JPH04500002A - トランスジエニツク植物におけるフイトクロムの過度の発現 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニック植物におけるフィトクロムの過度の発現関係する出願 この出願は１’９８８年７月２９日提出の米国特許出願第０７／２２６゜３４４ 号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、フィトクロムのポリペプチドのための中断されない解読配列の調製、 このような解読配列を植物の中に導入しそして発現するために使用する組み換え ＤＮＡ構成体、およびフィトクロムを過度に発現するトランスジェニック植物お よびそれらの種子に関する。 発明の背景 植物はある数の光受容体系を使用して環境における光を感する。フィトクロムは これらの光受容体を最もよく特性決定されるものであり、植物のライフサイクル 全体を通じて成長および発育のＷＲ節において重要な役割を演することが示され た。それは植物における広い範囲の生物学的および発育の機能の制御に機能的に 含まれることが示され、この酔うな制御は発芽する実生の脱黄化、色素体タンパ ク質の宿主の合成、例えば、光合成装置の合成の調節、耐陰性の制御および花成 および果実のタイミングの調節のようなプロセスを包含する［概観について、参 照、シュロブシャイヤー（Ｓｈｒｏｐｓｈｉｅｒ）、Ｗ、　、Ｊｒ、および％− （Ｍｏｈ　ｒ）　、Ｈ，（編）、「光形態形成（Ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｒｐｈ ｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｊ、植物生理学の百科辞典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏ ｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、二ｚ−シリーズ、Ｖｏｌ、１６Ａお よび１６Ｂ１スブリンガー・レルラーグ；ベルリン／ハイデルベルグ、１９８３ ］。フィトクロム分子は現在サブユニットのホモシマーであると信じられ、各々 はチオエーテル結合を経てポリペプチドのバックボーンに共有結合した線状テト ラビロールの発色団から成ることが知られている。光受容体のポリペプチド部分 の大きさは、植物種の間で１２０〜１２７キロダルトンで変化する［ピーストラ （Ｖ　ｉ　ｅｒｓｔｒａ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、１６０　：　５２１ −５２８（１９８４）］。フィトクロムは植物の中に２つのスペクトル的に明確 な型で存在する；スペクトルの赤色光（λｍａｘ＝６６０ｎｍ）領域に吸収極大 を有するＰｒ型およびスペクトルの近赤外（λｍａｘ＝７３０ｎｍ）領域に吸収 極大を有するＰｆｒ型。２つの型は光により可逆的に相互転換可能である；Ｐｒ は赤色光を吸収することによってＰｒに変換し、モしてＰｆｒは近赤色光を吸収 することによってＰｒに変換する。 生体内で、赤色光によるＰｆｒへのＰｒの光変換は非常に多数の形態形成の応答 を誘導が、近赤色光によりＰｒへ戻るＰｆｒの再変換はこれらの応答の誘導を無 効にする。フィトクロムが本質的に可逆的調節スイッチとして機能することがで きるようにするのは、この無限に反復可能な光相互変換能力の性質であり、Ｐｒ およびＰｆｒは、それぞれ、分子の生物学的に不活性な型収量活性な型であると 考えられる。光変換の一般論文について、参照、モーゼス（Ｍｏｓｅｓ）および チュア（Ｃｈｕａ）、Ｎ、Ｈ，、サイアンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉ、 Ａｍｅｒ、）、２５８　（４）：　８８−９３　（１９８８）５光受容体による 光感知から核遺伝子の転写のパターンへの通路は未知のままであるが、フィトク ロムの機能は非常に多数の生物学的プロセスのその調節によりよく定義されてい る。結局、光成長した植物における変更するフィトクロムのレベルは、植物の発 育を調節する複雑な発育系に非侵略的に影響を及ぼす独特の機会を提供するであ ろうといえる。さらに、フィトクロムは植物のライフサイクル全体を通じてこの ような重要な役割を演するので、光成長した植物の細胞中の定常状態のフィトク ロム濃度の変更は、潜在的な耕種学の利益を有しうる、ある数の望ましい成長お よび発育の特性をつくることができる。これらの利益は変更した表現型をもつ遺 伝子操作した植物の形態であることができ、こうしてこれらの新しい表現型は植 物にそれらの正常相手と比較してこの分野において利益を与え、こうして改良さ れた耕種学的価値を有する新しい植物の変異型を生ずる。 さらに、フィトクロム系は、植物組織中のフィトクロムのバランスを調節するプ ロセスと、まだ未知の方法で、相互作用することが知られている。トランスジェ ニック植物中の定常状態のフィトクロムのレベルの変更は、植物の形態と発育の 両者を支配する、種々の内因性植物ホルモンの間のバランスを変化させることが できる。光成長した植物の組織中のフィトクロムのレベルの変更は、正常のフィ トクロムのノくランスの崩壊により、変更した植物の発育および形態の劇的な作 用を有することができ、これにより耕種学的価値を有する新しい特性をもつ植物 を潜在的に生ずる。 植物の成長および形態の変更による光成長した植物中のフィトクロムのレベルを 変更することによって、新しいかつ有用な表現型をつ（るための植物の遺伝子的 変更は、新規な概念である。）＼−シエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら［バーンエイ（ Ｈｅｒｓｈｅｙ）Ｈ，Ｐ、　、／＜−カー（Ｂａｒｋｅｒ）　、Ｒ，Ｆ、　、ア イドラー（Ｉｄｌｅｒ）、に、Ｂ、　、ムレイ（Ｍｕ　ｒ　ｒ　ａ　ｙ）および ファイル（Ｑｕａ　ｉ　］）　、Ｐ、Ｈ，、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６１　：　３３ ９−３４８１は、植物からノフイトクロム遺伝子の配列および組織の最初の最初 の解明を報告した。この遺伝子のヌクレオチド配列は、対応するｃＤＮＡのクロ ーンから誘導された配列とのその遺伝子配列の比較から決定した、そのイントロ ン／エクソンの組織と一緒に提示される。さらに、遺伝子の転写開始部位を示す データが与えられた。その光調節に参加することができるフィトクロム遺伝子の ５゜フランキング領域における配列要素は、他の光調節した遺伝子とのこれらの 要素の相同性に基づいて示唆された。著者らは、トランスジェニック系における その自然のプロモーターをもつフィトクロムを発現することが、フィトクロム遺 伝子の転写の光調節における提案されたプロモーター要素の役割を研究する方法 となり得るかについて考察している。形質転換した植物の表現型への発現または 過度の発現のいずれの価値または効果の開示も存在しない。 ナジイ（Ｎａｇｙ）ら［ナジイ（Ｎａｇｙ）　、Ｆ、カイ（Ｋａｙ）、Ｓ、　Ａ 、およびチュア（Ｃｈｕａ）　、Ｎ、Ｈ，、トレンズ・イン・ジエネティックス （Ｔｒｅｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、４：３７−４２（１９８８）］は、 フィトクロムの研究の状態を概観しており、ＰｒからＰｆｒへの赤色光誘導光変 換から、フィトクロムにより調節される遺伝子の発現における変化に導（、シグ ナル形質導入の通路の解明を強調している。シグナル形質導入についての考察の 背景として、著者らは、光受容体の性質、そのタンパク質構造、植物中のおよび 細胞内のその局在化、その異なる型、およびフィトクロムの解読配列をクローニ ングする努力の状態を考察している。フィトクロム制御される遺伝子の転写の調 節の性質が考察されており、この調節に参加するＤＮＡ配列および相互作用する タンパク質について強調されている。遺伝子の調節およびシグナル形質導入につ いてのモデルが提案された。 ナジイ（Ｎａｇｙ）ら（上に引用した）は、フィトクロムの研究において取るべ き将来の方向を論じており、シグナル形質導入通路についてとくに強調している 。トランスジェニック植物において部位特異的突然変異誘導させたフィトクロム 遺伝子の試験は、フィトクロムのタンノくり賀の構造と変更した発現との間の構 造／機能の関係をよりよく理解する方法として示唆された。これに関して、著者 らは、発現のこれらの変化が他のフィトクロム制御遺伝子に影響を与える方法を 研究する道具として、不適当な細胞の型におけるフィトクロムの過度の発現およ び／または光受容体の発現を提案している。彼らは、また、光受容体の機能的構 造を変更することによって、フィトクロムのタンノくり質の中に優生突然変異を つくって、シグナル形質導入通路を研究することを提案してＬＸる。 著者らは、存在する場合、トランスジエニ・ツク植物中の遺伝子の発現または植 物の全体の応答ヘフイトクロムの発現がどんな作用を有するよりむしろ、光受容 体による遺伝子の発現の調節に、彼らの考察および推測を集中している。さらに 、全植物中のフィトクロムの過度の発現から生じうる潜在的な耕種学の利益の考 察はこの論文の中に存在しなしλ。最後に、トランスジェニック植物中のフィト クロムを、その自然プロモーター上で、あるいはフィトクロムの解読配列を高度 に活性な構成的プロモーターに融合することによって、発現する試みにつＬ）で の報告１才、ナジイ（Ｎａｇｙ）らの論文（上に引用した）に開示されて１％７ ｊ４％。 他の最近概観は、フィトクロムおよび紫外線光受容体による核の光調節およぶ葉 緑体の遺伝子の発現の現在の理解を論考している。［ジヨルダン（Ｊｏｒｄａｎ ）、Ｂ１、トマス（Ｔｈｏｍａｓ）　、およびパーチス（Ｐａｒｔ　ｉ　ｓ）　 、Ｍ、Ｄ、　、１９８６　ＢＣＰＣモノ（Ｍｏｎｏ）Ｎｏ、３４バイオテクノロ ジーおよび作物の改良および保護（Ｂ　ｉ　ｏ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ 　Ｃｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）　、　 ｐｐ、４９−５９　（１９８６）　コ　。　光調節された遺伝子を操作して作物 の生産性を改良できる方法が示唆されている。これらは次のものを包含する：　 １）ＲＵＢＰカルボキシラーゼ分子の突然変異変更および光呼吸に関係する他の 酵素の先革活性；２）チュラロド膜を遺伝子操作して、除草剤抵抗性を与え、そ して低い光条件下のそれらの存在量を増加する；３）光調節した遺伝子からの制 御（プロモーター）配列を使用して、通常光調節されない遺伝子を制御する；お よび４）化成および種子の産生の光層性調節の操作して、これらのプロセスをよ り多く制御すること。光周期の操作に対する特定のアプローチは記載されておら ず、そして既知の植物の光受容体を遺伝子操作して、作物の生産性を変更する可 能性について何も述べられていない。 フィトクロムのレベルが変化する植物を論する唯一の既知の報告は、野生型植物 に比較して特異的に検出可能なフィトクロムのレベルが減少したと思われるトマ トの突然変異体およびアラビドプシス（ａｒａｂｉｄｏｐｓ　ｉ　ｓ）に関する 。突然変異体は黄化した植物に見られるものに多少類似するある特性を表すと報 告され、すなわち、それらはより細長い胚軸を有し、それらの正常の健康な緑色 の相手より黄色がかつており、そして多少増加した頂芽優生を表すように思われ る［クールニーフ（Ｋｏｏｒｎｅｅｆ　ｆ）　、Ｍ、　、Ｄ−ン（Ｃｏｎｅ）　 、Ｊ、Ｗ、　、デケンス（Ｄｅｋｅｎｓ）　、Ｒ，Ｇ、オヘルネーロバーズ（０ ’　Ｈｅｒｎｅ−Ｒｏｂｅｒｓ）、Ｅ、Ｇ、、スブロイト（Ｓｐｒｏｉ　ｔ）　 、Ｃ，Ｊ、Ｐおよびケントリクル（Ｋｎｄｒｉｃｌｅ）　、Ｒ，Ｅ、　、ジャー ナル・オブ・プラント・フィジオロジ−（Ｊ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、） 、１２０　：１５３−１６５　（１９８５）］。収量または潜在的な耕種学的価 値の他の特性への突然変異体の作用に関するデータは示されておらず、そして光 受容体のレベルの突然変異的減少のみが考慮された。 今日まで、完全なフィトクロムのポリペプチドのための中断されない解読配列を 含有するＤＮＡ断片の分離の１つの報告のみが存在する［リッセモア（Ｌｉ　ｓ ｓｅｍｏｒｅ）　、Ｊ、Ｌ、　、コルバー）（Ｃｏｌｂｅｒｔ）、Ｊ、Ｔ、、フ ァイル（Ｑｕａ　ｉ　］）　、Ｐ、Ｈ，、プラント・モレキュラー・バイオロジ ー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、８　：　４８５− ４９６　（１９８７）］。この論文は、フィトクロムの全長のｃＤＮＡクローン をクルクルビタ・ペポ（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ）（ズッキーニ）から 分離することを開示している。 しかしながら、アペナ（Ａｖｅｎａ）（カラスムギ）中のフィトクロム遺伝子の 発現と異なり、内因性クルク′ルビタ（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ）のフィトクロム 遺伝子の発現は、Ｐｒ／Ｐｆｒの光変換に対して応答をほとんど表さないので、 存在したとしても、弱いフィトクロムの制御下にある。研究者ら他の植物種にお いてフィトクロムの制御下にあることが知られている他の遺伝子をズッキーニ中 の応答を試験しなかったので、ズッキーニのフィトクロム遺伝子の応答性の欠如 が単に遺伝子の光応答性の差のためであるかどうか、あるいは核の遺伝子の発現 のレベルでクルクルビタ（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａ）およびアベナ（Ａｖｅｎａ） のフィトクロムの間の調節機能の多少基本的差するかどうかは、まだ未知のまま である。それ以上のデータが存在しないので、トランスジェニック植物において フィトクロムを過度に発現する試みはアベナ（Ａｖｅｎａ）型の解読配列を使用 してなすべきであることは賢明であると思われる。 なぜなら、それはその自然の種中の核遺伝子の発現を越えた強い調節の影響を及 ぼすことが知られているからである。 組み合わせて、完全なフィトクロムのポリペプチドを合成するために必要な情報 を提供することができる、アベナ（Ａｖｅｎａ）の部分的解読配列を含有する種 々のＤＮＡ断片は入手可能である。しかしながら、アベナ（Ａｖｅｎａ）のゲノ ムのクローンを組み合わせて、完全な光受容体の分子をエンコードする単一のＤ ＮＡ断片を作ることができるが、すべての既知のアベナ（Ａｖｅｎａ）遺伝子は イントロンを含有するので、解読領域はある数のエクソンの間に分散されるであ ろう。これは、存在するゲノムのＤＮＡ断片を、トランスジェニック植物中の発 現のために一般に有用である解読領域をつくために劣った出発物質とする。なぜ なら、単子葉植物［アベナ（Ａｖｅｎａ）の１つの例］からの遺伝子のイントロ ンが双子葉種中で劣って処理されるという最近の証拠が存在するからである。　 ［ケイス（Ｋｅ　ｉ　ｔｈ）　、Ｂ、およびチュア（Ｃｈｕａ）　、Ｎ、Ｈ，、 ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）、５：２４１９−２４２５　（１９８６）］。した がって、トランスジェニック植物中の発現のための中断されないアベナ（Ａｖｅ ｎａ）のフィトクロムの解読配列を産生ことが必要である。なぜなら、一般に有 用なタンパク質の解読領域を含有するクローンは入手不可能であるからである。 ＰｒおよびＰｆｒのコンフォメーンヨンの構造における光誘導の差は光受容体の 作用の機構に基本的に関係があることが記載されているので、フィトクロムのア ミノ酸組成の変化は変更したタンパク質の生物学的効能にマイナスに影響を与え ることがある。フィトクロムのサブユニットの二量体化に関係があるタンパク質 のドメインはタンパク質のＣ−末端の３０キロダルトンの中に見いだされｃピー ストラ（Ｖｉｅｒｓｔｒａ）ら、１９８４、前述した、ジョンズ（Ｊｏｎｅｓ） およびファイル（Ｑａ　ｉ　Ｉ）　、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔ ｒｙ）、２５：２９８７−２９９５　（１９８６）コそしてＰｒ／Ｐｆｒの光変 換に関係するドメインはＮ−末端の７０キロダルトンの中に存在するｃピースト ラ（Ｖｉｅｒｓｔｒａ）ら、１９８４、前述した、ウォング（Ｗｏ　ｎ　ｇ）ら 、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、）　、２６１　：１２０８９−１２０９７　（１９８６）コが、これ らの機能に関係がある正確なアミノ酸ならびにＰｒおよびＰｆｒの二量体の二次 またはそれより高次の構造の適合および維持はなお解明しなくてはならない。し たがって、この研究において使用する新規なフィトクロムのポリペプチドは３型 のフィトクロムから５アミノ酸で異なりそして４型のフィトクロムから２０アミ ノ酸で異なるので、タンパク質が活性であるかどうかは未知であった。なぜなら 、単一のアミノ酸の変化または変化の組み合わせはタンパク質の三次元構造に悪 影響を及ぼすことがあり、こうしてその生物学的活性に悪影響を及ぼすことがあ るからである。事実、唯一の既知の単子葉［アベナ（Ａｖｅｎａ）］および双子 葉［ククルビタ（Ｃｕｃｕｒｂ　ｉ　ｔ　ａ）］のフィトクロムの配列の間にわ ずかに６５％のタンパク質の相同性が存在する［シャロツタ（Ｓｈａｒｒｏｃｋ ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、４７　：　２８７−２９５　（１９８６）コ。 フィトクロムのペプチドについてのかなりの研究にかかわらず、単子葉植物およ び双子葉植物の両者において一般に機能的であることが示された解読領域が示さ れた。さらに、形質転換構成体はいずれの植物種におけるフィトクロムの過度の 発現についても存在しない。したがって、フィトクロムの過度の発現における耕 種学的利益は達成されなかった。 発明の要約 暗い所および明るい所で野生型植物に関してフィトクロムを過度に発現するトラ ンスジェニック植物を産生ずる手段が発見された。このようなトランスジェニッ ク植物は、ある数の望ましい性質、例えば、減少した頂芽優生、半矯性、増加し た耐陰性および暗い緑色を有する。詳しくは、フィトクロムのポリペプチドのた めの単一の中断されない解読配列からなる単子葉植物から誘導された核酸断片を 、組み換えＤＮＡ構成体を利用して、植物の中に導入して形質転換およびフィト クロムの過度の発現を達成することによって、上の望ましい耕種学的特性の１ま たは２以上が得られる。単子葉植物および双子葉植物を利用して本発明の実施態 様を利用することができ、好ましい単子葉植物はトウモロコシ、カラスムギ、キ ビ、コムギ、イネ、オオミギ、モロコシ、アマランサス、タマネギ、アスパラガ ス、およびサトウキビを包含する；そして好ましい双子葉植物は、アルファルフ ァ、ダイズ、ペチュニア、ワタ、サトウダイコン、ヒマワリ、ニンジン、セロリ 、キャベツ、キュウリ、コシヨウ、カノラ（ｃａｎｏ　ｌ　ａ）　、）マド、ジ ャガイモ、ヒラマメ、アマ、ブロッコリー、タバコ、マメ、レタス、オイルシー ドレイブ（ｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅ）、カリフラワー、ホウレンソウ、メキャベ ツ、アーチチョ−り、エントウ、オクタ、カポチャ、ケール、コラ−ドグリーン （ＣＯｌｌａｒｄ　ｇｒｅｅｎ）、チャおよびコーヒーツキを包含する。観賞植 物は、また、本発明の好ましいクラスを表す。上のトランスジェニック植物を成 長させることによって得られる種子は、フィトクロムの過度の発現を通して生成 した有益な耕種学的特性を捕捉および転移するための好ましい手段を表す。 本発明の他の面は、単子葉植物から誘導され、フィトクロムのポリペプチドのた めの単一の中断されない解読配列からなり、植物を形質転換してフィトクロムの 過度の発現を達成するために使用する組み換えＤＮＡ構成体の中に組み込むこと ができる核酸断片を包含する。単子葉植物からのこのような解読配列は、イント ロンの欠失により調製され、モしてゲノムのライブラリーおよび／またはｃＤＮ Ａのライブラリー中の異なるクローンから誘導された成分からアセンブリングす ることができる。 好ましい解読配列は、アベナ（Ａｖｅｎａ）からイントロンの欠失後に誘導され る。 本発明の他の実施態様は、植物を形質転換することができ、核酸プロモーター断 片に対して５°でおよび１または２以上のポリアデニル化シグナルを含有する調 節配列に対して３°で連鎖により機能的に操作的にとされたフィトクロムのポリ ペプチドのための単一の中断されない解読配列からなり、こうして形質転換のと き、前記植物は野生型植物に関して暗い所および明るい所でフィトクロムを過度 に発現する、組み換えＤＮＡ構成体を包含する。好ましい組み換えＤＮＡ構成体 は、ウィルスのゲノムからか、あるいはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ）から誘導される。より好ましい核酸プロモーター断片は、カリフラ ワーのモザイクウィルスの３５３および１９Ｓ構成成分からか、あるいはアグロ バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のオピンシンターゼ遺伝子から誘 導される。必要に応じて、核酸プロモーター断片は転写および発現をさらに刺激 するエンハンサ−を含有し、好ましいエンハンサ−はウィルスまたはアグロバク テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られる。より好ましいエンハン サ−はカリフラワーのモザイクウィルスの３５８構成成分またはアグロバクテリ ウム（Ａｇｒ。 ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のオピンシンターゼ遺伝子から得られる。より好ましくは 、活性または調製の容易さのためにより、組み換えＤＮＡ構成体は、カリフラワ ーのモザイクウィルスの３５３構成成分から得られた核酸プロモーター断片に操 作的に連鎖したアベナ（Ａｖｅｎａ）がら誘導されたフィトクロムのポリペプチ ドのための単一の中断されない解読配列、およびアベナ（Ａｖｅｎａ）のフィト クロム遺伝子から得られた３°ポリアデニル化シグナル配列からなる。上の組み 換えＤＮＡ構成体を形質転換ベクターの中に組み込み、こうしてそれらがアグロ バクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域とともに、バクテリアによる植物 の感染後に、植物の中に移動するようにすると、最も好ましい手段が植物の組織 の中に与えられる。 図面の簡単な説明 この特許のファイルは、カラーで製作した少なくとも１枚の写真を含有する。こ の特許のコピーはカラー写真とともに特許および商標間により必要な手数料を払 って要求すると提供されるであろう。 第１図は、連鎖されて組み換えＤＮＡ構成体をつくった異なるクローンからの領 域を示す、ｐｃＶ３５ｐｈ’！ｔの物理学的地図である。 第２図は、ｐＧＰ８．２−２から誘導したｐＧＰ８．２−２１の物理学的地図で ある。 第３図は、ｐＧＰ８．２−２１から誘導したｐＧＰ８．２−２２の物理学的地図 である。 第４図は、ｐＧＰ８．２−１およびｐＭＳＰＸｒから誘導したｐＣＶ５の物理学 的地図である。 第５図は、ｐｃＶ５およびｐＧＰ８．２−２２から誘導したｐＣ■５−８．２の 物理学的地図である。 第６図は、ｐｃＶ５−８．２およＵｐＡＰ３．１から誘導したｐＣ■５Ｂの物理 学的地図である。 第７図は、ｐＧＰ２．４−１およびｐｃＶ５Ｂから誘導したｐＣＶ５Ｂ３の物理 学的地図である。 第８図は、ｐＭＳＰＫＮおよびｐＵＣ３５Ｋから誘導したｐＬＪｃ３５Ｐの物理 学的地図である。 第９図は、ｐＵＣ３５ＰおよびｐＣＶ５Ｂ３から誘導したｐＣＶ３５ｐ　ｈ　ｙ 　ｔ　Ａの物理学的地図である。 第１０図は、ｐＣＶ３５ｐｈｙｔＡおよびｐＣＸｒ５Ｂ３から誘導したｐｃｖ３ ５ｐｈｙｔの物理学的地図である。 第１１図は、形質転換したタバコ植物中の保護されたアベナ（Ａｖｅｎａ）型フ ィトクロムＲＮＡを示すオートラジオグラフである。 第１２図は、形質転換した植物７Ａおよび９Ａを示すカラー写真である。 第１３図は、明るいまたは暗い成長条件下に成長した形質転換した植物中のフィ トクロムのポリペプチドの発現を示すタンパク質のイムノプロットである。 発明の詳細な説明 本発明は、遺伝子操作した植物の細胞の中のフィトクロムの定常状態のレベルを 増加して、成長および形態学的特性を変更して、それらの耕種学的および商業的 価値を改良する方法を提供する。フィトクロムは、すべての植物の中に見いださ れる可溶性タンパク質であり、広範な種類の生物学的プロセスを制御する調節能 力において機能する。種々の種からのフィトクロムの分析は、それらが２つの同 一のサブユニットから成ることを示し、各々は１２０〜１２７キロダルトンの範 囲の分子量をもつポリペプチドから構成されている。各サブユニットは、チオエ ーテル結合を経てタンパク質共有結合された、線状テトラピロール発色団から成 る。貧化した植物組織中のフィトクロムの存在は、光受容体の特徴ある異なるス ペクトル（ＰｒからＰｆｒのスペクトルの減法により得られるスペクトル）の測 定によりしばしば決定される。しかしながら、緑色植物組織の中でクロロフィル の多量の存在は、光受容体のスペクトルの測定を妨害する。種々の植物種からの フィトクロムを認識するポリクローナル抗体、ならびにアベナ（Ａｖｅｎａ）の フィトクロムにのみを認識する高度に特異的なモノクローナル抗体の発生は、緑 色植物中の光受容体の分析を促進した。トランスジェニック植物中のアベナ（Ａ ｖｅｎａ）のフィトクロムの発現の分析は、分析する組織に依存して免疫化学的 にまたはスペクトル的にこの研究において実施する。 本発明を利用して、核酸断片の導入により問題の植物種中の細胞内フィトクロム のレベルを増加する。この核酸断片は、フィトクロムの解読配列の発現レベルを 増加することができる遺伝子配列および適切なＲＮＡのプロセシングのためのポ リアデニル化シグナルを提供することができる配列へのその連鎖により、所望の 植物種中で操作的に機能的とされた、フィトクロムのポリペプチドのための単一 の中断されない解読配列を含有する。このような組み合わせが植物の中に存在す るとき、植物は望ましい方法で１または２以上の成長および形態学的特性の変更 、例えば、減少した頂芽優生、半矯性、増加した耐陰性、および暗い緑色を示す べきである。これらの変更は、背の高い種の風の損傷が有意の収量の損失を引き 起こす作物植物において、およびより緑色の、より短い、より低木の植物が高度 に望ましい観賞植物において、大きい価値をもつ。このような変更は、また、多 数の副作用を誘導するサイトカイニンホルモン化合物に植物を暴露することによ って、現在探求されている。 前述の型のキメラのフィトクロム遺伝子を表す組み換えＤＮＡ構成体をつくった （第１図に示すように）。これは、キメラのフィトクロム配列に操作的に連鎖し たカリフラワーのモザイクウィルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　 Ｖｉｒｕｓ）３５８プロモ一ター断片転写体から成る。キメラのフィトクロム配 列は、アベナ（Ａｖｅｎａ）の３型ゲノムのクローン、ｐＧＰ８．２−２、から の１４３８ｂｐのフィトクロムの解読配列から成り、クローンｐＡＰ３．１から の１８６２ｂｐのアベナ（Ａｖｅｎａ）３型ｃＤＮＡ解読配列（このプラスミド からのＥｃｏＲＶ　〜Ｘｂａ　Ｉ）に連鎖し、そしてアベナ（Ａｖｅｎａ）の４ 型ゲノムのクローンｐＧＰ２．４−１からの１７３３ｂｐ　（ｐＧＰ２．４−１ のＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ断片）で停止し、解読領域を完結し、そしてポリアデニ ル化シグナルおよび植物遺伝子の３°末端において要求されうる他の調節機能を 提供する。生ずる構成体は、中断されないＤＮＡ配列中の１１２９アミノ酸のフ ィトクロムのポリペプチドをエンコードする。組み換えＤＮＡ構成体を使用して 、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介の葉ディスクの感染 によりタバコ植物を形質転換した。形質転換から再生したタバコ植物は、機能的 キメラのフィトクロムのタンパク質の発現を示し、そして明所および暗所の両者 において合計のフィトクロムの増加した定常状態のレベルを表す。キメラ遺伝子 を発現するタバコの形質転換体のすべては、増加した緑色の色素、増加した分！ ！（植物の基部からのより覆い茎の形成）、頂芽優生の顕著な減少、および部間 距離の減少）を示し、半矯性の表現型をもつ植物を生じ、こうして形質転換した 植物は正常植物と同一数の葉の節対花序を有するが、はぼ半分の高さを有する。 一般の実用性をもつフィトクロムの解読領域の発生は、本発明において、２つの 異なるフィトクロム遺伝子からの片を表す２つの独立のゲノムのアベナ（Ａｖｅ ｎａ）フィトクロムのクローンの部分を１つのアベナ（Ａｖｅｎａ）のｃＤＮＡ のクローンと組み合わせることによって達成される。ここで使用するｃＤＮＡの クローン、ｐＡｐ３．１と表示する［バージエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら、核酸の 研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１３：８５４３−８５ ５９（１９８５））は、フィトクロムのポリペプチドの中央区画をエンコードす るが、光受容体のＮ−末端およびＣ−末端をエンコードする５′および３′配列 の両者を欠如する。ｃＤＮＡのクローンから失うエクソン２からの５′解解読列 を含有するゲノムのクローンｐＧＰ８．２−２からの断片［バージエイ（Ｈｅｒ ｓｈｅｙ）ら、１９８５、前述した］を使用して、光受容体のＮ−末端の解読領 域を完結し、そして解読領域のための５′非翻訳リーダーを提供する。ｐＡＰ３ ．１からの失う３゛解解読列およびポリアデニル化配列を、λＧＰ２．４と表示 するゲノムのクローンから誘導した。ｐＧＰ２．４−１は、ｐＢＲ３２２のＥｃ ｏＲ１部位の中にスクリーニングしたゲノムのクローンｐＧＰ２．４からの５． ５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片である［バージエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら、１９８５ 、前述した］。生ずるＤＮＡ断片によりエンコードされる新規なタンパク質配列 は、３型および４型のフィトクロムの部分から成る融合タンパク質であり［バー ジエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら、１９８５コそして自然に存在しない。本発明は、 また、植物のゲノムの中にまたは複製する染色体以外の要素として存在する、前 述の、遺伝子組み合わせからなり、この場合において、産生されるフィトクロム のタンパク質は、それが発現される種に対して本来のフィトクロムであるか、あ るいは他の植物種の解読領域から誘導した異種タンパク質である。事実、フィト クロムの解読領域は、所望の植物中で機能的フィトクロムを産生ずる、任意の異 種または相同の解読領域から成ることができる。 フィトクロムの解読領域の発現を誘導するように選択したプロモーターの由来は 、それが明所および暗所で成長した植物中の定常状態のレベルを増加することに よって、本発明を達成するために十分な転写活性を有するかぎり、臨界的ではな い。本発明において使用するプロモーター領域は、カリフラワーのモザイクウィ ルスの３５３転写体から誘導される。プロモーター、例えば、カリフラワーのモ ザイクウィルスの１９８遺伝子から誘導したもの、種々のアグロバクテリウム（ ＡｇｒｏｂａｃＲＵＢＰカルボキシラーゼ遺伝子からのプロモーター、クロロフ ィルＡ／Ｂ結合タンパク質遺伝子、植物由来のＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ま たはそれが連鎖しているフィトクロムの領域の十分に高いレベルの転写を提供す る、任意の源からの遺伝子からのプロモーターは、本発明を達成することが期待 される。 自然のフィトクロムのプロモーターの中にあるいは他のプロモーター構成体の中 にエンハンサ−またはエンハンサ一様要素は、また、フィトクロムをエンコード する遺伝子の増加した転写活性によりフィトクロムのレベルを増加して、本発明 を達成するであろう。これは、次のものを包含する：ウイルスのエンハンサ−１ 例えば、３５Ｓの中に見いだされるもの、オウデル（Ｏｄｅｌ）ら、１９８７　 ［オウデル（Ｏｄｅｌ）Ｊ。 Ｔ８、ノウルトン（Ｋｎｏｗｌ　ｔｏｎ）　、Ｓ、　、リン（Ｌ　ｉ　ｎ）　、 Ｗ。 およびマウバース（Ｍａｕｖａｒｓ）、Ｃ，Ｊ、　、プラント・モレキュラー・ バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）１０：２６ ３−２７２（１９８８）］、オクトピンシンターゼまたはツバリンシンターゼ遺 伝子からのエンハンサ−１またはフィトクロムの解読配列に操作的に連鎖したプ ロモーターの中に配置したとき、転写を増加する他のエンハンサ−。 フィトクロムの解読配列は、本発明を達成するために、イントロンを含有するか 、あるいは含有しないことができる。イントロンをもたないフィトクロムは好ま しいことがある。なぜなら、このような解読領域は、種々の植物種の間でイント ロンの欠失の原因となる機構が潜在的に異なるために、フィトクロムの一次転写 の起こり得る転写後のプロセシング回避するからである。解読配列源に無関係に 植物中の活性フィトクロムの発現を提供するであろう、フィトクロムの解読領域 は、本発明を達成するために十分である得ることが期待される。これは次ぎを包 含する：他の単子葉または双子葉種の中に導入された単子葉植物からのフィトク ロムの解読領域、および双子葉または単子葉中の双子葉のフィトクロムの使用。 事実、フィトクロムの解読配列は進化を通してそのように機能的に保存されてき たので、藻類の種からのフィトクロムは、また、本発明の達成に有用であること を期待することができる。使用する解読領域の唯一の要件は、その適切な発現に 要求される適当な５°および３゛の調節配列に操作的に連鎖した、このような解 読領域で植物を形質転換したとき、それが所望の植物種の中に活性なフィトクロ ムを提供することができることである。 ポリアデニル化シグナルおよびフィトクロムの解読領域の適切な発現に要求され 得る他の調節配列を提供することができる、任意の３゛非解読領域を使用して、 本発明を達成することができる。これは、次のものを包含する：変更すべき植物 種の相同性フィトクロム遺伝子の自然３゛末端、異種フィトクロム遺伝子からの ３゛末端、ウィルスの遺伝子からの３°末端、例えば、カリフラワーのモザイク ウィルスの転写体の３５Ｓまたは１９Ｓの３°末端、オピンンンターゼ遺伝子か らの３″末端、ＲＵＢＩＳＣＯまたはＣＡＢ遺伝子の３°末端、あるいはその核 酸配列内の必要な調節の情報を提供して、それが操作的に連鎖するプロモーター ／フィトクロムの解読領域の組み合わせの適切な発現を、使用する配列が生ずる ような、任意の源からの３°末端配列。 本発明は、また、所望の末端を得る種々の他の方法により達成することができる 。１つの形態において、本発明は、野生型または植物中の異種のフィトクロムの 有意に多数のコピーを有することによって、増加したレベルのフィトクロムを産 生ずるように植物を変更することに基づく。 これは本発明を達成するために十分にフィトクロムのレベルを増加することがあ る。 フィトクロムは明所で成長した植物中で急速に劣化することが知られている。本 発明の他の形態は、フィトクロムのタンパク質のそれ自体を変更して、そのタン パク質の細胞の半減期を有意に増加して、明所でフィトクロムのより高い定常状 態のレベルを得ることから成る。フィトクロムはウビクイチン仲介通路を経て劣 化することが知られている［シャンクリン（Ｓｈａｎｋ］　ｉｎ）ら、ブロシー デインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８４　：　３５９−３６３　（１９８７）コので、本発明は フィトクロム中のウビクイチン認識部位を変更して、明所でタンパク質の劣化速 度を減少しフィトクロムのレベルを増加することによって達成できる。 下に記載する本発明の実施例は、タバコ、トマトおよびアブラナ中のフィトクロ ムの過度の発現についてであるが、フィトクロムは植物界を１して高度に機能的 に保存されるので、本発明は広範な種類の植物種をフィトクロムの過度の発現の 表現型に形質転換することによってこれらの植物種において達成することができ る。ことに低い光条件において増加した光合成活性により、矯性によるか、ある いは減少した頂芽優生により利益を得るであろう、耕種学的に重要な種は、次の ものを包含するが、これらに限定されない：イネ、コムギ、ダイズ、オイルシー ドレイブ、レタス、ヒマワリおよび他の果実の木の変種。例えば、イネでは、暗 い緑色の葉をもつ単項性である変種は、倒れに対する抵抗の増加のための最良の 収量、ならびに穀果の産生の間の光合成の生産量の増大を与えることが発見され た［概観について、参照、マツケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ら、栽培変種植物 の発育の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆＣｕｌｔｉｖａｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ）、（Ｗ、　Ｆ　ｅ　ｈ　ｒｉり、Ｖｏｌ、２．４８７−５３２、Ｍａ　 ｃＭｉ　１１　ａｎ　：二、−：Ｉ−り　１９８７コ。自然に矯性ではないが、 他の有利な特性、例えば、耐寒性または病害虫に対する抵抗を表すイネの変種に おいてこれらの特性を誘導する能力は、大きい耕種学的の利益をもつであろう。 単項性は他の重要な作物植物、例えば、ダイズ［フェール（Ｆｅｈｒ）、Ｗ、、 栽培変種植物の発育の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｉｖａｒ　Ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、（Ｗ、Ｆｅｈｒ編）、Ｖｏｌ、２．５３３−５７６、 ＭａｃＭｉ　ｌ　ｌａｎ　：ニューヨーク　１９８７コ、ヒマワリ　［ミラー（ Ｍｉ　］　１ｅｒ）、Ｊ、Ｆ、　、栽培変種植物の発育の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐ ｌｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｉｖａｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、（Ｗ、Ｆｅｈｒ編 ）、Ｖｏｌ、２．６２６０６６８、ＭａｃＭｉｌｌａｎ：ニュ　Ｅ−り　１９８ ７コ、およびコムギ［アラン（ＡＩｉａｎ）、栽培変種植物の発育の原理（Ｐｒ ｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｉｖａｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、（Ｗ、 Ｆｅｈｒ編）、Ｖｏｌ、２．６６９−７４８、ＭａｃＭｉ　］　ｌ　ａｎ　：ニ ューヨーク　１９８７］における量の増大について有益であることが発見された 。さらに、コムギはそれを光周期に対する感受性を低（シ（フィトクロム依存性 特性）、これによりそれをその／−ズンにおいてより早く成熟させることによっ て、フィトクロムの過度の発現を有益に実施することができる。さらに、植物の 変更によりよく暗い緑色を誘導してフィトクロムを過度に発現すると、消費者へ のアラピールが改良されるために、緑色の野菜、例えば、レタスおよび観賞植物 、例えば、キクの市場性を改良することができる。 動物の飼料、例えば、アルファルファおよびクローバ−のために使用する植物に おける光合成活性の増加は、バイオマスの種子中の蓄積を増加することによって 、同様によくより価値がある食糧とすることがある。 この開示に関して、ある数の用語を利用する。ここで使用するとき、用語「プロ モーター領域」は、ＤＮＡの配列を呼び、これは、通常、ＲＮＡポリメラーゼに ついての認識および／または正しい部位において転写を開始するために要求され る他の因子を提供することによって、解読領域の発現を制御する、構造遺伝子の 解読配列に対して上流（５°）に存在する。プロモーター配列は必要であるが、 遺伝子の発現を推進するために常に十分であるとはかぎらない。「プロモーター 断片」は、プロモーター領域のＤＮＡ配列の一部分を構成する。「エンハンサ− 」は、向きおよび位置に対して独立の方法で操作してプロモーターの活性を刺激 することができる、ＤＮＡ断片の型である。エンハンサ−は、また、オウデル（ Ｏｄｅｌｌ）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（ＰＩａｎｔ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１０：２６３−２７２　（１９８８）に記載 するように、転写刺激体を表示することができる。「核酸」は、糖、リン酸塩お よびプリンまたはピリミジンを含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成され た、−重鎮または二本鎖であることができる、大きい分子を呼ぶ。「核酸断片」 は、通常より大きい核酸分子の制限エンドヌクレアーゼの消化により得られる、 所定の核酸分子の一部分である。高等植物において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）は遺伝子物質であるが、リポ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡ中の情報をタンパク質の 中に翻訳するとき関係する。「ゲノム」は、有機体の各細胞の中に含有される遺 伝子物質の全体の本体である。用語「ヌクレオチド配列」は、−重鎖または二本 鎖であることができるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであり、ＤＮＡまたはＲＮ Ａのポリマーの中に組み込むことができる、合成、自然以外のまたは変更したヌ クレオチド塩基を必要に応じて含有する。ここで使用するとき、「選択した遺伝 子産生物のためのＤＮＡ配列」は、特定のタンパク質の遺伝情報を指定するＤＮ Ａ配列の遺伝子を呼ぶ。「調節配列」は、ここで使用するとき、その転写および 発現が細胞のタンパク質合成装置に関して調節配列により制御される、選択した 遺伝子産生物のためのＤＮＡに対して上流（５°）、その中に、および／または 下流（３°）に位置するヌクレオチド配列を呼ぶ。用語「構造遺伝子」は、タン パク質、ポリペプチド、またはその一部分をエンコードし、そして転写の開始お よびＲＮＡのプロセシングを推進する調節配列を排除する遺伝子の部分を呼ぶ。 構造遺伝子は通常細胞の中に見いだすことができるか、あるいはそれが導入され る細胞の位置の中に見いだすことができ、この場合において、それは異種遺伝子 と呼ぶ。「異種遺伝子」は、この分野において知られている任意の源から、例え ば、バクテリアのゲノムまたはエピソーム、真核生物の核またはプラスミドのＤ ＮＡ、ｃＤＮＡ、または化学的に合成したＤＮＡから、全体でまたは一部分で推 進することができる。構造遺伝子は「中断されない解読配列」を構成することが でき、すなわち、タンパク質分子へのその転写の前にメツセンジャーＲＮＡから のイントロンの切除を必要としないか、あるいはそれは適当なスプライシング接 合により結合された１または２以上のイントロンを含むことができる。「イント ロン」はＤＮＡから合成した最初の転写体に存在するＲＮＡの配列であるが、細 胞内のＲＮＡの切断および再メツセンジャーＲＮＡにより除去して成熟したメツ センジャーＲＮＡをつくり、次いでこれをタンパク質に翻訳することができる。 構造遺伝子は、天然に産出するか、あるいは合成の、異なる源から誘導されたセ グメントから構成することができる。構造遺伝子は異なる源から誘導されたセグ メントの複合体から構成する場合、それはしばしば「キメラ遺伝子」と呼ばれる 。３°　の中断されない配列は、ＤＮＡセグメントからなる遺伝子の部分を呼び 、ポリアデニル化シグナルおよび解読配列のプロモーターの末端においてｍＲＮ Ａのプロセシングを実施することができる他の調節シグナルを含有する。ポリア デニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３′末端へのポリアデニル酸の特性の付 加を実施することによって、通常特性決定される。ポリアデニル化シグナルは標 準の形態５°−ＡＡＴＡＡＡ−３°　に対する相同性の存在により普通に認識さ れるが、変動は異常ではない。用語「組み換えＤＮＡ構成体」は、任意の源から 誘導された、−重鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または円形の、 プラスミド、ウィルス、自律的に複製する配列、ファージまたはヌクレオチド配 列を呼び、ここで適当な３′の中断されない配列と一緒に選択した遺伝子産生物 のためのＤＮＡ配列およびプロモーター断片を植物細胞の中に導入することがで きる、独特の構成体の中に、ある数のヌクレオチド配列が接合または再び組み合 わせられている。 「原形質体」は、細胞壁または細胞外のマトリックスをもたない植物細胞を呼ぶ 。「減少しだ頂芽優生」は、主要な頂端分裂組織が脇芽への影響が少ないので、 増加した葉の形成および分枝が植物の分裂組織から起こる、植物における状態を 呼ぶ。「生理性」は、同一種の正常植物より約半分だけ小さいが、それ以外は正 常の構造（すなわち、同一数の茎の節対花部、同一数の花）を有する植物を呼ぶ 。 ここで使用するとき、「形質転換」は、細胞／組織／植物に転移した核酸分子上 にエンコードされた性質を細胞／組織／性質が獲得するプロセスを意味する。「 転移」は、ＤＮＡを細胞の中に転移する方法を呼び、マイクロインジェクション 、あるいは種々の物理学的処理（例えば、エレクトロポレイション）または化学 的処理（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）で細胞膜を浸透することを 包含する。核酸で形質転換される結果として新しい特性を獲得する植物は、「ト ランスジェニック植物」と呼ばれる。ここで使用するとき、原形質体または植物 を化学物質へ「暴露する」は、その物質で前記原形質体または植物を処理、イン キュベーション、接触することを呼ぶ。用語「操作的に連鎖した」は、２つのＤ ＮＡ断片を機能的ＲＮＡの中に転写これにより適切な向きおよびリーディングフ レームで化学的融合することを呼ぶ。ここて使用するとき、用語「に対して相同 性」は同様なアミノ酸配列を有するタンパク質を呼ぶ。用語「発現」は、ここで 使用するとき、遺伝子産生物の配列の遺伝情報を指定する遺伝子から遺伝子産生 物への翻訳を意味することを意図する。発現において、遺伝子産生物の配列の遺 伝情報を指定するＤＮＡは、まず、メツセンジャーＲＮＡと呼ぶ相補的ＲＮＡに 転写され、次いで、こうして転写されたメツセンジャーＲＮＡは前述の遺伝子産 生物に翻訳される。連続的でありかつさらに外部で制御されたプロモーター断片 により増強され、これによりメツセンジャーＲＮＡの多数のコピーおよび大量の 選択した遺伝子産生物を産生ずる、発現は、「過度の発現」と呼ぶ。「翻訳開始 コドン」は、タンパク質解読配列の開始を特定する核酸中の３つのヌクレオチド のユニット（コドン）を呼ぶ。 本発明を通じて使用ＤＮＡの組み換えの技術は、この分野において知られており 、そして一般にマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング、研究所 のマニアル（Ｍｏｌｅｃｕ］ａｒ　Ｃ］ｏｎｉｎｇ。 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ− （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）（１９８３）に記載されている。 ＤＮＡの酵素処理 １、制限酵素の消化 使用する制限酵素消化の緩衝液および消化条件は、各特定の酵素の製造業者によ り供給されるものである。製造業者により推奨されるとき、ジチオスレイトール （ＤＴＴ）を別々の無菌の溶液から推奨される濃度に添加する。酵素を添加して ５〜−１０ユニット／μｇのＤＮＡとし、そして反応混合物を水で適当な最終体 積（通常１０〜２０μｍ）に調節する。使用する制限酵素の反応混合物は、日常 的に０．７〜２．０μｇのプラスミドＤＮＡを含有した。反応成分を混合し、次 いで適当な温度において１〜３時間インキュベーションする。多数の酵素による ＤＮＡの消化は、別々の酵素の最適な塩および温度の条件が類似するとき、同時 に実施される。これらの条件が十分に異なるとき、消化は最低の塩の条件を要求 する酵素を使用して順次に開始する。引き続く反応は使用する酵素について適当 な緩衝条件に対して補助的である。 ２、平滑末端の反応 場合に応じて、結合の前に制限断片の末端を平滑とすることが必要である。平滑 末端の反応は、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を利用する 。反応混合物は１ユニツトのクレノー断片／μｇのＤＮＡ、５０ミリモルのトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０〜５０ミリモルのＮａＣ１，５〜１０のＭｇＣｌ２ ．５ミリモルのＤＴＴ中の５０ミリモルの４つのデオキシヌクレシドトリホスフ ェート（ｄＮＴＰｓ）の各々であり、そして室温（２２℃）において１５〜３０ 分間インキュベーションする（５°オーバーハングをフィルインするために）か 、あるいは２時間インキュベーションする（３°オーバーハングを除去するため に）。便利なときには、反応は同一の管の中で実施し、この管の中で１または２ 以上の制限酵素との反応が起こる。それらの場合において、塩濃度を５０ミリモ ルより低い最終濃度に調節する。第２の１または２以上の制限消化を実施すべき とき、クレノー断片を６５〜７０℃に加熱することによって不活性化した後、第 ２制限酵素を添加する。 ３、ホスフェートの反応 結合の間、ＤＮＡリガーゼは、一方のヌクレオチドが５“　−ホスフェート基を 含有し、そして他方が３゛−ヒドロキシル基を含有するときはじめて、隣接する ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の形成を触媒するであろう。したがっ て、プラスミドＤＮＡの再環化は、バクテリアのアルカリ性ホスファターゼまた は仔つン腸ホスファターゼで線状ＤＮＡの両端から５゛　ホスファターゼを除去 することによって、最小とすることができる。結局、二重らせんのいずれの鎖も ホスホジエステル結合を形成することができない。しかしながら、５°−末端の ホスフェートをもつ外来ＤＮＡは脱リン酸化プラスミドＤＮＡに効率的に結合し て、２つのニックを含有する開いた円形の分子を形成することができる。円形Ｄ ＮＡ　にツクド線状ＤＮＡでさえ）線状のプラスミドＤＮＡより非常に効率よく 形質転換する。結局、形質転換体の大部分は組み換えプラスミドを含有するであ ろう。 ホスファターゼ処理は、制限エンドヌクレアーゼ消化またはクレノー断片の処理 後、ＤＮＡを含有する溶液をトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，４の中で０．　１モルと し、そしてこの溶液を０．５ユニツトの仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｃ ＩＰ）／μｇのＤＮＡ　（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と５５℃において１５分間インキュベーションすることに よって実施する。ホスファターゼは７０℃に１５分間加熱することによって不活 性化し、次いでＤＮＡ溶液を等しい体積のフェノール（使用するフェノールは０ ．　１モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０で使用前に飽和する）、フェノール： クロロホルム（１：　１）およびクロロホルムで順次に抽出する。酢酸ナトリウ ムを０．３モルの最終濃度に添加し、次いで２体積のエタノールを添加すること によって、ＤＮＡを沈澱させてそれを濃縮する。 ４、結合 ＤＮＡ断片の結合のために、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＰＨａｍａｃ　ｉａ１ニ二 −ジャージイ州ビス力タウェイ）およびリガーゼ緩衝液（５０ミリモルのトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ミリモルのＭｇＣｌ２．１．０ミリモルのＤＴＴ、 および１．０ミリモルのＡＴＰ）を使用する。 平滑末端のＤＮＡを結合し、ポリエチレングリコール８０００　（ＰＥＧ８００ ０）結合混合物に５％（ｗ／ｖ）の最終濃度に添加する。２〜５ユニツトの酵素 をＤＮＡの１μｇ当たりに添加する。反応混合物を１６℃において一夜インキユ ベーションする。 ＤＮＡのゲル電気泳動 ＤＮＡのポリアクリルアミドゲルの電気泳動のために、８９ミリモルのトリスお よび８９ミリモルのホウ酸塩（ｐＨ８，３）　、２．５ミリモルのＮａ２ＥＤＴ Ａから成るトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ　（ＴＢＥ）緩衝液（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 マリイランド州２０８７７ガイサーバーグ）を使用する。使用するゲルは、２５ ％のグリセロールを含有する１００ｍ１のＩＸＴＢＥ中に溶解した４、５％のア クリルアミドおよび０．１５％のビス−アクリルアミドから成っていた。この溶 液に、０．０５ｇの過硫酸アンモニウムおよび３５μ】のＮ、Ｎ、　Ｎ’　、　 Ｎ“−テトラ−メチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加し、そしてこの溶 液をゲルの型の中に注ぐ。２ｍｍのコームおよびスペーサーを普通に使用し、そ してほぼ１０〜１５μｇ／ウェルのＤＮＡを装入する。電気泳動を１５０〜２５ ０ボルトで１ｘＴＢＥの中で実施する。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウム（１ μｇ　／　ｍ目の水溶液の中で染色し、そしてＤＮＡを紫外線トランスイルミネ ーターで可視化する。ゲルをポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）カメラおよびポラ ロイド６６７フイルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ　Ｔｅｃｈ、Ｐｈｏｔ○、マサチュセ ッツ州０２１３９ケンブリッジ）を使用して写真撮影する。 ＤＮＡはポリアクリルアミドゲルから次のようにして回収する　臭化エチジウム （Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ）の染色により可視化した、所望のバンドをゲルから切断し、 エッペンドルフ管に入れ、そしてスパチュラで細分する。 等しい体積のゲル溶離緩衝液（０，５モルの酢酸アンモニウム、１４ミリモルの 酢酸マグネシウム、１ミリモルのＥＤＴＡおよび０１％のＳＤＳ溶液）を添加し 、そして管を３７℃において一夜激しく震盪しながらインキュベーションする。 次の日に、ガラスウールのプラグを含有する１ｍｌのピペッティングチップにア クリルアミドを通すことによって、アクリルアミドから液体を排出する。アクリ ルアミドを第２体積のゲル溶離緩衝液ですすぎ、そして１ｍｌのピペットマン（ Ｐｉｐｅｔｍａｎ）ピペッタ−を使用して液体をティップから強制的に出す。次 いで、ＤＮＡを２体積のエタノールの添加により沈澱させ、そしてドライアイス −エタノールの中でインキュベーションした。ＤＮＡを、前述したように、マイ クロフーグ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）の中で試料を４℃において１５分間遠心する ことによって集める。次いで、沈澱を７０％のエタノールですすぎ、真空乾燥し 、そして次の操作の性質に依存して選択した緩衝液の中に再懸濁する。 ポリアクリルアミドゲルについて前述した緩衝液を使用して０．７〜１．２％の アガロースゲル（分析するＤＮＡ断片の大きさに依存する）の中で、ＤＮＡのア ガロースゲルの電気泳動を実施する。電気泳動はＤＮＡの量／レーンおよび実験 の所望の時限に依存して５０〜１５０ポルトの電圧で実施する。電気泳動後、前 述したように、ゲルを１μｇ／ｍ１のＥｔＢｒで染色し、そしてＤＮＡを紫外線 トランスイルミネーターで可視化し、そして写真撮影する。 ＤＮＡを低温のゲル化アガロースを使用してアガロースゲルから回収する［ノー ・プラーク・アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇａｒｏｓｅ）、ＦＭＣＣ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｉ］ｖｉｓｉｏｎ、 メイン州０４８４１０ツクランド］。電気泳動の手順は前述したものである。問 題のＤＮＡの可視化後、バンドを切断し、そしてニッペンドルフ管の中に入れる 。次いで、管を一８０℃において３０分間凍結し、次いで融解する。次いで、ア ガロースをスパチュラで破砕し、そして試料をマイクロフーグ内で１０分間遠心 する。 上澄み液を管の底においてアガロースの沈澱を乱さないで管から取り出す。試料 を１／１０体積の３モルの酢酸ナトリウムおよび２体積のエタノールで沈澱させ 、次いて一８０℃において１５〜３０分間インキュベーションする。ＤＮＡをマ イクロフーグの中で４℃において１５分間遠心することによって回収する。次い で、ＤＮＡの沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、真空乾燥し、そしてＴＥ緩衝 液の中に再懸濁する。 バクテリアの細胞の形質転換 プラスミドＤＮＡによるＥ、ｃｏｌｉの形質転換を、ベセスダ・リサーチ・ラボ ラトリーズの凍結した能力細胞を使用して実施した。従ったプロトコルに細胞を 供給する。 能力細胞を一８０℃のフリーザー内の貯蔵から取り出し、そして氷上で融解する 。要求される数の１７Ｘ１００ｍｍのポリプロピレン管（Ｆａ　］　ｃｏｎ２０ ５９）を予備冷却のために氷上に配置する。細胞をおだやかに混合し、次いで１ ００μｌのアリコートを容管の中に入れる。結合混合物を水で５倍に希釈した後 、細胞に添加する。２μｍの希釈した結合混合物を細胞に添加し、そしてこれを 氷上で３０分間インキュベーションする。次いで、細胞を水浴で震盪しないで４ ２℃において４５秒間熱衝撃する。細胞を氷に２分間戻した後、０９ｍｌのＳ、 　Ｏ，Ｃ。 培地を添加する。Ｓ、Ｏ，Ｃ，培地は２％のバクトドリプトン、０．５％の酵母 エキス、１０ｍ１のＮａＣ］、２．５ミリモルのＫＣＩ、２０ミリモルのＭｇＣ ＋２、ＭｇＳＯ４（各１０ミリモルの）および２０ミリモルのグルコースから構 成されている。次いで、細胞を２２５ＲＰＭで３７℃で１時間Ｍ盪する。この増 殖期間後、細胞を形質転換したプラスミドの選択に適当な抗生物質を含有するＬ Ｂ平板上で平板培養する。 通常、平板当たりいくつかの異なる体積（すなわち、１５．１５および１５０μ ｍ）の細胞を添加し、次いで平板を３７℃において一夜インキュベーションして コロニーを増殖する。 エンドヌクレアーゼがダム（ｄａｍ）メチル化に対して感受性である制限部位で ＤＮＡを切断することが必要であるとき、所望のＤＮＡを含有するプラスミドを Ｅ、ｃｏｌｉのｄａｍ−菌株の中で増殖する。菌株Ｎ５２６２６をこの研究にお いて使用するが、任意の商業的に入手可能なＥ、ｃｏｌｉのｄａｍ−を使用する ことができる。能力ｄａｍ−細胞は次のようにして得られる。５０ｍ１のＬＢブ ロスを１００μｌの一夜の培養物で接種し、それらを３７℃において震盪しなが らＯ，Ｄ、　ａｇｏが０．２５０となるまでインキュベーションし、次いで細胞 を氷上で０℃に冷却する。バクテリアを１５００ｘｇで１０分間遠心することに よって収穫し、次いで２５ｍ１の１００ミリモルのＣａＣｌ２の中に再懸濁し、 そして氷上で３０分間インキュベーションする。バクテリアを再遠心しく上のよ うにして）そして１ｍｌの１００ミリモルのＣａＣｌ２の中に再懸濁する。氷上 で４時間後、２００μｍの能力細胞を除去し、１μｇのプラスミドＤＮＡを添加 し、そして細胞を氷上で３０分間インキュベーションする。次いで、細胞を４２ ℃の水浴の中で震盪せずに２分間熱衝撃する。細胞を氷に２分間戻した後、１ｍ ｌのＳ、　Ｏ，Ｃ６培地を添加する。形質転換は前述したように進行する。 プラスミドの分離および精製 １、大規模の調製 ２５ｍ１の所望のプラスミドを含有する一夜の培養物（または指数成長した培養 物）を調製する。次いで、２ｍｌの一夜の培養物をｌ】のＭ９ＣＡまたはＬ２’ ロスに希釈し［分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ　１）　、マ＝アチス（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ）ら、：ｌ−／ｌ／ドースプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、 コールド・ノ１−ノ＜−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ）、＝ニーヨークコそして１６時間（−夜）３６℃で激しく震盪しなが らインキュベーションした。４℃において５分間４０００Ｘｇで遠心することに よってバクテリアを集める。沈澱をよく排液し、そして３６ｍ１の合計の体積の ＧＴＥ緩衝液［５０ｍ１のグルコース、２５ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ および１０ミリモルのＥＤＴＡ］の中に再懸濁する。４ｍ】のＧＴＥ中の４０ｍ ｇ／ｍｌのりゾチームを懸濁液に添加し、そしてこの混合物を室温において１０ 分間インキュベーションする。細胞懸濁液を氷上で冷却し、そして８０ｍ１の新 しくつくった０、２ＮのＮａＯＨおよび１％のＳＤＳをおだやかにかきまぜなが ら添加する。この混合物を氷上で１０分間インキュベーションする。４０ｍ１の ２モルの酢酸中の３モルの酢酸カリウムを添加し、そしてよく混合する。次いで 、この混合物を水上で１５分間インキュベーションする。２４．ＯＯＯｘｇ［１ ２Ｋ　ＲＰＭＩで１５分間遠心することによって沈澱を除去し、そして上澄み液 を４〜５層のチーズクロスを通して濾過する。領　６体積のイソプロパツールの 添加により、核酸を沈澱させる。生ずる沈澱を１２．０００ｒｐｍで１５℃にお いて１０分間遠心することによって集める。前述したように、沈澱を７０％のエ タノール（ＴＥ緩衝液）で洗浄し、そしてＤＮＡを再沈澱させる。核酸の沈澱を １０ｍ１のＴＥ、ｐＨ８中に溶解する。ＤＮＡが溶解してしまった後、溶解した ＤＮＡの各１ｍｌに１．０ｇのＣｓＣ１を添加する。０．３２ｍ１のの臭化エチ ジウム（ＥｔＢｒ）を１０ｍｇ／ｍｌの原溶液からのＤＮＡ溶液に添加する（６ ００μｇ／ｍｌの最終濃度）。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０゜１Ｔｉｏ− ターまたは同等の装置で２０℃において少な（とも１５時間６５．０００ｒｐｍ で遠心することによって、プラスミドＤＮＡをバンドに分ける。勾配は一般に３ つのバンドを含有する。最低のバンドは臭化エチジウムを吸収しないが、２つの 上のバンドは事実色素を吸収する。 染色体ＤＮＡに相当するそれほど密でない上部のバンドはしばしば肉眼で見るこ とができる。勾配からの２つの吸収バンドの下であるプラスミドのバンドを、管 のバンドより下の側面を２０ゲージの針で穿刺し、そしてＤＮＡを管の中から外 に抜き出すことによって取り出す。ＮａＣ１で飽和した８０％のイソプロパツー ル（ＩＱｍｌの５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ミリモルのＥＤ ＴＡおよびｌＱｍｌの５モルＮａＣ１を８０ｍ１の２−プロパツールに添加する ことによって調製した）でＤＮＡを反復して抽出することによって、ＥｔＢｒを 除去した。 抽出したプラスミドを２体積のＴＥＳｐＨ８，０で希釈し、そしてＤＮＡを２体 積のエタノールで一２０℃において少なくとも１時間沈澱させる。４℃において ３０分間１０．ＯＯＯｘｇで遠心することによって、ＤＮＡを回収する。ＤＮＡ をＴＥ緩衝液の中に再懸濁し、そして酢酸ナトリウムを０．　３ミリモルに添加 し、次いで２体積のエタノールを添加することによってＤＮＡを再沈澱する。前 述したようにＤＮＡを回収し、そして−２０℃において貯蔵する。 ２、小規模の調製 ５ｍｌの抗生物質を含有する培地を単一のバクテリアのコロニーで接種する。３ ７℃において激しく農産しながら一夜インキユベーションする。１．５ｍｌの培 養物をエッペンドルフ管の中に注ぐ。吸引により培地を除去し、バクテリアの沈 澱をできるだけ乾燥して残す。同一管中で反復する。−夜の培養物の残部を４℃ で貯蔵するか、あるいは各ピック（ｐｉｃｋ）の原平板を番号を付したマトリッ クス上で作って各のコロニーの同一性を確立する。４ｍｇ／ｍ］のリゾチーム（ 使用直前に溶液に添加する）を含有するＧＴＥ緩衝液の水冷溶液の１００μｍの 中で渦形成して沈澱を再懸濁する。室温において５分間インキュベーションする 。管の上部はこの期間の間に閉じる必要はない。２００μｌの溶菌緩衝液の新し く調製した溶液を添加する（０．２ＮのＮａＯＨおよび１％の５ＤＳ）。管の上 部を閉じ、そして管を急速に３または３回倒立させることによって内容物を混合 する。管を水上で５分間貯蔵する。次のようにして調製した酢酸カリウムの水冷 溶液（ｐＨ４，８）の１５０μｍを添加する　６０ｍ１の５モルの酢酸カリウム に、１１．５ｍｌの氷酢酸および２８．５ｍｌのＨ２Ｏを添加する。生ずる溶液 はカリウムに関して３モルであり、そしてアセテートに関して５モルである。管 のキャップを閉じ、そして管を鋭く数回倒立させることによって混合する。水上 で５分間貯蔵する。エツベンドルフ遠心機内で４℃において５分間遠心する。上 澄み液を新しい管に移し、そして等しい体積のフェノール／クロロホルムを添加 する。渦形成により混合する。エッペンドルフ還心機内で２分間遠心後、上澄み 液を新しい管に移す。室温において２体積のエタノールを添加する。倒立により 混合する。室温において２分間放置する。エッペンドルフ遠心機内で室温におい て５分間遠心する。上澄み液を取り出し、そして紙タオル上で倒立した位置に管 を放置して、流体のすべてを排液する。２５０μｍの７０％のエタノールを添加 する。短時間混合し、次いで再遠心する。上澄み液のすべてを再び取り出す。真 空デシケータ−内で短時間沈澱を乾燥する。ＤＮアーゼ不含膵臓ＲＮアーゼ（２ ０ｇｇ／ｍｌ）を含有するＴＥ　（ｐＨ８，０）の５０μｍを添加し、そして短 時間渦形成する。２μｍの溶液を新しいエツベンドルフ管に移す。６μｍの水、 １μｍの適当なＩＯＸ制限緩衝液、および１μｌの所望の制限酵素を添加する。 適当な温度（３７℃）において１〜２時間インキュベーションする。調製物の残 部を一２０℃において貯蔵する。制限消化におけるＤＮＡ断片をゲル電気泳動に より分析する。 ３載接合（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）問題のＤＮＡ構成体を平板 培養の中に導入してそれらの活性を試験するために、構成体をＥ、ｃｏ］ｊ菌株 ＨＢＩＯＩからアグロバクテリウム・ツメ７７シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、菌株ＧＶ３８５０の中に移動させる。プラ スミドｐＲＫ２０１３を含有するＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩを、３載接合にお けるプラスミドの移動化のためのヘルパーとして使用する。バクテリアの各菌株 、ＨＢＩＯＩ（構成体を含有する）　、ＨＢＩＯＩ　（ｐＲＫ２０１３）、およ びＧＶ３８５０を、５ｒｎＪのルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ ）（ＬＢ）ブロスの中で適当な選択的抗生物質の存在下に、別々に一夜増殖させ る。培養物からの細胞を２２℃において１０分間を４０００ｘｇで遠心すること によって収穫し、次いで５ｍｌのＬＢブロスの中に再懸濁する。１００μ】の３ つの培養物の各々を１．５ｍｌのエッペンドルフ遠心機中で混合し、そして全体 の混合物を無菌のニトロセルロースのディスク（Ｍｉ　］　］　１ｐｏｒｅ　Ｈ Ａ型フィルター）上にピペッティングすることによって、接合を実施する。各ニ トロセルロースのディスクを６〜８枚のワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）＃１濾 紙上に配置して、過剰の液体を培養物から除去し、これにより混合物中のバクテ リアを濃縮する。次いで、ニトロセルロースのディスクを１００ｍｍのベトリ皿 中のＬＢアガロースゲル上に配置し、そして３０℃においてほぼ１６時間インキ ュベーションする。インキュベーション後、バクテリアをニトロセルロースのデ ィスクから無菌の４ｍｌのポリプロピレン培養管の中に１ｍｌの１０ミリモルの Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４を使用して洗浄する。 バクテリアを無菌的に希釈し、そして種々の希釈物を１００μｇ／ｍ１のりファ ンピシン、スペクチノマイシン、およびストレプトマイシン（または他の適当な 抗生物質の組み合わせ）の各々を含有するＬＢ寒寒天平板−配置する。３０℃に おいて３日間インキュベーションした後、抵抗性コロニーを選択し、そして前述 の小規模のプラスミドの分離を使用して、個々のコロニーから調製したＴ１プラ スミドのサザンプロット分析により、所望のインサートのＤＮＡの存在を確証す る。 植物の形質転換 構成体を、タバコの葉のディスクのアグロバクテリウム・ツメファシェンス（、 へｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の感染を経て、植物の ゲノムの中に移動化する。無菌の培地および異種生物を混じない植物／バクテリ アの培養物の操作のための標準の無菌の技術に従い、これはすべての転移のため に層状流れのフードの使用を包含する。葉のディスクの感染のための鉢植のタバ コ植物を、１２時間、２４℃日中、１２時間、２０’Ｃ夜のサイクルで、はぼ８ ０％の相対湿度で、混合した冷白色蛍光および白熱光の下に維持した成長室内で 成長させる。 タバコの葉のディスクの場合は、本質的にポルシニ（Ｈｏｒｓｃｈ）らの方法に より実施する［ホルシｘ　（Ｈｏ　ｒ　ｓ　ｃｈ）　、Ｒ，Ｂ、　、７　！Ｊ　 （Ｆｒｙ）　、Ｊ、　Ｅ、　、ホ７７ン（ＨＯｆ　ｆｍａｎ）　、Ｎ、Ｌ、　エ イキホルツ（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ）、Ｄ、　、ｏジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）　、 Ｓ。 Ｇ、およびフラレイ（Ｆｒａ　Ｉｅｙ）　、Ｒ，Ｔ、（１９８５）　、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７．１２２９−１２３１コ。 若い葉、完全に広がらずかつほぼ４〜６インチ、を、はぼ４〜６週齢のタバコ植 物からメスで収穫する。葉をほぼ５００ｍ１の１０％のクロロホルム（Ｃｈｌｏ ｒｏＸ）、０．１％のｓＤｓ溶液の中に沈め、次イで無菌の脱イオン水で３回す すぐことによって、葉を表面滅菌する。無菌の紙ポンチを使用して全葉がら、直 径６ｍｍの葉のディスクを調製する。 問題のプラスミドを有するアゲロバクチ１功ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） の−夜のＬＢブロスの１＝１０希釈物の２０ｍ１の中に葉のディスクを数分開法 めることによって、葉のディスクを接種する。接種後、ＣＮ寒天培地（１バツグ のＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ）　、３０ｇのスクロース、８ｇの寒天、Ｏ，１ｍ］の１ ｍｇ／ｍｌのＮＡＡおよび１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのＢＡＰ／ｌ、ｐＨ５，８）を 含有するベトリ皿に葉のディスクを配置する。平板をバラフィルムでシールし、 そして混合した蛍光およびｒＧｒｏおよび５ｈｏＪ植物光（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅ ｌｅｃｔｒｉｃ）下でほぼ２５℃に維持した培養室内で２〜３日間インキュベー ションする。 アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の葉のディスクを除去しそ して形質転換したタバコ細胞の成長について選択するために、葉のディスクを５ ００ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび１００ｍｇ／］のカナマイシンを含有する 新鮮なＣＮ緩衝液に移す。セフォタキシムを凍結した１００ｍｇ／ｍ］の原溶液 として保持し、そしてオートクレーブ処理後培地に無菌的に添加する（０．４５ μｍのフィルターを通して濾過滅菌する）。新鮮なカナマイシン原溶液（５０ｍ ｇ／ｍｌ）を各使用のために調製し、そしてオートクレーブ処理した培地に濾過 滅菌して入れる。 葉のディスクを前述の成長条件下に３週間インキュベーションし、次いで同一組 成の新鮮な培地に移す。 カナマイシン選択した外植体上で発育するほぼ１〜２週後の苗条を無菌のメスで 切除し、そして１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＡ培地（ｌバッグのＭ Ｓ塩（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｇのスクロース、および８ｇの寒天／１）の中に植え る。カナマイシンの中で根付く苗条を土に移し、そして前述の成長室の中で成長 する。 植物のＲＮＡの分離 葉のディスクの接種の手順を経て植物の中に形質転換されたＤＮＡの発現を分析 するために、ＲＮＡを植物から分離し、そして形質転換性ＤＮＡによりエンコー ドされる特異的ＲＮＡ転写体の存在について試験する。土の中に鉢植後、そして 植物がほぼ１０枚の葉の段階に成長したとき、１ｇの葉の組織を各植物から収穫 し、そして液体窒素の中で凍結した。凍結した葉の組織を乳鉢および乳棒で粉砕 し、次いで４ｍｌのプロイテイナーゼに溶液（５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、 ｐＨ９，０，１０ミリモルのＥＤＴＡ、および２％のＳＤＳ中の２５０ｇｇ／ｍ ｌのプロイテイナーゼＫ）５０℃において１０分間消化する。次いで、この溶液 を等しい体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで２回抽出し 、そして核酸を水性相から０．６体積のイソプロパツールで０．３モルの酢酸ナ トリウムの存在下に沈澱させる。−２０℃において一夜のインキュベーション後 、核酸を１２．ＯＯＯＸｇにおける遠心により集め、そして沈澱を１．５ｍｌの Ｈ２Ｏの中に再懸濁する。ＲＮＡを示差的にＤＮＡから、Ｑ、５ｍｌの８モルＬ ｉＣ１の添加および氷上の２時間のインキュベーションにより、沈澱させる。沈 澱を４℃において２０分間１２，０００Ｘｇで遠心することによって集め、そし てＨ２Ｏの中に再懸濁させ、そして前述したように同一濃度のＬｉＣ１で再沈澱 させる。次いで、ＲＮＡをＨ２Ｏの中に再懸濁し、そして１／１０体積の３．０ モルの酢酸ナトリウムｐＨ６，２および２．５体積のエタノールの添加および一 ２０℃において４時間より長い時間インキュベーションすることによりて沈澱さ せる。 ＲＮアーゼの保護の分析 ＲＮアーゼの保護の手順［ジン（Ｚｉｎｎ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）３４．８６５ −８７９．１９８３、メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１２．７０３５−７０５６　（１９８４ ）］を使用して、形質転換された植物から分離したＲＮＡ中のアベナ（Ａｖｅｎ ａ）フィトクロムのメツセージを検出する。キメラのフィトクロム遺伝子の転写 開始部位とオーバーラッピングしそして下流を連続してフィトクロム遺伝子の解 読領域に入る８００ｂｐのＤＮＡ断片を、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼがアベナ（ Ａｖｅｎａ）フィトクロムのメツセージに対して相補的な転写を発生するような 向きで、ｐＧＥＭ３　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）の中にクローニングす る。プローブと形質転換された植物から分離したＲＮＡとの間のハイブリダイゼ ーション後、引き続＜ＲＮアーゼの処理は非ハイブリダイゼーションＲＮＡを除 去し、そしてハイブリダイゼーションした二本鎖ＲＮＡにのみを残すであろう。 保護された領域はゲル電気泳動により検出することができる。製造業者が特定し ているように［３２Ｐ］　ＵＴＰ（＞３００００ｉ／ミリモル）の存在下にＳ　 Ｐ　６　ＲＮＡポリメラーゼおよびプロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ ｉｏｔｅｃ）キットを使用して、リボプローブを発生させる。形質転換された植 物および対照植物からの５０ｇｇの合計のＲＮＡ　（、前述したように調製した ）を、１ｘ　ｌ　Ｑ’ｃ　ｐｍのリボプローブと混合し、そして３０μＩの４０ ミリモルのＰＩ　ＰＥＳ　（ｐＨ６，４）　、４００ミリモルのＮａＣ＋、およ び８０％のホルムアミドを含有する溶液の中で４５．５℃において１６時間イン キュベーションする。生ずるハイブリッドを、３５０μｌの３００ミリモルのＮ ａＣＬ　１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ミリモルのＥＤＴＡ、 ４０ｇｇ／ｍｌのＲＮアーゼおよび２　ｕ　ｇ／ｍ　］のＲＮアーゼＴ１を含有 する溶液を添加することによって、ＲＮアーゼで３０℃において３０分間消化す る。インキュベーション後、ＲＮアーゼをＳＤＳを消化物に０，５％の最終濃度 で添加し、そしてそれを５０ｇｇのプロテイナーゼにで３７℃において３０分間 処理することによって消化する。次いで、ＲＮアーゼおよびプロテイナーゼにで 処理したハイブリッドを等しい体積のフェノール：クロロホルム：　ＩＡＡ　（ ２５：２５：１）で抽出し、そして２．５体積のエタノールで沈澱させる。ＲＮ Ａの試料を８モルの尿素を含有する４、５％のアクリルアミドゲル上で分析する 。 タンパク質の分析 形質転換された植物の中でアベナ（、Ａｖｅｎａ）フィトクロムの発現の存在は 、また、タンパク質レベルにおいて、アベナ（Ａｖｅｎａ）タンパク質を特異的 抗体で検出するか、あるいは暗所および明所で合計のフィトクロムのスペクトル 活性の増加を評価することによって、評価することができる。フィトクロムタン パク質のレベルは、モノクローナルまたはポリクローナルの抗フィトクロム抗体 を使用するイムノプロット手順により決定した［シャンクリン（Ｓｈａｎｋ　ｌ 　ｉｎ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８４．３５ ９−３６３　（１９８７）に記載されているコ。ポリクローナル抗体をウサギに おいて高度に精製したアベナ（Ａｖｅｎａ）フィトクロムに対して発生させ、そ して固定化したアベナ（Ａｖｅｎａ）フィトクロムを含有するＡｆｆｉ−Ｇｅｌ 　１０カラムの使用により精製した。５０％のエチレングリコール、１００ミリ モルのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，３）、１４０ミリモルの硫酸アンモニウム、 ２０ミリモルの重亜硫酸ナトリウム、１０ミリモルのＥＤＴＡ、および新しく添 加した４ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオライドの溶液（緩衝液Ａ） の中で、ホモジナイゼイションすることによって、凍結した組織からタンパク質 抽出した。抽出物をポリエチレンインの中で１０％（Ｗ／Ｖ）溶液（ｐＨ７，８ ）の添加により０．１％（ｗ／　ｖ　）とし、５分間撹拌し、そして５０．　０ ００×ｇで２０分間遠心することによって透明にした。上澄み液のタンパク質濃 度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏｒ ａｄ）を使用して決定し、そして３５μｇのタンパク質を含有する各抽出物の体 積を１０％のグリセロール、３％のＳＤＳ、０゜２５モルのトリス−ＭＣＩ　（ ｐＨ６，８）　、０．２ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー、および０．７モ ルのβ−メルカプトエタノールの溶液と混合し、３分間沸騰させ、そして７％の ＳＤＳのポリアクリルアミドゲル上で展開した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル の電気泳動後、タンパク質をニドｏセルロース（ＨＡＨＹ　３０４　ＦＯ，Ｍｉ 　Ｉ　ｌ　ｉ　ｐｏｒｅ）に電気泳動的に移した。免疫反応性のフィトクロムの バンドを比色的に可視化し、ここでウサギ免疫グロブリンに対して向けられたア ルカリ性ホスファターゼ接合ヤギｉｇＧおよびホスフェート基質ニトロブルーテ トラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートと組 み合わせてウサギ抗フィトクロム免疫グロブリンを使用した。 フィトクロム活性のスペクトル分析は、イムノプロット分析について前述したよ うに抽出したタンパク質を使用して実施したが、ただしポリニチレンイミンの添 加および遠心による透明化後、フィトクロムは硫酸アンモニウムを２５０ｍｇ／ ｍｌに添加し、そして前述したように５０゜０００ｘｇで遠心により集めた。沈 澱を１／２強度の重亜硫酸ナトリウムの代わりに１４ミリモルのβ−メルカプト エタノールを含有する緩衝液Ａ（前述の）の中に再懸濁した。フィトクロムの特 別の定量は、この緩衝液の中で、二重波長（Ａ７ｓｏ／Ａｓ５ｓ）の分光光度測 定を使用して、飽和の赤色光または近赤色光の照射後、シマズ（Ｓｈｉｍａｄｚ ｕ］　ＩＪＶ３０００分光光度計を使用して実施した。Ｐｒについて１．２Ｘ１ ０’１１モル／　ｃ　ｍの吸光係数および赤色光中で８６％のＰｆｒの光平衡を フィトクロム含量のすべての計算に使用した。 本発明を次の実施例においてさらに説明する。これらの実施例において、特記し ない限り、すべての部および百分率は重量により、そして度はセ氏である。これ らの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、例示のみを目的とすること を理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本 質的特性を確認することができ、そしてその精神および範囲を逸脱しないで、本 発明の種々の変化および変更を行って、それを種々の用途および条件に適合させ ることができる。 実施例１ 中断されないフィトクロムの解読領域を含有するＤＮＡ構成体を推進するための プラスミドｐＧＰ８．２−２１、ｐａｐｓ、２−２２、ｐＣＶ５、ｐＣＶ５Ｂお よびＣＶ５Ｂ３の構成ｐＡＦ’：３．１、ｐＧＰ２．４−１、ｐＧＰ８．２−１ およびｐＧＰ８゜２−２はバージエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら［核酸の研究（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１３：８５４３−８５５９（１ ９８５）］およびバージエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら［遺伝子（Ｇｅｎｅ）６１　 ：３３９−３４８　（１９８７）コに開示されており、そして１９８８年５月２ ７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｔｏｎ）（米国マリイランド 州２０８５２−１７７６０ツクビレ）に受託された。プラスミドｐＡＰ３．１は ＡＴＣＣ受は入れ番号６７７１３を有し、プラスミドｐＧＰ２．４−１はＡＴＣ Ｃ受は入れ番号６７７１５を有し、プラスミドｐＧＰ８．２−１はＡＴＣＣ受は 入れ番号６７７１４を有し、そしてプラスミドｐＧＰ８．２−２はＡＴＣＣ受は 入れ番号６７７１６を有する。カラスムギのフィトクロムのゲノムのクローンｐ ａｐｓ、２−１、ｐＧＰ８．２−２、およびｐＧＰ２．４−１、およびｃＤＮＡ のクローンｐＡＰ３．１の配列を使用してキメラ遺伝子を作り、この遺伝子は１ ｋｂｐの３型フイトクロム遺伝子からの５°　プロモーター配列、５°非翻訳リ ーダー、両者の３および４型のフィトクロムの解読配列から成る中断されない解 読領域および１ｋｂｐの４型アベナ（ＡＶｅｎａ）フィトクロム遺伝子からの３ ゛フランキング配を含有する。 高い塩の緩衝液中で２．５％ｇのｐＧＰ８．２−２をＸｂａｌ、ＥｃｏＲＩおよ びＰｓｔｌで切断することによって、フィトクロム３型遺伝子の５゛転写された 部分を得た。Ｘｂａｌはクローニングされなかったｐａｐｓ、２−２プラスミド の部分を切断し、そして望ましくないインサートを含有するクローンの数を減少 する消化において使用した。この消化は、２．５６ｋｂの断片上に存在する転写 した領域を生じた。ｐＧＰ８．２−２の消化産生物を、ＥｃｏＲｌおよびＰｓｔ Ｉで完全に消化したベクターｐＵｃ１８とｌ：ｌ（ｗ：ｗ）混合した。リガーゼ で一夜処理した後、この混合物を使用してＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０７を形質転換 し、そして形質転換したバクテリアを５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル ホスフェート（Ｘ−ｇａｌ）およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ） を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。白色コロニーから小規模のプラスミ ドＤＮＡ分離手順を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。これは適当な抗生 物質（アンピシリン）を含有するＬＢ培地の５ｍｌのアリコートを単一のバクテ リアのコロニーで接種することによって達成した。３７℃において激しく農産し ながら一夜インキユベーションした後、各培養物の１．５ｍｌをマイクロ遠心管 の中に注いだ。これらの管をマイクロ遠心機内で２０秒間遠心し、そして培地を 吸引により除去し、バクテリアの沈澱をできるだけ乾燥して残した。 追加の１．５ｍｌの培養物を管に添加し、そして上の工程を反復した。 沈澱をリゾチーム（使用直前に溶液に添加した）を有するＧＴＥ緩衝液（５０ミ リモルのグルコース、１０ミリモルのＥＤＴＡ、２５ミリモルのトリス−ＨＣｌ 、ｐＨ８，０）の１００μｍの水冷溶液の中に再懸濁した。室温において５分後 、２００μｌの溶菌緩衝液（０，２ＮのＮａＯＨおよび１％の５ＤＳ）の新しく 調製した溶液を管に添加し、そして内容物を２または３回の急速な倒立により混 合した。管を５分間氷上に配置し、次いで１５０μｌの酢酸カリウムの水溶液ｐ Ｈ４，８（１１゜５ｍｌの氷酢酸および２８．５ｍｌのＨ２Ｏを６０　ｍ　ｌの ５モルの酢酸カリウムに添加することによって調製した）。管を鋭（数回倒立す ることによって、内容物を混合した。氷上で５分後、管をマイクロ遠心機内で４ ℃において５分間遠心した。上澄み液を新しい管に移し、そして等しい体積のフ ェノール／クロロホルムを各々に混合しながら添加した。 生ずる乳濁液をマイクロ遠心機内で２分間遠心し、そして上澄み液を新しい管に 移した。２体積のエタノールを添加し、そして管の内容物をよく混合した。室温 において２分後、ＤＮＡを周囲温度においてマイクロ遠心機内で５分間遠心した 。上澄み液を廃棄し、そして管を紙タオル上で倒立位置に保持して流体のすべて を排出した。沈澱を２５０μ］の７０％のエタノールで洗浄し、次いて管を再遠 心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱を真空デシケータ−中で短時間合成した 。粗製プラスミドＤＮＡを５０μｍのＴＥ　ｐＨ８，０中に溶解し、そして所望 のインサートを含有するプラスミドが同定されるまで、適当な制限消化により分 析した。このプラスミドをｐＧＰ８．２−２１と表示した（参照、第２図）。 １０μｇのｐＧＰ８．２−２１を制限エンドヌクレアーゼＡｃｃｌで、０．８ユ ニツトの酵素／μｇのＤＮＡを使用して５．１０．１５および２０分間３７℃に おいて部分的に消化した。これらの消化条件下に、すべての時点は部分的に消化 したＤＮＡを含有しので、すべての時点からのＤＮＡを引き続くプロセシングの ために組み合わせた。１／１０体積の１０×クレノー塩（０，５モルトリス−１ （Ｃ１，ｐＨ７，２またはｐＨ７，５，０１モルのＭｇ　Ｓ　Ｏａ　、１０ミリ モルのＤＴＴ）　、１／２０体積の５ミリモルのデオキシヌクレオチドトリホス フエート混合物（すべての４つのｄＮＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼＩの１ユ ニ１．トのクレノー断片／ｌ１ｇのＤＮＡを添加することによって、Ａｃｃ１部 位の５゛オーバーハングをフィルインした。このフィルイン反応を室温において ３０分間インキュベーションした。生ずる平滑末端のＤＮＡｆｅＰ　ｓ　ｔＩで 切断し、そしてＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで完全に消化したベクターｐＬｌ ｃ１８中に結合した。結合混合物のアリコートを使用してＥｃｏｌ＋　ＪＭ１０ ７を形質転換し、形質転換混合物のアリコートＬＢ寒天＋Ｘ−ｇａｌおよびＩＰ ＴＧ上で平板培養し、そして所望の１．９ｋｂｐのインサートを含有するものが 同定されるまで、白色コロニーからのプラスミドを分析した。生ずるプラスミド をｐａｐｓ、２−２２と命名し、これは１．９ｋｂのフィトクロム遺伝子、３８ ｂｐの５′中断されない配列を含む、および１．８６ｋｂのタンパク質解読配列 を含有した（参照、第３図）。 転写開始部位、第１の８５ｂｐの５°非翻訳リーダー配列、および１ｋｂｐの上 流のプロモーター配列を含有するフィトクロム３型遺伝子の領域は、１０μｇの プラスミドｐＧＰ８．２−１をＫｐｎｌで低い塩の緩衝液中で完全に消化するこ とによって得られた。ＫｐｎＩ部位の３′オーバーハングを、ＤＮＡをＤＮＡポ リメラーゼＩのクレノー断片とともに、この実施例において前に記載した反応条 件下に２時間インキュベーションすることによって、平滑末端とした。ポリメラ ーゼを加熱不活性化し、そして平滑末端のＤＮＡをＨｉｎｄｌＩＩで完全に消化 した。 生ずるＤＮＡを１：１（ｗ：ｗ）の比で、ＨｉｎｄｌＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで 切断したｐＵｃ１８に結合した。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０７を結合体のアリコー トで形質転換し、そしてＸ−ｇａ］およびＩ　Ｔ　Ｐ　Ｇを含有するＬＢ寒天上 で平板培養した。白色コロニーを形質転換平板から分析し、そしてｐＪ−１と呼 ぶプラスミドが得られ、これはｐｃｙｐ３゜２−１からの１．１ｋｂｐのプロモ ーターを含有した。このクローニング工程の結果は、ｐＵｃ１８ポリリンカーか らの制限酵素の認識部位を１．１ｋｂｐの断片の末端に添加して、ｐＵｃ１８中 のこれらのポリリンカ一部位の多くを引き続くクローニング工程に利用可能とし た。プラスミドｐＪ−ｉをＸｂａｌおよびＨｊｎｄｌ　Ｔ　Ｉで切断し、そして １゜１ｋｂｐのプロモーター領域を、高い塩の緩衝液の中てＸｂａｌおよびＨｉ ｎｄｌｌｌで完全に消化したクローニングベクターｐＭＳＰ’Ｋ［１９８８年６ 月８日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏａｌｅｃｔｉｏｎ）、米国マリイラン ド州１０８５２０ツクビレ、に受託された、ＡＴＣＣ受託＃６７７２３コ中に再 結合した。ｐＭＳＰ’には、次のものを含有するプラスミドベクターである：ｐ ＵＣ１９ポリリンカー、複製のｐＢＲ，３２２由来、スペクノマイシン／ストレ プトマイシン（ｓｐｅｃ／５ｔｒｅｐ）抵抗性配列、およびネオマシンホスホト ランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ　ＩＩ）解読配列、これは上流のプロモーター領 域と、植物について選択可能なマーカーとしてカリフラワーのモザイクウィルス ３５Ｓ転写体からの下流のポリアデニル化シグナルにより限界を確定されている （参照、第４図）。結合混合物のアリコートを使用してＥ、ｃｏ１ｉ菌株ＨＢＩ ＯＩを形質転換し、そして所望の１．１ｋｂｐのインサートをもつベクターを含 有するプラスミドが同定されるまで、個々の５ｐｅｃ／５ｔｒｅｐ抵抗性コロニ ーを分析した。このプラスミドをｐＣＶ５と表示する。（参照、第４図）。 プラスミドｐＣＶ５　（１，５μｇ）およびｐＧＰ８．２−２２　（３μｇ）の 両者をＰｓｔＩおよびＸｂａＩで完全に消化し、そして各消化からの１／１０の ＤＮＡを結合緩衝液中で混合し、そして１６℃において一夜結合した。結合混合 物のアリコートを使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢ　１０　Ｉ形質転ｍシ、そＬｒ ｐｃＶ５中に挿入され７’：ｐＧＰ８．２−２２からの所望の１．．９ｋｂのＰ ｓｔｌ−Ｘｂａｌ断片を含有するプラスミドが同定されるまで、個々の５ｐｅｃ ／５ｔｒｅｐ抵抗性コロニーを分析した（参照、第５図）。このプラスミドをｐ ＣＶ５−８．２と表示した。 ｐＣＶ５−８．２およびｐＡＰ３．１　（各５μｇ）を、高い塩の緩衝液中で制 限酵素ＥｃｏＲＶで完全に消化した。次いで、制限消化物をトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８，４中の０．１モルとし、そして０．　５ユニツトの仔つシ腸アルカリ性ホ スファターゼ（ＣＩＰ）／μｇのＤ　Ｎ　Ａ　（Ｂ　。 ｅｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともにＤＮ Ａを５５℃において３０分間インキュベーションすることによって、ｐＣＶ５− ８．２を脱リン酸化した。ＤＮＡ溶液を等しい体積のフェノール（使用するフェ ノールを使用前に０．１モルのトリス−）ＴＣＩ、ｐＨ８，０で飽和する）、フ ェノール：クロロホルム（１：　１）およびクロロホルムで順次に抽出すること によって、ホスファターゼを不活性化した。酢酸ナトリウム０．３モルの最終濃 度に添加し、次いで２体積のエタノールの添加により、ＤＮＡを沈澱させた。Ｅ ｃｏＲＶ消化しかつ脱リン酸化したｐＣＶ５−８．２の遠心および再懸濁後、０ ，５μｇの両者のこのＤＮＡおよびＥｃｏＲＶ消化したｐＡＰ３．１を混合物し そして結合した。結合混合物のアリコートを使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯ Ｉを形質転換し、そしてｐＣＶ５−８．２中にｐＡＰ３．１　（フィトクロムの 解読領域の大部分およびｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの部分を含有する）から の所望の３．０ｋｂｐのＥｃｏＲＶ断片を含有するプラスミドが同定されるまで 、個々の５ｐｅｃ／５ｔｒｅｐ抵抗性のコロニーを分析した。このプラスミドを ｐＣＶ５Ｂと表示する（参照、第６図）。 ｐＣＶ５Ｂ（５μｇ）を、高い塩の緩衝液中で、２０ユニツトの酵素／μｇのＤ ＮＡを使用して３７℃において制限エンドヌクレアーゼｘｂａＩで部分的に消化 した。１０．１５．２０．２５および３０分の消化後、アリコートを取り出し、 そして各アリコートに１μｌの０．５モルのＥＤＴＡの添加により停止した。１ ０．１５および２０分の時点のもはそれらの中にほとんど直線化したプラスミド を有し、それゆえそれらを−緒にし、そしてエタノール沈澱した。生ずるＤＮＡ をＥｃｏＲＩで完全に消化した。１０μｇのプラスミドｐＧＰ２．４−１をＸｂ ａ　ＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化し、そして調製用の４．５％のアクリルア ミドゲル上で展開した。Ｃ末端の解読領域のための配列の情報、プロモーターの 末端イントロン、およびフィトクロム４型遺伝子からの３°プロセシングシグナ ルを含有する１、７ｋｂｐのバンドを、それを臭化エチジウムでまず染色してＤ ＮＡを可視化することによってゲルから回収した。所望の１．７ｋｂｐの断片を 含有するゲル片をカミソリの刃で切断し、そしてスパチュラで粉砕した。粉砕し たゲル片を４００μｍの溶離緩衝液（１２５ミリモルの酢酸アンモニウム、１． ５ミリモルの酢酸マグネシウム、０．２５ミリモルのＥＤＴＡおよび０．１％の ５ＤＳ）を懸濁させ、そして生ずるスラリーを３７℃において一夜農産すること によって、ゲルの断片からＤＮＡを溶離した。ゲルの断片をガラスウールを通し て濾過することによってスラリーから除去し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱に より回収した。溶離した１、７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を１０ｍ１の ＴＥの中に再懸濁し、そして１μｍを２０μｍの結合混合物の中で０．２５μｇ の消化したｐＣＶ５Ｂ　ＤＮＡに結合した。１μｍの結合混合物を使用してＥ、 ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１を形質転換した。ｐＣＶ５Ｂ中の正しいＸｂａｌに挿入 されたｐＧＰ２゜４−１の１．７ｋｂｐのＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を含有す るプラスミドが同定されるまで、個々の５ｐｅｃ／５ｔｒｅｐ抵抗性コロニーを 分析した（参照、第７図）。生ずるプラスミドをｐＣＶ５Ｂと呼び、そして完全 なフィトクロムの解読領域および１ｋｂｐのフィトクロム遺伝子からの５′　お よび３°　の配列の各々を含有する。 実施例２ プラスミド　ＣＶ３５ｐｈｙｔの構成 ｐＣＶ５Ｂからフィトクロムのプロモーターを除去し、そしてそれをカリフラワ ーのモザイクウィルス（ＣａＭＶ）からＤＮＡとヌクレオチド６４９３および７ ４５４の間で置換することによって、プラスミドｐＣＶ３５ｐｈｙｔを構成した 。この配列はＣａＭＶ中の３５３転写体のためのプロモーター活性を含有し［オ ウデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１３　：８１０ −８１２　（１９８５）コそして３５Ｓプロモーターと呼ぶ。それはプラスミド ｐＵＣ３５に中のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位との 間に含有される［１９８７年１月７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州１０８５−１７７６０ツクビレに受託された、 ＡＴＣ（４託＃６７２８５］　、プラスミドｐＵＣ３５Ｋ　（１０μｇ）を）Ｉ ｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで完全に消化し、５°オーバーハング末端を実施例１に記載す るようにクレノー断片でフィルインした。生ずる平滑末端の断片をＥｃｏＲＩで 完全に消化し、４．５％のアクリルアミドゲル上で展開し、そして３５５プロモ ーターを含有する９６０ｂｐの断片を精製した。３５Ｓプロモーターをクローニ ングベクターｐＭＳＰＫＮ　（１９ｇ８年６月８日にＡＴＣＣに受託された、受 託＃６７７２２）中に挿入し、そしてこのベクターはｐＭＳＰ’Ｋに類似するが 、ただしｐＭＳＰｒＫ中のＮＰＴＩＩ解読配列に操作的に連鎖した３５Ｓプロモ ーターおよびポリアデニル化シグナルは、ｐＭＳＰＫＮの中でノパリンンンター ゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナルと置換されている。ｐＭＳＰＫＮ を使用して、ｐＭＳＰｒＫ中のＮＰＴＩＩの３５３プロモーターとフィトクロム の解読領域に連鎖した３５Ｓプロモーターとの間で起こり得る、潜在的内部の相 同的組み換えを回避した。下に概説するクローニング工程のための適当な制限部 位を含有するクローニングベクター、およびアグロバクテリウム・ツメファシェ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ　ｔｕｍｅｆａｃｊｅｎｓ）中の自律的複 製のためのｐＢＲ３２２１または２以上の配列をｐＭＳＰＫＮの代わりに使用す ることができる。生ずる３′オーバーハングを実施例１においてＫｐｎ１部位に ついて記載したように平滑とし、そして生ずるＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に消化 しく参照、第８図）、ホスファターゼで処理し、そして５％のＰＥＧを含有する ２０μｍの結合混合物中のゲル精製した３５Ｓ断片の１／１０体積に結合した５ μＭＳＰＫＮ中の３５Ｓプロモーターを含有する同定されるまで、個々のプラス ミドを分析した。生ずる構成体をｐＣＶ３５Ｐと呼ぶ。 ホスファターゼで処理し、案０．１μｇの生ずるＤＮＡを混合し、そして０．２ μｇの消化したｐＣＶ５Ｂ３　ＤＮＡに結合した。１μｍの結合を使用してＥ、 ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩを形質転換した。３５Ｓプロモーターがフィトクロムの 解読鎖の転写を指令するような向きに、ｐｃ断片を含有するプラスミドが発見さ れるまで、個々の５ｐｅｃ／５ｔｒｅｐ抵抗性コロニーを分析した。生ずるプラ スミドをｐＣＶ３５ｐｈｙｔＡと呼ぶ（参照、第９図）。 非メチル化ＤＮＡを得られかつ切断が可能であるフィトクロム遺伝子のインサー ト内にＢｃｌＩ部位をつ（るために、ｐＣＶ３５ｐｈｙ　ｔＡプラスミドをｄａ ｍ−Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ菌株の中に形質転換した。Ｎ３２６２６をこの研究におい て使用したが、Ｅ、ｃｏｌｉの普通に入手可能であるＥ、ｃｏｌｉのｄａｍ−菌 株を使用して本発明を達成することができる。能力ｄａｍ−細胞は５０ｍ１のＬ Ｂブロスを１００μ］のＮ５２６２６の一夜の培養物で接種し、モしてＯ，Ｄ、 　６＋１０が０４２５に到達するまで、培養物を３７℃において震盪しながらイ ンキュベーションした。細胞を氷上で０℃に冷却し、そしてバクテリアを１５０ ０ｘｇで１０分間遠心することによって収穫し、２５ｍ１の１００ミリモルのＣ ａＣｌ２の中に懸濁し、そして３０分間氷上でインキュベーションした。 バクテリアを上のようにして再遠心し、１ｍｌの１００ミリモルのＣａＣｌ２の 中に再懸濁し、そして氷上に配置した。氷上で４時間後、２００μｌの能力細胞 を除去し、形質転換性ＤＮＡを添加し、そして細胞を氷上で３０分間インキュベ ーションした。形質転換混合物を４２℃の水浴中で震盪せずに２分間熱衝撃する 。細胞を氷に２分間戻した後、１ｍｌのＳ、　Ｏ，Ｃ，培地を添加した。次いで 、形質転換を実施例１に記載するように進行させた。２０μｇの非メチル化ｐＣ Ｖ３５ｐｈｙｔＡを高い塩の緩衝液中で５ａｌＩで完全に消化し、次いでエタノ ール沈澱した。生ずるプラスミドＤＮＡをＢｃｌＩで部分的に消化した。なぜな ら、Ｂｃ１１部位はクローニングベクターの５μｅｃ／５ｔｒｅ’ｐ’部分の中 に存在するからである。これを実施するために、平板を１００μｍ中に再懸濁し 、そして酵素の供給者により特定された塩の条件下に、１８゜２ユニツトのＢｃ ｌＩで３７℃において５分間消化した。ｐＣＶ５Ｂ３は、また、Ｎ５２６２６中 に形質転換し、そしてプラスミドの非メチル化形態をＢｃｌｌおよび５ａｉｌで 完全に消化した。消化したＤＮＡを０．８％の低融点のアガロースゲル中の電気 泳動により分割した。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、そして所望 の２．５ｋｂｐの断片を含有するアガロースの片を切り出し、そしてマイクロ遠 心管の中に入れた。次いで、管を一８０℃において３０分間凍結し、そして融解 した。次いで、アガロースをスパチュラで粉砕し、そして管を１０分間遠心した 。管の底のアガロースの沈澱を乱さないで、上澄み液を管から取り出した。ＤＮ Ａを１／１０体積の３モルの酢酸ナトリウムおよび２体積のエタノールの添加に より沈澱させ、次いで一８０℃において１５〜３０分間インキュベーションした 。ＤＮＡをマイクロ遠心機中で４℃において１５分間遠心することによって回収 した。ＤＮＡの沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、真空下に乾燥し、そしてＴ Ｅ緩衝液中に再懸濁した。生ずるｐＣＶ５Ｂ３　ＤＮＡを、ＢｃｌＩで部分的に 消化し、そして５ａｌｌで完全に消化したｐＣＶ３５Ｐ　ＤＮＡに結合した。結 合混合物のアリコートを使用してＥ、ｃ○１１菌株ＨＢＩＯＩを形質転換し、そ してｐ　ＣＶ　３５　Ｐの中でフィトクロム解読配列内のＢｃ１１部位に挿入さ れたｐＣＶ５Ｂ３からフィトクロム遺伝子の３°末端を含有する所望の２．５ｋ ｂｐのＢｃｌｌ／５ａｉ１断片が回収されたものが同定されるまで、個々のプラ スミドを分析した（参照、第１０図）。生ずるプラスミドをｐＣＶ３５ｐｈｙ　 ｔと呼び、そしてこれは３５Ｓカリフラワーのモザイクウィルスのプロモーター に操作的に連鎖したｐＣＶ５Ｂ３からの完全なフィトクロム解読配列を含有する 。 実施例３ トランスジェニックタバコの中でフィトクロムの過度の発現ｐＣＶ３５］）ｈｙ ｔは、３載接合技術により、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１からアグロバクテリウ ム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）菌株ＧＶ３８５０の中に移動化した。プラスミドｐＲＫ２０１３を含有するＥ 、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯ１を、３載接合におけるプラスミド移動化のためのヘル パーとして使用した。バクテリアの各菌株、ｐＣＶ３５ｐｈｙｔ構成体を含有す るＨＢｌｏｌ、ｐＲＫ２０１３を含有するＨＢＩＯＩ、およびＧＶ３８５０を別 々の５ｍｌのルリア・ベルタイン（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｉｎ）（ＬＢ）ブロ ス培養物中で適当な選択的抗生物質の存在下に一夜増殖した。 培養物から細胞を４０００ｘｇで１０分間２２℃において遠心することによって 収穫し、次いで５ｍｌのＬＢジブロス中再懸濁した。１００μ］の３つの培養物 の各々を１．５ｍｌのエツベンドルフ管中で混合し、そして混合物全体を無菌の ニトロセルロースのディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ＨＡ型フィルター）上にピ ペラフイルターることによって接合を実施した。各ニトロセルロースのディスク を６〜８枚のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃濾紙のディスク上に配置して培養 物から過剰の液体を除去し、これにより混合物中のバクテリアを濃縮した。次い で、ニトロセルロースのディスクを１００ｍｍのペトリ皿中のＬＢ寒天上に配置 し、そして３０℃においてほぼ１６時間インキュベーションした。インキュベー ション後、１ｍｌの１０ミリモルのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４を使用して、バクテリアを ニトロセルロースのディスクから無菌の４ｍｌのポリプロピレンの培養管中に洗 浄して入れた。バクテリアを系統的に希釈し、そして種々の希釈物を１００μｇ ／ｍｌの各リファンパシン、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含 有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。 ３０℃において３日間インキュベーションした後、平板上で増殖する抵抗性コロ ニーを取り上げ、そして所望のインサートＤＮＡの存在を、実施例１に記載する 小規模のプラスミド分離を使用して、個々のコロニーから調製したＴｉプラスミ ドのサザンプロット分析により確証した。Ｔｉプラスミド中にｐＣＶ３５ｐｈｙ ｔ構成体を含有するバクテリアのコロニーを同定し、そしてＧＶ３８５０−３５ ｐｈｙｔと表示した。 ＧＶ３８５０−３５ｐｈｙｔを使用してタバコの葉のディスクのアグロバクテリ ウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）の感染を経て、３５Ｓプロモーター／フイトクロムのキメラ遺伝子を植物の ゲノムの中に移動化した。無菌の培地および異種生物を混じない植物／バクテリ アの培養物の操作のために標準の無菌的技術に従い、これは層状流れのフードを すべての植物について使用することを包含する。葉のディスクの感染のための鉢 植のタバコ植物ｊ、１２時間、２４℃日中、１２時間、２０℃夜のサイクルで、 はぼ８０％の相対湿度で、混合した冷白色蛍光および白熱光の下に維持した成長 室内で成長させる。タバコの葉のディスクの場合は、本質的にホルシュ（Ｈｏｒ ｓｃｈ）らの方法により実施する［ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）、Ｒ，Ｂ、　、フ リ（Ｆ　ｒｙ）　、Ｊ、　Ｅ、　、ホフーｖン（Ｈｏｆ　ｆｍａｎ）、Ｎ、Ｌ、 　！イキホルツ（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ）　、Ｄ、　、ｏジャース（Ｒｏｇｅ　ｒ 　ｓ）　、Ｓ、Ｇ、およびフラレイ（Ｆｒａｌｅｙ）、Ｒ，Ｔ、（１９８５）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７．１２２９−１２３１］。 若い葉、完全に広がらずかつほぼ４〜６インチ、を、はぼ４〜６週齢のタバコ植 物からメスで収穫する。葉をほぼ５００ｍ１の１０％のクロロックス（Ｃｈｌｏ ｒｏｘ）　、０．１％のＳＤＳ溶液の中に沈め、次いで無菌の脱イオン水で３回 すすぐことによって、葉を表面滅菌する。無菌の紙ポンチを使用して全葉から、 直径６ｍｍの葉のディスクを調製する。 ｐＣＶ３５ｐｈｙｔ構成体を有するアグロバクテリウム（Ａ　ｇ　ｒ　ｏ　ｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ）の−夜のＬＢブロスの１：１０希釈物の２０ｍ１の中に葉のデ ィスクを数分開法めることによって、葉のディスクを接種する。接種後、ＣＮ寒 天培地（１バツグのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ）　、３０ｇノスメスース、８ｇの寒天 、Ｑ、１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのＮＡＡおよび１ｍ］の１ｍｇ／ｍｌのＢＡＰ／］ 、ｐＨ５，８）を含有するペトリ皿に葉のディスクを配置する。平板をバラフィ ルムでシールし、そして混合した蛍光およびｒＧｒｏおよび５ｈｏＪ植物光（Ｇ ｅｎｅｒａｌ　Ｅアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の葉のデ ィスクを除去しそして形質転換したタバコ細胞の成長について選択するために、 葉のディスクを５００ｍｇ／ｌのセフオタキシムおよび１００ｍｇ／］のカナマ イシンを含有する新鮮なＣＮ緩衝液に移す。セフオタキシムを凍結した１００ｍ ｇ／ｍｌの原溶液として保持し、そしてオートクレーブ処理後培地に無菌的に添 加する（０４５μｍのフィルターを通して濾過滅菌する）。新鮮なカナマイシン 原溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）を各使用のために調製し、そしてオートクレーブ処理 した培地に濾過滅菌して入れる。 葉のディスクを前述の成長条件下に３週間インキュベーションし、次いて同一組 成の新鮮な培地に移す。カナマイシン選択した外植体上で発育するほぼ１〜２週 後の５３の苗条を無菌のメスで切除し、そして１００ｍｇ／］のカナマイシンを 含有するＡ培地（１）く、ソゲのＭＳ塩（Ｇｌｂｅｏ）、１０ｇのスクロース、 および８ｇの寒天／１）の中に植える。 カナマイシンの中で根付いた４つの苗条を土に移し、そして前述の成長室の中で 成長させた。これらの小植物を７Ａ、９Ａ、９Ｂおよび５４Ａと表示した。 個々の形質転換した植物を、ＲＮアーゼ保護手順を使用して、アベナ（Ａｖｅｎ ａ）のフィトクロムの発現の存在について分析した。これを達成するために、ア ベナ（Ａｖｅｎａ）のフィトクロム３型遺伝子中の転写の開始をオーバーラッピ ングするＤＮＡ断片を、ｐｐＣＶ５Ｂ３　（実施例１に記載した）から、次のよ うにして分離した。１０ｇｇのプラスミドを高い塩の緩衝液中でＨｉｎｄｌｌｌ および５ａｉｌで切断し、消化したＤＮＡを４，５％のポリアクリルアミドゲル を通して展開し、そして所望の８００ｂｐの断片を精製する。次いで、ＤＮＡ断 片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｉｌで切断しそしてホスファターゼで処理した ｐＧＥＭ３　（Ｐｒｏｍｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）＋：結合した。ＳＦ３　ＲＮＡポ リメラーゼがキメラのフィトクロムのメ・ンセイジに対して相補的なＲＮＡを合 成するような向きで、ｐＣＶ５Ｂ３からの５ａｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有 するものが同定されるまで、個々のプラスミドを分析した。生ずるｐＧＥＭプラ スミドをｐＳＰ３．３と呼んだ（第１１図に「プローブ」として示す）。プラス ミドｐＳＰ３．３をＥｃｏＲＩで切断することによって直線化し、そして［３２ ｐ］プローブをそれからプロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ） キットを製造業者のプロトコルに従い使用して発生させた。 葉のディスクの接種の手順を経て形質転換された植物の中のカラスムギのフィト クロムの発現を分析するために、ＲＮＡを各カナマイノン抵抗性の植物から分離 し、そして形質転換性ＤＮＡによりエンコードされる特異的ＲＮＡ転写体の存在 について試験した。土の中に鉢植後、そして植物がほぼ１０枚の葉の段階に成長 したとき、１ｇの葉の組織を各植物から収穫し、そして液体窒素の中で凍結した 。凍結した葉の組織を乳鉢および乳棒で粉砕し、次いで４ｍｌのプロイテイナー ゼに溶液（５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０，１０ミリモルのＥＤＴ Ａ、および２％のＳＤＳ中の２５０ｇｇ／ｍｌのプロイテイナーゼＫ）５０℃に おいて１０分間消化した。次いで、この溶液を等しい体積のフェノール：クロロ ホルム：イソアミルアルコールで２回抽出し、そして核酸を水性相から０．６体 積のイソプロパツールで０，３モルの酢酸ナトリウムの存在下ｌ二沈澱させた。 −２０℃において一夜のインキュベーション後、核酸を１２．ＯＯＯｘｇにおけ る遠心により集め、そして沈澱を１゜５ｍｌのＨ２Ｏの中に再懸濁する。ＲＮＡ を示差的にＤＮＡから、０゜５ｍｌの８モルＬｉＣ１の添加および氷上の２時間 のインキュベーションにより、沈澱させた。沈澱を４℃において２０分間１２． ０００Ｘｇで遠心することによって集め、モしてＨ２Ｏの中に再懸濁させ、そし て前述したように同一濃度のＬｉＣ］で再沈澱させた。次いで、ＲＮＡをＨ２Ｏ の中に再懸濁し、そして１／１０体積の３．０モルの酢酸ナトリウムｐＨ６，２ および２，５体積のエタノールの添加および一２０℃において４時間より長い時 間インキュベーションすることによって沈澱させた。ＲＮＡをＨ２Ｏ中に懸濁し 、そして−８０℃において貯蔵した。 ＲＮアーゼの保護の手順［ジン（Ｚｉｎｎ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）３４．８６５ −８７９．１９８３、メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、核酸の研究ＣＮｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１２．７０３５−７０５６　（１９８４ ）］を使用して、形質転換された植物から分離したＲＮＡ中のアベナ（Ａｖｅｎ ａ）フィトクロムのメツセージを検出した。各形質転換体５０ｕｇのＲＮＡを、 ｌＸ１Ｏ’ｃｐｍ（７）ｐＳＰ３．３から発生したりボブローブと、３０μｍの ４０ミリモルのＰＩＦＥＳ　ＣｐＨ６，４）　、４００ミリモルのＮａＣ１、お よび８０％のホルムアミドを含有する溶液の中で４５．５℃において１６時間イ ンキュベーションした。生ずるハイブリッドを、３５０μｊの３００ミリモルの ＮａＣ１，１０ミリモルのトリス−ＨＣＬ　ｐ）（７，５，５ミリモルのＥＤＴ Ａ、４０ｇｇ／ｍ１のＲＮアーゼおよび２ｕｇ／ｍＩのＲＮアーゼＴ１を含有す る溶液を添加することによって、ＲＮアーゼで３０℃において３０分間消化した 。インキュベーション後、ＲＮアーゼをＳＤＳを消化物に０．　５％の最終濃度 で添加し、そしてそれを５０ｇｇのプロテイナーゼにで３７℃において３０分間 処理することによって消化する。 次いで、ＲＮアーゼおよびプロテイナーゼにで処理したハイブリッドを等しい体 積のフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２５：１）Ｔ抽出し、そして２ ．５体積のエタノールで沈澱させる。ＲＮＡの試料を８モルの尿素を含有する４ 、５％のアクリルアミドゲル上で分析した。 ｐＣＶ３５ｐｈｙｔ中のフィトクロム−３５５配列接合におけるＸｂａ１部位か らフィトクロム配列に対して内部の第１ＨｉｎｄｌｌＩ部位に伸長する６４５ｂ ｐの断片（参照、第１１図）は、前記３５ｐｈｙｔ構成体を発現する植物中でプ ローブにより保護されることが期待される。 １つのこのような分析の結果は第１１図に示されている。赤色光の照射後２時間 で貧化したアベナ（Ａｖｅｎａ）の実生から分離した合計のＲＮＡの１０ｇｇを 、この実験において、アベナ（Ａｖ　ｅ　ｎ　ａ）　型フィトクロムの発現のた めの陽性の対照として展開した。野生型タバコのＲＮＡおよび植物７Ａから分離 したＮＡは、記載する実験の条件下にでｐＳＰ３．３プローブへのハイブリダイ ゼーションを示さなかった。しかしながら、植物９Ａ、９Ｂおよび５４Ａからの ＲＮＡは、強いハイブリダイゼーションのシグナルを示し、予測した６４５塩基 の保護された断片を生じた。この結果が実証するように、植物９Ａ、９Ｂおよび ５４Ａは、フィトクロムのレベルが通常極めて低いとき、明所においてさえ安定 なアベナ（Ａｖｅｎａ）型のフィトクロムＲＮＡを高いレベルで産生ずる。 ３５Ｓフィトクロム構成体で形質転換したタバコ植物は、成長して成熟すること ができた。このとき、ＲＮアーゼ保護分析によりフィトクロムを過度に発現する ことが示された、植物９Ａ、９Ｂおよび５４Ａは、野生型タバコと形態学的に異 なることが観測された（参照、第１２図）。 しかしながら、フィトクロムを過度に発現しない植物７Ａは、野生型タバコと形 態学的に区別できなかった。野生型植物と比較したとき、フィトクロムを過度に 発現する３つの植物はすべて緑色の色素の増加、分画の増加（植物の基部からの より多い茎の形成）、減少した頂芽優生、および配量距離の減少を示した。後者 の特性は、同一の数の葉の節対花部を有するが、正常の植物のほぼ半分の高さで ある植物を生じた。植物９Ａ、９Ｂおよび５４Ａは、非発現性植物７Ａよりわず かに小さい葉を有するが、はぼ同一時期に開花し、そして花部当たり匹敵しうる 種子の収量を有した。 もとの形質転換した植物からおよび／または形質転換した植物の自家受精により 発生した種子から成長した実生から、組織を収穫した。形質転換された植物の中 でアベナ（Ａｖｅｎａ）フィトクロムの発現の存在を、タンパク質レベルにおい て、アベナ（Ａｖｅｎａ）タンパク質を特異的抗体で検出するか、あるいは暗所 および明所で合計のフィトクロムのスペクトル活性の増加を評価することによっ て、評価した。フィトクロムタンパク質のレベルは、モノクローナルまたはポリ クローナルの抗フィトクロム抗体を使用するイムノプロット手順により決定した ［シャンクリン（Ｓｈａｎｋ　ｌ　ｉ　ｎ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ 、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８４．３５９−３６３　（１９８７）に記載されている コ。ポリクローナル抗体をウサギにおいて高度に精製したアベナ（Ａｖｅｎａ） フィトクロムに対して発生させ、そして固定化したアベナ（Ａｖｅｎａ）フィト クロムを含有するＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０カラムの使用により精製した。５０％ のエチレングリコール、１００ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３Ｌ　１ ４０ミリモルの硫酸アンモニウム、２０ミリモルの重亜硫酸ナトリウム、１０ミ リモルのＥＤＴＡ、および新しく添加した４ミリモルのフェニルメチルスルホニ ルフルオライドの溶液（緩衝液Ａ）の中で、ホモジナイゼイションすることによ って、凍結した組織からタンパク質抽出した。抽出物をポリエチレンインの中で １０％（Ｗ／Ｖ）溶液（ｐＨ７，８）の添加により０．１％（Ｗ／Ｖ）とし、５ 分間撹拌し、そして５０．ＯＯＯｘｇで２０分間遠心することによって透明にし た。上澄み液のタンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパ ク質アッセイ試薬（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して決定し、そして３５μｇのタンパ ク質を含有する各抽出物の体積を１０％のグリセロール、３％のＳＤＳ、０．２ ５モルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ６，８）　、０．２ｍｇ／ｍｌのブロモフェノー ルブルー、および０．７モルのβ−メルカプトエタノールの溶液と混合し、３分 間沸騰させ、そして７％のＳＤＳのポリアクリルアミドゲル上で展開した。ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲルの電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース（ＨＡ ＨＹ　３０４　ＦＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的に移した。 免疫反応性のフィトクロムのバンドを比色的に可視化し、ここでウサギ免疫グロ ブリンに対して向けられたアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギｉｇＧおよびホス フェート基質ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリルホスフェートと組み合わせてウサギ抗フィトクロム免疫グロブリンを 使用した。 １つのこのような分析の結果を第１３図に示す。形質転換した植物９Ａおよび５ ４Ａは、明所および暗所の両者に適合する苗条において、野生型植物または植物 ７Ａより、非常により高いレベルで全長のフィトクロムを明瞭につくっている。 植物９Ａおよび５４Ａにおけるタンパク質レベルの増加は、アベナ（Ａｖｅｎａ ）を認識するが、内因性タバコフィトクロムを認識しないモノクローナル抗体を 使用して示されように、形質転換性アベナ（Ａｖｅｎａ）様遺伝子のためである 。全長のアベナ（Ａｖｅｎａ）型フィトクロムは、９Ａの第２世代の実生におい て産生される。植物９Ｂはこれらの実験において試験しなかった。 形質転換した植物中のフィトクロム活性を、９Ａ植物の自家受精から誘導した種 子から成長した実生の抽出物について測定した。タンパク質の抽出物は、次の変 更を使用してイムノプロ・ソト分析について前述したように調製した。ポリエチ レンイミンの添加および遠心による透明化後、粗製のフィトクロムは硫酸アンモ ニウムを２５０ｍｇ／ｍ１に添加し、そして前述したように５０，０００ｘｇで 遠心により集めた。沈澱を１／２強度の重亜硫酸ナトリウムの代わりに１４ミリ モルのβ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液Ａ（前述の）の中に再懸濁し た。フィトクロムの特別の定量は、この緩衝液の中で、二重波長（Ａ７３０／Ａ ６６６）の分光光度測定を使用して、飽和の赤色光または近赤色光の照射後、シ マズ（ＳｈｉｍａｄｚｕコＵＶ３０００分光光度計を使用して実施した。Ｐｒに ついて１．２Ｘ１０’１１モル／Ｃｍの吸光係数および赤色光中で８６％のＰｆ ｒの光平衡をフィトクロム含量のすべての計算に使用した。 このような分析の結果が示すように、存在するアベナ（Ａｖｅｎａ）型およびタ バコのフィトクロムの両者をもつ野生型に比較して、暗所で成長した９Ａにおい て５０％多いフィトクロムの活性が存在する。し力＼しながら、明所で成長した 植物において、１μｇのタンノ（り質の基準で、明所で成長した野生型より、９ Ａ実生において少なくとも１０倍のフィトクロム活性の増加が存在する。さらに 、これらの明所で成長した植物におけるすべての検出可能なフィトクロムは、モ ノクローナル抗体分析に基づくキメラ遺伝子から産生される。 実施例４ ｐｃＶ３５ｐｌ”Ｉｙｔから全体の３５８−フィトクロム遺伝子構成体を除去す ることによって、プラスミドｐＮＰＴ３５ｐｈｙｔを構成した。 ｐＮＰＴ３５ｐｂ）’ｔを作るために使用したノくイナリーベクターｐＺＳ９６ は、入手可能でありかつこの目的に使用できる、多数のノくイナリーベクターの ただ１つの例である。ｐＺＳ９６はオクトピンＴｉプラスミドｐＴｉＡ６からの 左の境界断片およびｐＴｉＡｃｈ５からの右の境界断片を含有する［パン・デン ・エルイン（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ）、Ｐｌ、リ−（１ｅｅ）　、Ｋ、Ｙ 、　、タウセンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）、Ｊ、およびベトブルーク（Ｂｅｄｂｒ ｏｏｋ）、ジャーナル・オブ・プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｐ ｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕＩａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５：１４９−１５４．１９ ８５コ。境界の断片は、アゲロバクチ１功ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲 介形質転換のプロセスの間に宿主植物ゲノムの中に組み込まれるよう１；なる、 ＤＮＡのセグメントの範囲を定める。植物細胞におけるカナマイシン抵抗性を特 定するキメラのマーカー遺伝子およびｐＵｃ１８のポリリンカーの配列により中 断されたβ−ガラクトシダーゼ（Ｌａｃ　Ｚ）Ｉｔ、左および右の境界断片の間 に位置する。アンピシリン抵抗性遺伝子および複製のｐＢＲ３２２由来は、Ｅ、 ｃｏｌｉ中のベクターの選択および増幅のためのＴ　ＤＮＡの境界配列の外側に 含有される。アグロノくクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中の安定化（ｓｔａ）および複製（ｒｅｐ） を可能とする配列ハ、また、ｐＺＳ９６の中に含有されており、そして緑膿菌（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のプラスミドｐｖｓ　１力１ ら得られた［イトウ（ＩｔＯｈ）、Ｙｌ、ワトソン（Ｗａ　ｔ　ｓ　ｏ　ｎ）、 Ｊ、　Ｍ、　、ハース（Ｈａ　ａ　ｓ）　、Ｄ、およびレイシンガー（Ｌｅｉｓ ｉｎｇｅ　ｒ）　、Ｔ、　、プラスミド（Ｐ］ａｓｍｉｄ）、１１：２０６−２ ２０．１９８４］。 ｐＺＳ９６　（１０μｇ）およびｐＣＶ３５ｐｈｙｔ　（１，０μｇ）を、高い 塩の緩衝液中でＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌで完全に切断した。次いで、ｐＺＳ９ ６を実施例１に記載するようにアルカリ性ホスファターゼで処理し、そして０． １μｇの生ずるプラスミドを０．２μｇのｐＣＶ３５ｐｈｙｔと一夜結合した。 １μｇの結合対を使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩを形質転換し、そして５ ０ｍｇ／ｍｌのアンピンリンを含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。ｐＺＳ ９６の中に挿入された３５Ｓ−フィトクロム遺伝子を含有するプラスミドが同定 されるまで、個々のコロニーを分析した（参照、第１４図）。 ３親液合手順を使用して、ｐＮＰＴ３５ｐｈｙ　ｔをＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢ　１ ０１からアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＬＢＡ４４０ ４．［ヘケ７　（Ｈｏｅｋｅｍａ）　、Ａ、　バーシュ（Ｈｉｒｓｃｈ）Ｒ，Ａ 、　、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３：１７９−１８０．１９８３］に移 動化した（参照、実施例３）。ＬＢＡ４４０４をスクロースを有する最小Ａ培地 （ｌｘＭ９塩［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ、ら、（１９８２）モレキュ ラー・クローニング（Ｍｏ　ｌ　ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｐ、４４０ に記載されているコ、１ミリモルのＭｇ５Ｏ，，１ミリモルのＣａＣｌ２および ０．　４％のスクロース）中で増殖した。ＬＢＡ４４０４−ＮＰＴ３５ｐｈ　を 接合体を、１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する最小Ａ寒天上で選択し た。 実施例５ トランスジェニックトマト中のフィトクロムの過度の発現無菌の培地および異種 生物を混じない植物／バクテリアの培養物の操作の標準の無菌的技術に従い、こ れはすべての移動のために層状流れのフードの使用を包含する。 トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｊｃｏｎ　ｅｓｃｕＪｅｎｔｕｍ　ｖａｒ。 Ｈｅｒｂｓｊ　Ｒｅｄ　Ｃｈｅｒｒｙ）の種子を１０％のりｏｏクス（Ｃ１ｏｒ ｏｘ）　、０．１％のＳＤＳ溶液中で３０分間表面滅菌し、そして無菌の脱イオ ン水で３回すすぐ。種子を８５ｍ１の０ＭＳ寒天培地　゛を含有するマゼンタ（ Ｍａｇｅｎｔａ）ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ　Ｃａｒｐ、）の中にまき、そして 混合蛍光および「グロ・アンド・ショウ（Ｇｒｏ　ａｎｄ　５ｈｏ）Ｊ植物光（ Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）の下でほぼ２５°Ｃに維持した培養室内で 発芽させた。１０〜１５日齢の実生からの子葉をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の接種に使用した。子葉の各されるからほぼ２ｍｍの組織 をメスで除去することによって、子葉を損傷する。損傷した子葉をベトリ皿中の ７５ミリモルののアセトシリンボン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含 むかあるいは含まないＣ７Ｍ寒天培地上に植えた。 子葉の接種のための調製において、最小Ａ＋テトラサイクリン（１μｇ／ｍ、］ ）寒天平板からのＬＢＡ４４０４＋ＮＰＴ３５ｐｈ）’ｔ　（実施例４に記載し た）の単一のコロニーを、３〜５ｍｌの最小Ａブロスを含有する管の中に接種し 、そして二ニー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｈ）プラットフ ォーム農産機中で２８℃において２日間成長させた。子葉の接種の朝、バクテリ アの培養物を無菌の最小Ａブロスで０．１のＯＤ　６６０に希釈し、そして前述 の成長条件下に０．３の０Ｄ６５゜に増殖させた。次いで、この培養物を希釈し ないで子葉外植体の接種に使用した。 子葉外植体を含有するＣＴＭ寒天平板を、５ｍｌのＬＢＡ４４０４−ＮＰＴ３５ ｐｈｙｔバクテリア溶液でほぼ５分間フラッディングした後、溶液を除去した。 平板をタイプ・テープ（Ｔｉｍｅ　Ｔａｐｅ）（Ｓｈａｍｒｏｃｋ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　５ｐｅｃｉａｌｔｙ）でディスクの２つの側に固定し、そして混合 蛍光および「グロ・アンド・ショウ（Ｇｒｏ　ａｎｄ　５ｈｏ）Ｊ植物光（Ｇｅ ｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）の下でほぼ２５℃で２日間インキュベーション した。 植物培養物から過剰のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除 去するために、５００ｍｇ／ｌのセフオタキシムを含有するＯＭＳ液体液体中地 中葉外植体をほぼ１０分間処理した。次いで、それらを５００ｍｇ／］のセフオ タキシムおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する新鮮なＣ７Ｍ培地に移し 、そして前述と同一条件下にほぼ３週間インキュベーションした。次いで、子葉 をＣＴＭと同一の組成および選択因子であるが、１／１０のゼアチン濃度の新鮮 な培地に移した。 はぼ２〜４週後、カナマイシン選択した子葉から発育する苗条を切除し、そして ５０’Ｏｍｇ／ｌのセフオタキシムおよび０または５０ｍｇ／ｌのカナマイシン を含有する０ＭＳ培地の中に植えた。はぼ２〜３週後に根付いたトマトの苗条を ８インチのポット中の土に移植し、そしてプラスチックバッグで覆った。植物を 混合蛍光および白熱光の下で１２時間、２４℃日中：１２時間、２０℃夜のサイ クルで、はぼ８０％の相対湿度において、１週間成長させた後、プラスチックバ ッグを除去した。 完全に期待されるように、タバコの場合おけるように、再生したカナマイシン抵 抗性トマト植物は３５Ｓ−フィトクロム構成体を発現し、したがって暗所および 明所で機能的単子葉フィトクロムを過度に発現する。 これらの植物は、ＣＶ３５ｐｈｙｔで形質転換したタバコを使用する実施例３に おいて得られたフィトクロムの過度の発現に関連するのと同一の、表現型の変化 を表すことが期待される。これらの変化は、減少した頂芽優生、半倭性、増加し た耐陰性、およびより暗い緑色を包含する。 Ｃ７Ｍ培地 ｌｐｋｇのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ） １ｍｌのＢ５ビタミン（１００ｍｌ当たり：ニコチン酸１００ｍｇ、チアミン塩 酸塩１０００ｇ、ピリドキシン塩酸塩１００ｍｇ、Ｍ−イノシトール１０．　０ ００ｍｇ） ３ミリモルのＭＥｓ ３％のグルコース ０．７％の寒天 ｐＨ５，７ オートクレープ処理し、そして１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのゼアチンのストックを添 加する。 ０ＭＳ培地 ｌｐｋｇのＭＳ塩（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ）１ｍｌのＢ５ビタミン（上を参照） ３ミリモルのＭＥｓ ３％のグルコース ０．８％の寒天 １．４００ｍ１のＨ２ｏ１：’７．０ｇの寒天を添加する。 ２、ストックをつくる： ＫＰＰｏ、　５．２５ｇ ＫＨ，Ｐｏ、　２．２５ｇ （ＮＨ４）２Ｓ○４０．５ｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２００，２５ｇ００ｍ１ ３、ＭｇＳＯ４７Ｈ２０ストツク＝２０ｇ／１００ｍ１をつくり、オートクレー ブ処理する。 ４、グルコースのストック＝２０％の溶液をつくり、オートクレーブ処理する。 ５、テトラサイクリンのストック＝１．０ｍｇ／ｍＬエタノール／　Ｈ２０，５ ０％ｖ　／　ｖ中、をつ（す、濾過滅菌する。 最小Ａ培地＋１ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリン（１）および（２）を混合する、 ０．５ｍ］の（３）、５ｍｌの（４）、および０．５ｍｌの（５）を添無菌の培 地および異種生物を混じない植物／バクテリアの培養物の操作の標準の無菌的技 術に従い、これはすべての移動に層状流れのフードの使用を包含する。 カメラ（ｃｎｏｌａ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｖａｒ、Ｗｅ　ｓ　ｔ 　ａ　ｒ）の種子を１０％のクロロクス（Ｃｌｏｒｏｘ）　、０．１％のＳＤＳ 溶液中で３０分間表面滅菌する。無菌の脱イオン水で３回よくすすいだ後、種子 を７５の種子７皿を使用して、発芽培地（３０ミリモルのＣａＣ１□、１．５％ の寒天）を含有するガラスの結晶化皿の中にまいた。次いで、皿を暗所に２５℃ において５日間配置した。 アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＬＢＡ４４０４−ＮＰ Ｔ３５ｐｈｙｔの一夜の培養を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する スクロースを含む無菌の液体の最小Ａ培地の３ｍｌを単一のコロニーで接種する ことによって開始した。培養物を２８℃で１８〜２０時間震盪しな農産インキュ ベーションした。 抽だいの胚軸を１ｃｍのセグメントに切断し、そして２２．５ｍｌの有するＭＳ 液体）平板の中に直ちに配置した。ＬＢＡ４４０４−ＮＰＴ３５ｐｈｙ　ｔの一 夜の培養物（ＯＤｅｓｏ＝１．０〜２．０）の２．５ｍｌのアリコートを、胚軸 片を含有するバクテリア希釈培地の各平板に添加した。３０分後、胚軸片をバク テリアの懸濁液から取り出し、そして２ｃｍのみその中に配置し、これらみぞは １００マイクロモルのアセトシリングノンを含有する新鮮なりＣ−１の表面の中 に形成した。平板を層状流れのフード内に開いたまま３０分間放置して簡単に乾 燥した後、使用した。アガロースの乾燥した表面が過剰の液体を胚軸から吸収す るようにさせ、次いで平板を薄暗い光の中で３日間インキュベーションした。 外植体をＢＣ−１平板から外植体の洗浄溶液（５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム を含有する液状ＭＳ）を含有する皿に移植する。皿を３時間ゆっくり農産して、 外植体からアゲロバクチリアを洗浄した。次いで、外植体を１００ｍｇ／］のバ ンコマイシン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＢＣ−１に移し、そして １６．８時間、明−暗ヤンバー内に２５℃において配置した。 ２１日後、外植体を１００ｍｇ／ｌのバンコマイシン、５０ｍｇ／］のカナマイ シンを含有する新しいＢＣ−１平板に移した。次いで、平板をさらに２１日間成 長室内で２５℃において１６二８の明［のサイクルでインキュベーションした。 カルスの直径は少なくとも５ｍｍであるとき、それらを２００ｍｇ／ｌのバンコ マイシンおよび２５ｍｇ／］のカナマイシンを含有するＢ５−５の苗条の誘導培 地に移した。次いで、培養物を誘導期間の間２５℃において連続の光の中に維持 した。外植体を新しいＢ５−５に２週毎に移した。Ｂ５−５上で３〜１０週の成 長後、認識可能な苗条の原基が現れはじめた。カルスからの切除の多少前に、苗 条を伸長させた。 Ｂ５−５から最初の取り出し後、苗条は一般に高度にガラス状−一厚く、半透明 、カラス様葉および茎の組織であった。それらをＭＳＶ−１、へ培地上で少なく とも２つの３週のサイクルの間サブクローニングした。 苗条の先端および下の数配量は各二次培養物に移し、そして短い光周期−−明所 で１０時間／暗所で１４時間または明所で１２時間／暗所で１２時間−一を使用 して室内で成長させた。この処置は、また、培養中の開花を防止した。 いったん苗条が常態になったとき、それらを生体外で根付かせる試みをしないで 鉢植混合物の中に直接植えた。苗条を寒天表面付近で切除し、そして切断した表 面をルートン（Ｒ○ｏｔｏｎｅ）の中に浸漬した［セキュリティ・ロラン・アン ド・ガーデン・プロダクツ（ＳｅｃｕｔｉＹＬａｗｎ　ａｎｄ　Ｇａｒｄｅｎ　 ｐｒｏｄｕｃｔｓ）Ｓジョーンア州アトラント］。苗条を８インチのボッ中の水 で飽和したメトロ−ミックス（Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ）（Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ　ａ ｎｄ　Ｃｏ、）の中に植え、そしてプラスチックバッグで２週間覆った後、植物 は明瞭に成長していた。 ＲＮＡをある数のアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の形質転換体の葉の組織から抽 出し、そして実施例３に記載されているＲＮＡ抽出およびＲＮアーゼの保護手順 を使用して、アベナ（Ａｖｅｎａ）のフィトクロムの発現の存在について分析し た。野生型アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のＲＮＡは、記載した実験条件下にｐ ＳＰ３．３プローブの保護を示さなかった。しかしながら、ＲＮアーゼ保護によ り試験したすべての３つの形質転換した植物からのＲＮＡは、強いハイブリダイ ゼーションのシグナルを示し、予測した６４５塩基の保護した断片を生じた。こ の結果が実証するように、これらの３つの植物は、フィトクロムのレベルが検出 不可能なほど通常極めて低いとき明所でさえ、安定なアベナ（Ａｖｅｎａ）のフ ィトクロムのＲＮＡを産生じている。 完全に期待されるように、カナマイシン抵抗性Ｂ、ｎｐｕｓ再生体は、アベナ（ Ａｖｅｎａ）のフィトクロムタンパク質を発現し、したがって機能的単子葉のフ ィトクロムを暗所および明所で過度に発現するであろう。結局、これらの植物は 、それらが成熟するとき、ＣＶ３５ｐｈｙｔで形質転換したタバコを使用する実 施例３において得られたフィトクロムの過度の発現に関連する、同一の表現型の 変化を示すであろう。これらの変化は、減少した頂芽優生、半倭性、増加した耐 陰性、およびより暗い緑色を包含する。 アブラナの組織の培地 困盃ぶニＪυ鴎シ１ 立　」潜動し ＮＨ４ＮＯ３２０，６ｍＭ ）ＣＮＯ３１８，８ｒｎＭ ＭｇＳＯ，−７Ｈ２０１，５ｒ＋ｔＭ ＫＨ，、Ｐｏ、　１．２５　 請求 Ｌ求凶ｊ副里爽 遮ｉ　最終濃度 ＫＮＯ３２５，ＯｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ，１，ＯｍＭ ＭｑＳＯ４−７Ｈ２０１、Ｏ藺 ＫＨ２ＰＯ４１，ｓ　ｍＭ ＮＨ，Ｎｏ３３．１　ｍＭ Ｃｊ　Ｃ１２ＪＢ２Ｑ 成分　１Ｌソリし ＣａＣｌ２−２Ｈ２０６，３ｍＭ ｙ下１１日」υＬ 立　Ｌ圃Ｕ ＭｎＣ１２−４Ｈ２０１００ｕＭ Ｈ３ＢＯ３６２００ｕＭ ＺｎＳＯ４−ＶＨ２０３０ｕＭ ＮａＭｏ０４−２Ｈ２０１，２ｕＭ ＣｕＳＯ，＋　−５Ｈ２００、ｌ　ｕＭＣｏＣ１２−６Ｈ２０、０，１ｕＭ ＥａＪΩτΔ チアミン　０．５　ｍｇ／Ｉ Ｔ　ビタミン（１００００Ｘ原溶液） １ビタミシ（１００ＯＯＸ原溶液）（続き）チアミン塩酸塩　５００　ｍｇ／ｌ ユヨチ、酸　５９１１ １１ｆ−イノシトール　Ｚｏｏ　ｇ／ｌキシロース　２００　ｍｇ／ｌ オートクレーブ処理後添力　る： ゼアチン　２　ｍｇ／Ｉ ＩＡＡ　０．１　ｍｇ／１ Ｍ５Ｖ−ラ五 ＤＮＡ等級アガロース　４９７１ ｐＨ５，８ ＭＳ最小有機培地 ＭＳ微量栄養素 ミオ−イノシトール　Ｚｏｏ　ｍｇ／ｌチアミン　０．４　ｍｇ／ｌ ＥＳ−５培地 ＭＳ微量栄養素 ＣａＣｌ２−２Ｈ２０６，３ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ　１００　ｒｒ７ ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０１００ｍＭ ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｐＧＰ８．２−２２ ｐＣＶ５−８．２ ｐＧＰ２．４−１ ＭｓＰＫＮ 部分的ｐｕｃ　１９ ＦＩＧ−８ ｐα３５Ｐ ＦＩＧ、９ ｐｃＶ３５ｐｈｙｔＡ ＲＮＡｓｅＮＡ ｓ−３５ＳＰｈｙｔ　ＲＮＡにより１ 保護された領域 フィトクロムを過度に発現する植物９Ａと正常の植物７Ａとの比較 ＦＩＧ、１２ トランスジエニーツク植物からのタンパク質のイムノプロットレーン１およびｌ Ｏ：精製したアペナのフィトクロムレーン２および３：貧化した実生の抽出物レ ーン２：野生型 レーン３：９Ａ レーン４〜９：明所で成長した苗条 レーン４．６および８：明所で収穫 レーン５．７および９：４日の暗所の適合後収穫 レーン４および５：９Ａ レーン６および７：７Ａ レーン８および９：５４Ａ ＦＩＧ、１４ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法筒１８４％の８）平成３年１月２５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、暗い所および明るい所で野生型植物に関してフィトクロムを過度に発現する トランスジェニック植物。 ２、野生型植物に関して、減少した頂芽優生、半矮性、増加した耐陰性および暗 い緑色から成る群より選択される表現型の特性を示す、上記第１項記載のトラン スジェニック植物。 ３、単子葉植物である、上記第１項記載のトランスジェニック植物。 ４、トウモロコシ、カラスムギ、キビ、コムギ、イネ、オオミギ、モロコシ、ア マランサス、タマネギ、アスパラガス、およびサトウキビから成る群より選択さ れる、上記第３項記載のトランスジェニック植物。 ５、双子葉植物である、上記第１項記載のトランスジェニック植物。 ６、アルファルファ、ダイズ、ペチュニア、ワタ、サトウダイコン、ヒマワリ、 ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、コショウ、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、 トマト、ジャガイモ、ヒラマメ、アマ、ブロッコリー、タバコ、マメ、レタス、 オイルシードレイプ（ｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅ）、カリフラワー、ホウレンソウ 、メキャベツ、アーチチョーク、エンドウ、オクラ、カボチャ、ケール、コラー ドグリーン（ｃｏｌｌａｒｄｇｒｅｅｎ）、チャおよびコーヒーノキから成る群 より選択される、上記第５項記載のトランスジェニック植物。 ７、フウロウソウ、カーネイション、ラン、バラ、ホウセンカ、ペチュニア、ベ ゴニア、フシア（ｆｕｓｃｉａ）、キンセンカ、キク、グラジオラス、アストロ メリア（ａｓｔｒｏｍｅｒｉａ）、サルビア、クワガタソウ、ヒナギクおよびア イリスから成る群より選択される観賞植物である、上記第５項記載のトランスジ ェニック植物。 ８、上記第１項記載のトランスジェニック植物を成長させることによって得られ た種子。 ９、上記第３項記載のトランスジェニック植物を成長させることによって得られ た種子。 １０、上記第５項記載のトランスジェニック植物を成長させることによって得ら れた種子。 １１、単子葉植物から誘導され、フィトクロムのポリペプチドのための単一の中 断されない解読配列からなり、植物を形質転換してフィトクロムの過度の発現を 達成するために使用する組み換えＰＮＡ構成体の中に組み込むことができる核酸 断片。 １２、アベナ（Ａｖｅｎａ）から誘導された上記第１１項記載の核酸断片。 １３、植物を形質転換することができ、核酸プロモーター断片に対して上流（５ ′）でおよびポリアデニル化シグナルを含有する調節配列に対して下流（３′） で操作的に連鎖したフィトクロムのポリペプチドのための単一の中断されない解 読配列からなり、こうして形質転換のとき、前記植物は野生型植物に関して暗い 所および明るい所でフィトクロムを過度に発現する、組み換えＤＮＡ構成体。 １４、核酸プロモーター断片はウイルスのゲノムから誘導される、上記第１３項 記載の組み換えＤＮＡ構成体。 １５、核酸プロモーター断片は、カリフラワーのモザイクウイルスの３５Ｓおよ び１９Ｓ構成成分から成る群より選択される、上記第１４項記載の組み換えＤＮ Ａ構成体。 １６、核酸プロモーター断片は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）のオピンシンターゼ遺伝子から誘導される、上記第１３項記載の組み換え ＤＮＡ構成体。 １７、核酸プロモーター断片は、また、転写および発現をさらに刺激するエンハ ンサーを含有する、上記第１３項記載の組み換えＤＮＡ構成体。 １８、エンハンサーはウイルスのゲノムから誘導される、上記第１７項記載の組 み換えＤＮＡ構成体。 １９、エンハンサーはカリフラワーのモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターか ら誘導される、上記第１８項記載の組み換えＤＮＡ構成体。 ２０、エンハンサーはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ）のオ ピンシンターゼ遺伝子から誘導される、上記第１７項記載の組み換えＤＮＡ構成 体。 ２１、フィトクロムのポリペプチドのための単一の中断されない解読配列は、単 子葉植物から誘導されたフィトクロムのポリペプチドのための解読配列からイン トロンを欠失することによって得られる、上記第１３項記載の組み換えＤＮＡ構 成体。 ２２、フィトクロムのポリペプチドのための解読配列はアベナ（Ａｖｅｎａ）か ら誘導される、上記第２１項記載の組み換えＤＮＡ構成体。 ２３、上記第１３項記載の組み換えＤＮＡ構成体を含有するトランスジェニック 植物。 ２４、上記第１５項記載の組み換えＤＮＡ構成体を含有するトランスジェニック 植物。 ２５、上記第２３項記載のトランスジェニック植物を成長させることによって得 られた種子。 ２６、上記第２４項記載のトランスジェニック植物を成長させることによって得 られた種子。