KR20130117297A - 블루베리 품종인 블루골드，엘리자베스，오따드 또는 티프블루의 엽편 배양 방법을 이용한 식물체 형성 방법 - Google Patents

블루베리 품종인 블루골드，엘리자베스，오따드 또는 티프블루의 엽편 배양 방법을 이용한 식물체 형성 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 블루베리 4품종의 엽편 배양 방법을 이용한 기내 유식물체 형성하는 배지 조성 및 배양 조건에 관한 것으로 기내 배양중인 블루베리 유식물체의 잎을 직접 이용하기 때문에 생장점 채취와 같이 고도의 정밀한 기술이 필요하지 않으면서 비교적 간단하게 배양할 수 있는 엽편 배양 방법을 이용한 북부하이부시 계통 2품종인 블루골드 또는 엘리자베스와 래빗아이 계통 2품종인 오따드와 티프블루의 식물체 형성 방법에 관한 것으로 생장점 배양보다 다신초 형성율이 높기 때문에 배양 규모를 확대하는 증식 배양 과정에서 유식물체 수를 증가가 유리하며, 전체 유식물체 형성 기간은 8 ~ 9개월이므로 건전한 블루베리 국산 조직 배양 묘목의 확대 보급을 위한 생산 기술로 유용하다.

Description

블루베리 품종인 블루골드，엘리자베스，오따드 또는 티프블루의 엽편 배양 방법을 이용한 식물체 형성 방법{Method for Plant Formation of Blueberry cv． Bluegold，Eligabeth，Woodard or Tifblue through laminas culture}
본 발명은 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법에 관한 것이다.
블루베리(Vaccinium spp.)는 진달래과(family Ericaceae) 산앵도나무속(genus Vaccinium) 시아노코커스절(sections Cyanoccous)에 속하는 관목성 작물로 타임지 선정 세계 10대 슈퍼푸드 중 하나로써 안토시아닌, 래스베리톨 등의 유효성분에 의해 그 효용 가치를 인정받아 21세기형 과수로도 불리고 있다. 뛰어난 생체조절 기능으로는 시력 회복 및 증진, 망막의 변성과 백내장 방지, 발암 억제, 항산화 작용 등을 들 수 있다.
산앵도나무속은 위와 같이 4개의 절로 나뉘며 그 중 하나의 아속(subgenus)인 실제 블루베리(True blueberries = Cyanococcus)는 미국 동부에 많은 하이부시블루베리(highbush blueberry, V. corymbosum, 미국 북동부와 캐나다에 많은 로우부시블루베리(lowbush blueberry, V. angustifolium, Georgia 주 등 온난한 지역에서 자라는 래빗아이블루베리(rabbiteye blueberry, V. ashie.)로 나뉜다. 북아메리카 및 핀란드 등 유럽 각 지역이 원산지로 알려진 블루베리는 과실의 맛과 효능이 널리 알려지기 시작해서 1950년대 이후에 품종 개발이 진행되어 현재 약 200여 종이 알려져 있다. 한국에서 상업적 재배가 가능한 블루베리의 종은 하이부시종으로 하이부시계 블루베리는 주로 다음과 같이 나뉜다. 한냉한 지역에서 잘 자라는 북부하이부시계 블루베리, 추위가 약한 지역에서 잘 자라는 남부하이부시계 블루베리, 반수고 하이부시계 블루베리, 레빗아이계 블루베리로 나뉜다.
고기능성 신소득 작목으로 국내에는 2000년 이후 본격적으로 도입되어 재배가 시작되었으며, 2011년 전체 재배면적은 1,082ha(충북 118ha)으로 2010년 대비 2.1배 정도 급증하여 묘목 품귀현상이 있을 정도로 관심이 집중되고 있다. 국내 수입량 또한 매년 증가하고 있으며, 생과뿐만 아니라 와인, 잼 등의 가공식품에 대한 수요도 급증하고 있다.
블루베리 묘목은 2년생이 주당 1 ~ 2만원 정도로 초기 재배 비용 중 묘목비가 차지하는 비율이 높아 농가 경영에 큰 부담을 차지하고 있다. 또한 수요에 비해 묘목 공급이 부족하고, 국산 삽목묘의 품질이 떨어져 중국, 미국, 일본으로부터 묘목과 삽수가 수입되는 등 재배 농가가 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
특히 검역과정에서 중국산 블루베리 묘목으로부터 BlSV(Blueberry scorch virus)가 검출되는 등 수입 묘목의 유해 병해충 발견 건수는 해마다 증가하고 있다. 이에 따른 페기반송 조치 사례도 2010년 177건으로 수입산 묘목의 품질 검증에 대한 필요성이 제기되고 있다.
현재 농림수산식품부에서는 무병 우량 묘목 생산보급 대책(2011~2017)을 시행하고 있으며 2020년까지 주요 과수 묘목 수요량의 60%를 무병 묘목으로 공급할 계획에 있어 무병주 묘목의 국내 생산 기술 개발이 매우 중요한 시점이다.
따라서 virus-free한 무병주로써 삽목묘보다 뿌리 생육 등이 강건하고 초기 생장속도가 훨씬 빠르며 조기 수확이 가능할 뿐만 아니라 과실품질이나 내병성 등이 우수하다는 평가를 받는 블루베리 조직 배양묘의 국내 생산 기술 확보가 매우 중요하다.
엽편배양 방법 이용 블루베리 조직배양묘 기내 생산 관련 국내 연구는 본 개발자가 2011년 발명하여 특허출원을 완료한엽편배양 방법을 이용한 블루베리품종인 토로, 레가시, 또는 오레곤블루의 기내 유식물체 형성방법(출원번호 10-2011-0138656)이 최초인데, 엽편배양시 필요한 배지조성 등 품종별 배양조건을 포함하여 토로, 레가시, 오레곤블루 3품종에 대한 조직배양묘를 생산할 수 있는 기술이다.
또한 본 발명과 관련된 블루베리 품종에 대한 조직배양묘 기내 생산을 위한 국내 관련 연구는 본 발명자가 2011년 발명하여 특허출원을 완료한 생장점배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성방법(출원번호 10-2011-0020374)이 최초인데, 생장점배양 시 필요한 배지조성 등 품종별 배양조건을 포함하여 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루 5품종에 대한 조직배양묘를 생산할 수 있는 기술이다.
현재 블루베리의 전통적 육종방법의 한계를 극복하고자 조직배양 및 유전자 조작(genetic engineering) 등의 연구가 수행되고 있는데, 이 과정의 효율성을 높이기 위하여 잎 절편(엽편, leaf explant)으로부터 신초를 분화시켜 온전한 식물체를 완성하였다는 연구(Billings 등, 1988; Callow 등, 1989) 보고 이후, 토마토(Tatchell과 Binns, 1986), 감자(Shddrman와 Bevan, 1988)뿐만 아니라 같은 진달래과 작물인 크랜베리(Qu, 2000), 블랙베리(Gupta와 Mahalaxmi, 2009)에서도 연구되고 있다.
엽편을 이용하여 신초 형성 및 식물체 재분화를 유도하는 배양 방법은 식물이 가지고 있는 전형성능(totipotency)을 이용하는 것으로, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 작물별로 또는 품종별로 배양 조건을 최적화하는 것이 필요하다. 보통 엽편으로부터 신초 재분화(shoot regeneration)를 유도하려면 미분화된 부정형의 세포덩어리인 캘러스 형성 이후, 신초가 형성되는 과정을 거치게 되므로, 배양 초기 왕성한 캘러스 형성 능력 또는 직접적인 신초 분화 능력을 유도하는 배양 조건을 찾는 것이 가장 중요하다.
블루베리의 조직배양시, 배지에 포함되는 생장조정제 및 첨가물의 종류와 농도에 따라 블루베리의 신초 형성 및 생육이 현저히 다르다는 연구들이 보고되었다(Alexandru F., D. Clapa, and C. Badescu. 2008. Horticulture. 65(1):104~109, Jiang Y.Q., Yu H., Zhang D.Q, He S.A. and Wang C.Y. ISHS Acta Horticulturae 810: IX International Vaccinium Symposium., Sedlak J. and Paprstein F. ISHS Acta Horticulturae 810: IX International Vaccinium Symposium., Clapa D., Fira A., and Rusu T. 2008. Food, Agriculture and Environment. 6(1):145~147). 더욱이 같은 배양 조건이라도 블루베리 품종에 따라 신초 분화 및 식물체 생육이 서로 다르다는 연구 결과가 보고되었다(Gajdosova A., Ostrolucka M. G., Libiakova G., Ondruskova E., and Simala D. 2006. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 14(Suppl. 1):103~119, Ostrolucka M. G., Libiakova G., Ondruskova E. and Gajdosova A. 2004. Acta Universitatis Latviensis, Biology. 676:207~212).따라서 이러한 결과들은 블루베리의 신초 형성율 및 분화율이 생장조정제를 포함한 첨가물의 종류 및 농도에 따른 배지의 조성과 식물체 재분화 과정에 있는 각각의 블루베리 품종간 상호 작용 또는 반응(reaction of specific cultivar to the cytokinin type)에 의해 좌우된다는 것을 보여준다. 따라서 조직배양 방법을 이용하는 경우, 블루베리의 식물체 형성율을 높이고 아울러 성공적인 조직배양묘의 대량생산을 위해서는 블루베리 품종별로, 생장조정제를 포함한 배지 첨가물의 종류 및 농도 등 배지의 조성 최적화가 반드시 필요하다.
이에 본 발명자는 국내 적응성이 뛰어나고 비교적 많은 재배면적을 차지하는 북부하이부시 계통 2품종 블루골드 또는 엘리자베스와 래빗아이 계통 2품종 오따드 또는 티프블루를 엽편 배양하여 기내에서 8 ~ 9 개월 내에 유식물체를 형성하는 배지 조성 및 배양 조건을 개발함으로써 건전한 블루베리 국산 조식배양 묘목의 확대 보급을 위한 원천기술로 활용하고자 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 엽편 배양을 통하여 기내에서 배양 중인 블루베리 유식물체의 잎을 직접 이용하여 간단하게 블루베리 조직 배양묘를 제공할 수 있는 북부하이부시 계통 2품종 블루골드 또는 엘리자베스와 래빗아이 계통 2품종 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 옆편 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 오따드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
아울러, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 티프블루 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 5종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
본 발명에 따른 블루베리 북부하이부시 계통 2품종 블루골드 또는 엘리자베스와 래빗아이 계통 2품종 오따드 또는 티프블루의 형성 방법은 엽편을 이용하여 신초 형성 능력 및 식물체 재분화를 유도함으로써, 기내 배양중인 블루베리 유식물체의 잎을 직접 이용하기 때문에 생장점 채취와 같이 고도의 정밀한 기술이 필요하지 않으면서 비교적 간단하게 배양할 수 있고 다신초 형성율이 높기 때문에 배양 규모를 확대하는 증식 배양 과정에서 유식물체 수를 증가가 유리하며, 전체 유식물체 형성 기간은 8 ~ 9개월이므로 유용하다.
도 1은 블루베리 하이부시 계통 2품종인 블루골드 또는 엘리자베스와 래빗아이 계통 2품종인 오따드 또는 티프블루을 본 발명에 따른 엽편 배양 방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 기내에서 배양 및 증식 중인 북부하이부시 계통 2품종(블루골드, 엘리자베스)과 래빗아이 계통 2품종(오따드, 티프블루)의 잎(엽편)을 시험재료로 사용하였다. 배양 과정은 왕성히 생육중인 기내 유식물체의 잎(엽편)을 절취하여 배양하는 초기 캘러스형성 및 다신초(multi-shoot) 유도 단계, 식물체 형성 단계, 뿌리 형성(발근) 단계, 그리고 기내(배양실)에서 기외(온실 또는 포장)로 식물체를 순화하는 단계로 구성되어 있다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 옆편 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 기내 유식물체 형성 방법:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
상기 방법에 있어서, (c)는 (b)의 첨가물 중 지아틴의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 첨가하거나 또는 아예 첨가하지 않고 그 대신 IBA(인돌-3-부트릭산)를 1 또는 2 ㎎/L 첨가하여 뿌리를 유도하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
상기 방법에 있어서, (c)는 (b)의 첨가물 중 지아틴의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 첨가하거나 또는 아예 첨가하지 않고 그 대신 IBA(인돌-3-부트릭산)를 1 또는 2 ㎎/L 첨가하여 뿌리를 유도하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 오따드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
상기 방법에 있어서, (c)는 (b)의 첨가물 중 지아틴의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 첨가하거나 또는 아예 첨가하지 않고 그 대신 IBA(인돌-3-부트릭산)를 1 또는 2 ㎎/L 첨가하여 뿌리를 유도하는 단계를 포함한다.
아울러, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 티프블루 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
(a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 5종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
(b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
상기 방법에 있어서, (c)는 (b)의 첨가물 중 지아틴의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 첨가하거나 또는 아예 첨가하지 않고 그 대신 IBA(인돌-3-부트릭산)를 1 또는 2 ㎎/L 첨가하여 뿌리를 유도하는 단계를 포함한다.
조직 배양 배지는 크게 무기염류, 탄소 및 에너지원, 기타 유기물, 비타민류, 생장조절제, 기타 첨가물(아가)로 구성된다.
산소, 탄소, 수소를 제외한 조직 배양 배지의 무기염류로써, 식물세포 및 조직배양에 필요한 원소로는 질소, 인산, 칼리, 황 등의 다량요소와 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 구리, 아연, 붕소, 코발트, 철 등 비교적 소량으로 필요한 미량요소가 있다.
상기의 원소들은 식물체뿐만 아니라 세포나 조직의 발달에 중요한 역할을 한다. 특히 미량요소 중 철(Fe)의 기능이 중요한데, 식물체 내에 일어나는 여러 대사과정을 조절하는 효소(enzyme)의 기능을 보완하고 보조하는 보조인자(cofactor)의 역할을 한다. 특히 식물의 광합성 작용이 일어나는 세포 내 엽록체에는 라멜라(lamellae)라는 층이 존재하는데, 이 층은 싸이토크롬(cytochrome)이라는 단백질로 구성되어 있고 이 싸이토크롬(cytochrome) 내에 철(Fe)을 포함하는 색소가 있어 산화·환원 작용을 통한 전자의 전달 기능 등 광합성 작용을 촉매하는 중요한 역할을 한다. 그 외에도 식물의 생장이나 형태 형성에 필수적인 것으로 알려져 있다.
배지 내 철(Fe)의 흡수는 pH의 영향을 많이 받는데 pH가 5.2 이상이 되면 흡수율이 떨어질 뿐만 아니라, 철(Fe) 자체가 물에 잘 녹지 않아 배지를 만들 때 침전이 생기는 문제가 발생하기도 한다. 과거 상업적으로 개발된 배지의 경우, Fe(SO4)3의 형태로 Fe를 공급하였으나, 이후에 개발된 배지에서는 위에서 언급한 문제점들을 극복하기 위하여 FeSO42H2O를 첨가하여 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA)의 착염(chelate)을 형성시켰으며, 착염 상태의 철(Fe)은 배지의 pH가 8까지 올라가도 흡수가 가능하여 식물체가 계속 이용할 수 있다.
생장조절제인 지아틴(Zeatin) 또는 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)는 벤질아미노푸린(Benzylaminopurine), 티디아주론(Thidiazuron), 카이네틴(Kinetin) 및 디메틸알릴아미노퓨린(2iP)과 같은 시토시닌(cytokinis)류의 식물성장호르몬으로써, 식물의 세포분열을 촉진한다. 특히 지하부의 발육을 억제하고 지상부의 생육을 촉진한다고 알려져 있어 식물체의 대량번식에서 신초를 유기, 증식시키는데 많이 사용되고 있다.
상기 신초 유도시 지아틴(Zeatin) 또는 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)를 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 오히려 식물체 생육을 저해하여 신초 발생이 지연되거나 억제되고 식물체 고사율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 캘러스 형성율이 높아지고 신초 형성율이 낮아지는 문제점이 발생한다.
또한 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA)를 73.4 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 신초의 잎이 붉게 변하고 고사율 또는 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 27.6 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 그리고 미오이노시톨(Myo-Inositol)을 150 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 형성과정에서 변이율이 높아지는 문제점이 있으며, 50 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 티아민 HCl(Thiamine HCl)을 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 또한 니코틴산(Nicotinic acid)을 1.5 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 1.5 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 또한, 수크로오스(Sucrose)를 50 g/L 이상으로 첨가할 경우, 배지내 당 농도가 과도하게 높아지고 역삼투 현상이 일어나 식물체 조직 내부의 수분이 배지로 빠져나갈 가능성이 높아지며, 따라서 신초가 정상적으로 신장하지 못하고 생육 중간에 식물체의 줄기와 잎이 마르는 등 식물체가 고사하는 문제점이 있다. 수크로오스(Sucrose)를 10 g/L 이하로 첨가할 경우, 식물체의 탄소 및 에너지원인 당의 농도가 급격히 낮아져 신초의 성장이 느려지고 배양단계 후반부에 생육의 억제되는 문제점이 있다. 그리고 액체상태의 배지를 고형화(젤라틴화)시켜 고체상태로 만드는 역활을 하는 아가(Agar)를 7 g/L 이상으로 첨가할 경우, 배지의 강도(딱딱한 정도)가 과도하게 높아져 식물체에서 뿌리가 잘 뻗어 내리지 못하는 문제점이 있으며, 5 g/L 이하로 첨가할 경우, 식물체가 배지에 제대로 지지 되지 못하는 문제점이 있다.
상기 다신초 유도시 지아틴(Zeatin) 또는 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)를 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 변이율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 다신초 형성율이 낮아지고 식물체 생육이 억제되는 문제점이 있다.
상기 뿌리 유도시 인돌-3-부티르산(Indole-3-butyric acid, IBA)을 4.0 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 뿌리형성이 오히려 억제되고 식물체의 줄기와 잎이 갈변하는 등 고사율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 뿌리 형성이 잘 이루어지지 않는 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, “기본 배지”는 식물의 배양에 필요한 가장 기본적인 물질들만 포함되어 있는 배양액을 의미하며, 본 발명에서는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)과 MS(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)의 혼합 배지를 기본 배지로 사용하였으며, 기본 배지에 지아틴(Zeatin) 또는 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 추가로 첨가하여 블루베리의 생장점 배양을 위한 배지로 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 기본 배지의 pH는 3 ~ 7로 사용하는 것을 특징으로 한다. 배지의 pH를 7 이상으로 사용하였을 경우에는 산성상태에서 잘 자라는 블루베리의 특성과 맞지 않아 식물체의 생장이 늦어질 수 있으며, pH를 3 이하로 사용하였을 경우에는 식물체의 칼슘(Ca) 이온 흡수를 저해하여 칼슘이 결핍되게 되며 이로써 생장점이 괴사될 수 있다. 따라서 배지의 pH를 3 ~ 7로 조정하여 사용하는 것이 바람직하며, pH 4.5 ~ 5.5로 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
'블루골드 ' 품종의 엽편 배양 방법
<1-1> ‘ 블루골드 ' 품종의 엽편 절취
기내 배양중인 블루베리 블루골드 품종의 유식물체 잎(엽편)을 절취하여 엽병(petiole)을 제거한 후 잎의 윗면(adaxial side)이 초기 캘러스 형성 배지와 닿을 수 있도록 수평 치상하였다.
<1-2> ‘ 블루골드 ' 품종의 캘러스 및 다신초 생성 유도 배양
초기 캘러스(clallus) 및 다신초(mutli-shoot) 유도 배지는 1/2 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell社) 배지에 생장조정제 지아틴(Zeatin) 및 지아틴 리보사이드(Zeatin ridoside) 외 4가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지 조성 성분은 하기 [표 1]과 같았다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양병(외경 81 mm, 높이 132 mm)에 80 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 배양병에 잎(엽편)을 15개씩 치상하였으며, 25±1℃로 유지되는 배양실에서 암조건으로 2주 정도 배양한 후, 명조건(2,000~3,000 lux, 16시간 일장)으로 14 ~ 16주 정도 배양하였다. 배양 18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성은 하기 [표 2]와 같았다.
<1-3> ‘ 블루골드 ' 품종의 식물체 형성을 위한 증식 배양
엽편 치상 후 16~18주 정도 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배양을 거친 후 하기 [표 3]의 배지가 든 배양병에 계대하여 4 ~ 6주 정도 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화를 유도하였다. 재분화된 배양 24주차 유식물체의 특성은 하기 [표 4]와 같았다.
이때 하기 [표 3]의 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화 배지는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 외 7가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다.
<1-4> ‘ 블루골드 ' 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
블루골드 품종의 유식물체 뿌리를 형성시키기 위하여 하기 [표 3]의 배지 조성에서 지아틴(Zeatin)의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L로 줄이거나 아예 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 ㎎/L 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하였으며, 1개월 정도 배양하였다. 이때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있었다.
이때 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실)로 순화하는 것이 가능하였다.
<1-5> ‘ 블루골드 ' 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 이상 충분히 성장한 블루골드 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 피트모스와 펄라이트를 1:1(v:v)로 혼합한 상토를 준비한 후 블루베리 유식물체를 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 심고, 햇빛의 30 ~ 40%가 차광되며 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 온실에서 투명 비닐을 덮어주어 습도가 잘 유지되는 상태에서 경화처리를 하였다. 유식물체의 상태를 확인하면서 비닐을 서서히 걷어내고 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
블루골드 품종의 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배지조성
성 분 명
 함 량
MgSO4 90.30 mg/L
KNO3 950.00 mg/L
KH2PO4 85.00 mg/L
CaCl2 166.01 mg/L
CoCl26H2O 0.0125 mg/L
ZnSO47H2O 4.30 mg/L
Na2MoO42H2O 0.125 mg/L
MnSO4H2O 8.45 mg/L
H3BO3 3.10 mg/L
KI 0.415 mg/L
FeNaEDTA 55.05 mg/L
CuSO45H2O 0.125 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Sucrose 20.00 g/L
Zeatin 1.00 mg/L
Zeatin Riboside 1.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성
캘러스형성율(%) 신초분화율(%) 신초수개/plantlet) 신초장(㎜)
48.7±3.4 24.7±1.2 24.7±4.0 21.4±2.1
블루골드 품종의 식물체 형성 배지조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 300.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L
KNO3 475.00 mg/L
K2SO4 742.00 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 289.50 mg/L
CaCl2 137.38 mg/L
CoCl26H2O 0.00625 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 20.95 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.2075 mg/L
FeNaEDTA 45.875 mg/L
Na2EDTA 27.97 mg/L
FeSO47H2O 20.88 mg/L
CuSO45H2O 0.19 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L
Sucrose 30.00 g/L
Zeatin 2.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
블루베리 블루골드 품종의 24주차 유식물체 특성
식물체형성율(%) 신초수(개/plantlet) 신초장(㎜)
68.8±3.6 38.6±3.3 28.4±3.2
< 실시예 2>
‘엘리자베스' 품종의 엽편 배양 방법
<2-1> ‘엘리자베스' 품종의 엽편 절취
기내 배양중인 블루베리 엘리자베스 품종의 유식물체 잎(엽편)을 절취하여 엽병(petiole)을 제거한 후 잎의 윗면(adaxial side)이 초기 캘러스 형성 배지와 닿을 수 있도록 수평 치상하였다.
<2-2> ‘엘리자베스' 품종의 캘러스 및 다신초 생성 유도 배양
초기 캘러스(clallus) 및 다신초(mutli-shoot) 유도 배지는 1/2 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell社) 배지에 생장조정제 지아틴(Zeatin) 및 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 또는 지아틴(Zeatin) 및 티디아주론(TDZ, Thidiazuron) 외 4가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 하기 [표 5]와 같았다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양병(외경 81 mm, 높이 132 mm)에 80 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 배양병에 잎(엽편)을 15개씩 치상하였으며, 25±1℃로 유지되는 배양실에서 암조건으로 2주 정도 배양한 후, 명조건(2,000~3,000 lux, 16시간 일장)으로 14 ~ 16주 정도 배양하였다. 배양 18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성은 하기 [표 6]과 같았다.
<2-3> ‘엘리자베스' 품종의 식물체 형성을 위한 증식 배양
엽편 치상 후 16~18주 정도 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배양을 거친 후 하기 [표 7]의 배지가 든 배양병에 계대하여 4 ~ 6주 정도 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화를 유도하였다. 재분화된 배양 24주차 유식물체의 특성은 하기 [표 8]과 같았다.
이때 하기 [표 7]의 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화 배지는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드 외 7가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다.
<2-4> ‘엘리자베스' 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
엘리자베스 품종의 유식물체 뿌리를 형성시키기 위하여 하기 [표 7]의 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L로 줄이거나 아예 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 ㎎/L 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하였으며, 1개월 정도 배양하였다. 이때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있었다.
이때 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실)로 순화하는 것이 가능하였다.
<2-5> ‘엘리자베스' 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 엘리자베스 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 되었다. 피트모스와 펄라이트를 1:1(v:v)로 혼합한 상토를 준비한 후 블루베리 유식물체를 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 심고, 햇빛의 30 ~ 40%가 차광되며 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 온실에서 투명 비닐을 덮어주어 습도가 잘 유지되는 상태에서 경화처리를 하였다. 유식물체의 상태를 확인하면서 비닐을 서서히 걷어내고 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
엘리자베스 품종의 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배지 조성
성 분 명
 함 량
MgSO4 90.30 mg/L
KNO3 950.00 mg/L
KH2PO4 85.00 mg/L
CaCl2 166.01 mg/L
CoCl26H2O 0.0125 mg/L
ZnSO47H2O 4.30 mg/L
Na2MoO42H2O 0.125 mg/L
MnSO4H2O 8.45 mg/L
H3BO3 3.10 mg/L
KI 0.415 mg/L
FeNaEDTA 55.05 mg/L
CuSO45H2O 0.125 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Sucrose 20.00 g/L
Zeatin 1.00 mg/L
Zeatin Riboside 1.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성
캘러스형성율(%) 신초분화율(%) 신초수개/plantlet) 신초장(㎜)
52.6±2.2 25.9±3.1 4.0±0.7 8.1±0.5
엘리자베스 품종의 식물체 형성 배지 조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 200.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L
KNO3 950.00 mg/L
K2SO4 495.00 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 193.00 mg/L
CaCl2 202.26 mg/L
CoCl26H2O 0.0125 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 19.60 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.415 mg/L
FeNaEDTA 55.05 mg/L
Na2EDTA 18.65 mg/L
FeSO47H2O 13.92 mg/L
CuSO45H2O 0.13 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L
Sucrose 30.00 g/L
Zeatin Riboside 2.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
24주차 엘리자베스 품종의 유식물체 특성
식물체형성율(%) 신초수(개/plantlet) 신초장(㎜)
57.5±3.4 8.6±1.2 24.5±2.0
< 실시예 3>
‘ 오따드 ' 품종의 엽편 배양 방법
<3-1> ‘ 오따드 ' 품종의 엽편 절취
기내 배양중인 블루베리 오따드 품종의 유식물체 잎(엽편)을 절취하여 엽병(petiole)을 제거한 후 잎의 윗면(adaxial side)이 초기 캘러스 형성 배지와 닿을 수 있도록 수평 치상하였다.
<3-2> ‘ 오따드 ' 품종의 캘러스 및 다신초 생성 유도 배양
초기 캘러스(clallus) 및 다신초(mutli-shoot) 유도 배지는 Anderson( Anderso Salt Medium, MBcell社) 배지와 일반 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa社) 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 및 티디아주론(TDZ, Thidiazuron) 외 4가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 하기 [표 9]와 같았다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양병(외경 81 mm, 높이 132 mm)에 80 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 배양병에 잎(엽편)을 15개씩 치상하였으며, 25±1℃로 유지되는 배양실에서 암조건으로 2주 정도 배양한 후, 명조건(2,000~3,000 lux, 16시간 일장)으로 14 ~ 16주 정도 배양하였다. 배양 18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성은 하기 [표 10]과 같았다.
<3-3> ‘ 오따드 ' 품종의 식물체 형성을 위한 증식 배양
엽편 치상 후 16~18주 정도 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배양을 거친 후 하기 [표 11]의 배지가 든 배양병에 계대하여 4 ~ 6주 정도 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화를 유도하였다. 재분화된 배양 24주차 유식물체의 특성은 하기 [표 12]와 같았다.
이때 하기 [표 11]의 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화 배지는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 7가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다.
<3-4> ‘ 오따드 ' 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
오따드 품종의 유식물체 뿌리를 형성시키기 위하여 하기 [표 7]의 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L로 줄이거나 아예 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 ㎎/L 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하였으며, 1개월 정도 배양하였다. 이때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부 공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
이때 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실)로 순화하는 것이 가능하였다.
<3-5> ‘ 오따드 ' 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 오따드 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 되었다. 피트모스와 펄라이트를 1:1(v:v)로 혼합한 상토를 준비한 후 블루베리 유식물체를 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 심고, 햇빛의 30 ~ 40%가 차광되며 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 온실에서 투명 비닐을 덮어주어 습도가 잘 유지되는 상태에서 경화처리를 하였다. 유식물체의 상태를 확인하면서 비닐을 서서히 걷어내고 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
오따드 품종의 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배지 조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 200.00 mg/L
MgSO4 180.62 mg/L
KNO3 1190.00 mg/L
KH2PO4 85.00 mg/L
CaCl2 332.11 mg/L
CoCl26H2O 0.025 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 16.90 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.565 mg/L
FeNaEDTA 55.05 mg/L
Na2EDTA 37.25 mg/L
FeSO47H2O 27.85 mg/L
CuSO45H2O 0.025 mg/L
myo-Inositol 100.00 mg/L
Sucrose 20.00 g/L
Zeatin Riboside 1.00 mg/L
TDZ 1.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성
캘러스형성율(%) 신초분화율(%) 신초수개/plantlet) 신초장(㎜)
25.3±1.1 49.2±4.1 3.5±0.6 10.1±2.2
오따드 품종의 식물체 형성 배지 조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 100.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L
KNO3 1425.00 mg/L
K2SO4 247.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 96.50 mg/L
CaCl2 267.14 mg/L
CoCl26H2O 0.01875 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 18.25 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.6225 mg/L
FeNaEDTA 64.22 mg/L
Na2EDTA 9.32 mg/L
FeSO47H2O 6.96 mg/L
CuSO45H2O 0.08 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L
Sucrose 30.00 g/L
Zeatin Riboside 2.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
24주차 오따드 품종의 유식물체 특성
식물체형성율(%) 신초수(개/plantlet) 신초장(㎜)
57.5±3.4 8.6±31.2 24.5±2.0
< 실시예 4>‘ 티프블루 ' 품종의 엽편 배양 방법
<4-1> ‘ 티프블루 ' 품종의 엽편 절취
기내 배양중인 블루베리 티프블루 품종의 유식물체 잎(엽편)을 절취하여 엽병(petiole)을 제거한 후 잎의 윗면(adaxial side)이 초기 캘러스 형성 배지와 닿을 수 있도록 수평 치상하였다.
<4-2> ‘ 티프블루 ' 품종의 캘러스 및 다신초 생성 유도 배양
초기 캘러스(clallus) 및 다신초(mutli-shoot) 유도 배지는 Anderson( Anderso Salt Medium, MBcell社) 배지와 일반 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa社) 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 4가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 하기 [표 13]과 같았다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양병(외경 81 mm, 높이 132 mm)에 80 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 배양병에 잎(엽편)을 15개씩 치상하였으며, 25±1℃로 유지되는 배양실에서 암조건으로 2주 정도 배양한 후, 명조건(2,000~3,000 lux, 16시간 일장)으로 14 ~ 16주 정도 배양하였다. 배양 18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성은 하기 [표 14]와 같았다.
<4-3> ‘ 티프블루 ' 품종의 식물체 형성을 위한 증식 배양
엽편 치상 후 16 ~ 18주 정도 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배양을 거친 후 하기 [표 15]의 배지가 든 배양병에 계대하여 4~6주 정도 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화를 유도하였다. 재분화된 배양 24주차 유식물체의 특성은 하기 [표 16]와 같았다.
이때 하기 [표 15]의 유식물체(plantlet) 형성 및 식물체 재분화 배지는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드 외 7가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다.
<4-4> ‘ 티프블루 ' 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
티프블루 품종의 유식물체 뿌리를 형성시키기 위하여 하기 [표 15]의 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L로 줄이거나 아예 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하였으며, 1개월 정도 배양하였다. 이때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있었다.
이때 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실)로 순화하는 것이 가능하였다.
<4-5> ‘ 티프블루 ' 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 티프블루 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 되었다. 피트모스와 펄라이트를 1:1 (v:v)로 혼합한 상토를 준비한 후 블루베리 유식물체를 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 심고, 햇빛의 30 ~ 40%가 차광되며 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 온실에서 투명 비닐을 덮어주어 습도가 잘 유지되는 상태에서 경화처리를 하였다. 유식물체의 상태를 확인하면서 비닐을 서서히 걷어내고 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
티프블루 품종의 초기 캘러스 형성 및 다신초 유도 배지 조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 200.00 mg/L
MgSO4 180.62 mg/L
KNO3 1190.00 mg/L
KH2PO4 85.00 mg/L
CaCl2 332.11 mg/L
CoCl26H2O 0.025 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 16.90 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.565 mg/L
FeNaEDTA 55.05 mg/L
Na2EDTA 37.25 mg/L
FeSO47H2O 27.85 mg/L
CuSO45H2O 0.025 mg/L
myo-Inositol 100.00 mg/L
Sucrose 20.00 g/L
Zeatin Riboside 2.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
18주차 초기 캘러스 형성 및 신초분화 특성
캘러스형성율(%) 신초분화율(%) 신초수개/plantlet) 신초장(㎜)
41.7±4.2 19.1±1.7 2.8±0.3 11.8±1.7
티프블루 품종의 식물체 형성 배지 조성
성 분 명
 함 량
NH4NO3 300.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L
KNO3 475.00 mg/L
K2SO4 742.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 289.50 mg/L
CaCl2 137.38 mg/L
CoCl26H2O 0.00625 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L
MnSO4H2O 20.95 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L
KI 0.2075 mg/L
FeNaEDTA 48.875 mg/L
Na2EDTA 27.97 mg/L
FeSO47H2O 20.88 mg/L
CuSO45H2O 0.19 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L
Sucrose 30.00 g/L
Zeatin Riboside 2.00 mg/L
Agar 5.50 g/L
배지의 pH 5.0
블루베리 티프블루 품종의 24주차 유식물체 특성
식물체형성율(%) 신초수(개/plantlet) 신초장(㎜)
55.9±4.4 11.1±0.3 30.1±1.4

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 블루골드(Bluegold) 품종의 기내 유식물체의 형성 방법:
    (a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
    (b) 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스(Eligabeth) 품종의 기내 유식물체의 형성 방법:
    (a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
    (b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
  3. 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 오따드(Woodard) 품종의 기내 유식물체의 형성 방법:
    (a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴(Zeatin) 1 ~ 3 ㎎/L, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L 또는 티디아주론 TDZ(Thidiazuron) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 6종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
    (b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
  4. 다음 단계를 포함하는 엽편 배양을 이용한 블루베리 티프믈루(Tifblue) 품종의 기내 유식물체의 형성 방법:
    (a) 기내 배양중인 유식물체의 엽병(petiole)이 제거된 엽편을 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 5종을 첨가한 배지에 잎 윗면이 닿게 치상하여 2주간 암배양 후 명배양 시켜 초기 캘러스 형성 및 다신초를 유도하는 단계; 및
    (b) 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 1 ~ 3 ㎎/L, 페릭소디움솔트(FeNa-EDTA) 35 ~ 37 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 98 ~ 102 ㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 1 ~ 3 ㎎/L, 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ~ 1.5 ㎎/L, 수크로오스(Sucrose) 20 ~ 40 g/L 및 아가(Agar) 5 ~ 7 g/L 8종을 첨가한 배지에 유식물체의 형성 및 식물체 재분화하는 단계.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (c) 단계를 추가로 포함하는 기내 유식물체 형성 방법:
    (c) 상기 다신초를, 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 또는 인돌-3-부티르산(Indole-3-butyric acid, IBA) 1 ~ 2 ㎎/L을 포함하는 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium) 배지, 또는 WPM 배지와 일반 MS(Murashige & Skoog Medium) 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지로 하는 것을 특징으로 하는 기내 유식물체의 형성 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 배지는 WPM 배지, 또는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지로 하는 것을 특징으로 하는 기내 유식물체의 형성 방법.
  8. 제 3항에 있어서, 상기 배지는 Anderson(Anderson Salt Medium) 배지와 일반 MS 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지, 또는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 1:3 비율로 혼합한 배지로 하는 것을 특징으로 하는 기내 유식물체의 형성 방법.
  9. 제 4항에 있어서, 상기 배지는 Anderson 배지와 일반 MS 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지, 또는 WPM 배지와 일반 MS 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지로 하는 것을 특징으로 하는 기내 유식물체의 형성 방법.

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