KR20110061298A

KR20110061298A - 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20110061298A
Application number: KR1020090117905A
Authority: KR
Inventors: 김욱
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2011-06-09
Also published as: KR101149171B1

Abstract

본 발명은 바이러스 감염 식물체에서 조직을 분리하는 단계; 상기 분리된 조직을 캘러스 유기배지에 치상하여 캘러스를 유기하는 단계; 상기 유기된 캘러스를 체를 이용하여 일정 크기로 분리하는 단계; 및 상기 분리된 캘러스를 캘러스 배양배지에서 배양한 후 재분화시켜 재분화체를 형성하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 상기한 본원 발명에 의하면, 공정이 간단하고 생산효율이 높은 식물 조직배양기법을 이용하여 바이러스에 감염된 식물체 조직으로부터 바이러스 무병주 및 종자를 대량으로 생산할 수 있다.

바이러스, 무병주, 캘러스, 체

Description

바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법{Method for production of virus-free plants and seeds from virus infected plants}

본 발명은 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 공정이 간단하고 생산효율이 높은 식물 조직배양기법을 이용하여 바이러스에 감염된 식물체 조직으로부터 바이러스 무병주 및 종자를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물과 화훼류의 생산량 저하, 품질저하 및 품종퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다. 최근에는 식량 등 곡물 및 관상용 식물체 등의 국제 교역량이 늘어나면서 외국의 병원성 식물 바이러스까지 유입되어 문제가 되고 있다. 따라서 재배식물에 대한 바이러스 예방, 치료 및 검역은 식물 산업계에서 중요한 과제 중에 하나이다.

종래의 바이러스 무병주(virus-free) 식물을 생산하기 위한 방법은 크게 생장점 배양을 이용한 방법(Gregory C., Phillips, G. B. Collins., 1979. Virus Symptom-Free Plant of Red Clover Using Meristm Culture. Crop Sci. 19:213-216. N. Verma, R. Ram, V. Hallan, K. Kumar, A.A. Zaidi, 2004, Production of Cucumber mosaic virus-free chrysanthemums by meristem tip culture. Crop Protection 23: 469-473), 접목법을 이용한 방법(N. Katoh, M. Yui, S. Sato, T. Shirai, H. Yuasa, M, Hagimori, 2004, Production of virus-free plants from virus-infected sweet pepper by in vitro grafting. Scientia Hort., 100:1-6 J. Ju, E. Camarasa, C. Ortega, J.M. Arregui, M. Cambra, G. Li, L. Navarro. 1992. RECOVERY OF VIRUS-FREE ALMOND PLANTS BY SHOOT-TIP GRAFTING IN VITRO. Acta Hort.(ISHS) 309:393-400), 열처리와 조직배양을 이용한 방법(H. Lozoya-Salda, O. Merlin-Lara, 1984, Thermotherapy and tissue culture for elimination of potato virus X (PVX) in Mexican potato cultivars resistant to late blight. Am. J. Pot. Res., 61:735-739 Bruna, A. 1997. EFFECT OF THERMOTHERAPY AND MERISTEM-TIP CULTURE ON PRODUCTION OF VIRUS-FREE GARLIC IN CHILE. Acta Hort. (ISHS) 433:631-634), 화학적처리와 열처리를 이용한 방법(Kim, M.S., Lee, Y.R., Song, C.H., Kim, B.H., Kyun, S.B., Eun, J.S., 1997, Elimination of Odontoglossum ring spot virus (ORSV) from orchid (Cymbidium spp.) by chemotherapy and thermotherapy. - RDA J. Crop Protect. 39: 19-24. Vcelar, B.M., Ferreira, D.I., Niederwieser, J.G. 1992, Elimination of Ornithogalum mosaic virus in the Ornithogalum cv. Rojel through meristems tip culture and chemotherapy.Plant Cell Tissue Organ Cult. 29: 51-55.) 등이 있으나, 그 생산효율이 낮고 그 공정이 복잡한 문제점이 있었다.

보다 구체적으로 상기 생장점을 이용하는 방법은 식물체에서 정단부가 하나밖에 없기 때문에 이용가능한 조직이 한정되어 생산효율이 낮고, 정단부를 적출하는 작업의 효율이 낮고, 다양한 시료를 이용하므로 유전적으로 균일한 식물체를 생산할 수 없으며, 만약 이 방법이 실패했을 때 한정된 유전자원이 감소하는 문제점이 있었다. 또한, 접목법을 이용하는 방법은 수작업으로 이루어지며 작업시 감염된 식물체가 있으면 연속감염의 위험성이 높다. 나아가, 열처리 및 화학적 처리방법은 열처리 시 식물체의 발아율이 약 3 ~ 5% 감소하고 화학약품에 의한 유전자 변형 등의 문제가 발생할 수 있고 공정이 복잡한 문제점이 있었다.

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 바이러스에 감염된 식물체 또는 종자에서 바이러스 무병주 또는 종자를 간단한 공정에 의해 고효율로 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 바이러스에 감염된 식물체 또는 종자로부터 유전자의 변형을 최소화하고 유전적으로 동질인 바이러스 무병주 또는 종자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 바이러스 감염 식물체에서 조직을 분리하는 단계; 상기 분리된 조직을 캘러스 유기배지에 치상하여 캘러스를 유기하는 단계; 상기 유기된 캘러스를 체를 이용하여 일정 크기로 분리하는 단계; 및 상기 분리된 캘러스를 캘러스 배양배지에서 배양한 후 재분화시켜 재분화체를 형성하는 단계를 포함하여 구성된다.

상기와 같이 본 발명은 바이러스 감염된 식물 조직으로부터 유기된 캘러스를 체를 이용하여 잘게 부수어서 세포간에 바이러스 이동이 전개되지 않은 조직을 다량 확보할 수 있는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 의하면 단순화된 공정에 의해 높은 효율로 바이러스 무병주 또는 종자를 대량 생산할 수 있다. 본 발명에 의한 바이러스 무병주의 회수율은 재분화 개체 중 30%로 높게 나타났다. 또한, 종래 방법에 의한 열처리 또는 화학약품 처리에 의한 발아율 저하 또는 유전자 변형 등의 문제점들을 예방할 수 있다.

본 발명에서 상기 조직은 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 어떤 조직이라도 이용할 수 있다. 즉, 잎, 줄기, 뿌리 및 종자로 구성된 그룹에서 하나 이상 선택될 수 있다. 상기와 같이 본 발명에서는 식물의 모든 조직을 이용할 수 있으므로 정단부를 이용하는 종래의 방법 등에 비해 생산효율 및 작업 효율이 높고 생산비용을 절감할 수 있으며 한정된 유전자원을 효율적으로 이용할 수 있으며, 캘러스를 이용하여 유전적으로 균일한 식물체를 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에서 상기 체는 이에 한정되는 것은 아니나, 150 ~ 1000㎛ 크기인 것이 바람직하다. 캘러스를 분리할 때 150㎛ 이하의 작은 크기의 체를 이용하면 세포가 손상을 받아 캘러스 배양율이 저하되고, 1000㎛ 이상의 큰 크기의 체를 이용하면 캘러스 세포 간 바이러스 이동에 의해 무병주 회수율이 낮아지게 된다.

본 발명에서는 상기 분리된 캘러스에서 10주 후에 재분화체를 분리할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면 상대적으로 단시간에 재분화체를 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한이 있는 것은 아니나, 바이러스 피해가 큰 담배, 토마토, 고추, 당근 및 박과식물로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 담배가 바람직하다.

본 발명에서 상기 캘러스 유기배지는 MS 고체배지(MS solid)에 수크로 즈(sucrose) 3%, 플랜트-아가(plant-agar) 0.8%, BAP(Benzylamino purine) 1mg/L, NAA(1-Naphthylacetic acid) 0.1mg/L를 첨가하여 구성되고, 상기 캘러스 배양배지는 MS 고체(MS solid)에 수크로즈(sucrose) 3%, 플랜트-아가(plant-agar) 0.3%, BAP 1mg/L, NAA 0.1mg/L를 첨가하여 구성된다. 상기 MS 배지는 시빙(sieving) 후 호르몬 등의 원활한 흡수를 위해 반고체 배지인 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 분리된 조직이 캘러스 유기배지에 치상된 후 6 ~ 8주 후에 캘러스를 분리할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면 상대적으로 단시간에 재분화체를 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스 감염 식물체에서 조직을 분리하는 단계; 상기 분리된 조직을 멸균하는 단계; 상기 분리된 조직을 캘러스로 유기하는 단계; 상기 유기된 캘러스를 체를 이용하여 일정 크기로 분리하는 단계; 상기 분리된 캘러스를 재분화시켜 재분화체를 형성하는 단계; 및 상기 재분화체는 RT-PCR을 수행하여 바이러스 감염여부를 확인하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 멸균단계는 조직배양을 하기 위한 멸균 단계이며 특별한 제한이 있는 것은 아니며 통상의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 상기 RT-PCR은 육안으로 관찰하여 바이러스에 감염된 식물체를 구분할 수 없는 경우 등에 재분화체가 바이러스 무병주인 것을 확인하기 위한 것이다.

이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에서 상기 식물체는 담배이고, 상기 바이러스는 PMMoV 바이러스(Pepper Mild Mottle Virus)이고, 상기 RT-PCR은 재분화체로부터 RNA를 추출하여 Tabacco 18S rRNA을 이용하여 정량한 후 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 PMMoV 프라이머를 이용하여 행해진다.

상술한 바와 같은 구성을 갖는 본 발명에 의하면, 바이러스에 감염된 식물체 또는 종자의 모든 조직을 이용하여 바이러스 무병주 또는 종자를 간단한 공정에 의해 고효율로 대량 생산할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 바이러스에 감염된 식물체 또는 종자로부터 유전자의 변형을 최소화하고 유전적으로 동질인 바이러스 무병주 또는 종자를 대량으로 생산할 수 있다.

따라서 본 발명은 우수한 유전자원이 바이러스에 모두 감염된 경우라 하더라도 동질의 유전자를 갖는 바이러스 무병주 또는 종자를 고효율로 대량 생산할 수 있는 매우 유용한 발명이라 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 바이러스 감염 담배 개체 형성

1) 담배 종자파종

sunshine mix 5호 (이호바이오) 흙을 사용하여 담배 SSnn 품종을 온실에 파종하여 약 4주 후 담배 개체 당 하나의 포트에 이식하고, 파종한 담배의 길이가 약 5cm, 담배 잎이 4엽 이상 발생하면 바이러스에 감염시켰다.

2) 바이러스 감염

바이러스에 감염된 식물체를 형성하기 위해, 식물체는 Tobacco SSnn이, 바이러스는 PMMoV (Pepper Mild Mottle Virus)이 사용되었다. 막자사발에 바이러스가 감염된 식물체 0.1g에 100배의 0.1M PBS 버퍼(NaCl 136mM, KCl 2mM, Na₂HPO₄ 10mM, KH₂PO₄ 1.76mM)를 섞어서 갈았다. 생장점에서 가까운 1 ~ 2개의 잎을 제외하고, 순차적인 잎 3장에 카보런덤(Caborundum)을 가볍게 흩뿌려주었다. 카보런덤(Caborundum)이 뿌려진 잎에 PBS 버퍼(buffer)와 PMMoV 바이러스가 갈아진 액을 손가락에 묻히고 약간 힘을 주어 가운데 옆맥을 중심으로 양 옆으로 한 번씩만 문질러 주었다.

3) 바이러스 감염의 확인

육안으로 확인된 개체(도 2 참조)에 PMMoV-CP 프라이머(표 1의 서열번호 3 및 4 참조)를 사용하여 RT-PCR로 바이러스 감염을 확인하였다.

실시예 2 : 바이러스 감염 담배를 이용한 재분화체 유기

1) 담배 캘러스 유기

PMMoV 바이러스를 감염시킨 담배에서는 약 10일 후 모자이크 병징이 나타나고, RT-PCR로 바이러스 감염이 확인되면 생장점에서부터 3~4번째 잎을 이용하며 조직배양을 하기 위해 멸균(70% EtOH 30초 흔듬 -> 멸균수로 3회 세척 -> 50% 락스에서 15분간 침지 -> 멸균수로 3~4회 세척 -> 건조)을 하였다. 이 후 가로 세로 1cm 크기로 자른 후 캘러스 유기 배지(MS solid, sucrose 3%, plant-agar 0.8%, BAP(Benzylamino purine) 1mg/L, NAA(1-Naphthylacetic acid) 0.1mg/L: 표 3 참조)에 치상하였다. 약 2주마다 배지를 옮겨주며 캘러스를 유기하고, 캘러스를 유기하면서 재분화가 된 개체는 제거해 주었다. 상기와 같이 담배 잎을 이용하여 캘러스 유도 배지에 치상 후 약 6 ~ 8주 후 분리에 알맞은 캘러스를 획득하였다.

2) 유기한 캘러스의 바이러스 검정

조직배양으로 유기된 캘러스에서 바이러스의 변화를 알아보기 위하여 다음과 같이 ELISA와 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.

* ELISA법(Kisan Bio 사용)

① 96 웰플레이트(96 well plate)에 코팅 항체(coating antibody)를 각 웰(well) 당 100㎕씩 넣는다.

② 37℃의 습한 장소에서 4시간 배양한다.

③ 1X PBST 버퍼(buffer)로 3~4회 세척(washing)하고 기포가 없도록 타월에 탁탁 털어낸다.

④ 1.5ml E-tube에 있는 시료와 대조구 잎들을 액체질소를 이용하여 곱게 간 후 1X General Extract Buffer 1m을 넣고 그 액을 각 웰(well)에 100㎕씩 넣는다.

⑤ 실온에서 약 2시간동안 배양한 후 3~4회 세척(washing) 한다.

⑥ 1X ECI 버퍼(buffer)에 엔자임 컨쥬게이트(enzyme conjugate) 1/500을 희석하여 각 웰(well)에 100㎕씩 넣는다.

⑦ 실온에서 약 2시간동안 배양한 후 5회 세척(washing)하고 기포가 없도록 타월에 탁탁 털어낸다.

⑧ 1X PNP 기질을 각 웰(well)에 100㎕씩 넣는다.

⑨ 휴미드 박스(humid box)에 넣고 30분후에 1차 측정, 1시간 후에 2차 측정 한다.

⑩ 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)기를 이용하여 O.D. 405nm로 측정한다.

* Tri-reagent를 이용한 RNA 추출법

① 1.5ml E-tube에 재분화체의 잎 0.1g을 따서 넣은 후 액체질소를 넣고 그라인더(grinder)를 이용하여 마쇄한다.

② Tri-reagent 1ml 첨가 후 15초간 강하게 볼텍스(vortex) 한다.

③ 5분간 실온에 둔 후, 12000R.P.M. 4℃에서 10분간 원심분리 해준다.

④ 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 새 E-tube에 분리하고 0.2ml의 클로로포름(chloroform)을 첨가한 후 다시 15초간 볼텍스(vortex) 한다.

⑤ 15분 동안 실온에 두고 다시 한번 12000R.P.M. 4℃에서 10분간 원심분리 해준다.

⑥ 원심분리 후 한번 더 상층액을 조심스럽게 새 E-tube에 분리하고 0.5ml의 이소프로판올(isopropanol)과 3M의 NaOAc 첨가 후 10분간 실온에 둔다. 그리고 12000R.P.M. 4℃에서 8분간 원심분리 해준다.

⑥ 상층액을 버리고 75% EtOH 1ml을 첨가하고 12000R.P.M. 4℃에서 5분간 원심분리 해준다.

⑦ EtOH을 버리고 건조시킨다.

⑧ 전부 건조가 되면 DEPC-water 50㎕를 넣고 RNA를 녹인다.

이때 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

Tobacco 18S rRNA	F : 5'- TGGTACGGCCGTTCTTAGT - 3'	서열번호 1
Tobacco 18S rRNA	R : 5'- TCGGCCAAGGCTATATAAACTCGT - 3'	서열번호 2
PMMoV - cp	F : 5' - CTTAAGGAGTTGTAGCCCAG - 3'	서열번호 3
PMMoV - cp	R : 5' - ATGGCTTACACAGTCTCC - 3'	서열번호 4

RT-PCR은 INTRON BIOTECHNOLOGY Maxime^TM RT-PCR PreMix Kit 이용하였고, RT-PCR 조건은 표 2에 나타내었다.

Reverse Transcription Reaction 45℃ 30min Inactivation of Rtase 94℃ 5min	1cycle
Denaturation 94℃ 45sec Annealing 55℃ 45sec Extension 72℃ 1min	32cycle
Final Extension 72℃ 5min 4℃ ~

상기와 같이 캘러스 상태에서 바이러스의 이동 상황과 바이러스의 변화를 알아보기 위하여, 캘러스 상태에서 DAS-ELISA와 RNA를 추출하여 RT-PCR로 바이러스를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 담배 캘러스(No 1-27)은 DAS-ELISA 결과가 OD₄₀₅에서 0.15 내지 0.42를 나타내어 음성대조군에 비해 높게 측정되었다. 따라서 DAS-ELISA법과 RT-PCR법으로 모든 캘러스에서 바이러스가 확인되었으며 캘러스가 많이 부풀었을수록 DAS-ELISA 결과가 더 낮게 측정되었다 (도 3).

3) 담배 캘러스의 분리(segmentation)

담배 캘러스가 약 6주 후 1cm이상 크기로 자라면 체(sieve; cell dissociation sieve- Tissus Grinder kit (SIGMA-ALDRICH, Germany))를 이용하여 300 크기의 메시(50mesh)로 분리하여, 플랜트 아가(plant agar)가 0.3% 들어간 반고체 배지에 치상해주었다(도 4b의 c 참조). 분리된 캘러스의 세포가 자라는 것을 눈으로 확인하면서 각각의 세포가 0.4cm이상이 되면 다시 고체 배지로 옮겨서 치상하고 2주마다 배지를 교환해 주었다. 상기 캘러스는 약 4 ~ 6주 후 활발하게 자라 캘러스를 육안으로 관찰할 수 있었다(도 4b의 d 참조). 표 3은 잎 외식편(leaf explants) 및 분리 캘러스로부터 담배 식물체를 재분화하기 위해, 캘러스를 유도하기 위한 배지 조건을 나타낸다.

Medium compounds	induction of callus from leaf	Induction of callus from segmented callus
Medium	MS solid	MS solid
Carbohydrate	3% Sucrose	3% Sucrose
Hormone	BAP 1mg/l, NAA 0.1mg/l	BAP 1mg/l, NAA 0.1mg/l
Agar	Plant-agar 0.8%	Plant-agar 0.3%
pH	5.6-5.8	5.6-5.8

4) 분리된 담배 캘러스의 재분화 및 뿌리 유도

분리된 캘러스에서 10주 이상 지나 재분화가 시작되면 재분화체를 캘러스에서 분리하여 개별로 페트리-디쉬(petri-dish)에 치상하고, 잎이 3 ~ 4장 이상 분화가 되면 IAA호르몬이 들어간 배지(IAA O.1mg/l)에서 뿌리를 유도하였다(도 4b의 e 참조).

5) 재분화체 온실로의 순화

뿌리가 유도되면 포트로 옮겨 온실에서 순화를 시켰다.

실시예 3 : 재분화체의 분석

1) 육안검정

온실로 순화 시킨 후, 육안으로 관찰하여 각 개체의 잎에서 모자이크 모양이 나타나는 것과 나타나지 않은 것으로 1차 분리하였다 (도 5a 및 5b).

2) RNA의 추출 및 RT-PCR

Tri-reagent를 이용하여 각 재분화체 마다 RNA를 추출하여 18S rRNA를 이용하여 정량한 후 PMMoV-cp primer를 사용하여 RT-PCR로 바이러스 감염체와 바이러스가 감염되지 않은 개체를 분리, 확인하였다. 그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다. 그 결과 바이러스 무병주의 회수율은 30%로 높게 나타났다.

실시예 4 : 2차 실험 실시 및 재분화체의 종자 획득

1) 2차 실험 실시

RT-PCR 결과 상대적으로 밴드가 흐리게 나온 개체들을 이용하여 2차 실험(RT-PCR)을 준비하였다. 수행방법은 1차 실험과 방법과 같았다.

2) 재분화체의 종자 수확

RT-PCR 결과 후 바이러스가 감염되지 않은 식물의 종자를 획득하였다(도 7).

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법의 개략적 모식도이다.

도 2는 PMMoV 바이러스(Pepper Mild Mottle Virus)에 감염된 담배 식물체를 보여주는 사진이다.

도 3은 DAS-ELISA(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정된, 선택된 바이러스 감염 캘러스에서 외피 단백질의 축적량을 보인 도면이다. 감염된 담배 캘러스(No 1-27)는 OD₄₀₅에서 0.15 내지 0.42를 나타내었다. P : 양성대조군(positive control) N : 음성대조군(negative control) 1-27 : 감염된 담배 캘러스

도 4a 및 4b는 본 발명에 의해 담배에서 분리 캘러스 유도 및 정단부 재분화의 다양한 단계를 보여주는 도면이다. (a) 잎에서 유도된 캘러스 (b) 2개월된 캘러스 (c) 반고체 배지에 치상된 분리된 캘러스 (d) 반고체 배지(배지는 2주마다 교환되었고 핀셋(tweezers)에 의해 큰 사이즈의 캘러스만 새로운 배지로 치상되었음)상에서 분리 캘러스로부터 6주간 유도된 캘러스 (e) 재분화된 정단부(캘러스의 크기가 0.8mm 이상되었을 때 정단부 배지에 치상되었고, 정단부가 재분화된 후 발근 배지(IAA 0.1mg/l)에 치상됨).

도 5a 및 5b는 본 발명에 의해 바이러스 감염된 분리 캘러스로부터 재분화된 식물체의 사진이다. (a) 바이러스 무병주 R1 식물체(왼쪽) 및 PMMoV에 감염된 R1 식물체(오른쪽)의 표현형 (b) 바이러스 무병주 R1 식물체 잎(아래) 및 PMMoV에 감염된 R1 식물체 잎(위)의 형태. PMMoV에 감염된 R1 식물체 잎은 모자이크 무늬 및 잎 기형 증후를 보임 (c) 바이러스 무병주 R1 식물체의 사진 (d) PMMoV에 감염된 R1 식물체의 사진

도 6a 및 6b는 본 발명에 의한 R1 재분화 식물체의 RT-PCR의 전기영동사진(R1 : 감염된 담배 식물의 재분화체)이다. M: 100bp DNA marker(Bionix Co.); P : 양성대조군(positive control; RNA of infected tobacco with PMMoV); N : 음성대조군(negative control; RNA of virus-free tobacco); 1-27 : 재분화된 담배 식물체

도 7은 본 발명에 의한 담배 R1 종자 획득을 위한 식물체 사진이다.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Method for production of virus-free plants and seeds from virus infected plants <130> P11-091120-01 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 tggtacggcc gttcttagt 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 tcggccaagg ctatataaac tcgt 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 cttaaggagt tgtagcccag 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 atggcttaca cagtctcc 18

Claims

바이러스 감염 식물체에서 조직을 분리하는 단계;

상기 분리된 조직을 캘러스 유기배지에 치상하여 캘러스를 유기하는 단계;

상기 유기된 캘러스를 체를 이용하여 일정 크기로 분리하는 단계; 및

상기 분리된 캘러스를 캘러스 배양배지에서 배양한 후 재분화시켜 재분화체를 형성하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 조직은 잎, 줄기, 뿌리 및 종자로 구성된 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 체는 150 ~ 1000㎛ 크기인 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 캘러스에서 10주 후에 재분화체를 분리하는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 식물체는 담배, 토마토, 고추, 당근 및 박과식물로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 조직이 캘러스 유기배지에 치상된 후 6 ~ 8주 후에 캘러스를 분리하는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재분화체는 RT-PCR을 수행하여 바이러스 감염여부를 확인하는 단계를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 식물체는 담배이고, 상기 바이러스는 PMMoV 바이러스(Pepper Mild Mottle Virus)이고, 상기 RT-PCR은 재분화체로부터 RNA를 추출하여 Tabacco 18S rRNA을 이용하여 정량한 후 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 PMMoV 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 식물체로부터 바이러스 무병주 및 종자를 생산하는 방법.