CN100374012C - 花毛茛的组织培养与快速繁殖方法 - Google Patents
花毛茛的组织培养与快速繁殖方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种花毛茛的组织培养与快速繁殖方法，它采用种球催芽、外植体灭菌、不定芽诱导培养、不定芽继代培养、生根培养和过渡移栽等工艺步骤，并在所对应的各培养基上进行培养，直至长成生根苗后直接移栽即可。该方法解决了花毛茛无菌体系建立的关键技术，同时通过激素、营养、培养环境的综合调节，达到了进种效率高，增殖速度快，生产技术稳定目的。实现了花毛茛优良品种的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养及繁殖方法，具体涉及花毛茛的组织培养和快速繁殖方法。
背景技术
花毛茛是毛茛科，毛茛属的多年生宿根草本植物，具多个纺锤形的块根，茎单生或少生分枝，有毛，很少有明显的腋芽，叶腋间生长的基本为花芽。由于其花色鲜艳、色彩丰富、花型丰满、瓶插寿命长，近年来在国内花卉市场上获得了很好的效果，但目前种源仍只有依靠进口且进口价格昂贵。花毛茛常规的繁殖方法是采用种子和分株繁殖，但由于花毛茛是异花授粉植物，常规种子繁殖的杂种后代的分离严重，性状不稳定，所以种子繁殖主要用于花毛茛的育种工作中。分株繁殖的后代性状稳定，但繁殖系数低，难以进行规模化生产和优良品种的大面积推广。目前花毛茛的组培研究，尤其是花毛茛大规模无性繁殖的的研究报告较少，只有冯莉等人(1997)利用花毛茛的种子为外植体培养获得无菌苗。从实际操作上看，花毛茛组培的难度表现在：由于生长阶段无明显的腋芽和茎尖，而刚从土内萌发的蕖芽又嫩又脏，难于消毒和建立无菌体系，并且在无菌体系建立后增殖率低，难在短时间内进行大规模的生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种花毛茛组培快繁的方法，以便建立无菌快繁体系，并在无菌体系中提高增殖率，适宜大规模生产优质种苗。
本发明所述方法经过下列工艺步骤(本发明所用百分比为质量百分比)：
1、种球催芽：种球先在清水中浸泡8-10小时，之后播种于含水量在20-30％的基质中，在10-12℃进行催芽培养，待萌芽长到1-2cM的锥形并未展叶时，将芽从种球基部取下，取完芽后的种球放入基质中继续催芽；
2、外植体灭菌：将嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌10-30分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；
3、不定芽诱导培养：将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中：
MS培养基
BA 0.5-2.0mg/L
NAA 0.1-0.5mg/L
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，待锥形芽长成有叶的小苗后，将小苗去叶并在相同的培养基上进行继代转接2-3次后，在小苗的基部和叶腋间长出2-4个不定芽，继代4-5代后可得丛生芽；
4、不定芽继代培养：将上述丛生芽置于下列增殖培养基中进行继代培养：
MS培养基
BA 0.2-0.8mg/L
NAA 0.1-0.5mg/L，
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，每15天继代一次，继代5-6代；
5、生根培养和过渡移栽：将上述继代增殖中得到的不定芽分切成单株，接种在下列生根培养基上：
MS培养基
BA 0.1-0.4mg/L，
NAA 0.1-0.4mg/L，
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，培养15天后，小芽苗长大并生根，洗去附在生根苗上的琼脂，放入浓度为0.2％的多菌灵溶液中消毒分钟，直接移栽于腐殖土∶红土＝10∶1的基质中，待苗叶色浓绿并产生大量须根时，进行移栽种植。
所述MS培养基成分为下表：
| 药品名称 | 化学式 | 用量(mg/L) |
| 硝酸铵磷酸二氢钾硼酸硫酸锰硫酸锌碘化钾钼酸钠硫酸铜氯化钴 | NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>OZnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>OKINa<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>OCuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>OCoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 16501706.222.38.60.830.250.0250.025 |
| 硝酸钾 | KNO<sub>3</sub> | 1900 |
| 氯化钙硫酸镁 | CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>OMgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 440370 |
| 硫酸亚铁EDTA二钠 | FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>ONa<sub>2</sub>·EDTA | 27.837.3 |
| 肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸 | C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub>C<sub>8</sub>H<sub>12</sub>ClNO<sub>3</sub>C<sub>12</sub>H<sub>17</sub>ClN<sub>4</sub>OS·HClC<sub>2</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub> | 10000.50.50.12 |
在研究花毛茛的组培与高效快速繁殖方法的过程中，主要解决了下列难题：在外植体的选择上根据花毛茛的特性，通过种球直接产生锥形芽进行灭菌处理，并利用不同的培养基进行交替培养，同时采取降低培养温度，加快转接速度等技术措施，获得了花毛茛高效快速繁殖的效果。
本发明通过采取种球的相对无菌催芽、取锥形嫩芽灭菌、建立无菌体系，并进行环境、激素、营养和过渡基质等调节，解决花毛茛无菌体系建立困难的问题，并达到了高效快速增殖的目的，实现了花毛茛的规模化生产。其优越性体现在：
1、提供花毛茛离体组培快繁的成套技术，实现了花毛茛的规模化生产。
2、用种球催芽并取锥形嫩芽作为外植体，对无菌体系的建立是一种新颖而且有效的方法。
3、针对花毛茛习性，利用种球低温催芽技术，可以分批采芽，1个种球可获得10-15个嫩芽，结合有效的灭菌技术，每年可获提组培苗20-30万株，通过培养基的交替使用可以保证种源在2年后还有很强的增殖率和较低的变异率。
4、在培养过程中，进行20-22℃接近花毛茛生长环境低温培养，并加快转接速度使苗的不良生长情况得到改进。
5、进行不同培养阶段的激素调节，采取激素混用和轮用，达到提高增殖率和减少变异的目的。
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例1
1、种球催芽：种球先在清水中浸泡8小时，使种球充分吸水膨胀，然后播于塑料箱内的珍珠岩中，按照隔一层珍珠岩排一层种球的顺序依次播入，并用塑料薄膜进行覆盖保湿，基质的含水量控制在25％。在10-12℃下进行催芽培养，13天芽开始萌发，待萌芽长到1CM并呈锥形但未展叶时，将芽从种球基部取下，取完芽后的种球可以继续埋于基质中再催芽，以便多次重复采芽；
2、外植体灭菌：嫩芽采取三步消毒法进行灭菌，先将芽在75％的酒精中表面消毒30秒，然后在0.15％的Hgcl2中灭菌20分钟，最后再在1.5％的次氯酸钠溶液中消毒12分钟，之后用无菌水漂洗3次；
3、不定芽诱导培养：将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中：
MS培养基(同前)
BA 2.0mg/L，
NAA 0.1mg/L，
糖 30g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间11小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，20天后，有约20％的外植体无污染，并从锥形芽长成有叶的小苗，将小苗去叶后在相同的培养基上进行继代转接3次后，在小苗的基部和叶腋间长出2-4个不定芽，不定芽的发生与BA浓度呈正相关，但丛生和玻璃化的发生也随BA浓度的增加而加剧，在诱导培养基上继代4-5代，使之达到能转入正常生产时的种源基数；
4、不定芽继代培养：①将上述丛生芽置于下列增殖培养基中进行继代培养：
MS培养基(同前)
BA 0.2mg/L
NAA 0.5mg/L
糖 40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为10小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，每15天继代一次，增殖率可达2倍左右，在这个培养基上，既可以保证较高的增殖率，又可以保证组培苗的质量，丛生、变异和玻璃化的发生率很低，在继代培养基上继代5-6代后，取出；
②置于与步骤3的诱导培养基(BA1.0+NAA0.2)相同的培养基上继代1-2代；
①、②交替使用，可让一个种球一年生产种苗20-30万株：
5、生根培养和过渡移栽：将上述继代增殖中得到的不定芽分切成单株，接种在下列生根培养基上：
MS培养基(同前)
BA 0.1mg/L
NAA 0.4mg/L
糖 35g/L
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，小芽苗明显长高并生根，不仅根系分布均匀，且根的数量及根粗适中，过渡成活率高，将出瓶后的生根苗洗去琼脂放入低浓度多菌灵溶液中消毒片刻，直接移栽于腐殖土∶红土＝10∶1基质中，前期注意保湿和遮阴，前7天加盖双层遮阴网，以后逐渐减少遮阴，半月后可完全去除遮阴并适当控水，此时可适当增加光照并辅助喷施叶面肥，待苗叶色浓绿并产生大量须根时，可进行移栽种植。
实施例2
除培养基为下列培养基外，其余步骤均同实施例1：
诱导培养基中：
MS培养基(同前)
BA 0.5mg/L，
NAA 0.5mg/L，
糖 40g/L，
琼脂 5.5g/L
增殖培养基：
MS培养基(同前)
BA 0.8mg/L
NAA 0.1mg/L
糖 30g/L，
琼脂 5.5g/L
生根培养基上：
MS培养基(同前)
BA 0.4mg/L
NAA 0.1mg/L
糖 30g/L
琼脂 5.5g/L。
本发明经试验研究，其结果报告如下：
1、材料和方法所用材料为云南省农科院园艺所花卉研究中心进口花毛茛品种“2059”的种球，进行低温种球催芽后，在不同时期进行取材，分别用种球催芽萌发的嫩芽、栽培后的腋芽及花芽作为外植体进行组织培养。
2、培养基、培养条件、培养过程等均与实施例相同，其结果见表1、表2和表3。
表1不同外植体接种及生长表现
| 外植体 | 接种数(个) | 污染及死亡数(个) | 污染、死率％ | 不定芽发生数(个) | 有效进种率％ |
| 刚萌发的嫩芽 | 30 | 2 | 73.3 | 6 | 20.0 |
| 腋芽 | 30 | 28 | 93.3 | 0 | 0 |
| 花芽 | 30 | 22 | 73.3 | 0 | 0 |
从表1可以看出以在无菌基质中从种球萌发的锥形嫩芽为最佳的外植体材料。
表2不同激素浓度及配比对花毛茛诱导的影响
| 培养基(mg/L) | 接种数(个) | 产生芽数(个) | 增殖率％ | 有效芽数(个) | 变异率％ |
| BA1.0+NAA0.2 | 6 | 16 | 2.67 | 15 | 6.25 |
| BA1.5+NAA0.2 | 6 | 20 | 33.3 | 13 | 35.0 |
| BA2.0+NAA0.2 | 6 | 23 | 3.83 | 10 | 56.5 |
表3不同生长素对花毛茛生根和成活的影响
| 培养基(mg/L) | 接种芽数(个) | 生根时间(天) | 生根率％ | 平均根数(条) | 平均根长(cm) | 移栽成活率(％) |
| NAA0.1 | 100 | 14 | 97 | 3.8 | 1.5 | 94 |
| NAA0.4 | 100 | 15 | 98 | 4.1 | 1.4 | 93 |
| NAA0.7 | 100 | 15 | 96 | 4.2 | 1.1 | 80 |
| NAA1.0 | 100 | 15 | 97 | 3.9 | 0.9 | 78 |
从表2可以看出，随BA浓度增加，增殖率逐步提高，在BA2.0时增殖率最高，但是随培养代数的增加，变异明显增加，主要表现为不定芽矮化、叶片不展开，皱缩及黄化。在前期的诱导培养中BA1.0+NAA0.2效果最好，是一种高效有用的诱导培育基，增殖率适中，变异率低。
从表3可见，在NAA0.1-1.0mg/L的培养基上，均会长根，长根时间无明显差异，但以0.1-0.4mg/L时的生根效果较好，不仅根系分布均匀，且根的数量及根粗适中，过渡成活率高；生长素浓度过高则根系短粗，易脱落，过渡成活率低。幼苗移栽以春初及秋季节最好，此时幼苗成活率高，可达到90％以上，此时气候凉爽，苗的生长良好。花毛茛在夏季高温时会自然休眠，夏季移栽温度太高苗的生长不良。
影响花毛莨快繁增殖的因素：
继代时间：在花毛莨的培养中，随着培养时间的延长，小苗，特别是苗上比较老的叶片会褐化死亡，且汾泌物也会使培养基颜色变褐，褐色物的产生又加剧了小苗的死亡，针对这一问题，我们进行继代周期试验，结果表明，在12-15天及时进行转瓶，可以减少或减轻褐化的发生。
温度影响：花毛莨是喜欢冷凉的花卉，过高的温度会使植株休眠，在组培中，当温度高时，小苗的长势差，并伴有褐化发生，在20℃左右的培养温度下，有利于苗的生长工，在30℃时，半数以上的苗会褐死，这与花毛莨的田间生长习性相一致，田间表现为5月份以后花毛茛开始枯萎死休眠。
Claims (2)
1.一种花毛莨的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于经过下列工艺步骤：
A、种球催芽：种球先在清水中浸泡8-10小时，之后播种于含水量在20-30％的基质中，在10-12℃进行催芽培养，待萌芽长到1-2cM的锥形并未展叶时，将芽从种球基部取下，取完芽后的种球放入基质中继续催芽；
B、外植体灭菌：将嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌10-30分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；
C、不定芽诱导培养：将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中：
MS培养基
BA 0.5-2.0mg/L
NAA 0.1-0.5mg/L
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，待锥形芽长成有叶的小苗后，将小苗去叶并在相同的培养基上进行继代转接2-3次后，在小苗的基部和叶腋间长出2-4个不定芽，继代4-5代后可得丛生芽；
D、不定芽继代培养：将上述丛生芽置于下列增殖培养基中进行继代培养：
MS培养基
BA 0.2-0.8mg/L
NAA 0.1-0.5mg/L，
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，每15天继代一次，继代5-6代；
E、生根培养和过渡移栽：将上述继代增殖中得到的不定芽分切成单株，接种在下列生根培养基上：
MS培养基
BA 0.1-0.4mg/L，
NAA 0.1-0.4mg/L，
糖 30-40g/L，
琼脂 5.5g/L
控制PH为6.0，光照时间为10-12小时，光照强度为2000Lx，培养温度为20-22℃，培养15天后，小芽苗长大并生根，洗去附在生根苗上的琼脂，放入浓度为0.2％的多菌灵溶液中消毒片刻，直接移栽于腐殖土∶红土＝10∶1的基质中，待苗叶色浓绿并产生大量须根时，进行移栽种植。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D的不定芽继代培养过程中，先在继代培养基上继代5-6代后，再在诱导培养基上继代1-2代，如此交替使用。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Kunming Jinyuan Flower Industry Co., Ltd. Assignor: Gardening Grop Inst., Yunnan Agricultural Academy Contract fulfillment period: 2009.9.22 to 2013.11.7 contract change Contract record no.: 2009530000022 Denomination of invention: Tissure culture and fast growth of buttercup flowers Granted publication date: 20080312 License type: Exclusive license Record date: 2009.9.24 |
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| LIC | Patent licence contract for exploitation submitted for record |
Free format text: EXCLUSIVE LICENSE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2009.9.22 TO 2013.11.7; CHANGE OF CONTRACT Name of requester: KUNMING JINYUAN FLOWER INDUSTRY CO., LTD Effective date: 20090924 |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YUNNAN JINYUAN FLOWER INDUSTRY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: GARDENING GROP INST., YUNNAN AGRICULTURAL ACADEMY Effective date: 20111125 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 650205 KUNMING, YUNNAN PROVINCE TO: 650213 KUNMING, YUNNAN PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20111125 Address after: Guandu District of Yunnan city in Kunming province 650213 New Asia sports star city international headquarters base building 61 building 16-17 Patentee after: Yunnan Jinyuan flower industry Limited by Share Ltd Address before: 650205 Beijiao leading Street, Yunnan, Kunming Patentee before: Gardening Grop Inst., Yunnan Agricultural Academy |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080312 Termination date: 20151107 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |