KR20160042503A

KR20160042503A - 신고 배 조직 배양용 배지

Info

Publication number: KR20160042503A
Application number: KR1020140136456A
Authority: KR
Inventors: 김세희; 신일섭; 조강희; 김대현; 김현란; 최인명
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2016-04-20
Also published as: KR101651949B1

Abstract

본 발명은 신고 배의 조직 배양용 배지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 MS 무기염, LS비타민, NAA (1-Naphthaleneacetic acid), BA (benzylaminopurine), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함함으로써 신고 배의 신초 재분화율을 향상시킬 수 있는 식물 조직 배양용 배지에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신고 배 조직 배양용 배지를 사용함으로써 신고 배의 재분화율을 16.4%까지 높일 수 있는 신고 배 재분화 체계를 구축할 수 있다.

Description

신고 배 조직 배양용 배지{Medium for tissue culture of niitaka pears}

본 발명은 신고 배의 조직 배양용 배지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 MS무기염, LS비타민, NAA (1-Naphthaleneacetic acid), BA (benzylaminopurine), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함함으로써 신고 배의 신초 재분화율을 향상시킬 수 있는 신고 배 조직 배양용 배지에 관한 것이다.

배나무는 장미과(Rosaceae), 배나무아과(Pomoideae), 배나무속(Pyrus)에 속한다. 배나무속의 발상지는 중국 서부와 서남부의 산지로 알려져 있으며, 일부는 동쪽으로 동아시아를 경유하여 한국과 일본으로 전파되었고, 또 다른 일부는 서쪽으로 전파되면서 두 갈래로 나뉘어 한 쪽은 중앙아시아와 내륙아시아로, 다른 한 쪽은 코카서스, 소아시아, 지중해 연안, 서부 유라시아로 전파되었다. 이러한 배나무속 식물들은 지리적 고립이나 적응 및 종간 교잡등과 같은 종분화 과정을 거치면서 진화되어 종의 다양성을 이루었다.

현재 생식용으로 재배되고 있는 배나무속 식물은 남방형 동양배(P. pyrifolia Nakai), 북방형 동양배(P. ussuriensis Maxim.) 및 서양배(P.communis L.)로 크게 나뉘어지고, 우리나라에서 주로 재배되고 있는 품종은 남방형 동양배(P. pyrifolia Nakai)로 신고(新高, Niitaka)를 비롯하여 원황, 황금배 등이 있으며, 재배가 용이하고 저장성이 우수한 신고 품종이 약 80%를 차지하고 있다.

그러나, 상기 신고 품종은 배 검은별무늬병에 민감한 품종으로서 과실의 안정생산이 어려워 배 검은별무늬병 저항성 품종의 개발이 요구되고 있고, 이외에도 다양한 이유에서 배 품종 개량이 진행되고 있다. 예컨대, 배 품종 개발은 재배적인 기술로 극복할 수 없는 배 품종의 단점을 보완하고, 품질을 향상시켜 상품성을 증대하며, 생력 재배를 가능하게 할 수 있어 생산비를 줄일 수 있다.

전통적인 배 품종 개발방법으로서는 교배 육종방법이 사용되어왔다. 그러나, 이 방법에 따르면 개화 결실에 이르기까지 걸리는 시간과 과실 특성의 평가 및 선발에 따른 육종기간이 오래 소요될 뿐만 아니라 유전자의 직접도입이 불가능하고 다양한 형질이 집적되어 있는 목표형질을 얻는데 시간과 노동력이 요구된다.

이에, 상기 교배 육종방법의 대안으로서 외래의 유용 유전자를 직접 도입하는 형질전환 방법이 제시되었다. 그러나, 형질전환을 통한 외래 유전자의 도입은 대부분 기내에서 세포 배양의 과정을 거쳐 이루어지기 때문에 식물의 세포나 조직을 이용한 형질전환 연구가 성공적으로 수행되기 위해서는 식물조직배양 체계의 확립이 선행되어야 한다.

식물의 조직배양이란, 식물체로부터 기관, 조직 혹은 세포를 분리하여 영양분이 포함된 인공배지에서 배양함으로써 캘러스(callus)를 만들어내거나 완전한 기능을 가진 식물체로 재분화(regeneration)시키는 기술을 말하는 것으로, 유용물질 생산, 유용 유전자 도입을 통한 새로운 기능을 갖춘 신품종 개발 및 우량 종묘 생산 등의 목적을 위해 이용되고 있다.

식물조직배양 기술에 의한 식물체의 재분화 효율은 식물의 종에 따라 큰 차이를 보이고 동일한 종에서도 품종, 배양조직, 식물생장조절 물질의 종류와 농도, 광조건에 의해 영향을 받으며, 배양 배지에 첨가되는 물질에 의해서도 달라진다. 특히, 조직 배양되는 식물은 생장에 필요한 대부분의 영양물질을 배지를 통하여 얻기 때문에 배지의 성분이 매우 중요하다.

이러한 식물조직배양 기술을 배 품종에 적용한 종래의 방법으로서, 비특허문헌 1(J Plant Biotechnol(2012) 39:288-294)은 배양 배지에 첨가되는 물질이 황금배(Pyrus pyrifolia Nakai) 품종의 잎 절편체의 재분화에 영향을 미치는 여러 요인에 대한 연구를 진행하였다. 이 방법에서는, 식물생장호르몬인 thidizauron(TDZ), indolebutyric acid(IBA), indoleacetic acid(IAA), 그리고 탄소공급원인 sucrose와 sorbitol을 배양 배지에 첨가되는 물질로 사용하고, 이들의 농도에 따른 신초의 재분화율을 구하였다. 그 결과, TDZ 0.5 mg/L와 IAA 0.3 mg/L을 혼용 처리한 MS 기본 배지에 sorbitol을 30 g/L 농도로 첨가하여 잎 절편체를 치상 하였을 경우, 가장 높은 재분화율을 나타내었다.

그러나, 상기 방법에 따르면 황금배 품종에서의 재분화율을 확립할 수 있는 배지 조성은 얻을 수 있으나, 상기 배지 조성을 신고 품종 배에 적용하였을 경우 잎 절편체 재분화율은 현저히 떨어지거나 재분화가 이루어지지 않았다.

J Plant Biotechnol(2012) 39:288-294

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 식물조직배양 기술을 이용하여 신고 품종 배의 재분화율을 향상시킬 수 있는 신고 배 조직 배양용 배지를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 MS 무기염, LS 비타민(Linsmaier and Skoog 1965), NAA (1-Naphthaleneacetic acid), BA (benzylaminopurine), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함하는 신고 배의 조직 배양용 배지를 제공한다.

상기 MS 무기염은 CoCl₂.6H₂0 0.025mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L, FeNaEDTA 36.70mg/L, H₃BO₃ 6.20mg/L, KI 0.83mg/L, MnSO₄.H₂O 16.90mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L, ZnSO₄.7H₂O 8.60mg/L, CaCl₂ 332.02mg/L, KH₂PO₄ 170.00mg/L, KNO₃ 1900.00mg/L, MgSO₄ 180.54mg/L 및 NH₄NO₃ 1650.00mg/L를 포함하고, 상기 LS 비타민은 티아민 HCl(Thiamine-HCl) 0.4mg/L 및 미오이노시톨(Myo-inositol) 100mg/L를 포함할 수 있다.

또한, 상기 NAA의 첨가량은 0.01 ~ 0.5 mg/L, 상기 BA의 첨가량은 3 ~ 10 mg/L, 상기 탄소공급원의 첨가량은 25 ~ 35g/L, 상기 겔화제의 첨가량은 6 ~ 9 g/L 일 수 있으며, 보다 상세하게는 본 발명의 상기 신고 배의 조직 배양용 배지는 상기 NAA 0.01 mg/L, 상기 BA 5mg/L, 상기 탄소공급원인 소르비톨 30g/L, 상기 겔화제인 다이신 아가 7g/L을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 신고 배 조직 배양용 배지를 사용함으로써 신고 배의 재분화율을 16.4%까지 높일 수 있는 신고 배 재분화 체계를 구축할 수 있다.

이와 같이, 신고 배의 재분화 체계를 확립함으로써 교배 육종방식을 사용하던 기존의 품종 개발방식에 비하여 인력과 비용을 줄일 수 있고, 유용 유전자 도입을 위한 형질 전환체계 구축을 위한 단계로 활용할 수 있다.

도 1은 신고 배 잎 절편체가 실시예 5에 따라 배양된 지 4주후의 생장상태를 나타내는 사진이다.

본 발명은 MS 무기염, LS 비타민(Linsmaier and Skoog 1965), NAA (1-Naphthaleneacetic acid), BA (benzylaminopurine), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함하는 신고 배 조직 배양용 배지에 관한 것이다.

상기 MS 무기염은 MS 배지에 들어가는 무기염 성분을 말하는 것으로, CoCl₂.6H₂0 0.025mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L, FeNaEDTA 36.70mg/L, H₃BO₃ 6.20mg/L, KI 0.83mg/L, MnSO₄.H₂O 16.90mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L, ZnSO₄.7H₂O 8.60mg/L, CaCl₂ 332.02mg/L, KH₂PO₄ 170.00mg/L, KNO₃ 1900.00mg/L, MgSO₄ 180.54mg/L 및 NH₄NO₃ 1650.00mg/L로 구성될 수 있다. 상기한 각 성분들의 함량 단위는 증류수 1L를 기준으로 한 것으로, 이하 모든 성분들의 함량 기준도 이에 준한다.

일반적으로 사용되는 MS배지(Murashige and Skoog 1962)는 상기 MS무기염과 Glycine 2.00mg/L, myo-Inositol 100mg/L, Nicotinic acid 0.50mg/L, Pyridoxine HCl 0.50mg/L 및 Thiamine HCl 0.10mg/L로 구성된 비타민 성분(이하 'MS 비타민' 이라 함)으로 이루어진다. 반면, 본 발명에서는 기존의 MS 배지에서 상기 MS 비타민을 제외하고 상기 MS 무기염에 LS비타민을 첨가하여 신고 배 조직 배양용 배지를 제조하였다.

상기 LS 비타민(Linsmaier and Skoog 1965)은 식물체의 재분화에 영향을 미치는 성분으로서, 티아민 HCl(Thiamine-HCl) 0.4mg/L 및 미오이노시톨(Myo-inositol) 100mg/L로 구성된다. 상기 LS 비타민의 함량이 부족하거나 과잉일 경우, 신고 배 조직의 재분화율이 현저히 떨어질 수 있다.

상기 NAA 및 BA는 식물생장조절물질로서, 상기 NAA는 식물의 성장을 촉진하는 생장 호르몬인 옥신(auxin)의 일종이고, 상기 BA는 식물의 세포분열과 분화를 조절하는 호르몬인 사이토키닌(cytokinin)의 일종이다. 배양된 식물조직으로부터 싹과 뿌리가 재생되기 위해서는 식물호르몬인 옥신과 사이토키닌 간의 상호작용이 중요하다.

상기 NAA의 첨가량은 0.01 ~ 0.5 mg/L이고, 상기 BA의 첨가량은 3 ~ 10 mg/L일 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 NAA의 첨가량은 0.01 mg/L이고, 상기 BA의 첨가량은 5 mg/L일 수 있다. 상기 NAA 및 BA의 첨가량이 상기 범위를 벗어날 경우 재분화율이 떨어질 수 있고, NAA 및 BA를 혼합하여 사용하지 않고 NAA만을 첨가하거나 BA만을 첨가할 경우에는 재분화율 향상의 효과가 더욱 현저하게 떨어질 수 있다.

상기 탄소공급원(carbon source)은 배양된 식물 조직이 자라는데 필요한 에너지원 역할을 한다. 상기 탄소 공급원으로서는 수크로오스 (sucrose) 또는 소르비톨 (sorbitol)이 사용될 수 있다.

상기 탄소공급원 첨가량은 상기 MS 배지 부피(1L)를 기준으로 25 ~ 35g/L 일 수 있다. 상기 탄소공급원의 첨가량이 25g/L 미만일 경우 식물체의 탄소 및 에너지원인 당의 농도가 급격히 낮아져 신초의 성장이 느려지고 배양단계 후반부에 생육이 억제될 우려가 있고, 반면 35g/L을 초과할 경우 탄수화물의 공급이 과도하게 이루어져 재분화율이 떨어질 수 있다,

상기 겔화제(gelling agent)는 액체상태의 배지를 겔화(고형화)시켜 고체상태로 만드는 역할을 한다. 상기 겔화제로서는 플랜트 아가 (plant agar) 또는 다이신 아가(daishin agar)가 사용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 다이신 아가 (daishin agar)가 사용된다.

상기 겔화제의 첨가량은 상기 MS 배지 부피(1L)를 기준으로, 6 ~ 9 g/L 일 수 있으며, 보다 상세한 첨가량은 상기 겔화제가 플랜트 아가일 경우에는 8g/L, 다이신 아가일 경우에는 7g/L일 수 있다. 상기 겔화제의 첨가량이 6g/L 미만일 경우 식물체가 배지에 제대로 지지되지 못할 우려가 있고, 반면 상기 첨가량이 9 g/L를 초과할 경우 배지의 강도(딱딱한 정도)가 과도하게 높아져 재분화율이 떨어지고, 식물체에서 뿌리가 잘 뻗어 내리지 못할 우려가 있다.

본 발명에 따른 신고 배의 조직 배양용 배지는, 상기 NAA 0.01 mg/L, 상기 BA 5mg/L, 상기 탄소공급원인 소르비톨 30g/L, 상기 겔화제인 다이신 아가 7g/L을 포함할 수 있으며, 이때 가장 높은 신고 배 조직 재분화율을 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 설명하지만 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

증류수 1L에 MS 무기염 및 LS 비타민(Linsmaier and Skoog 1965), NAA(1-Naphthaleneacetic acid) 0.01mg, BA(benzylaminopurine) 3mg, 소르비톨 30g, 다이신 아가 7g을 첨가하고, pH는 5.8로 조정하였다. 여기에 신고 배 잎 절편체 55개를 치상하였다. 배양은 25℃로 조절되는 배양실에서 진행하였고, 암처리에서 6주간 배양 후 16시간 광주기(2000 umol·m²·sec¹광도로 16시간 광처리와 8시간 암처리하는 조건)로 옮겨 2주간 배양하였다.

상기 MS 무기염 및 LS 비타민의 구성성분 및 그 첨가량은 하기의 표 1에 나타내었다.

	성분	첨가량(mg/L)
MS 무기염	NH₄NO₃	1650.00
	KNO₃	1900.00
	CaCl₂	332.02
	MgSO₄	180.54
	KH₂PO₄	170.00
	KI	0.83
	H₃BO₃	6.20
	MnSO₄·H₂O	16.90
	ZnSO₄·7H₂O	8.60
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	CuSO₄·5H₂O	0.025
	CoCl₂·6H₂O	0.025
	FeNaEDTA	36.70
LS 비타민	myo-Inositol	100
LS 비타민	Thiamine HCl	0.40

실시예 2 내지 6

상기 NAA 및 BA의 함량을 하기의 표 3와 같이 조절한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 신고 배 잎 절편체를 배양하였다.

비교예 1 및 2

상기 LS 비타민 대신에 하기의 표 2에 기재된 MS 비타민을 포함하는 기존의 MS 배지를 사용하고, 상기 NAA 및 BA의 함량을 하기의 표 3와 같이 조절한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 신고 배 잎 절편체를 배양하였다.

	성분	첨가량(mg/L)
MS 무기염	NH₄NO₃	1650.00
	KNO₃	1900.00
	CaCl₂	332.02
	MgSO₄	180.54
	KH₂PO₄	170.00
	KI	0.83
	H₃BO₃	6.20
	MnSO₄·H₂O	16.90
	ZnSO₄·7H₂O	8.60
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	CuSO₄·5H₂O	0.025
	CoCl₂·6H₂O	0.025
	FeNaEDTA	36.70
MS 비타민	Glycine	2.00
	myo-Inositol	100.00
	Nicotinic acid	0.50
	Pyridoxine HCl	0.50
	Thiamine HCl	0.10

상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 및 비교예 2에 따라 배양된 신고 배 잎 절편체의 재분화율을 하기의 평가방법에 의해 평가하고, 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

< 재분화율 평가방법 >

상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 및 비교예 2에 따라 배양된 각각의 55개의 신고 배 잎 절편체로부터 1cm 이상 신초가 형성된 식물체수를 재분화 개체로 조사하였다. 신고 배의 신초 재분화율을 하기의 식에 따라 계산하고, 그 값을 하기의 표 3에 나타내었다.

재분화율(%) = (재분화된 식물체수/총절편체수(55개)) *100

	비타민종류	NAA(mg)	BA(mg)	재분화율(%)
실시예 1	LS 비타민	0.01	3	3.6
실시예 2	LS 비타민	0.05	3	1.8
실시예 3	LS 비타민	0.1	3	1.8
실시예 4	LS 비타민	0.5	3	1.8
실시예 5	LS 비타민	0.01	5	16.4
실시예 6	LS 비타민	0.01	10	5.5
비교예 1	MS 비타민	0.01	5	0
비교예 2	MS 비타민	0.01	10	0

상기 표 2를 살펴보면, 본 발명에 따른 배지를 이용하여 신고 배 잎 절편체를 배양시킨 실시예 1의 경우 16.4%에 달하는 높은 재분화율을 나타낸 반면, LS비타민을 포함하지 않는 비교예 1 및 2의 경우 신고 배 잎 절편체로부터 신초 재분화가 이루어지지 않았음을 확인할 수 있다.

이상, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 보호범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

MS 무기염, LS 비타민(Linsmaier and Skoog 1965), NAA (1-Naphthaleneacetic acid), BA (benzylaminopurine), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함하는 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 MS 무기염은 CoCl₂.6H₂0 0.025mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L, FeNaEDTA 36.70mg/L, H₃BO₃ 6.20mg/L, KI 0.83mg/L, MnSO₄.H₂O 16.90mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L, ZnSO₄.7H₂O 8.60mg/L, CaCl₂ 332.02mg/L, KH₂PO₄ 170.00mg/L, KNO₃ 1900.00mg/L, MgSO₄ 180.54mg/L 및 NH₄NO₃ 1650.00mg/L를 포함하는 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 LS 비타민은 티아민 HCl(Thiamine-HCl) 0.4mg/L 및 미오이노시톨(Myo-inositol) 100mg/L를 포함하는 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 NAA의 첨가량은 0.01 ~ 0.5mg/L이고, 상기 BA의 첨가량은 3 ~ 10mg/L인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 NAA의 첨가량은 0.01 mg/L이고, 상기 BA의 첨가량은 5mg/L인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 탄소공급원은 수크로오스(sucrose) 또는 소르비톨(sorbitol)인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 탄소공급원의 첨가량은 25 ~ 35g/L 인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 겔화제는 플랜트 아가 (plant agar) 또는 다이신 아가 (daishin agar)인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 겔화제의 첨가량은 6 ~ 9 g/L 인 신고 배 조직 배양용 배지.
제 1 항에 있어서,
상기 NAA 0.01 mg/L, 상기 BA 5mg/L, 상기 탄소공급원인 소르비톨 30g/L, 상기 겔화제인 다이신 아가 7g/L가 포함된 신고 배 조직 배양용 배지.