ES2214502T3 - Control biologico de insectos. - Google Patents
Control biologico de insectos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE RELACIONA CON UNA COMPOSICION Y UNOS METODOS DE UTILIZACION DE LA MISMA PARA CONTROLAR INSECTOS. LAS COMPOSICIONES COMPRENDEN INHIBIDORES DE AMINOPEPTIDADASAS O INHIBIDORES DE METALOPEPTIDASAS Y, ADEMAS, COMPRENDEN UN INHIBIDOR DE PEPTIDASAS QUE NO FORMA FUERTEMENTE COMPUESTOS QUELATOS. PREFERIBLEMENTE, ESTAS COMPOSICIONES SE APLICAN TOPICAMENTE, Y, PREFERIBLEMENTE, PROVOCAN LA INHIBICION DE HUEVOS DE INSECTOS Y/O LA INHIBICION DEL DESARROLLO Y/O LA MORTALIDAD DE LAS LARVAS DE INSECTOS.
Description
Control biológico de insectos.
La presente invención se refiere a un método para
el control de insectos, y a composiciones para el mismo.
En particular, la invención se refiere al control
de infestaciones, debidas a insectos, de animales o plantas, y a la
profilaxis de infecciones de animales o plantas que son transmitidas
por insectos. La invención también es aplicable a la mejora de
infecciones que son consecuencia de la infestación por insectos.
Más en particular, la invención se refiere a la
utilización de composiciones que comprenden inhibidores de
peptidasas para el control de insectos, y a la utilización de
organismos transgénicos resistentes a insectos, que expresan
inhibidores de peptidasas.
Los insectos son causa de importantes problemas
de plagas en una amplia variedad de animales y plantas en todo el
mundo, y se ha calculado que se pierde el 13% de la producción
agrícola cada año, a pesar de las medidas actuales de control. Las
especies de insectos de los órdenes Lepidoptera, Hemiptera,
Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Isoptera, Thysanoptera y
Homoptera causan pérdidas masivas en muchas cultivos hortícolas y a
gran escala, así como en productos de cereales almacenados o
manufacturados. Diptera, Anaplura, Malophaga y Siphonaptera causan
infecciones parasíticas en animales y en el hombre. Otros órdenes
(Hymenoptera, Dictyoptera, Isoptera) incluyen importantes plagas
domésticas e industriales.
Muchas de las medidas conocidas de control de
insectos hacen uso de insecticidas químicos, por ejemplo
hidrocarburos clorados (DDT, endosulfano, etc.), organofosfatos
(clorpirifos, diazinon, malatión, paratión), organocarbamatos
(carbarilo, metomilo, proxipur) y piretroides sintéticos
(cipermetrina, deltametrina).
Los problemas asociados a la utilización de
insecticidas químicos incluyen el desarrollo de resistencia por
parte de los insectos diana (organofosfatos, piretroides
sintéticos), la persistencia de los productos químicos en el medio
ambiente y en tejidos de plantas y animales, y los efectos nocivos
en organismos que no son diana (compuestos organoclorados,
reguladores del crecimiento de insectos).
Los compuestos de boro (bórax, poliboro) también
han sido utilizados como insecticidas. Los compuestos de boro son
estables, matan insectos de forma relativamente lenta a dosis
razonables (Mullens y Rodriguez, 1992), y la ingestión de elevadas
dosis por los seres humanos puede ser fatal (Anon, 1991).
Otras categorías de insecticidas incluyen los
reguladores del crecimiento de insectos (IGRs) y las toxinas
bacterianas insecticidas (por ejemplo, toxinas de Bacillus
thuringiensis (Bt)). Los IGRs son compuestos que interfieren de
alguna forma en la síntesis de quitina. Incluyen análogos de
hormonas juveniles (metopreno), inhibidores de la síntesis de
quitina (fenoxicarb, diflubenzurón, flurazurón) y derivados de
triazina (ciromazina). Se ha observado resistencia a muchas clases
de IGR. También está apareciendo resistencia de ciertos lepidópteros
a las toxinas de Bt. Desde un punto de vista técnico resulta
difícil, tanto con los IGRs como con las toxinas de Bt, asegurar una
mortalidad adecuada de insectos en una etapa apropiada de su ciclo
vital. Algunos IGRs son estables y pueden suponer un peligro para el
medio ambiente.
Los grupos de insecticidas más útiles son
aquellos que tienen elevada actividad insecticida y bajo nivel de
persistencia en el medio ambiente (organofosfatos, piretroides
sintéticos). El mayor problema asociado a estos compuesto es, sin
embargo, el desarrollo de resistencia por parte de los insectos
diana. Se cree que el 90% de la utilización de insecticidas se basa
todavía en insecticidas neurotóxicos clásicos. Así pues, la búsqueda
de insecticidas alternativos de bajo nivel de residuos que son
eficaces en insectos resistentes a los insecticidas existentes es
particularmente urgente.
Los agentes denominados sinérgicos pueden
utilizarse para aumentar al máximo la eficacia de insecticidas
particulares. Los agentes sinérgicos pueden ser, o no, insecticidas
por sí mismos. Blood y Studdert (1988) definen un agente sinérgico
como un agente que actúa junto con otro o que aumenta la acción de
otro. Como ejemplo, puede observarse que el butóxido de piperonilo
es un agente sinérgico para los piretroides sintéticos. Los agentes
sinérgicos que son eficaces en combinación con un insecticida
particular pueden no ser eficaces en combinación con otros
insecticidas. Los agentes sinérgicos pueden utilizarse para superar
problemas de resistencia por parte de los insectos, aunque también
puede aparecer resistencia de los insectos a agentes sinérgicos. El
papel de los agentes sinérgicos en las formulaciones de insecticidas
puede ser vital para conseguir un resultado viable desde el punto de
vista comercial, así como para la gestión de la resistencia a los
insecticidas. La búsqueda de combinaciones sinérgicas eficaces es
tan urgente como la búsqueda de insecticidas eficaces por sí mismos
(Forrester et al, 1993).
Recientemente, la atención se ha centrado en las
peptidasas de insectos, cuya inhibición puede proporcionar un
posible medio para el control de insectos. Las peptidasas son
enzimas ubicuos que rompen proteínas y péptidos, y ayudan de este
modo a la digestión tanto en el intestino como en las células. Están
involucradas en la reorganización de tejidos durante el desarrollo
embrionario, la muda y la formación de la pupa en insectos. Están
involucradas también en la defensa contra organismos invasores y en
la regulación de proteínas.
Las peptidasas constituyen un grupo muy amplio de
enzimas. Actualmente se clasifican según:
(1) la reacción catalizada
(2) la naturaleza química del centro catalítico,
y
(3) la relación evolutiva, deducida de la
estructura (Barrett, 1994)
La Unión Internacional de Bioquímica y Biología
Molecular (IUBMC), En: Enzyme Nomenclature (1992), clasifica las
peptidasas atendiendo a categorías según la clase de enzima (EC).
Estas categorías son EC 3.4.11 a 3.4.19 para las exopeptidasas
(enzimas que sólo actúan cerca de los extremos de las cadenas
peptídicas) y EC 3.4.21 a 3.4.99 para las enzimas que actúan
preferentemente en las regiones internas de los péptidos. El grupo
EC 3.4.99 es un grupo de peptidasas en las que el mecanismo
catalítico no se conoce o no está caracterizado.
A continuación se presenta un resumen de las
clases de peptidasas y su relación con la bioquímica de
insectos.
Este grupo incluye
serina-carboxipeptidasas EC 3.4.16 y
serina-endopeptidasas EC 3.4.21.
Las serina-peptidasas se
reconocen típicamente por un aminoácido serina, catalíticamente
activo, en su centro activo, y por su sensibilidad a un inhibidor
enzimático, 3,4-dicloroisocumarina
(3,4-DCl). El intervalo de pH preferido para la
actividad de las serina-peptidasas de mamífero es
2-8; no obstante, las
serina-peptidasas de insectos están habitualmente
adaptadas a condiciones alcalinas (pH 9 hasta más de 11 en algunas
larvas de lepidópteros).
La actividad de las
serina-peptidasas e insectos se define habitualmente
por la reacción de las enzimas con sustratos sintéticos. Las tres
categorías habituales de serina-peptidasas de
insectos (del tipo de la tripsina, del tipo de la quimotripsina y
del tipo de la elastina) pueden identificarse de esta manera. Las
serina-peptidasas del tipo de la tripsina reaccionan
con los siguientes sustratos sintéticos: éster metílico de
P-tosil-L-arginina
(TAME), éster etílico de
\alpha-N-benzoil-L-arginina
(BAEE),
\alpha-N-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida
(BAPNA) y
benzoil-DL-arginina-naftilamina
(BANA).
Las peptidasas del tipo de la quimotripsina
pueden identificarse por su reacción con:
Éster de
N-acetil-L-fenilalanina
(APNE)
Éster etílico de
N-acetil-L-tirosina
(ATEE)
Éster etílico de
N-benzoil-L-tirosina
(BTEE)
N-benzoil-L-tirosina-p-nitroanilida
(BTPNA)
L-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida
(GPPNA)
N-succinil-L-fenilalanina-p-nitroanilida
(SPAPNA)
L-glutaril-L-fenilalanina-naftilanida
(GPNA).
Los inhibidores de
serina-peptidasas del tipo de la elastasa pueden
identificarse por su reacción con sustratos sintéticos tales como
N-succinil-ala-ala-pro-leu-p-nitroanilida
(SAAPLpNA).
La actividad de las
serina-peptidasas puede describirse asimismo en
función de su reacción con inhibidores enzimáticos. El grupo de las
serina-peptidasas son inhibidas generalmente por
diisopropilflurofosfato (DipF/DFP) y por fluoruro de
para-fenilmetilsulfonilo (PMSF). Las peptidasas del
tipo de la tripsina son inhibidas por
tosil-L-lisina-clorometil-cetona
(TLCK). Las peptidasas del tipo de la quimotripsina son inhibidas
por
tosil-L-fenilalanina-clorometil-cetona
(TPCK). Las peptidasas del tipo de la elastasa son inhibidas por
Eglin-C.
Se han encontrado varias proteínas naturales que
son capaces de inhibir las serina-peptidasas. Entre
ellas se encuentran el inhibidor de tripsina de soja, cristalino, de
Kunitz (SBTI) y el inhibidor de tripsina de soja de
Bowman-Birk (BBTI). Algunas otras semillas de
leguminosas contienen inhibidor de peptidasas a una concentración de
1-4% de la proteína total; por ejemplo, el inhibidor
de tripsina/quimotripsina de garbanzos (CI), el inhibidor de
tripsina de judías de Lima (LBTI) y el inhibidor de tripsina de
judía de vaca (CPTI) (MacIntosh et al, 1990). Los inhibidores
de serina-peptidasas de origen animal incluyen el
inhibidor de tripsina de páncreas bovino (BPTI, Aprotinina), el
ovomucoide de huevo y la
alfa-1-antitripsina de la
sangre.
Las serina-peptidasas tienen pH
óptimos alcalinos y son enzimas solubles de importancia primordial
en los líquidos digestivos de los insectos. Los ejemplos incluyen
Sphingidae (Miller et al, 1974), Noctuidae (Ahmed et
al. 1976, 1980; Ishaaya et al, 1971; Prichet et
al, 1981; Teo et al, 1990; Broadway y Duffy, 1986),
Bombycidae (Sasaki y Suzuki, 1982; Euguchi y Iwanito, 1976; Euguchi
y Kuriyama, 1985), Pieridae (Lecadet y Dedonder, 1966; Broadway
et al, 1989) Pyralidae (Larocque y Houseman, 1990; Houseman
et al, 1989; Mohammed y Altias, 1987) y Diptera (Bowles et
al, 1990). Christeller et al (1992) demostraron que las
serina-peptidasas estaban implicadas en la actividad
digestiva (caseína) de doce lepidópteros fitófagos. En dicho
artículo, Christeller comprobó que ningún otro tipo de peptidasa
mostraba indicios significativos de actividad digestiva. También se
ha comprobado que las serina-peptidasas desempeñan
un papel importante en lepidópteros que digieren queratina
(Christeller et al, 1994; Prowning y Irzykiewicz 1962; Ward,
1975 a, b). Además, desempeñan un papel importante en la actividad
digestiva de algunos coleópteros (McGhie et al, 1995, Dymock
et al, 1992), algunos ortópteros (Sakal et al, 1989;
Christeller et al, 1990), algunos heterópteros (Cohen 1993) y
algunos dípteros (Bowles et al, 1990).
Las serina-peptidasas digestivas
presentan considerable variación intraespecífica e interespecífica
en el número y en las propiedades catalíticas (Applebaum, 1985). En
algunos casos se ha comprobado que los inhibidores de
serina-peptidasas presentes en la dieta de los
insectos provocan disuasión de la alimentación, así como inhibición
digestiva (Dymock et al, 1992).
Se ha comprobado que las
serina-peptidasas del tipo de la tripsina están
implicadas en un aspecto regulador crucial del crecimiento: la muda.
Están implicadas en varias funciones como el control de procesos, la
exposición de las fibras de quitina a las quitinasas y el reciclado
de material cuticular (Samuels y Paterson, 1991).
Dado su importante función en procesos
metabólicos, su amplia presencia en la naturaleza y la existencia de
muchos inhibidores naturales en plantas y animales, las
serina-peptidasas han sido las más estudiadas como
agentes para el control de insectos. Es importante señalar que el
contexto para la utilización de las
serina-peptidasas en el control de insectos ha sido
casi exclusivamente el campo de las plantas transgénica.
Este grupo incluye
cisteína-carboxipeptidasas (EC 3.4.18) y
cisteína-endopeptidasas (EC 3.4.22).
Estas enzimas se caracterizan por tener un
residuo de cisteína catalíticamente activo en su centro activo y por
su sensibilidad a ciertos inhibidores. Las
cisteína-peptidasas se activan de modo
característico en condiciones reductoras (añadiendo cisteína,
ditiotreitol u otros agentes reductores). Las
cisteína-peptidasas son enzimas solubles que se
encuentran generalmente en el interior del intestino medio de los
insectos. Las cisteína-peptidasas de mamíferos
funcionan habitualmente en condiciones de pH bajo, aunque en
insectos son más preferidos valores de pH cercanos a la neutralidad
o algo ácidos (Wolfson y Murdock, 1987).
El modelo de la actividad de las
cisteína-peptidasas es su reacción con los sustratos
sintéticos
n-\alpha-benzoil-L-arginina-p-nitroanilida
(BAPNA) o
benzoiloxi-carbonil-phe-arg-7-(4-metil)-cumaril-amida
(Z-Phe-Arg-MCA). La
actividad de las cisteína-peptidasas puede
describirse asimismo en función de su reacción con inhibidores
enzimáticos tales como la yodoacetamida, yodoacetato, metales
pesados, p-cloromercuribenzoato, cianuro de cistina,
N-etilmaleimida y, de modo característico,
E-64. El E-64 es un pequeño péptido
(L-trans-epoxi-succinil-leucilamido-(4-guanidino-butano)
obtenido a partir de una cepa de Aspergillus japonicus. Se
han identificado inhibidores naturales de
cisteína-peptidasas en microbios
(E-64), plantas (orizacistatinas I y II de granos de
arroz, y multicistatina de patata (PMC), procedente de tubérculos de
patata), y animales (cistatina de huevo de gallina, HEC). La
antipaína es otro inhibidor de cisteína-peptidasas
bien conocido.
Las cisteína-peptidasas
desempeñan una importante función como enzimas digestivas solubles
del intestino de algunos insectos, especialmente coleópteros (Orr
et al, 1994; Thie y Houseman, 1990; Liang et al,
1991). La utilización de inhibidores de
cisteína-peptidasas para el control de insectos se
ha explorado sobre todo en el contexto de plantas transgénicas (Orr
et al, 1994; Wolfson y Murdock, 1987).
Estas enzimas se reconocen típicamente porque
poseen dos residuos de aspartilo en su centro activo. Muchas
aspártico-peptidasas presentan actividad máxima a
valores de pH bajo. Los sustratos sintéticos para estas enzimas
incluyen
N-carbobenzoxi-glutamil-L-tirosina
y
N-acetil-L-fenanil-diyodotirosina.
Los inhibidores característicos de las
aspártico-peptidasas incluyen la pepstatina y el
difenil-diazometano (McDonald, 1985). La pepstatina
es un inhibidor natural de origen microbiano.
Applebaum (1985) ha señalado que las
aspártico-peptidasas tienen cierta importancia en
los dípteros. Wolfson y Murdock (1987) han demostrado cierta
inhibición del crecimiento de un coleóptero (larvas del escarabajo
de la patata) por la pepstatina; sin embargo, se obtuvo una mayor
inhibición del crecimiento atacando las
cisteína-peptidasas.
Una búsqueda exhaustiva en la literatura de las
peptidasas ha demostrado que sólo se ha llevado a cabo una cantidad
limitada de investigaciones sobre
aspartil-peptidasas de insectos para el control de
insectos, ya sea mediante modificación transgénica de plantas o por
aplicación tópica. Christeller et al (1992) comprobaron que
la actividad aspártico-peptidasa no estaba al
parecer presente en el intestino de lepidópteros fitófagos.
Estas enzimas se reconocen típicamente porque un
ion metálico catalíticamente activo (habitualmente cinc) en el
centro activo, y por su sensibilidad a agentes quelantes. La
categoría de las metalopeptidasas incluye algunas endopeptidasas
(enzimas que escinden la cadena peptídica) y exopeptidasas (enzimas
que escinden aminoácido(s) de los extremos terminales de
péptidos). Las exopeptidasas pueden subdividirse a su vez en
carboxipeptidasas (que escinden aminoácido(s) del extremo
C-terminal) o aminopeptidasas (que escinden
aminoácidos del extremo N-terminal).
Estas enzimas no han sido involucradas en la
bioquímica de insectos, excepto por su posible papel en la digestión
de lana por lepidópteros queratinófagos (Prowning y Irykiewicz,
1962; Ward, 1975 a y b; Christeller et al, 1990, 1994).
Las metalo-carboxipeptidasas
necesitan un catión divalente (habitualmente Zn^{2+}) para su
actividad. Existen tanto en forma libre como unida a membranas y
presentan más actividad a pH alto (8-10). Los
sustratos sintéticos para las carboxipeptidasas incluyen el ácido
hipuril-DL-fenil-láctico
y la hipuril-L-arginina, para las
carboxipeptidasas de tipo A y B, respectivamente. Las enzimas del
tipo de la carboxipeptidasa A parecen ser más habituales en insectos
y se han encontrado en ortópteros, coleópteros, dípteros y
lepidópteros.
Los inhibidores sintéticos de las
metalo-carboxipeptidasas incluyen la
1,10-fenantrolina, el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), la
\beta-hidroxiquinolina y el fosforamidón. Un
inhibidor natural de las metalo-carboxipeptidasas es
el inhibidor de carboxipeptidasa de la patata (PCPI).
Se ha comprobado la presencia de
carboxipeptidasas, tanto en forma libre como unida a membranas, en
el material del intestino medio de larvas de lepidóptero (Ferreira
et al, 1994; Christeller, 1990). Christeller et al
(1992) describió estas enzimas como componentes esperables en el
sistema de digestión de proteínas. Antes de la fecha de prioridad de
la presente solicitud estas enzimas no fueron al parecer reconocidas
como dianas para la modificación transgénica de plantas, mucho menos
como componentes de agentes de control tópicos.
Las aminopeptidasas hidrolizan aminoácidos del
extremo N-terminal de cadenas peptídicas, y se
clasifican generalmente según su dependencia de iones metálicos
(Zn^{2+} o Mg^{2+}). Las aminopeptidasas mejor estudiadas se
encuentran en el tubo digestivo de los mamíferos, tanto en forma
soluble como unida a membranas. Las aminopeptidasas se designan
generalmente con una letra de sufijo que hace referencia a sus pH
óptimos: ácido (A), básico (B) o neutro (N), o a su condición de
enzima unida a membranas: (M), o por el número y tipo de aminoácidos
escindidos de los sustratos peptídicos. Estos nombres no son
exclusivos; así una leucina-aminopeptidasa M o N es
una enzima que elimina, preferentemente pero no exclusivamente,
leucina de un péptido, que está unida a membranas y cuya actividad
es óptima a pH neutro. Las aminopeptidasas hidrolizan
preferentemente residuos de leucilo, arginilo, metionilo, aspartilo,
alanilo, glutamilo, prolilo, valilo y cisteinilo; sin embargo, la
especificidad de sustrato es generalmente amplia y depende también
de otros residuos de la cadena peptídica (Taylor, 1993 a y b). La
mayoría de las aminopeptidasas son metalopeptidasas, aunque se sabe
que algunas enzimas bacterianas no requieren iones metálicos para su
actividad (Taylor, 1993 a y b). Al parecer hay pocos inhibidores
naturales de las aminopeptidasas.
Las aminopeptidasas de insectos tienen
generalmente un pH óptimo alcalino y son generalmente inhibidas por
bestatina (Taylor, 1993) y fenantrolina (Barrett, 1994).
Las especificidades de sustrato son generalmente
amplias, como se ha señalado anteriormente, pero los sustratos
típicos incluyen leu-pNA, arg-pNA,
met-pNA y pro-pNA.
Las metalo-aminopeptidasas son
inhibidas por agentes quelantes (tales como EDTA), que pueden
eliminar el ion metálico de la peptidasa o formar un complejo
inactivo con la enzima (Terra & Ferriera, 1994). La acción de un
quelante particular variará con el tipo de aminopeptidasa así como
con la estructura del propio quelante.
También se ha comprobado que las aminopeptidasas
forman parte del conjunto de péptidos digestivos de los insectos, y
se cree que están implicadas en las fases terminales de la digestión
de proteínas (Terra & Ferriera, 1994). Christeller et al
(1990, 1992) sostienen que las exopeptidasas (incluidas las
aminopeptidasas) tendrán poco utilidad para el control de insectos
debido al escaso papel desempeñado por estas enzimas en la digestión
de proteínas de la dieta, en comparación con las serina- y
cisteína-peptidasas.
No se ha descrito el retardo del crecimiento
larvario de insectos tras la exposición a inhibidores específicos de
leucina-aminopeptidasas (LAP). Christeller et
al (1990) han demostrado en extractos crudos del intestino del
grillo común que aunque los niveles de exopeptidasas,
particularmente LAP, son significativos en este insecto, las
exopeptidasas contribuían sólo un 16-20% a la
digestión de proteínas. En el estudio de Christeller, se comprobó
además que, con la presencia de dos inhibidores eficaces de
serina-peptidasas, la contribución de las
exopeptidasas a la digestión de proteínas se vio considerablemente
reducida. Este resultado se atribuyó a la falta de extremos de la
cadena oligopeptídica que actúan como sustratos para exopeptidasas.
Este dato apuntaba adicionalmente a un escaso papel de las
aminopeptidasas en el control de insectos.
Los resultados anteriores arrojan importantes
dudas sobre la utilización de los inhibidores de exopeptidasas
(principalmente inhibidores de aminopeptidasas) como agentes de
control de insectos, y en particular, arrojan importantes dudas
sobre la utilización combinada de inhibidores de las
serina-peptidasas e inhibidores de las
aminopeptidasas como agentes de control de insectos.
Además de su papel en la digestión, se ha
demostrado actividad aminopeptidasa en el líquido de la muda del
lepidóptero Manduca sexta (Jungries, 1979). Sin embargo, una
vez más, el papel de las aminopeptidasas parece ser secundario, en
comparación con el papel de las serina-peptidasas
(del tipo de la tripsina). No se han descrito inhibidores naturales
de aminopeptidasas o metalopeptidasas importantes para el desarrollo
de insectos que sean eficaces en el retardo de la muda. Ninguno de
ellos se ha utilizado para obtener plantas transgénicas resistentes
a insectos.
En teoría, parece existir un alto potencial para
la utilización de inhibidores de peptidasas en el control de
insectos resistentes a los insecticidas químicos. En primer lugar,
el mecanismo de acción de la inhibición de las peptidasas es
diferente del mecanismo de acción de los organofosfatos y
piretroides sintéticos. En segundo lugar, la secuencia aminoácida de
los centros activos de las peptidasas parece estar muy conservada
(Taylor, 1993), lo que indica un bajo potencial de mutación sin la
consiguiente pérdida de actividad. Finalmente, en el caso de que
aparezca resistencia de los insectos a un inhibidor de peptidasas
particular, esta resistencia no debería trasladarse a otras etapas
metabólicas mediadas por peptidasas.
Sin embargo, hay problemas importantes asociados
a la utilización de inhibidores de peptidasas para el control de
insectos. Puede ser necesaria una elevada tasa de utilización, dando
lugar a un producto que no es rentable. Es más, aunque el inhibidor
de peptidasas puede limitar el crecimiento larvario, es posible que
se alcance una meseta en la curva de
dosis-respuesta, incluso a tasas elevadas de
utilización. Los inhibidores de peptidasas peptídicos o proteicos,
aunque presumiblemente no aportan residuos al medio ambiente, pueden
ser difíciles de almacenar durante períodos prolongados, y pueden
perder eficacia cuando se suministran en agua dura. Puede ser
necesario resolver algunos problemas difíciles relativos al origen
de un inhibidor enzimático particular. Por ejemplo, se han observado
respuestas anómalas en la inhibición del crecimiento de
Costelytra zealandica por el inhibidor de tripsina de soja,
de patata y de judía de vaca, y estimulación del crecimiento por el
inhibidor de tripsina de judías de Lima (Dymock et al,
1992).
1992).
Un considerable esfuerzo investigador se ha
centrado en investigaciones bioquímicas del metabolismo proteico de
insectos, principalmente el metabolismo digestivo, utilizando
tejidos de insectos, extractos intestinales, enzimas semipurificadas
o purificadas in vitro.
Buena parte de este trabajo se ha dirigido a la
selección de inhibidores enzimáticos para la modificación
transgénica de plantas mediante la investigación de la relación de
las enzimas digestivas con inhibidores proteicos o peptídicos
(Applebaum, 1985; Christeller et al, 1989, 1990, 1992; Lenz
et al, 1991; Teo et al, 1990; Pritchett et al,
1981, Santos y Terra, 1984; Dow, 1986; Sakal et al, 1984,
1989).
Un número relativamente menor de estudios
demuestran una influencia negativa directa de los inhibidores de
peptidasas en el crecimiento y/o la reproducción de insectos. Se ha
demostrado que los inhibidores de serina- y
cisteína-peptidasas reducen el crecimiento larvario
y/o la supervivencia de varios insectos, entre ellos:
Callosobruchus macalatus, Leptinotarsa
decemlineata, Heliothis spp, Spodoptera exiqua,
Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus,
Diabrotica sp, Manduca sexta, el escarabajo de la
harina y el escarabajo de la legumbres (Gatehouse y Boulter, 1983;
Shuckle y Murdock, 1983; Shade et al, 1986; Wolfson y
Murdock, 1987; Broadway y Duffey, 1986; Hilder et al, 1987;
Dymock et al, 1992; Orr et al, 1994; Burgess et
al, 1994; Hines et al, 1990).
Generalmente, la inhibición del crecimiento de
insectos se ha conseguido con inhibidores de las principales enzimas
digestivas intestinales; y un método para la selección de
inhibidores apropiados con actividad insecticida basados en estas
enzimas ha sido descrito por Christeller et al (1992).
Ninguno de los estudios anteriores parece
directamente dirigido a la producción de agentes tópicos para el
control de insectos por medio de la interferencia con el metabolismo
de proteínas. Sin embargo, en la solicitud internacional de patente
nº W094/16565, de Czapla, una reivindicación menor cita la
utilización tópica de aprotinina u otro inhibidor de
serina-peptidasas con 90% de homología con la
aprotinina para el control del taladro europeo del maíz (ECB) y de
la larva del escarabajo manchado del pepino (SCR). Se afirmó que la
aprotinina podría utilizarse sola o en combinación con una lectina
insecticida. Czapla comprobó que la incorporación de aprotinina en
la dieta a una concentración de 20 mg/ml mataba el 100% de las
larvas neonatas del ECB en un ensayo de laboratorio, y mataba el 60%
de las larvas neonatas del SCR. Sería difícil alcanzar tasas de
ingestión tan altas mediante aplicación tópica, y los costes del
tratamiento no serían probablemente competitivos con los
insecticidas químicos. Czapla comprobó que el inhibidor de
serina-peptidasas SBTI (Kunitz y
Bowman-Birk) y el inhibidor de
cisteína-peptidasas cistatina eran menos eficaces
que la aprotinina.
La alimentación directa con SBTI a insectos que
se alimentan de sangre ha sido investigada por Deloach y Spates
(1980), que comprobaron un aumento de la mortalidad y una
disminución de la eclosión de los huevos cuando se encapsuló SBTI en
eritrocitos bovinos y se utilizó como cebo para la mosca de los
cuernos. Se conocen varios inhibidores naturales de peptidasas
(principalmente de serina-peptidasas) en la sangre.
Sin embargo, tienen una eficacia limitada en la protección del
animal del ataque de los insectos (Sandeman et al, 1990).
Wolfson y Murdock (1987) observaron que, aunque
había una extensa documentación sobre la presencia y distribución de
inhibidores de peptidasas en plantas, y estos inhibidores se supone
que están dirigidos a peptidasas digestivas de insectos, hay pocas
pruebas directas que apoyen su acción eficaz en la inhibición del
crecimiento y desarrollo de insectos. Estos autores demostraron que
podía lograrse la reducción del crecimiento larvario en el
escarabajo de la patata añadiendo E-64 (un inhibidor
de cisteína-peptidasas) a niveles umbral de 50
\mug/ml en las hojas de la patata. Sin embargo, en un nivel de
aplicación muy superior (1000 \mug/ml) se encontró una meseta en
la mortalidad del 74-85%, que es insuficiente en la
práctica. Los SBTIs (Kunitz y Bowman-Birk) no fueron
eficaces como retardadores del crecimiento, y se encontró sólo una
pequeña respuesta a la pepstatina.
Un artículo de investigación publicado por Dymock
et al (1992) ha examinado la inhibición del crecimiento de
larvas de un coleóptero (gorgojo de Nueva Zelanda) por inhibidores
de peptidasas. La investigación se centró en la transformación
genética de importantes especies de pastos, ya que los gorgojos se
alimentan de las raíces. Los bioensayos mostraron inhibición del
crecimiento utilizando inhibidores de
serina-peptidasas. Se observaron algunas respuestas
anómalas a inhibidores particulares (inhibición por SBTI, POT I, POT
II, CpTI, estimulación por LBTI). Cristeller et al (1989)
había identificado previamente la tripsina como la principal
peptidasa intestinal en el gorgojo anterior, a pesar del hecho de
que, normalmente, las peptidasas intestinales de coleópteros son
predominantemente del tipo de cisteína-peptidasas.
Generalmente, la tasa de utilización de inhibidores de peptidasas
necesaria para conseguir la mortalidad era demasiado elevada para
ser rentable en utilización tópica.
Las composiciones que funcionan mediante la
inhibición de metalopeptidasas (incluidas aminopeptidasas o LAP) no
se han desarrollado comercialmente para el control de insectos. De
hecho, la materia antecedente desaconseja la utilización de
inhibidores peptídicos de aminopeptidasas o de metalopeptidasas para
el control de insectos, debido a que:
(a) no se han identificado inhibidores eficaces
de la categoría anterior adecuados para la transformación genética
de plantas,
(b) el papel aparente de estas enzimas es menor,
comparado con las actividades dominantes de cisteína- y/o
serina-peptidasas en el intestino de insectos.
Shenvi (1993) ha examinado la utilización de
derivados del ácido \alpha-aminoborónico como
inhibidores eficaces de aminopeptidasas de mamíferos. Shenvi observó
que ciertos intermediarios en la síntesis de derivados del ácido
\alpha-aminoborónico
\alpha-tienen propiedades insecticidas; sin
embargo, estos intermediarios carecían de grupo amino, y se suponía
que de ningún modo actuaban como inhibidores de aminopeptidasas o
inhibidores de peptidasas.
El agente quelante de metales hexadentado EDTA ha
sido reconocido por Samuels y Paterson (1995) y por Ferreira y Terra
(1986) como un inhibidor de una aminopeptidasa procedente del
líquido de la muda y de las membranas digestivas. No se ha
reconocido ningún efecto insecticida del EDTA; sin embargo, Tomalia
y Wilson (1985, 1986) han hecho indicaciones generales de la acción
insecticida de los agentes quelantes de metales. No se presentaron
pruebas en apoyo de esta idea. Sería esperable que la utilización de
agentes quelantes de metales para el control de insectos estuviese
influida de modo negativo por la utilización de agua dura para la
aplicación por pulverización, o en el caso de que hubiese
contaminación mineral o con el suelo, de los materiales que se van a
tratar.
Sorprendentemente, hemos comprobado ahora que las
composiciones que comprenden un inhibidor de aminopeptidasas o un
inhibidor de metalopeptidasas y que comprenden además un inhibidor
de peptidasas que no es un quelante potente son capaces de prevenir
la eclosión de huevos de insectos y/o el desarrollo de larvas de
insectos. El experto en la materia apreciará que la inmensa mayoría
de los inhibidores de aminopeptidasas son, en realidad, quelantes
poco potentes, en el sentido en que se define este término en la
presente memoria.
Se entenderá claramente que la invención es
aplicable al control de insectos por medio de diversos mecanismos.
Los métodos de la invención pueden dar lugar, por ejemplo, a la
muerte de los insectos o a la interrupción del crecimiento y
desarrollo de los insectos, de modo que la maduración se ralentiza o
se impide. La prevención de la eclosión de huevos de insectos es
particularmente deseable, ya que muchos insectos importantes desde
el punto de vista económico provocan daños como resultado de la
actividad alimenticia de sus larvas.
Se entenderá asimismo que, debido a la amplia
variación en las capacidades bioquímicas individuales dentro de los
miembros de la clase Insecta, las respuestas a inhibidores
particulares y/o combinaciones de inhibidores variarán entre
especies. Por tanto, es posible que algunas composiciones dentro del
alcance de la presente invención sean poco eficaces o incluso
ineficaces contra algunos insectos, siendo al mismo tiempo muy
eficaces contra otros. También pueden observarse variaciones en las
respuestas entre distintas subespecies o en diferentes etapas del
ciclo vital en insectos particulares, o incluso en la dieta de los
insectos. Los expertos en la materia serán capaces de relacionar los
inhibidores pertinentes con los insectos diana, aplicando las
pruebas normales de ensayo y error en el laboratorio y la
experimentación sobre el terreno.
El experto en la materia podrá apreciar que la
invención puede utilizarse de diversas formas, incluidas, pero sin
limitarse a las mismas:
(a) control de la infestación por insectos por
aplicación directa a una planta o animal vulnerable a dicha
infestación;
(b) reducción del número de insectos aplicando
los agentes de la invención en el hábitat de los insectos o en los
lugares en los que se reproducen;
(c) control, ya sea mediante profilaxis o
reducción en la gravedad, de las infecciones de plantas o animales
transmitidas por insectos; y
(d) control, ya sea mediante profilaxis o
reducción en la gravedad, de las infecciones de plantas o animales
que son consecuencia de la infestación por insectos.
Para los efectos de la presente especificación,
el término "inhibidor de peptidasas" debe entenderse como
cualquier compuesto capaz de inhibir cualquier peptidasa.
En la práctica, un inhibidor de peptidasas puede
identificarse mediante el siguiente procedimiento.
- 1.
- Seleccionar peptidasas activas representativas, que pueden estar purificadas o en composiciones que comprenden la enzima activa.
- 2.
- Seleccionar un ensayo de actividad enzimática para cada una de las peptidasas representativas, mediante la selección de un sustrato apropiado para la enzima y condiciones para la reacción, de modo que se obtenga un criterio de valoración apropiado cuantificable en un período de tiempo práctico.
- 3.
- El compuesto de prueba se considera un inhibidor de peptidasas si se comprueba una inhibición del 50% o superior en cualquiera de los ensayos de actividad enzimática anteriores.
Específicamente, un inhibidor de metalopeptidasas
o un inhibidor de aminopeptidasas pueden ser identificados de este
modo.
El término "inhibidor de peptidasas que no es
un quelante potente" debe entenderse como un inhibidor de
peptidasas capaz de quelar iones Zn^{2+} de forma menos potente
que el EDTA en una evaluación de unión competitiva. Tanto el EDTA
como el inhibidor deben estar a la misma concentración en la mezcla
de reacción, que puede ser en la práctica 0,1 mM. El experto en la
materia será capaz de escoger las condiciones de reacción apropiadas
y los métodos para determinar la distribución de Zn^{2+} (por
ejemplo, utilizando resonancia magnética multinuclear (NMR),
espectroscopía UV, técnicas voltamétricas y espectroscopía de masas
con ionización débil).
En un aspecto, la invención comprende una
composición para el control de insectos, comprendiendo dicha
composición un inhibidor de aminopeptidasas o un inhibidor de
metalopeptidasas, y comprendiendo, además, un inhibidor de
peptidasas que no es un quelante potente.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede comprender un grupo amino o un derivado del
mismo, o uno o más grupos aminoácidos o derivados de los mismos.
Preferiblemente el inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas comprende un grupo de leucina, arginina, metionina,
aspártico, alanina, glutamilo, prolilo, valilo o cisteína, o un
derivado de los mismos. Más preferiblemente, el inhibidor de
aminopeptidasas o el inhibidor de metalopeptidasas comprende un
grupo de leucina o un derivado del mismo.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede interaccionar con un ion o iones metálicos en
el centro activo de la metalopeptidasa o aminopeptidasa.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede comprender un agente quelante, que es
preferiblemente un agente quelante bidentado, tridentado,
cuatridentado o hexadentado. Preferiblemente el agente quelante es
un grupo de ácido aminocarboxílico, o una sal del mismo, que tiene
acción quelante, y más preferiblemente es ácido
etilendiaminotetraacético, o es ácido nitrilotriacético, o una sal
de los mismos, o un derivado de los mismos que tiene acción
quelante.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede comprender un ion de un metal de transición
hidrosoluble o complejo o derivado seleccionado a partir del grupo
formado por cobre, cobalto, cinc, vanadio, magnesio, manganeso y
hierro.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede comprender un grupo borónico, fosforilo o
fosfonilo.
\newpage
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede unirse de forma irreversible a una
aminopeptidasa o metalopeptidasa.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede comprender un inhibidor selectivo que no
inhibe tripsina o calpaína, y que preferiblemente no inhibe otras
serina- o cisteína-peptidasas.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas puede inhibir una enzima seleccionada a partir del
grupo formado por leucina-aminopeptidasas,
aminopeptidasas de tipo A, B, N y M,
arginina-aminopeptidasas,
metionina-minopeptidasas,
D-aminoácido aminopeptidasas,
peptidil-dipeptidasas,
cinc-aminopeptidasas,
N-formil-metionina-aminopeptidasas,
dipeptidil-aminopeptidasas, carboxipeptidasas de
tipo A y B, tripeptidil-peptidasas,
dipeptidil-peptidasas y
peptidil-tripeptidasas.
Preferiblemente el inhibidor de aminopeptidasas o
el inhibidor de metalopeptidasas es capaz de inhibir una
leucina-aminopeptidasa, y más preferiblemente inhibe
una leucina-aminopeptidasa de insectos.
El inhibidor de peptidasas que no es un quelante
potente puede comprender un inhibidor de
serina-peptidasas, un inhibidor de
cisteína-peptidasas, un inhibidor de aspartil
peptidasas, o un inhibidor de aminopeptidasas. Inhibidores adecuados
para su utilización en la invención incluyen, pero sin limitarse a
los mismos:
- -
- inhibidores de tripsina y quimotripsina, tales como Pefabloc
- -
- inhibidores de serina- o cisteína-peptidasas derivados de legumbres, verduras, frutas o cereales;
- -
- cistatinas y E-64;
- -
- inhibidores de carboxipeptidasas derivados de la patata o de otras fuentes;
- -
- Eglin C;
- -
- L-leucinatiol.
Los inhibidores de tripsina y quimotripsina
incluyen, pero sin limitarse a los mismos, inhibidor de tripsina de
Kunitz (SBTI), inhibidor de tripsina y quimotripsina de
Bowman-Birk, inhibidor de tripsina de soja,
inhibidor de tripsina de páncreas bovino, inhibidor de tripsina de
ovomucoide de pollo, inhibidor de tripsina de Cucurbit
maxima, inhibidor de tripsina POT-I y
POT-II,
alfa-1-antitripsina, inhibidor de
tripsina de sagitaria, inhibidor de tripsina de eritrina, e
inhibidor de inter-alfa-tripsina
humano.
Los inhibidores de serina o
cisteína-peptidasa procedentes de legumbres,
verduras, frutas o cereales incluyen, pero sin limitarse a los
mismos, inhibidores de peptidasas de judía roja, de judía de vaca,
guisantes, judía alada, judía mungo, mostaza, calabacín, escaravea,
guisante cajún, algodón, maíz, trigo, sorgo, colza, mijo, cebada y
calabaza.
Las cistatinas incluyen, pero sin limitarse a las
mismas, orizacistatina I y II de arroz, multicistatina de patata y
sus subunidades tras la digestión con tripsina, y cistatina de huevo
de gallina.
En todos los casos de la presente memoria en los
que se hace referencia a inhibidores de peptidasas por su nombre
común, la referencia pretende incluir análogos de estos inhibidores,
es decir, inhibidores con estructura y/o características
inhibitorias similares (interacciones con el centro o centros
activos de la enzima diana) a los de la sustancia o sustancias
habitualmente reconocidas
Los análogos apropiados pueden ser porciones de
dicho inhibidor, conjugados de los mismos, o sustancias con por lo
menos 70% de homología, preferiblemente por lo menos 80% de
homología, y más preferiblemente por lo menos 90% de homología con
dicha sustancia.
La composición de la invención también puede
comprender opcionalmente uno o más aditivos tales como dispersantes,
modificadores de la viscosidad, agentes anticongelantes,
humectantes, codisolventes, absorbentes de la radiación UV,
colorantes y excipientes que son aceptables para su utilización
farmacéutica, veterinaria, agrícola u hortícola.
En una realización, la composición de la
invención comprende un inhibidor de aminopeptidasas seleccionado a
partir del grupo formado por L-leucinatiol,
actinonina, bestatina, 1,10-fenantrolina y EDTA,
junto con un péptido inhibidor que no es un quelante potente,
seleccionado a partir del grupo formado por SBTI, Pefabloc y
antipaína.
El inhibidor de aminopeptidasas o el inhibidor de
metalopeptidasas o el inhibidor de peptidasas que no es un quelante
potente comprende preferiblemente un péptido, polipéptido y/o
proteína.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para controlar insectos, que comprende la etapa de exponer
dichos insectos a una composición según la invención.
Preferiblemente los insectos se controlan
inhibiendo la eclosión de los huevos de los insectos y/o inhibiendo
el desarrollo de las larvas de los insectos, mediante la exposición
de dichos huevos o larvas de insectos a una composición de la
invención.
Preferiblemente el insecto es una especie de un
orden seleccionado a partir del grupo formado por Lepidoptera,
Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Hymenoptera,
Dictyoptera, Isoptera, Thysanoptera, Homoptera, Diptera, Anaplura,
Malophaga y Siphonaptera. Más preferiblemente el insecto se
selecciona a partir del grupo formado por moscas miásicas, orugas de
los brotes, pulgas, grillos comunes, cucarachas, polilla marrón
clara del manzano e insectos que infestan cereales almacenados o
productos derivados de cereales.
Según el método de la invención, el insecto diana
puede exponerse al inhibidor enzimático por cualquier medio
adecuado. El experto en la materia apreciará que estos medios pueden
variar considerablemente, en función de si el inhibidor va a
aplicarse a una planta o a un animal, y en función de la naturaleza
del insecto diana y de la planta o animal. Los medios adecuados para
aplicar los inhibidores enzimáticos directamente a una planta o
animal que sufre el ataque del insecto pueden diferir
considerablemente de los medios adecuados para aplicar el inhibidor
enzimático en el hábitat de los insectos o en sus lugares de
reproducción.
Los medios adecuados de aplicación de los
inhibidores enzimáticos a los animales incluyen, pero sin limitarse
a los mismos, aplicación tópica directa, tal como inmersión o
pulverización, o aplicación interna, tales como aspersión oral,
implantes, formulaciones de bolos de liberación retardada o
dispositivos adaptados para la retención en el rumen y cebos y
comprimidos para insectos. En el caso de que los agentes de la
invención se apliquen a los seres humanos, las formulaciones
adecuadas para la aplicación tópica incluyen, pero sin limitarse a
los mismos, pulverizadores, aerosoles, cremas y lociones, y las
formulaciones adecuadas para su aplicación interna incluyen, pero
sin limitarse a los mismos, comprimidos, cápsulas o formulaciones
líquidas. En algunas situaciones, la administración parenteral por
inyección puede ser el medio más adecuado de tratamiento para los
seres humanos o para los
animales.
animales.
En el caso de que el inhibidor enzimático se vaya
a aplicar a plantas, los medios adecuados incluyen, pero sin
limitarse a los mismos, pulverizadores, polvos, tabletas, o
aerosoles. El método de la invención también abarca la utilización
concurrente o sucesiva de dos o más inhibidores de metalopeptidasas,
o la utilización de uno o más inhibidores de metalopeptidasas o de
aminopeptidasas junto con uno o más inhibidores de otros tipos de
enzimas, uno o más inhibidores de otros procesos fisiológicos de
insectos, o uno o más agentes insecticidas distintos,
independientemente de que estos otros inhibidores se suministren por
vía tópica, interna o a través de modificación
transgénica.
transgénica.
Algunos inhibidores útiles para los propósitos de
la invención son de naturaleza peptídica, polipeptídica o
proteica.
En realizaciones preferidas, no limitantes, de la
invención:
(a) Los animales tratados mediante los métodos de
la invención se seleccionan a partir del grupo formado por seres
humanos, ovejas, vacas, caballos, cerdos, aves de corral, perros y
gatos.
(b) Las plantas tratadas mediante los métodos de
la invención se seleccionan a partir del grupo formado por algodón,
cultivos para la obtención de aceite de semillas, plantas
ornamentales, flores, árboles frutales, cultivos de cereales,
cultivos de vid, cultivos de raíces, plantas para pasto y
verduras.
(c) Los insectos que se han de controlar en el
caso de aplicaciones hortícolas y de cultivo a gran escala de la
invención son Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera,
Isoptera, Thysanoptera o Homoptera, en el caso de infecciones
transmitidas por insectos a los animales, son Diptera, Anaplura,
Malophaga o Siphonaptera, o en el caso de plagas domésticas o
industriales son Isoptera, Dictyoptera e Hymenoptera.
La invención se describe a continuación de forma
detallada, haciendo referencia sólo a los siguientes ejemplos no
limitantes.
Los siguientes ejemplos demuestran la inhibición
del crecimiento de insectos o las actividades insecticidas obtenidas
en la utilización de la invención. Deberá entenderse, sin embargo,
que también pueden emplearse otros métodos y aplicaciones. Los
efectos de inhibidores de serina- y
cisteína-peptidasas, por separado, (que no se
encuentran dentro del campo de la presente invención) se incluyen
para ilustrar la variabilidad interespecífica en las respuestas a
los inhibidores, o para dar ejemplo de los beneficios aditivos o
sinérgicos obtenidos como consecuencia de la utilización de la
invención.
Método
Las larvas eclosionaron de los huevos que habían
sido esterilizados en la superficie con hipoclorito de sodio al 0,5%
e incubados durante toda la noche a 27ºC. Se recogieron las larvas
del primer estadio y se colocaron en 1 ml de medio de cultivo
esterilizado en autoclave con o sin inhibidor(es) añadidos,
según lo requerido. El medio de cultivo constaba de agar al 2%,
caseína al 10%, levadura al 2% y glucosa al 0,5% en agua destilada
en un vial o botella estéril. Se colocaron de cinco a cincuenta
larvas, en función de la duración del cultivo, en cada botella, que
se cerró después utilizando una tapa con una malla de plástico fina
insertada. Este tapón permitió el intercambio libre de aire en la
botella.
Las botellas se colocaron después en el interior
de un recipiente estéril grande, que fue sellado, para impedir el
contacto con el medio ambiente. El recipiente incorporaba tubos de
entrada y salida conectados a una fuente de aire húmedo caliente
estéril y a una bomba de vacío, respectivamente. Tanto el aparato
como las botellas de cultivo se mantuvieron a 35ºC durante 24 a 72
horas. Así se permitió el crecimiento de las larvas hasta los
estadios de desarrollo deseados.
Los cultivos se establecieron en una campana de
flujo estéril y se incubaron en un ambiente estéril, para reducir al
mínimo la posibilidad de contaminación por bacterias, que podrían
fomentar u obstaculizar el crecimiento larvario, invalidando de este
modo los resultados. Tras el período de cultivo planificado, se
sacaron las botellas y se sacrificaron las larvas por congelación.
Se secaron y pesaron, ya sea de forma colectiva o individual.
El peso de las larvas de insectos en los cultivos
testigo (larvas mantenidas en cultivo al mismo tiempo, en las mismas
condiciones ambientales y alimenticias, aunque sin inhibidores) se
comparó a continuación con el peso de las larvas mantenidas en
cultivo con inhibidores, y se calculó el porcentaje de inhibición
(I) según la fórmula:
I =
\frac{c-a}{c} \ x \
100
en la
que
a = peso de las larvas en presencia del inhibidor
y
c = peso de las larvas testigo.
Se han probado un gran número de inhibidores en
este sistema de cultivo y se presenta una selección de los mismos en
la Tabla 1.1. Los efectos de los inhibidores en el primer estadio
del crecimiento larvario y en la supervivencia se exponen en la
Tabla 1.2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}{14cm} * A no ser que se indique lo contrario,
los inhibidores enzimáticos son solubles en solución salina
tamponada con fosfato o en agua. Aquellos que sólo son solubles en
DMSO/H _{2} O o MeOH/H _{2} O se compararon con los tratamientos de
los testigos que incluían las mismas cantidades de DMSO o de
MeOH.\end{minipage} \cr}
Nuestros resultados indican que los inhibidores
que afectaban a las enzimas del tipo de la tripsina son eficaces en
la ralentización del crecimiento larvario, o en el caso del TLCK, en
la muerte de las larvas a las máximas concentraciones probadas. El
E64, un inhibidor de cisteína-peptidasas, no fue
eficaz; sin embargo, los efectos del inhibidor calpaína en el
crecimiento, y la inhibición intermedia por la leupeptina y el APMS
(inhibidores no específicos de cisteína) indican que es posible que
las cisteína-peptidasas desempeñen una función
esencial.
La ineficacia de la inhibición de
aspartil-peptidasa(s) por la pepstatina
concuerda con lo descrito previamente en la literatura.
El resultado sorprendente de este experimento fue
la influencia dominante de algunos inhibidores de aminopeptidasas en
el crecimiento larvario. Estos resultados indicaban que la
inhibición de aminopeptidasa(s) de las larvas fue eficaz.
L-leucinatiol, EDTA,
1,10-fenantrolina, bestatina, amastatina, leuhistina
y actinonina fueron eficaces
inhibidores del crecimiento. Los inhibidores de dipeptidilamino-peptidasa (Diprotina A) y metionina-aminopeptidasa (Ebalactona) no fueron eficaces.
inhibidores del crecimiento. Los inhibidores de dipeptidilamino-peptidasa (Diprotina A) y metionina-aminopeptidasa (Ebalactona) no fueron eficaces.
- (a)
- Utilización de combinaciones de inhibidores de serina- y de serina:aminopeptidasas.
Los datos de las pruebas presentados en el
Ejemplo 1 indican que las combinaciones de inhibidores que afectan a
enzimas del tipo de la tripsina y/o aminopeptidasas pueden tener
efectos aditivos o sinérgicos. Se llevaron a cabo experimentos
adicionales para examinar esta posibilidad utilizando métodos
previamente descritos. Los resultados se presentan en la Tabla
2.1.
Se observó un escaso efecto al combinar SBTI y
leupeptina o Pefabloc. Se obtuvo un efecto moderado con SBTI y EDTA.
Tuvo lugar una mayor inhibición cuando se probó SBTI con TLCK o
L-leucinatiol. Los resultados indican que la
inhibición múltiple de peptidasas del tipo de la tripsina y
aminopeptidasas tienen un efecto inhibidor útil en las larvas.
- (b)
- Investigación del efecto de la combinación de un inhibidor de serina- peptidasas (SBTI) con un inhibidor de aminopeptidasas (L-leucinatiol) sobre la inhibición del crecimiento de las larvas de L. cuprina
Se investigó el efecto en el crecimiento larvario
de los inhibidores SBTI y L-leucinatiol,
combinados, a diversas concentraciones para examinar la posibilidad
de inhibición sinérgica. Este experimento se dio por terminado antes
de que apareciese una mortalidad significativa. Los resultados se
presentan en la Tabla 2.2.
- (c)
- Investigación del efecto de la combinación de dos inhibidores de aminopeptidasas (EDTA y L-leucinatiol) sobre el crecimiento de las larvas de L. cuprina
Los resultados de estos experimentos se exponen
en la Tabla 2.3
Los siguientes experimentos se realizaron para
verificar si las composiciones de la invención podían desempeñar un
papel insecticida mediante la inhibición de la eclosión de los
huevos.
Se depositaron huevos de L. cuprina en
pedazos de hígado (0,9 g) colocados en pocillos individuales de una
placa de cultivo de a 24 pocillos. Se añadió solución salina
tamponada con fosfato (PBS, 0,1 ml), que contenía inhibidores a
concentraciones fijas, a cada pocillo con 30 huevos de L.
cuprina recién depositados y esterilizados. A continuación se
mantuvo la placa de cultivo en un ambiente estéril a 35ºC durante 24
horas, después de lo cual se evaluó el porcentaje de eclosión.
Se cultivaron huevos de Heliothis en un
medio definido (3 g de caseína, 3 g de gérmen de trigo, 5 g de
sacarosa, 2,25 g de agar, 5 mg de comprimidos de multivitamina B,
disueltos en 80 ml de PBS con penicilina y estreptomicina) en placas
de cultivo de a 24 pocillos (2 huevos/pocillo). La eclosión de los
huevos se evaluó tras 3 días de incubación a 27ºC. Los resultados se
presentan en la Tabla 3.1.
En ensayos iniciales in vitro, diez huevos
de Heliothis no eclosionaron en una mezcla de SBTI 0,17 mM y
actinonina 5 mM mientras que los huevos testigo eclosionaron.
Se preparó una dieta artificial de la siguiente
manera:
| Alubias | 466 gramos (g) |
| Germen de trigo | 100 g |
| Levadura | 70 g |
| Ácido ascórbico | 70 g |
| Parabeno | 44 g |
| Ácido sórbico | 2,2 g |
| Agar | 28 g |
| H_{2}O | 800 ml |
| *Ácidos fosfórico y propiónico | 4 ml |
* La solución madre de ácidos fosfórico y
propiónico contenía
| 29 ml | de ácido propiónico | |
| 21 ml | de ácido ortofosfórico | |
| 270 ml | de dH_{2}O | |
| Volumen total | 500 ml |
1. Las alubias se cocinaron en un horno de
microondas durante 40 minutos.
2. Se añadió agar al agua caliente y se agitó en
una placa calefactora casi hasta ebullición.
3. La alubias, la mezcla de agar, la levadura y
el germen de trigo se mezclaron en una mezcladora eléctrica durante
3 minutos.
4. Cuando la temperatura descendió hasta 60ºC, se
añadieron los ácidos y se mezclaron con el medio.
5. Se añadieron soluciones de inhibidores o un
volumen equivalente de agua a tubos de vidrio esterilizados a las
concentraciones indicadas. Se añadió medio artificial a cada tubo
(1,5 ml) utilizando una jeringa estéril de 10 ml. Se añadieron
larvas del primer estadio de Heliothis punctigens (1 larva
por tubo) a los tubos de vidrio y los tubos se cerraron. Los tubos
se incubaron durante 10 días a 25ºC. Las larvas se sacrificaron
colocando los tubos de vidrio a -70ºC durante 24 horas, y después se
pesaron por separado. Se calculó el porcentaje de inhibición, por
comparación con las larvas testigo.
Los resultados se presentan en la Tabla 4.1.
Se extrajo sangre de la vena yugular de una oveja
merina de cinco años que no había sido tratada con agentes contra
ectoparásitos durante 18 meses. La sangre se recogió en un frasco de
plástico de 100 ml que contenía 0,8 ml de heparina y se mantuvo a
4ºC. Los inhibidores se pesaron previamente en viales de plástico
estériles de 5 ml y se añadieron 4,5 ml de sangre. Las muestras se
mezclaron y se colocaron a -70ºC durante 24 horas, después se
liofilizaron. Las muestras liofilizadas se hicieron pasar por un
tamiz de acero inoxidable de 63 micrómetros, y se colocaron en
viales de plástico estériles de 5 ml (0,15 g/por tubo). Se colocaron
cuatro huevos de pulgas en cada vial, y se ajustó una hoja de papel
secante mediante una cinta elástica a la parte superior de casa
vial. Los viales se incubaron a 25ºC y 70-80% de HR
durante 6 días. Después se añadió vermiculita a cada vial, para
proporcionar un medio de soporte para que las pulgas se
transformasen en pupas, y los tubos se incubaron a 25ºC y
70-80% de HR, durante otros 10 días. Se analizaron
diez viales testigo y tres viales de cada tratamiento.
Al final del período de incubación se colocaron
los viales a -20ºC durante 24 horas para matar las pulgas. Se
registró el número de huevos eclosionados y el estadio del ciclo
vital. Los resultados se presentan en la Tabla 5.1.
- (i)
- Las soluciones madre de los inhibidores y las soluciones testigo se prepararon en forma de soluciones o suspensiones acuosas, como se describe en la Tabla 6.1.
- (ii)
- La mortalidad se evaluó comenzando el estudio con las ninfas del primer estadio larvario.
- (iii)
- Se untaron discos de hojas de col (discos de 5 x 8 mm de diámetro/tratamiento) con 100 \mul de soluciones de inhibidor o testigo, y se dejaron secar. Los discos se colocaron por separado en placas de Petri de 40 mm, junto con una almohadilla de algodón húmedo para el suministro de agua y un trozo de plástico agujereado como refugio.
- (iv)
- Se colocaron diez ninfas en cada refugio y los discos se incubaron a 25ºC.
- (v)
- La mortalidad se evaluó diariamente y se separaron los individuos muertos.
Los resultados se presentan en la Tabla 6,1.
Los piojos de oveja son una importante plaga de
insectos en explotaciones agrícolas de Australia y muchos otros
países. Algunas cepas de insectos están desarrollando altos niveles
de resistencia a organofosfatos y piretroides sintéticos. Este
ensayo se realizó para:
- (i)
- ampliar la evaluación de la inhibición del crecimiento o la actividad insecticida de los inhibidores útiles para la invención; y
- (ii)
- evaluar la inhibición del crecimiento o la actividad insecticida de la invención en una cepa de insectos que se sabe que tiene un alto nivel de resistencia a los insecticidas.
La cepa de piojos escogida fue una cepa de
referencia conocida como Hartley. Es muy resistente a piretroides
sintéticos (Tabla 7.1, Levot G. W., Aust. Vet. J., 1992 69
120).
- (i)
- Se recogieron los piojos cortando una pequeña área de lana de una oveja fuertemente infestada y se cubrió el área esquilada durante 1 minuto con un paño de algodón. Los piojos se transfirieron del paño a un recipiente, con ayuda de un cepillo.
- (ii)
- Se aplicaron soluciones o suspensiones madre acuosas de inhibidores a manojos de lana tomados a 40 mm del vellón más cercano a la piel. Se sabía que la oveja donante no había sido tratada con insecticidas durante 2 años, y su lana tenía una longitud de fibra de 100 mm en el momento de esquilar.
- (iii)
- Teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada, se trataron muestras de lana por cuadruplicado por inmersión en soluciones o suspensiones acuosas de inhibidores, se escurrieron y se secaron al aire durante 24 h.
- (iv)
- Las muestras de lana se añadieron a tubos de plástico marcados y cerrados.
- (v)
- Se dejó que los piojos se alejasen de una fuente de luz arrastrándose a través de un papel (como prueba de viabilidad) y se añadieron 10 piojos, en cada caso, de la fase adulta y de los estadio larvarios 3º, 2º y 1º a cada tubo con lana.
- (vi)
- Los tubos se incubaron a 35ºC y 60-80% de HR y se inspeccionaron diariamente.
- (vii)
- Las evaluaciones de viabilidad se realizaron dando por sentado que los piojos incapaces de moverse estaban muertos.
Los resultados se presentan en la Tabla 7.1.
La composición de la invención fue muy eficaz en
piojos de oveja resistentes a insecticidas.
Los insectos se cultivaron en harina integral
limpia, molida y tamizada, obtenida a partir de trigo ecológico. Los
inhibidores colocados en frascos de material previamente pesado se
mezclaron en seco con la harina y los residuos de inhibidores se
enjuagaron en los frascos con un pequeño volumen de agua. Se añadió
agua a la harina y la mezcla se molió de nuevo. La harina impregnada
se transfirió a un vial de 20 ml y se mezcló a conciencia mediante
agitación e inversión.
Se dejó que los individuos adultos de T.
castaneum depositaran sus huevos en la harina; los huevos se
separaron de la harina y se transfirieron uno a uno mediante un pelo
a tubos de micropocillos que contenían una pequeña cantidad de
harina. Cada nivel de tratamiento se llevó a cabo por triplicado,
utilizando 32 pocillos/repetido. Los ensayos se realizaron por
triplicado. Los cultivos se incubaron a 30ºC y 55% de HR.
Después de 6 días, se combinaron los repetidos de
32 pocillos, se contaron las larvas y los números se compararon con
los números en el testigo del tratamiento (sin inhibidor). Las
larvas se clasificaron como "pequeñas" si eran claramente más
pequeñas que las larvas de referencia, o anómalas en caso de
observarse una formación o comportamiento inusual (por ejemplo,
larvas torciéndose o torcidas).
Los inhibidores analizados y los niveles de
dosificación fueron los mismos utilizados en el Ejemplo 4.
(Día
6)
- -
- La eclosión de los huevos no se vio afectada de modo claro el día 6.
- -
- Las larvas se clasificaron como "pequeñas" en todos los niveles de dosificación en el caso de la actinonina y el EDTA, pero fueron normales en el caso de la 1,10-fenantrolina y de otros tratamientos.
El bioensayo para este insecto fue el presentado
para el caso de T. castaneum, con la excepción de que las
incubaciones se llevaron a cabo a 32,5ºC y 70% de HR. Después de 8
días los insectos se separaron de la harina y se pesaron.
Estos resultados se presentan en la Tabla
9.1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La respuesta a los inhibidores individuales de
aminopeptidasas fue variable. La 1,10-fenantrolina
resultó un inhibidor del crecimiento muy eficaz; mientras que el
EDTA fue moderadamente eficaz y las bestatina no fue eficaz.
El experto en la materia apreciará que aunque la
invención se ha descrito con detalle a efectos de claridad y
comprensión, pueden realizarse varias modificaciones y alteraciones
en las realizaciones y métodos descritos en la presente memoria sin
salirse del alcance del concepto de la invención descrita en la
presente especificación.
En las siguientes páginas se presenta la lista de
las referencias citadas en la presente memoria.
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Claims (36)
1. Composición para el control de insectos, que
comprende un inhibidor de aminopeptidasas y un inhibidor de
peptidasas que no es un quelante potente, junto con un excipiente
aceptable para su utilización farmacéutica, veterinaria, agrícola u
hortícola; en la que el inhibidor de peptidasas que no es un
quelante potente puede comprender el inhibidor de aminopeptidasas, y
en la que un inhibidor de peptidasas que no es un quelante potente
es un inhibidor de peptidasas que quela iones Zn^{2+} de modo
menos potente que el EDTA en una evaluación de unión competitiva en
la que tanto el inhibidor como el EDTA están a la misma
concentración en la mezcla de reacción.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que el inhibidor de aminopeptidasas comprende uno o más grupos
aminoácidos o derivados de los mismos.
3. Composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en la que el inhibidor de aminopeptidasas
comprende un grupo de leucina, un grupo de valina, o un derivado de
los mismos.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el inhibidor de aminopeptidasas
comprende un agente quelante o que tiene actividad quelante.
5. Composición según la reivindicación 4, en la
que el inhibidor de aminopeptidasas comprende un agente quelante
bidentado, tridentado, cuatridentado o hexadentado.
6. Composición según la reivindicación 4 o la
reivindicación 5, en la que el agente quelante comprende un grupo de
ácido aminocarboxílico o ácido nitrilotriacético, o una sal o
derivado de los mismos que tiene actividad quelante.
7. Composición según la reivindicación 6, en la
que el agente quelante comprende ácido etilendiaminotetraacético, o
una sal o derivado del mismo que tiene acción quelante.
8. Composición según la reivindicación 1, en la
que el inhibidor de aminopeptidasas o comprende un ion de metal de
transición o un complejo o derivado de dicho ion, en el que el ion
se selecciona a partir del grupo formado por cobre, cobalto, cinc,
magnesio, manganeso, vanadio y hierro.
9. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el inhibidor de aminopeptidasas
comprende un grupo borónico, fosforilo o fosfonilo.
10. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que el inhibidor de aminopeptidasas se
une de modo irreversible a una aminopeptidasa.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la que el inhibidor de aminopeptidasas
no inhibe tripsina o calpaína.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el inhibidor de aminopeptidasas
no inhibe serina- o cisteína-peptidasas.
13. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que el inhibidor inhibe la actividad
de una enzima seleccionada a partir del grupo formado por
leucina-aminopeptidasas, aminopeptidasas de tipo A,
B, N y M, arginina-aminopeptidasas,
metionina-aminopeptidasas,
D-aminoácido-aminopeptidasas,
peptidil-dipeptidasas,
cinc-aminopeptidasas,
N-formil-metionina-aminopeptidasas,
dipeptidil-aminopeptidasas, carboxipeptidasas de
tipo A y B, tripeptidil-peptidasas,
dipeptidil-peptidasas y
peptidil-tripeptidasas.
14. Composición según la reivindicación 13, en la
que el inhibidor inhibe la actividad de una
leucina-aminopeptidasa.
15. Composición según la reivindicación 14, en la
que el inhibidor inhibe la actividad de una
leucina-aminopeptidasa de insectos.
16. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que el inhibidor de peptidasas que no
es un quelante potente comprende un inhibidor de
serina-peptidasas, un inhibidor de
cisteína-peptidasas, un inhibidor de
aspartil-peptidasas o un inhibidor de
aminopeptidasas.
17. Composición según la reivindicación 16, en la
que el inhibidor de peptidasas que no es un quelante potente se
selecciona a partir del grupo formado por inhibidores de tripsina y
quimotripsina.
18. Composición según la reivindicación 16, en la
que el inhibidor de peptidasas que no es un quelante potente
comprende Eglin C.
19. Composición según la reivindicación 16, en la
que el inhibidor de peptidasas que no es un quelante potente
comprende Pefabloc.
20. Composición según la reivindicación 16, que
comprende SBTI y EDTA.
21. Composición según la reivindicación 16, que
comprende L-leucinatiol y EDTA.
22. Composición según la reivindicación 16, que
comprende Pefabloc y EDTA.
23. Composición según la reivindicación 16, que
comprende actinonina y SBTI.
24. Composición según la reivindicación 16, que
comprende L-leucinatiol y SBTI.
25. Composición según la reivindicación 16, que
comprende 1,10-fenantrolina y SBTI.
26. Composición según la reivindicación 16, que
comprende Bestatina y SBTI.
27. Composición según la reivindicación 16, que
comprende antipaína y EDTA.
28. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, en la que el inhibidor de aminopeptidasas o
el inhibidor de peptidasas que no es un quelante potente comprende
un grupo peptídico, polipeptídico o proteico.
29. Método para el control de insectos, que
comprende la etapa de exponer dichos insectos de insectos a una
composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
30. Método según la reivindicación 29, que
comprende la etapa de exponer huevos de insecto o larvas de insecto
a una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28,
de modo que se inhibe la eclosión de los huevos de insecto y/o el
desarrollo de las larvas de insecto.
31. Método según la reivindicación 29 o la
reivindicación 30, en el que el insecto es de un orden seleccionado
a partir del grupo formado por Lepidoptera, Hemiptera, Dictyoptera,
Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Isoptera, Thysanoptera,
Hymenoptera, Homoptera, Diptera, Anoplura, Malophaga y
Siphonaptera.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
el insecto es de un orden seleccionado a partir del grupo formado
por Lepidoptera, Hemiptera, Dictyoptera, Orthoptera, Psocoptera,
Isoptera, Thysanoptera, Hymenoptera, Homoptera, Diptera, Anoplura,
Malophaga y Siphonaptera.
33. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 31, en el que el insecto se selecciona a
partir del grupo formado por moscas miásicas, pulgas, cucarachas,
polillas marrón claro del manzano, grillos, orugas de los brotes e
insectos que atacan cereales y productos almacenados.
34. Método según la reivindicación 33, en el que
el insecto se selecciona a partir del grupo formado por moscas
miásicas, pulgas, cucarachas, polillas marrón claro del manzano,
grillos y orugas de los brotes.
35. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 33, en el que la composición se administra por
vía tópica.
36. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 35, en el que las composiciones se administran
a una planta seleccionada a partir del grupo formado por algodón,
cultivos de semillas para extracción de aceite, plantas
ornamentales, flores, árboles frutales, cultivos de cereales,
cultivos de vid, cultivos de raíces, plantas para pasto y
verduras.
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