CN108651280A - 一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，选用成熟但未开裂的文心兰杂交蒴果，经预处理后，并通过种子萌发培养、原球茎分化培养、生根培养、试管苗移栽以达到快速育苗的目的。采用本发明育苗方法仅需5至7个月就能获得文心兰杂交种苗；育苗过程中不仅种子萌发率高、原球茎增殖率低、原球茎分化快，而且分化后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，经由本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率。

Description

一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法
【技术领域】
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法。
【背景技术】
文心兰(Oncidium spp.)为兰科文心兰属及与其近缘属间杂交种的总称，又称金蝶兰、舞女兰、瘤瓣兰等，原产中南美洲的热带和亚热带地区。我国从20世纪90年代初开始引种和栽培文心兰，因其花型奇特、花色丰富、花期长，观赏价值高，已成为我国重要的切花和盆花种类。随着国内兰花消费水平的不断提高，对文心兰新品种的需求不断增加。
我国大陆文心兰栽培品种主要依靠引进，自育品种极少，滞后的品种严重影响了国内文心兰产业的持续发展。杂交育种是文心兰最主要的育种手段，但文心兰杂交易败育，杂交种子少且发育不完全等问题突出，同时文心兰杂交种子无菌播种育苗技术不健全，导致文心兰杂交育种进程缓慢。因此急需建立成熟稳定的文心兰杂交种子无菌播种的育苗技术，实现优质、高效地获得文心兰杂交后代种苗，成为从业人员的迫切需要。
2015年张莹等曾报道迷你芳香型文心兰自花授粉后的成熟种子为外植体，先诱导出原球茎，后经原球茎分化、壮苗、生根等环节，建立了自交种子无菌播种与快速繁殖技术[张莹，田敏，陈胜.文心兰无菌播种与快速繁殖[J].中国花卉园艺，2015，(10)：43]；2016年罗远华等曾报道以‘红狐狸’与‘百万金币’杂种胚为外植体，先诱导出原球茎，后经原球茎分化、生根等环节，建立了文心兰杂种胚培养技术[罗远华，黄敏玲，林兵，叶秀仙，钟淮钦.文心兰杂种胚培养研究[J].福建农业学报，2016，31(8)：839-843]。
以上文献仅提供了文心兰自交种子、及杂种胚培养组织培养育苗技术，且存在着操作过程相对繁琐，培养时间较长，种子萌发率、原球茎分化率等不理想的问题，因而，文心兰杂交种子无菌播种的育苗技术仍需要完善。
由鉴于此，研究或优化，以期得到一种操作过程相对便捷、种子萌发率、原球茎分化率、生根率、移栽成活率均较为理想的文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，是从业人员所迫切希望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，该育苗方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采摘成熟但未开裂的文心兰杂交蒴果，在超净工作台上，先用75％的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用1～2g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌10～15min，接着取出用无菌水冲洗2～3次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内种子或含有种子的絮状物取出，备用；
(2)种子萌发培养：取步骤(1)获得的种子或含有种子的絮状物，并接种到种子萌发培养基中进行萌发培养，培养周期60～110d后获得原球茎；
(3)原球茎分化培养：将步骤(2)获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期50～60d后获得再生小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的再生小苗切割成单苗，并接种到生根培养基上进行生根培养，培养周期40～50d即获得株高5.0～8.0cm、根数2～8条的完整植株，且生根率100％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗于温室中进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～2.0g/L广谱杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～10min，取出晾干表面水分，接着用水苔包住根部植入育苗杯中，然后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖15～25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.3～0.6mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
原球茎分化培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.05～0.2mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～200g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、及萘乙酸0.1～0.3mg/L。
进一步地，所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后120～180d的蒴果。
进一步地，所述种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比为1:1。
进一步地，所述种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且种子萌发培养、原球茎分化培养、生根培养的培养温度均为(24±2)℃；种子萌发培养光强为培养室自然散射光强，原球茎分化培养、生根培养在接种后先于培养室自然散射光强下培养5～7d，之后光强1500～2500lx下光照12～14h/d。
进一步地，所述步骤(2)中，原球茎具茸毛、绿色，且顶端开始分化出叶。
进一步地，所述步骤(5)中，温室的条件均如下：温度为22～28℃、遮光率为70～80％，且炼苗为闭口7～10d、半敞口2～3d、全敞口2～3d。
进一步地，所述步骤(5)中，广谱杀菌剂为多菌灵或百菌清。
进一步地，所述步骤(5)中，试管苗移栽的时间为4～5月份或者10～11月份。
进一步地，所述步骤(5)中，育苗杯为1.5寸育苗杯。
进一步地，所述步骤(5)中，水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡24～30h，取出后再用自来水冲洗1～2次，之后挤干水分即可。
本发明一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法的有益效果在于：
利用本发明育苗方法仅需5至7个月就能获得文心兰杂交种苗；育苗过程中不仅种子萌发率高、原球茎分化快，而且分化后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，经由本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率；换而言之，本发明育苗方法解决了因文心兰杂交种子少、且发育不完全引起的萌发率低、萌发时间较长、且成苗时间较长的问题，为快速、高效的培育文心兰杂交种苗提供了方法。
【具体实施方式】
本发明一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，该育苗方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采摘成熟但未开裂的文心兰杂交蒴果(可优选杂交授粉后120～180d的蒴果)，在超净工作台上，先用75％(V/V)的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用1～2g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌10～15min，接着取出用无菌水冲洗2～3次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内种子或含有种子的絮状物取出，备用；
(2)种子萌发培养：取步骤(1)获得的种子或含有种子的絮状物，并接种到种子萌发培养基中进行萌发培养，培养周期60～110d后获得原球茎；该原球茎通常具茸毛、绿色，且顶端开始分化出叶；
(3)原球茎分化培养：将步骤(2)获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期50～60d后获得再生小苗(高度为2.0～4.0cm)；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的再生小苗切割成单苗，并接种到生根培养基上进行生根培养，培养周期40～50d即获得株高5.0～8.0cm、根数2～8条的完整植株，且生根率100％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗于温室中进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～2.0g/L广谱杀菌剂水溶液(多菌灵水溶液或百菌清水溶液)中浸泡消毒5min，取出晾干表面水分，接着用水苔包住根部植入育苗杯(选用1.5寸育苗杯)中，然后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖15～25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.3～0.6mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
原球茎分化培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.05～0.2mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～200g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、及萘乙酸0.1～0.3mg/L。
在本发明具体实施例中，种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比为1:1，成本较低。种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且种子萌发培养、原球茎分化培养、生根培养的培养温度均为(24±2)℃；种子萌发培养光强为培养室自然散射光强，原球茎分化培养、生根培养在接种后先于培养室自然散射光强下培养5～7d，之后光强1500～2500lx下光照12～14h/d。步骤(5)中，温室的条件均如下：温度为22～28℃、遮光率为70～80％，且炼苗为闭口7～10d、半敞口2～3d、全敞口2～3d；试管苗移栽的时间为4～5月份或者10～11月份，能够更有利于移栽种苗的成活；水苔选用智利进口水苔，且水苔在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡24～30h，取出后再用自来水冲洗1～2次，之后挤干水分即可。椰子汁选取市售新鲜椰子制备而成，将椰子汁取出用纱布过滤后直接使用，制备好的椰子汁可-20℃低温保存6个月；马铃薯泥选取市售新鲜马铃薯制备而成，先用自来水洗净，然后用粉粹机打成浆状，且现做现用。
另外，需要说明的是，本发明中，花宝1号产地美国，其N、P、K质量比为7:6:19；化学试剂为分析纯试剂；琼脂粉、卡拉胶产地日本，强度分别为1400g/cm2、1500g/cm2；白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
为了对本发明方法进行进一步的阐述说明，申请人给出了如下几个实施例，且这些实施例仅是示例性的，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
种子的选择与消毒：选择‘小樱桃’(Oncidium Little Cherry)ב蜜糖’(Oncidium Sweet sugar)杂交授粉后140d的未开裂蒴果，在超净工作台上，先用75％(V/V)的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用2g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌10min，取出用无菌水冲洗2次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内含有种子的絮状物取出，备用；
种子萌发培养：取获得含有种子的絮状物，接种到种子萌发培养基中进行种子萌发培养，培养周期100d后种子萌发获得原球茎；种子萌发培养基组分为：花宝1号1.5g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁100g/L、水解乳蛋白1.0g/L、白糖20g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、及萘乙酸0.1mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，光强为培养室自然散射光强；
原球茎分化培养：将种子萌发获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期60d后获得株高2.0～4.0cm的再生小苗；原球茎分化培养基组分为：花宝1号1.5g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100g/L、水解乳蛋白1.2g/L、白糖25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.8g/L、6-苄氨基嘌呤0.2mg/L、及萘乙酸0.1mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养7d，之后光强1500lx下光照12h/d；
生根培养：将获得的再生小苗切割成单苗，并接种于生根培养基上进行生根培养，培养周期45d即获得株高5.0～7.0cm、根数3～5条的完整植株，且生根率100％；生根培养基的组分为：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥150g/L、白糖30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5g/L、及萘乙酸0.1mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养7d，之后光强2000lx下光照14h/d；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后的瓶苗在温度22～28℃、遮光率为70～80％的温室中进行炼苗12d(闭口7d、半敞口3d、全敞口2d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗净根部粘连的培养基，之后将苗置入1.5g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒8min，取出晾干表面水分，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月后移栽成活率达96.0％。
实施例2
种子的选择与消毒：选择‘甜红豆’(Oncidium Boso Sweet)ב百万金币’(Oncidium Sweet Sugar‘Million Dollar’)杂交授粉后180d的未开裂蒴果，在超净工作台上，先用75％(V/V)的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用1.5g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌12min，取出用无菌水冲洗2次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内含有种子的絮状物取出，备用；
种子萌发培养：取获得含有种子的絮状物，接种到种子萌发培养基中进行种子萌发培养，培养周期110d后种子萌发获得原球茎；种子萌发培养基的组分为：花宝1号1.2g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁150g/L、水解乳蛋白1.0g/L、白糖20g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.6mg/L、及萘乙酸0.2mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，光强为培养室自然散射光强；
原球茎分化培养：将种子萌发获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期50～60d后获得株高2.0～4.0cm的再生小苗；原球茎分化培养基的组分为：花宝1号1.2g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100g/L、水解乳蛋白1.2g/L、白糖25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.8g/L、6-苄氨基嘌呤0.1mg/L、及萘乙酸0.1mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养5d，之后光强1500lx下光照12h/d；
生根培养：将获得的再生小苗切割成单苗，并接种于生根培养基上进行生根培养，培养周期50d即获得株高5.0～7.0cm、根数3～5条的完整植株，且生根率100％；生根培养基的组分为：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥150g/L、白糖30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5g/L、及萘乙酸0.2mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养5d，之后光强2500lx下光照14h/d；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后的瓶苗在温度22～28℃、遮光率为70～80％的温室中进行炼苗14d(闭口8d、半敞口3d、全敞口3d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于2.0g/L多菌灵水溶液浸泡消毒5min，取出晾干表面水分，然后用水苔包住根部植入1.5寸白色育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月后移栽成活率达95.0％。
实施例3
种子的选择与消毒：选择‘黄金午后’(Wilsonara Golden Afternoon)ב百万金币’(Oncidium Sweet Sugar‘Million Dollar’)杂交授粉后126d的未开裂蒴果，在超净工作台上，先用75％(V/V)的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用1.0g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌15min，取出用无菌水冲洗3次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内种子或含有种子的絮状物取出，备用；
种子萌发培养：取获得含有种子的絮状物，接种到种子萌发培养基中进行种子萌发培养，培养周期70d后种子萌发获得原球茎；种子萌发培养基成分为：花宝1号1.5g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁150g/L、水解乳蛋白1.0g/L、白糖20g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.3mg/L、及萘乙酸0.05mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，光强为培养室自然散射光强；
原球茎分化培养：将种子萌发获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期55d后获得株高2.0～4.0cm的再生小苗；原球茎分化培养基成分为：花宝1号1.0g/L、NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100g/L、水解乳蛋白1.2g/L、白糖25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.8g/L、6-苄氨基嘌呤0.05mg/L、及萘乙酸0.05mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养6d，之后光强1500lx下光照14h/d；
生根培养：将获得的再生小苗切割成单苗，并接种于生根培养基上进行生根培养，培养周期45d即获得株高5.0～8.0cm、根数3～6条的完整植株，且生根率100％；生根培养基成分为：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥150g/L、白糖30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5g/L、及萘乙酸0.3mg/L；培养条件为培养温度(24±2)℃，在接种后先于培养室自然散射光强下培养7d，之后光强2500lx下光照14h/d；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后的瓶苗在温度22～28℃、遮光率为70～80％的温室中进行炼苗16d(闭口10d、半敞口3d、全敞口3d)，使得瓶苗适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.5g/L百菌清水溶液浸泡消毒10min，取出晾干表面水分，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月后移栽成活率达92.0％。
综上，采用本发明育苗方法仅需5至7个月就能获得文心兰杂交种苗；育苗过程中不仅种子萌发率高、原球茎分化快，而且分化后无需进行壮苗培养即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，经由本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率；换而言之，本发明育苗方法解决了因文心兰杂交种子少、且发育不完全引起的萌发率低、萌发时间较长、且成苗时间较长的问题，为快速、高效的培育文心兰杂交种苗提供了方法。

Claims (10)

1.一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：该育苗方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采摘成熟但未开裂的文心兰杂交蒴果，在超净工作台上，先用75％的酒精浸泡过的脱脂棉擦洗蒴果表面，然后用1～2g/L的HgCl2水溶液浸泡灭菌10～15min，接着取出用无菌水冲洗2～3次，再用无菌吸水纸擦干表面水分，之后在无菌器皿上切开蒴果，将蒴果内种子或含有种子的絮状物取出，备用；
(2)种子萌发培养：取步骤(1)获得的种子或含有种子的絮状物，并接种到种子萌发培养基中进行萌发培养，培养周期60～110d后获得原球茎；
(3)原球茎分化培养：将步骤(2)获得的原球茎转接到原球茎分化培养基中进行分化培养，培养周期50～60d后获得再生小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的再生小苗切割成单苗，并接种到生根培养基上进行生根培养，培养周期40～50d即获得株高5.0～8.0cm、根数2～8条的完整植株，且生根率100％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的瓶苗于温室中进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～2.0g/L广谱杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～10min，取出晾干表面水分，接着用水苔包住根部植入育苗杯中，然后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、椰子汁100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖15～25g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.3～0.6mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
原球茎分化培养基的组分为：花宝1号1.0～2.0g/L、NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～150g/L、水解乳蛋白1.0～1.5g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、6-苄氨基嘌呤0.05～0.2mg/L、及萘乙酸0.05～0.2mg/L；
生根培养基的组分为：NH4NO3 550～1100mg/L、KNO3 600～1300mg/L、CaCl2·2H2O 150～300mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、KH2PO4 60～115mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA 18.7mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L、盐酸硫胺素0.1～0.2mg/L、甘氨酸2.0mg/L、马铃薯泥100～200g/L、白糖20～30g/L、活性炭1.0g/L、凝固剂6.5～7.0g/L、及萘乙酸0.1～0.3mg/L。
2.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后120～180d的蒴果。
3.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述种子萌发培养基、原球茎分化培养基、生根培养基的pH值均为5.4～5.8；且种子萌发培养、原球茎分化培养、生根培养的培养温度均为(24±2)℃；种子萌发培养光强为培养室自然散射光强，原球茎分化培养、生根培养在接种后先于培养室自然散射光强下培养5～7d，之后光强1500～2500lx下光照12～14h/d。
5.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(2)中，原球茎具茸毛、绿色，且顶端开始分化出叶。
6.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(5)中，温室的条件均如下：温度为22～28℃、遮光率为70～80％，且炼苗为闭口7～10d、半敞口2～3d、全敞口2～3d。
7.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(5)中，广谱杀菌剂为多菌灵或百菌清。
8.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(5)中，试管苗移栽的时间为4～5月份或者10～11月份。
9.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(5)中，育苗杯为1.5寸育苗杯。
10.根据权利要求1所述一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法，其特征在于：所述步骤(5)中，水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行如下操作：采用自来水浸泡24～30h，取出后再用自来水冲洗1～2次，之后挤干水分即可。
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