CN117925696A - 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 - Google Patents
柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925696A CN117925696A CN202410106694.0A CN202410106694A CN117925696A CN 117925696 A CN117925696 A CN 117925696A CN 202410106694 A CN202410106694 A CN 202410106694A CN 117925696 A CN117925696 A CN 117925696A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hairy roots
- transgenic hairy
- explant
- induction
- transgenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 title claims abstract description 65
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 241000412329 Stylosanthes hispida Species 0.000 title claims description 22
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 claims abstract description 21
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000207894 Convolvulus arvensis Species 0.000 claims abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 16
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 15
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 15
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 15
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 15
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 14
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 14
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 13
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 13
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 claims description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 241000249864 Tussilago Species 0.000 abstract description 4
- 235000004869 Tussilago farfara Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 10
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 3
- 101150075111 ROLB gene Proteins 0.000 description 3
- 101100288046 Streptomyces hygroscopicus hyg gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108010063723 poly-pyrimidine tract binding protein Proteins 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100008047 Caenorhabditis elegans cut-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 241000207892 Convolvulus Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000593068 Psychine stylosa Species 0.000 description 1
- 241001495120 Stylosanthes Species 0.000 description 1
- 241001336626 Stylosanthes leiocarpa Species 0.000 description 1
- 241001336583 Stylosanthes scabra Species 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法，柱花草诱导转基因毛状根的方法包括外植体的获得：切取萌发后的光果柱花草幼苗的子叶节为外植体；侵染及共培养：将外植体放入携带有目的基因的重组发根农杆菌Ar1193侵染液中浸泡，得到侵染后的外植体，吸干外植体表面的侵染液，将外植体置于MS固体培养基上暗培养；诱导及筛选：暗培养完成后，吸去表面液体残留，将外置体插入添加抗生素的诱导培养基中进行诱导及筛选，初步得到转基因毛状根；将转基因毛状根转移至继代培养基中继代培养。本方法毛状根诱导率达到96.7％，毛状根阳性率达100％；本发明建立的利用柱花草转基因毛状根制备原生质体的方法，获得的原生质体细胞100％为转基因细胞。
Description
技术领域
本发明涉及热带农作物转基因技术领域，尤其涉及柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法。
背景技术
柱花草属(Stylosanthes Sw.)全属大约有50个种，目前，该属已被驯化并栽培利用的主要两个种是圭亚那柱花草(Stylosanthes guianensis)和西卡柱花草(Stylosanthes scabra)，这两个种在热带与亚热带地区被用作牧草和绿肥。光果柱花草(Stylosanthes leiocarpa)是柱花草属的一个野生种，该种的枝条长度30～50cm、分蘖位低、分蘖数大、草层覆盖度好，有作为覆盖作物用于热带地区的林果园间作物的巨大潜力。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种存在于植物根系附近土壤中的革兰氏阴性菌，该菌具有诱导植物形成毛状根的能力，其主要机制是通过将根诱导(Ri)质粒中的细菌DNA片段整合到植物基因组中。由发根农杆菌介导产生的毛状根具有可离体生长等特点，因此可被作为一种生物反应器。
现有技术中通过发根农杆菌介导并建立的柱花草(Stylosanthes guianensis)的转基因毛状根方法的毛状根转化率低，且毛状根阳性率低，不利于对诱导柱花草毛状根的研究，也不利于推动柱花草毛状根的应用。
因此亟需建立一种柱花草高效诱导转基因毛状根以及提高毛状根阳性率的方法以解决以上问题。
发明内容
本发明提供一种柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种柱花草诱导转基因毛状根的方法，包括以下步骤：
S1：外植体的获得：切取萌发后的光果柱花草幼苗的子叶节为外植体；
S2：侵染及共培养：将外植体放入携带有目的基因的重组发根农杆菌Ar1193侵染液中浸泡，分离得到侵染后的外植体，吸干外植体表面的侵染液，将外植体置于MS固体培养基上暗培养；
S3：诱导及筛选：暗培养完成后，使用抑菌剂清洗外植体并吸去表面液体残留，将外置体插入添加抗生素的诱导培养基中进行诱导及筛选，初步得到转基因毛状根；
S4：继代培养：将转基因毛状根转移至继代培养基中，继代培养。
进一步的，在步骤S1中，取萌发2天后的光果柱花草幼苗，在子叶节下0.5～1.0cm处切除下胚轴，切开两片子叶节，在每片子叶节上分别划出伤口，得到所述外植体。
进一步的，在步骤S3中，所述添加抗生素的诱导培养基组成为：2.21g·L-1MS、2％蔗糖、200mg·L-1特美汀、8mg·L-1潮霉素B、3.5g·L-1植物凝胶。
进一步的，步骤S2中，所述浸泡的时间为15min，所述重组发根农杆菌侵染液浓度为OD600＝0.3～0.5。
进一步的，步骤S2中，所述暗培养条件为：在22～25℃，黑暗条件下共培养4天。
进一步的，步骤S3中，在温度为22～25℃，光强为38000～38500lux，12h d-1光照条件下，利用所述诱导培养基对毛状根进行诱导和筛选。
进一步的，步骤S4中，继代培养的具体过程包括：将转基因毛状根从诱导培养基中转移至固体继代培养基中，25℃黑暗条件下培养，增殖5～10天后，去除子叶，每7天更换一次培养基，更换2～4次培养基后，取毛状根在无菌条件下用手术刀切割下长约5～7cm的根尖部分，将根尖部分置于新配制的液体继代培养基中在相同条件下继代培养；
所述固体继代培养基组成为：1/2MS、2％蔗糖、3.5g·L-1植物凝胶；所述液体继代培养基组成为：1/2MS、2％蔗糖。
一种制备原生质体的方法，包括以下步骤：
Ⅰ：酶解：取通过本发明所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法获得的继代培养20天后的转基因毛状根，加入甘露醇溶液，细胞质壁分离后取出毛状根，切片后置于培养皿中，加入酶解液浸没，25℃黑暗条件下振荡酶解7～9h后，加入终止液，终止酶解；
Ⅱ：获得转基因毛状根原生质体：摇动培养皿释放原生质体，过滤后收集得到转基因毛状根原生质体。
进一步的，步骤Ⅰ中，所述酶解液组成为：1.5％～2.5％纤维素酶、1.5～2.5％离析酶、0.6M甘露醇、10mM CaCl2、10mM MgCl2、10mM MES、1％BSA。
本发明的有益效果是：
本发明中公开的一种柱花草的转基因毛状根诱导方法，光果柱花草转基因毛状根诱导率达到96.7％，毛状根阳性率高达100％，本方法具有能够高效诱导光果柱花草毛状根且毛状根阳性率高的优点，为柱花草分子生物学研究提供了重要支撑；另外，本发明还成功建立了利用柱花草转基因毛状根制备原生质体的方法，获得的原生质体细胞100％为转基因细胞，填补了该领域的技术空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一中公开的柱花草诱导转基因毛状根的过程示意图；
图2为本发明实施例一中转基因毛状根PCR检测电泳图；
图3为本发明实施例一中5种发根农杆菌菌株诱导的毛状根诱导率结果图；
图4为本发明实施例一中阳性毛状根及阴性毛状根的荧光检测结果对比图；
图5为本发明实施例一中不同浓度潮霉素B的毛状根阳性率结果图；
图6为本发明实施例一中发根农杆菌Ar1193在不同潮霉素B浓度下诱导产生毛状根的表型图；
图7为为本发明实施例二中公开的原生质体制备过程示意图；
图8为本发明实施例二中酶解条件下分离的毛状根原生质体及其荧光检测图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所用材料及试剂：
材料：
光果柱花草种质材料CIAT10105，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供；
发根农杆菌Ar1193(货号：AC1090S)、ArQua1(货号：AC1060S)、C58C1(货号：AC1110S)、K599(货号：AC1080S)以及MSU440(货号：AC1070S)购于上海唯地生物技术有限公司；
转染发根农杆菌的质粒是pCXSN-EGFP，商业化载体质粒pCXSN(货号：KL-ZL1626)，购于柯雷生物科技有限公司，经改造后携带有增强绿色荧光蛋白EGFP基因；
试剂：
潮霉素B(Hygromycin B，货号：1366)购于Biofroxx(德国)公司；纤维素酶(Cellulase R-10，货号：MX7352)与离析酶(Macerozyme R-10，货号：MX7351)购于Yakult(日本)公司。
Microsoft office 2022软件进行数据统计分析。毛状根诱导率＝产生毛状根外植体数量/外植体总数量×100％；毛状根阳性率＝发绿色荧光毛状根外植体数量/产生毛状根外植体数量×100％。使用Graphpad prism 7制作图片。
实施例1：
光果柱花草转基因毛状根的诱导：
(1)外植体的制备：
选取颗粒饱满的光果柱花草种子，剥去种皮后置于2mL离心管中加入适量无菌水80℃热激3min，在超净工作台中吸出无菌水，加入等体积75％乙醇溶液消毒3min，无菌水冲洗3次，0.1％氯化汞溶液消毒12分钟，无菌水冲洗6次。将消毒后的种子铺在浸满无菌水的灭菌滤纸上，密封在无菌培养皿中并置于光照培养箱中，培养温度25℃，光照强度38500lux，12h·d-1光照条件下吸胀萌发处理2天，待种子萌发并长出下胚轴后，使用无菌手术刀片在子叶节下0.6mm处切去下胚轴，沿子叶节纵向平均切开成两片子叶节，使用手术刀片在每片子叶节划出3个平行伤口，作为发根农杆菌介导转化的外植体(图1A～D)。
(2)发根农杆菌的转化
采用冻融法将pCXSN-EGFP质粒转入发根农杆菌Ar1193的感受态中：
取500ng质粒加入50μL感受态中混匀，冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min，加入500μL无抗生素的LB液体培养基，28℃震荡培养2h，吸取100μL菌液涂布于含有50mg·L-1Stre和50mg·L-1Kan的LB固体平板上28℃培养48h，挑取单克隆菌落，进行PCR鉴定，选择阳性克隆菌落加入10μL无菌水稀释成OD600＞0.2的菌液，备用；
其中，PCR检测引物为EGFP-F/R(见表1)，片段长度661bp。PCR反应体系：1μL阳性克隆菌液，5μL 2×Rapid Taq Master Mix(南京诺维赞生物有限公司)，0.8μL正向引物，0.8μL反向引物，2.4μL ddH2O。PCR反应程序为95℃3min，(95℃15s，56℃15s，72℃12s，32个循环反应)，72℃5min。
(3)菌株的选择和活化：
已转入pCXSN-EGFP质粒的阳性发根农杆菌菌株涂布在50mg·L-1链霉素(Streptomycin，Stre)的LB(10g·L-1Tryptone+10g·L-1NaCl+5g·L-1Yeast extract+15g·L-1Agar，液体培养基不添加Agar)固体培养基上，置于28℃培养箱培养48h。挑取单克隆菌株接种在50mg·L-1链霉素和50mg·L-1卡那霉素(Kanamycin，Kan)的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养12h。取100μL菌液转移至10mL含有Stre和Kan的LB液体培养基，在200rpm的摇床上震荡培养，使菌液的OD600＝0.9，5000rpm离心10min，弃上清，使用不含抗生素的LB液体培养基重悬菌体至OD600＝0.3，重悬菌液作为侵染液，用于侵染光果柱花草外植体。
(4)侵染及共培养：
将制备好的外植体放入侵染液中浸泡侵染15min，侵染完成后从侵染液中分离外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的侵染液，将外植体置于MS固体培养基上暗培养4天，温度25℃(图1E：发根农杆菌侵染外植体；图1F：共培养)。
(5)毛状根的诱导及筛选：
暗培养完成后，利用200mg·L-1特美汀(Timentin)溶液清洗外植体，最后吸干多余水分将外植体插入诱导培养基中，诱导培养基组成为：2.21g·L-1MS+2％蔗糖+200mg·L-1特美汀+8mg·L-1潮霉素B+3.5g·L-1植物凝胶Phytagel，在温度25℃、光强38500lux、12h·d-1光照条件下，利用诱导培养基对毛状根进行诱导和筛选(图1G～H)。
(6)转基因毛状根继代培养：
取通过本实施例中的柱花草诱导转基因毛状根的方法获得的转基因毛状根，将其转移至固体继代培养基(1/2MS+2％蔗糖+0.35％植物凝胶Phytagel，液体继代培养基中不添加Phytagel)中，25℃黑暗条件下培养，7天后，毛状根增殖状态稳定，即能够持续长出侧根后去除子叶，每7天更换一次培养基，更换4次培养基后，选择表现出持续侧根生长能力，即生长良好的毛状根，在无菌条件下，用手术刀切割下长约6cm的根尖部分，将其置于新配制的液体继代培养基中在相同条件下继代培养(图1I)。
(7)转基因毛状根的鉴定：
使用艾科瑞生物有限公司SteadyPure植物基因组DNA提取试剂盒(货号：AG21011)提取毛状根DNA，并以此为模板，设计特异性引物(如表1所示)，分别通过PCR扩增以下基因：柱花草的看家基因PTB、发根农杆菌Ri质粒rolB基因、pCXSN-EGFP质粒上的Hyg和EGFP基因，以验证是否为转基因毛状根。PCR反应体系：1μL DNA，5μL 2×Phanta Max Master Mix(南京诺维赞生物有限公司)，0.8μL正向引物，0.8μL反向引物，2.4μLddH2O。PCR反应程序为95℃3min，(95℃15s，56℃15s，72℃45s，33个循环反应)，72℃5min。
表1引物列表
提取阳性毛状根的DNA(T1～T5)作为模板，通过PCR检测PTB、rolB、Hyg和EGFP基因。以野生型柱花草根系DNA(WT)和ddH2O(d)作为阴性对照，转入pCXSN-EGFP质粒的Ar1193农杆菌液(P)为阳性对照。
转基因毛状根的鉴定结果：
PCR扩增产物的电泳结果如图2所示，在WT和T1～T5样品中检测到柱花草内参基因PTB的条带，表明样品的可靠性。在T1～T5样品中扩增出rolB、Hyg和EGFP基因的条带，说明这些基因已成功整合到光果柱花草毛状根基因组中，为转基因毛状根。
(8)毛状根诱导率结果：
统计并计算得出Ar1193菌株诱导毛状根诱导率为58/60×100％＝96.7％；
利用本实施例中的诱导方法，分别采用ArQua1、C58C1、K599以及MSU440菌株诱导外植体与Ar1193菌株诱导外植体的毛状根诱导率进行对比：
如图3所示，结果显示不同的发根农杆菌对毛状根诱导率的影响不同，其中，K599菌株诱导毛状根诱导率为34/60×100％＝56.7％，MSU440菌株诱导毛状根诱导率为38/60×100％＝63.3％，C58C1菌株诱导毛状根诱导率为36/60×100％＝56.7％，ArQua1菌株诱导毛状根诱导率为28/60×100％＝46.7％，4种发根农杆菌对光果柱花草产生毛状根诱导率均低于Ar1193菌株，因此发根农杆菌Ar1193是诱导光果柱花草产生毛状根的最佳菌株。
(9)阳性转基因毛状根的鉴定：
通过使用双波长便携式荧光蛋白激发光源(LUYOR-3415RG)观察并统计发绿色荧光毛状根外植体数量。在绿色荧光蛋白激发光源下，阳性转基因毛状根呈现出绿色荧光，而非阳性毛状根不能发出绿色荧光，如图4所示，其中A、B分别为阳性毛状根的明场和荧光场，C、D分别为非阳性毛状根的明场和荧光场；
利用本实施例中公开的诱导光果柱花草转基因毛状根的方法，分别采用潮霉素B的浓度设置为0mg·L-1以及4mg·L-1的诱导培养基对外植体进行诱导，每个处理3次重复，每个重复20～25个外植体，3周后，统计毛状根诱导率，并与潮霉素B浓度设置为8mg·L-1诱导外植体进行对比，结果如图5、图6所示，Ar1193菌株诱导的毛状根阳性率随潮霉素B浓度的提高呈现上升趋势，在潮霉素B浓度为0mg·L-1时菌株Ar1193诱导的毛状根阳性率为2/58×100％＝3.45％，在4mg·L-1潮霉素B浓度下，菌株Ar1193诱导的毛状根阳性率为14/44×100％＝31.82％，在8mg·L-1的潮霉素B浓度下，菌株Ar1193诱导的毛状根阳性率达到20/20×100％＝100％，即8mg·L-1浓度为诱导的光果柱花草转基因毛状根的潮霉素B最佳浓度。
实施例2：
原生质体的制备方法：
取通过实施例中1中的柱花草诱导转基因毛状根的方法获得的转基因毛状根并继代培养20天后(图7A：液体继代培养基中生长的毛状根)，使用灭菌手术刀切取1g幼嫩的毛状根转移至培养皿中，加入0.8M甘露醇溶液(图7B)，细胞质壁分离1h后取出；再使用刀片将毛状根切成约1mm的切片(图7C)，随后移入培养皿中并加入5mL酶解液，使毛状根充分浸没(图7D：真空浸润组织碎块)，25℃黑暗条件下以75rpm振荡酶解8h(图7E)，酶解液的组成为：2.5％纤维素酶+2％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L- 1MES+1％ BSA(酶解液配制时将各组分混合后需在55℃水浴10min，再冷却至室温，随后使用0.22μm滤膜过滤)。酶解结束后，向酶解液中加入5mL W5溶液(154mmol·L-1NaCl+125mmol·L-1CaCl2+5mmol·L-1KCl+10mmol·L-1MES，pH＝5.7)，以终止酶解。轻摇培养皿释放原生质体，重复3次通过300目不锈钢细胞过滤器后，收集原生质体至50mL离心管，400rcf离心3min，吸取上清，加入500μLW5溶液重悬原生质体(图7F：离心收集原生质体(黑框标记))。吸取10μL至血球计数板，并在光学显微镜下计数。通过荧光显微镜观察EGFP荧光信号，以评估其活性。采用SPSS27.0和Microsoft office 2022软件进行数据分析：原生质体产量(个·g-1)＝(25个大方格中毛状根原生质体数量×混悬液体积×104)/毛状根总质量；原生质体活力(％)＝发荧光毛状根原生质体数量/视野中毛状根原生质体数量×100％。(原生质体产量和原生质体活力是检验原生质体制备结果好坏的重要依据)。
通过本实施例中制备原生质体的方法制备得到的原生质体产量为2.745×105/g，原生质体活力91.023％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞，如图8所示。
实施例3：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：1.5％纤维素酶+1.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％ BSA。
结果：
原生质体产量为1.640×105/g，原生质体活力为81.580％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例4：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：1.5％纤维素酶+2％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％BSA，酶解时间为9h。
结果：
原生质体产量为1.125×105/g，原生质体活力为66.613％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例5：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：1.5％纤维素酶+2.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％ BSA，酶解时间为7h。
结果：
原生质体产量为2.013×105/g，原生质体活力为69.653％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例6：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：2％纤维素酶+2.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％BSA。
结果：
原生质体产量为2.563×105/g，原生质体活力为81.413％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例7：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：2％纤维素酶+1.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％BSA，酶解时间为9h。
结果：
原生质体产量为1.600×105/g，原生质体活力为61.668％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞，
实施例8：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：2％纤维素酶+2％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％BSA，酶解时间为7h。
结果：
原生质体产量为1.825×105/g，原生质体活力为82.160％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例9：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：2.5％纤维素酶+2.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％ BSA，酶解时间为9h。
结果：
原生质体产量为1.650×105/g，原生质体活力为61.365％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
实施例10：
本实施例与实施例2的不同之处仅在于，在本实施例中，酶解液的组成为：2.5％纤维素酶+1.5％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％ BSA，酶解时间为7h。
结果：
原生质体产量为1.700×105/g，原生质体活力为75.165％，利用荧光显微镜观察EGFP荧光信号，均发出绿色荧光，即100％为转基因原生质体细胞。
根据实施例2-10可以得出，实施例2中，酶解液组成为2.5％纤维素酶+2％离析酶+0.6M·L-1甘露醇+10mM·L-1CaCl2+10mM·L-1MgCl2+10mM·L-1MES+1％ BSA，酶解时间为8h，在此酶解条件下制备的原生质体产量最高，且原生质体活力也最高，因此，此条件为制备光果柱花草转基因毛状根原生质体的最佳酶解条件。
综上，本发明建立光果柱花草的转基因毛状根诱导方法，毛状根诱导率为96.7％，毛状根阳性率达100％，本方法的毛状根诱导率高，且毛状根诱阳性率高，同时，本发明建立的利用柱花草转基因毛状根制备原生质体的方法，使得获得的原生质体细胞100％为转基因细胞，填补了该领域的技术空白。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：外植体的获得：切取萌发后的光果柱花草幼苗的子叶节为外植体；
S2：侵染及共培养：将外植体放入携带有目的基因的重组发根农杆菌Ar1193侵染液中浸泡，分离得到侵染后的外植体，吸干外植体表面的侵染液，将外植体置于MS固体培养基上暗培养；
S3：诱导及筛选：暗培养完成后，使用抑菌剂清洗外植体并吸去表面液体残留，将外置体插入添加抗生素的诱导培养基中进行诱导及筛选，初步得到转基因毛状根；
S4：继代培养：将转基因毛状根转移至继代培养基中，继代培养。
2.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，在步骤S1中，取萌发2天后的光果柱花草幼苗，在子叶节下0.5～1.0cm处切除下胚轴，切开两片子叶节，在每片子叶节上分别划出伤口，得到所述外植体。
3.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述添加抗生素的诱导培养基组成为：2.21g·L-1MS、2％蔗糖、200mg·L-1特美汀、8mg·L-1潮霉素B、3.5g·L-1植物凝胶。
4.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤S2中，所述浸泡的时间为15min，所述重组发根农杆菌侵染液浓度为OD600＝0.3～0.5。
5.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤S2中，所述暗培养条件为：在22～25℃，黑暗条件下共培养4天。
6.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤S3中，在温度为22～25℃，光强为38000～38500lux，12h d-1光照条件下，利用所述诱导培养基对毛状根进行诱导和筛选。
7.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤S4中，继代培养的具体过程包括：将转基因毛状根从诱导培养基中转移至固体继代培养基中，25℃黑暗条件下培养，增殖5～10天后，去除子叶，每7天更换一次培养基，更换2～4次培养基后，取毛状根在无菌条件下用手术刀切割下长约5～7cm的根尖部分，将根尖部分置于新配制的液体继代培养基中在相同条件下继代培养；
所述固体继代培养基组成为：1/2MS、2％蔗糖、3.5g·L-1植物凝胶；所述液体继代培养基组成为：1/2MS、2％蔗糖。
8.一种制备原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ：酶解：取通过权利要求1-7任意一项所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法获得的继代培养20天后的转基因毛状根，加入甘露醇溶液，细胞质壁分离后取出毛状根，切片后置于培养皿中，加入酶解液浸没，25℃黑暗条件下振荡酶解7～9h后，加入终止液，终止酶解；
Ⅱ：获得转基因毛状根原生质体：摇动培养皿释放原生质体，过滤后收集得到转基因毛状根原生质体。
9.根据权利要求8所述的制备原生质体的方法，其特征在于，步骤Ⅰ中，所述酶解液组成为：1.5％～2.5％纤维素酶、1.5～2.5％离析酶、0.6M甘露醇、10mM CaCl2、10mM MgCl2、10mMMES、1％BSA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410106694.0A CN117925696A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410106694.0A CN117925696A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925696A true CN117925696A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90766196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410106694.0A Pending CN117925696A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925696A (zh) |
-
2024
- 2024-01-25 CN CN202410106694.0A patent/CN117925696A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108456690B (zh) | 一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法 | |
| CN113584072B (zh) | 草莓的遗传转化体系构建方法 | |
| CN105543278A (zh) | 一种砀山酥梨遗传转化方法 | |
| CN115433740A (zh) | 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法 | |
| CN101715730A (zh) | 甘蔗新台糖10号组织培养快速繁殖方法 | |
| CN113265421B (zh) | 一种农杆菌介导的短枝木麻黄愈伤转基因体系的建立方法 | |
| CN109182375B (zh) | 一种德国鸢尾的遗传转化方法 | |
| CN107475287B (zh) | 一种茄子遗传转化方法 | |
| CN114058640A (zh) | 一种高效的农杆菌介导甘蔗遗传转化方法 | |
| CN110305894B (zh) | 一种快速高效的楸遗传转化方法 | |
| CN110295191B (zh) | 一种二倍体毛白杨的遗传转化方法 | |
| CN102978235A (zh) | 一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法 | |
| CN109536513B (zh) | 白菜雌蕊发育相关基因BrCRF11a及其应用 | |
| CN1149918C (zh) | 农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法 | |
| CN117925696A (zh) | 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法 | |
| CN113973658B (zh) | 一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法 | |
| JP2008259497A (ja) | アグロバクテリウムを介したダイズ国内品種の形質転換体作出方法並びに形質転換体当代及び後代の種子を短期間で獲得する方法 | |
| CN112042532B (zh) | 一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用 | |
| CN106047921A (zh) | 一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法 | |
| CN117187294B (zh) | BnaC5.ACBP4基因在提高植物耐水淹性中的应用 | |
| CN1596617A (zh) | 一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用 | |
| CN117511892B (zh) | 一种fto蛋白在促进树木繁育中的应用 | |
| CN110423753B (zh) | 一种由根结线虫诱导的根结特异性启动子t106-p及应用 | |
| CN1633839A (zh) | 一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法 | |
| KR20110061298A (ko) | 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |