CN108157176A - 一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法 - Google Patents

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雷连海
杜永魏
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Abstract

本发明公开了一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括外植体选择步骤、外植体消毒步骤、播种步骤、继代培养步骤、生根培养步骤和炼苗、驯化移栽步骤。本发明的方法能够有效的提高玫瑰石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现玫瑰石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。

Description

一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法
技术领域
本发明涉及组织培养育苗领域，尤其涉及一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法。
背景技术
玫瑰石斛(Dendrobium crepidatumLindl.ex Paxt.)为兰科，主要分布在中国、印度、尼泊尔、不丹、缅甸、泰国、老挝、越南。茎悬垂，肉质状肥厚，青绿色，圆柱形，不分枝，具多节；总状花序很短，从落了叶的老茎上发出，具有1-4朵花，花瓣质地厚，开展，萼片和花瓣白色，中上部淡紫色，唇瓣中部以上淡紫红色，中部以下金黄色，花期3-4月。
目前国内市场上的玫瑰石斛主要靠野生采挖，有少数人工栽培，一般通过分株繁殖和扦插的方式进行繁殖，繁殖种苗较少，繁殖率低，生长周期较长，正常生长环境下不经人工授粉结果的几率较小；由于果荚少，果粉细小，在自然环境下不易萌发生长等诸多因素的制约，野生的玫瑰石斛资源不断减少。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，该方法能够有效的提高玫瑰石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现玫瑰石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括：
外植体选择步骤：选择玫瑰石斛母本植株，对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育，待果荚成熟后，将其采摘保存；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先洁净果荚，然后对果荚外壳进行一次消毒1-2min，然后用无菌水冲洗3-4次，再进行二次消毒6-8min，然后用无菌水冲洗4-5次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，封上培养瓶的瓶盖，培养至种子萌发；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子继续培养，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，长至5-6cm时称为二级母瓶；
生根培养步骤：将二级母瓶转至MS培养基中，生根培养得到生根瓶苗；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养85-95天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置15-30天，再打开培养瓶的瓶盖放置3-5天后，用多菌灵稀释液浸泡玫瑰石斛苗根部，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
进一步地，外植体选择步骤中，选择玫瑰石斛2-4年的母本植株，在玫瑰石斛开花期间对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育3-4个月，待果荚成熟后，将其采摘放置在3-7℃的环境下保存1-3周。
进一步地，外植体消毒步骤中，洁净果荚的具体步骤为，先将果荚用洗洁精水浸泡15-20min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗10-15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗3-4次，再进行消毒；用浓度为1-3％的次氯酸钠进行一次消毒，用浓度为0.1-0.3％的氯化汞进行二次消毒。
进一步地，播种步骤中，第一1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，浓度为2％-3％的蔗糖和4.8-6.0g/L琼脂粉，pH调至5.8-6.2。
进一步地，播种步骤中，培养25-30天至种子萌发，培养的条件为，温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天。
进一步地，继代培养具体为，萌发的玫瑰石斛种子置于光照强度为2000-2500lx的培养室中继续培养40-50天，光照时间为10-12小时/天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，培养55-65天，长至5-6cm时称为二级母瓶。
进一步地，继代培养步骤中，第二1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，0.5-0.8mg/L萘乙酸，1.2-1.5mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
进一步地，生根培养具体为，将生长45-55天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，生根培养85-95天，得到生根瓶苗。
进一步地，生根培养步骤中，MS培养基的成分包括3790-3800mg/L硝酸钾，3290-3300mg/L硝酸铵，870-880mg/L二水氯化钙，730-740mg/L七水硫酸镁，330-340mg/L磷酸二氢钾，1.62-1.66mg/L碘化钾，12.0-12.44mg/L硼酸，44.6-46mg/L四水硫酸锰，17.2-18mg/L七水硫酸锌，0.4-0.5mg/L钼酸钠，0.05-0.06mg/L五水硫酸铜，0.05-0.06mg/L氯化钴，55-58mg/L硫酸亚铁，46-50mg/L乙二胺四乙酸，192-200mg/L肌醇，0.4-0.6mg/L烟酸，0.5-0.7mg/L盐酸硫胺素，0.4-0.6mg/L盐酸吡哆锌，1.6-1.8mg/L甘氨酸，1.6-2.0mg/L萘乙酸，0.3-0.6mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁，25-35g/L香蕉汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
进一步地，炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗培养85-95天的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55-65天后，将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中炼苗20-40天。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，该方法能够有效的提高玫瑰石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现玫瑰石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况；
(2)本发明的外植体消毒步骤对果荚外壳进行两次消毒，一次消毒1-2min，二次消毒6-8min，果荚消毒彻底才能保证种子播种后培养基不感染，在温度、光照条件适合的情况下，玫瑰石斛种子育苗的发芽率大于85％，保证品种纯正；
(3)本发明的播种步骤和继代培养步骤的第一1/2MS培养基和第二1/2MS培养基均采用1/2MS培养基，通过和MS培养基对比，对种苗的萌发生长无影响，采用1/2MS培养基还可以节约原料；
(4)本发明的炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗培养85-95天的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55-65天后，将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中炼苗20-40天，这样可以节约培养室日光灯和空调的耗电量，每月可节约1200-1500元左右的成本。
附图说明
图1为本发明玫瑰石斛种子萌发初始状态图；
图2为本发明玫瑰石斛愈伤组织开始分化不定芽图；
图3为本发明玫瑰石斛继代培养图；
图4为本发明玫瑰石斛生根培养图；
图5为本发明玫瑰石斛组培驯化苗图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括：
外植体选择步骤：选择玫瑰石斛母本植株，对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育，待果荚成熟后，将其采摘保存；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先洁净果荚，然后对果荚外壳进行一次消毒1-2min，然后用无菌水冲洗3-4次，再进行二次消毒6-8min，然后用无菌水冲洗4-5次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，封上培养瓶的瓶盖，培养至种子萌发；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子继续培养，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，长至5-6cm时称为二级母瓶；
生根培养步骤：将二级母瓶转至MS培养基中，生根培养得到生根瓶苗；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养85-95天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置15-30天，再打开培养瓶的瓶盖放置3-5天后，用多菌灵稀释液浸泡玫瑰石斛苗根部，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
作为进一步地实施方式，外植体选择步骤中，选择玫瑰石斛2-4年的母本植株，在玫瑰石斛开花期间对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育3-4个月，待果荚成熟后，将其采摘放置在3-7℃的环境下保存1-3周。
作为进一步地实施方式，外植体消毒步骤中，洁净果荚的具体步骤为，先将果荚用洗洁精水浸泡15-20min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗10-15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗3-4次，再进行消毒；用浓度为1-3％的次氯酸钠进行一次消毒，用浓度为0.1-0.3％的氯化汞进行二次消毒。
作为进一步地实施方式，播种步骤中，第一1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，浓度为2％-3％的蔗糖和4.8-6.0g/L琼脂粉，pH调至5.8-6.2。
作为进一步地实施方式，播种步骤中，培养25-30天至种子萌发，培养的条件为，温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天。
作为进一步地实施方式，继代培养具体为，萌发的玫瑰石斛种子置于光照强度为2000-2500lx的培养室中继续培养40-50天，光照时间为10-12小时/天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，培养55-65天，长至5-6cm时称为二级母瓶。
作为进一步地实施方式，继代培养步骤中，第二1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，0.5-0.8mg/L萘乙酸，1.2-1.5mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
作为进一步地实施方式，生根培养具体为，将生长45-55天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，生根培养85-95天，得到生根瓶苗。
作为进一步地实施方式，生根培养步骤中，MS培养基的成分包括3790-3800mg/L硝酸钾，3290-3300mg/L硝酸铵，870-880mg/L二水氯化钙，730-740mg/L七水硫酸镁，330-340mg/L磷酸二氢钾，1.62-1.66mg/L碘化钾，12.0-12.44mg/L硼酸，44.6-46mg/L四水硫酸锰，17.2-18mg/L七水硫酸锌，0.4-0.5mg/L钼酸钠，0.05-0.06mg/L五水硫酸铜，0.05-0.06mg/L氯化钴，55-58mg/L硫酸亚铁，46-50mg/L乙二胺四乙酸，192-200mg/L肌醇，0.4-0.6mg/L烟酸，0.5-0.7mg/L盐酸硫胺素，0.4-0.6mg/L盐酸吡哆锌，1.6-1.8mg/L甘氨酸，1.6-2.0mg/L萘乙酸，0.3-0.6mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁，25-35g/L香蕉汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
作为进一步地实施方式，炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗培养85-95天的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55-65天后，将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中炼苗20-40天。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1：
一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括：
外植体选择步骤：选择健壮的玫瑰石斛2-4年的母本植株，在6月中旬玫瑰石斛开花期间对玫瑰石斛进行人工授粉，让其长出果荚，经过3-4个月培育，果荚成熟后，将其采摘放置在5℃的环境下保存2周；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先将果荚用洗洁精水浸泡18min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡50s，无菌水冲洗3次，然后用浓度为2％的次氯酸钠对果荚外壳进行一次消毒1min，然后用无菌水冲洗3次，再用浓度为0.2％的氯化汞进行二次消毒6min，然后用无菌水冲洗4次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，将第一1/2MS培养基的pH调至6.0，封上培养瓶的瓶盖，在温度为24℃，光照强度为2300lx，光照时间为11小时/天的条件下，培养27天，种子萌发；第一1/2MS培养基的成分包括1895mg/L硝酸钾，1645mg/L硝酸铵，442mg/L二水氯化钙，372mg/L七水硫酸镁，165mg/L磷酸二氢钾，0.81mg/L碘化钾，6.1mg/L硼酸，22.6mg/L四水硫酸锰，8.8mg/L七水硫酸锌，0.22mg/L钼酸钠，0.027mg/L五水硫酸铜，0.029mg/L氯化钴，28mg/L硫酸亚铁，24mg/L乙二胺四乙酸，98mg/L肌醇，0.25mg/L烟酸，0.30mg/L盐酸硫胺素，0.25mg/L盐酸吡哆锌，0.84mg/L甘氨酸，浓度为3％的蔗糖和5.6g/L琼脂粉；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子在光照强度为2300lx，光照时间为10-12小时/天的条件下生长45天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，将第二1/2MS培养基的pH调至6.0，培养60天，长至5-6cm时称为二级母瓶；第二1/2MS培养基的成分包括1895mg/L硝酸钾，1645mg/L硝酸铵，442mg/L二水氯化钙，372mg/L七水硫酸镁，165mg/L磷酸二氢钾，0.82mg/L碘化钾，6.1mg/L硼酸，22.6mg/L四水硫酸锰，8.8mg/L七水硫酸锌，0.22mg/L钼酸钠，0.027mg/L五水硫酸铜，0.029mg/L氯化钴，28mg/L硫酸亚铁，24mg/L乙二胺四乙酸，98mg/L肌醇，0.25mg/L烟酸，0.3mg/L盐酸硫胺素，0.25mg/L盐酸吡哆锌，0.85mg/L甘氨酸，0.6mg/L萘乙酸，1.3mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为3％的蔗糖，5.0g/L琼脂粉，38g/L土豆汁和0.2g/L活性碳粉；
生根培养步骤：将生长50天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，将MS培养基的pH调至6.0，生根培养90天，得到生根瓶苗；MS培养基的成分包括3795mg/L硝酸钾，3295mg/L硝酸铵，875mg/L二水氯化钙，735mg/L七水硫酸镁，335mg/L磷酸二氢钾，1.64mg/L碘化钾，12.2mg/L硼酸，45mg/L四水硫酸锰，17.6mg/L七水硫酸锌，0.45mg/L钼酸钠，0.05mg/L五水硫酸铜，0.05mg/L氯化钴，56mg/L硫酸亚铁，48mg/L乙二胺四乙酸，196mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.6mg/L盐酸硫胺素，0.5mg/L盐酸吡哆锌，1.7mg/L甘氨酸，1.8mg/L萘乙酸，0.5mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为3％的蔗糖，5.4g/L琼脂粉，37g/L土豆汁，30g/L香蕉汁和0.2g/L活性碳粉；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养的具体步骤为，瓶苗在培养室长至60天后，将其移至温度为26℃、湿度为50％的大棚中炼苗30天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置20天，再打开培养瓶的瓶盖放置3天后，将玫瑰石斛苗倒出，洗净培养基，用多菌灵稀释到800倍浸泡玫瑰石斛苗根部15min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
实施例2：
一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括：
外植体选择步骤：选择健壮的玫瑰石斛2-4年的母本植株，在6月中旬玫瑰石斛开花期间对玫瑰石斛进行人工授粉，让其长出果荚，经过3-4个月培育，果荚成熟后，将其采摘放置在3℃的环境下保存2周；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先将果荚用洗洁精水浸泡15min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗10min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡33s，无菌水冲洗3次，然后用浓度为1％的次氯酸钠对果荚外壳进行一次消毒2min，然后用无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1％的氯化汞进行二次消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，将第一1/2MS培养基的pH调至5.8，封上培养瓶的瓶盖，在温度为24℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天的条件下，培养30天，种子萌发；第一1/2MS培养基的成分包括1890mg/L硝酸钾，1640mg/L硝酸铵，440mg/L二水氯化钙，370mg/L七水硫酸镁，160mg/L磷酸二氢钾，0.8mg/L碘化钾，6.0mg/L硼酸，22.3mg/L四水硫酸锰，8.6mg/L七水硫酸锌，0.2mg/L钼酸钠，0.025mg/L五水硫酸铜，0.028mg/L氯化钴，27.5mg/L硫酸亚铁，23mg/L乙二胺四乙酸，96mg/L肌醇，0.2mg/L烟酸，0.25mg/L盐酸硫胺素，0.2mg/L盐酸吡哆锌，0.8mg/L甘氨酸，浓度为2％的蔗糖和4.8g/L琼脂粉；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子在光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天的条件下生长50天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，将第二1/2MS培养基的pH调至5.8，培养55天，长至5-6cm时称为二级母瓶；第二1/2MS培养基的成分包括1890mg/L硝酸钾，1640mg/L硝酸铵，440mg/L二水氯化钙，370mg/L七水硫酸镁，160mg/L磷酸二氢钾，0.8mg/L碘化钾，6.0mg/L硼酸，22.3mg/L四水硫酸锰，8.6mg/L七水硫酸锌，0.2mg/L钼酸钠，0.025mg/L五水硫酸铜，0.028mg/L氯化钴，27.5mg/L硫酸亚铁，23mg/L乙二胺四乙酸，96mg/L肌醇，0.2mg/L烟酸，0.25mg/L盐酸硫胺素，0.2mg/L盐酸吡哆锌，0.8mg/L甘氨酸，0.5mg/L萘乙酸，1.2mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％的蔗糖，4.8g/L琼脂粉，35g/L土豆汁和0.1g/L活性碳粉；
生根培养步骤：将生长45天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，将MS培养基的pH调至5.8，生根培养85天，得到生根瓶苗；MS培养基的成分包括3790mg/L硝酸钾，3290mg/L硝酸铵，870mg/L二水氯化钙，730mg/L七水硫酸镁，330mg/L磷酸二氢钾，1.62mg/L碘化钾，12.0mg/L硼酸，44.6mg/L四水硫酸锰，17.2mg/L七水硫酸锌，0.4mg/L钼酸钠，0.05mg/L五水硫酸铜，0.05mg/L氯化钴，55mg/L硫酸亚铁，46mg/L乙二胺四乙酸，192mg/L肌醇，0.4mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸硫胺素，0.4mg/L盐酸吡哆锌，1.6mg/L甘氨酸，1.6mg/L萘乙酸，0.3mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％的蔗糖，4.8g/L琼脂粉，35g/L土豆汁，25g/L香蕉汁和0.1g/L活性碳粉；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55天后，将其移至温度为22℃、湿度为45％的大棚中炼苗30天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置15天，再打开培养瓶的瓶盖放置3天后，将玫瑰石斛苗倒出，洗净培养基，用多菌灵稀释到800倍浸泡玫瑰石斛苗根部15min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
实施例3：
一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括：
外植体选择步骤：选择健壮的玫瑰石斛2-4年的母本植株，在6月中旬玫瑰石斛开花期间对玫瑰石斛进行人工授粉，让其长出果荚，经过3-4个月培育，果荚成熟后，将其采摘放置在7℃的环境下保存3周；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先将果荚用洗洁精水浸泡20min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡60s，无菌水冲洗4次，然后用浓度为3％的次氯酸钠对果荚外壳进行一次消毒1min，然后用无菌水冲洗4次，再用浓度为0.3％的氯化汞进行二次消毒6min，然后用无菌水冲洗5次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，将第一1/2MS培养基的pH调至6.2，封上培养瓶的瓶盖，在温度为26℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天的条件下，培养25天，种子萌发；第一1/2MS培养基的成分包括1900mg/L硝酸钾，1650mg/L硝酸铵，445mg/L二水氯化钙，375mg/L七水硫酸镁，170mg/L磷酸二氢钾，0.83mg/L碘化钾，6.2mg/L硼酸，23mg/L四水硫酸锰，9mg/L七水硫酸锌，0.25mg/L钼酸钠，0.028mg/L五水硫酸铜，0.028mg/L氯化钴，29mg/L硫酸亚铁，25mg/L乙二胺四乙酸，100mg/L肌醇，0.3mg/L烟酸，0.35mg/L盐酸硫胺素，0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.9mg/L甘氨酸，浓度为3％的蔗糖和6g/L琼脂粉；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子在光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天的条件下生长40天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，将第二1/2MS培养基的pH调至6.2，培养65天，长至5-6cm时称为二级母瓶；第二1/2MS培养基的成分包括1900mg/L硝酸钾，1650mg/L硝酸铵，445mg/L二水氯化钙，375mg/L七水硫酸镁，170mg/L磷酸二氢钾，0.83mg/L碘化钾，6.2mg/L硼酸，23.0mg/L四水硫酸锰，9.0mg/L七水硫酸锌，0.25mg/L钼酸钠，0.028mg/L五水硫酸铜，0.03mg/L氯化钴，29mg/L硫酸亚铁，25mg/L乙二胺四乙酸，100mg/L肌醇，0.3mg/L烟酸，0.35mg/L盐酸硫胺素，0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.9mg/L甘氨酸，0.8mg/L萘乙酸，1.5mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为3％的蔗糖，6.0g/L琼脂粉，40g/L土豆汁和0.3g/L活性碳粉；
生根培养步骤：将生长55天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，将MS培养基的pH调至6.0，生根培养95天，得到生根瓶苗；MS培养基的成分包括3800mg/L硝酸钾，3300mg/L硝酸铵，880mg/L二水氯化钙，740mg/L七水硫酸镁，340mg/L磷酸二氢钾，1.66mg/L碘化钾，12.44mg/L硼酸，46mg/L四水硫酸锰，18mg/L七水硫酸锌，0.5mg/L钼酸钠，0.06mg/L五水硫酸铜，0.06mg/L氯化钴，58mg/L硫酸亚铁，50mg/L乙二胺四乙酸，200mg/L肌醇，0.6mg/L烟酸，0.7mg/L盐酸硫胺素，0.6mg/L盐酸吡哆锌，1.8mg/L甘氨酸，2.0mg/L萘乙酸，0.6mg/L6苄基腺嘌呤，浓度为3％的蔗糖，6.0g/L琼脂粉，40g/L土豆汁，35g/L香蕉汁和0.3g/L活性碳粉；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养的具体步骤为，瓶苗在培养室长至65天后，将其移至温度为28℃、湿度为75％的大棚中炼苗30天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置30天，再打开培养瓶的瓶盖放置5天后，将玫瑰石斛苗倒出，洗净培养基，用多菌灵稀释到1000倍浸泡玫瑰石斛苗根部20min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
对比例1：
对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1无对果荚外壳进行一次消毒和二次消毒的步骤。
对比例2：
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2的播种步骤和继代培养步骤中的第一1/2MS培养基和第二1/2MS培养基均采用MS培养基代替。
对比例3：
对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3的炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗在培养室中培养85-95天。
效果评价及性能检测
对实施例1-3以及对比例1-3的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法中生产的成本以及玫瑰石斛种子育苗的发芽率进行监测，培养1000瓶培养瓶，结果如下表所示：
表1：实施例1-3以及对比例1-3的结果对比
发芽率(％) 生产成本(千元)
实施例1 97 20
实施例2 95 22
实施例3 96 24
对比例1 80 22
对比例2 91 36
对比例3 90 42
由表1可见，对于对比例1而言，虽然生产成本相差不大，但是实施例1-3的发芽率均优于对比例1，对于对比例2而言，虽然发芽率相差不大，但是实施例1-3的成本均低于对比例2，对比例3而言，虽然发芽率相差不大，但是实施例1-3的成本均低于对比例3，而实施例1-3中，实施例1为最优实施例。可见，本发明的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，该方法从母本源头控制种质的稳定性，能够有效的提高玫瑰石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，保证种苗质量；两次消毒能保证种子播种后培养基不感染提高种子发芽率；使用第一1/2MS培养基和第二1/2MS培养基对种苗的萌发生长无影响，采用1/2MS培养基还可以节约原料；瓶苗在培养室长至55-65天后，将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中炼苗20-40天，这样节约了生产成本。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于包括：
外植体选择步骤：选择玫瑰石斛母本植株，对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育，待果荚成熟后，将其采摘保存；
外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先洁净果荚，然后对果荚外壳进行一次消毒1-2min，然后用无菌水冲洗3-4次，再进行二次消毒6-8min，然后用无菌水冲洗4-5次，备用；
播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，封上培养瓶的瓶盖，培养至种子萌发；
继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子继续培养，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，长至5-6cm时称为二级母瓶；
生根培养步骤：将二级母瓶转至MS培养基中，生根培养得到生根瓶苗；
炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养85-95天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置15-30天，再打开培养瓶的瓶盖放置3-5天后，用多菌灵稀释液浸泡玫瑰石斛苗根部，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。
2.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：外植体选择步骤中，选择玫瑰石斛2-4年的母本植株，在玫瑰石斛开花期间对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育3-4个月，待果荚成熟后，将其采摘放置在3-7℃的环境下保存1-3周。
3.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：外植体消毒步骤中，洁净果荚的具体步骤为，先将果荚用洗洁精水浸泡15-20min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗10-15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗3-4次，再进行消毒；用浓度为1-3％的次氯酸钠进行一次消毒，用浓度为0.1-0.3％的氯化汞进行二次消毒。
4.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：播种步骤中，第一1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，浓度为2％-3％的蔗糖和4.8-6.0g/L琼脂粉，pH调至5.8-6.2。
5.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：播种步骤中，培养25-30天至种子萌发，培养的条件为，温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天。
6.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：继代培养具体为，萌发的玫瑰石斛种子置于光照强度为2000-2500lx的培养室中继续培养40-50天，光照时间为10-12小时/天，玫瑰石斛种苗长到2-3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，培养55-65天，长至5-6cm时称为二级母瓶。
7.如权利要求6所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：继代培养步骤中，第二1/2MS培养基的成分包括1890-1900mg/L硝酸钾，1640-1650mg/L硝酸铵，440-445mg/L二水氯化钙，370-375mg/L七水硫酸镁，160-170mg/L磷酸二氢钾，0.8-0.83mg/L碘化钾，6.0-6.2mg/L硼酸，22.3-23.0mg/L四水硫酸锰，8.6-9.0mg/L七水硫酸锌，0.2-0.25mg/L钼酸钠，0.025-0.028mg/L五水硫酸铜，0.028-0.03mg/L氯化钴，27.5-29mg/L硫酸亚铁，23-25mg/L乙二胺四乙酸，96-100mg/L肌醇，0.2-0.3mg/L烟酸，0.25-0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2-0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8-0.9mg/L甘氨酸，0.5-0.8mg/L萘乙酸，1.2-1.5mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
8.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：生根培养具体为，将生长45-55天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，生根培养85-95天，得到生根瓶苗。
9.如权利要求8所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：生根培养步骤中，MS培养基的成分包括3790-3800mg/L硝酸钾，3290-3300mg/L硝酸铵，870-880mg/L二水氯化钙，730-740mg/L七水硫酸镁，330-340mg/L磷酸二氢钾，1.62-1.66mg/L碘化钾，12.0-12.44mg/L硼酸，44.6-46mg/L四水硫酸锰，17.2-18mg/L七水硫酸锌，0.4-0.5mg/L钼酸钠，0.05-0.06mg/L五水硫酸铜，0.05-0.06mg/L氯化钴，55-58mg/L硫酸亚铁，46-50mg/L乙二胺四乙酸，192-200mg/L肌醇，0.4-0.6mg/L烟酸，0.5-0.7mg/L盐酸硫胺素，0.4-0.6mg/L盐酸吡哆锌，1.6-1.8mg/L甘氨酸，1.6-2.0mg/L萘乙酸，0.3-0.6mg/L6-苄基腺嘌呤，浓度为2％-3％的蔗糖，4.8-6.0g/L琼脂粉，35-40g/L土豆汁，25-35g/L香蕉汁和0.1-0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8-6.0。
10.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗培养85-95天的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55-65天后，将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中炼苗20-40天。
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