯二酰亚胺的反应来说明。E-64是由日本曲霉(Aspergillus japonicus)的一个菌株中得到的一个小肽(L-反-环氧-琥珀酰-亮氨酰胺-4-胍乙基-丁烷)，已在微生物(E-64)、植物(稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂I和II及马铃薯多半胱氨酸蛋白酶抑制剂PCM)和动物(母鸡卵细胞半胱氨酸蛋白酶抑制剂HEC)中鉴定了天然产生的半胱氨酸肽酶。抗痛素(Antipain)是另一种熟知的半胱氨酸肽酶抑制剂。
半胱氨酸肽酶作为肠道的可溶性消化酶类在一些昆虫中起着主要作用，显著的如鞘翅目(coleopteran)昆虫(Orr等，1994；Thie和Houseman，1990；Liang等，1991)。利用半胱氨酸肽酶的抑制剂控制昆虫，已经在转基因植物中进行了大量探索(Orr等，1994；Wolfson和Murdock，1987)。3、天冬氨酸肽酶(EC 3.4.23)
这类酶典型地在活性位点具2个天冬氨酸残基。大多数天冬氨酸肽酶在低pH值时活性最强。这类酶的合成底物包括N-苄氧羰基谷氨酰-L-酪氨酸和N-乙酰-L-phenanyl、二碘酪氨酸(diiodotyrosine)。天冬氨酸肽酶的特征性抑制剂包括胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)和二苯基重氮甲烷(diphenyl diazomethane)(McDonald，1985)。胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)是一种来源于微生物的天然产生的抑制剂。
Applebaum(1985)曾指出一些天冬氨酸肽酶对双翅目的昆虫(dipteran)的重要性。Wolfson和Murdock(1987)曾证实通过胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)对一种鞘翅目昆虫马铃薯叶甲幼虫造成的一些生长抑制，但是，更强的生长抑制是针对半胱氨酸肽酶造成的。
通过广泛查寻有关肽酶的文献结果表明，将昆虫天冬氨酸肽酶用于昆虫控制，不论是以植物的转基因改造还是局部的应用，都只进行了有限的研究。Christeller等(1992)发现，天冬氨酸肽酶的活性显然在鳞翅目昆虫的肠道物中不明显。4、金属肽酶
公认这类酶典型地在活性位点含有催化活性的金属离子(一般为锌离子)，而且对螯合剂敏感。金属肽酶的类型包括一些肽链内切酶(酶切肽链中间的酶)和肽链端解酶(由肽链末端酶切氨基酸的酶)。肽链端解酶可以进一步划分为羧肽酶类(这类酶从C末端酶切氨基酸)或氨肽酶类(这类酶从N末端酶切氨基酸)。金属肽链内切酶(EC 3.4.22)
这类酶除了在以角蛋白为食的鳞翅目昆虫消化羊毛时可能起作用外，还未曾涉及昆虫的生物化学(Prowning和Irykiewicz，1962；Ward，1975 a和b；Christeller等，1990，1994)。金属羧肽酶(EC 3.4.17)
金属羧肽酶的活性需要一个二价阳离子(常为Zn2+)。它们以游离态存在或处于膜被结构中，高的pH(8-10)有利于其活性。羧肽酶的合成底物包括马尿酰-DL-苯基-乳酸(hippuryl-DL-phenyl-lactic acid)和马尿酰-L-精氨酸(hippuryl-L-arginine)，它们分别是羧肽酶A和B的底物。羧肽酶A类似的酶在昆虫体内显得更普遍些，已在直翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目昆虫中发现。
金属羧肽酶的合成抑制剂包括1，10-邻二氮杂菲、乙二胺四乙酸(EDTA)，β-羟基喹啉和磷酰胺(phosphoramidon)。金属羧肽酶的天然产生的抑制剂是来源于土豆的羧肽酶抑制剂(PCPI)。
已确认在鳞翅目幼虫的中肠物质中有游离的或膜被形式的羧肽酶(Ferreira等，1994；Christeller，1990)。Chriteller等(1992)将这类酶描述为蛋白质消化体系中所需的成份。在本申请的优先权日之前，这类酶还未被公认是植物转基因改造的目标，更不用说用作局部控制剂的成份。氨肽酶(EC 3.4.11-3.4.13)
氨肽酶从肽链的N-末端水解氨基酸，一般根据其对金属(如Zn2+或Mg2+)的依赖性来分类。研究最彻底的氨肽酶既以膜被也以可溶形式存在于哺乳类的消化道中。常以标示其适宜pH酸性(A)、碱性(B)或中性(N)的下标字母，或者以其膜被(M)状况，或者以从肽链底物切下来的氨基酸的数目和类型来命名氨肽酶。这些名称并非专有；因此亮氨酸氨肽酶M或N是一种优先，但不是专门由肽链切去亮氨酸的酶，它由膜包被，在中性pH时活性最佳。氨肽酶优先水解亮氨酰、精氨酰、甲硫氨酰、天冬氨酰、丙氨酰、谷氨酰、脯氨酰、缬氨酰和半胱氨酰残基；但是底物特异性常常较广，而且依赖于肽链中的其他残基(Taylor，1993 a和b)。虽然已知一些细菌来源的酶的活性不需要金属离子，大多数氨肽酶是金属肽酶(Taylor，1993a和b)。很显然，氨肽酶没有天然抑制剂。
昆虫氨肽酶最适pH通常为碱性，一般会被贝他定(bestatin)(Taylor，1993)和邻二氮杂菲(Barrett，1994)抑制。
如上所述，氨肽酶的底物特异性广泛，但典型的底物包括亮氨酸-戊糖核酸(leu-pNA)、精氨酸-戊糖核酸、甲硫氨酸-戊糖核酸和脯氨酸-戊糖核酸。
金属氨肽酶会被螯合剂(如EDTA)抑制，这些螯合剂或者从肽酶移去金属离子，或者与酶形成失活的络合物(Terra & Ferriera，1994)。某一特定螯合剂的作用会随氨肽酶的类型和螯合剂自身的结构而改变。
氨肽酶还被认为是昆虫的有消化作用的肽补体，并认为它们涉及蛋白质消化的最后阶段(Terra & Ferriera，1994)。Christellar等(1990，1992)曾断言这些肽链端解酶(包括氨肽酶)对于昆虫控制是没什么用的，因为这些酶在消化摄入的蛋白质中的作用与丝氨酶和半胱氨酸肽酶相比很小。
还未见将昆虫幼虫暴露给特异的亮氨酸氨肽酶(LAP)抑制剂后，出现生长迟滞的报道。Christellar等(1990)曾以粗制的黑蟋蟀的肠道提取物证明，虽然肽链端解酶的含量，尤其是LAP的量在这种昆虫中是重要的，但肽链端解酶消化的蛋白质仅占16-20％。在Christellar等(1990)的研究中，还发现在2种有效的丝氨酸肽酶的抑制剂存在时，肽链端解酶对蛋白质的消化会被大大减弱。这是由于缺乏作为肽链端解酶底物的寡肽末端。这些发现进一步表明了氨肽酶在昆虫控制中的作用很小。
上述发现有力地说明，肽链端解酶抑制剂(主要是氨肽酶抑制剂)不能作为昆虫控制剂，而且特别有力地说明了不能将丝氨酸肽酶抑制剂和氨肽酶抑制剂联用作为昆虫控制剂。
除了消化功能，氨肽酶还被证实在鳞翅目昆虫Manduca sexta的蜕皮液中有活性(Jungries，1979)。但也又一次表明了氨肽酶的功能似乎是次于丝氨酸(类胰蛋白酶)肽酶的功能。尚未有在昆虫发育中重要的氨肽酶或金属肽酶的天然抑制剂对延缓蜕皮有效的报道。也还没有将这些抑制剂用于产生抗虫的转基因植物。
理论上，将肽酶抑制剂用于控制对化学杀虫剂有抗药性的昆虫似乎有很大潜力。首先，肽酶抑制作用的机理不同于有机磷类和合成的拟除虫菊酯的作用机理。其次，肽酶的活性位点的氨基酸顺序似乎是高度保守的(Taylor，1993)，因而发生突变而无随之而来的活性丧失的可能性小。最后，如果发生昆虫对一种特定的肽酶抑制剂产生抗性，那么这种抗性不会继续到其他的肽酶介导的代谢活动中去。
但是，将肽酶抑制剂用于昆虫控制有一些严重的问题。可能需要的频繁使用，会使一种产品没有好效益。而且，肽酶抑制剂虽然会限制幼虫的生长，但当使用量增加时，可能在剂量-反应曲线中达到一个停滞期。以肽或蛋白质为主剂的肽酶抑制剂虽然在环境中可能不会残留，但可能难以保存太长的时期，而且在硬水中分装时可能失效。需要说明一下可能涉及到的一种特定酶抑制剂来源的细微问题。例如，已注意到的异常反应涉及Costelytrazealandica的生长会受到大豆、土豆和豇豆的胰蛋白酶抑制剂的抑制，而被鹰嘴豆的胰蛋酶抑制剂刺激(Dymock等1992)。
大量的研究工作集中在昆虫蛋白质代谢的生物化学研究，主要是利用昆虫组织、肠提物、体外半纯化或纯化的酶研究消化代谢。
很多工作是为植物转基因改造而选择酶抑制剂，通过研究消化酶与蛋白质或肽抑制剂的关系而进行的。(Applebaum，1985；Christeller等1989，1990，1992；Lenz等1991；Teo等，1990；Pritchett等1981，Santos和Terra，1984；Dow 1986；Sakal等，1984，1989)。
相对较少的研究证明了肽酶抑制剂对昆虫生长和/或繁殖直接的不利影响。已证明丝氨酸肽酶和半胱氨酸肽酶抑制剂会减少各种昆虫，包括四纹豆象(Callosobruchus maculatus)、Leptinotarsa decemlineat、Heliothis spp、沙草夜蛾(Spodoptera exiqua)、Costelytra zealandica、Teleogryllus commodusDiabrotica sp、Manduca sexta、赤拟谷盗(red flour bettle)和大豆象(beanweevil)的幼虫生长量或存活率(Gatehouse和Boulter 1983；Shukle和Murdock，1983；Shade等，1986；Wolfson和Murdock，1987；Broadway和Duffy 1986，Hilder等1987；Dymock等，1992；Orr等1994；Burgess等，1994；Hines等1990)。
总的来说，昆虫生长的抑制是通过使用肠道主要消化酶的抑制剂而达到的。Christeller等(1992)描述了一种以这些酶为基础，选择合适的杀昆虫的抑制剂的方法(1992)。
上述研究中似乎没有直接以生产局部施用的昆虫控制剂，通过干扰蛋白质代谢为目标的。不过，在Czapla的国际专利申请No.WO94/16565中，一个次要的权利要求引证了局部使用抑蛋白酶肽(aprotinin)或另一种与抑蛋白酶肽有90％同源性的丝氨酸肽酶，用于控制欧洲玉蜀黍钻蛀虫(ECB)和南方玉蜀黍根蠕虫(SCR)。根据权利要求，抑蛋白酶可以单独或与一种杀虫的植物凝集素联用。Czapla在实验室分析中发现，抑蛋白酶肽在食物中的比例为20mg/ml时杀死了100％的ECB的新生幼虫，并能杀死60％的SCR的新生幼虫；而通过局部应用很难达到这样高的摄入率，而且其处理费用无法与化学杀虫剂竞争。Czapla发现丝氨酸肽酶抑制剂SBTI(Kunitz和Bowman-Birk)和半胱氨酸肽酶抑制剂抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)不及抑蛋白酶肽(aprotinin)有效。
Deloach和Spates(1980)曾对吸血昆虫直接喂饲SBTI进行了研究。他们发现在SBTI被牛红细胞包被并用作螫蝇的诱饵时，死亡率增高而且卵孵化受抑制。已知在血液中有几种天然的肽酶抑制剂(主要为丝氨酸抑制剂)。但是，这些抑制剂在保护动物不受昆虫侵害方面功效有限(Sandeman等，1990)。
Wolfson和Murdock(1987)注意到虽然有很多有关植物中的肽酶抑制剂的存在和分布的记载，并且可以推测这些抑制剂是针对昆虫消化的肽酶的，但与此同时，却几乎没有支持其在抑制昆虫的生长和发育方面有效作用的直接证据。他们证实了在马铃薯叶片上用50μg/ml阈水平的E-64(一种半胱氨酸肽酶抑制剂)喂饲马铃薯叶甲虫时，幼虫的生长会减慢。但是在一个高得多的施用水平时(1000μg/ml)，会发现有一个死亡率为74-85％的迟滞时期，这一死亡率对于实际应用是不够的。SBTI类(Kunitz和Bowman-Birk)用作生长延缓剂是无效的，且昆虫对pepstatin的反应小。
Dymock等(1992)的一篇研究论文曾就肽酶(peptidase)抑制剂对鞘翅目昆虫幼虫(新西兰天然草场蛴螬)的生长抑制进行了探讨。由于蛴螬以草根为食，这一研究集中在对重要的牧草种类进行遗传改造上。生物检定表明了使用肽酶抑制剂对生长具抑制作用。人们已注意到对特殊的抑制剂的不正常反应(被SBTI、POTI、POTII、CpTI抑制，被LBTI刺激)。尽管事实是正常情况下鞘翅目肠肽酶在半胱氨酸肽酶中占优势，Christeller等(1989)在这之前证明了上述蛴螬中胰蛋白酶是主要的肠肽酶。在局部应用中，要达到致死效果时，通常肽酶抑制剂的使用量太高而在成本上没有实益。
通过抑制金属肽酶(包括氨肽酶或LAP)起作用的组合物，还尚未进行商业规模生产以控制昆虫。实际上，现有技术说明了以肽为主剂的肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂不能用于昆虫控制。因为：
(a)还未验证上述类型中有适合于植物遗传改造的有效抑制剂。
(b)与昆虫肠道中占优势的半胱氨酸肽酶和/或丝氨酸肽酶相比，这类酶抑制剂的作用很小。
Shenvi(1993)曾讨论将α-氨基的硼酸衍生物用作哺乳类氨肽酶的有效抑制剂。Shenvi注意到在合成α-氨基硼酸衍生物中，某些中间产物有杀虫性能；但这些中间产物没有氨基基团，被认为既不作为氨肽酶抑制剂，也不作为任何类型的肽酶抑制剂起作用。
Samuels和Paterson(1995)，以及Ferreira和Terra(1986)认为六齿的(hexadentate)金属螯合剂EDTA是来自蜕皮液和消化膜的氨肽酶抑制剂。人们对EDTA的杀虫效果并无公认，但Tomalia和Wilson(1985，1986)认为金属螯合剂有杀虫作用，但他们未给出任何证据。可以预计，将硬水用于喷洒施药时，或有矿质或有要处理的金属或土壤污染时，金属螯合剂对昆虫控制的作用会受到不利影响。
现在我们惊奇地发现，这个含有氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂，并还含有非紧密螯合的金属肽酶抑制剂的组合物，能阻止昆虫卵的孵化和/或昆虫幼虫的发育。本领域的技术人员会认识到，正如本文所定义的那样，绝大多数这种氨肽酶抑制剂实际上都是非紧密螯合的。
很容易理解，通过各种不同途径可将此发明应用于昆虫控制。本发明的方法可以是导致实际灭杀昆虫，或者干扰昆虫的生长发育而延缓或阻止成熟。由于很多经济上重要的昆虫会由于其幼虫的摄食活动而造成损害，因此，阻止昆虫卵的孵化显得尤其必要。
人们也会理解，由于昆虫纲的成员中个体生化能力的差别很大，不同的种对特定的抑制剂和/或抑制剂联用的反应也会不同。因而，有可能本发明范围内的一些组合物抗某些昆虫的效果不好或者甚至无效，但可以高效地抗其他昆虫。对于特殊的昆虫来说，反应的差异可见于亚种水平或生活史中不同阶段，甚至是随所摄入食物不同而异。本领域的熟练技术人员能够通过应用实验室和田间实验的渐次逼近法将相关的抑制剂同靶昆虫对应起来。
显然，对本领域熟练技术人员来说，这一发明可以采用各种不同的方式应用，包括但不限于：
(a)直接应用于易受昆虫侵害的植物或动物来控制昆虫侵扰；
(b)通过将本发明的药剂施于昆虫栖息地或繁殖地来减少昆虫数目；
(c)通过预防或减少由昆虫传播的动植物感染的严重性来控制昆虫；和
(d)通过预防或减少由于昆虫侵扰而导致的植物或动物感染的严重性来控制昆虫。
为理解本说明书，“肽酶抑制剂”一词应该理解为任何可以抑制任意肽酶的物质。
实际使用时，可以按如下步骤确认一种肽酶抑制剂。
1、选择典型的有活性的肽酶，这种酶可以是纯化了的或是含该活性酶的组合物。
2、对每一有代表性肽酶选择酶活性测定法，即为酶选择合适的底物和反应条件，使反应在适当时间内达到合适的可定量的反应终点。
3、如果在任意上述酶活性分析中发现有50％或更大的反应抑制，就认为测试物为肽酶抑制剂。
尤其是金属肽酶抑制剂或氨肽酶抑制剂可以采用这种方法来确认。
“非牢固螯合的肽酶抑制剂”一词应理解为在竞争性结合的评定中，螯合Zn2+不及EDTA牢固的肽酶抑制剂。反应混合物中EDTA和抑制剂应该浓度相同，如可以方便地定为0.1mM。本领域的熟练技术人员能够选择合适的反应条件和方法来测定Zn2+的分布。(如利用多核核磁共振(NMR)、紫外分光镜、电量测量技术和软性离子团分光镜)。
本发明概述
一方面，本发明包括用于控制昆虫的组合物，所述组合物含有一种氨肽酶抑制剂或一种金属肽酶抑制剂，还含有一种非牢固螯合的肽酶抑制剂。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以含有一个氨基基团或其衍生的基团，或者一个或多个氨基酸部分或其衍生物。优选该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸或半胱氨酸的部分结构或其衍生物。更优选的氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个亮氨酸部分或其衍生物。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以与氨肽酶或金属肽酶活性位点的金属离子起反应。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以含有一种螯合剂，优选二齿、三齿、四齿或六齿螯合剂。优选这种螯合剂为有螯合作用的氨基酸羧酸部分和其盐类，更优选为乙二胺四乙酸或次氮基三乙酸或其有螯合作用的盐或衍生物。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以含有水溶性的过渡金属，包括铜、钴、锌、钒、镁、锰和铁的离子、配合物或衍生物。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以含有硼、磷酰基或膦酰基部分。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以不可逆地结合到氨肽酶或金属肽酶上去。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以含有不抑制胰蛋白酶或需钙蛋白酶(calpain)的选择性抑制物，而且优选不抑制其他丝氨酸或半胱氨酸肽酶。
氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂可以抑制下列酶中的一种：亮氨酸氨肽酶、A、B、N和M型氨肽酶、精氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、D-氨基酸氨肽酶、肽键-二肽酶、Zn-氨肽酶、N-甲酰甲硫氨酸氨肽酶、二肽键-氨肽酶、羧肽酶A和B、三肽键-肽酶、二肽键肽酶和肽键-三肽酶。
优选氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂能抑制亮氨酸氨肽酶，更优选抑制昆虫亮氨酸氨肽酶。
非牢固螯合的肽酶抑制剂可以含有丝氨酸肽酶抑制剂，半胱氨酸肽酶抑制剂，天冬氨酸肽酶抑制剂或氨肽酶抑制剂。本发明中适用的抑制剂包括但不限于：
·胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂，如pefabloc；
·来源于豆科作物、蔬菜、水果或谷物的丝氨酸或半胱氨酸肽酶抑制剂；
·抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatins)和E-64；
·马铃薯或其他来源的羧肽酶抑制剂；
·水蛀(蛋白酶)抑制剂C(Eglin C)；
·L-巯基亮氨酸(L-Leucinethiol)。
胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂包括但不限于Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂、牛胰蛋白酶抑制剂、鸡卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂、笋瓜胰蛋白酶抑制剂、POT-I和POT-II胰蛋白酶抑制剂、α-l-抗胰蛋白酶剂、慈菇胰蛋白酶抑制剂、红细胞胰蛋白酶抑制剂和人inter-alpha胰蛋白酶抑制剂。
豆科作物、蔬菜、水果或谷类的丝氨酸肽酶或半胱氨酸肽酶包括但不限于来源于红豆、豇豆、wing bean、绿豆、欧白芥属、南瓜、葛缕子、cajunpea、棉花、玉蜀黍、小麦、高粱属、油菜籽、粟(millet)、大麦和西葫芦的肽酶抑制剂。
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatins)包括但不限于来源于稻的稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂I和II(oryzacystatin I和II)、马铃薯多抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(multicystatin)和用胰蛋白酶消化的亚单元以及鸡卵细胞抑半胱氨酸蛋白酶蛋白。
本文每一例中都以普通名称提及肽酶抑制剂，这些提法应包括这类抑制剂的类似物，即与普遍确认的物质有相似的结构和/或抑制特点(与靶酶的活性位点起反应)的抑制剂。
合适的类似物可以是被命名的抑制剂的部分、其同源物，或者与被命名的物质有至少70％同源性、优选至少80％同源性和更优选至少90％同源性的物质。
本发明的组合物也可以任意含有一种或多种添加剂，如分散剂、粘度调节剂、抗冻剂、润湿剂、助溶剂、紫外线吸收剂、染料和载体，这些添加剂都是药学、兽医学、农业或园艺学应用中可接受的。
在一个实施方案中，本发明的组合物含有选自于L-巯基亮氨酸(L-Leucinethiol)、放线酰胺素(actinonin)、贝他定(bestatin)、1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline)和EDTA的氨肽酶抑制剂，以及选自SBTI、pefabloc和抗痛素的非牢固螯合的肽酶抑制剂。
优选氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂或非牢固螯合的肽酶抑制剂含有肽、多肽和/或蛋白质。
另一方面，本发明提供了包括根据本发明，将所述昆虫暴露给某种组合物以控制昆虫的方法。
优选通过将所述昆虫卵或幼虫暴露给本发明的混合物，以阻止昆虫卵孵化和/或阻止昆虫幼虫发育，从而来控制昆虫。
优选这种昆虫是下列靶昆虫中某一种：
鳞翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、啮虫目(Psocoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、网翅目(Dictyoptera)等翅目(Isoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、同翅目(Homoptera)、双翅目(Diptera)、废翅目(Anaplura)、Malophaga、和蚤目(Siphonaptera)。这种昆虫更优选为下列昆虫：蛆蝇、芽虫、跳蚤、黑蟋蟀、蟑螂、苹浅褐卷叶蛾和谷类与面粉储藏昆虫。
根据本发明的方法，靶昆虫可以以任何合适的方式暴露给酶抑制剂。本领域熟练技术人员可以体会到，这些方式可以根据抑制剂是施于植物还是动物，靶昆虫的特性以及动、植物的特性而有很多变化。将酶抑制剂直接施于被昆虫侵扰的植物或动物的合适方法，可能与将酶抑制剂施于昆虫栖息地或繁殖地的方法大不相同。
将酶抑制剂施于动物的适宜方法包括但不限于直接局部施用，如浸蘸或喷洒，或者内部施用，如口灌、植入法、适于在瘤胃中停留的大团缓释药剂或装置以及昆虫诱饵和药片等。将本发明的抑制剂施于人时，适于局部施用的方式包括但不限于喷洒、烟雾剂、乳剂和洗剂，适于内部施药的方法包括但不限于片剂、胶囊或液体配方。某些情况下，对人或动物来说，采用注射的非肠道途径可能是最合适的治疗方式。
将酶抑制剂施于植物，合适的方式包括但不限于喷剂、粉剂、丸剂或烟雾剂。本发明的方法也包括同时或连续施用2种或更多种的金属肽酶抑制剂，或使用一种或多种金属肽酶抑制剂或氨肽酶抑制剂，结合一种或多种其他类型酶的抑制剂、或一种或多种其他昆虫生理过程的抑制剂、或一种或多种无论采用外部、内部还是遗传改造的方法施用的杀昆虫剂。
对于本发明有用的一些抑制剂在性质上属于肽、多肽或蛋白质。这种情况下，氨肽酶或金属肽酶的抑制剂和非牢固螯合的肽酶抑制剂中的任一种或两者，都可以在靶植物或非人类的动物中通过转基团表达获得。当在这两种抑制剂中只有一种通过转基团表达时，另一种可以采用局部施用的方法。
优选转基因生物为易被昆虫侵扰的植物或非人类的动物，但也可以是居留在易受侵扰的动物或植物体上的生物。后一情况下，优选这种生物与植物或动物共生或共栖。适合居留的生物包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus spp.)，或假单胞菌(Pseudomonas spp.)，或分枝杆菌(Mycobacterium spp.)。在一个优选方案中，这些生物为苏云金芽孢杆(Bacillus thuringiensis)或分枝杆菌(Mycobacterium phlei)，产生转基因生物的方法是本领域中熟知的，表达苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)晶体蛋白的植物能抵抗昆虫侵扰。
在本发明的优选但没有限制性的实施方案中：
(a)以本发明的方法处理的动物选自人、绵羊、牛、马、猪、家禽、狗和猫。
(b)以本发明的方法处理的植物选自棉花、油料作物、观赏植物、花卉、果树、谷类作物、藤本植物、块茎植物、牧草和蔬菜。
(c)应用本发明在园艺和大田中控制的昆虫为鳞翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、等翅目(Isoptera)、缨翅目(Thysanoptera)或同翅目(Homoptera)。而所控制的引起动物感染的昆虫为：双翅目(Diptera)、Anaplura、Malophaga或蚤目(Siphonaptera)，或者为居家或工业害虫的等翅目(Isoptera)、网翅目(Dictyoptera)和膜翅目(Hymenoptorn)。
(d)转基因植物选自于棉花、油料种子作物，观赏植物、花卉、果树、谷类作物、藤本作物、块茎作物、牧草和蔬菜，和
(e)栖息于动植物体内或体表的转基因生物为芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)或分枝杆菌(Mycobacteria spp.)。
转基因植物或生物可以按本领域熟练技术人员所知的技术来制备。例如，一种非人类的动物、植物或其它生物可以按下列步骤进行改造：
·制备一种合适的载体，它含有编码抑制氨肽酶或“非牢固螯合的”肽酶的肽制剂的核苷酸序列，还含有一个启动子，其核苷酸序列能被含有此载体的宿主表达。
·将载体整合到宿主体内，
·保持含有该载体的宿主于合适条件，使该核苷酸序列转录和翻译为所述肽制剂。本发明的详细描述
现仅以参考下述非限制性的实施例对本发明进行详细描述。
下述实例说明了应用本发明达到的昆虫生长抑制或杀灭作用。不过，其他方法和应用也可以采用。丝氨酸和半胱氨酸肽酶抑制剂单独作用(不在本发明的范围内)在此用来说明不同种对抑制剂反应的差异，或者用以说明应用本发明产生的加性作用或协同增效作用。
实施例1  单独的抑制剂对绵羊丽蝇(Lucilia cuprina；双翅目Diptera)幼虫的生长和存活的影响方法
幼虫从表面以0.5％次氯酸钠消毒的卵孵化而来，并于27℃保温过夜。收集一龄幼虫，并置于1ml标记好的含或不含抑制剂的经高压灭菌的培养基上。这种培养基是在无菌小瓶中，含有溶于蒸馏水的2％琼脂、10％酪蛋白、2％酵母和0.5％葡萄糖。根据所要培养的时间，将5至50条幼虫置于每个小瓶中，然后盖上装有塑料细网的盖子。这种盖子能使空气自由交换进出小瓶。
然后将瓶子放入一个大的密封的无菌容器中，隔绝其与周围环境接触。该容器有导入管和导出管，它们分别与无菌的温暖湿润空气和一个真空泵相连。将这些装置，包括培养瓶，置于35℃下24-72小时，使幼虫生长到所要需的成熟阶段。
在无菌的空气流通的罩内建立培养，并在无菌的环境中保温以减少被细菌感染的可能性。细菌感染可能有助于或阻碍幼虫生长，从而使结果无效。经所需时间的培养，取出培养瓶并冰冻杀死幼虫。然后将它们一起或单独干燥、称重。
将对照培养(除无抑制剂外，在同样的环境条件和食物条件下同时培养幼虫)的昆虫幼虫的体重，与有抑制剂条件下培养的幼虫的体重相比较，并根据下式计算抑制百分比(I)： I = c - a c × 100
其中：
a＝有抑制剂存在时的幼虫体重；和
c＝对照幼虫的体重
在这一培养体系中对大量的抑制剂进行了实验，挑选一部分示于表1.1；抑制剂对一龄幼虫的生长和存活的效果示于表1.2。
表1.1对丽蝇幼虫进行离体试验的肽抑制剂和相关化合物
    抑制剂 作用的肽酶类型        特殊条件
大豆胰蛋白酶抑制剂 丝氨酸
AEBSF(4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟，盐酸化物)(＝Pefabloc) 丝氨酸
APMSF(p-脒基)甲磺酰氟 丝氨酸和半胱氨酸 可溶于二甲亚砜
E64(L-转环氧琥珀酰亮氨酰脒(4-胍基) 半胱氨酸
亮抑蛋白酶肽(锕-亮氨酰-亮氨酰-精氨酸1/2硫酸水) 丝氨酸和半胱氨酸
TPCK(甲苯磺酰基-苯丙氨酸-氯甲基甲苯磺酰基-氯甲基酮) 丝氨酸(类Chymotrypsin) 可溶于甲醇
TLCK(甲苯磺酰基-亮氨酸-氯甲基甲苯磺酰基-氯甲基酮) 丝氨酸(类胰蛋白酶类酶)
需钙蛋白酶抑制剂I(N-乙酰-亮氨酰-Ley-正亮氨酸) 钙激半胱氨酸肽酶 可溶于甲醇
L-巯基亮氨酸(乙-氨基-4-甲基-1-戊硫醇) 氨肽酶
贝他定((2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基-丁酰)-亮氨酸-羟基) 氨肽酶 可溶
Leuhistin((2R-3R)-3-氨基-2-羟基-2(III-咪唑-4-甲基)5-异庚酸 氨肽酶 可溶于甲醇
氨肽酶抑制剂((2S，3R)-3-氨基-2-羟基-5-甲基-己基)-缬氨酰-缬氨酰-天冬氨酸-羟基 氨肽酶 可溶于甲醇
Diprotin A(H-异亮氨酰-脯氨酰-异亮氨酸-羟基) 二肽氨肽酶
Ebelactone B(3，11-二羟基-2，4，6，8，10，12-六甲基-9-氧代-6-四癸烯酸1，3-内酯) N-甲酰甲硫氨酸氨肽酶 可溶于甲醇
放线酰氨素(3-((1-((2-(羟甲基)-1-丙基-idinyl)-羰基)2-甲丙基)-(甲氨酰)-辛基异羟肟酸) 氨肽酶 可溶于甲醇
EDTA(乙二胺四乙酸) 金属(肽酶)(一般)
胃蛋白酶抑制剂 天冬氨酸
抗痛素 氨肽酶/金属肽酶 可溶于甲醇
*除非另外说明，酶抑制剂在无菌磷酸盐缓冲液或无菌水中是可溶的。将仅溶于二甲亚砜/水或甲醇/水的酶抑制剂组，与含有同样量的二甲亚砜或甲醇的对照组进行比较。
表1.2各种抑制剂对一龄幼虫生长和存活的作用
抑制剂 所测试的浓度(mM) 生长抑制
    大豆胰蛋白酶种抑制剂     0.17，0.20，0.40，1     0.17mM时抑制76％0.4mM时抑制64％
    Pefabloc     0.5，1，10，25，50     10mM时抑制72％50mM时抑制92％
    APMSF     1，2，5     5mM时抑制43％
    E64     1，2，5     未检测到抑制作用
    EDTA     1，2.5，5，10     5mM时抑制84％10mM时全部杀死
    L-巯基亮氨酸     1，2，5     2mM时抑制47％5mM时全部杀死
    贝他定     1，2.5，5     5mM时抑制63％
    亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)     1，2，5，10     2mM时抑制71％10mM时抑制80％
    TLCK     1，2.5，5，10     5和10mM时全部杀死
    TPCK     1，2，5，10     未检测到抑制作用
    需钙蛋白酶抑制剂I     1，2，5     2mM时抑制71％
    Leuhistin     1，2，5     5mM时抑制65％
    Amastatin     1，2，5     10mM时抑制90％2mM时抑制60％
    Diprotin     1，2，5，10     未检测到抑制作用
    Ebelactone B     1，2，5     2mM时抑制18％
    放线酰氨素(Actinonin)     1，2.5，10     10mM时抑制95％25mM时抑制83％
    胃蛋白酶抑制剂     1，2，10     未检测到抑制作用
    抗痛素(Antipain)     0.3125，0.625，1.25，2.5，5     5mM时为63.22.5mM时为45.5
    1，10-菲咯啉     1，2.5，5     所有幼虫死去
结果表明，作用于类胰蛋白酶的抑制剂在延缓幼虫生长方面有效，或存在TLCK(N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮)时，试验的最高浓度对杀死幼虫有效。E64(一种半胱氨酸肽酶抑制酶)无效；但是，需钙蛋白酶对生长的抑制效果，及亮抑蛋白酶肽和APMS(氨肽酶M)(非半胱氨酸特异的抑制剂)的中间抑制作用表明：半胱氨酸肽酶可能有非常重要的作用。
胃蛋白酶抑制剂对天冬氨酰肽酶抑制无效，这与现有的文献是一致的。
本实验令人惊讶的结果是一些氨肽酶抑制剂对幼虫生长有明显影响。这些结果表明抑制幼虫的氨肽酶是有效的。L-巯基亮氨酸，EDTA(乙二胺四乙酸、1，10-菲咯啉、苯丁抑制素、氨肽酶抑制剂、Leuhistin和放线酰胺素为有效的生长抑制剂。而抑制剂二肽氨肽酶(Diprotin A)和蛋氨酸氨肽酶(Ebalactone)无效。
实施例2  肽酶抑制剂联用对绵羊丽蝇(L.cuprina；Diptera)幼虫的生长和存活的影响
(a)结合丝氨酸和丝氨酸氨基肽酶抑制剂联用的方法。
实施例1概述的实验数据表明，将类胰蛋白酶的酶和/或氨肽酶的抑制剂联用可能有加性或协同增强效果。应用前述的方法进行进一步的实验来检验这种可能性。结果示于表2.1
表2.1
抑制剂联用及其在离体试验下对一龄幼虫生长和存活的影响
    抑制剂     所试验的浓度(mM)     生长抑制
SBTI+Pefabloc 0.17 SBTI+2.5 Pefabloc 72％生长抑制
SBTI+TLCK 0.17 SBTI+2.5TLCK 幼虫被杀死
SBTI+Leupeptin 0.17 SBTI+2 Leupeptin 44％生长抑制
SBTI+L-leucinethiol 0.17 SBTI+0.5、0.75或1 L-Leucinethiol 所有浓度条件下幼虫都被杀死
SBTI-EDTA 0.17 SBTI+2或5 EDTA 5mM：92％生长抑制2mM：88％生长抑制
SBTI+Bestatin 0.17 SBTI & 3.3 Bestatin 73％生长抑制
EDTA+Pefabloc 1.0EDTA+3.0Pefabloc 78％生长抑制
EDTA+Antipain 0.5EDTA+5.0Antipain 85％生长抑制
将SBTI和亮抑蛋白酶肽或Pefabloc联用没有明显效果。SBTI和EDTA联用时有中等的效果。SBTI和TLCK或L-巯基亮氨酸联用时抑制作用较大。这些结果表明类胰蛋白酶的肽酶的和氨肽酶的多重抑制对幼虫能产生有效的抑制作用。
(b)一种丝氨酸肽酶抑制剂(SBTI)和一种氨肽酶抑制剂(L-巯基亮氨酸)联用对抑制L.cuprina幼虫生长的效果的研究
在某一浓度范围内研究了SBTI和L-巯基亮氨酸抑制剂结合使用时幼虫生长的影响，以调查协同抑制作用发生的可能性。在严重致死前结束这一实验。结果见表2.2。
表2.2
抑制剂SBTI和L-巯基亮氨酸(L-leu)联用时对幼虫生长的抑制作用
抑制剂 浓度(mM) 幼虫平均重量(10-4g) ％生长抑制
    对照     10.26
    SBTI     0.0425     12.57     -22.5
    SBTI     0.085     7.34     28.5
    SBTI     0.170     5.63     45.1
    SBTI     0.340     3.15     69.3
    SBTI     0.680     3.02     70.6
    L-leu     1.00     8.06     21.4
    L-leu     2.00     2.76     73.1
    SBTI&L-leu     0.02175&0.5     11.90     -15.9
    SBTI&L-leu     0.0425&0.5     6.77     34.0*
    SBTI&L-leu     0.085&1.0     2.90     71.7*
    SBTI&L-leu     0.17&1.0     2.41     76.5*
    SBTI&L-leu     0.34&1.0     0.98     90.5*
*这些联用反应进一步证实了Cornell所定义的协同作用(1981，P24)
(c)研究联用2种氨肽酶抑制剂(EDTA和L-巯基亮氨酸)对L.cuprina幼虫的生长的效果。这些实验的结果见表2.3
表2.3EDTA和L-leu联用
    处理     浓度(mM) 平均幼虫体重(10-4g)   生长抑制百分比
    对照     -     9.08     -
    EDTA     0.25     9.68     -6.6
    EDTA     0.50     5.47     39.8
    EDTA     1.0     2.75     69.7
    EDTA     1.5     4.43     51.2
    EDTA     2.0     2.51     72.4
    L-leu     1.0     2.98     67.2
    L-leu     2.0     1.22     86.6
    EDTA&L-leu     0.15&0.50     8.66     4.6
    EDTA&L-leu     0.25&0.50     5.56     38.6
    EDTA&L-leu     0.50&0.50     3.94     56.6
    EDTA&L-leu     0.75&0.50     3.65     59.8
    EDTA&L-leu     1.00&1.00     2.94     67.6
实施例3  肽酶抑制剂对绵羊丽蝇(L.cuprina；Diptera)和Heliothispunctigens的卵孵化的影响
下述实验用于评价本发明的组合物能否通过抑制卵孵化而起到杀虫作用。
将绵羊丽蝇的卵置于多片肝(0.9g)上，然后将肝片放入24孔组织培养板的各个孔中。将含有指定浓度抑制剂的磷酸盐缓冲液(PBS，0.1ml)加到每个小孔中，每一小孔中有30个新放置的消毒过的绵羊丽蝇的卵。然后将培养板保持在35℃下无菌环境中24小时，计算孵化的百分率。
在24孔组织培养板内(2枚卵/孔)，用指定培养基(酪蛋白3g，麦芽3g，蔗糖5g，琼脂2.25g，复合维生素B片剂5mg，连同青霉素和链霉素溶于80ml磷酸盐缓冲液中)培养Heliothis的卵。于27℃温育3天后计算卵孵化情况。结果见表3.1。
表3.1离体条件下酶抑制剂对绵羊丽蝇(L·cuprina)卵孵化率的影响
    抑制剂     浓度(mM) 孵化百分率
对照 71
EDTA 2，5，10 10.0 10
大豆胰蛋白酶抑制剂 0.17 17
大豆胰蛋白酶抑制剂+EDTA 0.17 SBTI+2，5，10 EDTA 15，25，7
TLCK+EDTA 2，5，10 TLCK+2 EDTA 3，7，2
在最初的体外实验中，含0.17mM SBTI和5mM放线酰胺素混合物中10枚Heliothis的卵未孵化，而对照的10枚卵都孵化了。
实施例4  本发明对喂饲人工食物的棉蚜(Heliothis punctigens，Lepidoptera)幼虫的生长和存活的影响
如下制备人工食物：
菜豆(Haricot Beans)    468克(g)
麦芽                   100g
酵母                   70g
维生素C                70g
Paraben                44g
山梨酸                 2.2g
琼脂                   28g
水                     800ml
*磷酸和丙酸            4ml
*磷酸和丙酸储备液含：
29ml                   丙酸
21ml                   正磷酸
270ml                  蒸馏水
总体积                 500ml
1、菜豆(Haricot beans)于微波炉中煮40分钟。
2、向热水中加入琼脂并于热的平台上搅拌至几乎沸腾。
3、将菜豆、琼脂混合物、酵母和麦芽于电动混匀器中混合3分钟。
4、温度降至60℃时，加入酸并与培养基混匀。
5、将指定浓度的抑制剂溶液或等量的水加入到消毒过的玻璃管中。用消毒的10ml注射器向每管(1.5ml)加入人工培养基。将Heliothis punctigens的一龄幼虫(每管1条幼虫)置于玻璃管并加盖。25℃下将这些管保温10天。再将管置于-70℃24小时冻死幼虫，各自称重。与对照幼虫比较来计算抑制百分数。
结果见表4.1
表4.1
以含或不含抑制剂的人工食物喂饲Helothis punctigens幼虫的生长情况
    抑制剂   浓度(mM)   ％存活   幼虫平均重量(mg) 生长抑制百分率
    对照     -     70.0     165.4     -
    羧肽酶抑制剂     2.5     83.3     140.6     15.0
    羧肽酶抑制剂     5.0     50.0     123.6     -53.5
    EDTA     2.5     50.0     123.6     25.3
    EDTA     5.0     33.3     9.25     94.4
    EDTA     10.0     67.0     4.75     97.1
    Leupeptin     2.5     16.6     16.6     90.0
Leupeptin 5.0 33.3 17.0 89.7
    Actinonin     2.5     33.3     -     97.5
    Actinonin     5.0     0.00     -     100.0
    EDTA&SBTI     2.5&0.17     75.0     22.0     86.7
    EDTA&SBTI     5.0&0.17     25.0     5.00     97.0
实施例5  肽酶抑制剂对猫蚤(Ctenocephalides felis；蚤目Siphonaptera)的生长和存活的影响
从5岁的已有18个月未用外寄生药剂处理的美利奴羊的颈静脉取血。将血收集到一个盛有0.8ml肝素的100ml塑料瓶中并保持在4℃。预先称重抑制剂，然后加入到5ml的无菌塑料瓶中，再加入4.5ml血液。样品混合后，置于-70℃24小时，再冷冻干燥。冷冻干燥的样品以63微米的不锈钢筛过筛，再加到无菌的5ml塑料瓶中(0.15g/每瓶)。每瓶放入4枚蚤卵，瓶子上端用橡皮筋将一张面巾纸扎在瓶口。培养瓶于25℃、70-80％相对温度下保温6天。然后向每瓶加入蛭石，为蚤化蛹提供支持介质。再于25℃、70-80％相对温度下保温10天。对10个对照瓶和每一处理的3个瓶进行测试。
保温期结束时将培养瓶置于-20℃下24小时以杀死蚤。对孵化的卵数目和生活史的阶段进行记录。结果见表5.1
表5.1
干血食物中蚤卵的发育(16天)
    处理     发育至蛹化的蚤的百分数
    对照     97.5
  EDTA         1.5625mg3.125mg6.25mg     000
  Actinonin    1.40mg2.80mg     016.8
  Leupeptin    1.70mg3.40mg     00
  SBTI         5.0mg10.0mg     00
  Pefabloc     1.10mg2.20mg     00
  EDTA         1.5625mg&SBTI        5mg 0
  EDTA         3.125mg&SBTI        5mg 0
实施例6  肽酶抑制剂对以自然食物喂饲的黑蟋蟀(Teleogrylluscommodus，直翅目)幼虫存活的影响
(i)抑制剂和对照溶液储备液按表6.1制备为水溶液或悬浮液。
(ii)从一龄若虫开始研究死亡率。
(iii)将卷心菜叶片(5×8mm直径叶片/每一处理)涂上抑制剂或对照储备液100μl并晾干。将叶片单个置于40mm平皿中，并同时放一湿棉毛垫供给水分和一块有沟的塑料片作为遮蔽物。
(iv)在每一叶片放置10条若虫，并把培养皿置于25℃保温。
(v)每天计算死亡率并移走死去的个体。
结果见表6.1
表6.1
7天后各种抑制剂对黑蟋蟀幼虫死亡率的影响
    抑制剂     所测浓度范围(mM)     死亡率
    Actinonin     5     无
    EDTA     30     高(78％)
    SBTI     0.17-0.68     无
    EDTA/SBTI     上述B和C相加     高(41％)
    Pefabloc     2.5-10     中
1，10-phenanthroline 5-20 中
    Actinonin/SBTI     上述A和C相加     低
    Antipain     2.5-10     无
    硼砂     5-20     高(93％)
    对照(水)     -     -
*无/低，10-20％死亡率/中，21-40％死亡率/高41-100％死亡率。
实施例7  肽酶抑制剂对绵羊虱(Bovicola ovis；Anoplura)的生长和存活的影响
在澳大利亚和很多其他国家绵羊虱是一种主要的农业害虫，这类昆虫的一些品系正在对有机磷和合成的拟除虫菊酯形成强的抗性。本次实验是为：
(i)拓宽对本发明有用的抑制剂的生长抑制或杀虫活性的评价；和
(ii)评价本发明对已知能抗高浓度杀虫剂的昆虫品系的生长抑制或杀虫活性。
所选虱的品系是称作Hartley的参考品系。它对合成的拟除虫菊酯有很强的抗性(表7.1，Levot G W.，“澳大利亚畜牧兽医杂志”(Aust.Vet J.)，199269 120)。
(i)从严重感染虱的绵羊身上剪下一小块面积的羊毛，再用棉布在剪过毛的地方覆盖1分钟以收集虱。将棉布上的虱刷到一容器中。
(ii)将抑制剂的溶液或悬浮液状的储备液施于从最接近皮肤的40mm处剪下的几簇羊毛。提供虱的羊已有2年未用杀虫剂处理，在剪毛时其毛平均长度为100mm。
(iii)为防止交叉感染，将毛样品一式四份，浸入到抑制剂的水溶液或悬浮液中进行处理，除去水份并在空气中干燥24小时。
(iv)将羊毛样品放入带标签的加盖塑料瓶中。
(v)使虱爬过纸张离开光源(作为生活力测试)，并向每管的羊毛中放入成虫、三龄幼虫、二龄幼虫和一龄幼虫各10只虱。
(vi)将管于35℃，60-80％相对湿度条件下保温，并每天进行观察。
(vii)以假定触碰虱时不能活动作为死亡标准来评定存活率。
结果见表7.1
表7.1在35℃保温24小时后生长在抑制剂处理过的羊毛上的活虱数目
处理(浓度mM) 虱的龄级
1 2 3 成虫
    水    重复1重复2重复3     101010     101010     101010     101010
  EDTA    1020     000     210     100     210
  SBTI    0.170.340.68     110     200     240     400
EDTA/SBTI 10/0.1720/0.3430/0.68     000     000     000     000
表7.2所试验的虱对杀虫剂的抗性特征
      杀虫剂     LC50(mg/L)   LC95(mg/L)     抗性系数
    氯氰菊脂     29.4     475   642(Peak Hill)
    Dizzinon     5.31     19.7   1.4(Singapore)
本发明的组合物对抗杀虫剂的绵羊虱有很好的效果。
实施例8  肽酶抑制剂对豆象(Tribolium castaneum；鞘翅目)的生长和存活的影响
用由有机小麦制得的清洁、磨碎并筛过的粗面粉培养昆虫。将装有预先称重物质的各瓶中的抑制剂与面粉干拌，并以少量水中洗瓶中残留的抑制剂。将冲洗的水份加到面粉中并将混合物重新研磨。浸渍的面粉被转移到一个20ml的瓶中并摇动和颠倒使完全混匀。
让T.castaneum的成虫在面粉上产卵，将卵从面粉中筛出并用一根毛发将卵一个个转移到盛有少量面粉的微孔管，管内装少量面粉。每一处理水平用32孔，并做三个平行样。培养物于30℃和55％相对湿度下保温。
6天后将每一重复的32孔合在一起，对幼虫计数并将数目与对照处理(无抑制剂)中的数目进行比较。如果明显小于参照幼虫则将幼虫归类为“小的”，或者，如果观察到异常的行为或状态(如扭曲的或被扭曲的幼虫)则将幼虫归类为“异常的”。
实验的抑制剂和剂量等级同实施例4中所使用的一致。结果：(第6天)-在第6天卵的孵化受到的影响情况是不一致的。
-在所有剂量水平的放线酰胺素和EDTA的作用下的幼虫都被归类为“小的”，但在以1，10-菲咯啉和其他处理下，幼虫是正常的。
实施例9  肽酶抑制剂对谷物储藏害虫锯谷盗(Oryzaephylussurinamensis；鞘翅目)的生长和存活的影响
除了保温是在32.5℃和70％相对温度下进行外，对这种昆虫的生物测试方法同所述的T.castaneum的方法一样。8天后将昆虫从面粉中筛出并称重。
结果见表9.1
表9.1
锯谷盗(O.surinamensis)幼虫体重减少的百分数
    处理     浓度(mM)     生长抑制百分数*
    Bestatin     1.25255     -52-4
    EDTA     102030     32428
    SBTI     0.170.340.68     123046
    EDTA/SBTI(上述相加)     10/0.1720/0.3430/0.68     633044
    Pefabloc     2.5510     496179
1，10-phenanthroline 51020 1006395
    Bestatin/SBTI(上述相加)     1.25/0.172.5/0.345/0.68     -23032
    Antipain     2.5510     -10-2-2
Casein 10mg/ml20mg/ml40mg/ml -510-2
Borax 51020 -53968
*相对于未处理幼虫的生长情况
对各氨肽酶抑制剂的反应是不同的。1，10-菲咯啉为高效的生长抑制剂，EDTA为中等效果的，贝他定(bestatin)无效。
显而易见，对于本领域的熟练技术人员来说，虽然为达到清楚和理解的目的而对本发明进行了一些详细的描述，但仍可在不超出本说明书所说明的发明范围的前提下，对文中所述的发明具体实施和方法进行各种修改和变更。
文中所引用的参考文献在后面几页列出，并入此文中。
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Claims (51)

1、一种用于控制昆虫的组合物，包括一种氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂，还包含一种非牢固螯合的肽酶抑制剂，以及一种药学、兽医学、农学或园艺学上可接受的载体。
2、权利要求1的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个氨基基团或其衍生物。
3、权利要求1或2的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个或多个氨基酸残基或其衍生物。
4、权利要求1-3的任一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸或丙氨酸的残基或它们的衍生物。
5、权利要求1-4的任一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一个亮氨酸残基或其衍生物。
6、权利要求1-5的任一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂与氨肽酶和金属肽酶的活性位点中的金属离子起反应。
7、权利要求1-6的任一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一种螯合剂或具有螯合活性。
8、权利要求7的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂包含一个二齿、三齿、四齿或六齿的螯合剂。
9、权利要求7或8的组合物，其中该螯合剂包含有一个氨基羧酸残基。或次氮基三乙酸，或者是具螯合活性的它们的盐或衍生物。
10、权利要求9中的组合物，其中该螯合剂包括乙二胺四乙酸，或具螯合活性的盐或衍生物。
11、权利要求1中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂含有一种过渡金属离子或该离子的一种复合物或衍生物，组合物中的离子选自铜、钴、锌、镁、锰、钒或铁。
12、权利要求1-9的任一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂包含一个硼、磷酰基或膦酰基残基。
13、权利要求1-12的任意一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂和氨肽酶或金属肽酶不可逆地结合。
14、权利要求1-13的任意一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂不抑制胰蛋白酶或需钙蛋白酶(calpain)。
15、权利要求1-13的任意一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂不抑制丝氨酸或半胱氨酸肽酶。
16、权利要求1-15的任意一项中的组合物，其中该抑制剂抑制下列一种酶的活性：亮氨酸氨肽酶、A、B、N和M型氨肽酶，精氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、D-氨基酸氨肽酶、肽键二肽酶、Zn-氨肽酶、N-甲酰甲硫氨酸氨肽酶、二肽键-氨肽酶、A型和B型羧肽酶、三肽键肽酶、二肽键肽酶和肽键-三肽酶。
17、权利要求16的组合物，其中该抑制剂抑制亮氨酸氨肽酶的活性。
18、权利要求17的组合物，其中该抑制剂抑制一种昆虫亮氨酸氨肽酶的活性。
19、权利要求1-18中的任一项的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂含有一种丝氨酸肽酶抑制剂、一种半胱氨酸肽酶抑制剂、一种天冬氨酸肽酶抑制剂、一种金属肽酶抑制剂或一种氨肽酶抑制剂。
20、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂选自胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)抑制剂组成的一类物质。
21、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂选自来源于豆科植物、蔬菜、水果或谷物的丝氨酸肽酶或半胱氨酸肽酶抑制剂组成的一类物质。
22、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂选自抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)和E-64组成的一类物质。
23、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂含有一种马铃薯羧肽酶抑制剂。
24、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的肽酶抑制剂含有水蛭(蛋白酶)抑制剂C(Eglin C)。
25、权利要求19的组合物，其中该非牢固螯合的氨肽酶抑制剂含有Pefabloc。
26、权利要求19的组合物，其中含有SBTI和EDTA(乙二胺四乙酸)。
27、权利要求19的组合物，其中含有L-亮氨酸硫醇和EDTA。
28、权利要求19的组合物，其中含有Pefabloc和EDTA。
29、权利要求19的组合物，其中含有放线酰胺素和SBTI。
30、权利要求19的组合物，其中含有L-亮氨酸硫醇和SBTI。
31、权利要求19的组合物，其中含有1，10-菲咯啉和SBTI。
32、权利要求19的组合物，其中含有贝他定(Bestatin)和SBTI。
33、权利要求19的组合物，其中含有抗痛素和EDTA。
34、权利要求1-33的任意一项中的组合物，其中该氨肽酶抑制剂或非牢固螯合的肽酶抑制剂含有肽、多肽或蛋白质的部分结构。
35、一种控制昆虫的方法，包括将所述昆虫暴露给权利要求1-34的任意一项中的组合物。
36、权利要求35的方法，包括将昆虫的卵或昆虫幼虫暴露给权利要求1-34的任意一项中的组合物，利用这种方法可抑制昆虫卵的孵化和/或昆虫幼虫的发育。
37、权利要求35或36的方法，其中昆虫选自鳞翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、网翅目(Dictyoptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、啮虫目(Psocoptera)、等翅目(Isoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)。双翅目(Diptera)、Anoplura、Malophaga和蚤目(Siphonaptera)中的一个目。
38、权利要求35-37中的任意一项的方法，其中昆虫选自于蛆蝇(myiasis flies)、跳蚤(fleas)、蟑螂(cockroaches)、苹浅褐卷叶蛾(light brownapple moths)、蟋蟀(crickets)、芽虫(budworms)、谷物和仓储昆虫(grain andstorage insects)。
39、权利要求35-38中的任意一项的方法，其中组合物以局部、口服或非肠道的方式给药。
40、权利要求35-38中的任意一项的方法，其中组合物以局部的方式给药。
41、权利要求35-40中的任意一项的方法，其中将该组合物施用于下列药物中的一种：棉花、油料种子作物、观赏植物、花卉、果树、谷类作物、藤本植物、块茎作物、牧草和蔬菜。
42、一种非人类的转基因生物，能表达一种氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂，和/或一种非牢固螯合的肽酶抑制剂。
43、权利要求42中的生物，该生物既表达一种氨肽酶抑制剂或一种金属肽酶抑制剂，也表达一种非牢固螯合的肽酶抑制剂。
44、权利要求42的生物，该生物表达一种氨肽酶抑制剂或一种金属肽酶抑制剂。
45、权利要求42的生物，该生物表达一种非牢固螯合的肽酶抑制剂。
46、权利要求42-45的任意一项中的生物，其中所述生物栖息在易被所述昆虫侵扰的植物或动物体上，或者其体内。
47、权利要求46的生物，其中所述生物和所述动物或植物共生或共栖。
48、权利要求46或47的生物，该生物选自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。
49、一种控制昆虫的方法，包括按权利要求44，将转基因生物暴露给一种非牢固螯合的抑制剂的步骤。
50、一种控制昆虫的方法，包括按权利要求45，将生物暴露给一种氨肽酶抑制剂或金属肽酶抑制剂的步骤。
51、一种控制昆虫的方法，包括按权利要求42-49的任意一项，将转基因生物暴露给权利要求1-34的任意一项中的组合物的步骤。
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