CN109258152A - 一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，以泰山紫草人工优选种子经低温沙藏和3层滤纸胚芽培养2步催芽法获实生苗，以其茎段进行瓶内微茎扦插，使繁殖、生根同步进行并相互循环利用，实现组培技术与扦插技术有机结合，形成一套整体瓶内微茎扦插繁殖系统。本发明简单易操作，突破了种子繁殖发芽率低、繁殖速度慢、大田苗扦插难成活等技术瓶颈，可持续快速获得高质量种苗，显著提高泰山紫草繁殖效率，拓宽泰山紫草繁殖方式，有效缓解泰山紫草种苗限制问题。

Description

一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域的泰山紫草繁育技术领域，具体为一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法。

背景技术

泰山紫草（Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. ）为紫草科紫草属多年生草本植物，多生于山坡草地，泰山紫草为泰山特有中草药品种。紫草根含紫草素，为紫草主要药用部位，可用于治麻疹不透、斑疹、腮腺炎、便秘等症；外用可治烧烫伤。因泰山紫草对生长环境特殊要求，加上多年来人为滥采滥挖，导致泰山紫草野生资源极度匮乏，濒临灭绝，亟需保护。加上，泰山紫草又被称为“泰山四大名药”之一，对于发展泰山特色经济、改善经济结构、促进供给侧经济结构调整和扩大特色种质资源的利用有促进作用，当地政府也对泰山紫草的繁殖推广研究高度重视，以上都对泰山紫草的种质资源保护、繁殖和发展有迫切需要，因此，探索泰山紫草的人工繁殖技术成为当前紧迫任务。

对泰山紫草的人工繁殖已经进行了几十年，但截止目前，泰山紫草主要用种子繁殖，繁殖方式单一，还容易出现种质退化和病虫害积累问题，种植规模受到收获的种子质量、数量、育苗等因素影响，因此，多年来，泰山紫草的种质利用、繁殖效率、良种选育、规模推广受到极大限制，亟需提高人工繁殖水平、探索新的繁殖技术，拓宽繁殖途径。

发明内容

本发明针对以上不足之处，提供了一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法, 本发明利用植物生物技术手段探索进行了泰山紫草组培繁育技研究，以科技手段拓宽泰山紫草优质种苗快速繁育技术。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，具体步骤如下：

（1）种子催芽 先沙藏催芽至种子露白，然后再进行胚芽培养催芽，经胚芽培养后的种子长成为具有2片整体子叶的实生苗；

（2）幼苗培养 将上步得到的实生苗用水漂洗干净，在无菌环境下进行消毒，然后接种至实生幼苗生长培养基上，培养15-20 d，实生苗长出1-2对整体真叶，叶色深绿，继续培养，30 d后，实生苗高4-6 cm，叶片4-6对，绿色舒展且茎秆粗壮，此时已长成泰山紫草幼苗；

（3）幼苗微茎扦插 将上步培养得到的泰山紫草幼苗剪切成段，扦插在扦插培养基上培养，每株实生幼苗可扦插繁殖4-6株；这类型扦插苗培养20-35 d后，幼苗新生茎段高度1.5-3.5 cm，具叶片2-3对，叶片绿色舒展，可用于进行微茎扦插，从基部往上开始剪切，剪切标准：每段至少具1个节间，每段长度1-1.5 cm，扦插深度0.2-0.3 cm，瓶内株距0.5-1 cm；

（4）微茎扦插后再培养

再生扩繁性培养：用于扩繁的上一步微茎扦插时在瓶中放置微茎扦插培养基培养，培养20-35 d后，扦插苗生长方式为顶芽高生长和侧芽分生生长，将顶芽长高部分和伸长侧芽切成茎段插入新鲜的微茎扦插培养基培养，如此循环繁殖，得到可用于生根性培养的幼苗；

生根性培养：上步微茎扦插时选择茎秆较粗壮的扦插苗用于生根性培养，在上一步微茎扦插时在瓶中放置生根培养基培养，或者在生根培养基中接入经过再生扩繁性培养得到的幼苗，每7-15 d完成一次扦插生根过程，获得可用于炼苗移栽的生根苗，直接进行炼苗移栽，或者将生根苗用于再生扩繁性培养。

进一步的，第一步中催芽具体步骤为：先将经过挑选的种子在4℃条件中进行沙藏催芽至种子露白，然后将种子放到铺设有双层湿润滤纸的培养皿至全部脱掉种皮，且培养过程中种子表面均盖1层湿润滤纸，室温下进行胚芽培养催芽。

进一步的，所述幼苗培养条件光照强度10000lx，每天光照12h，温度25℃左右

进一步的，泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法中所采用的各类培养基为：

实生幼苗生长培养基为：MS+3-5%蔗糖；

扦插培养基为: MS+6-BA 0.2-1.0 mg/L＋IAA 0.3-0.8 mg/L；

生根培养基为：1/2MS + IBA 0.01-0.05 mg/L＋ IAA0.01-0.06 mg/L；

进一步的，催芽前，所述种子先经过筛选，筛选分为过筛、水选、清水冲洗、手选、晾干、保存。将倒入种子放入足够大的容器，容器内放足水，充分搅拌后，迅速捞去浮在水面的轻种和杂质后，立即捞出下沉的种子晾干。手选方法为：用肉眼或放大镜观察，将水选未净的病虫粒、瘪粒等再次挑选出来；

进一步的，所述种子筛选的基础是从泰山紫草大田时期定株观察，壮苗，待种子达到形态成熟标准后，采收备用。种子形态成熟标准为：卵形、种皮由绿色变成灰白色，种皮坚硬，经随机抽查种胚成熟度，达到种子形态成熟标准；

一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖系统，是以生长期定株观察的无病虫害壮苗泰山紫草采收的种子，经人工优选（水选+手选）后，先4℃低温沙藏催芽至种子露白，然后再用3层滤纸在培养皿中进行胚芽培养的2步催芽法，获得实生幼苗，并对其进行无菌消毒，接种到幼苗生长培养基培养成幼苗，幼苗长至高度4-6 cm，4-6对叶片时，剪切成至少具1个节间，每段长度1-1.5 cm的茎段，按扦插深度0.2-0.3 cm，瓶内株距0.5-1 cm进行瓶内微茎扦插；微茎扦插有2种培养方向，一是再生扩繁性扦插，目的是培养顶芽长高和分生侧芽，再将长高部分和侧芽切成茎段插入新鲜的微茎扦插培养基培养，如此循环繁殖，实现类似大田常规扦插的扦插式繁殖；二是生根性扦插，目的是培养紫草生根苗；2种培养方向获得的幼苗既可实现繁殖、生根同时进行，也可相互循环利用，形成一套整体微茎扦插繁殖系统。

本发明方法采用瓶内无菌苗微茎扦插和大田扦插方式相结合繁殖泰山紫草，创新了泰山紫草繁殖方式，方法简单易操作、突破了种子繁殖发芽率低、繁殖速度慢、大田苗扦插难成活等技术瓶颈，是植物组培技术和常规扦插技术的有机整合，实现了科研与生产的跨越式结合；以培养瓶为微茎扦插环境，实现扦插微茎生长环境的高度人工控制，最大程度减轻了外界环境对泰山紫草生存因素的影响，也较好地保持了泰山紫草优良植物性状的稳定性，并实现植物材料的高效循环利用，从而为实现泰山紫草的高效繁殖开辟新的途径。应用本发明可有效克服当前泰山紫草常规用种子繁殖的弊端和限制，并可持续快速获得高质量的组培苗，由1粒种子繁殖一株种苗，跨越到1粒种子年繁殖瓶苗十万株以上，显著提高泰山紫草繁殖效率。

本发明提供的泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖系统方法目前尚未见公开报道。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：

实施例1

选择泰山罗汉崖林场试验地生长期泰山紫草大田苗，定株观察确定无病虫害壮苗，待8月进入种子成熟期，卵形种子由绿色变成灰白色，种皮坚硬，并随机取10-15粒种子，破坏种皮，确定达到种子形态成熟标准后，开始种子采收。

先将收获的泰山紫草种子进行筛选处理。筛选共分6步：过筛、水选（淘汰病粒、虫粒和其他杂物）、清水冲洗、手选、晾干、保存。其中，水选方法为：将倒入种子放入足够大的容器，容器内放足水，充分搅拌后，迅速捞去浮在水面的轻种和杂质后，立即捞出下沉的种子晾干。手选方法为：用肉眼或放大镜观察，将水选未净的病虫粒、瘪粒等再次挑选出来。

筛选后的种子晾干后暂放4℃冰箱，待11月中旬左右进行沙藏。根据采收的种子数量确定沙藏方式，量少时可将种子在4℃左右冰箱沙藏，种子量大也可在室内堆沙沙藏。因泰山紫草种子较小，先用小布袋分装种子后再装入等量湿沙，使种子和沙子的体积占布袋容积的1/4，然后把布袋平面埋入湿度为60%左右的沙子中。沙藏期间定期检查，至第二年3月发现多数种子露白后，及时将露白种子挑出。此阶段种子完好率、发芽率、成苗率均在95%以上。

将沙藏种子种已经开始露白的挑出，洗净泥沙，放置于有湿润滤纸或纱布的培养皿中继续培养，培养条件为自然环境；待新芽完全脱掉种皮，长成具2片整体子叶的实生苗后，用水漂洗掉种皮，用于表面消毒。

洗净的泰山紫草实生苗在无菌环境下消毒，先用70%酒精消毒15-30 s，再用0.1%升汞消毒5-6 min，无菌水冲洗3-5次，接种在实生幼苗生长培养基（MS+3-5%蔗糖）上。培养15-20 d后，幼苗长出至少2对整体真叶，叶色深绿且茎秆粗壮时可用作扦插。

此阶段培养条件：光照强度10000lx，每天光照12 h，温度25℃左右。

将具2对整体真叶的紫草幼苗剪切成段，扦插在扦插培养基（MS+6-BA 0.2-1.0mg/L＋IAA 0.3-0.8 mg/L）上培养。培养20-35 d后，幼苗新生茎段高度1.5-3.5 cm，具叶片2-3对，叶片绿色舒展，可从基部往上开始剪切进行扦插。剪切标准：每段至少具1个节间，每段长度1-1.5 cm，扦插深度0.2-0.3 cm，瓶内株距0.5-1 cm。

扦插培养可分2个培养方向，（1）再生扩繁性培养，扦插苗生长方式为顶芽高生长和侧芽分生生长，将长高部分和伸长侧芽切成茎段插入新鲜的微茎扦插培养基培养，用于扩繁的上一步微茎扦插时在瓶中放置微茎扦插培养基培养，培养20-35 d后，扦插苗生长方式为顶芽高生长和侧芽分生生长，将顶芽长高部分和伸长侧芽切成茎段插入新鲜的微茎扦插培养基培养，每隔20-35 d重复一次微茎扦插过程，如此循环繁殖，得到可用于生根性培养的幼苗；

（2）生根性培养：上步微茎扦插时选择茎秆较粗壮的扦插苗用于生根性培养，在上一步微茎扦插时在瓶中放置生根培养基1/2MS + IBA 0.01-0.05 mg/L＋ IAA0.01-0.06 mg/L培养，或者在生根培养基中接入经过再生扩繁性培养得到的幼苗，每7-15 d完成一次扦插生根过程，获得可用于炼苗移栽的生根苗，直接进行炼苗移栽，

这一过程的生根苗若不用于移栽，也可在原培养基继续培养，新生长的茎段也可用阶段(1) 再生扩繁性培养的方向，因此，2个培养方向幼苗繁殖、生根既可同步进行也可相互循环利用，形成一套整体瓶内微茎扦插繁殖系统。

实施例2

如实施例1所述，不同之处在于：

所用实生幼苗生长培养基为：MS+3%蔗糖；

扦插培养基为: MS+6-BA 0.2 mg/L＋IAA 0.3 mg/L ；

生根培养基为：1/2MS + IBA 0.01 mg/L＋ IAA 0.01 mg/L；

实施例3

如实施例1所述，不同之处在于：

所用实生幼苗生长培养基为：MS+5%蔗糖；

扦插培养基为: MS+6-BA 1.0 mg/L＋IAA 0.8 mg/L ；

生根培养基为：1/2MS + IBA 0.05 mg/L＋ IAA0.06 mg/L；

实施例4

如实施例1所述，不同之处在于：

所用实生幼苗生长培养基为：MS+4%蔗糖；

扦插培养基为: MS+6-BA 0.6 mg/L＋IAA 0.5 mg/L ；

生根培养基为：1/2MS + IBA 0.03 mg/L＋ IAA0.04 mg/L；

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）种子催芽 先沙藏催芽至种子露白，然后再进行胚芽培养催芽，经胚芽培养后的种子长成为具有2片整体子叶的实生苗；

（2）幼苗培养 将上步得到的实生苗用水漂洗干净，在无菌环境下进行消毒，然后接种至实生幼苗生长培养基上，培养15-20 d，实生苗长出1-2对整体真叶，叶色深绿，继续培养，30 d后，实生苗高4-6 cm，叶片4-6对，绿色舒展且茎秆粗壮，此时已长成泰山紫草幼苗；

（3）幼苗微茎扦插 将上步培养得到的泰山紫草幼苗剪切成段，扦插在扦插培养基上培养，每株实生幼苗可扦插繁殖4-6株；这类型扦插苗培养20-35 d后，幼苗新生茎段高度1.5-3.5 cm，具叶片2-3对，叶片绿色舒展，可用于进行微茎扦插，从基部往上开始剪切，剪切标准：每段至少具1个节间，每段长度1-1.5 cm，扦插深度0.2-0.3 cm，瓶内株距0.5-1 cm；

（4）微茎扦插后再培养

再生扩繁性培养：用于扩繁的上一步微茎扦插时在瓶中放置微茎扦插培养基培养，培养20-35 d后，扦插苗生长方式为顶芽高生长和侧芽分生生长，将顶芽长高部分和伸长侧芽切成茎段插入新鲜的微茎扦插培养基培养，如此循环繁殖，得到可用于生根性培养的幼苗；

生根性培养：上步微茎扦插时选择茎秆较粗壮的扦插苗用于生根性培养，在上一步微茎扦插时在瓶中放置生根培养基培养，或者在生根培养基中接入经过再生扩繁性培养得到的幼苗，每7-15 d完成一次扦插生根过程，获得可用于炼苗移栽的生根苗，直接进行炼苗移栽，或者将生根苗用于再生扩繁性培养。

2.根据权利要求1所述的一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，第一步中催芽具体步骤为：先将经过挑选的种子在4℃条件中进行沙藏催芽至种子露白，然后将种子放到铺设有双层湿润滤纸的培养皿至全部脱掉种皮，且培养过程中种子表面均盖1层湿润滤纸，室温下进行胚芽培养催芽。

3.根据权利要求1所述的一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，所述幼苗培养条件光照强度10000lx，每天光照12h，温度25℃左右。

4.根据权利要求1所述的一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，所采用的各类培养基为：

实生幼苗生长培养基为：MS+3-5%蔗糖；

扦插培养基为: MS+6-BA 0.2-1.0 mg/L＋IAA 0.3-0.8 mg/L ；

生根培养基为：1/2MS + IBA 0.01-0.05 mg/L＋ IAA0.01-0.06 mg/L。

5.根据权利要求2所述的一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，催芽前，所述种子先经过筛选，筛选分为过筛、水选、清水冲洗、手选、晾干、保存。

6.根据权利要求2所述的一种泰山紫草瓶内微茎扦插繁殖方法，其特征在于，所述种子筛选的基础是从泰山紫草大田时期定株观察，壮苗，待种子达到形态成熟标准后，采收备用。