CN107047305A - 一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，是以秋石斛兰的新芽为外植体，采用丛生芽诱导途径，通过芽长芽达到快速繁殖目的，包括以下步骤：外植体的选择和消毒、丛生芽的诱导培养、丛生芽的增殖培养、生根培养、及试管苗移栽。采用本发明方法仅需5至6个月就能获得秋石斛兰种苗；繁殖过程中不仅诱导率高，而且增殖后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、降低了培养成本，即增殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率。

Description

一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法
【技术领域】
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法。
【背景技术】
秋石斛兰(Dendrobium spp.)为兰科石斛属常绿类石斛，又称蝴蝶石斛、杜兰、石斛、石兰等。多是以原产于新几内亚的热带原生种蝴蝶石解(Dendrobium Phalaenopsis)为亲本育成的杂交品种。秋石斛兰是是近几年在中国插花市场上流行的花卉，种类繁多，花形花姿优美，色彩艳丽，花期长，具有较高的观赏价值，在国内切花和盆花的市场需求量逐年增加，对优质种苗的需求迫切。
近年我国大陆引进了不少秋石斛兰品种，但是种苗生产主要靠分株繁殖，繁殖速度慢，而且病毒不断积累严重影响品质，难以满足市场需求。利用植物组织培养技术可以实现秋石斛兰种苗快速繁殖，从而近年愈来愈受到从业人员的重视。
2002年黄志明等曾报道蝴蝶石斛兰以嫩芽茎尖为外植体，先诱导无菌球胚，后经球胚增殖与芽分化、壮苗等环节建立了育苗技术[黄志明，林庆良，佘慧敏.蝴蝶石斛兰工厂化育苗技术的研究[J].莆田学院学报，2002，9(3)：22-26]。罗岚等曾分别在2003年、2004年报道过以秋石解兰小苗的茎尖为材料，先诱导原球茎，后经原球茎增殖、芽分化、生根等环节建立了离体繁殖技术[罗岚，关仕港，刘建昌，林少娟.秋石解兰离体快速繁殖研究[J].佛山科学技术学院学报(自然科学版)，2004，22(2)：69-71；罗岚.秋石解原球茎增殖培养[J].花木盆景，2003，6(8)：4-7]。2009年陈亚鸿等曾报道秋石斛兰梦系列品种在原球茎增殖、芽分化过程通过培养基中添加活性炭和胰蛋白胨降低褐化率的研究，并筛选出适宜的培养基配方[陈亚，洪磊，陈雄庭.减少秋石斛在组织培养中的褐化研究[J].现代农业科学，2009，16(3)：44-48]。
以上文献均提供了秋石斛兰原球茎诱导途径繁殖技术，但原球茎诱导途径要经历脱分化再分化培养过程，历时较长，成苗率较低，这对秋石斛兰优质种苗的获得极为不利。
为了解决原球茎诱导途径存在的问题，申请号为CN200410077729.5、名称为“秋石斛兰优质种苗组织培养快速繁殖方法”的中国专利中，提出了以秋石斛兰种质新芽为外植体，采用培养基进行丛生芽增殖并获得种苗；其虽然建立了秋石斛兰的组织培养繁殖技术，但增殖效率与移栽成活率仍然不够理想，并存在着操作过程相对较为繁复的缺陷。
由鉴于此，研究或优化，以期得到一种操作过程相对便捷、培养效率与移栽成活率均较为理想的秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，是从业人员所迫切希望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，不仅培养环节简化即操作过程相对便捷，而且培养效率与移栽成活率均较为理想。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰健康母株为外植体取材对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，进行套袋隔离；待新芽具3～5个节时进行取样，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡30～50s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒5～6min，然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒4～5min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗4～5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
(2)丛生芽的诱导培养：取步骤(1)切取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L+萘乙酸0.1～0.2mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；
(3)丛生芽的增殖培养：将步骤(2)诱导获得丛生芽切割成带3～6个小芽的丛芽团，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期45～50d，增殖系数达5.5～6.6，之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养45～50d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养15～20d，即增殖培养60～65d获得健壮的丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮的丛生芽切割成单芽，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期75～80d即获得株高6.0～8.0cm、根长2.0～4.0cm、根数3～6条的完整植株，且生根率100.0％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于0.8～1.0g/L杀菌剂溶液浸泡消毒3～5min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入育苗杯中，之后置于22～28℃的温室进行常规栽培管理即可；
其中，增殖培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 800～950mg/L、NH4NO3 550～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素5.0～8.0mg/L、烟酸2.0～3.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、白糖25000～35000mg/L、凝固剂6000～6600mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、及萘乙酸0.1～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 600～900mg/L、NH4NO3500～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O 220～440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0～3.0mg/L、烟酸1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0～10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20000～25000mg/L、凝固剂6300～7000mg/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、萘乙酸0.1～0.3mg/L、活性炭500～800mg/L、及提香蕉泥50000～100000mg/L。
进一步地，所述步骤(1)中，摇床振荡的转速为90r/min；外植体取材时间为3～5月份。
进一步地，所述增殖培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1。
进一步地，所述丛生芽诱导培养基、增殖培养基、及生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且丛生芽诱导培养、增殖培养、生根培养的培养条件均如下：培养温度(24±3)℃，在刚接种时先于自然光照条件下放置5～7d，之后光强1800～2500lx下光照12h/d。
进一步地，所述步骤(3)中，丛芽团的芽大小为0.5～0.8cm。
进一步地，所述步骤(4)中，单芽的芽大小为2.0～2.5cm。
进一步地，所述步骤(5)中，炼苗是在遮光率为70～80％的智能温室中进行，且闭口6～10d、半敞口2～4d、全敞口1～3d。
进一步地，所述步骤(5)中，杀菌剂为多菌灵或百菌清。
进一步地，所述步骤(5)中，育苗杯为1.5寸育苗杯。
进一步地，所述试管苗移栽的时间为4～5月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡8～12h，之后取出沥干，然后再用自来水冲洗1～2遍再挤干水分即可。
本发明的有益效果在于：
利用本发明方法，仅需5至6个月即可获得秋石斛兰种苗，繁殖过程中不仅诱导率高，而且因增殖培养的特殊性，从而使得增殖后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节即操作过程相对便捷、降低了培养成本，即增殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，利用本发明生根培养基配方培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达96.5％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中秋石斛兰种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
本发明一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰健康母株为外植体取材对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，进行套袋隔离(可采用无菌保鲜袋进行套袋隔离)；待新芽具3～5个节时进行取样(外植体取材时间一般在3～5月份)，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡30～50s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒5～6min，摇床振荡的转速可有优选为90r/min；然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒4～5min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗4～5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
(2)丛生芽的诱导培养：取步骤(1)切取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L+萘乙酸0.1～0.2mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；
(3)丛生芽的增殖培养：将步骤(2)诱导获得丛生芽切割成带3～6个小芽的丛芽团(芽大小为0.5～0.8cm)，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期45～50d，增殖系数达5.5～6.6，之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养45～50d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养15～20d，即增殖培养60～65d获得健壮的丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮的丛生芽切割成单芽(芽大小为2.0～2.5cm)，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期75～80d即获得株高6.0～8.0cm、根长2.0～4.0cm、根数3～6条的完整植株，且生根率100.0％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于0.8～1.0g/L杀菌剂溶液(多菌灵溶液或百菌清溶液)浸泡消毒3～5min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入育苗杯(可选用1.5寸的)中，之后置于22～28℃的温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，增殖培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 800～950mg/L、NH4NO3 550～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素5.0～8.0mg/L、烟酸2.0～3.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、白糖25000～35000mg/L、凝固剂6000～6600mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、及萘乙酸0.1～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 600～900mg/L、NH4NO3500～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O 220～440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0～3.0mg/L、烟酸1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0～10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20000～25000mg/L、凝固剂6300～7000mg/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、萘乙酸0.1～0.3mg/L、活性炭500～800mg/L、及香蕉泥50000～100000mg/L。
在本发明具体实施例中，增殖培养基、生根培养基中的凝固剂均可采用琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1，成本较低。丛生芽诱导培养基、增殖培养基、及生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且丛生芽诱导培养、增殖培养、生根培养的培养条件均如下：培养温度(24±3)℃，在刚接种时先于自然光照条件下放置5～7d，之后光强1800～2500lx下光照12h/d。炼苗通常在遮光率为70～80％的智能温室中进行，且闭口6～10d、半敞口2～4d、全敞口1～3d。试管苗移栽的时间为4～5月份，能够更有利于移栽种苗的成活；所述水苔采用智利进口水苔，其品质比较优良，水苔需在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡8～12h，之后取出沥干，然后再用自来水冲洗1～2遍再挤干水分即可。
另外，需要说明的是，在无特殊说明的情况下，本发明中的百分数均为质量百分数。且本发明中，MS培养基是国际通用的培养基，而改良MS培养基与MS培养基相比较，其不同点仅在于KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O用量减半，其余同MS培养基；花宝1号产地美国，其N、P、K质量比为7：6：19；琼脂粉、卡拉胶产地日本，强度分别为1400g/cm2、1500g/cm2；白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
为了对本发明方法进行进一步的阐述说明，申请人给出了如下几个实施例，且这些实施例仅是示例性的，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例一
外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰‘三亚阳光’(引种于海南)的健康母株为外植体取材对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，采用无菌保鲜袋进行套袋隔离；待新芽具3～5个节时进行取样，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡30s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒5min，然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒5min，摇床振荡的转速均为90r/min；最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗4次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
丛生芽的诱导培养：取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤3.0mg/L+萘乙酸0.2mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；培养20～22d后陆续诱导出丛生芽，芽诱导率达70％；
丛生芽的增殖培养：将诱导培养获得丛生芽切割成带3～6个小芽的丛芽团(芽大小为0.5cm)，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期45d，增殖系数达5.8，之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养50d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养15d，获得健壮的丛生芽；增殖培养基的组分为：花宝1号12000mg/L、KNO3 800mg/L、NH4NO3 550mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、烟酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150mg/L、白糖25000mg/L、凝固剂6000mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、及萘乙酸0.1mg/L；
生根培养：将获得的健壮的丛生芽切割成单芽(芽大小为2.0～2.5cm)，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期75d即获得株高6.0～7.0cm、根长2.0～3.0cm、根数3～5条的完整植株，且生根率100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号12000mg/L、KNO3 600mg/L、NH4NO3 500mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20000mg/L、凝固剂6300mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭500mg/L、及香蕉泥50000mg/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养获得的瓶苗置于遮光率为70～80％的温室中炼苗10d(闭口6d、半敞口2d、全敞口2d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0g/L多菌灵溶液浸泡消毒5min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入1.5寸的育苗杯中，之后置于22～28℃的温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达96.5％。
实施例二
外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰‘水晶’(引种于海南)的健康母株为外植体取材对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，采用无菌保鲜袋进行套袋隔离；待新芽具3～5个节时进行取样，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡50s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒6min，然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒5min，摇床振荡的转速均为90r/min；最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
丛生芽的诱导培养：取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；培养18～20d后陆续诱导出丛生芽，芽诱导率达75％；
丛生芽的增殖培养：将诱导培养获得丛生芽切割成带3～5个小芽的丛芽团(芽大小为0.8cm)，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期50d，增殖系数达6.3，之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养45d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养18d，获得健壮的丛生芽；增殖培养基的组分为：花宝1号14000mg/L、KNO3 950mg/L、NH4NO3875mg/L、KH2PO4 125mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素6.0mg/L、烟酸2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180mg/L、白糖30000mg/L、凝固剂6300mg/L、6-苄氨基嘌呤2.0mg/L、及萘乙酸0.1mg/L；
生根培养：将获得的健壮的丛生芽切割成单芽(芽大小为2.0～2.5cm)，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期76d即获得株高6.0～7.0cm、根长2.0～3.0cm、根数3～5条的完整植株，且生根率100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号12000mg/L、KNO3 800mg/L、NH4NO3 750mg/L、KH2PO4100mg/L、MgSO4·7H2O200mg/L、CaCl2·2H2O 330mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、盐酸硫胺素2.0mg/L、烟酸1.5mg/L、盐酸吡哆醇8.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖25000mg/L、凝固剂6500mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭600mg/L、及香蕉泥80000mg/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养获得的瓶苗置于遮光率为70～80％的温室中炼苗12d(闭口7d、半敞口2d、全敞口3d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于0.8g/L百菌清溶液浸泡消毒3min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入1.5寸的育苗杯中，之后置于22～28℃的温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达97.8％。
实施例三
外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰‘红粉佳人’(引种于海南)的健康母株为外植体取材对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，采用无菌保鲜袋进行套袋隔离；待新芽具3～5个节时进行取样，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡42s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒6min，然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒5min，摇床振荡的转速均为90r/min；最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
丛生芽的诱导培养：取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤3.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；培养20～25d后陆续诱导出丛生芽，芽诱导率达82％；
丛生芽的增殖培养：将诱导培养获得丛生芽切割成带3～5个小芽的丛芽团(芽大小为0.6cm)，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期50d，增殖系数达6.6；之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养48d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养20d，获得健壮的丛生芽；增殖培养基的组分为：花宝1号16000mg/L、KNO3 950mg/L、NH4NO3875mg/L、KH2PO4 125mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素8.0mg/L、烟酸3.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇200mg/L、白糖35000mg/L、凝固剂6600mg/L、6-苄氨基嘌呤3.0mg/L、及萘乙酸0.2mg/L；
生根培养：将获得的健壮的丛生芽切割成单芽(芽大小为2.0～2.5cm)，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期80d即获得株高7.0～8.0cm、根长3.0～4.0cm、根数5～6条的完整植株，且生根率100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号16000mg/L、KNO3900mg/L、NH4NO3 875mg/L、KH2PO4125mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、盐酸硫胺素3.0mg/L、烟酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖25000mg/L、凝固剂7000mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭800mg/L、及香蕉泥100000mg/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养获得的瓶苗置于遮光率为70～80％的温室中炼苗14d(闭口10d、半敞口2d、全敞口2d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于0.9g/L多菌灵溶液浸泡消毒5min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入1.5寸的育苗杯中，之后置于22～28℃的温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达98.5％。
综上，利用本发明方法仅需5至6个月即可获得秋石斛兰种苗，繁殖过程中不仅诱导率高，而且因增殖培养的特殊性，从而使得增殖后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、降低了培养成本，即增殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，利用本发明生根培养基配方培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达96.5％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中秋石斛兰种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。

Claims (10)

1.一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择秋石斛兰健康母株为外植体对象，当新芽萌发1.0～2.0cm时，进行套袋隔离；待新芽具3～5个节时进行取样，去除叶片后，用自来水冲洗干净，之后在超净工作台上采用75％的酒精浸泡30～50s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒5～6min，然后更换0.1％升汞溶液1次，再摇床振荡消毒4～5min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗4～5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段和茎尖，备用；
(2)丛生芽的诱导培养：取步骤(1)切取所得带节茎段和茎尖，并接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导培养，丛生芽诱导培养基的配方为改良MS+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L+萘乙酸0.1～0.2mg/L+白糖30g/L+琼脂粉5.0mg/L；
(3)丛生芽的增殖培养：将步骤(2)诱导获得丛生芽切割成带3～6个小芽的丛芽团，接着把丛芽团接种到增殖培养基中进行增殖培养，培养周期45～50d，增殖系数达5.5～6.6，之后更换增殖培养基进行继代增殖培养，继代增殖培养45～50d得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团，然后继续培养15～20d，即增殖培养60～70d获得健壮的丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮的丛生芽切割成单芽，并接种于生根培养基上进行培养，培养周期75～80d即获得株高6.0～8.0cm、根长2.0～4.0cm、根数3～6条的完整植株，且生根率100.0％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于0.8～1.0g/L杀菌剂溶液浸泡消毒3～5min，取出晾干，然后采用水苔包住根部植入育苗杯中，之后置于22～28℃的温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，增殖培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 800～950mg/L、NH4NO3550～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素5.0～8.0mg/L、烟酸2.0～3.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、白糖25000～35000mg/L、凝固剂6000～6600mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、及萘乙酸0.1～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：花宝1号12000～16000mg/L、KNO3 600～900mg/L、NH4NO3 500～875mg/L、KH2PO4 85～125mg/L、MgSO4·7H2O 185～250mg/L、CaCl2·2H2O 220～440mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0～3.0mg/L、烟酸1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0～10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20000～25000mg/L、凝固剂6300～7000mg/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、萘乙酸0.1～0.3mg/L、活性炭500～800mg/L、及香蕉泥50000～100000mg/L。
2.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中，摇床振荡的转速为90r/min；外植体取材时间为3～5月份。
3.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述增殖培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1。
4.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述丛生芽诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且丛生芽诱导培养、增殖培养、生根培养的培养条件均如下：培养温度(24±3)℃，在刚接种时先于自然关照条件下放置5～7d，之后光强1800～2500lx下光照12h/d。
5.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(3)中，丛芽团的芽大小为0.5～0.8cm。
6.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)中，单芽的芽大小为2.0～2.5cm。
7.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(5)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口6～10d、半敞口2～4d、全敞口1～3d。
8.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(5)中，杀菌剂为多菌灵或百菌清。
9.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(5)中，育苗杯为1.5寸育苗杯。
10.根据权利要求1所述一种秋石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述试管苗移栽的时间为4～5月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡8～12h，之后取出沥干，然后再用自来水冲洗1～2遍再挤干水分即可。
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