CN115918530B - 一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基和组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基和组培方法。本发明提供了降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基，所述去玻璃苗培养基包括缓苗培养基和优化培养基，去玻璃苗培养基在6‑BA、NAA、植物凝胶、蔗糖和椰子水的共同作用下降低了组培过程玻璃苗发生率，缩短整个育苗周期，快速获得健壮的植株苗，为广藿香的人工栽培提供大量的种苗，同时解决了广藿香微体快繁中玻璃化现象发生率高的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基和组培方法。
背景技术
广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)是唇形科(Lamiaceae)刺蕊草属(Pogostemon)植物，是一种重要的中药材，它具有明显的抑菌、抗病毒、抑制淀粉样蛋白的神经毒性、抗炎及杀虫等功效。由于广藿香长期采用扦插繁殖，导致其后代种质退化，无法得到优质的种苗。而采用组织培养的方法，不仅有助于广藿香优质品种的保存、复壮，可以解决广藿香生产中的连作障碍等问题。
但是在进行植物微体快繁时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明的水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh(1981)首先命名的“玻璃化”(Vitrification)现象，玻璃化现象是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；玻璃苗在组培中生根困难，移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，玻璃苗的出现概率高达50％以上，严重影响组培中繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗玻璃化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。培养基成分与玻璃苗化现象相关，因此，需要加强广藿香组培培养基的研究，解决广藿香微体快繁中玻璃化现象发生率高的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培培养基，应用本发明提供的组培培养基进行广藿香微体快繁，可以降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率，缩短育苗周期，快速获得健壮的广藿香植株苗。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基，所述去玻璃苗培养基包括缓苗培养基和优化培养基，所述缓苗培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5％椰子水；所述优化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.4～0.45mg/L6-BA、0.1～0.15mg/LNAA、25～26g/L蔗糖、2.3～3g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。
本发明提供了一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法，所述组培方法采用上述技术方案所述的去玻璃苗培养基，包括以下步骤：
将广藿香无菌外植体接种在初代培养基上进行初代培养，得到广藿香不定芽；
将所述广藿香不定芽转接于继代培养基中进行继代培养，得到广藿香壮苗和广藿香玻璃苗；
将所述广藿香玻璃苗转接于去玻璃苗培养基中进行去玻璃苗培养，得到优化后的广藿香无菌苗；
将所述广藿香壮苗和所述优化后的广藿香无菌苗转接于生根培养基中进行生根培养后再进行第二次优化培养，得到健壮的广藿香植株苗。
优选的，所述初代培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.9～1.1mg/L6-BA、0.15～0.25mg/L NAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；
所述继代培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.45～0.55mg/L 6-BA、0.05～0.18mg/L NAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；
所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0.15～0.25mg/LNAA、24～26g/L蔗糖、0.8～1.2g/L活性炭、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。
优选的，所述第二次优化培养的时间为15～28d，所述第二次优化培养的温度为24～26℃。
优选的，所述外植体包括萌发3～5天的广藿香幼嫩叶片。
优选的，所述广藿香幼嫩叶片为不含叶柄且保留主叶脉的叶片；接种在初代培养基上的广藿香幼嫩叶片为1～2.5cm的块状叶片。
优选的，所述初代培养、继代培养、去玻璃苗培养和生根培养的温度分别为24～26℃。
优选的，所述初代培养为暗培养，所述继代培养、去玻璃苗培养、生根培养和第二次优化培养均在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间分别为光照培养10～12h黑暗培养10～12h，所述光照的强度分别为2000～3000lux。
优选的，所述初代培养的时间为13～15d；所述继代培养的时间为20～25d，所述去玻璃苗培养的时间为25～32d；所述生根培养的时间为20～25d。
优选的，所述无菌外植体接种前，还包括对外植体进行清洗和消毒；
所述清洗的方式包括自来水冲洗10～15min后再用清洁剂浸泡15～20min，所述清洁剂包括肥皂水；
所述消毒的方式包括：体积浓度70％～75％酒精消毒25～30s，无菌水冲洗3～4次，再用体积浓度0.1％～0.2％升汞溶液消毒13～15min，无菌水冲洗5～6次。
本发明的有益效果：本发明提供了一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基，所述去玻璃苗培养基包括缓苗培养基和优化培养基，所述缓苗培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5％椰子水；所述优化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.4～0.45mg/L6-BA、0.1～0.15mg/LNAA、25～26g/L蔗糖、2.3～3g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。在本发明提供的组培培养基中，6-BA(6-苄氨基嘌呤)刺激细胞分裂促进植物生长和发育，促进广藿香不定芽和愈伤组织的形成；NAA(1-萘乙酸)促进广藿香发芽和生长；植物凝胶具有凝固培养基的作用，植物凝胶、椰子水提供广藿香生长的营养物质，蔗糖在适宜的浓度下为植物细胞提供碳源，以被动形式进入细胞，影响培养物生长速度及生长量，还参与代谢水平及代谢物的合成，以及细胞形态和发生。
在6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶和椰子水共同作用下使玻璃苗体内含水量稳定，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量高、角质层、栅栏组织等发育正常，光合能力和酶活性提高，最终使玻璃化苗恢复成正常苗，缩短整个育苗周期，快速获得健壮的植株苗，为广藿香的人工栽培提供大量的种苗。实施例结果表明：广藿香微体快繁中，玻璃化苗恢复成正常苗的恢复率最高达到90.58％，恢复苗能够保持植株的优良特性。可见本发明通过所述初代培养基、继代培养基、去玻璃苗培养基和生根培养基中各个组分的配合、各个组分的用量的控制缓解了广藿香微体快繁中出现的玻璃化现象，解决了广藿香微体快繁中玻璃化现象发生率高的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1从田间取回的广藿香幼嫩叶片消毒后在初代培养基上培养最初图；
图2为实施例1广藿香幼嫩叶片在初代培养基生长15d的生长情况图；
图3为实施例1继代培养基上培养20d后的广藿香生长情况图；
图4(A1)为对比例2、对比例3和对比例6玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图；其中图4(A1)中1、2、3依次代表对比例2、对比例6和对比例3；
图4(A2)为对比例1、对比例4和对比例5玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图；其中图4(A2)中4、5、6依次代表对比例5、对比例4和对比例1；
图4(A3)为实施例1、对比例7和对比例8玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图；其中图4(A3)中7、8、9依次代表对比例8，对比例7和实施例1；
图5为实施例1广藿香玻璃苗优化后转接生根培养基培养20d后的广藿香生长情况图；
图6为实施例1广藿香玻璃苗优化后生根培养后再转接到继代培养基培养15d后的广藿香生长情况图。
具体实施方式
本发明提供了一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基，所述去玻璃苗培养基包括缓苗培养基和优化培养基，所述缓苗培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：25g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和质量浓度5％椰子水；所述优化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：还包括：0.4～0.45mg/L6-BA、0.1～0.15mg/LNAA、25～26g/L蔗糖、2.3～3g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。
在本发明中，所述缓苗培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5％椰子水；更优选为以MS培养基为基本培养基，还仅含有：蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5％椰子水。
在本发明中，所述优化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.4～0.45mg/L6-BA、0.1～0.15mg/LNAA、25～26g/L蔗糖、2.3～3g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；更优选为以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.4～0.45mg/L6-BA、0.1～0.15mg/LNAA、25～26g/L蔗糖、2.3～3g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。
本发明所述优化培养基中包括浓度为0.4～0.45mg/L6-BA，优选为0.4～0.42mg/L，更优选为0.4mg/L。本发明所述优化培养基中包括浓度为0.1～0.15mg/LNAA，优选为0.1～0.12mg/L，更优选为0.1mg/L。本发明所述优化培养基中包括浓度为25～26g/L蔗糖，优选为25～25.5g/L，更优选为25g/L。本发明所述优化培养基中包括浓度为2.3～3g/L植物凝胶，优选为2.3～2.5g/L，更优选为2.3g/L。本发明所述优化培养基中包括浓度为4％～5％椰子水，优选为4.5％～5％，更优选为5％。
在本发明提供的缓苗培养基和优化培养基中，通过控制6-BA、NAA激素浓度和蔗糖浓度使玻璃化苗恢复成正常苗；与现有技术相比，本发明提供的去玻璃苗培养基能够显著降低玻璃化苗率，玻璃化苗恢复成正常苗的恢复率最高达到90.58％，恢复苗能够保持植株的优良特性。本发明的植物凝胶具有凝固培养基的作用，同时还能为广藿香的生长提供营养物质，本发明对所述植物凝胶的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，所述植物凝胶优选为P8169植物凝胶。本发明对所述椰子水的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，所述椰子水优选从水果店购买新鲜椰子获得椰子水进行分装，4℃冰箱保存备用。
本发明还提供了一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法，所述组培方法采用上述技术方案所述的去玻璃苗培养基，包括以下步骤：
将广藿香无菌外植体接种在初代培养基上进行初代培养，得到广藿香不定芽；
将所述广藿香不定芽转接于继代培养基中进行继代培养，得到广藿香壮苗和广藿香玻璃苗；
将所述广藿香玻璃苗转接于去玻璃苗培养基中进行去玻璃苗培养，得到优化后的广藿香无菌苗；
将所述广藿香壮苗和所述优化后的广藿香无菌苗转接于生根培养基中进行生根培养后再进行第二次优化培养，得到健壮的广藿香植株苗。
本发明将广藿香无菌外植体接种在初代培养基上进行初代培养，得到广藿香不定芽。
在本发明中，所述初代培养基优选以MS培养基为基本培养基，还包括：0.9～1.1mg/L 6-BA、0.15～0.25mg/LNAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；更优选以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.9～1.1mg/L 6-BA、0.15～0.25mg/LNAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。
本发明所述初代培养基中优选包括浓度为0.9～1.1mg/L 6-BA，进一步优选为0.95～1.05mg/L，更优选为1.0mg/L。本发明所述初代培养基中优选包括浓度为0.15～0.25mg/LNAA，进一步优选为0.18～0.22mg/L，更优选为0.2mg/L。本发明所述初代培养基中优选包括浓度为28～32g/L蔗糖，进一步优选为29～31g/L，更优选为30g/L。本发明所述初代培养基中优选包括浓度为2.3～2.5g/L植物凝胶，进一步优选为2.35～2.45g/L，更优选为2.4g/L。本发明所述初代培养基中优选包括质量浓度4％～5％椰子水，进一步优选为4.5～5％，更优选为5％。在本发明实施例中，本发明所述初代培养基中植物凝胶浓度优选为2.3g/L。
在本发明中，广藿香外植体优选包括萌发3～5天的广藿香幼嫩叶片。本发明可以从田间或者温室大棚内选取广藿香顶端萌发3～5天的幼嫩叶片，将叶片的叶柄剪去，并用封口袋装起来进行隔绝空气2～4℃保存，待用。本发明采用封口袋可以防止广藿香幼嫩叶片在保存过程中被磨损。本发明所述广藿香幼嫩叶片优选为生长良好且无病虫害的幼嫩叶片。本发明接种在初代培养基上的广藿香幼嫩叶片优选为不含叶柄且保留主叶脉的1～2.5cm的块状叶片，进一步优选为1.2～1.8cm的块状叶片，更优选为1.5cm的块状叶片。本发明以广藿香幼嫩叶片作为外植体进行微体快繁育苗，是由于幼嫩叶片具有较高的形态发生能力，器官再生能力强。本发明所述初代培养时每个培养瓶接种的外植体块数没有特殊限定，采用常规的接种操作确定外植体接种块数即可。本发明所述初代培养时优选每个培养瓶接种3块外植体。
现有技术中，广藿香生产上均采用扦插的手段繁育种苗，但容易导致种性退化，组织培养一直是广藿香重要的繁殖方式，但是在微体快繁中也比较容易出现玻璃苗，本发明通过选取广藿香刚萌发的幼嫩叶片并结合前述合适的培养基和有效的处理方法，实现了短时间内刺激幼嫩叶片愈伤萌发，促使幼嫩叶片生根产生试管苗植株，不仅使玻璃化苗恢复成正常苗，还能减少玻璃苗的产生。
接种所述广藿香无菌外植体前，本发明优选还包括对外植体进行清洗和消毒。本发明对所述清洗方式没有特殊限定。本发明所述清洗的方式优选包括自来水冲洗10～15min后再用清洁剂浸泡15～20min，更优选为自来水冲洗15min后再用清洁剂浸泡18min；本发明所述清洁剂优选包括肥皂水。本发明所述肥皂水能够有效清洗广藿香外植体表面的污物。
本发明对所述消毒方式没有特殊限定，优选为清洗后，广藿香外植体用体积浓度70％～75％酒精消毒25～30s，无菌水冲洗3～4次，再用体积浓度0.1％～0.2％升汞溶液消毒13～15min，无菌水冲洗5～6次；更优选为用体积浓度75％酒精消毒28s，无菌水冲洗4次，再用体积浓度0.1％升汞溶液消毒14min，无菌水冲洗6次。在本发明实施例中，优选广藿香外植体用流动的自来水冲洗广藿香幼嫩叶片15min，再用肥皂水浸泡广藿香幼嫩叶片18min，之后将清洗后的广藿香幼嫩叶片放置于超净工作台上进行常规的消毒灭菌，先用体积浓度75％酒精浸泡幼嫩叶片25s，无菌水冲洗4次，再用体积浓度0.1％升汞溶液浸泡幼嫩叶片15min，无菌水冲洗6次。
本发明对无菌水没有特殊限定，优选对蒸馏水灭菌后获得；本发明所述酒精和升汞的用量均优选淹没外植体即可。本发明所述0.1％升汞优选以每1g升汞定容至1000mL得到。
在本发明中，所述初代培养的温度优选为24～26℃，进一步优选为24.5～25.5℃，更优选为25℃。
在本发明中，所述初代培养优选为暗培养。本发明采用暗培养有利于广藿香幼嫩叶片愈伤分化，产生不定芽。
在本发明中，所述初代培养的时间优选为13～15d，更优选为14d。
得到广藿香不定芽后，本发明将所述广藿香不定芽转接于继代培养基中进行继代培养，得到广藿香壮苗和广藿香玻璃苗。
在本发明中，所述广藿香壮苗和广藿香玻璃苗通过叶片和茎段颜色进行判断，本发明所述广藿香玻璃苗的叶片茎段颜色偏向浅绿色透明；而广藿香壮苗叶片和茎段颜色深绿色，半透明。
在本发明中，所述继代培养基优选以MS培养基为基本培养基，还包括：0.45～0.55mg/L 6-BA、0.05～0.18mg/LNAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；更优选以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.45～0.55mg/L 6-BA、0.05～0.18mg/LNAA、28～32g/L蔗糖、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。本发明所述继代培养基中优选包括浓度为0.45～0.55mg/L 6-BA，进一步优选为0.48～0.53mg/L，更优选为0.5mg/L。本发明所述继代培养基中优选包括浓度为0.05～0.15mg/L NAA，进一步优选为0.08～0.13mg/L，更优选为0.1mg/L。本发明所述继代培养基中优选包括浓度为28～32g/L蔗糖，进一步优选为29～31g/L，更优选为30g/L。本发明所述继代培养基中优选包括浓度为2.3～2.5g/L植物凝胶，进一步优选为2.3～2.4g/L，更优选为2.3g/L。本发明所述继代培养基中优选包括质量浓度4％～5％椰子水，进一步优选为4.5％～5％，更优选为5％。
本发明优选将长度为2～3cm的广藿香不定芽转接于继代培养基，更优选为广藿香不定芽长成长度为2.5cm转接于继代培养基。本发明所述继代培养时每个培养瓶接种的不定芽个数没有特殊限定，采用常规的接种操作确定不定芽接种个数即可。本发明实施例中继代培养时每个培养瓶接种的不定芽个数优选为20个。本发明实施例中继代培养时接种的不定芽长度优选为2cm。
在本发明中，所述继代培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述继代培养优选在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间优选为光照培养10～12h黑暗培养10～12h，进一步优选为光照培养11～12h黑暗培养11～12h，更优选为光照培养12h黑暗培养12h；所述光照的强度优选为2000～3000lux，进一步优选为2200～2800lux，更优选为2600lux。在本发明中，所述继代培养的时间优选为20～25d，进一步优选为22～24d，更优选为23d。在本发明实施例中，继代培养的时间优选为20d。
得到广藿香玻璃苗后，本发明将所述广藿香玻璃苗转接于去玻璃苗培养基中进行去玻璃苗培养，得到优化后的广藿香无菌苗。
在本发明中，所述去玻璃苗培养优选包括玻璃苗缓苗培养和玻璃苗优化培养。本发明所述去玻璃苗培养(玻璃苗缓苗培养和玻璃苗优化培养)的总时间优选为25～32d，进一步优选为26～30d，更优选为28d。本发明所述玻璃苗缓苗培养的时间优选为5～7d，更优选为6d。在本发明中，所述玻璃苗缓苗培养和玻璃苗优化培养的培养温度、光暗交替条件和光照强度相同。在本发明实施例中，所述玻璃苗优化培养优选为25d。
在本发明中，所述去玻璃苗培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。
在本发明中，所述去玻璃苗培养优选在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间优选为光照培养10～12h黑暗培养10～12h，进一步优选为光照培养11～12h黑暗培养11～12h，更优选为光照培养12h黑暗培养12h；所述光照的强度优选为2000～3000lux，进一步优选为2300～2700lux，更优选为2500lux。
本发明去玻璃苗培养时优选利用规格为240～250mL玻璃瓶的作为培养器皿，本发明所述去玻璃苗培养优选在培养室中完成，所述培养室的湿度优选保持在90％以上。本发明利用湿度保持在90％以上的培养室能够为广藿香苗提供良好的生长环境。
本发明将所述广藿香壮苗和所述优化后的广藿香无菌苗转接于生根培养基中进行生根培养后再进行第二次优化培养，得到健壮的广藿香植株苗。
在本发明中，所述生根培养基优选以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0.15～0.25mg/LNAA、24～26g/L蔗糖、0.8～1.2g/L活性炭、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水；更优选以1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.15～0.25mg/LNAA、24～26g/L蔗糖、0.8～1.2g/L活性炭、2.3～2.5g/L植物凝胶和质量浓度4％～5％椰子水。本发明所述生根培养基中优选包括浓度为0.15～0.25mg/LNAA，进一步优选为0.18～0.23mg/L，更优选为0.2mg/L；本发明所述生根培养基中优选包括浓度为24～26g/L蔗糖，进一步优选为24.5～25.5g/L，更优选为25g/L；本发明所述生根培养基中优选包括浓度为0.8～1.2g/L活性炭，进一步优选为0.9～1.1g/L，更优选为1.0g/L；本发明所述生根培养基中优选包括浓度为2.3～2.5g/L植物凝胶，进一步优选为2.3～2.4g/L，更优选为2.3g/L；本发明所述生根培养基中优选包括质量浓度4％～5％椰子水，进一步优选为4.2％～4.8％，更优选为4.5％。在本发明实施例中，所述生根培养基中椰子水的浓度优选为5％。
广藿香微体快繁中会产生一些有害物质酚类化合物和多酚氧化酶，使外植体的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。本发明提供的生根培养基中活性炭可以减少微体快繁中一些有害物质酚类化合物和多酚氧化酶的影响，有利于广藿香生根。
本发明的初代培养基、继代培养基、生根培养基对所述植物凝胶的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，所述植物凝胶优选为P8169植物凝胶。本发明对所述6-BA、NAA、活性炭、蔗糖和椰子水的来源没有特殊的限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，所述椰子水优选从水果店购买新鲜椰子获得椰子水进行分装，4℃冰箱保存备用。
在本发明中，所述生根培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述生根培养优选在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间优选为光照培养10～12h黑暗培养10～12h，进一步优选为光照培养11～12h黑暗培养11～12h，更优选为光照培养12h黑暗培养12h；所述光照培养的光照强度优选为2000～3000lux，进一步优选为2300～2800lux，更优选为2500lux。本发明所述生根培养的时间优选为20～25d，进一步优选为21～23d，更优选为22d。
生根培养后获得生根后的广藿香组培苗，本发明优选对所述生根后的广藿香组培苗再进行第二次优化培养，得到健壮的广藿香植株苗。在本发明中，所述第二次优化培养的培养基利用优化培养基进行，所述优化培养基的组成已在上文论述，在此不再赘述。
在本发明中，所述第二次优化培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述第二次优化培养优选在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间优选为光照培养10～12h黑暗培养10～12h，进一步优选为光照培养11～12h黑暗培养11～12h，更优选为光照培养12h黑暗培养12h；所述光照培养的光照强度优选为2000～3000lux，进一步优选为2100～2700lux，更优选为2500lux。本发明所述第二次优化培养的时间优选为15～28d，进一步优选为18～22d，更优选为20d。
本发明所得广藿香健壮的植株苗优选为同时包括3片真叶，叶片肥厚，深绿色，子叶健全，株高9～11cm，茎粗5～6mm，根系白色且密。
在本发明提供的初代培养基、继代培养基、去玻璃苗培养基和生根培养基中，NAA、6-BA作为植物生长调节剂能够促进广藿香微体快繁生长；本发明的植物凝胶具有凝固培养基的作用，同时还能为广藿香的生长提供营养物质；椰子水为广藿香微体快繁提供营养物质。
本发明提供的初代培养基、继代培养基和生根培养基、培养温度、培养光照强度和光暗交替条件的设定均有利于广藿香玻璃苗优化恢复成正常苗，减少玻璃苗的产生。
本发明选取广藿香刚萌发的幼嫩叶片，通过筛选合适的培养基和有效的处理方法，短时间内刺激幼嫩叶片的腋芽萌发，促使幼嫩叶片生根产生试管苗植株，使玻璃化苗恢复成正常苗，缩短整个育苗周期，快速获得健壮的植株苗，为广藿香的人工栽培提供大量的种苗。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法为：
(1)获得广藿香幼嫩叶片外植体
从田间(或者温室大棚内)选取广藿香的萌发3～5天的、生长良好且无病虫害的幼嫩叶片，将叶片的叶柄剪去，并用蛇皮袋进行隔绝空气4℃保存，带回实验室备用。
(2)广藿香幼嫩叶片外植体清洗和消毒
首先用流动的自来水冲洗广藿香幼嫩叶片15min，再用肥皂水浸泡广藿香幼嫩叶片18min，之后将清洗后的广藿香幼嫩叶片放置于超净工作台上进行常规的消毒灭菌，消毒灭菌的过程具体如下：先用体积浓度75％酒精浸泡幼嫩叶片25s，无菌水冲洗4次，再用体积浓度0.1％升汞溶液浸泡幼嫩叶片15min，无菌水冲洗6次。将消毒好的幼嫩叶片切成不含叶柄且带有主叶脉的大小为1.5cm的块状。
(3)初代培养
将步骤(2)经过消毒灭菌的大小为1.5cm的广藿香幼嫩叶片外植体接种在初代培养基上进行初代培养，每个培养瓶接种3块外植体，见图1。初代培养基的配方如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L、植物凝胶2.3g/L和5wt.％椰子水。培养瓶放置于培养室，培养室的温度为25℃，暗培养24h，培养13～15d开始产生不定芽，见图2。
(4)继代培养
当步骤(3)中不定芽的长度长到2cm，将不定芽转接在继代培养基上，继代培养基的配方如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、2.3g/凝胶和5wt.％椰子水。每个培养瓶接种20个不定芽，培养瓶放置于培养室进行光暗交替培养，光照培养12h黑暗培养12h，培养室温度为25℃，光照强度为2500lux，培养时间为20d，得到广藿香壮苗和广藿香玻璃苗，继代培养基上培养20d后的广藿香生长情况图见图3。
(5)去玻璃苗培养
将步骤(4)所得广藿香玻璃苗先转接在缓苗培养基进行玻璃苗缓苗培养5～7天后，接种到优化培养基上进行优化培养。缓苗培养基的组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5％椰子水。优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.4mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、25g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水；
去玻璃苗培养在培养室完成，培养室的温度为25℃、光照强度为2500lux、去玻璃苗培养为光照黑暗交替培养，每天光照培养时间为12h，黑暗培养时间为12h，优化培养25d后获得优化后的广藿香无菌苗，玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图如图4(A3)所示。
(6)生根培养
将步骤(5)优化后的广藿香无菌苗和步骤(4)广藿香壮苗转移到生根培养基上，生根培养基的组成如下：以1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有0.2mg/LNAA、25g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶、1g/L活性炭和5wt.％椰子水，生根培养在培养室内完成，培养室的温度为25℃±1，生根培养为光照黑暗交替培养，光照强度为2500lux，每天光照培养时间为12h，每天黑暗培养时间为12h，生根培养20～25d后广藿香玻璃苗试管苗长出须根。步骤(5)优化后的广藿香玻璃苗转接生根培养基培养20d后的广藿香生长情况图如图5所示。产生根后，再将广藿香玻璃苗转接到优化培养基进行培养15～28d。玻璃苗优化后生根培养后再转接到优化培养基培养15d后的广藿香生长情况图见图6。图1～图6中的字母为申请人便于区分自己设置的标记，无特殊的意义。
对比例1
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.3mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例2
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.3mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、25g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例3
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.3mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例4
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.4mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例5
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.4mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例6
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例7
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、25g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水，其余条件同实施例1。
对比例8
优化培养基组成如下：以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、2.3g/L植物凝胶和5wt.％椰子水。其余条件同实施例1。
对比例2、对比例3和对比例6玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图如图4(A1)所示，其中1代表对比例2，2代表对比例6，3代表对比例3。对比例1、对比例4和对比例5玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图如图4(A2)所示；其中图4(A2)中4代表对比例5，5代表对比例4，6代表对比例1；实施例1、对比例7和对比例8玻璃苗在优化培养基培养20d后的广藿香生长情况图如图4(A3)所示；其中图4(A3)中7代表对比例8，8代表对比例7，9代表实施例1。根据图4(A1)、图4(A2)、图4(A3)可知实施例1的广藿香玻璃苗的恢复苗长势最佳。
对实施例1和对比例1～8的广藿香玻璃苗的增殖系数和恢复率进行计算，增殖系数和恢复率的公式如下，结果见表1。
玻璃苗的增殖系数(％)＝玻璃苗第二次优化培养完成后广藿香组培苗重量/玻璃苗第一次优化培养接种时广藿香玻璃化组培苗重量×100％；
广藿香玻璃苗恢复率(％)＝第二次优化培养后恢复的广藿香组培苗丛数/玻璃苗第一次优化培养接种时的玻璃苗丛数×100％。
实施例1和对比例1～8分别进行了三次平行实验，广藿香玻璃苗的增殖系数和恢复率是三次平行实验的平均值，玻璃苗的增殖系数和广藿香玻璃苗恢复率结果见表1。
表1实施例1和对比例1～8的广藿香玻璃苗的增殖系数和恢复率
对比例1的广藿香玻璃苗、实施例1的广藿香壮苗、实施例1的广藿香玻璃苗恢复苗的生理生化指标数据对比见表2，玻璃苗恢复苗与广藿香壮苗之间的SOD、POD、CAT的酶活性指标差异不显著，数值相近。因此，广藿香玻璃苗恢复苗保持植株的优良特性。可知，本发明提供的降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法的技术方案，有利于保持广藿香植株的优良特性，达到遗传性状稳定的优良效果，微体快繁是人为控制培养条件，微体快繁不受自然条件影响，因此，广藿香微体快繁实现了不受环境时间季节限制的育苗，可以周年生产广藿香优异种苗，为广藿香转基因株系和优良株系(例如产药性量高和抗寒性、抗病性强)的繁殖提供了有力的技术支持和保障。
表2广藿香玻璃苗、广藿香壮苗、广藿香玻璃苗恢复苗的酶活性对比
综上，本发明的降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法的技术方案实现了广藿香微体快繁，降低了玻璃苗化发生率，缩短广藿香组培苗在生产的周期，且能得到健壮的植株无菌苗。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的去玻璃苗培养基，其特征在于，所述去玻璃苗培养基由缓苗培养基和优化培养基组成，所述缓苗培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：蔗糖25g/L、植物凝胶2.3g/L和质量浓度5%椰子水；所述优化培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.4~0.45mg/L6-BA、0.1~0.15mg/LNAA、25~26g/L蔗糖、2.3~3g/L植物凝胶和质量浓度4%~5%椰子水。
2.一种降低广藿香微体快繁玻璃苗发生率的组培方法，其特征在于，所述组培方法包括以下步骤：
将广藿香无菌外植体接种在初代培养基上进行初代培养，得到广藿香不定芽；
将所述广藿香不定芽转接于继代培养基中进行继代培养，得到广藿香壮苗和广藿香玻璃苗；
将所述广藿香玻璃苗转接于权利要求1所述的去玻璃苗培养基中进行去玻璃苗培养为：将继代培养得到的广藿香玻璃苗先转接在缓苗培养基中进行玻璃苗缓苗培养后再接种到优化培养基中进行优化培养，得到优化后的广藿香无菌苗；
将所述广藿香壮苗和所述优化后的广藿香无菌苗转接于生根培养基中进行生根培养后，再转接于优化培养基进行第二次优化培养，得到健壮的广藿香植株苗。
3.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述初代培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.9~1.1 mg/L 6-BA、0.15~0.25mg/L NAA、28~32g/L蔗糖、2.3~2.5g/L植物凝胶和质量浓度4%~5%椰子水；
所述继代培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.45~0.55mg/L 6-BA、0.05~0.18mg/L NAA、28~32g/L蔗糖、2.3~2.5g/L植物凝胶和质量浓度4%~5%椰子水；
所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有：0.15~0.25mg/L NAA、24~26g/L蔗糖、0.8~1.2g/L活性炭、2.3~2.5g/L植物凝胶和质量浓度4%~5%椰子水。
4.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述第二次优化培养的时间为15~28d，所述第二次优化培养的温度为24~26℃。
5.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述外植体包括萌发3~5天的广藿香幼嫩叶片。
6.根据权利要求5所述的组培方法，其特征在于，所述广藿香幼嫩叶片为不含叶柄且保留主叶脉的叶片；接种在初代培养基上的广藿香幼嫩叶片为1~2.5cm的块状叶片。
7.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述初代培养、继代培养、去玻璃苗培养和生根培养的温度分别为24~26℃。
8.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述初代培养为暗培养，所述继代培养、去玻璃苗培养、生根培养和第二次优化培养均在光暗交替条件下进行的，所述光暗交替的时间分别为光照培养10~12h黑暗培养10~12h，所述光照的强度分别为2000~3000lux。
9.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述初代培养的时间为13~15d；所述继代培养的时间为20~25d，所述去玻璃苗培养的时间为25~32d；所述生根培养的时间为20~25d。
10.根据权利要求2所述的组培方法，其特征在于，所述无菌外植体接种前，还包括对外植体进行清洗和消毒；
所述清洗的方式包括自来水冲洗10~15min后再用清洁剂浸泡15~20min，所述清洁剂包括肥皂水；
所述消毒的方式包括：体积浓度70%~75%酒精消毒25~30s，无菌水冲洗3~4次，再用体积浓度0.1%~0.2%升汞溶液消毒13~15 min，无菌水冲洗5~6次。
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