CN114375840A - 恢复绣球花杂交后代生长势的培养基及恢复生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物技术领域，具体涉及一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基及恢复生长的方法。所述培养基包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；所述诱导培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20‑30g、琼脂5‑7g；所述生长培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20‑30g、琼脂5‑7g、6‑BA 0.1‑0.15mg、IBA 0.2‑0.5mg；所述增殖培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20‑30g、琼脂5‑7g、6‑BA 0.4‑0.8mg、IBA 0.05‑0.1mg。本发明利用绣球花杂交果实作为外植体，利用胚培养方法对杂交种进行胚抢救，实现了胚的快速繁殖，使那些无法自然萌发和生长的种子恢复生长能力，是克服传统杂交障碍的有效措施。

Description

恢复绣球花杂交后代生长势的培养基及恢复生长的方法

技术领域

本发明属于植物技术领域，具体涉及一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基及恢复生长的方法。

背景技术

绣球花(Hydrangea macrophylla)又名山绣球、八仙花、紫阳花等，为虎耳草科绣球属多年生灌木。绣球花是重要的观赏植物，在园艺市场中占有重要地位。绣球花原产于我国长江流域和日本地区，国内拥有46种原种，10变种(《中国植物志》，1995年)绣球属品种资源，其中秦岭地区约有绣球属植物7种。筛选野生变种、传统杂交等手段是绣球花育种的主要方法，也有研究工作者采用诱变育种和倍性育种等方式培育绣球花的新品种。由于不同绣球花的种质资源差异较大，种间不亲和现象很常见，所以，绣球花杂交后代很容易出现生长势较差(比如种子不萌发，或者幼苗生长速度慢)的情况，导致绣球花杂交后代的繁殖量少，这是传统杂交育种的重大阻碍。

现有技术为了提高绣球花的繁殖量，通常采用组织培养方法，首先选择合适的外植体，常见的外植体为带腋芽茎段、茎叶、叶片、叶柄、叶块，通常不采用“种子、根系或者花器官”，然后采用HgCl₂、酒精等进行外植体消毒，接着采用特定配方的组织培养基进行诱导培养(闫海霞,蒋月喜,邓杰玲,等.绣球花组织培养的研究进展[J].广西农学报,2017,32(3):5)。然而，由于传统育种过程中，绣球花的杂交后代会出现种子不萌发的情况，而现有技术的方法却无法利用种子作为外植体，因此，无法针对种子不萌发的杂交后代提供培养方法，阻碍了杂交后代萌发以及长势。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基。

本发明的目的是提供一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；

包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；

所述诱导培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g；

所述生长培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g、6-BA0.1-0.15mg、IBA0.2-0.5mg；

所述增殖培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g、6-BA 0.4-0.8mg、IBA0.05-0.1mg。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，每升所述诱导培养基中还添加有重金属离子20-30mg。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，每升所述增殖培养基中还添加有重金属离子25-35mg。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，所述重金属离子为二价铅离子或者二价铜离子。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，还包括与所述重金属离子配合使用的螯合剂，每升培养基中螯合剂的用量为1mg，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，还包括：

叶片诱导愈伤组织培养基：每升MS中添加蔗糖20-30g、琼脂4-7g、6-BA2.5-3mg、IAA 0.2-0.3mg。

生根培养基：每升1/4MS中添加蔗糖20-30g、琼脂4-7g、IBA 0.05-0.1mg。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的方法，包括以下步骤：

S1，子房清洗

将采回的绣球花杂交后的膨大子房清洗和消毒；

S2，诱导培养

在无菌环境下取出消毒后子房的胚囊，放置在预先配好的诱导培养基上，用塑料封口膜封口后暗培养，培养温度25±2℃；当培养皿内胚开始萌发后，再给予光照，进行光周期培养；

S3，生长培养

待培养基上幼苗长至5-7mm时，将整棵组培苗转移至生长培养基上，光周期培养30-45d；

S4，增殖培养

将生长培养基上长2-3cm的组培苗转移在增殖培养基上，光周期培养30-35d左右，获得绣球花幼苗。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的方法，还包括以下步骤：

S5，叶片诱导愈伤组织培养：

取生长培养后得到的组培苗顶端叶面充分展开的幼嫩叶片，垂直于主脉切2-4刀，叶背朝下与叶片诱导愈伤组织培养基充分接触，暗培养15d之后，再进行光周期培养；

S6，生根培养

选择长度为1-2cm的组培苗在生根培养基中进行光周期培养，光周期培养45-50d后，进行移栽；

S7，驯化移栽

将生根的幼苗在培养室半开瓶盖驯化，先转移至细泥炭的穴盘中，放置在温度25℃，湿度80％以上，生长30d以上，存活后移栽至小盆中生长。

优选的，上述恢复绣球花杂交后代生长势的方法，所述光周期培养的条件为日光灯照明16-17h/d，光照条件为2000lx，温度25±2℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用绣球花杂交果实(即杂交后代的种子胚)作为外植体，利用胚培养方法对杂交种进行胚抢救，实现了胚的快速繁殖，使那些无法自然萌发和生长的种子恢复生长能力，获得更多在自然条件下无法萌发或者生长的杂交后代，是克服传统杂交障碍的有效措施。

2、本发明通过胚培养的方式可以在短期获得大量的绣球花种间杂交后代，获得具有优良性状的绣球花新品种，缩短了绣球花的育种周期。

3、当通过胚培养发现种间杂交后代仍然长势弱小，则继续利用幼苗叶片作为外植体诱导愈伤组织，进行扩繁和复壮，可获得长势良好的杂交后代组培苗。

4、本发明的实施例11-14利用微量浓度的重金属离子(低于抑制植物生长的浓度)对植物的生长提供胁迫刺激，与生长调节剂配合条件下，加速植物的出愈，螯合剂敖合了重金属离子，提高了重金属离子在培养基中的分散性，也提高了重金属离子的刺激样本产生愈伤组织的效果。

附图说明

图1为本发明实施例4采回的绣球花杂交果实(从右至左的6个管的编号分别为6-11)；

图2为本发明实施例4的S3的培养过程图片；

图3为本发明实施例8的S5的培养过程图片；

图4为本发明实施例8的S6的培养过程图片。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。

实施例1杂交后代A的获得

选择大花绣球[H.macrophylla ssp.macrophylla(Thunb.)Ser.]玉石(Topaz)做母本，圆锥绣球(Hydrangea paniculata Siebold)草莓冰淇淋(Strawberry sundae)做父本，进行种间杂交，取杂交后40-50d的膨大子房，剥离良好的胚，将胚作为外植体进行培养。

绣球花人工杂交过程如下：因绣球花可育花藏在不育花下面，必须首先剪掉不育花才能进行去雄工作。剪不育花花枝操作在上午9:00以后进行，确保此时花瓣及花枝上的露水已经蒸发，防止因整个花序不是干燥的，极易引起病菌的滋生，从而影响杂交结实率。去雄后的第二天授粉，授粉一般选择在晴朗的天气进行，一般最好的授粉时间是早上的八点-九点钟。

实施例2杂交后代B的获得

选择大花绣球[H.macrophylla ssp.macrophylla(Thunb.)Ser.]博登湖(Bodensee)做母本，圆锥绣球(Hydrangea paniculata Siebold)草莓冰淇淋(Strawberrysundae)做父本，进行种间杂交，取杂交后40-50d的膨大子房，剥离良好的胚，将胚作为外植体进行培养。

绣球花人工杂交过程参照实施例1。

实施例3

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；

所述诱导培养基为1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；

所述生长培养基为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.1mg/L+IBA(吲哚丁酸)0.2mg/L；

所述增殖培养基为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA0.05mg/L。

实施例4

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，包括以下步骤：

S1，子房清洗

将实施例1方法采回的绣球花杂交后的膨大子房(图1)用自来水冲洗，用洗衣粉漂洗5min后，再用自来水冲洗1h。在无菌超净工作台上用体积分数为75％的酒精清洗1min，之后用提前灭好的无菌水洗2次，然后用质量分数0.1％升汞浸泡8min，用无菌水清洗2次，再用质量分数0.1％升汞浸泡8min，无菌水清洗4次。

S2，诱导培养

在无菌环境下先用解剖刀将果实剖开，再用刀尖将带有发育良好胚的胚囊轻轻挑出，放置在预先配好的诱导培养基(1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂7g/L)上，用塑料封口膜封口后，放入带盖的纸盒箱中，接种100个胚样本，每瓶培养基各10个，共10瓶，均在培养室内进行暗培养，培养温度25℃。当培养皿内胚开始萌发后，再给予光照，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃。38个胚样本萌发，且最早的萌发时间为第5d。

S3，生长培养

待培养基上幼苗高度长至5mm时(出现愈伤组织前)，将30个幼苗整棵组培苗转移至生长培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L+IBA0.2mg/L)上，制作30个样本，生长30-45d(组织高度长至2cm左右)，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃，进行增殖培养。30个幼苗均可长至高度2cm左右(图2)，且最早长到2cm的样本的时间为30d。

S4，增殖培养

将生长培养基上的组培苗连根切下放置在增殖培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA 0.05mg/L)上，制作30个样本，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃，30个样本均可长至高度5cm左右的绣球花幼苗，且最早长到5cm的样本的时间为28d。

对照组1

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例4的S1-S2基本相同，区别在于：

S2接种后直接进行光周期培养而不进行暗培养，100个胚样本仅有10个萌发，其余未萌发，且最早的萌发时间为第10d。

对照组2

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例4的S1-S4基本相同，区别在于：

所述生长培养基为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；增殖培养基为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；

结果显示，S3中30个样本仅有6个在45天内长出高度2cm左右组培苗，其余的样本培养至50d仍无法长到2cm，且最早长到2cm的时间为第40d；S4中6个样本仅有1个在45天内长出5cm左右组培苗，且最早长到5cm的时间为第42d。

对照组3

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例4的S1-S4基本相同，区别在于：

将IBA替换为NAA；

结果显示，S3中30个样本有28个在45天内长出2cm左右组培苗，且最早长到2cm的时间为第37d；S4中制作的28个样本有27个在45天内长出5cm左右组培苗，且最早长到5cm的时间为第38d。

实施例5

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；

所述诱导培养基为1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L；

所述生长培养基为1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L+6-BA 0.15mg/L+IBA0.5mg/L；

所述增殖培养基为1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L+6-BA 0.8mg/L+IBA0.1mg/L。

实施例6

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，包括以下步骤：

S1，子房清洗

与实施例4的S1的操作相同。

S2，诱导培养

与实施例4的S2的操作相同，接种100个样本，39个样本萌发，且最早的萌发时间为第5d。

S3，生长培养

待培养基上幼苗长至5mm时(出现愈伤组织前)，将整棵组培苗转移至生长培养基(1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L+6-BA 0.15mg/L+IBA0.5mg/L)上，制作30个样本，生长大概30-45d(组织高度长至3cm左右)，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃，进行增殖培养。30个样本均可长至2cm左右，且最早长到2cm的样本的时间为30d。

S4，增殖培养

将生长培养基上的组培苗连根切下放置在增殖培养基(1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L+6-BA 0.8mg/L+IBA 0.1mg/L)上，制作30个样本，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃，增殖30-35d左右，获得绣球花幼苗。30个样本均可长至高度5cm左右的绣球花幼苗，且最早长到5cm的样本的时间为29d。

实施例7

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，在实施例3的基础上，还新增了叶片诱导愈伤组织培养基：MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 2.5mg/L+IAA0.2mg/L。

生根培养基：1/4MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+IBA 0.05mg/L。

实施例8

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，在实施例4的基础上还增加了以下步骤：

S5，叶片诱导愈伤组织培养：

取生长培养后得到的组培苗顶端叶面充分展开的幼嫩叶片，垂直于主脉切2-4刀，叶背朝下与叶片诱导愈伤组织培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA2.5mg/L+IAA 0.2mg/L)充分接触，制作15个样本，暗培养15d之后，再进行光照培养，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃(图3)。15个样本均可长至2cm左右，且最早长到2cm的样本的时间为40d。

S6，生根培养

选择长度为1-2cm的组培苗在生根培养基中(1/4MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+IBA0.05mg/L)进行生根培养，制作15个样本，日光灯照明16h/d，光照条件为2000lx，温度依然25℃，生根45d后(图4)，进行移栽。15个样本均可生根。

S7，驯化移栽

将生根的小苗在培养室半开瓶盖驯化，先转移至细泥炭的穴盘中，制作15个样本，放置在温度25℃，湿度80％以上，生长32d，存活后移栽至小盆中生长。制作的15个样本均可存活。

实施例9

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，在实施例3的基础上，还新增了叶片诱导愈伤组织培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+6-BA 3mg/L+IAA0.3mg/L。

生根培养基：1/4MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L。

实施例10

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例8的操作基本相同(包括样本制作量、实验方法等)，区别在于：

叶片诱导愈伤组织培养基改为MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+6-BA 3mg/L+IAA0.3mg/L；

生根培养基改为1/4MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L。

S5中制作的15个样本均可长至2cm左右愈伤组织，且最早长到2cm的样本的时间为40d；S6中制作的15个样本均可成功产生生根，S7中移栽的15个样本幼苗均可存活。

实施例11

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，包括诱导培养基、生长培养基、和增殖培养基；

所述生长培养基的配方与实施例3相同；

所述诱导培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+氯化铜20mg/L；

所述增殖培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA0.05mg/L+氯化铜30mg/L。

实施例12

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例4的操作基本相同(包括样本制作量、实验方法等)，区别在于：

所述诱导培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+氯化铜20mg/L；

所述增殖培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA0.05mg/L+氯化铜30mg/L。

本实施例制作的所有样本均可成功产生愈伤组织、长至2cm以及5cm，且最早到达2cm(S3)的时间为第28d，最早到达5cm(S4)的时间为28d。

实施例13

一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，包括诱导培养基、生长培养基、和增殖培养基；

所述生长培养基的配方与实施例3相同；

所述诱导培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+硝酸铅20mg/L；

所述增殖培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA0.05mg/L+硝酸铅30mg/L+螯合剂(EDTA)1.5mg/L。

实施例14

一种恢复绣球花杂交后代生长势的方法，与实施例8的操作基本相同，区别在于：

所述诱导培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+硝酸铅20mg/L；

所述增殖培养基改为1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.4mg/L+IBA0.05mg/L+硝酸铅30mg/L+螯合剂(EDTA)1.5mg/L。

本实施例制作的所有样本均可成功产生愈伤组织、长至2cm以及5cm，且最早到达2cm(S3)的时间为第27d，最早到达5cm(S4)的时间为26d。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，包括诱导培养基、生长培养基和增殖培养基；

所述诱导培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g；

所述生长培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g、6-BA 0.1-0.15mg、IBA0.2-0.5mg；

所述增殖培养基为每升1/2MS中添加蔗糖20-30g、琼脂5-7g、6-BA 0.4-0.8mg、IBA0.05-0.1mg。

2.根据权利要求1所述的恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，每升所述诱导培养基中还添加有重金属离子20-30mg。

3.根据权利要求2所述的恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，每升所述增殖培养基中还添加有重金属离子25-35mg。

4.根据权利要求2或3所述的恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，所述重金属离子为二价铅离子或者二价铜离子。

5.根据权利要求4所述的恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，还包括与所述重金属离子配合使用的螯合剂，每升培养基中螯合剂的用量为1mg，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。

6.根据权利要求1所述的恢复绣球花杂交后代生长势的培养基，其特征在于，还包括：

叶片诱导愈伤组织培养基：每升MS中添加蔗糖20-30g、琼脂4-7g、6-BA 2.5-3mg、IAA0.2-0.3mg。

生根培养基：每升1/4MS中添加蔗糖20-30g、琼脂4-7g、IBA 0.05-0.1mg。

7.利用权利要求1所述的培养基恢复绣球花杂交后代生长势的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，子房清洗

将采回的绣球花杂交后的膨大子房清洗和消毒；

S2，诱导培养

在无菌环境下取出消毒后子房的胚囊，放置在预先配好的诱导培养基上，用塑料封口膜封口后暗培养，培养温度25±2℃；当培养皿内胚开始萌发后，再给予光照，进行光周期培养；

S3，生长培养

待培养基上幼苗长至5-7mm时，将整棵组培苗转移至生长培养基上，光周期培养30-45d；

S4，增殖培养

将生长培养基上长2-3cm的组培苗转移在增殖培养基上，光周期培养30-35d左右，获得绣球花幼苗。

8.根据权利要求7所述的恢复绣球花杂交后代生长势的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

S5，叶片诱导愈伤组织培养：

取生长培养后得到的组培苗顶端叶面充分展开的幼嫩叶片，垂直于主脉切2-4刀，叶背朝下与叶片诱导愈伤组织培养基充分接触，暗培养15d之后，再进行光周期培养；

S6，生根培养

选择长度为1-2cm的组培苗在生根培养基中进行光周期培养，光周期培养45-50d后，进行移栽；

S7，驯化移栽

将生根的幼苗在培养室半开瓶盖驯化，先转移至细泥炭的穴盘中，放置在温度25℃，湿度80％以上，生长30d以上，存活后移栽至小盆中生长。

9.根据权利要求8所述的恢复绣球花杂交后代生长势的方法，其特征在于，所述光周期培养的条件为日光灯照明16-17h/d，光照条件为2000lx，温度25±2℃。

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