CN115517167A - 一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法 - Google Patents

一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，采用氨磺乐灵作为蓝莓染色体加倍的处理试剂，该试剂具有毒性低，廉价等优点，操作过程对人员安全，对环境友好，同时具有较高的诱导加倍效率，诱导率达到25％以上。本发明将蓝莓的组织培养技术应用于染色体加倍诱导，在提高诱导效率的同时，纯和体植株的获得效率达到80％以上，解决了蓝莓多倍体诱导过程中的嵌合体干扰问题，多倍体植株可以直接采用组织培养的方法，进行简便、高效、安全的规模化快速繁殖。

Description

一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法
技术领域
本发明属于果树生物技术领域，具体涉及一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法。
背景技术
蓝莓为杜鹃花科越橘属小浆果类多年生灌木，大多数为落叶树种，少数为常绿树种。蓝莓果实具有诱人的蓝色、口感佳、味道丰富，并且富含黄酮类化合物，尤其是富含花青素、黄烷醇、绿原酸等一系列天然活性物质。这些天然活性物质对人体具有非常重要的健康保健功能，可以增强机体抗癌能力、降低心脑血管疾病的发生风险、提高记忆力、预防和缓解氧化应激与炎症、延缓衰老、增强免疫力等。蓝莓被世界粮农组织列为五大健康食品之一，又有“浆果之王”的美誉，具有广阔的市场前景。
蓝莓原产于北美，由20世纪80年代传入中国，目前全世界的蓝莓种植面积已跃居小浆果类第一位。我国蓝莓的种植面积也在逐年增加，但产量和品质与美国等原产国还有较大差距，而且没有自育品种，总体育种水平尚处于引种阶段，种质资源严重依赖于进口。植物倍性育种在果树上得到了大量应用，多倍体植株具有巨大型、抗逆性强、生长旺盛、适应性广等优点，并且多倍体诱导可以快速获得新的蓝莓种植资源。
国内外已对蓝莓多倍体诱导进行了一些探索研究，石佳(2012)和李宏平等(2013)采用秋水仙素对南高丛越橘的组培苗茎尖进行浸泡处理，获得四倍体植株。陈冰心(2014)以兔眼蓝莓的杰兔品种为实验材料，釆用秋水仙素处理离体茎尖诱导多倍体。张永福(2015)以高丛康维尔蓝莓组培苗为材料，采用秋水仙素处理，通过浸渍法和培养法进行染色体加倍。李雪松(2015)利用秋水仙素浸渍法对蓝莓“legacy”组培苗茎尖进行离体诱变。何梦玲等(2019)取兔眼蓝莓“灿烂”离体叶片再生芽苗的茎尖进行秋水仙素共培养，诱导多倍体。
中国专利201910575199.3公开了“一种蓝莓多倍体的培养方法”，采用秋水仙素浸渍法对蓝莓“顶级”的离体茎尖进行加倍诱导。
参考目前的研究报道，针对蓝莓加倍诱导的化学试剂均为秋水仙素，但是秋水仙素具有较大的挥发性和毒性，对操作人员存在安全隐患。而且，目前报道的方法均采用蓝莓茎尖作为受体材料，尽管可以诱导染色体加倍，但绝大多数形成了嵌合体，后期需要通过组织培养的方法进行纯化和增殖，额外增加了时间成本和操作难度。
因此，需要寻找一种低毒的染色体加倍诱导试剂，能够快速、高效获得蓝莓多倍体诱导植物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，克服现有技术中在蓝莓多倍体育种过程中处理试剂毒性大，形成的植株容易形成嵌合体等缺陷。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，包括以下步骤：
1)外植体预培养
取生长旺盛的蓝莓试管苗，剪取幼嫩叶片，剪除叶尖，余下的部分作为外植体，将外植体背面与培养基接触接种于不定芽再生培养基上，于22～25℃、黑暗条件下培养15～20天；
2)氨磺乐灵处理
将伤口处有愈伤组织发生的外植体取出，转接于添加了半致死剂量氨磺乐灵的诱导培养基上，于22～25℃、黑暗条件下培养2～3天；
3)不定芽再生
将氨磺乐灵处理后的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，继续于22～25℃、黑暗条件下培养7～10天，然后置于25～28℃、光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养20～30天诱导不定芽发生，每个不定芽为一个株系；
4)不定芽增殖
将单个不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基中，于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养30～60天诱导获得丛生芽；
5)生根及鉴定
获得的丛生芽，其中一半丛生芽进行增殖培养；另一半丛生芽用于染色体倍性鉴定，对于鉴定结果为染色体加倍的不定芽，将其转接于生根培养基上，于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养30～45天，获得完整植株。
优选的，步骤1)和步骤3)中，所述不定芽再生培养基以改良WPM培养基为基本培养基，并添加4.0～5.0mg/L玉米素+0.05～0.1mg/L萘乙酸+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
进一步，步骤2)中，氨磺乐灵半致死剂量的具体确定步骤如下：
1)将预培养后叶片伤口处有愈伤发生的外植体取出，转接于添加不同浓度氨磺乐灵的改良WPM培养基上，其中氨磺乐灵的浓度梯度设置范围为0～1.0mg/L，于22～25℃，黑暗条件下培养2～3天；
2)将经过氨磺乐灵处理的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，于22～25℃、黑暗条件下培养7～10天；
3)最后将外植体置于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养20～25天，统计不定芽的发生数量，以不进行氨磺乐灵的培养基上外植体获得的不定芽数量为对照，不定芽发生数量为对照组数量的45～55％时所添加的氨磺乐灵量即为半致死剂量。
优选的，步骤2)中，所述诱导培养基以改良WPM培养基为基本培养基，并添加20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
优选的，步骤4)中，所述增殖培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加1.0～1.5mg/L玉米素+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
优选的，步骤5)中，所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加0.2～0.5mg/L吲哚丁酸+0.2～0.5mg/L萘乙酸+0.2～0.4g/L活性炭+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
本发明所述改良WPM培养基的配方(Commercially feasible micropropagationof mountain laurel,Kalmia latifolia,by use of shoot-tip culture.Int PlantProp Soc Comb Proc 30:421-427)如表1所示，mg/L表示每升改良WPM培养基中含各成分的毫克数。
表1
Figure BDA0003869003260000041
本发明采用改良WPM培养基作为基本培养基，将原WPM培养基中的氯化钙去除，同时提高硝酸钙的含量，并添加一定量的糖酸钙，因此增加了培养基中的钙元素含量，可以促进蓝莓叶片的不定芽再生，提高染色体加倍的诱导效率。
本发明采用蓝莓试管苗叶片作为外植体，在预培养之后，叶片伤口处有愈伤组织发生，外植体正好处于细胞分裂的最佳状态，是加倍处理的优良受体材料。
本发明采氨磺乐灵对预培养后的外植体进行处理，使蓝莓染色体加倍，该试剂具有毒性低，廉价等优点，操作过程对人员安全，对环境友好，同时具有较高的诱导加倍效率，诱导率达到25％以上。在诱导培养基中添加半致死剂量的氨磺乐灵进行加倍诱导，采用添加到培养基中的方法进行诱导，尽量较少对外植体的伤害，从而在保证不定芽再生成活率的同时，提高了染色体加倍的诱导频率。
蓝莓经过氨磺乐灵处理诱导加倍后，重新将外植体转接于不定芽再生培养基上，在黑暗环境下恢复培养7天左右，然后再转移到光照条件下，可以提高不定芽的再生效率。随后使用增殖培养基诱导单个的不定芽形成丛生芽，从而对加倍诱导获得的目标植株实现快速大量增殖。
最后使用的生根培养基能够高效地促进不定芽生根，形成完整且健壮的蓝莓染色体加倍植株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用氨磺乐灵作为蓝莓染色体加倍的处理试剂，该试剂具有毒性低，廉价等优点，操作过程对人员安全，对环境友好，同时具有较高的诱导加倍效率，诱导率达到25％以上。
本发明将蓝莓的组织培养技术应用于染色体加倍诱导，在提高诱导效率的同时，纯和体植株的获得效率达到80％以上，解决了蓝莓多倍体诱导过程中的嵌合体干扰问题，多倍体植株可以直接采用组织培养的方法，进行规模化快速繁殖。
附图说明
图1为本发明实施例中蓝莓品种‘戴安娜’诱导胚性愈伤组织图。
图2为本发明实施例中蓝莓品种‘戴安娜’染色体加倍前后植株生长图。
图3为流式细胞仪检测染色体倍性的峰图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种诱导‘戴安娜’蓝莓染色体加倍的培养方法，详细步骤如下：
1)外植体培养：取生长旺盛的南高丛蓝莓‘戴安娜’试管苗，剪取幼嫩叶片，剪除叶尖，余下的部分作为外植体，将外植体背面与培养基接触接种于不定芽再生培养基上，于25℃、黑暗条件下培养15天，结果参见图1，由图1可以看出外植体伤口处有愈伤和不定芽发生；
2)氨磺乐灵处理：将伤口处有少量愈伤组织发生的外植体取出，转接于添加了半致死剂量的氨磺乐灵的诱导培养基上，于25℃、黑暗条件下培养2天。
3)不定芽再生
将氨磺乐灵处理后的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，继续于25℃、黑暗条件下培养10天，然后置于25℃、光照时间14小时/天，光照强度2000勒克斯的条件下，培养20～30天诱导不定芽发生，并对每个再生的不定芽进行编号，每个不定芽为一个株系；
4)不定芽增殖
将单个不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基中，于25℃，光照时间15小时/天，光照强度2500勒克斯的条件下，培养30天诱导获得丛生芽；
5)生根及鉴定
获得的丛生芽，一半丛生芽进行增殖培养；另一半丛生芽用于染色体倍性鉴定，对于鉴定结果为染色体加倍的不定芽，将其转接于生根培养基上，于25℃，光照时间16小时/天，光照强度2000勒克斯的条件下，培养30天，获得完整植株。
其中，所述不定芽再生培养基以改良WPM培养基(见表2)为基本培养基，添加玉米素4.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉3.5g/L、结冷胶1.4g/L，pH为5.0；
所述增殖培养基以WPM培养基(见表2)为基本培养基，添加并添加玉米素1.0mg/L，蔗糖20g/L、琼脂粉3.5g/L、结冷胶1.4g/L，pH为5.1；
所述生根培养基以WPM培养基(见表2)为基本培养基，添加吲哚丁酸0.5mg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭0.2g/L，琼脂粉3.5g/L、结冷胶1.4g/L，pH为5.0；
成功获得染色体加倍的蓝莓植株见图2，从图2可以看出植株表现为茎干增粗、叶片增厚、节间缩短、生长缓慢。采用流式细胞仪对植株的倍性进行鉴定，部分鉴定结果见图3，在所有被检测植株中，加倍植株的概率为25％。从图3来看，染色体加倍植株检测为单峰，表明加倍植株为纯系，且没有检测到嵌合体的发生，纯合体植株的概率为100％。
实施例2
一种诱导‘薄雾’蓝莓染色体加倍的培养方法，详细步骤如下：
1)外植体培养：取生长旺盛的南高丛蓝莓‘薄雾’试管苗，剪取幼嫩叶片，剪除叶尖，余下的部分作为外植体，将外植体背面与培养基接触接种于不定芽再生培养基上，于25℃、黑暗条件下培养20天；
2)氨磺乐灵处理：将伤口处有少量愈伤组织发生的外植体取出，转接于添加了半致死剂量的氨磺乐灵的诱导培养基上，于25℃、黑暗条件下培养2天。
3)不定芽再生
将氨磺乐灵处理后的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，继续于25℃、黑暗条件下培养7天，然后置于25℃、光照时间15小时/天，光照强度3000勒克斯的条件下，培养20天诱导不定芽发生；
4)不定芽增殖
将单个不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基中，于25℃，光照时间16小时/天，光照强度2600勒克斯的条件下，培养30天诱导获得丛生芽；
5)生根及鉴定
获得的丛生芽，一半丛生芽进行增殖培养；另一半丛生芽用于染色体倍性鉴定，对于鉴定结果为染色体加倍的不定芽，将其转接于生根培养基上，于25℃，光照时间14小时/天，光照强度2000勒克斯的条件下，培养30天，获得完整植株。
其中，所述不定芽再生培养基以改良WPM培养基(见表2)为基本培养基，添加玉米素4.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉3.25g/L、结冷胶1.4g/L，pH调至5.0；
所述诱导培养基以改良WPM培养基(见表2)为基本培养基，并添加0.6mg/L的氨磺乐灵；
所述增殖培养基以改良WPM培养基(见表2)为基本培养基，并添加玉米素1.5mg/L、蔗糖25g/L、琼脂粉3.25g/L、结冷胶1.5g/L，pH调至5.1；
所述生根培养基以改良WPM培养基(见表2)为基本培养基，添加吲哚丁酸0.2mg/L、萘乙酸0.5mg/L、活性炭0.4g/L、蔗糖25g/L、琼脂粉3.25g/L、结冷胶1.5g/L，pH调至5.2；
成功获得染色体加倍的‘薄雾’生根植株，植株同样表现为茎干增粗、生长缓慢。诱导染色体加倍的效率为47％，其中纯合体的概率为86％。
本实施例所述改良WPM培养基的配方如表2所示，mg/L表示每升改良MS培养基中含各成分的毫克数。
表2
Figure BDA0003869003260000081
氨磺乐灵半致死剂量的具体确定步骤如下：
1)将预培养后叶片伤口处有少量愈伤发生的外植体取出，转接于添加不同浓度氨磺乐灵的改良WPM培养基上，其中氨磺乐灵的浓度梯度设置范围为0～1.0mg/L，其中氨磺乐灵的浓度设置了11个梯度具体参见表3，将培养基分装于直径为9cm的培养皿中，每个培养皿接种30个外植体，于25℃，黑暗条件下培养2～3天；
2)将经过氨磺乐灵处理的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，于25℃、黑暗条件下培养7～10天；
3)最后将外植体置于25℃，光照时间14小时/天，光照强度2500勒克斯的条件下，培养20天，统计不定芽的发生数量，不定芽发生数量为不进行氨磺乐灵处理时不定芽数量的45～55％时所对应的氨磺乐灵添加量即为半致死剂量。
表3
氨磺乐灵浓度(mg/L) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
不定芽数量/皿 81 67 56 53 49 37 30 29 27 25 19
从表3结果可以看出，氨磺乐灵的半致死计量为0.5mg/L，并采用此浓度进行染色体加倍处理。
对比例1
采用南高丛蓝莓‘戴安娜’为研究对象，在氨磺乐灵加倍处理时，氨磺乐灵的浓度为1.5mg/L，其余步骤和条件与实施例1相同，结果在步骤3不定芽再生过程中，培养20天后外植体全部褐化，没有不定芽发生。
对比例2
采用南高丛蓝莓‘戴安娜’为研究对象，在氨磺乐灵加倍处理时，氨磺乐灵的使用浓度为0.5mg/L，共培养4天，其余步骤和条件与实施例1相同，结果在不定芽再生过程中，培养20天后的外植体部分褐化，而且没有任何不定芽发生。
对比例1和对比例2表明氨磺乐灵处理的浓度太高或处理时间太长时，将对再生芽产生伤害，导致试验失败。针对不同蓝莓品种，应首先对氨磺乐灵处理的浓度和时间进行筛选。

Claims (7)

1.一种诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，包括以下步骤：
1)外植体预培养
取生长旺盛的蓝莓试管苗，剪取幼嫩叶片，剪除叶尖，余下的部分作为外植体，将外植体背面与培养基接触接种于不定芽再生培养基上，于22～25℃、黑暗条件下培养15～20天；
2)氨磺乐灵处理
将伤口处有愈伤组织发生的外植体取出，转接于添加了半致死剂量氨磺乐灵的诱导培养基上，于22～25℃、黑暗条件下培养2～3天；
3)不定芽再生
将氨磺乐灵处理后的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，继续于22～25℃、黑暗条件下培养7～10天，然后置于25～28℃、光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养20～30天诱导不定芽发生，每个不定芽为一个株系；
4)不定芽增殖
将单个不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基中，于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养30～60天诱导获得丛生芽；
5)生根及鉴定
获得的丛生芽，其中一半丛生芽进行增殖培养；另一半丛生芽用于染色体倍性鉴定，对于鉴定结果为染色体加倍的不定芽，将其转接于生根培养基上，于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养30～45天，获得完整植株。
2.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)中，所述不定芽再生培养基以改良WPM培养基为基本培养基，并添加4.0～5.0mg/L玉米素+0.05～0.1mg/L萘乙酸+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
3.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，步骤2)中，氨磺乐灵半致死剂量的具体确定步骤如下：
1)将预培养后叶片伤口处有愈伤发生的外植体取出，转接于添加不同浓度氨磺乐灵的改良WPM培养基上，其中氨磺乐灵的浓度梯度设置范围为0～1.0mg/L，于22～25℃，黑暗条件下培养2～3天；
2)将经过氨磺乐灵处理的外植体重新转接于不定芽再生培养基中，于22～25℃、黑暗条件下培养7～10天；
3)最后将外植体置于25～28℃，光照时间14～16小时/天，光照强度2000-3000勒克斯的条件下，培养20～25天，统计不定芽的发生数量，以不进行氨磺乐灵的培养基上外植体获得的不定芽数量为对照，不定芽发生数量为对照组数量的45～55％时所添加的氨磺乐灵量即为半致死剂量。
4.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述诱导培养基以改良WPM培养基为基本培养基，并添加20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
5.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述增殖培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加1.0～1.5mg/L玉米素+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
6.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加0.2～0.5mg/L吲哚丁酸+0.2～0.5mg/L萘乙酸+0.2～0.4g/L活性炭+20～25g/L蔗糖+3.25～3.5g/L琼脂粉+1.4～1.5g/L结冷胶，培养基pH为5.0～5.2。
7.根据权利要求1所述诱导蓝莓染色体加倍的培养方法，其特征在于，所述改良WPM培养基配方具体如下所述，mg/L表示每升改良WPM培养基中含各成分的毫克数：
Figure FDA0003869003250000021
Figure FDA0003869003250000031
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