CN115956506A - 一种茶树离体再生组织的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶树离体再生组织的构建方法，属于植物组织培养技术领域。所述方法包括以下步骤：(1)采集茶树嫩枝的新梢，消毒后以新梢的茎尖作为外植体；(2)将外植体接种于愈伤组织培养基中进行黑暗培养，之后进行光照培养并通电处理，诱导分化丛生芽；(3)将分化生成的丛生芽依次接种于增殖培养基和生根培养基中进行培养，获得茶树离体再生幼苗；所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加褪黑素和抗坏血酸。抗坏血酸作为抗氧化剂，与褪黑素共同作用，加强了对茶树离体组织褐化的抑制效果，结合通电处理，进一步促进了丛生芽的分化与根的形成，促进茶树离体再生幼苗的生成，提高了茶树离体组织再生的效率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，特别是涉及一种茶树离体再生组织的构建方法。
背景技术
茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科多年生木本植物，是重要的生产非酒精类饮料的木本植物之一，也是我国重要的经济作物。选育高产优质的茶树品种是科研工作者的育种目标，常规育种和杂交育种是常用的茶树育种方法，但由于受茶树自交不亲和、育种年限长等因素的制约，茶树育种工作难以得到突破性进展。
植物遗传转化(plant genetic transformation)技术又称植物转基因技术，是指通过DNA重组技术、细胞组织培养技术或者种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段转入受体细胞，使其能够稳定遗传的过程。植物遗传转化技术能够实现茶树定向育种、缩短茶树育种年限，从而获得品质优良的茶树新品种，对开展茶树种质资源保存、新品种培育和性状改良等工作具有重要意义。进行茶树遗传转化之前，需要通过组织培养技术建立茶树器官的再生系统，目前，尽管茶树器官离体再生技术已得到一定的优化和改进，但仍有一些问题待解决。如茶树外植体的再生能力不一致、内生菌污染及外植体的褐化等因素都制约茶树诱导和分化效率，导致茶树器官的离体再生组织的重复实验效果不理想。因此，如何构建一种能够高效分化再生并且稳定遗传的茶树离体再生组织，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种茶树离体再生组织的构建方法，以解决现有技术中存在的问题，提高愈伤组织的诱导率并促进不定芽的分化，同时使茶树离体培养过程中的褐变率降低，以获得高效分化的茶树离体再生组织。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种茶树离体再生组织的构建方法，包括以下步骤：
(1)采集茶树嫩枝的新梢，消毒后以新梢的茎尖作为外植体；
(2)将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中进行黑暗培养，之后进行光照培养并通电处理，诱导分化丛生芽；
(3)将分化生成的丛生芽依次接种于增殖培养基和生根培养基中进行培养，获得茶树离体再生幼苗；
所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加褪黑素和抗坏血酸。
进一步地，所述褪黑素在所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为0.8mg/L，所述抗坏血酸在所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为10mg/L。
进一步地，在步骤(2)中，所述愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+2mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
进一步地，在步骤(3)中，所述增殖培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+30g/L蔗糖；所述生根培养基为：1/2MS+5mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
进一步地，在步骤(1)中，所述消毒为室温下乙醇溶液浸泡1min，转入NaClO溶液浸泡10min；所述乙醇溶液的体积分数为75％；所述NaClO溶液的质量分数为35％。
进一步地，在步骤(2)中，所述黑暗培养为25℃，培养10d。
进一步地，在步骤(2)中，所述光照培养为光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养30d。
进一步地，在步骤(2)中，所述通电处理采用电压为100V的脉冲电流，脉冲间隔0.5s，通电时间3h。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将外植体置于黑暗环境下培养，有利于愈伤组织的形成，通过在愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中添加褪黑素和抗坏血酸，有效缓解了茶树离体组织培养过程中外植体褐化的现象，其中，抗坏血酸作为抗氧化剂，与褪黑素共同作用，加强了对茶树离体组织褐化的抑制效果。
诱导成功的愈伤组织经电刺激，提升了其不定芽的生成能力，褪黑素与抗坏血酸的加入进一步促进了丛生芽的分化与根的形成，促进茶树离体再生幼苗的生成，提高了茶树离体组织再生的效率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)外植体的获取
采集茶树当年生嫩枝的新梢，室温下乙醇溶液(体积分数75％)浸泡1min之后转入NaClO溶液(质量分数为35％)浸泡10min，进行消毒处理，消毒后无菌水冲洗3次，切取新梢顶端的茎尖作为外植体。
(2)诱导培养
将步骤(1)获得的外植体接种于愈伤组织培养基中，25℃下黑暗培养，黑暗条件有利于愈伤组织的生成，黑暗培养第10d时，外植体切口处明显膨大，开始形成愈伤组织，此时采用电压为100V的脉冲电流，脉冲间隔0.5s，进行通电处理3h，同时改为12h/d的光照培养，光照强度为2000lx，继续培养30d。
(3)离体再生幼苗的培养
将步骤(2)中生长良好的愈伤组织转入增殖培养基中，在25℃，光照强度为2200lx，光照时间为12h/d的条件下，培养40天，最后转入生根培养基中，在25℃，光照强度为2200lx，光照时间为12h/d的条件下，培养40天，获得茶树离体再生幼苗。将获得的离体再生幼苗，炼苗，移栽，统计成活率。
愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+2mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
增殖培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+30g/L蔗糖。
生根培养基为：1/2MS+5mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
本实施例以茶树茎尖组织为外植体，构建了50个茶树离体再生组织，其中，1个外植体在构建过程中出现了褐化现象，未能成功构建成茶树离体再生幼苗，其余49个全部构建成功，经过炼苗，移栽，全部成活。
试验例1
将愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基分别调整为：愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+2mg/LNAA+2mg/L6-BA+20g/L蔗糖；增殖培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+30g/L蔗糖；生根培养基为：1/2MS+5mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+20g/L蔗糖。在此基础上，按照表1所示分别加入不同浓度的抗坏血酸，其余操作同实施例1，分别对30个茶树茎尖组织进行体外再生培养，统计愈伤组织培养中的褐化情况，结果见表1。根据表1可以看出，在愈伤组织培诱导养基、增殖培养基和生根培养基中添加抗坏血酸，有利于降低愈伤组织的褐化率，当抗坏血酸的添加浓度为10mg/L时，褐化率最低。
表1
试验例2
将愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基分别调整为：愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+2mg/LNAA+2mg/L6-BA+20g/L蔗糖；增殖培养基为：1/2MS+3mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+30g/L蔗糖；生根培养基为：1/2MS+5mg/L2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L6-BA+20g/L蔗糖。在此基础上，按照表2所示分别加入不同浓度的褪黑素，其余操作同实施例1，分别对30个茶树茎尖组织进行体外再生培养，统计愈伤组织培养中的褐化情况，结果见表2。根据表2可以看出，在愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中添加褪黑素，有利于降低愈伤组织的褐化率，当褪黑素的添加浓度为0.8mg/L时，褐化率最低。
表2
试验例3
在茶树离体再生组织的构建中，有的虽然成功诱导出了愈伤组织，但很难分化形芽和根，难以构建出能够稳定遗传的茶树离体再生幼苗，因此，丛生芽和根的生成也是茶树离体再生组织的构建中至关重要的部分。为了进一步提升丛生芽和根的分化，我们对诱导培养中的其他条件进行了优化。分别验证通电时间和愈伤组织诱导培养基中有无褪黑素和抗坏血酸对丛生芽和根的影响，如表3所示，其余操作同实施例1，在此基础上分别对30个茶树茎尖组织进行体外再生培养，统计丛芽和根的平均生成数量，结果见表3。结果表明，电刺激对诱导茶树茎尖外植体产生不定根和不定芽具有重要作用，褪黑素与电刺激结合可以促进丛生芽和根的生成量。电刺激处理3h，丛生芽和根的生成效果最好。
表3
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种茶树离体再生组织的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集茶树嫩枝的新梢，消毒后以新梢的茎尖作为外植体；
(2)将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中进行黑暗培养，之后进行光照培养并通电处理，诱导分化丛生芽；
(3)将分化生成的丛生芽依次接种于增殖培养基和生根培养基中进行培养，获得茶树离体再生幼苗；
所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加褪黑素和抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑素在所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为0.8mg/L，所述抗坏血酸在所述愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为10mg/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+3mg/L 2,4-D+2mg/LNAA+2mg/L 6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(3)中，所述增殖培养基为：1/2MS+3mg/L 2,4-D+5mg/LNAA+2mg/L 6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+30g/L蔗糖；所述生根培养基为：1/2MS+5mg/L 2,4-D+5mg/L NAA+2mg/L 6-BA+0.8mg/L褪黑素+10mg/L抗坏血酸+20g/L蔗糖。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述消毒为室温下乙醇溶液浸泡1min，转入NaClO溶液浸泡10min；所述乙醇溶液的体积分数为75％；所述NaClO溶液的质量分数为35％。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述黑暗培养为25℃，培养10d。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述光照培养为光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养30d。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述通电处理采用电压为100V的脉冲电流，脉冲间隔0.5s，通电时间3h。
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|---|
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Also Published As
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|---|---|
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