KR101922441B1 - 원황배 발근용 배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 LS 배지, NAA, IBA, 탄소공급원, 겔화제 및 증류수를 포함하는 원황배 발근용 배지, 이를 이용한 원황배 발근 유도 방법 및 원황배 재분화 방법에 관한 것이다.

Description

원황배 발근용 배지{MEDIUM FOR ROOTING OF WONHWANG PEAR}

본 발명은 LS 배지, NAA(1-Naphthaleneacetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), 탄소공급원, 겔화제 및 증류수를 포함하는 원황배 발근용 배지, 이를 이용한 원황배 발근 유도 방법 및 원황배 재분화 방법에 관한 것이다.

배나무는 장미과(Rosaceae), 배나무아과(Pomoideae), 배나무속(Pyrus)에 속한다. 배나무속의 발상지는 중국 서부와 서남부의 산지로 알려져 있으며, 일부는 동쪽으로 동아시아를 경유하여 한국과 일본으로 전파되었고, 또다른 일부는 서쪽으로 전파되면서 두 갈래로 나뉘어 한 쪽은 중앙아시아와 내륙아시아로, 다른 한 쪽은 코카서스, 소아시아, 지중해 연안, 서부 유라시아로 전파되었다. 이러한 배나무속 식물들은 지리적 고립이나 적응 및 종간 교잡등과 같은 종분화 과정을 거치면서 진화되어 종의 다양성을 이루었다.

현재 생식용으로 재배되고 있는 배나무속 식물은 남방형 동양배(P. pyrifolia Nakai), 북방형 동양배(P. ussuriensis Maxim.) 및 서양배(P. communis L.)로 크게 나뉘어지고, 우리나라에서 주로 재배되고 있는 품종은 남방형 동양배(P. pyrifolia Nakai)로 신고(新高, Niitaka)를 비롯하여 원황, 황금배 등이 있다.

전통적인 배 품종 개발방법으로서는 교배 육종방법이 사용되어왔다. 그러나, 이 방법에 따르면 개화 결실에 이르기까지 걸리는 시간과 과실 특성의 평가 및 선발에 따른 육종기간이 오래 소요될 뿐만 아니라 유전자의 직접 도입이 불가능하고 다양한 형질이 집적되어 있는 목표형질을 얻는 데에 많은 시간과 노동력이 요구된다.

이에, 상기 교배 육종방법의 대안으로서 외래의 유용 유전자를 직접 도입하는 형질전환 방법이 제시되었다. 그러나, 형질전환을 통한 외래 유전자의 도입은 대부분 기내에서 세포 배양의 과정을 거쳐 이루어지기 때문에 식물의 세포나 조직을 이용한 형질전환 연구가 성공적으로 수행되기 위해서는 식물조직배양 체계의 확립이 선행되어야 한다. 식물의 조직배양이란, 식물체로부터 기관, 조직 혹은 세포를 분리하여 영양분이 포함된 인공배지에서 배양함으로써 캘러스(callus)를 만들어내거나 완전한 기능을 가진 식물체로 재분화(regeneration)시키는 기술을 말하는것으로, 유용물질 생산, 유용 유전자 도입을 통한 새로운 기능을 갖춘 신품종 개발 및 우량 종묘 생산 등의 목적을 위해 이용되고 있다.

조직배양 기술에 의한 식물체의 재분화 및 발근은 종에 따라 큰 차이를 보이고, 동일한 종에서도 품종, 배양조직, 식물생장조절물질의 종류와 농도, 광조건에 의해 영향을 받으며 (Garcia et al. 2011), 배양 배지에 첨가되는 물질, 지지체와 항생제에 의해서도 달라진다 (Chevreau et al. 1997). 국내에서는 현재 '신고' (Kim et al. 2013) 및 '황금배' (Chun et al. 2012) 의 재분화 연구 결과가 보고되었으나, 동양배는 발근이 잘 되지 않는 수체 특성이 있어 (Banno et al. 1982) 품종별 발근배지 조성의 개발이 시급하다.

특히, 기존의 발근배지 조성에서 신고, 황금배의 발근율은 70% 이상으로 발근이 잘 되었지만 원황 품종은 전혀 발근이 되지 않았으므로, 원황 품종에 맞는 발근배지 조성의 개발이 요구되고 있다.

Banno K, Yoshida K, Hayashi S, Tanabe K (1982) "In vitro propagation of Japanese pear cultivars", J Japan Soc Hort Sci 58:37-42 Chevreau E, Mourgues F, Martine N, Chevalier M (1997) "Effect of gelling agents and antibiotics on adventitious bud regeneration from in vitro leaves of pear", In Vitro Cell Dev Biol Plant 33:173-179 Chun JA, Do KR, Kim SH, Cho KH, Kim HR, Hwang HS, Shin IS (2012) "In vitro shoot regeneration from leaf tissue of 'Whangkeumbae' pear (Pyurs pyrifolia Nakai)", J Plant Biotechnol 39:288-294 Garcia R, Pacheco G, Falcao E, Borges G, Mansur E (2011) "Influence of type of explants, plant growth regulators, salt composition of basal medium, and light on callogenesis and regeneration in Passiflora suberosa L. (Passifloraceae)", Plant Cell Tissue Organ Cult 106:47-54 Hennayake CK, Dissanayake K, Matsuda N, Takasaki T, Nakanishi T (2003) "An Efficient and reproducible in vitro plant regeneration from leaf discs in pear cultivars (Pyrus spp)", Plant Biotechnol 20:283-289 Huetteman CA, Preece JE (1993) Thidiazuron: "A potent cytokine for woody plant tissue culture", Plant Cell Tissue Organ Cult 33:105-119 Kim SH, Kim JH, Kim KO, Do KR, Shin IS, Cho KH, Hwang HS (2011) "GUS gene expression and plant regeneration via co-culturing with Agrobacterium in grapevine (Vitis vinifera)", J Plant Biotechnol 38:308-314 Linsmaier EM, Skoog F (1965) "Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures", Physiol Plant 18:100-127 Moon JG, Choo BK, Doo HS, Kwon TH, Yahn MS, Ryu JH (2000) "Effect of growth regulators on plant regeneration from the cotyledon explants in oriential melon (Cucumis melo L.)", Kor J Plant Tiss Cult 27:1-6 Murashige T, Skoog F (1962) "A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures", Phyiol Plant 15:473-497

본원에서는 배 원황 품종의 발근에 영향을 미치는 여러 요인들 중 식물생장조절물질로써 NAA(1-Naphthaleneacetic acid) 및 IBA(indole-3-butyric acid)의 농도, 그리고 비타민 및 탄소공급원의 종류 및 농도에 따른 발근 및 재분화 효율을 연구하여 원황배의 발근 및 재분화를 효율적으로 유도할 수 있는 배지 조성을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, LS 배지 (Linsmaier and Skoog), NAA (1-Naphthaleneacetic acid), IBA (indole-3-butyric acid), 탄소공급원 (carbon source), 겔화제 (gelling agent) 및 증류수를 포함하는 원황배 발근용 배지를 제공할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 원황배의 식물체 일부를 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양한 후, 본원의 제 1 측면에 따른 배지로 옮겨 발근을 유도하는 것을 포함하는 원황배 발근 유도 방법을 제공할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 배지 상에서 원황배의 식물체 일부를 배양하는 것을 포함하는 원황배의 재분화 방법을 제공할 수 있다.

본원에서는 국내에서 육성한 주요 품종인 원황배의 발근 조건을 규명하였다. 이러한 결과들은 배의 조직배양 효율 향상에 직접적으로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 조직배양 기법을 이용한 무병묘 생산 및 배의 형질전환 효율 향상에도 매우 유익하게 활용될 수 있다. 또한, 식물조직배양기술을 이용하여 배 원황 품종으로부터 효율적인 발근 배지 조성을 구축함으로써 재분화 과정 이후 발근에 소요되는 인력과 비용을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따라 발근이 유도된 원황배의 사진 이미지이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.

이하, 본 발명에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 1 측면은, LS 배지 (Linsmaier and Skoog), NAA(1-Naphthaleneacetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함하는 원황배 발근용 배지를 제공할 수 있다.

식물의 배양에 일반적으로 사용되는 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)는아래의 표 1에 나타난 무기염 및 비타민의 조성 및 함량을 가진다. LS 배지는 종래의 MS 배지에서 비타민 조성이 변화된 것으로서, LS 배지의 무기염 및 비타민 조성 및 함량 역시 아래의 표 1에 나타나 있다.

더욱 구체적으로는, MS 배지와 LS 배지는 미량 원소(micro elements)와 대량 원소(macro elements) 조성은 모두 같고, 다만 비타민의 종류가 MS 배지는 글리신(glycine), 마이오-이노시톨(myo-inositol), 니코틴산(nicotinic acid), 피리독신 HCl(pyridoxine HCl), 티아민 HCl(thiamine HCl)을 함유하나, LS 배지는 마이오-이노시톨과 티아민 HCl만을 함유하며 티아민 HCl의 농도가 MS 배지와 다르다는 차이가 있다.

상기 LS 배지에 함유된 비타민은 식물체의 재분화에 영향을 미치는 성분으로서, 상기 LS 비타민의 함량이 부족하거나 과잉일 경우, 배 조직의 재분화율이 현저히 떨어질 수 있다.

상기 NAA 및 IBA는 식물생장조절물질로서, NAA는 식물의 성장을 촉진하는 생장 호르몬인 옥신(auxin)의 일종이고, IBA는 식물의 기관형성 등을 조절하는 생장 호르몬의 일종이다. 배양된 식물조직으로부터 싹과 뿌리가 재생되기 위해서는 식물 호르몬들 간의 상호작용이 중요하다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 원황배 발근용 배지에서 상기 LS 배지는 약 20% 내지 30% 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 LS 배지는 약 25% 농도 (1/4 농도)로 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 LS 배지 부피를 기준으로 상기 NAA가 약 0.5 mg/L 내지 2 mg/L 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 NAA는 상기 LS 배지 부피를 기준으로 약 1 mg/L 함유될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 LS 배지 부피를 기준으로 상기 IBA가 약 0.5 mg/L 내지 2 mg/L 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 IBA는 상기 LS 배지 부피를 기준으로 약 1 mg/L 함유될 수 있다.

상기 NAA 및 IBA의 첨가량이 상기 범위를 벗어날 경우 발근률 및 재분화율이 떨어질 수 있고, NAA 및 IBA를 함께 사용하지 않고 NAA만을 첨가하거나 IBA만을 첨가할 경우에는 발근률 및 재분화율 향상의 효과가 더욱 현저하게 떨어지거나 발근 및 재분화가 전혀 이루어지지 않을 수도 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 LS 배지 부피를 기준으로 상기 탄소공급원이 약 5 g/L 내지 10 g/L 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 탄소공급원(carbon source)은 배양된 식물 조직이 자라는데 필요한 에너지원 역할을 한다. 상기 탄소 공급원으로서는 수크로스 (sucrose), 소르비톨 (sorbitol) 및/또는 글루코스 (glucose) 등이 사용될 수 있다.

상기 탄소공급원의 첨가량이 상기 범위 미만일 경우 식물체의 탄소 및 에너지원인 당의 농도가 급격히 낮아져 신초의 성장이 느려지고 배양 단계 후반부에 생육이 억제될 우려가 있고, 반면 상기 범위를 초과할 경우 탄수화물의 공급이 과도하게 이루어져 재분화율이 떨어질 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소공급원은 상기 LS 배지 부피를 기준으로 약 7.5 g/L 함유될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소공급원은 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

겔화제(gelling agent)는 액체상태의 배지를 겔화(고형화)시켜 고체상태로 만드는 역할을 한다. 상기 겔화제로서는 플랜트 아가 (plant agar) 또는 다이신 아가(daishin agar)가 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 겔화제는 플랜트 아가 (plant agar)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 LS 배지 부피를 기준으로 상기 겔화제가 약 6 g/L 내지 10 g/L 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 겔화제의 첨가량이 상기 범위 미만일 경우 식물체가 배지에 제대로 지지되지 못할 우려가 있고, 반면 상기 첨가량이 상기 범위를 초과할 경우 배지의 강도(딱딱한 정도)가 과도하게 높아져 발근률 및 재분화율이 떨어지고, 식물체에서 뿌리가 잘 뻗어 내리지 못할 우려가 있다. 예를 들어, 상기 겔화제는 상기 LS 배지 부피를 기준으로 약 8 g/L 함유될 수 있다.

본원에 따른 원황배 발근용 배지는, 1/4 농도의 LS 배지 1 L를 기준으로 IBA 1.0 mg/L, NAA 1.0 mg/L, 글루코스 7.5 g/L, 및 플랜트 아가 8 g/L을 포함할 수 있으며, 이때 가장 높은 원황배 발근률 (24%)을 나타내었다. 예를 들어, 상기 원황배 발근용 배지는 약 5 내지 6의 pH를 가질 수 있고, 바람직하게는 약 5.8의 pH를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 원황배의 식물체 일부를 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양한 후, 본원의 제 1 측면에 따른 배지로 옮겨 발근을 유도하는 것을 포함하는 원황배 발근 유도 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 식물체 일부는 액아 또는 잎의 절편일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 발근을 유도하는 단계는 약 4 주 내지 10 주 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 발근을 유도하는 단계는 약 6 주 내지 8 주 동안 수행될 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 배지 상에서 원황배의 식물체 일부를 배양하는 것을 포함하는 원황배의 재분화 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

식물재료

본 실시예에서는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 배 '원황'을 이용하였다. '원황'은 1978년 조생적에 만삼길을 교배하여 일차 선발되었으며 원교나-09호로 4 년간 지역적응시험을 거쳐 고당도의 조생종으로 우수성이 인정되어 1994 년 최종 선발 명명되었다.

기존의 '신고'와 '황금배'의 발근배지로 사용하였던 1/2 MS 배지+비타민, IBA 0.3 mg/L, 수크로스 15 g/L, 플랜트 아가 8 g/L 조성과 '배연3호' 품종의 발근배지로 사용하였던 1/2 MS 배지+비타민, IBA 1.0 mg/L, 수크로스 15g/L, 플랜트 아가 8 g/L 조성에서는 원황 품종의 발근이 전혀 이루어지지 않았다. 따라서, 종래의 발근배지 조성 외에 새로운 발근배지 조성 3 가지를 추가하여 총 5 종류의 발근배지가 본 실시예에서 시험되었다

먼저 '원황' 1 년생 휴면지를 채취하여 4℃에서 6 주간 저온 처리를 하여 휴면을 타파시킨 후 액아를 유도하고, 발생한 액아를 70% EtOH로 세척한 다음 3.0%의 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 10 분간 살균하고 멸균수로 5 내지 10 회 반복하여 세척하였다. 멸균된 액아는 BA(benzylaminopurine) 1.0 mg/L, 수크로스 30 g/L, 및 플랜트 아가(plant agar) 10 g/L 를 첨가하고 pH를 5.8로 조정한 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지에 치상하여 기내 도입을 유도하였다. 신초 증식 배양은 25±2℃로 조절되는 배양실에서 2,000 μmol·m²·sec¹의 광도로 16 시간 광주기, 8 시간 암주기로 처리하였다. 8 주 간격으로 1~3 ㎝ 정도 길이의 신초들을 BA 1.0 mg/L, IBA 0.1 mg/L, 수크로스 30 g/L, 플랜트 아가 10 g/L 를 첨가하고 pH를 5.8로 조정한 MS 배지에 치상하여 계대배양하였다.

식물생장조절물질의 농도 조절

기내 도입된 식물체를 증식배지로 옮기고 나서 조직배양묘의 활성이 좋은 단계에 1 번 내지 5 번 중 하나의 발근배지로 옮겨 발근률을 측정하였다. 생장조절물질에 의한 원황 품종의 발근률을 조사하기 위하여 옥신(auxin)인 NAA을 0.5 mg/L 또는 1.0 mg/L, 그리고 IBA를 0.3 mg/L, 0.5 mg/L 또는 1.0 mg/L 농도로 혼용 처리하였다. 또한, 비타민의 영향을 보기 위해 비타민 조성이 다른 MS 배지( Murashige and Skoog 1962)와 LS 배지(Linsmaier and Skoog 1965)를 사용하였다. 5 종의 조성을 가지는 발근배지에 처리구당 25 개씩 3 반복으로 치상하였다.

탄소원의 종류 및 농도 조절

탄소원의 종류와 농도에 의한 발근률을 조사하기 위해 MS 배지에 수크로스 15 g/L를 첨가하였고, LS 배지에는 글루코스를 7.5 g/L 또는 15 g/L 두 가지 농도로 첨가하였다. 지지체로는 플랜트 아가 8 g/L를 5 가지 발근배지에 동일하게 사용하였다.

발근 배지 조성

원황배의 발근 실험을 위해 비교 실험된 배지의 구체적인 조성은 아래의 표 2에 나타나 있다.

번호	배지 조성
1	½ MS 배지+비타민, IBA 0.3 mg/L, 수크로스 15 g/L, 플랜트 아가 8 g/L, pH 5.8
2	½ MS 배지+비타민, IBA 1.0 mg/L, 수크로스 15 g/L, 플랜트 아가 8 g/L, pH 5.8
3	½ MS 배지+비타민, IBA 0.5 mg/L, NAA 0.5 mg/L, 수크로스 15 g/L, 플랜트 아가 8 g/L, pH 5.8
4	¼ LS 배지+비타민, IBA 1.0 mg/L, NAA 1.0 mg/L, 글루코스 7.5 g/L, 플랜트 아가 8 g/L, pH 5.8
5	½ LS 배지+비타민, IBA 1.0 mg/L, NAA 1.0 mg/L, 글루코스 15 g/L, 플랜트 아가 8 g/L, pH 5.8

1번 배지는 기존의 '신고'와 '황금배'의 발근배지 조성으로 두 품종 모두 이 배지 조성에서 70% 이상의 발근률을 보인 바 있고, 2번 배지는 기존의 '배연3호'의 발근배지 조성으로 상기 품종은 이 배지 조성에서 80% 이상의 발근률을 보인 바 있다. 1번과 2번 배지 모두에서 원황 품종의 발근이 이루어지지 않았기 때문에, 3번 배지에서는 식물생장조절물질인 IBA 농도를 0.5 mg/L, NAA 0.5 mg/L로 하여 실험하였고, 4번 배지는 MS 배지와 비타민의 조성이 다른 LS 배지를 1/4 농도로 사용하였고 IBA 농도를 1.0 mg/L, NAA 1.0 mg/L로 하고 탄소원을 수크로스 대신 글루코스로 변경하고 농도를 1/2로 줄여 실험하였으며, 5번 배지는 LS 배지를 1/2 농도로 사용하였고 IBA 농도를 1.0 mg/L, NAA 1.0 mg/L로 하였고 탄소원을 수크로스 대신 글루코스로 변경하여 사용하였다.

발근률 조사

1번 내지 5번 배지 각각에서 원황배의 발근률을 조사한 결과를 아래의 표 3에 정리하였다. ¼ LS 배지, IBA 1 mg/L, NAA 1.0mg/L, 글루코스 7.5 g/L를 포함하는 4번 배지 조성에서 18 개체가 발근하여 가장 높은 24%의 발근률을 보였다. 1번 및 2번 배지에서는 전혀 발근이 이루어지지 않았으며, 3번 및 5 번 배지에서는 75 개체 중 단 3 개체에서만 발근이 이루어져 4%의 낮은 발근률을 보였다.

배지번호	1회	2회	3회	총발근개체수	발근률
1	0/25	0/25	0/25	0/75	0%
2	0/25	0/25	0/25	0/75	0%
3	0/25	2/25	1/25	3/75	4%
4	6/25	7/25	5/25	18/75	24%
5	1/25	1/25	1/25	3/75	4%

옥신 처리에 따른 식물체 재분화 관찰

식물체 재분화는 생장조절물질의 조성과 절편체의 종류, 유전형 등 여러 가지 요인에 따라 많은 차이가 있지만 (Moon et al. 2000), 그 중에서도 대표적인 식물생장조절물질인 옥신(auxin)과 시토키닌(cytokinin)의 농도 비율에 따라서 기관발생 및 캘러스가 형성된다 (Huetteman and Preece 1993). 옥신은 세포벽을 신장시켜 길이 생장 촉진, 곁눈의 생장 억제, 과실의 생장과 낙엽 및 낙과 방지, 발근 촉진에 관여하는 식물생장조절물질로 생장을 촉진하는 최적 농도는 식물체의 기관에 따라 다르다. 줄기의 생장이 촉진되는 증식배지에서의 옥신 농도에서는 뿌리의 생성이 억제된다. 배 원황 품종의 발근에 적합한 옥신 농도를 찾기 위해서 NAA의 농도를 0.5 mg/L 또는 1.0mg/L, IBA의 농도를 0.3, 0.5 또는 1 mg/L로 조합한 배지에 식물체를 치상하였다. 배양 4 주 후부터 식물체의 하단부에서 발근이 시작되었으며 6 주 후에는 주근이 나오기 시작하여 8 주가 지나면 주근에서 잔뿌리가 나와 발근이 정상적으로 이루어지게 된다. 발근이 이루어진 원황배의 사진 이미지가 도 1에 나타나 있다. NAA를 첨가하지 않은 배지에서는 원황배의 발근이 전혀 이루어지지 않았지만 NAA가 0.5mg/L 또는 1.0 mg/L의 농도로 첨가된 배지에서는 발근이 되었다. IBA 처리구에서도 0.3mg/L의 낮은 농도에서는 발근이 되지 않았지만 NAA 0.5 mg/L 또는 1.0 mg/L의 농도 조합 배지에서는 발근이 되었으며 이는 높은 농도의 옥신에서 원황배의 발근 형성이 일어남을 보여주는 것이다. 동양배의 재분화에 관한 연구결과에서 '풍수' (Pyrus pyrifolia cv. Housui)와 '행수' (Pyrus pyrifolia cv. Kousui)는 IBA 5 mg/L의 높은 농도에서 캘러스 형성과 발근이 유도되었으며 (Hennayake et al. 2003) 선행 연구결과에서 '신고' (Kim et al. 2013) 와 '황금배' (Chun et al. 2012)에서는 IBA 0.3 mg/L에서 높은 발근률이 보고되었다. 이러한 차이는 품종에 따라 발근률에 있어 서로 다른 최적 옥신 농도를 가지기 때문으로 해석된다.

식물체 발근 과정에서 탄소원과 그 농도의 영향 관찰

수크로스와 글루코스는 식물 조직배양에서 에너지원과 탄소원 그리고 삼투압 조절제로서 많이 사용되고 있다. 기존의 '신고', '황금배', '배연3호'의 발근배지에서 사용한 수크로스 대신에, 원황배의 발근을 위한 본원의 배지에서는 글루코스를 사용하였다. 글루코스 농도를 7.5 g/L 또는 15 g/L의 두 가지로 발근률을 조사한 결과 배 원황 품종의 발근은 15 g/L의 농도의 글루코스에서보다 7.5 g/L 농도의 글루코스에서 보다 높게 나타났다. 수크로스는 열에 약하기 때문에 배지의 멸균 시간이 길어지거나 압력이 높아지면 단당류인 글루코스나 프럭토스(fructose)로 변하며, 이 때문에 세가지의 당이 혼재할 수 있고 이는 발근을 억제하는 요인이 될 수 있다. 조직배양에서 플랜트 아가가 지지체로서 주로 많이 사용되고 있으므로, 본원에서는 플랜트 아가를 8 g/L의 농도로 5 종류의 배지에 동일하게 사용하였다. 기내도입한 식물체에서 뿌리가 분화되는 과정을 보면 발근배지에 이식 후 3~4주까지는 뿌리의 분화가 일어나지 않고 하단부의 비대현상이 관찰되며 배양 6 주 후부터 주근의 분화가 일어난다. 배양 8 주 후에는 주근으로부터 세근이 전개된 다음 정상적인 발근이 이루어졌다 (도 1).

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 겹합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. LS 배지 (Linsmaier and Skoog), NAA(1-Naphthaleneacetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), 탄소공급원(carbon source), 겔화제(gelling agent) 및 증류수를 포함하고,
   상기 LS 배지는 20% 내지 30% 농도를 가지고,
   상기 NAA는 0.5 mg/L 내지 2 mg/L 범위 내로 포함되고,
   상기 IBA는 0.5 mg/L 내지 2 mg/L 범위 내로 포함되고,
   상기 탄소공급원은 글루코스(glucose)가 5 g/L 내지 10 g/L 범위 내로 포함되고,
   상기 겔화제는 플랜트 아가(plant agar)가 6 g/L 내지 10 g/L 범위 내로 포함된 것을 특징으로 하는, 원황배 발근용 배지.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 LS 배지는 25% 농도를 가지고,
   상기 NAA는 1.0 mg/L 만큼 포함되고,
   상기 IBA는 1.0 mg/L 만큼 포함되고.
   상기 탄소공급원은 글루코스(glucose)가 7.5 g/L 만큼 포함되고,
   상기 겔화제는 플랜트 아가(plant agar)가 8 g/L 만큼 포함된 것을 특징으로 하는, 원황배 발근용 배지.
   
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9. 원황배의 식물체 일부를 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양한 후, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 배지로 옮겨 발근을 유도하는 것을 포함하는, 원황배 발근 유도 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 발근을 유도하는 단계는 4 주 내지 10 주 동안 수행되는 것인, 원황배 발근 유도 방법.
    
11. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 배지 상에서 원황배의 식물체 일부를 배양하는 것을 포함하는, 원황배의 재분화 방법.

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