CN102405842A

CN102405842A - 一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法

Info

Publication number: CN102405842A
Application number: CN2011103111854A
Authority: CN
Inventors: 林庆良; 许莉萍
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN102405842B

Abstract

本发明涉及一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，包括种茎热水处理、抑菌剂的配制、器皿消毒、接种操作、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。采用本发明的开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，培养基无需高压灭菌，接种只要在自然、开放的环境中进行，不需要超净工作台，从根本上简化组培环节，降低组培成本；开放组培与传统组培对比，至少可以降低成本20%以上。而且操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可。投资少，实用性强，推广性好，适合在蔗农中推广。

Description

一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法

技术领域

本发明涉及一种一种植物种苗培育方法，具体涉及一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，属生物技术领域。

背景技术

食糖是关系国计民生的四个大宗农产品，蔗糖占我国食糖总产的92%，因此，蔗糖生产关系我国食糖安全，而蔗糖生产则取决于原料甘蔗的生产，种苗质量直接影响原料蔗的产量和品质。

甘蔗是利用营养体——蔗茎进行无性繁殖的作物，育种周期长达10年，传统种苗自身携带多种病原菌，包括病毒类的甘蔗花叶病病毒、黄叶病病毒等，细菌类的宿根矮化病菌和白条病菌等，真菌类的系统性侵染病害甘蔗黑穗病菌、赤腐病菌和梢腐病菌等，这些病原菌寄生在维管束系统中，影响水分、养分输送和光合作用，导致种性退化。国际甘蔗先进生产国巴西、美国等普遍采用甘蔗蔗茎腋芽经综合脱毒后生产脱毒种苗的策略，同等条件下可提高甘蔗产量15%以上，提高蔗糖分0.5个百分点。为此，我国2011年在国家层面也正式启动了甘蔗脱毒种苗技术示范与推广应用，该项工作已列入农业部“2011年农技推广与体系建设”财政项目，第一批财政投资1000万元在全国广西、云南、广东和海南四个甘蔗主产蔗区进行大规模示范，2012年还将继续实施。

该项技术是否能成功推广应用，关键是种苗的生产成本。由于组织培养是甘蔗脱毒种苗生产所必需的环节，也是决定种苗生产成本的关键环节，因此，降低组织培养环节的成本至关重要。传统组织培养由于需要严格的无菌操作和培养环境，致使技术繁琐，组培投资大，成本过高。2011年8月受农业部种植业司和全国农技推广中心委托，赴广西对该项技术进行督导调研，目前百万株规模的甘蔗脱毒组培苗的生产成本为0.7元/株。由于甘蔗是一种低值农产品，吨甘蔗售价只有300-500元，惟有降低脱毒种苗的生产成本，该项技术才能得到大面积推广应用。

甘蔗脱毒种苗生产过程中脱毒组培苗生产的主要成本构成包括组培苗生产所需的人工成本和设施设备、培养基、耗材及供电成本，由于常规需要提供一个无菌环境并要求接种过程、培养过程在无菌培养基中进行，使得无菌消毒耗能量大，人工操作成本大幅度增加，如果能通过培养基改造，达到即保证植物组织正常生长，又具有杀菌、抗菌或抑菌功能的培养基，菌类也就不能在培养基中滋生。这种培养基既不需要进行高温高压灭菌，也不需要无菌操作要求，从而可降低组织培养对设施设备的要求，投资成本可相应大幅度降低，因为不需要高温高压灭菌和创造无菌环境所需配置的高压锅、超净工作台、隔离接种室等一系列相关设备，电能消耗也将大幅度降低，而且，由于无需无菌操作，简化了组培环节，人工操作的速度将大幅度提高，从而大幅度降低人工成本。不仅如此，由于培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，组织培养过程的污染问题还能得到有效控制，使组培过程脱离严格的无菌环境，从根本上简化组培环节，实现开放式简化组培。改造培养基的关键是找到一种能够添加到培养基中既具有广谱性杀菌或抑菌能力，又不会对甘蔗生长产生毒害或抑制，即不影响甘蔗生长的物质。　要找到适宜特定植物种的处理物质和处理组合是比较困难的。自2003年开始，我国研究人员就开始对开放式组织培养进行了摸索试验，山东农业大学经过近五年的研究，最终成功研制出了以大分子为主的广谱性抑菌药剂－－山农一号，并成功应用到葡萄、苹果等果树组织培养上。2009年，湖北省恩施州农业科学院魔芋研究所应用H198抑菌剂，通过稀释400倍使pH值达到5. 5时成功抑制了魔芋组织培养过程中的菌类生长，魔芋分化状况良好。

本发明是利用上海宇涵生物科技有限公司购买的商品——益培隆，通过添加蒜头汁液配制而成的杀菌剂，对甘蔗组织培养进行了研究，成功建立了开放式甘蔗组织培养的技术体系，为降低甘蔗脱毒组培苗成本提供关键技术。

发明内容

鉴于现有甘蔗组织培养技术环节繁琐，导致组培苗生产成本过高，无法充分体现组织培养技术的优越性问题，本发明的目的在于提供一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括种茎热水处理、抑菌剂的配制、器皿消毒、接种操作、诱导培养、增殖培养、生根培养、瓶苗移栽，其特征在于：

　　1.种茎热水处理：选择无病虫害植株，在蔗茎中部取具有饱满蔗芽的双芽茎段，洗净并用800～1000倍稀释的多菌灵浸泡25～30min，清水洗净后入恒温水浴锅中，50～52℃热水处理28～30min，期间不断搅拌使蔗茎受热均匀；然后，取出蔗茎用泥炭土覆盖，厚度以刚露出蔗芽为宜，保持湿润，并在25～38℃和1200 ～1500 lx光照条件下培养；

　2.抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂１号和抑菌剂2号；抑菌剂１号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10～20ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂１号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10～20 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再加成熟蒜头的汁液20～60 ml，用蒸馏水定容到100 ml,即为抑菌剂2号；

　3.器皿消毒：将培养瓶及瓶盖在0.3%～0.5%（Ｖ/Ｖ）抑菌剂１号的水溶液中浸泡不少于１０h备用；

　4.接种操作：接种室内用紫外灯照射消毒，接种的器具用75%（V/V）酒精消毒后,放在0.5％（V/V）抑菌剂１号水溶液浸泡不少于0.5h,接种过程始终浸泡在0.5％（V/V）抑菌剂１号水溶液中；

　5.诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用75%（V/V）的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的芽尖，接种到诱导培养基；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；所述诱导培养基为MS＋6-BA 2.0 mg/L＋KT 0.5～2.0 mg/L+抑菌剂2号5 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述BA，指6－苄氨基嘌吟；所述KT，指6－糠氨基嘌吟；

6、增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 0.5～2.0 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉3.5g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；

　　7、生根培养：当苗高不低于2.0cm、且茎粗不小于0.2cm，转入1/2MS+NAA 3 mg/L+活性炭500 mg/L+抑菌剂2号3ml/L＋蔗糖40 g/L+琼脂粉3.5 g/L的生根培养基中，20～30天移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

8.瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内，移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖，移栽的环境温度为20～32℃ 。

本发明的应用效果：

１.开放式培养对甘蔗增殖倍数和污染率的影响

　　在增殖过程中，开放组培与传统组培相比,增殖率和污染率都没有太大差异。从瓶苗的生长状况看，开放式培养的培养基由于不经过高压灭菌,激素和营养元素损失较少，其甘蔗组培苗更绿，更壮（见表１）。

表１　开放式培养的增殖情况

组培方式	增殖倍数	污染率（%）	生长状况
				CK	3.2	0	苗浅绿、弱
开放式培养	3.1	0	苗绿、壮

2.开放式培养对甘蔗生根率和污染率的影响

在生根过程中，开放组培与传统组培相比，生根率和污染率都没有太大差异。从瓶苗的生长状况看，开放组培的甘蔗组培苗茎更粗，分蘖少（见表2）。

表２　开放式培养的生根情况

组培方式	生根率（%）	污染率（%）	生长状况
				CK	98	0	茎细，分蘖多
开放式培养	100	3.3	茎粗，分蘖少

3.开放式培养中不同品种和KT浓度对芽丛形成壮苗的影响

试验结果（见表3）表明，不同品种对KT浓度的要求有所不同，ROC22以低浓度的KT 0.5 mg/L为好，平均每丛壮苗数为4.96。FN15则以高浓度的KT 1.5 mg/L为好,平均每丛壮苗数为4.00。

表３　不同品种和KT浓度对芽丛形成壮苗的影响

Figure 2011103111854100002DEST_PATH_IMAGE002

注：培养基成份为：MS＋6-BA1.0mg/L+ KT 0.5～2.0 mg/L+抑菌剂2号3ml/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉3.5g/L　pH５.８；壮苗指：茎粗不小于1.5 mm，且苗高不低于2 cm；接种丛芽的面积为0.2 cm²。

本发明具有以下优点：

１.培养基无需高压灭菌，接种只要在自然、开放的环境中进行，不需要超净工作台，从根本上简化组培环节，降低组培成本。　　　

2. 本发明操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可．实用性强，推广性好。

3. 开放组培与传统组培对比，至少可以降低成本２０%以上。

4. 本发明操作简单，投资少，适合在蔗农中推广。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例一、一种开放式培养甘蔗ROC22脱毒种苗的方法

一种开放式培养甘蔗ROC22脱毒种苗的方法，包括以下步骤：

1. 种茎热水处理：选择无病虫害植株，在蔗茎中部取具有饱满蔗芽的双芽茎段，洗净并用850倍稀释的多菌灵浸泡30min，清水洗净后入恒温水浴锅中，50℃热水处理30min，期间不断搅拌使蔗茎受热均匀；然后，取出蔗茎用泥炭土覆盖，厚度以刚露出蔗芽为宜，保持湿润，并在30℃和1200 ～1500 lx光照条件下培养；

2.抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂１号和抑菌剂2号；抑菌剂１号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂１号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再加成熟蒜头的汁液50 ml，用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；

　3.器皿消毒：培养瓶及瓶盖在0.5%（Ｖ/Ｖ）抑菌剂1号的水溶液中浸泡１０h后取出备用；

　 4.接种操作：接种室每40M³的空间用40W紫外灯照射消毒３０min后进行接种操作；接种的器具用75%（Ｖ/Ｖ）酒精擦洗后，放在0.5％（Ｖ/Ｖ）抑菌剂1号水溶液浸泡0.5h，接种过程始终浸泡在抑菌剂1号水溶液中；

5.诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用75%（Ｖ/Ｖ）的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的芽尖，接种到MS＋6-BA 2.0 mg/L＋KT 0.5 mg/L+抑菌剂2号5 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L诱导培养基中；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

6、增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 0.5 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200～1500 lx；

7、生根培养：当苗高达到2.0cm、且茎粗达到0.2cm以上，转入1/2MS+NAA 3 mg/L+活性炭500 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖40 g/L+琼脂粉3.5 g/L的生根培养基中，20～30天后移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

8. 瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内，移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖；移栽的环境温度为22～30 ℃。

实施例二、一种开放式培养甘蔗FN15脱毒种苗的方法

一种开放式培养甘蔗FN15脱毒种苗的方法包括以下步骤：

1.种茎热水处理：参照实施例一的种茎热水处理；

2.抑菌剂的配制：参照实施例一的抑菌剂的配制；

3.器皿消毒：参照实施例一的器皿消毒；

4.接种操作：参照实施例一的接种操作；

5.诱导培养：参照实施例一的诱导培养；

6、增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 1.5 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200～1500 lx；

7、生根培养：参照实施例一的生根培养；

8.　瓶苗移栽：参照实施例一的瓶苗移栽。。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，包括种茎热水处理、抑菌剂的配制、器皿消毒、接种操作、诱导培养、增殖培养、生根培养、瓶苗移栽，其特征在于：

　　（1）种茎热水处理：选择无病虫害植株，在蔗茎中部取具有饱满蔗芽的双芽茎段，洗净并用800～1000倍稀释的多菌灵浸泡25～30min，清水洗净后入恒温水浴锅中，50～52℃热水处理28～30min，期间不断搅拌使蔗茎受热均匀；然后，取出蔗茎用泥炭土覆盖，厚度以刚露出蔗芽为宜，保持湿润，并在25～38℃和1200 ～1500 lx光照条件下培养；

　（2）抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂１号和抑菌剂2号；抑菌剂１号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10～20ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂１号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10～20 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再加成熟蒜头的汁液20～60 ml，用蒸馏水定容到100 ml,即为抑菌剂2号；

　（3）器皿消毒：将培养瓶及瓶盖在体积比为0.3%～0.5%抑菌剂１号的水溶液中浸泡不少于１０h备用；

　（4）接种操作：接种室内用紫外灯照射消毒，接种的器具用体积比为75%的酒精消毒后,放在体积比为0.5％的抑菌剂１号水溶液中浸泡不少于0.5h,接种过程始终浸泡在体积比为0.5％的抑菌剂１号水溶液中；

　（5）诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用体积比为75%的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的芽尖，接种到诱导培养基；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；所述诱导培养基为MS＋6-BA 2.0 mg/L＋KT 0.5～2.0 mg/L+抑菌剂2号5 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述BA，指6－苄氨基嘌吟；所述KT，指6－糠氨基嘌吟；

（6）增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 0.5～2.0 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉3.5g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；

　　（7）生根培养：当苗高不低于2.0cm、且茎粗不小于0.2cm，转入1/2MS+NAA 3 mg/L+活性炭500 mg/L+抑菌剂2号3ml/L＋蔗糖40 g/L+琼脂粉3.5 g/L的生根培养基中，20～30天移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

（8）瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内，移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖，移栽的环境温度为20～32℃。

2.根据权利要求1所述的一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，其特征在于：

（1）种茎热水处理：选择无病虫害植株，在蔗茎中部取具有饱满蔗芽的双芽茎段，洗净并用850倍稀释的多菌灵浸泡30min，清水洗净后入恒温水浴锅中，50℃热水处理30min，期间不断搅拌使蔗茎受热均匀；然后，取出蔗茎用泥炭土覆盖，厚度以刚露出蔗芽为宜，保持湿润，并在30℃和1200 ～1500 lx光照条件下培养；

（2）抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂１号和抑菌剂2号；抑菌剂１号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂１号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再加成熟蒜头的汁液50 ml，用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；

　（3）器皿消毒：培养瓶及瓶盖在体积比为0.5%抑菌剂1号的水溶液中浸泡１０h后取出备用；

　（4）接种操作：接种室每40M³的空间用40W紫外灯照射消毒３０min后进行接种操作；接种的器具用体积比为75%的酒精擦洗后，放在体积比为0.5％的抑菌剂1号水溶液浸泡0.5h，接种过程始终浸泡在抑菌剂1号水溶液中；

（5）诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用体积比为75%的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的芽尖，接种到MS＋6-BA 2.0 mg/L＋KT 0.5 mg/L+抑菌剂2号5 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L诱导培养基中；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

（6）增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 0.5 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200～1500 lx；

（7）生根培养：当苗高达到2.0cm、且茎粗达到0.2cm以上，转入1/2MS+NAA 3 mg/L+活性炭500 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖40 g/L+琼脂粉3.5 g/L的生根培养基中，20～30天后移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；

（8）瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内，移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖；移栽的环境温度为22～30 ℃。

3.根据权利要求2所述的一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，其特征在于，所述增殖培养：将外植体诱导出的丛生芽接种到MS＋6-BA1.0 mg/L＋KT 1.5 mg/L+抑菌剂2号3 ml/L＋蔗糖30 g/L+琼脂粉3.5 g/L的增殖培养基中，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200～1500 lx。